PRODUKSI BIOPLASTIK POLI-β-HIDROKSIBUTIRAT OLEH BAKTERI AMILOLITIK YANG DIISOLASI DARI TEPUNG SAGU BASAH MENGGUNAKAN BERBAGAI MACAM SUBSTRAT PATI Nur Arfa Yanti Jurusan Biologi, FMIPA Universitas Haluoleo e-mail :
[email protected] ABSTRAK Dua isolat bakteri amilolitik yang diisolasi dari tepung sagu basah diuji kemampuannya memproduksi bahan baku bioplastik poli-β-hidroksibutirat (PHB) dari berbagai macam substrat pati yaitu pati sagu, pati singkong, pati garut dan pati ganyong sebagai sumber karbon. Kedua isolat bakteri amilolitik diidentifikasi berdasarkan karakteristik morfologi, kultural dan biokimianya. Produksi PHB dilakukan menggunakan media sintetik (media Ramsay) dengan berbagai macam pati sebagai sumber karbon. Ekstraksi PHB dilakukan menggunakan metode nhexan-aceton-dietil eter. Kadar PHB dideterminasi menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 235 nm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kedua isolat bakteri amilolitik diidentifikasi sebagai anggota genus Bacillus yaitu Bacillus sp. PSA10 dan Bacillus sp. PPK5. Produksi PHB dari Bacillus sp. PSA10 pada berbagai macam pati (pati sagu, pati singkong, pati garut dan pati ganyong) berkisar antara 21-56 % (g PHB/g berat kering sel) sedangkan Bacillus sp. PPK5 berkisar antara 11-24 % (g PHB/g berat kering sel). Produksi PHB tertinggi oleh kedua isolat bakteri amilolitik diperoleh dari substrat pati sagu yaitu Bacillus sp. PSA10 sebanyak 56,49 % sedangkan Bacillus sp. PPK5 sebanyak 24,07 %. Dengan demikian, pati sagu merupakan substrat pati yang potensial digunakan sebagai sumber karbon murah untuk produksi PHB terutama oleh Bacillus sp. PSA10. Kata kunci : Bioplastik, PHB, Bakteri amilolitik, substrat pati, pati sagu
Pendahuluan Poli-β-hidroksibutirat (PHB) adalah polimer yang diakumulasi secara intraselular oleh mikrobia sebagai granula cadangan karbon dan energi (Anderson & Dawes, 1990). Polimer ini bersifat termostabil, dapat didegradasi secara biologis (biodegradable) dan memiliki sifat yang hampir sama dengan plastik sintetik yaitu polipropilen (Chen, 2003) sehingga berpotensi sebagai pengganti plastik sintetik yang sulit didegradasi (undegradable) (Anderson & Dawes, 1990). Kendala utama dalam pengembangan bioplastik dari PHB adalah harganya yang jauh lebih mahal dibandingkan plastik sintetik karena biaya produksi yang tinggi. Sebagai perbandingan produk Biopol (nama dagang bioplastik) seharga US 16 dolar/kg padahal harga plastik polipropilen kurang lebih US 1 dolar/kg (Lee, 1996). Salah satu upaya yang dapat dilakukan untuk menurunkan biaya produksi PHB adalah penggunaan sumber karbon murah (Kim, 2000) karena biaya produksi PHB yang tertinggi berasal dari substrat yaitu 40 % dari total biaya produksi (Lee, 1996). Pati merupakan salah satu sumber karbon alternatif untuk produksi PHB yang digunakan sebagai pengganti glukosa karena harganya relatif lebih murah (Kim, 2000; Halami, 2008; Ramadas et al., 2009). Kendala penggunaan pati sebagai substrat untuk produksi PHB adalah pati harus dihidrolisis terlebih dahulu menjadi glukosa sehingga dibutuhkan bakteri yang memiliki enzim penghidrolisis pati (amilolitik). Pemanfaatan bakteri yang memiliki kemampuan ganda yaitu bersifat amilolitik sekaligus mampu mengakumulasi PHB merupakan solusi tepat untuk memproduksi PHB dengan substrat yang komponen utamanya pati. Beberapa jenis pati yang dapat ditemukan di Indonesia seperti pati sagu, pati singkong, pati ganyong dan pati garut berpotensi digunakan sebagai substrat alternatif untuk produksi PHB. Pemanfaatan pati sebagai substrat untuk produksi PHB diharapkan mampu menurunkan biaya produksi PHB sekaligus memberikan nilai tambah bagi pati-pati tersebut. Oleh karena itu, pada penelitian ini dikaji kemampuan bakteri amilolitik indigenous dalam memproduksi PHB menggunakan beberapa jenis pati sebagai substratnya.
