Prof. Ing. Josef Špak, DrSc. DIAGNOSTIKA ROSTLINNÝCH VIRŮ

Prof. Ing. Josef Špak, DrSc.

DIAGNOSTIKA ROSTLINNÝCH VIRŮ. Studijní text ke kurzu EKOTECH Diagnostika rostlinných patogenů

Adresa autora: Biologické centrum Akademie věd České republiky, Ústav molekulární biologie rostlin, Branišovská 31, 370 05 České Budějovice, e-mail: [email protected]

EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů

Obsah 1.0. ÚVOD. ....................................................................................................................... 3 2.0. ROSTLINNÉ VIRY. ....................................................................................................... 4 2.1. STRUKTURA A MORFOLOGIE VIROVÝCH ČÁSTIC. .......................................... 4 2.2. SYSTÉM ROSTLINNÝCH VIRŮ.............................................................................. 5 3.0. DIAGNOSTICKÉ METODY. ......................................................................................... 11 3.1. HODNOCENÍ PŘÍZNAKŮ NA ROSTLINÁCH (SYMPTOMATOLOGIE). ............. 11 3.2. BIOLOGICKÉ TESTY........................................................................................... 16 3.3. ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE ........................................................................ 17 3.4. METODY ZALOŽENÉ NA SÉROLOGICKÝCH VLASTNOSTECH VIROVÝCH PROTEINŮ ................................................................................................................. 21 3.5. METODY DETEKCE NUKLEOVÉ KYSELINY. .................................................... 29 4.0. UCHOVÁVÁNÍ STANDARDŮ........................................................................................ 37 5.0. ODBĚR, UCHOVÁNÍ A PŘEPRAVA VZORKŮ................................................................. 38 6.0. LEGISLATIVA, ORGANIZACE A PERSPEKTIVY FYTODIAGNOSTIKY V ČR A EU. ......... 39 7.0. SEZNAM LITERATURY. .............................................................................................. 42

EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů

1.0. Úvod. Diagnostika rostlinných virů má značný praktický význam v několika oblastech. První z nich je kontrola zdravotního stavu sadby a osiv. Vzhledem k tomu, ţe proti virům neexistují prakticky pouţitelné pesticidy je produkce viruprosté sadby a osiv klíčovým preventivním a ochranným opatřením proti virům. Druhou oblastí je vnější a vnitřní karanténa, která brání zavlečení a rozšíření ekonomicky významných virů. Její význam roste se zvyšující se mezinárodní obchodní výměnou rostlinného materiálu. Poţadavky EU staví fytosanitární diagnostiku na úroveň diagnostiky veterinární a dosaţení srovnatelné úrovně s EU je úkolem nemalým a dlouhodobým. Rychlé detekční metody jsou nepostradatelné i pro poznání biologie a epidemiologie fytovirů. Česká odborná literatura vyšlá do roku je jiţ v mnohém zastaralá (Bojňanský et al. 1963, Musil et al. 1981). Rychle zastarávají i anglicky psané učebnice (např. Matthews 1991, Walkey 1991) zejména v molekulárně biologických metodách diagnostiky, které se mezitím jiţ staly standardními. Proto lze ke studiu doporučit novější učebnice Bos L.: Plant viruses, unique and intriguing pathogens – a textbook of plant virology. 1999 a Hull, R. Comparative Plant Virology 2009, které jsou dostupné v Akademické a univerzitní knihovně v Č. Budějovicích. Tento text poskytuje přehled prakticky vyuţívaných metod detekce rostlinných virů, zhodnocení jejich předností a nedostatků. Je koncipován tak, aby mohl být vyuţit jako studijní text a umoţnit rychlou orientaci v problematice všem, kteří se fytosanitární diagnostikou zabývají.

EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů 3

2.0. Rostlinné viry. 2.1. STRUKTURA A MORFOLOGIE VIROVÝCH ČÁSTIC. Rostlinný virus je řetězec jedné nebo více molekul nukleových kyselin, obvykle uzavřený v ochranném plášti nebo pláštích z proteinu nebo lipoproteinu, který je schopen organizovat svoji vlastní replikaci pouze uvnitř vhodných hostitelských buněk (obr.1.) (Matthews 1991).

Obr.1. Modelová struktura částice viru mozaiky tabáku. Uvnitř buněk hostitele replikace viru závisí na aparátu hostitele syntetizujícím proteiny, organizuje se ze zásob nezbytných látek spíše neţ dělením buněk, probíhá v místech, která nejsou oddělena od obsahu hostitelské buňky dvojitou lipoproteinovou membránou a neustále umoţňuje vznik variant prostřednictvím různých změn virové nukleové kyseliny (Matthews 1991). EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů 4

Nukleová kyselina viru obecně kóduje: 1) Enzymy, které se účastní při syntéze nukleové kyseliny (polymerázy) a proteázy. 2) Strukturní proteiny - subjednotky plášťového proteinu viru. 3) Nestrukturní proteiny. Ty rozdělujeme na transportní proteiny, umoţňující šíření viru do sousedních buněk (cell to cell) a do celé rostliny (systemic movement proteins), pomocné proteiny (helper component protein), umoţňující přenos viru vektory a proteiny inkluzí.

2.2. SYSTÉM ROSTLINNÝCH VIRŮ Podle druhu nukleové kyseliny, která je nositelkou genetické informace rozlišujeme viry obsahující kyselinu deoxyribonukleovou (DNA) a ribonukleovou (RNA), které mohou být dvouvláknové (double strand - ds) nebo jednovláknové (single strand - ss) a v podobě lineární nebo kruhové molekuly (tab.1.). U ssRNA virů můţe být vlákno v pozitivní nebo negativní orientaci. Některé izoláty určitých fytovirů mohou navíc obsahovat tzv. satelitní viry, jejichţ RNA kóduje svůj vlastní obalový protein. Tab. 1. Rozdělení rostlinných virů podle druhu nukleové kyseliny. DNA viry

RNA viry

Kruhová dsDNA

dsRNA

Lineární dsDNA

Negativní ssRNA

Kruhová ssDNA

Pozitivní ssRNA Satelitní viry ss RNA

Pro klasifikaci rostlinných virů se pouţívá těchto kriterií: 1. Vlastnosti nukleové kyseliny 2. Virové proteiny EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů 5

3. Struktura virové částice (virionu) 4. Fyzikální a chemické a vlastnosti částice 5. Sérologické vztahy 6. Hostitelský okruh a příznaky na rostlinách 7. Způsoby přenosu Nejčastěji uţívané taxonomické kategorie v rostlinné virologiii jsou čeleď, rod, druh, kmen, izolát. Charakterizovat je přesně je obtíţné. Velmi zjednodušeně je však moţné říci, ţe přílušnost k čeledi je dána druhem, formou a členěním nukleové kyseliny, příslušnost k rodu tvarem a velikostí virových částic (obr.2.). Jako druh viru si lze představit populaci virových částic vyvolávajících na určité rostlině charakteristické onemocnění. Ke kmeni zpravidla řadíme sérologicky příbuzné nebo jinak podobné izoláty určitého druhu viru (například nekrotický kmen Y viru bramboru). Kategorii izolát pak často pouţíváme k označení původu podle hostitelské rostliny nebo země. Úpravy systému provádí výkonný výbor International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) a publikuje je v 3 letém intervalu, zpravidla při příleţitosti mezinárodního virologického kongresu. Nejnovější změny jsou přístupné na www stránkách ICTV http://www.virustaxonomyonline.com . Tab. 2. Systém DNA virů


Obr. 2. Čeledi a rody rostlinných virů. Originál Murphy et al. (1993).


Tab.3. Systém RNA virů. dsRNA Čeleď: Partitiviridae

Rod

Typový druh

Alphacryptovirus

white clover cryptic virus 1

Betacryptovirus

white clover cryptic virus 2

Fijivirus

Fiji disease virus

Phytoreovirus

wound tumor virus

Oryzavirus

rice ragged stunt virus

Čeleď: ?

Varicosavirus

lettuce big vein associated virus

Čeleď: Endoviridae?

Endornavirus

Vicia faba endornavirus

Čeleď: Reoviridae

Negativní ssRNA Řád: Mononegavirales Čeleď: Rhabdoviridae

Nucleorhabdovirus Cytorhabdovirus

Čeleď: Bunyaviridae

ssRNA satelitní viry

potato yellow dwarf virus lettuce necrotic yellows virus

Tospovirus

tomato spotted wilt virus

Tenuivirus

rice stripe virus

Ophiovirus

citrus psorosis virus tobacco necrosis satellite

Tab. 4. Systém RNA virů



Systém rostlinných virů se vyvíjí velmi dynamicky. Přesný počet popsaných virů je velmi obtíţné určit. Zaitlin a Hull (1987) uvádějí 632 virů (tab.5.), Brunt et al. (1996) uvádějí jiţ 864 virů a neustále jsou popisovány nové v současnosti se uvádí cca 1700 popsaných fytovirů. Tab. 5. Četnost a % zastoupení virů podle typu jejich nukleové kyseliny (Zaitlin a Hull 1987) Typ nukleové kyseliny

Počet virů

%

+ ssRNA

484

76.6

- ssRNA

82

13.0

dsRNA

27

4.3

ssDNA

26

4.1

dsDNA

13

2.0


Zatímco některé viry jsou prozkoumány velmi dobře, u jiných je údajů velmi málo a nejsou řídké případy, kdy jeden virus napadající různé hostitele byl popsán pod různými názvy. Vysoký je rovněţ počet virů, které nejsou definitivně zařazeny do určitého rodu a jsou popisovány i natolik odlišné viry, ţe lze předpokládat vznik nových rodů a snad i čeledí.

