PRINSIP TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN DEBBIE S. RETNONINGRUM SEKOLAH FARMASI INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1
PUSTAKA 1. Glick, BR and JJ Pasternak, 2003, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA,hal. 47-89 dan 101-110 2. Groves MJ, 2006, Pharmaceutical Biotechnology, hal. 44-55 3. Brown TA, 2006, Gene Cloning & DNA analysis, hal. 3-6 dan 8-12; 54-80 dan 87-97
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN • Rekombinasi antara molekul DNA dari organisme berbeda: fenomena umum di alam. • Corynebacterium diphtheriae yang diinfeksi oleh virus β menghasilkan toksin yang bertanggung jawab terhadap gejala difteri. • Perubahan genetik dalam bakteri ini disebabkan oleh virus dan merupakan suatu rekayasa genetik dalam alam.
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 3
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN • Duplikasi fenomena alam di laboratorium • Mengembangkan metode introduksi berbagai informasi genetik ke dalam suatu organisme. • Manipulasi genetik E. coli dan Bacillus subtilis (bakteri) Saccharomyces cerevisiae (ragi) • Produksi bahan mahal atau tidak mungkin dibuat secara tradisional.
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 4
CONTOH PRODUK REKOMBINAN – ANTIBODI REKOMBINAN – PROTEIN TERAPEUTIK: insulin, interferon, albumin serum manusia, hormon pertumbuhan manusia, aktivator plasminogen jaringan, antithrombin, faktor pembekuan darah, limfokin, faktor nekrosis tumor, dismutase superoksida, dan gonadotropin manusia
– VAKSIN: hepatitis B, herpes, influenza, malaria – VAKSIN DNA – TERAPI GEN
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 5
CONTOH PRODUK REKOMBINAN
– PRODUK PERTANIAN: tanaman tahan penyakit, resistensi pestisida, bioinsektisida, fiksasi nitrogen
– PRODUK BIOREMEDIASI: pengurai lemak/minyak, penghilangan herbisida, pendegradasi pestisida
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 6
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN) •
PENYEDIAAN DNA: SISIPAN DAN VEKTOR (Ex: PLASMID)
•
LIGASI: PENGGABUNGAN DNA SISIPAN DAN VEKTOR (= VEKTOR REKOMBINAN)
•
TRANSFORMASI: TRANSFER INFO GENETIK KE SEL INANG & PERBANYAKAN DNA
•
SELEKSI: SEL YG MENGANDUNG PLASMID/ VEKTOR REKOMBINAN
•
DETEKSI: KEBERADAAN DNA SISIPAN, KEBENARAN DNA SISIPAN (UKURAN DAN URUTAN NUKLEOTIDA)
1972 Stanley Cohen dan Herbert Boyer Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 7
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN) DNA kromosom DNA plasmid
Potong dengan enzim restriksi
ligasi DNA rekombinan
transformasi sel
transforman 1 sel tumbuh jadi 1 koloni
klon Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 8
Kloning DNA ke Plasmid
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 9
SUMBER DNA SISIPAN • TIGA PENDEKATAN: – KEPUSTAKAAN DNA (DNA LIBRARY): DNA GENOMIK – PRODUK PCR – mRNA
Sekolah Farmasi ITB
cDNA (eukariot)
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 10
Kepustakaan genomik (genomic library) • Koleksi klon yang jumlahnya cukup mencakup semua gen dari suatu organisme • Contoh ukuran genom: – Bacillus anthracis: 5,1 – 5,2 Megabasa – Escherichia coli: 4 Megabasa – Pseudomonas putida: 6,0 – 6,1 Megabasa – Staphylococcus aureus: 2,9 Megabasa
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 11
KROMOSOM vs PLASMID
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 12
PLASMID • DNA UNTAI GANDA • BERBENTUK LINGKARAN • BERSALINAN TINGGI • BERUKURAN KECIL (MUDAH DIMANIPULASI) • DAPAT BEREPLIKASI SENDIRI DI DALAM SEL • DAPAT DISISIPI DNA ASING (DNA SISIPAN) • ADA DUA GEN MARKER: – UNTUK MENDETEKSI ADANYA VEKTOR – UNTUK MENDETEKSI ADANYA DNA SISIPAN
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 13
VEKTOR (Plasmid) • VEKTOR KLONING HANYA UNTUK MENDAPATKAN DNA
• VEKTOR EKSPRESI UNTUK MENDAPATKAN PROTEIN (tambahan komponen untuk mempermudah proses “downstream”/pemurnian)
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 14
Beberapa contoh vektor kloning
Nama
Tipe
Sel inang
Keterangan
pBR322
Plasmid
E. coli
Resistensi terhadap ampisilin, tetrasiklin. Vektor untuk tujuan umum
pUC8
Plasmid
E. coli
Resistensi terhadap ampisilin, skrining lac. Vektor untuk tujuan umum
pBluescript
Plasmid
E. coli
Resistensi terhadap ampisilin, skrining lac.