METODE, ALAT DAN BAHAN Bahan dan Alat Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah strain Bacillus sp. PSA10 dan Bacillus sp. PPK5 yang diisolasi dari tepung sagu basah. Pati yang digunakan sebagai substrat
untuk produksi PHB adalah pati sagu, pati singkong, pati garut dan pati ganyong. Bahan kimia yang digunakan meliputi seperangkat bahan untuk karakterisasi bakteri, seperangkat bahan untuk ekstraksi PHB yang meliputi, N-hexana, dietil eter, aseton, etanol, sodium hipoklorit, asam sulfat pekat dan bahan kimia untuk media Ramsay yaitu (NH 4 ) 2 SO 4 , Na 2 HPO 4 . 7H 2 O, KH 2 PO 4 , MgSO 4. 7H 2 O, Ferrous Amonium Citrate,
CaCl 2 .2H 2 O. Alat-alat yang digunakan dalam
penelitian ini meliputi laminar air-flow, autoklaf, spektrofotometer UV, mikroskop, inkubator shaker, sentrifuse, oven dan water bath. Karakterisasi dan Identifikasi bakteri Amilolitik Isolat bakteri diidentifikasi berdasarkan karakteristik fenotipik meliputi karakteristik morfologi, kultural dan biokimia. Karakter morfologi yang dideterminasi meliputi bentuk sel, reaksi Gram, pembentukan endospora dan motilitas. Karakter kultural meliputi morfologi koloni, pertumbuhan pada pH, suhu dan keberadaan NaCl. Karakter biokimia meliputi produksi katalase, pertumbuhan anaerobik, reduksi nitrat, hidrolisis pati, hidrolisis gelatin, tween 80, uji Methyl Red and Voges-Proskauer, penggunaan sitrat dan fermentasi berbagai macam gula. Produksi PHB dan Analisis Kuantitatif PHB Produksi PHB dilakukan dengan menumbuhkan isolat bakteri
pada medium minimal
Ramsay (Ramsay et al., 1990) dengan menggunakan sumber karbon berbagai jenis pati yaitu pati sagu, pati singkong, pati garut dan pati ganyong sebanyak 1 % (b/v). Kultur diinkubasi pada penggojog dengan kecepatan 125 rpm, pada suhu 30oC selama 72 jam (Yanti dkk., 2009a). Sel bakteri dipanen dengan sentrifugasi kultur cair pada kecepatan 3000 rpm selama 20 menit. PHB diekstraksi dari massa sel (pelet) yang dipecah menggunakan larutan sodium hipoklorit 5% selama 24 jam. Ekstraksi PHB dilakukan menggunakan metode n-hexan-aceton-dietil eter (Senior dkk., 1972). Kadar PHB dideterminasi menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 235 nm dengan pelarut asam sulfat pekat.