3.0. Diagnostické metody. Současná rostlinná virologie

disponuje širokou škálou diagnostických metod, které

jsou zaloţeny na: 1. Hodnocení příznaků (symptomů) onemocnění 2. Biologických testech 3. Elektronové mikroskopii 4. Sérologických vlastnostech virových proteinů 5. Zjišťování virové nukleové kyseliny V praxi diagnostika řeší nejčastěji dva problémy. Prvním je určení původce onemocnění (etiologie). To je zpravidla náročný a nákladný proces, který můţe trvat řadu měsíců i let a vyuţívá většinu výše uvedených metod. Je tedy spíše záleţitostí vědeckých a výzkumných pracovišť. Druhým je detekce určitého viru nebo virů, například při kontrole zdravotního stavu osiv a sadby, nebo v rámci fytokaranténních opatření. V tomto případě je ideální provádět rutinně sériovou detekci jednou, vyjímečně více metodami. Vzhledem k malým znalostem řady ekonomicky významných virů je však často nezbytné pro spolehlivou detekci pouţít i několika metod, nebo jejich kombinace. Kaţdá z uvedených metod má své přednosti a nedostatky. Pro jednotlivé viry nebo účely je třeba vybrat nejvhodnější metodu.Významná je přitom citlivost metod (kvalitativní či kvantitativní stanovení),

objektivnost (hodnota měřitelná přístroji či naopak subjektivní

posouzení zkušeným pracovníkem), cena (poţadavky na přístrojové a materiálové vybavení, kvalifikaci pracovníků) a expeditivnost (moţnost provedení velkého počtu testů v krátkém čase, s dostatečnou citlivostí a přijatelnými náklady). EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů 11

3.1. HODNOCENÍ PŘÍZNAKŮ NA ROSTLINÁCH (SYMPTOMATOLOGIE). Virová infekce můţe být na rostlině specificky zjevná podle změn viditelných na jejích orgánech, podle změn anatomických, histologických, cytologických a podle změn patofyziologických (Brčák 1983). Virózy (a podle nich i jejich původci - viry) dostávaly nejčastěji názvy podle příznaků viditelných na nadzemních orgánech rostliny (obr.3.). Reakce rostlin na infekci můţeme posuzovat podle jejich vnímavosti (susceptibility) vyjadřující schopnost k nákaze (zcela nevnímavé rostliny jsou "imunní") a podle jejich citlivosti (sensitivity), kterou vyjadřujeme intenzitu patogenního účinku (velmi nízká citlivost se rovná toleranci; při tom se virus můţe v rostlině mnoţit, ale příznaky jsou velmi mírné). Rezistenci můţeme charakterizovat

jako malou vnímavost nebo malou citlivost.

Hypersenzitivitu charakterizuje prudká reakce vedoucí k nekrotizaci. Latentní infekce znamenají trvalý stav nakaţeného hostitele bez příznaků. Dočasné zmizení příznaků označujeme jako maskování. Lokální infekce vzniká v místě, kde virus vnikl do orgánu rostliny, nešíří-li se virus do dalších orgánů, jde o lokalizovanou infekci, šíří-li se do neinokulovaných orgánů, jde o systémovou infekci (z inokulovaného listu např. virus pronikne do kořenů, pak do vrcholu a postupně do spodnějších listů). Jako primární symptomy označujeme příznaky, které jsou prvně viditelné; nemusí při tom jít o příznaky lokální infekce. Rozlišujeme téţ akutní fázi onemocnění (obvykle provázenou silnými šokovými příznaky) a chronickou fázi, charakterizovanou zmírněním příznaků. Soubor všech symptomů způsobených patogenem nazýváme syndrom. Habitus virózní rostliny můţe být změněn zpomalením růstu, projeví se zakrslost, zkrácení internodií a podobně, nebo můţe dojít k vadnutí a odumírání rostliny (např. při infekci okurky virem mozaiky okurky při nízkých teplotách). Osy bývají téţ znetvořeny - např. u jabloní virem plochosti větví. Listy lokálně infikované mohou mít chlorotické nebo nekrotické léze (skvrny), které jsou často pro určité viry charakteristické. Systémově infikované listy jsou u mnoha viróz difúzně chloroticky skvrnité nebo mozaikové (s ostře ohraničenými tmavými a světlými skvrnami; při tom tmavé skvrny obsahují mnohem méně viru neţ světlé). Dalšími příznaky jsou ţloutnutí ţilek, okrajová nebo celková chloróza čepele, prouţkovitost (u jednoděloţných), páskování EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů 12

kolem ţilek, antokyanizace a bronzovitost (nekrotizují pouze pokoţkové buňky). Ţlutými krouţky na čepeli se např. projevuje rod Ilarvirus, nekrotickými soustředěnými krouţky rod Nepovirus, Potexvirus aj., které současně způsobují skvrnitost nebo mozaiku a různé nekrózy (tečkovité, stonkové, vrcholové). Uvedené příznaky na listové čepeli bývají provázeny její deformací, zúţením aţ nitovitostí, vrásčitostí, kadeřením, kroucením do strany nebo epinastií, která vzniká rychlejším růstem pletiv na svrchní straně listu. Vadne-li nekrotizovaný list, můţe buď odpadnout (autotomie) nebo zůstane viset na stonku (např. u čárkovitosti bramboru způsobené Y virem). Ţloutnutí listů je typické pro rod Luteovirus, jeli provázeno (u řepy) nekrotickými tečkami, můţe jít o rod Closterovirus. Pro čeleď Reoviridae jsou charakteristické drobné nádorkovité výrůstky na ţilkách na spodní straně listů, nazývané téţ histoidní enace. Nádory se někdy tvoří i na stoncích a kořenech. U některých viróz jsou enace anatomicky podobné listu. Mnoho druhů rodu Carlavirus vyvolává jen slabé příznaky nebo latentní infekce (Brčák 1983). Květní obaly mohou mít velmi nápadné příznaky; dobře známá je pestrá pruhovitost perigonu u tulipánů nebo ţluté nepravidelné pruhování korunních plátků u Matthiola incana. Také plody a semena mohou projevovat barevné, deformační a nekrotické změny (např. u viru šarky švestky). Symptomy na rostlinách nejsou působeny přímo

virem, ale jsou důsledkem

patofyziologických změn, ke kterým dochází rozsáhlým narušením metabolismu rostliny v důsledku replikace (mnoţení) viru v napadených buňkách. Listy s lokálními lézemi mají vţdy zvýšenou respiraci, v blízkosti lézí se hromadí některé aromatické sloučeniny (např. skopoletin) nebo je tu indukována zvýšená syntéza ligninu, suberinu a kalózy. Při systémové infekci jsou obvykle zaznamenány zvýšené aktivity mnoha enzymů (zejména polyfenoloxidáz), které však během infekčního procesu různě kolísají.

U virů svinutky

bramboru a ţloutenky řepy je typické hromadění škrobu vedoucí ke křehkosti listů. Řada prací dokumentuje změny v obsahu volných aminokyselin, kyseliny askorbové atd. Typické jsou zejména změny v pigmentech (ztráta chlorofylů), zvýšení vakuolárního antokyanu, sníţená aktivita růstových látek a fotosyntézy.


Symptomy jsou důleţité pro rychlé rozeznání virózních rostlin v kultuře. Výhodou této metody jsou nízké náklady, rychlost a vysoká expeditivnost, nevýhodou subjektivnost hodnocení a nezbytnost dlouholetých zkušeností. Je to kvalitativní metoda, která neumoţňuje rozlišit směsné nebo latentní infekce. Je vhodná pro negativní výběry rostlin napadených viry, které vyvolávají typické příznaky onemocnění. Neumoţňuje jednoznačné stanovení původce onemocnění.


Obr. 3. Typy symptomů vyvolaných na rostlinách viry. Originál Kůdela et al. (1989).


