PRINSIP TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

PRINSIP TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN DEBBIE S. RETNONINGRUM SEKOLAH FARMASI INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

Sekolah Farmasi ITB

Bioteknologi Farmasi-FA 4202

Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1

PUSTAKA 1. Glick, BR and JJ Pasternak, 2003, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA,hal. 47-89 dan 101-110 2. Groves MJ, 2006, Pharmaceutical Biotechnology, hal. 44-55 3. Brown TA, 2006, Gene Cloning & DNA analysis, hal. 3-6 dan 8-12; 54-80 dan 87-97

Sekolah Farmasi ITB



TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN • Rekombinasi antara molekul DNA dari organisme berbeda: fenomena umum di alam. • Corynebacterium diphtheriae yang diinfeksi oleh virus β menghasilkan toksin yang bertanggung jawab terhadap gejala difteri. • Perubahan genetik dalam bakteri ini disebabkan oleh virus dan merupakan suatu rekayasa genetik dalam alam.

Sekolah Farmasi ITB



TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN • Duplikasi fenomena alam di laboratorium • Mengembangkan metode introduksi berbagai informasi genetik ke dalam suatu organisme. • Manipulasi genetik E. coli dan Bacillus subtilis (bakteri) Saccharomyces cerevisiae (ragi) • Produksi bahan mahal atau tidak mungkin dibuat secara tradisional.

Sekolah Farmasi ITB



CONTOH PRODUK REKOMBINAN – ANTIBODI REKOMBINAN – PROTEIN TERAPEUTIK: insulin, interferon, albumin serum manusia, hormon pertumbuhan manusia, aktivator plasminogen jaringan, antithrombin, faktor pembekuan darah, limfokin, faktor nekrosis tumor, dismutase superoksida, dan gonadotropin manusia

– VAKSIN: hepatitis B, herpes, influenza, malaria – VAKSIN DNA – TERAPI GEN

Sekolah Farmasi ITB



CONTOH PRODUK REKOMBINAN

– PRODUK PERTANIAN: tanaman tahan penyakit, resistensi pestisida, bioinsektisida, fiksasi nitrogen

– PRODUK BIOREMEDIASI: pengurai lemak/minyak, penghilangan herbisida, pendegradasi pestisida

Sekolah Farmasi ITB



TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN) •

PENYEDIAAN DNA: SISIPAN DAN VEKTOR (Ex: PLASMID)

•

LIGASI: PENGGABUNGAN DNA SISIPAN DAN VEKTOR (= VEKTOR REKOMBINAN)

•

TRANSFORMASI: TRANSFER INFO GENETIK KE SEL INANG & PERBANYAKAN DNA

•

SELEKSI: SEL YG MENGANDUNG PLASMID/ VEKTOR REKOMBINAN

•

DETEKSI: KEBERADAAN DNA SISIPAN, KEBENARAN DNA SISIPAN (UKURAN DAN URUTAN NUKLEOTIDA)

1972 Stanley Cohen dan Herbert Boyer Sekolah Farmasi ITB



TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN) DNA kromosom DNA plasmid

Potong dengan enzim restriksi

ligasi DNA rekombinan

transformasi sel

transforman 1 sel tumbuh jadi 1 koloni

klon Sekolah Farmasi ITB



Kloning DNA ke Plasmid

Sekolah Farmasi ITB



SUMBER DNA SISIPAN • TIGA PENDEKATAN: – KEPUSTAKAAN DNA (DNA LIBRARY): DNA GENOMIK – PRODUK PCR – mRNA

Sekolah Farmasi ITB

cDNA (eukariot)



Kepustakaan genomik (genomic library) • Koleksi klon yang jumlahnya cukup mencakup semua gen dari suatu organisme • Contoh ukuran genom: – Bacillus anthracis: 5,1 – 5,2 Megabasa – Escherichia coli: 4 Megabasa – Pseudomonas putida: 6,0 – 6,1 Megabasa – Staphylococcus aureus: 2,9 Megabasa

Sekolah Farmasi ITB



KROMOSOM vs PLASMID

Sekolah Farmasi ITB



PLASMID • DNA UNTAI GANDA • BERBENTUK LINGKARAN • BERSALINAN TINGGI • BERUKURAN KECIL (MUDAH DIMANIPULASI) • DAPAT BEREPLIKASI SENDIRI DI DALAM SEL • DAPAT DISISIPI DNA ASING (DNA SISIPAN) • ADA DUA GEN MARKER: – UNTUK MENDETEKSI ADANYA VEKTOR – UNTUK MENDETEKSI ADANYA DNA SISIPAN

Sekolah Farmasi ITB



VEKTOR (Plasmid) • VEKTOR KLONING HANYA UNTUK MENDAPATKAN DNA

• VEKTOR EKSPRESI UNTUK MENDAPATKAN PROTEIN (tambahan komponen untuk mempermudah proses “downstream”/pemurnian)

Sekolah Farmasi ITB



Beberapa contoh vektor kloning

Nama

Tipe

Sel inang

Keterangan

pBR322

Plasmid

E. coli

Resistensi terhadap ampisilin, tetrasiklin. Vektor untuk tujuan umum

pUC8

Plasmid

E. coli

Resistensi terhadap ampisilin, skrining lac. Vektor untuk tujuan umum

pBluescript

Plasmid

E. coli

Resistensi terhadap ampisilin, skrining lac.