Hasil dan Pembahasan Identifikasi Bakteri Amilolitik Indigenous Identifikasi bakteri amilolitik indigenous dilakukan berdasarkan karakter fenotipik yang meliputi karakter morfologi, kultural dan biokimia. Karakter fenotipik dari kedua isolat bakteri amilolitik dan karakter genus Bacillus yang digunakan sebagai acuan disajikan pada Tabel 1. Hasil penelitian pada Tabel 1 menunjukkan bahwa kedua isolat bakteri mempunyai sel berbentuk
batang, Gram positif, membentuk spora, katalase positif dan motil. Karakter-karakter ini sesuai dengan karakter kunci dari genus Bacillus (Holt et al., 1994; Apun et al., 2000; Yanti et al., 2009b). Dengan demikian, kedua isolat bakteri amilolitik indigenous merupakan anggota genus Bacillus. Beberapa anggota genus Bacillus dilaporkan memiliki kemampuan memproduksi PHB dari berbagai macam substrat (Yilmaz et al., 2005; Valappil et al., 2007). PHB yang dihasilkan oleh bakteri Gram positif seperti Bacillus sangat berpotensi digunakan sebagai bahan baku untuk peralatan medis (Valappil et al., 2007). Menurut Valappil et al. (2007), penggunaan bakteri Gram positif sebagai penghasil PHB untuk keperluan medis memiliki kelebihan dibandingkan dengan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram negatif mempunyai lipopolisakarida (LPS) pada dinding selnya yang dapat menyebabkan reaksi imunogenik sementara bakteri Gram positif tidak mempunyai LPS. Dengan demikian, isolat PSA10 dan isolat PPK5 yang merupakan bakteri Gram positif sangat berpotensi dimanfaatkan sebagai penghasil PHB untuk keperluan medis. Tabel 1. Karakteristik Fenotipik Isolat bakteri amilolitik indigenous dan genus Bacillus Karakter Morfologi Bentuk sel Ukuran sel (µm) Motilitas Endospora Reaksi Gram Kultural Bentuk koloni Tumbuh pada Nutrient Broth pH 5,0-7,0 Tumbuh dengan adanya NaCl 2,0-5,0 % Tumbuh pada suhu 50oC Biokimia Katalase Reduksi Nitrat Methyl red Voges-proskauer Hidrolisis Kasein Hidrolisis Gelatin Hidrolisis Tween 80 Hidrolisis Pati Akumulasi PHB Pembentukan asam dari : Glukose, Sukrosa, Maltosa Dextrosa, Xylosa, Mannitol, Galactosa, L-Arabinosa Produksi Gas dari glukosa
PSA10
PPK5
Bacillus
Batang 1,5 x 5-10
Batang 0,8 x 3-4
+ + Positif
+ + Positif
Batang 0,5 x 1,2 (kecil) 2,5 -10 (besar) + + Positif
Sirkuler + + +
Sirkuler + + +
Variable + + +/-
+ + + + + +
+ + + + + + +
+ +/+/+/+/+ +/+/-
+ +
+ +
+ +/-
-
-
+/-
+ reaksi positif atau ada pertumbuhan; - reaksi negatif atau tidak ada pertumbuhan
Produksi PHB dari berbagai Substrat Pati Sumber karbon merupakan salah satu komponen yang paling penting dalam media produksi PHB, karena komponen sel mikrobia sebagian besar terdiri atas unsur-unsur karbon. Karbohidrat merupakan sumber karbon yang paling banyak digunakan dalam suatu proses fermentasi dan salah satunya adalah pati. Pemanfaatan pati sebagai substrat yang harganya relatif murah untuk memproduksi PHB merupakan salah satu upaya untuk mengembangkan PHB sebagai bahan baku bioplastik. Pati berpotensi digunakan sebagai substrat untuk memproduksi PHB karena memiliki karena pati mengandung kadar karbon (C) tinggi namun kadar nitrogen (N) dan fosfat (P) rendah. Menurut Anderson & Dawes (1990) secara umum, PHB akan disintesis dan diakumulasi oleh sel bakteri pada substrat yang mengandung kadar C tinggi sedangkan sumber N dan P terbatas. Oleh karena itu, pada penelitian ini dikaji kemampuan dua isolat bakteri amilolitik indigenous dalam memproduksi PHB menggunakan beberapa jenis pati yang banyak terdapat di Indonesia seperti pati sagu, singkong, garut dan ganyong. Produksi PHB oleh kedua isolat bakteri (Bacillus sp. PSA10 dan Bacillus sp. PPK5) pada 4 macam substrat pati ditampilkan pada Gambar 1. Kadar PHB yang diproduksi oleh Bacillus sp. PSA10 pada empat jenis pati dari yang terendah hingga tertinggi berturut-turut adalah sebagai berikut : pati singkong 21,48 %, pati ganyong 27,65 %, pati garut 36,92 % dan pati sagu 56,39 %. Kadar PHB yang diproduksi oleh Bacillus sp. PPK5 pada empat jenis pati dari yang terendah hingga tertinggi berturut-turut adalah sebagai berikut : pati singkong 11,20 %, pati ganyong 16.28%, pati garut 18,45 % dan pati sagu 24,07 %. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa produksi PHB tertinggi oleh kedua bakteri amilolitik diperoleh pada media yang menggunakan substrat pati sagu
sedangkan yang terendah diperoleh dari media pati singkong. Hal ini
mengindikasikan bahwa pati sagu merupakan substrat pati yang paling berpotensi digunakan sebagai substrat untuk memproduksi PHB oleh kedua bakteri amilolitik indigenous. Pertumbuhan kedua strain bakteri amilolitik pada 4 jenis pati yang dideterminasi dalam bentuk berat kering sel ditampilkan pada Tabel 2. Hasil penelitian pada Tabel 2 menunjukkan bahwa berat kering sel Bacillus sp. PSA10 dan Bacillus sp. PPK5 tertinggi diperoleh pada pati singkong berturut-turut yaitu 1,49 g/l dan 1,16 g/l dibandingkan ketiga jenis pati lainnya. Hal ini mengindikasikan bahwa pertumbuhan kedua strain bakteri amilolitik pada pati singkong paling baik.