3.2. BIOLOGICKÉ TESTY Provádí se ve sklenících mechanickou inokulací (očkováním), roubováním nebo přenosem vektory (např. mšice, křísi) na rostliny (klony) citlivé k infekci. Tyto rostliny zpravidla reagují na infekci určitým virem tvorbou typických příznaků onemocnění. Proto je nazýváme indikátorové, nebo také diferenční hostitelské rostliny. Jejich

předností je

především univerzálnost a poměrně vysoká citlivost. Indikátorové rostliny mohou zachytit nejen široké spektrum

virů, ale i viroidů

a fytoplazem (dříve nazývaných organismy

připomínající mykoplazmy - MLO). Mezi nejčastěji pouţívané bylinné indikátory patří druhy a odrůdy tabáku např. Nicotiana tabacum cv. Samsun NN, cv. Xanthi, N. benthamiana, N. clevelandii, N. glutinosa, z lilkovitých rostlin dále rajče, durman (Datura stramonium) z merlíků např. Chenopodium quinoa, Ch. amaranticolor, dále Vigna sinensis, Phaseolus vulgaris, Tetragonia expansa, Gomphrena globosa, Cucumis sativum, pro trávy a obiloviny Hordeum vulgare, pro brukvovité Sinapis alba, Brassica chinensis, B. pekinensis a další. Při výběru indikátorových rostlin pro test volíme i rostlinu příbuznou původní hostitelské rostlině, z níţ virus přenášíme. Očkování pouţíváme pro mechanický přenos virů z bylinných hostitelů. Část rostliny s příznaky onemocnění se homogenizuje ve vhodném, nejlépe vychlazeném, tlumivém roztoku (pufru) a vzniklá šťáva se nanáší na listy indikátorových rostlin. Tlumivý roztok stabilizuje virové částice a zvyšuje úspěšnost přenosu. Často do něj proto přidáváme i další látky chránící virový nukleoprotein před účinky enzymů. Nejčastěji pouţívanými pufry jsou fosfátový pufr 0,1M pH 7,2-7,4, 0,05M Tris-HCl pH 8,0 s 0.005M EDTA, pro dřeviny 2% roztok nikotinu. Přenos virů z keřů a dřevin šťávou je velmi obtíţný vzhledem k nízké koncentraci virových částic, jejich nerovnoměrnému výskytu v hostiteli a obsahu polysacharidů a polyfenolů sniţujících infekčnost viru. Je proto nezbytné přidávat do homogenizačního pufru například antioxidační a jiné stabilizující chemikálie. Přesto však úspěšnost přenosu viru bývá nízká. Proto současně provádíme roubování na vybrané citlivé klony a kultivary příbuzných druhů např. u jahodníku a maliníku, u peckovin např. podnoţ GF 305. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů 16

Indikátorové rostliny vyuţíváme i k udrţování izolovaných virů a jejich namnoţení pro další studium. Nevýhodou biologických testů je velká časová náročnost. Vyhodnocení se provádí 1 - 6 měsíců po inokulaci (naroubování, přenosu vektory) indikátorových

rostlin. Zdravé i

očkované (naroubované) indikátorové klony a rostliny je nezbytné pěstovat ve skleníku, izolovaném

proti

přenašečům virů (např.

mšicím) ve sterilizované půdě. Rostliny i

jednotlivé pokusy je nezbytné prostorově izolovat a chránit proti houbovým chorobám (např. padlí) a škůdcům (svilušky, molice, třásněnky aj.). Rovněţ je třeba kontrolovat bezvirózní stav indikátorů a odděleně udrţovat chovy přenašečů. Teplota a vzdušná vlhkost ve skleníku mohou významně ovlivnit úspěšnost přenosu a tvorbu příznaků. Dodrţení výše uvedených podmínek a dlouhá doba nezbytná pro vyhodnocení testů způsobují vysoké náklady. Expeditivnost metody je nízká pro její pracnost, zejména při roubování a přenosech vektory. Podobně je tomu i s objektivností testů, které vyţadují zkušenost při vyhodnocování příznaků na indikátorových rostlinách. Biologické testy jsou nezbytné zejména v případech, kdy jsou naše znalosti o virech napadajících určitou plodinu nedostatečné, nebo dosud nemáme jiné detekční metody například sérologické. Je tomu tak velmi často u virů drobného ovoce (maliník, jahodník, rybíz) a ovocných dřevin. 3.3. ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE Histologické změny vyvolané virovou infekcí můţeme pozorovat i optickým mikroskopem. Kromě hyperplasií a hypoplasií patří např. u mozaik neúplná diferenciace mezofylu; ve ţlutých místech jsou menší rozdíly palisádového a houbového parenchymu a je tam méně intercelulárních prostorů. Charakteristické bývají i nekrózy, které vznikají současně s vodním deficitem. U viru svinutky bramboru byly v minulosti nekrózy floemu vyuţívány jako diagnostický znak, s rozvojem sérologických metod však ztratily význam. Pro diagnostické účely se v rostlinné virologii vyuţívá výhradně transmisní elektronová mikroskopie, při níţ svazek emitovaných elektronů zobrazuje preparát na síťce vloţené do mikroskopu. Preparáty se připravují dvěma způsoby - metodou negativního kontrastu a metodou ultratenkých řezů. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů 17

3.3.1. Metoda negativního kontrastu. Při negativním kontrastu se nepatrná část pletiv homogenizuje v destilované vodě, roztok se nanese na síťku potaţenou pouhlíkovanou formvarovou membránou a obarví se nejčastěji octanem uranu, nebo kyselinou fosfowolframovou (obr.4.). Vhodných barviv a technik je však mnoho, jejich přehled uvádí Roberts (1985). Největší předností této metody je zjištění velikosti a tvaru virových částic, které značně usnadňuje zařazení viru do rodu. Podobně lze prokázat i směsnou virovou infekci v případě, kdy pozorujeme částice odlišné tvarem a velikostí. Předností metody je rychlost a citlivost, která je niţší u virů malých rozměrů a s velmi nízkou koncentrací v rostlině (např. rod Luteovirus). V těchto případech je moţné zvýšit citlivost pouţitím imunosorpční elektronové mikroskopie. Obr. 4. Elektronogram purifikovaných částic viru mozaiky vodnice.

3.3.2. Imunosorpční elektronová mikroskopie (ISEM) Metoda je kombinací negativního kontrastu a imunosorpční techniky, kdy specifické protilátky nanesené na síťku koncentrují („vychytávají“) virové částice z roztoku. Virové částice adsorbované na síťku je rovněţ moţné „dekorovat“ homologními nebo heterologními EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů 18

protilátkami a posoudit tak odlišnost nebo příbuznost částic v rámci rodu či druhu viru (obr.5). Toho se vyuţívá zejména u vláknitých a tyčinkovitých virů (Milne 1985). Obr. 5. Imunosorpční elektronová mikroskopie. Směs purifikovaných částic viru nekrózy tabáku a viru keříčkovité zakrslosti rajčete („dekorované částice“). Originál

Matthews

(1991).

3.3.3. Metoda ultratenkých řezů Přestoţe se v praktické diagnostice nevyuţívá, je třeba zmínit moţnosti, které nám poskytuje. Především nám umoţňuje pozorování viru v rostlině „in situ“ a tedy i lokalizaci virionů v jednotlivých pletivech a buněčných organelách. Pouze několik milimetrů velké částic pletiv se poměrně sloţitým postupem fixují a barví, aby z nich bylo moţné na speciálním přístroji ultramikrotomu připravit ultratenké řezy, které lze prohlíţet v transmisním elektronovém mikroskopu a pozorovat cytopatologické změny vyvolané virovou infekcí. Cytopatologické změny se projevují především tvorbou krystalů virových částic tzv. inkluzí. Ty mohu být tvořeny krystaly virových částic, nebo nestrukturními virovými proteiny. Pro virus mozaiky tabáku jsou typické hexagonální destičky, jehlicovité nebo amorfní inkluze, které leţí v cytoplasmě a bývají větší neţ jádro buňky a je dokonce moţné je EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů 19

pozorovat optickým mikroskopem. Velké komplexní inkluze jsou známy hlavně u rodu Potyvirus. Jsou to masivní amorfní útvary často spojené s jádrem a obsahující různé normální i poškozené organely, shluky rovnoběţně uspořádaných virových částic a válcovité proteinové inkluze, které na příčném řezu mají vzhled svitků, růţic nebo lamel. Tyto proteinové inkluze představují nestrukturní proteiny, jejichţ syntéza je řízena virovou RNA. Cytologické změny mohou téţ dokumentovat histotropismus virů: některé viry dosahují vyšší koncentrace v pokoţce, jiné v lýku; např. virus ţloutenky řepy je zpočátku pouze ve floemu, později i v mezofylu a epidermis. K běţným cytologickým změnám patří i tloustnutí a deformace buněčné stěny, patologické změny chloroplastů a mitochondrií aj. (Brčák 1983). Pozorovat na ultratenkých řezech jednotlivé virové částice, zejména sférických virů, je velmi obtíţné. I zde je však moţné, podobně jako u imunosorpční elektronové mikroskopie, vyuţít komplexu protilátek a koloidního zlata k jejich značení (obr.6.), byť tyto metody jsou laboratorně velmi náročné (Van Lent a Verduin 1985). Obr. 6. Částice viru mozaiky tabáku a chlorotické strakatosti kravského hrachu značené komplexem proteinu A a koloidního zlata. Originál Matthews (1991).