λgt10

Bakteriofaga

E. coli

Kloning cDNA

YEp24

Plasmid

E. coli/ragi

Resistensi ampisilin. Vektor ragi shuttle

Sekolah Farmasi ITB



PETA PLASMID

Sekolah Farmasi ITB



ENZIM RESTRIKSI • MEMBATASI PERTUMBUHAN VIRUS PADA INFEKSI VIRUS PADA BAKTERI • TIPE II: DIGUNAKAN PADA DNA REKOMBINAN • MEMOTONG IKATAN FOSFODIESTERASE • MENGENALI URUTAN PALINDROM 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ Sekolah Farmasi ITB



ENZIM RESTRIKSI & LIGASE DNA (ligase)

DNA (enzim restriksi) 5’- NNNGAATTCNNN -3’ 3’- NNNCTTAAGNNN -5’

5’- NNNGOH 3’- NNNCTTAAP

EcoRI 5’- NNNGOH 3’- NNNCTTAA P

-3’

OHGNNN

-5’

ligase

PAATTCNNN

-3’

OHGNNN

-5’

•

Sisi pengenalan enzim restriksi

•

Urutan nukleotida rantai atas = Urutan nukleotida rantai bawah

Sekolah Farmasi ITB

PAATTCNNN


5’- NNNGAATTCNNN -3’ 3’- NNNCTTAAGNNN -5’


CONTOH ENZIM RESTRIKSI •

EcoRI (Escherichia coli galur R): G↓AATTC (ujung lancip)

•

BamHI (Bacillus amyloliquefaciens): G↓GATCC (ujung lancip)

•

BglII (Bacillus globigii): A↓GATCT (ujung lancip)

•

SalI (Streptomyces albus): G↓TCGAC (ujung lancip)

•

PstI (Providencia stuartii 164): CTGCA↓G (ujung lancip)

•

HindIII (Haemophilus influenzae): A↓AGCTT (ujung lancip)

•

KpnI (Klebsiella pneumonia): GGTAC↓C (ujung lancip)

•

XbaI (Xanthomonas bradii): T↓CTAGA (ujung lancip)

•

HaeIII (Hemophilus aegyptius): GG↓CC (ujung tumpul)

Sekolah Farmasi ITB



Kloning Produk PCR PCR

S. pyogenes M12

Ligasi

Gen ska

pGEMT rekombinan SDM Transformasi

E. coli XL-Blue

Sekolah Farmasi ITB


pGEMT/ska


LIGASI PRODUK PCR KE pGEM-T ligasi A

A

Transformasi

+

Gen ska pGEM-T

pGEM-T REKOMBINAN

E. coli JM109

Streptococcus pyogenes

Sekolah Farmasi ITB

Kontrol –

Kontrol + E. coli pGEM-T REK

LB/Amp

LB/Amp


LB/Amp/X-Gal/IPTG


Sekolah Farmasi ITB



Transformasi • info genetik ditransfer ke sel inang dengan metode transformasi • Sel inang dibuat kompeten (siap menerima “DNA asing”) → modifikasi struktur dinding sel • Metode transformasi : heat shock/elektroporasi

Sekolah Farmasi ITB



Seleksi Transforman Sel kompeten

Transformasi

Seleksi Biru-Putih Sekolah Farmasi ITB



SELEKSI BIRU PUTIH • MENGETAHUI APAKAH DNA SISIPAN SUDAH ADA? • PADA MCS TERDAPAT GEN lacZ (MENGKODE GALAKTOSIDASE) • X-GAL → BIRU • DNA SISIPAN AKAN MERUSAK GEN lacZ → GALAKTOSIDASE TIDAK DIPRODUKSI → X-GAL TIDAK DIURAIKAN → PUTIH

Sekolah Farmasi ITB



Deteksi keberadaan DNA sisipan • Analisis migrasi • Analisis restriksi

Elektroforesis gel

• PCR • Penentuan urutan DNA sisipan (sekuensing)

Sekolah Farmasi ITB



ELEKTROFORESIS GEL • Gel agarosa atau poliakrilamid • DNA bermuatan negatif (ada gugus fosfat): bergerak dari kutub negatif ke kutub positif • DNA bermigrasi tergantung dari ukurannya: migrasi DNA ukuran kecil > ukuran besar • Visualisasi: – etidium bromida / Syber Green (DNA berfluorosensi dengan pemaparan UV)

Sekolah Farmasi ITB



Elektroforesis Gel Agarosa

Joe Sambrook dan Bill Sugden: elektroforesis gel agarose untuk DNA

Sekolah Farmasi ITB



KONFIRMASI pGEM-T REKOMBINAN 1

2

Isolasi pGEM-T/ska (kit Qiaprep, Qiagene)

Ukuran plasmid tanpa DNA sisipan < ukuran plasmid dengan DNA sisipan

Sekolah Farmasi ITB


1 = pGEM-T rekombinan 2 = pGEM-T tanpa DNA sisipan


KONFIRMASI pGEM-T REKOMBINAN Isolasi Plasmid Rekombinan

Analisis Restriksi pGEM-T rekombinan

1 2 3

Koloni Biru

1 Koloni Putih Koloni Biru 1419 pb 517 pb

Elektrogram hasil isolasi plasmid koloni biru dan putih : 1. Koloni biru 2. Koloni putih 3. Koloni biru

Sekolah Farmasi ITB

2

pGEM-T (3000 bp) 881 pb DNA sisipan

Elektrogram hasil restriksi Nde/BamHI 1. Marka pUC19/HinfI 2. Hasil Pemotongan NdeI/BamHI



HASIL PENENTUAN URUTAN NUKLEOTIDA DNA SISIPAN (DNA Sequencing)

Sekolah Farmasi ITB



HASIL SEKUENSING

Bandingkan urutan hasil sekuensing dg urutan DNA sisipan asal (Analisis homologi/kesamaan – program BLAST dari NCBI)

Sekolah Farmasi ITB



PRINSIP TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

Recommend Documents