60.00
56.39
Kadar PHB (%)
50.00 36.92
40.00 30.00
24.07
20.00
27.56
21.48
18.45
11.21
10.00
16.28
0.00 Pati Sagu
Pati Singkong
Pati Garut
Pati Ganyong
Substrat Pati Bacillus sp. PSA10
Bacillus sp. PPK5
Gambar 1. Produksi bioplastik PHB oleh Bacillus sp. PSA10 dan Bacillus sp. PPK5 dari berbagai substrat pati sebagai sumber karbon
Berat kering sel yang tinggi namun kadar PHB paling rendah dari kedua strain bakteri amilolitik pada substrat pati singkong (Tabel 2) menunjukkan bahwa pati singkong merupakan substrat yang lebih baik digunakan untuk pertumbuhan sel bakteri daripada untuk memproduksi PHB. Hal ini mungkin disebabkan karena adanya perbedaan komposisi nutrien terutama kadar protein dari keempat jenis pati. Kadar protein tertinggi terdapat pada pati singkong, yaitu 1,20 % (BSN, 1996) dibandingkan pati sagu (0,69 %) (Wina et al., 1996), pati ganyong (0,67 %) dan pati garut (0,50 %) (Perez & Lares, 2005).
Menurut Anderson dan Dawes (1990), PHB akan
diproduksi oleh bakteri pada saat kondisi media pertumbuhan mengalami ketidakseimbangan kadar substrat yaitu ketika kadar C berlebih sedangkan kadar nutrien lain seperti N, P atau K terbatas. Pada kondisi pertumbuhan yang tidak seimbang (sumber C berlebih tetapi nutrisi lain terbatas), aktivitas NADH oksidase dalam siklus Krebs menurun sehingga meningkatkan jumlah NADH. Peningkatan NADH akan menghambat aktivitas sitrat sintase sehingga asetil-CoA dan oksaloasetat (OAA) tidak diubah menjadi sitrat dan CoA bebas. Hal ini menyebabkan hilangnya penghambatan asetil-CoA asetiltransferase (β-Ketotiolase) oleh CoA bebas sehingga terjadi reaksi kondensasi asetil-CoA menjadi asetoasetil-CoA yang merupakan senyawa awal terjadinya polimerisasi PHB (Braunegg et al., 1998).
Tabel 2. Berat kering sel, konsentrasi PHB dan kadar PHB yang diperoleh dari 4 macam substrat pati yang berbeda pada skala erlenmeyer setelah 72 jam inkubasi. ISOLAT
Pati sagu 1,33 0,74 56.39 1,08 0.26 24,07
Substrat Pati Pati singkong Pati garut 1,49 1,30 0,26 0,48 21,48 36,92 1,16 1,03 0.088 0,19 11,21 18,45
BKSa (g/L) PHBb (g/L) P/Xc (%) Bacillus sp. PPK5 BKSa (g/L) PHBb (g/L) P/Xc (%) a Keterangan : BKS = Berat kering sel PHBb = Konsentrasi PHB P/Xc = Kadar PHB (g PHB/g berat kering sel) Bacillus sp. PSA10
Pati ganyong 1,27 0,35 27,56 0,86 0,097 16,28
Produksi PHB yang paling tinggi pada substrat pati sagu oleh Bacillus sp. PSA10 dan Bacillus sp. PPK5 dibandingkan ketiga jenis pati lainnya (pati singkong, pati garut dan pati ganyong) menunjukkan bahwa pati sagu merupakan substrat paling potensial digunakan untuk memproduksi PHB oleh kedua strain bakteri amilolitik. Hal ini mungkin disebabkan karena kedua strain bakteri amilolitik diisolasi dari tepung sagu basah sehingga mereka telah beradaptasi dan mampu menggunakan komponen-komponen pada pati sagu untuk memproduksi PHB. Dugaan ini sesuai dengan hasil penelitian Du et al. (2004) yang menyatakan bahwa bakteri yang hidup di lingkungan mengandung sumber C tinggi cenderung mengakumulasi material cadangan tertentu seperti PHB.