Obecně jsou nevýhodou elektronmikroskopických metod vysoké náklady na přístrojové vybavení, odbornou kvalifikaci personálu a zkušenost při přípravě a vyhodnocování preparátů. Expeditivnost metody je nízká, i kdyţ negativně barvené preparáty je moţné připravit během několika minut. Moţnost vidět velikost a tvar virionů však činí z elektronové mikroskopie metodu diagnosticky zcela nepostradatelnou. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů 20

3.4. METODY ZALOŢENÉ NA SÉROLOGICKÝCH VLASTNOSTECH VIROVÝCH PROTEINŮ. Virové částice mají na povrchu plášťového proteinu specifické struktury, které nazýváme epitopy. Jestliţe izolovaný (purifikovaný) virus naočkujeme do vhodného obratlovce, nejčastěji králíka, vytvoří ve svém těle proti těmto bílkovinám specifické protilátky zvané imunoglobuliny G (IgG). Krevní sérum pak obsahuje směs protilátek proti různým epitopům. Takové protilátky nazýváme polyklonální. Koncentraci protilátek v séru označujeme jako titr. Titr označuje ředění, při kterém protilátka ještě reaguje s antigenem (virem). Antiséra vhodná pro diagnostiku virů by měla mít vysoký titr (1:512 a více). Pouţít lze i antiséra s titrem

niţším (1:64), v kaţdém případě však musí být reakce IgG s

bílkovinami ve šťávě zdravých rostlin buď negativní nebo nejvýše

velmi slabá. Jinak

antisérum neumoţňuje odlišit zdravé a virem infikované rostliny (je nespecifické) a není pro diagnostiku pouţitelné. Izolace viru v dostatečném mnoţství a čistotě vyţaduje nákladné přístrojové vybavení a příprava protilátek je tedy záleţitostí výzkumných pracovišť nebo komerčních firem, od nichţ je moţné antisérum získat. Pro praktickou diagnostiku se pouţívají sérologické metody, které vyuţívají kompletního antiséra a imunoenzymatické metody, kdy pracujeme s předem izolovanými IgG.

3.4.1. Sérologické metody. Aţ do poloviny 70. let byly hlavní diagnostickou metodou testy zaloţené na precipitaci virového antigenu s protilátkami (Jermoljev a Pozděna 1972). Nejprve v podobě precipitačního testu později testů difúze v agaru (Ouchterlony 1958) v četných modifikacích. Nejpouţívanější metoda, která se pro svoji jednoduchost běţně pouţívá dosud, je dvojitá difúze v agaru (obr.7.). Test je moţné provést s minimálním laboratorním vybavením. Rozvařený 0,8% agar nalijeme do Petriho misek ve vrstvě 2-3 mm. V agarovém gelu korkovrtem vyřízneme jamky a jejich obsah odsajeme např. vodní vývěvou. Do jamek po obvodu pak pipetujeme šťávu z testovaných rostlin, do centrální jamky antisérum. Protilátky a EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů 21

virový antigen difúzí pronikají gelem a v místech jejich vzájemné reakce vzniká precipitační linie. Reakci je moţné provést v řadě modifikací a při vhodném uspořádání testu je moţné usuzovat podle tvaru precipitačních linií i na serologickou příbuznost virů. Předností této metody jsou nízké náklady, nevýhodou omezené pouţití pro viry s nízkou koncentrací v rostlině nebo s vláknitými částicemi, které obtíţně procházejí gelem. Ve srovnání s imunoenzymatickými metodami je nevýhodou vysoká spotřeba protilátek a nízká expeditivnost. Obr. 7. Test dvojité difúze v agaru s virem ţilkové mozaiky květáku (As - antisérum, 1-5 vzorky z rostlin, K - zdravá kontrola, barveno amidočerní).

3.4.2. Imunoenzymatické stanovení. Imunoenzymatické stanovení (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay - ELISA) rostlinných virů pouţili poprvé Clark a Adams (1977). Dnes je nejrozšířenější metodou pro vysokou citlivost, objektivnost a expeditivnost. Zatímco specifičnost IgG je stejná jako u sérologie v agaru, vysoké citlivosti je dosaţeno reakcí enzymu navázaného na IgG s odpovídajícím substrátem. Standardně se pouţívá enzymu alkalické fosfatázy a substrátu 4EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů 22

nitrofenyl fosfátu. Metodu lze provést v řadě modifikací, z nichţ nejčastější je tzv. dvojitá sendvičová metoda (Clark a Adams 1977). Vlastnímu testu předchází izolace IgG z antiséra a konjugace IgG s alkalickou fosfatázou. I kdyţ se stále více pouţívají komerční diagnostické soupravy, můţeme, máme-li k dispozici vhodné antisérum, poměrně jednoduše izolovat z 1ml antiséra 2 - 5 mg IgG. Z nich připravíme reagencie pro několik tisíc testů coţ podstatně sniţuje cenu testu. Izolaci IgG z antiséra lze provést vysráţením protilátek nasyceným roztokem síranu amonného. Následuje odstředění sraţeniny a několikanásobná dialýza. Získané IgG můţeme dále čistit iontovou chromatografií např. na DEAE celulóze. IgG můţeme uchovávat řadu let, nejlépe lyofilizované, nebo zmrazené. Metod pouţitelných pro izolaci IgG existuje více (Gallo a Dědič 1986). Ke značení IgG enzymem (konjugaci) běţně pouţíváme alkalickou fosfatázu firmy Loewe Biochemica (nejniţší cena při dobré kvalitě) nebo jiných firem. Po smíchání 1 mg IgG s

2 500 U alkalické fosfatázy a přidání glutaraldehydu dojde k vytvoření vazby mezi

enzymem a IgG. Glutaraldehyd pak odstraníme dialýzou. Připravené konjugáty lze v plné aktivitě uchovat nejméně l8 měsíců při 5oC. Pozor! Mraţením dochází ke zničení konjugátu. Pro test

pouţíváme mikrotitrační desky s 96 jamkami s plochým dnem např. firmy

Gama. Lze téţ pouţít jamkové pásky na speciálním nosiči, vhodné pro menší počet vzorků nebo k testování IgG a konjugátu. Při rozvrţení testů na destičce je velmi důleţité pamatovat na slepý pokus (blank), který stanovuje pozadí testu, dále negativní kontrolu (ověřuje specifičnost protilátek) a pozitivní kontrolu (potvrzuje správnost provedení testu). Kromě toho, ţe tyto hodnoty jsou nezbytné pro stanovení hodnoty absorbance rozlišující vzorky zdravé od nemocných, umoţňují nám v případech, kdy je například celá destička nezbarvená nebo naopak ţlutá, rychle odhalit moţnou chybu. Odběr vzorků rostlinného materiálu. Pro přípravu průměrného vzorku z rostlinného materiálu a pro dobu testu nelze stanovit obecná pravidla. Úspěch závisí do značné míry na tom, je-li test proveden v době optimální koncentrace daného viru v určité části rostliny. Zejména u dřevin proto provádíme odběry z předem narašených větví ve skleníku, z pupenů, květů nebo lýka. I u bylin dochází po infekci k pomnoţení viru v pletivech do určitého EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů 23

maxima a pak k poklesu koncentrace viru. U starších rostlin mohou test rušit i některé látky přítomné ve šťávě. Příprava vzorků. Rostlinný materiál (listy, květy, kůra, pokoţka plodů, hlízy, semena a klíčky semen) homogenizujeme s extrakčním pufrem obsahujícím chemikálie pro stabilizaci daného viru v poměru l:l0 - l:l00. Při malém počtu vzorků pouţijeme běţné třecí misky, při větším počtu vzorků je výhodné pouţít lis na šťávu (firmy Pollahne, NSR, pro brambory, zeleninu) anebo homogenizátor (Polytron) pro pletiva stromů. Pro listy drobného ovoce např. jahodníku lze pouţit tekutý dusík, který výrazně usnadní homogenizaci listů v třecí misce (Albrechtová 1986). Vlastní test má následující kroky (obr.8.): l. Navázání IgG na povrch stěn jamek. Do jamek desky pipetujeme 0,2 ml IgG v ředění 2 g ml-1 a desku inkubujeme 4 hodiny při 36oC. Jestliţe je totiţ koncentrace IgG niţší, při slabé koncentraci viru ve vzorku nemusí dojít k dostatečnému navázání viru a výsledné zabarvení je tak slabé, ţe vzorek je hodnocen jako negativní. Při koncentraci IgG vyšší neţ 5 gml-1 dochází zpravidla k nespecifickým reakcím. 2. Promývání. Promýváme třikrát promývacím pufrem po 3 min. Pokaţdé promývací roztok velmi důkladně vyklepáme, naposledy na filtračním papíře. 3. Navázání testovaného vzorku. Z kaţdého

vzorku pipetujeme 0.2

ml šťávy do

minimálně dvou jamek desky. Pro hodnocení blanku naplníme pufrem nejméně 4 jamky. Desku inkubujeme nejlépe přes noc při teplotě 5 oC, coţ se v praxi osvědčilo u vyššího počtu vzorků, nebo 4 hodiny při 36oC. Virové částice ze surové testované šťávy se naváţou na protilátky na stěnách jamek a vytvoří stabilní komplex. Protoţe příprava vzorků, zejména homogenizace je velmi náročná a pracná, je výhodné připravit zhruba dvojnásobné mnoţství šťávy a uchovat je v chladničce aţ do vyhodnocení testu. Tak je v případě nepříznivého výsledku moţné test rychle opakovat. 4. Vymývání desek provádíme jako v případě IgG aţ do úplného odstranění stop šťávy. 5. Navázání konjugátu IgG a enzymu. Na komplex protilátky a viru naváţeme další antigenní reakcí enzymem značenou protilátku. Do jamky pipetujeme 0,2 ml ředěného EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů 24

konjugátu IgG a desku inkubujeme 4 hodiny při 36oC. Konjugát ředíme podle reaktivity IgG l:250 aţ l:5000. 6. Promývání provádíme stejně jako po navázání IgG na desku. 7. Inkubace reakcí enzymovým substrátem. Do jamek pipetujeme 0,2 ml substrátu v koncentraci 1 mg ml

-1

substrátového pufru. Desku inkubujeme 1 hodinu při pokojové

teplotě. Navázaný enzym štěpí bezbarvý p-nitrofenylfosfát na fosfát a ţlutý nitrofenol. Mnoţství nitrofenolu je po určité době úměrné aktivitě fosfatázy a můţeme jej stanovit spektrofotometricky při vlnové délce 405 nm. Čím je ţluté zabarvení sytější, tím je vyšší koncentrace viru v testovaném vzorku.