λgt10
Bakteriofaga
E. coli
Kloning cDNA
YEp24
Plasmid
E. coli/ragi
Resistensi ampisilin. Vektor ragi shuttle
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 15
PETA PLASMID
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 16
ENZIM RESTRIKSI • MEMBATASI PERTUMBUHAN VIRUS PADA INFEKSI VIRUS PADA BAKTERI • TIPE II: DIGUNAKAN PADA DNA REKOMBINAN • MEMOTONG IKATAN FOSFODIESTERASE • MENGENALI URUTAN PALINDROM 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 17
ENZIM RESTRIKSI & LIGASE DNA (ligase)
DNA (enzim restriksi) 5’- NNNGAATTCNNN -3’ 3’- NNNCTTAAGNNN -5’
5’- NNNGOH 3’- NNNCTTAAP
EcoRI 5’- NNNGOH 3’- NNNCTTAA P
-3’
OHGNNN
-5’
ligase
PAATTCNNN
-3’
OHGNNN
-5’
•
Sisi pengenalan enzim restriksi
•
Urutan nukleotida rantai atas = Urutan nukleotida rantai bawah
Sekolah Farmasi ITB
PAATTCNNN
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
5’- NNNGAATTCNNN -3’ 3’- NNNCTTAAGNNN -5’
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 18
CONTOH ENZIM RESTRIKSI •
EcoRI (Escherichia coli galur R): G↓AATTC (ujung lancip)
•
BamHI (Bacillus amyloliquefaciens): G↓GATCC (ujung lancip)
•
BglII (Bacillus globigii): A↓GATCT (ujung lancip)
•
SalI (Streptomyces albus): G↓TCGAC (ujung lancip)
•
PstI (Providencia stuartii 164): CTGCA↓G (ujung lancip)
•
HindIII (Haemophilus influenzae): A↓AGCTT (ujung lancip)
•
KpnI (Klebsiella pneumonia): GGTAC↓C (ujung lancip)
•
XbaI (Xanthomonas bradii): T↓CTAGA (ujung lancip)
•
HaeIII (Hemophilus aegyptius): GG↓CC (ujung tumpul)
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 19
Kloning Produk PCR PCR
S. pyogenes M12
Ligasi
Gen ska
pGEMT rekombinan SDM Transformasi
E. coli XL-Blue
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
pGEMT/ska
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 20
LIGASI PRODUK PCR KE pGEM-T ligasi A
A
Transformasi
+
Gen ska pGEM-T
pGEM-T REKOMBINAN
E. coli JM109
Streptococcus pyogenes
Sekolah Farmasi ITB
Kontrol –
Kontrol + E. coli pGEM-T REK
LB/Amp
LB/Amp
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
LB/Amp/X-Gal/IPTG
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 21
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 22
Transformasi • info genetik ditransfer ke sel inang dengan metode transformasi • Sel inang dibuat kompeten (siap menerima “DNA asing”) → modifikasi struktur dinding sel • Metode transformasi : heat shock/elektroporasi
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 23
Seleksi Transforman Sel kompeten
Transformasi
Seleksi Biru-Putih Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 24
SELEKSI BIRU PUTIH • MENGETAHUI APAKAH DNA SISIPAN SUDAH ADA? • PADA MCS TERDAPAT GEN lacZ (MENGKODE GALAKTOSIDASE) • X-GAL → BIRU • DNA SISIPAN AKAN MERUSAK GEN lacZ → GALAKTOSIDASE TIDAK DIPRODUKSI → X-GAL TIDAK DIURAIKAN → PUTIH
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 25
Deteksi keberadaan DNA sisipan • Analisis migrasi • Analisis restriksi
Elektroforesis gel
• PCR • Penentuan urutan DNA sisipan (sekuensing)
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 26
ELEKTROFORESIS GEL • Gel agarosa atau poliakrilamid • DNA bermuatan negatif (ada gugus fosfat): bergerak dari kutub negatif ke kutub positif • DNA bermigrasi tergantung dari ukurannya: migrasi DNA ukuran kecil > ukuran besar • Visualisasi: – etidium bromida / Syber Green (DNA berfluorosensi dengan pemaparan UV)
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 27
Elektroforesis Gel Agarosa
Joe Sambrook dan Bill Sugden: elektroforesis gel agarose untuk DNA
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 28
KONFIRMASI pGEM-T REKOMBINAN 1
2
Isolasi pGEM-T/ska (kit Qiaprep, Qiagene)
Ukuran plasmid tanpa DNA sisipan < ukuran plasmid dengan DNA sisipan
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
1 = pGEM-T rekombinan 2 = pGEM-T tanpa DNA sisipan
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 29
KONFIRMASI pGEM-T REKOMBINAN Isolasi Plasmid Rekombinan
Analisis Restriksi pGEM-T rekombinan
1 2 3
Koloni Biru
1 Koloni Putih Koloni Biru 1419 pb 517 pb
Elektrogram hasil isolasi plasmid koloni biru dan putih : 1. Koloni biru 2. Koloni putih 3. Koloni biru
Sekolah Farmasi ITB
2
pGEM-T (3000 bp) 881 pb DNA sisipan
Elektrogram hasil restriksi Nde/BamHI 1. Marka pUC19/HinfI 2. Hasil Pemotongan NdeI/BamHI
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 30
HASIL PENENTUAN URUTAN NUKLEOTIDA DNA SISIPAN (DNA Sequencing)
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 31
HASIL SEKUENSING
Bandingkan urutan hasil sekuensing dg urutan DNA sisipan asal (Analisis homologi/kesamaan – program BLAST dari NCBI)
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 32