DAFTAR PUSTAKA Anderson, A.J. & Dawes, E.A. 1990. Occurence, Metabolism, Metabolic Role and Industrial Uses of Bacterial Polyhydroxyalkanoates. Microbiological Reviews. 54 (4) : 450-472. Apun, K., Jong, B.C. & Salleh, M.D. 2000. Screening and Isolation of a Cellulolytic and Amylolitic Bacillus from Sago Pith Waste. Journal of General and Applied Microbiology, 46 : 263-267 Badan Standardisasi Nasional (BSN), 1996. Tapioka. . Chen, Guo-Qiang. 2003. Microbial Production of Bioplastics-Polyhydroxyalkanoate. International Conference on Bio-Based Polymers. Riken Institute Tokyo, Japan. Du, G., Chen, L.X.L. & Yu, J. 2004. High-Efficiency Production of bioplastics from Biodegradable Organic Solids. Journal of Polymers & The environment 12 (2) : 89-94. Halami, P.M. 2008. Production of polyhydroxyalkanoate from starch by the native isolate Bacillus cereus CFR06. World Journal Microbiology & Biotechnology 24 : 805-812.
Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneath, P.H.A., Stanley, J.T. & Williams, S.T. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed. Lipincot, Williams and wilkins, Baltimore. Kim, B.S. 2000. Production of poly(3-hydroxybutyrate) from inexpensive substrates. Enzyme and Microbial Technology 27 : 774-777. Lee, S.Y. 1996. Plastic Bacteria? Progress and Prospect for Polyhydroxyalkanoate Production in Bacteria. Tibtech 14 : 431-438. Perez, E. & Lares, M. 2005. Chemical Composition, Mineral Profile, and Functional Properties of Canna (Canna edulis) and Arrowroot (Maranta spp.) Starches. Plant Food for Human Nutrition 60 :113-116. Ramadas, N.V. Singh, S.K., Soccol, C.R. & Pandey, A. 2009. Polyhydroxybutyrate Production using Agro-industrial Residue as Substrate by Bacillus sphaericus NCIM 5149. Brazilian Archives of Biology and Technology 52 :17-23. Ramsay, B.A., Lomaliza, K., Chavarie, C., Dube, B., Bataille, P. & Ramsay, J.A. 1990. Production of Poly-(ß-Hydroxybutyric-Co- ß-Hydroxyvaleric) Acids. Applied and Environmental Microbiology 56 (7) : 2093-2098. Senior, P.J., Beech, G.A., Ritchie, G.A.F. & Dawes, E.A. 1972. The Role of Oxygen Limitation in the Formation of Poly-β-hydroxybutyrate during Batch and Continuous Culture of Azotobacter beijerinckii. Biochemistry Journal, 128 : 1193-1201. Valappil, S.P., Boccaccini, A.R., Bucke, C. & Roy, E.I. 2007c. Polyhydroxyalkanoates in Gram positive bacteria : insight from the Genera Bacillus and Streptomyces. Antonie van leuuwenhoek 91 : 1-17. Wina, E., Evanza, A.J. & Lowry, J.B. 1986. The Composition of Pith from the Sago Palms Metroxylon sagu and Arenga pinnata. Journal of Science Food Agricultural 37 : 352-358 Yanti, N.A., Sembiring, L. & Margino, S. 2009a. Amylolytic Bacteria Producing The Raw Material of Bioplastic. Berkala Penelitian Hayati 3C : 95-99. Yanti, N.A., Sembiring, L. & Margino, S. 2009b. Production of Poly-β-hydroxybutyrate (PHB) from sago starch by the native isolate Bacillus megaterium PSA10. Indonesian Journal of Biotechnology 14 (1) : 1111-1116. Yilmaz, M., Soran, H. & Beyatli, Y. 2005. Determination of Poly-β-hydroxybutyrate (PHB) production by some Bacillus spp. World Journal of Microbiology & Biotechnology 21 : 565-566