Obr. 8. Schéma dvojité sendvičové metody ELISA. Originál Boehringer, upraveno.


8. Vyhodnocení. Od naměřených hodnot absorbance odečteme průměrnou hodnotu slepého pokusu a s vyuţitím průměrných hodnot pozitivní (infikované) a zdravé kontroly určíme mezní hodnotu určující zdravé a virem infikované vzorky. K vyhodnocení dat můţeme vyuţít i vhodné statistické programy dodávané většinou se spektrofotometrem. Zpracováním dat se zabývali Sutula et al. (1986). Kohler a Milstein (1975) vypracovali postup přípravy tzv. monoklonálních protilátek. (monoclonal antibodies - Mab). Jejich předností je, ţe rozlišují pouze jediný epitop a mohou tedy být mnohem specifičtější neţ protilátky polyklonální, coţ je výhodné při rozlišení kmenů virů. Na druhé straně při sériové diagnostice můţe být jejich přílišná specifičnost nevýhodou, neboť nedetekují všechny kmeny určitého viru (Van Regenmortel 1986). Příprava monoklonálních protilátek v myších je mnohem náročnější neţ příprava polyklonálních protilátek, postup přípravy uvádí např. Matthews (1991).

Hybridomy produkující

monoklonální protilátky je však moţné dlouhodobě uchovávat v tekutém dusíku a znovu je pouţít. To je výhodné jestliţe

izolace (purifikace) viru je velmi obtíţná a výtěţek a

imunogenicita viru je velmi nízká (rod Luteovirus). Podobně lze s výhodou vyuţít technologie Mab v případě, kdy nelze izolovat dostatečně čistý virus. Z mnoţství hybridomů, lze vybrat takové, které produkují dostatečně specifickou protilátku. Jak jiţ bylo uvedeno, ELISA se rychle stala standardem ve fytosanitární diagnostice. Huttinga (1996) uvádí, ţe jen v Holandsku je ročně provedeno asi 11 milionů testů sadbových rostlin. Nejen proto, ţe ELISA je vysoce citlivá a umoţňuje kvalitativní i kvantitativní stanovení viru. Důleţitá je zejména objektivnost plynoucí z měření absorbance na fotometru. Výsledek tedy není závislý na subjektivním úsudku a zkušenostech pracovníka, coţ sniţuje nároky na kvalifikaci personálu. I kdyţ je moţné hodnotit zabarvení vizuálně, je nezbytné mít odpovídající fotometr, coţ je spolu s pipetami dostatečné přístrojové vybavení pro provedení testu. Pro sériová stanovení je vhodné zakoupit promývačky. Existují i plně automatická zařízení dosahující vysokou expeditivnost. Přínosem pro standardizaci výsledků v mezinárodním měřítku jsou diagnostické soupravy firem pro stanovení řady ekonomicky významných virů. První byla v roce 1983 firma EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů 27

Bioreba (Švýcarsko), postupně následovaly další (Německo),

Sanofi (Francie), Loewe Biochemica

Boehringer (Rakousko) a jejich počet neustále roste. Firma Agdia (USA)

pouţívá jako jediná namísto alkalické fosfatázy křenovou peroxidázu. Nabídku firem je moţné sledovat i na Internetu. Liší se podstatně nejen sortimentem virů a kvalitou či původem protilátek, ale i počtem testů 100, 500 nebo 1000. Dodávány jsou buď kity, které obsahují IgG, konjugované protilátky, zdravou a nemocnou kontrolu a někdy i pufry a substrát, nebo sety, které neobsahují kontroly. Tomu odpovídá i cena, kterou je velmi obtíţné porovnávat. Nabídka se rozšiřuje i na fytopatogenní houby a bakterie.


3.5. METODY DETEKCE NUKLEOVÉ KYSELINY. Nalézají uplatnění při detekci virů, proti kterým se dosud nepodařilo připravit specifické protilátky,

nebo tam,

kde citlivost

sérologických a imunoenzymatických metod není

dostatečná. Tak je tomu u virů drobného ovoce a ovocných dřevin, z nichţ mnohé jsou karanténní povahy. Metody detekce nukleových kyselin se začaly rozšiřovat s rozvojem molekulární biologie v 80. letech. Pro praktickou diagnostiku lze uţít metod: a) Izolace dvouvláknové ribonukleové kyseliny (dsRNA) b) Molekulární hybridizace c) Polymerázové řetězové reakce (Polymerase Chain Reaction - PCR)

3.5.1. Izolace dvouvláknové ribonukleové kyseliny (dsRNA). DsRNA se vyskytuje u rostlinných virů čeledí Reoviridae a Partitiviridae (cryptoviry) jako genomová nukleová kyselina. V rostlinách infikovaných ssRNA viry je přítomna dvouvláknová RNA, jako replikativní forma těchto virů. Tyto dsRNA mohou být z rostlin izolovány a vyuţity pro diagnostiku. Diagnostiku pomocí dsRNA lze provést: a) charakterizací dsRNA elektroforézou v polyakrylamidovém gelu (PAGE) b) pouţitím protilátek reagujících s dsRNA, c) k přípravě specifických sond pro molekulární hybridizaci. Izolace dsRNA byla velmi nadějnou metodou začátkem 80. let. Vychází ze skutečnosti, ţe v podstatě kaţdý RNA virus lze charakterizovat odlišnými prouţky dsRNA, po jejím rozdělení elektroforézou v polyakrylamidovém gelu (Valverde et al., 1986). Touto metodou je tedy moţné odhalit cizorodou dsRNA v rostlině a získat tak jednoduchý, prakticky vyuţitelný test pro diagnostiku RNA virů. To má značný význam při testovaní matečných rostlin


vegetativně mnoţených plodin. DNA viry nejsou touto metodou zjistitelné, jejich počet je však malý. Citlivost metody je srovnatelná s ELISA testem. Diagnostické vyuţití dsRNA je však komplikováno skutečností, ţe zdravé rostliny někdy obsahují dsRNA neznámého původu. Vzhledem k velké molekulové hmotnosti některé z nich mohou pocházet z dosud nepopsaných virů čeledi Partitiviridae, které nevyvolávají na rostlinách příznaky, rostlinám zjevně neškodí a byly popsány u mnoha plodin. DsRNA mohou rovněţ indikovat přítomnost houbového patogena. I přes tyto potíţe lze dsRNA vyuţít pro diagnózu virů v některých hostitelích, kdy nemáme protilátky a neznáme sekvenci nukleotidů a zejména tam, kde je jedinou alternativou ke zdlouhavému a pracnému roubování nebo přenosu viru mšicemi, zejména u virů drobného ovoce, např. raspberry leaf spot viru v rodu Rubus (Martin 1986). V našich pokusech s praktickou detekcí dsRNA v matečných rostlinách jahodníku jsme narazili na problém nízké koncentrace virové RNA v rostlinách a rušivý vliv polysacharidů při její izolaci. To spolu s pracností izolace dsRNA omezuje pouţití metody pro rutinní detekci. S nástupem polymerázové řetězové reakce se význam této metody dále sníţil.

3.5.2. Molekulární hybridizace. Metoda vyuţívá schopnosti jednovláknové nukleové kyseliny vázat se na jiné vlákno s komplementární sekvencí nukleotidů. Nejčastěji pouţívanou hybridizační metodou pro detekci fytovirů je dot blot hybridizace. Principem metody je navázání (imobilizace) virové nukleové kyseliny na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu a její detekce úsekem komplementární nukleové kyseliny, která je radioaktivně nebo neradioaktivně značena a kterou nazýváme sonda. Optimální délka sondy je 400-600 bází nukleotidů (Hull 1986). Při srovnání dot blot hybridizace s ELISA nitrocelulózová membrána nahrazuje polystyrenovou destičku s jamkami, na níţ se přímo váţe virus a značená sonda nahrazuje protilátku značenou enzymem. Jestliţe v ELISE detekujeme protilátkami virový protein pak dot blot hybridizací detekujeme sondou nukleovou kyselinu viru. Příprava a značení sond. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů 30

Připravit a označit sondu lze řadou postupů, z nichţ nejvíce pouţívané jsou: 1. Reverzní transkripce. Virová RNA je přepisována do komplementární DNA (cDNA) pomocí reverzní transkriptázy. V průběhu přepisování je nově syntetizované vlákno radioaktivně nebo neradioaktivně značeno. Vzniká značená ssDNA. 2. Klonování úseku DNA. Dvouvláknová cDNA je začleněna do bakteriálního plasmidu a v něm udrţována a mnoţena. DsDNA můţe být značena po celé své délce, nebo jen na koncích. Před pouţitím je třeba sondu denaturovat. 3. Metoda polymerázové řetězové reakce. Sonda se značí v průběhu amplifikace. Sondy lze připravit jako velmi specifické (rozlišují kmeny virů) nebo naopak při vyuţití konzervativní sekvence, která je identická pro viry jednoho rodu, připravíme skupinovou sondu. Sondy lze značit radioaktivně, nečastěji izotopem 32P. Jeho výhodou je velmi silný signál u pozitivních reakcí, nevýhodou je krátký poločas rozpadu izotopu. Diagnostické laboratoře rovněţ nejsou běţně vybaveny pro práci s radioaktivními izotopy. Proto se stále častěji vyuţívá značení neradioaktivní. Nejlepší a nejuţívanější neradioaktivní metodou je v současné době značení digoxigeninem, při pouţití souprav (kitů) pro přípravu sondy (DIG DNA labeling kit) a vlastní hybridizaci (DIG nucleic acid detection kit), vyvinutých firmou Boehringer (obr.9.). Základní kroky při dot blot hybridizaci: 1. Pipetování vzorků izolované nukleové kyseliny nebo šťávy z testovaných rostlin na nylonovou membránu napuštěnou pufrem a umístěnou v bloku blotovacího zařízení (blotter). Odsátí přebytečného pufru. 2. Fixace vzorků na membráně 30 minut při 120 o C v peci. 3. Prehybridizace vzorků v hybridizačním pufru 1 hodinu při 68 o C. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů 31

4. Hybridizace nukleové kyseliny se sondou, nejméně 6 hodin. 5. Vymývání nenavázané sondy. 6. Navázání konjugátu (protilátka proti digoxigeninu konjugovaná s alkalickou fosfatázou). 7. Vymývání nenavázaného konjugátu a stabilizace membrány. 8. Inkubace v roztoku substrátu (5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfát (BCIP) a nitroblue tetrazolem (NBT), které po odštěpení fosfátu enzymem vytváří nerozpustný modrý precipitát. 9. Vyhodnocení zbarvení. Obr. 9. Schéma dot blot hybridizace se sondou značenou digoxygeninem. Originál Boehringer, upraveno.


Metodu lze provádět i s minimálním laboratorním vybavením, pro sériová stanovení je vhodné mít blotovací zařízení, UV crosslinker nebo hybridizační pec. Citlivost metody je srovnatelná nebo vyšší neţ u ELISA, nevýhodou jsou vyšší náklady na chemikálie (kity), které však na druhé straně zajišťují standardizaci metody. Náklady na přístrojové vybavení jsou srovnatelné, expeditivnost metody je niţší. Jak jiţ bylo uvedeno, metoda nalézá uplatnění především tam, kde nelze uţít ELISA. Je standardní (nikoliv experimentální) metodou diagnostických laboratoří v řadě zemí. V posledních letech jsou vyvíjeny detekční metody na bázi mikrohybriidizace tzv. microarrays nukleových kyselin i proteinů viz např. http://www.cost853.ch/ , které umoţňují simultánní detekci řady patogenů. Největším problémem zde však zůstává izolace nukleových kyselin (RNA a DNA) z rozdílných částí rostlin. 3.5.3. Polymerázová řetězová reakce (PCR). Vyuţití metody PCR, vyvinuté Saikim et al. (1988), v diagnostice rostlinných virů je stejným kvalitativním skokem jako aplikace ELISA v 70. letech. Principem metody je exponenciální namnoţení (amplifikace) určitých úseků (sekvencí) DNA in vitro (Henson a French 1993). Základními kroky metody jsou: a) denaturace cílové DNA (RNA) do formy jednoho vlákna b) připojení (annealing) dvou primerů

(synteticky připravených oligonukleotidů -

krátkých úseků DNA) k cílové molekule DNA (RNA) c) syntéza úseku DNA vymezeného primery pomocí termostabilní DNA polymerázy. Specifičnost metody je určována sekvencí primerů, které se párují s cílovou nukleovou kyselinou a určují konce sekvence, která má být amplifikována. Reakční směs se skládá ze vzorku šťávy, která obsahuje (nebo neobsahuje) cílovou molekulu nukleové kyseliny patogena, tlumivého roztoku, vody, solí, deoxyribonukleotidů (dNTPs), primerů a DNA polymerázy v amplifikační zkumavce. Celkový objem reakce je pouze 20 l. V prvním kroku dochází k tepelné denaturaci nukleové kyseliny při vysoké teplotě (melting temperature) (obr.10.). Při amplifikaci se pouţívá speciální polymeráza izolovaná z EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů 33

bakterie Thermus aquaticus (Taq), která je stabilní i při teplotě přes 90oC, nezbytné pro denaturaci (oddělení vláken) nově syntetizované dvouvláknové DNA. Ve druhém kroku je teplota sníţena na optimální pro spárování primerů s nukleovou kyselinou (annealing temperature). Její výše závisí na nukleotidovém sloţení primerů. Ve třetím kroku následuje zvýšení teploty na optimum pro syntézu DNA polymerázou. Celý proces vyţaduje přesné dodrţení teplotních a časových intervalů. Provádí se proto ve speciálním přístroji, který rychle a přesně mění teplotu reakční směsi ve zkumavce (termocykler). Cyklus se opakuje asi 30 krát. Namnoţená DNA je pak vyhodnocena elektroforézou v agarózovém gelu. Přítomnost prouţku odpovídající molekulové hmotnosti amplifikovaného úseku signalizuje přítomnost viru. I kdyţ je moţné amplifikovat i úseky DNA dlouhé několik tisíc párů bází, optimální pro diagnostiku fytovirů je rozmezí 200-800 párů bází. Obr. 10. Schematické znázornění polymerázové řetězové reakce. Orig. Alberts et al., 1998


Předností metody je výjimečná citlivost. Teoreticky je moţné detekovat jednu cílovou molekulu (virovou částici) v rostlinné šťávě. Podle toho, jak jsou navrţeny primery, lze metodu vyuţít k detekcí úzkého (kmen) nebo naopak širokého spektra virů (rod Potyvirus), či jednoho viru ve směsi několika virů. Pro detekci fytovirů s genomovou RNA, jichţ je většina, poprvé metodu pouţili Vunsh et al. (1990). U RNA virů je nezbytné před vlastní amplifikační reakcí provést syntézu komplementárního vlákna DNA reverzní transkriptázou (reverse transcription - polymerase chain reaction, RT-PCR). Původně se pouţívaly speciální enzymy, v současné době existují polymerázy, např. z Thermus thermophilus (Tth polymeráza), které mohou v rozdílných reakčních podmínkách plnit obě funkce. Dostupné jsou také kity pro izolaci nukleových kyselin, jejich reverzní transkripci a amplifikaci. Od počátku 90. let metoda doznala širokého uplatnění nejen v rostlinné virologii. Díky širokému pouţití v molekulární biologii a v humánní i veterinární medicíně velice rychle klesla cena termocyklerů (dnes na 50-60 000 Kč), polymerázy a dalších reagencií. Nezbytné primery syntetizují firmy na zakázku během několika dnů. Jsou dostupné i soupravy pro rychlou izolaci a amplifikaci RNA, čímţ se metoda dále standardizuje. Tím se cena jednoho testu dostala na úroveň srovnatelnou s ELISA, přitom její citlivost je řádově vyšší. Další výhodou PCR je moţnost vyuţít amplifikované úseky DNA jako sond, jak bylo uvedeno v předchozí kapitole. Z popisu metody je zřejmé, ţe návrh primerů velmi ovlivňuje citlivost a specifičnost detekce. Primery o délce 18-30 nukleotidů se navrhují na základě znalosti sekvence nukleové kyseliny patogenů, pomocí speciálních počítačových programů. Sekvence nukleových kyselin jednotlivých rostlinných virů je moţné získat z mezinárodních databází (EMBL) pomocí Internetu. Protoţe v současnosti jsou známy částečné nebo kompletní sekvence mnoha fytovirů, lze návrh primerů provést velmi rychle. V mnoha případech lze vyuţít jiţ vyzkoušené primery, jejichţ pouţití bylo publikováno v odborné literatuře. PCR se v sériové diagnostice uplatní v případech, kdy není moţné pouţít ELISA. Například proto, ţe proti některému viru dosud nebyly připraveny protilátky. Protoţe PCR je citlivější metodou neţ ELISA, je výhodné ji pouţít při testování ozdravené sadby. Vzhledem EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů 35

k vysoké citlivosti a minimální potřebě rostlinného materiálu pro vzorek, lze testovat rostlinky odvozené z meristémů podstatně dříve neţ při ELISE. Jestliţe testujeme matečné rostliny, například chmelu, je výhodné pouţít ELISA a pouze rostliny, které se jeví jako zdravé, podrobit dodatečně citlivějšímu testu PCR (Petrzik a Svoboda 1997). Přitom lze navíc vyuţít specifické IgG proti viru pro tzv. immunocapture PCR (imunopoutání, imunovázání) (Wetzel et al. 1992). Immunocapture PCR Při této modifikaci PCR se nejprve na stěny mikrozkumavky naváţí IgG (podobně jako v ELISA), následně se pipetuje šťáva z testovaných rostlin a po vymytí se do stejných zkumavek pipetuje reakční směs pro PCR se specifickými primery. Výhodou této metody je zvýšená citlivost a specifičnost a u některých virů odpadá nutnost izolace nukleové kyseliny viru. Přestoţe vyhodnocení produktu reakce PCR není obtíţné ani přístrojově náročné, komplikuje moţnost pouţití PCR pro sériová stanovení. Zatímco termocyklery jsou konstruovány k provedení 96 reakcí (počet reakcí na destičce pro ELISA), nanesení obsahu zkumavek na gel je poměrně pracné. Proto jsou vyvíjeny metody, které umoţňují provést například immunocapture PCR reakci v termocykleru v destičce pro ELISA (Nolasco et al. 1993) a následně amplifikovanou DNA detekovat hybridizací s digoxigeninem značenou sodou a vyhodnotit

barevnou reakci

(Rowhani et al., 1997). V diagnostických laboratořích se PCR uplatní proto, ţe umoţňuje i detekci viroidů a fytoplazem, jejichţ význam roste. Navíc podobně jako ELISA ji lze vyuţít i k detekci fytopatogenních hub a bakterií. PCR lze tedy hodnotit jako objektivní metodu, citlivější neţ ELISA (obr.11.), dostatečně expeditivní pro rutinní vyuţití v diagnostických laboratořích, i kdyţ v tomto ohledu za ELISA dosud zaostávající.


4.0. Uchovávání standardů. Uchovávání standardů, pozitivních virem infikovaných kontrol i zdravých rostlin odvozených z meristémů, je v diagnostice rostlinných patogenů velmi významné. Představují nejen srovnávací materiál, ale mohou i sníţit náklady na provedení testů. Nejčastější a nejjednodušší je vysušení listů rostlin nad chloridem vápenatým v uzavřené zkumavce. Pečlivě označené zkumavky uchováváme v chladicím boxu. Tato metoda je vhodná především pro viry mechanicky přenosné, stabilní s vysokou koncentrací virionů v rostlinných pletivech. Například virus ţluté mozaiky vodnice byl infekční po 20 letech konzervace. Méně stabilní viry (rod Potyvirus) je vhodné kaţdoročně znovu naočkovat na rostliny a následně připravit nové „konzervy“. Tím se však zvyšuje riziko kontaminace nebo mutace viru. Lyofilizace (vysušení sublimací) a zatavení vysušených vzorků do skleněných ampulek je metoda uţívaná v mnoha laboratořích, kde je dostupný lyofilizační přístroj. Podstatně prodluţuje moţnost uchování vzorků virů. Ampulky ukládáme většinou do mrazícího boxu při 20 o C. Uchování zdravých a infikovaných rostlin v tkáňových kulturách je velmi efektivní metodou pro uchování obtíţně mechanicky přenosných virů dřevin a drobného ovoce nebo těch, které nejsou mechanicky přenosné (rod Luteovirus). Laboratoře, které provádějí ozdravení vegetativně mnoţených plodin tkáňovými kulturami, mají vyzkoušená vhodná agarová média i způsob uchování rostlin v boxech.


5.0. Odběr, uchování a přeprava vzorků. Správně provedený odběr, uchovávání a přeprava vzorků nemocných rostlin je důleţitým předpokladem pro úspěšnou identifikaci původce choroby. U bylinných hostitelů je ideální odebrat celou rostlinu včetně kořenů. Vzorky uchováváme v chladícím boxu (nemrazíme!). Důleţitá je i průvodní dokumentace - údaje o lokalitě, odrůdě, provedených agrotechnických zásazích, postřicích apod. a označení místa (například řádku, keře, stromu), pro případné opakování odběrů. Pro přepravu je vhodné rostliny zabalit do vlhkého filtračního papíru, mikrotenu a zvolit co nejrychlejší způsob přepravy do diagnostické laboratoře (například EMS aj.). Je také velmi vhodné laboratoř předem upozornit na odeslání vzorků. Jejich dobrý stav podstatně zvyšuje úspěšnost přenosu viru mechanickou inokulací nebo roubováním na indikátorové rostliny, ale i provedení elektronmikroskopických, imunologických a molekulárně biologických testů.


6.0. Legislativa, organizace a perspektivy fytodiagnostiky v ČR a EU. Laboratorní diagnostika je dním z klíčových článků rostlinolékařské péče v ČR. Nedostatečný rozsah a zaostávání v kvalitě diagnostických sluţeb má za následek, ţe nejsme s to se účinně bránit zavlékání nebezpečných karanténních organismů rostlin a jejich šíření na území státu. Jsme v nevýhodě, máme-li vyvracet podezření, ţe rostlinný materiál exportovaný z území ČR je infikován škodlivými patogeny rostlin. Zákazy vývozu některých komodit mohou být případem skrytého antiimportního opatření. EU poţaduje nejen sjednocení legislativy, ale i vybudování specializovaných laboratoří nezbytných pro státní a mezinárodní kontrolu dodrţování právních předpisů a mezinárodních smluv. Platná legislativa je dostupná na http://eagri.cz/public/web/srs/portal/ Základním právním dokumentem, kterým je vytvořeno institucionální postavení a obsah činnosti Státní rostlinolékařské správy je zákon č. 326/2004 Sb., o rostlinolékařské péči a o změně některých souvisejících zákonů, ve znění zákona č. 626/2004 Sb., zákona č. 444/2005 Sb., zákona č. 131/2006 Sb., zákona č. 189/2008 Sb., zákona č. 249/2008 Sb., zákona č. 227/2009 Sb., zákona č. 281/2009 Sb., zákona č. 291/2009 Sb., zákona č. 490/2009 Sb. a zákona č. 102/2010 Sb.. Státní rostlinolékařská správa je správním úřadem rostlinolékařské péče, který působí zejména v oblastech ochrany rostlin a rostlinných produktů proti škodlivým organizmům, ochrany proti zavlékání organizmů škodlivých rostlinám a rostlinným produktům do České republiky, registrace přípravků na ochranu rostlin a mechanizačních prostředků na ochranu rostlin. Zákon byl zpracován s ohledem na skutečnost přistoupení České republiky do Evropské unie tzn., ţe z důvodu společného právního prostředí byly do zákona a příslušných vyhlášek transponovány právní akty Evropských společenství v oblasti rostlinolékařské péče. Základními prováděcími vyhláškami zákona 326/2004 Sb. upravující především problematiku, která je z hlediska dodrţování zákona velmi závaţná a je proto nezbytné podrobněji stanovit postupy a způsoby dodrţování příslušných ustanovení zákona jsou: EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů 39

 Vyhláška č. 327/2004 Sb., o ochraně včel, zvěře, vodních organismů a dalších

necílových organismů při pouţívání přípravků na ochranu rostlin.  Vyhláška č. 328/2004 Sb., o evidenci výskytu a hubení škodlivých organismů

ve skladech rostlinných produktů a o způsobech zjišťování a regulace jejich výskytu v zemědělských veřejných skladech a skladech Státního zemědělského intervenčního fondu.  Vyhláška č. 329/2004 Sb., o přípravcích a dalších prostředcích na ochranu

rostlin, ve znění vyhlášky č. 371/2006 a vyhlášky č. 146/2009 Sb.  Vyhláška č. 331/2004 Sb., o opatřeních k zabezpečení ochrany proti zavlékání

a šíření původce bakteriální krouţkovitosti bramboru a původce bakteriální hnědé hniloby, ve znění vyhlášky č. 328/2008 Sb.  Vyhláška č. 332/2004 Sb., o opatřeních k zabezpečení ochrany proti zavlékání

a šíření původce rakoviny bramboru, háďátka bramborového a háďátka naţloutlého, ve znění vyhlášky č. 75/2010 Sb.  Vyhláška č. 333/2004 Sb., o odborné způsobilosti na úseku rostlinolékařské

péče.  Vyhláška č. 334/2004 Sb., o mechanizačních prostředcích na ochranu rostlin,

ve znění vyhlášky č. 147/2009 Sb.  Vyhláška č. 175/2005 Sb., o náhradách nákladů za odborné úkony provedené

Státní rostlinolékařskou správou.  Vyhláška č. 215/2008 Sb., o optřeních proti zavlékání a rozšiřování

škodlivých organismů rostlin a rostlinných produktů, ve znění vyhlášky č. 159/2009 Sb. a vyhlášky č. 76/2010 Sb. Vzhledem ke změnám a vzniku nových právních předpisů Evropské unie jsou vydávány nové vnitrostátní právní normy nebo dochází aktuálně k novelizacím výše uvedených příslušných právních předpisů. Vyhláška č. 83/1997 Sb., obsahuje v souladu s předpisy EU více neţ 200 karanténních škodlivých organismů, jejichţ diagnostiku je potřeba zajistit personálně a materiálně na poţadované mezinárodní úrovni. V mnoha případech jde o druhy nové, s nimiţ nejsou u nás praktické zkušenosti včetně údajů o jejich moţném výskytu na území republiky. Hlavní EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů 40

příčinou je sloţitost diagnostiky většiny karanténních organismů, zejména virů, viroidů a fytoplazem, ale i bakterií a hub. Ta vyţaduje nejen finančně náročné přístrojové vybavení, ale zejména vysokou odbornou kvalifikaci pracovníků, srovnatelné s úrovní poţadovanou ve veterinární oblasti. Důvodem jsou především poţadavky na průkaznost a srovnatelnost výsledků, které mohou zajistit jen standardizované diagnostické metody např. ELISA. Poţadavky evropské unie nejsou malé, na druhé straně je moţné vyuţít její pomoci ve formě vědeckovýzkumných programů např. COST, rámcových programů např. 7th Framework Program EU projekt QBOL (Vývoj nového diagnostického nástroje s pouţitím DNA "barcoding" pro identifikaci karátnénních organizmů rostlin), .které umoţňují spolupráci v rámci existujících sítí pracovišť a přesun nových technologií. V rámci výzkumných programů např. EUPHRESCO http://www.euphresco.org/ byly organizovány tzv. ring testy pro jednotlivé patogeny, při nichţ jsou porovnávány a vyvíjeny diagnostické metody, které jsou posléze standardy členských a přidruţených zemí EU. EUPHRESCO cílí na zvýšení spolupráce a koordinace národních programů ochrany rostlin na úrovni EU vytvořením sítě výzkumných aktivit a vzájemného otvírání národních programů pro zahraniční partnery. EUPHRESCO vytvořilo partnerství 24 organizací fytosanitárního výzkumu v 17 zemích EU. Cílem je bránit zavlékání a šíření nových ekonomicky i pro ţivotní prostředí škodlivých chorob a škůdců, zejména exotických, jejichţ počet trvale narůstá jako důsledek expanze globálního obchodu s rostlinným materiálem. Jestliţe dnes není problém vybavit laboratoř přístroji během několika měsíců, daleko obtíţnější je vychovat specialisty nejen odborně, ale i jazykově zdatné, neboť fytokaranténa je věcí mezinárodní. Je tedy nutné věnovat soustavnou pozornost výchově a vzdělávání rostlinolékařů. Velmi důleţité je i formulování priorit v oblasti vývoje diagnostických metod zejména pro karanténní organismy. V zahraniční je běţným jevem vypisování grantových soutěţí na řešení závaţných úkolů příslušným ministerstvem. To umoţňuje i vznik meziresortních výzkumných týmů, schopných řešit daný problém v co nejkratší době.Je třeba pracovat na obnovení komunikace mezi výrobci, šlechtiteli, orgány SRS, ÚKZÚZ, univerzitami i vědeckovýzkumnými pracovišti v zájmu řešení problémů a zlepšení kvality rostlinolékařské péče. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů 41

7.0. Seznam literatury Alberts B. et al., Základy buněčné biologie, Espero publishing, ští nad labem 1998, 630 s. Albrechtová L. Stanovení rostlinných virů dvojitou sendvičovou metodou ELISA s IgG značenými alkalickou fosfatázou. In: Sborník referátů „Praktická diagnostika rostlinných virů ELISA testem“, ČSVTS - VÚRV, Praha, 1986, 44 s. Bojňanský a kol.: Vírusové choroby rastlín. SVPL, Bratislava, 1963, 540 s. Bos L.: Plant viruses, unique and intriguing pathogens – a textbook of plant virology. Backhuys Publishers Leiden. 1999. 358 s. Brčák J.: Rostlinné viry. In: Urban Z.: Základy fytopatologie. Státní pedagogické nakladatelství, Praha, 1983, s. 32-52. Brunt A.A., Crabtree K., Dallwitz M.J., Gibbs A.J., Watson L. (eds.): Viruses of Plants. CAB International, Wallingford, U.K., 1996, 1484 s. Clark M.F., Adams A.N.: Characteristics of the microplate methods of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. gen. Virol. 34:476-483, 1977. Gallo J., Dědič P.: Vyuţitie niektorych modifikácií nepriameho ELISA na detekciu rastlinných vírusov. In: Sborník referátů „Praktická diagnostika rostlinných virů ELISA testem“, ČSVTS - VÚRV, Praha, 1986, 44 s. Henson J.M., Frenbch R.: The polymerase chain reaction and plant disease diagnosis. Annu. Rev. Phytopathol. 31:81-109, 1993. Hull R.: The potential for using dot-blot hybridisation in the detection of plant viruses. In: Jones R.A.C., Torrance L. (eds.): Developments and application in virus testing. Association of Applied Biologists, Wellesbourne, U.K., 1986, s. 3-12. Hull, R. Comparative Plant Virology 2nd edition Academic Press. 2009, 376 s. Huttinga H.: Sensitivity of indexing procedures for viruses and viroids. Advances in Botanical Research 23:59-71, 1996. Jermoljev E., Pozděna J.: Sérologie rostlinných patogenů. Academia, Praha, 1972, 264 s. Kohler G., Milstein C.: Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predetermined specificity. Nature 256:495-497, 1975. Kůdela V. a kol.: Obecná fytopatologie. Academia, Praha, 1989, 388 s. Martin R.: Use of double-stranded RNA for detection and identification of virus diseases of Rubus species. Acta Hortic. 186:51-62, 1986. Matthews R.E.F.: Plant Virology. 3rd edition. Academic Press, London 1991, 835 s. Milne R.G.: New developments in electron microscope serology and their possible applications. In: Jones R.A.C., Torrance L. (eds.): Developments and application in virus testing. Association of Applied Biologists, Wellesbourne, U.K., 1986, s.179-192. Murphy F.A., Faquet C.M., Bishop D.H.L., Ghabrial S.A., Jarvis, A.W., Martelli, G.P., Mayo M.A., Summers M.D. (eds.): Virus Taxonomy. Springer Verlag Wien, 1993. 586 s. Musil M., Kvíčala A., Lešková 0.: Diagnostika vírusov strukovín a datelinovín. Veda, SAV, Bratislava, 1981, 175 s. Nolasco G., de Blas C., Torres V., Ponz F.: A method combinig immunocapture and PCR amplification in a microtiter plate for the detection of plant viruses and subviral pathogens. J. Virol. Methods 45:201-218, 1993. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů J. Špak - Diagnostika rostlinných virů 42

Ouchterlony 0.: Diffusion in gel methods for immunological analysis. Progr. allergy 5:1-78, 1958. Petrzik K., Svoboda P.: Screning of apple mosaic virus in hop cultivars in the Czech Republic by reverse transcription-polymerase chain reaction. Acta Virologica 41:101-103, 1997. Roberts I.M.: Practical aspects of handling, preparing and staining samples containing plant virus particles for electron microscopy. In: Jones R.A.C., Torrance L. (eds.): Developments and application in virus testing. Association of Applied Biologists, Wellesbourne, U.K., 1986, s. 213-246. Rowhani A., Biardi L., Golino D.A.: Detection of viruses of woody host plants using colorimetric PCR. Proc. 17. Internat. Symp. on Virus and Virus-like Diseases of Temperate Fruit Crops, Bethesda, USA, 1997, s. 66. Saiki R.K., Gelfand G.H., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., Horn G.: Primer directed enzymatic amplification of DNA with a termostable DNA polymerase. Science 239:487491, 1988. Smith I.M., McNamara D.G., Scott P.R., Holderness M., Burger B.: Quarantine Pests for Europe. CAB International, Wallingford, 1997, 1165 s. Sutula Ch.L., Gillet, J.M., Morrisey S.M., Ramsdell D.C.: Interpreting ELISA data and establishing the positive-negative threshold. Plant Disease 70:722-726, 1986. Valverde R.A., Nameth S.T., Jordan R.L.: Analysis of double-stranded RNA for plant virus diagnosis. Plant Disease 74:255-258, 1990. Van Lent J.W.M., Verduin B.J.M.: Detection of viral protein and particles in thin sections of infected plant tissue using immunogold labelling. In: Jones R.A.C., Torrance L. (eds.): Developments and application in virus testing. Association of Applied Biologists, Wellesbourne, U.K., 1986, s. 193-212. Van Regenmortel M.H.V.: The potential for using monoclonal antibodies in the detection of plant viruses. In: Jones R.A.C., Torrance L. (eds.): Developments and application in virus testing. Association of Applied Biologists, Wellesbourne, U.K., 1986, s. 89-102. Vunsh R., Rosner., Stein A.: The use of polymeras chain reaction (PCT) for the detection of bean yellow mosaic in gladiolus. Annals of Applied Biology 117:661-669, 1990. Walkey D.G.A.: Applied Plant Virology. 2nd edition. Chapman and Hall, London, 1991, 338 s. Wetzel T., Candresse T., Macquire G., Ravelonadro M., Dunez J.: A highly sensitive immunocapture polymerase chain reaction method for plum pox potyvirus detection. J. Virol. Methods 39:27-37. Zaitlin M., Hull R.: Plant-virus-host interactions. Annu. Rev. Plant Physiol. 38:291-315, 1987


Prof. Ing. Josef Špak, DrSc. DIAGNOSTIKA ROSTLINNÝCH VIRŮ

Recommend Documents