GIBSON ASSEMBLY, PIRANTI ENZIMATIS TERBARU DALAM TEKNOLOGI REKOMBINASI DNA

BioTrends Vol.6 No.2 Tahun 2015

GIBSON ASSEMBLY, PIRANTI ENZIMATIS TERBARU DALAM TEKNOLOGI REKOMBINASI DNA Sri Kartika Wijaya Pusat Penelitian Bioteknologi- LIPI Jl.Raya Bogor KM.46 Cibinong Science Center, Bogor 16911. Telepon: 021-8754587. Email : [email protected], [email protected]

S

elama hampir setengah abad, tak terhitung jumlah peneliti yang telah melakukan rekombinasi DNA. Rekombinasi DNA didefinisikan sebagai teknik perakitan DNA baik

secara natural atau artifisialyang prosesnya melibatkan pertukaran materi genetik dari kromosom yang berbeda atau dari region berbeda dari satu kromosom makhluk hidup yang sama

(Clancy, S 2008), rekombinasi ini secara umum diperlukan untuk duplikasi kromosom pada saat meiosis yang merupakan momen kritikal perkembangbiakan makhluk hidup. Selain itu,

Gambar 1. menjelaskan tentang teknik Gibson Assembly dilakukan diawal masa percobaan yang secara umum dituturkan bertujuan untuk menginsersi sebuah fragmen DNA ke dalam vektor pUC19. Bagian [1A] memperlihatkan sisi penggabungan vektor dan insert. Perbanyakan vektor pUC19 yang memiliki sisi overlap dengan beberapa bagian dari –N dan –C fragmen insert dilakukan dengan teknik PCRdengan primer yang didesain unik pada sisi reverse dan forward.Bagian [1B] merupakan gambaran umum dari prosesGA. Sisi DNA vektor dan insert yang saling tumpang tindih dilambangkan dengan garis hitam. T4 DNA Polimerasi akan memakan beberapa puluh basa yang bersinggungan pada sisi 3’ dari DNA, yang akibatnya akan membentuk overhang pada dua sisi DNA yang bersinggungan. Taq Polimerase dan Taq ligase akan mengisi celah DNA sekaligus melekatkan dua untai DNA asing menjadi satu untai DNA yang tersambung rapat tanpa celah.

14

BioTrends Vol.6 No.2 Tahun 2015

rekombinasi DNA juga berperan dalam proses perbaikan dan replikasi DNA yang terjadi secara alami (Clancy, S 2008).

ligase DNA(Gellert 1967)yang esensial untuk pelekatan untai DNA (Lehnman 1974)dan enzim restriksi(Smith & Welcox 1970) yang berfungsi sebagai enzim Secara umum, rekombinasi DNA yang bisa membelah DNA pada dikelompokkan menjadi sekuens yang spesifik(Loenen et rekombinasi yang sifatnya natural al. 2013). Dua enzim yang dan non-natural. Salah satu tipe fenomenal tersebut memiliki peran rekombinasi yang sering dilakukan utama dalam proses rekombinasi diantaranya adalah rekombinasi DNA karena keberadaannya yang yang bersifat non-natural, karena memungkinkan peneliti untuk terkadang rekombinasi non-natural memotong DNA dengan ukuran ini diperlukan saat seorang peneliti tertentu dan kemudian meletakkan ingin menyusun elemen genetik atau menyambungkan DNA asing atau pada saat mensintesa genom tersebut ke dalam genom makhluk suatu makhluk hidup secara utuh. yang lain. Hingga kini, berbagai Sejak itulah metoda rekombinasi adaptasi dan penyempurnaan DNA mengalami banyak perbaikan metode rekombinasi terus dari segi teknik dan kemudahan dilakukan demi hasil yang lebih penggunaan, dan pada akhirnya cepat danakurat. pengembangan metoda tersebutmenjadi sangat beragam. Penelitian mengenai teknologi Tak dapat dipungkiri bahwa rekombinasi DNA sudah dimulai perkembangan metoda sejak tahun 1967, yaitu ketika rekombinasi DNA menjadi sangat kelompok penelitian Zimmerman pesat sejak ditemukannya enzim melakukan eksperimen ekstrem

Gambar2.

yang bertujuan untuk menyatukan dua untai DNA bakteriofagedengan reaksi enzimatis(Zimmerman et al. 1967). Kelompok penelitian mereka menggunakan enzim yang berasal dari ekstrak Escherichiacoli untuk menggabungkan dua untai DNA. Beberapa tahun kemudian, A.D Kaiser dan Peter Lobban berhasil mengembangkan teknik untuk menggabungkan dua molekul DNA, yang dikemudian hari menjadi teori dan teknik acuan dibuatnya DNA dimer sirkuler dari Polyomavirus simian virus 40 (SV40)(Jackson, Symons & Berg 1972). Polyomavirus simian virus 40 (SV40) adalah DNA virus yang berperan kuat sebagai salah satu penyebab penyakit kanker (Vilchez & Butel 2004), dan pada saat itu ditemukan bahwa pada infeksi tingkat akhir, mayoritas virus SV40 ditemukan dalam bentuk sirkuler DNA yang ditengarai terbentuk dengan cara

Memperlihatkan pembaharuan teknik Gibson Assembly dengan menggunakan enzimeksonuklease III dan T5 eksonuklease. Kedua enzim ini hanya dibedakan di sisi aktif pemotongan ujung DNA. Secara umum, T5 eksonuklease lebih ringkas karena hanya memerlukan satu kali pengaturan suhu pada 50ºC.

15

BioTrends Vol.6 No.2 Tahun 2015

rekombinasi DNA (Goff & Berg 1977). Karena proses rekombinasi inilah SV40 digunakan sebagai subjek untuk mengamati proses rekombinasi yang terjadi secara natural.

Gibson Assembly Gibson Assembly (Borgi & Gargouri) adalah teknologi rekombinasi DNA terbaru yang diperkenalkan oleh Gibson grup. Teknik rekombinasi ini pertama kali dipublikasikan pada tahun 2009. Dalam sebuah tulisan komunikasi singkat, Daniel Gibson dengan gamblang memaparkan proses enzimatis perakitan molekul DNA yang berhasil menggabungkan molekul DNA hingga ribuan kilobasa dalam satu

Lompatan besar di bidang rekombinasi DNA terjadi ketika para peneliti bisa mengembangkan teknik penggabungkan dua molekul DNAyang tadinya hanya berupa fragmen linearhingga akhirnya berhasil membuat DNA sirkuler yang memiliki Gibson Assembly (Borgi & struktur berupa lingkaran tertutup. Gargouri) adalah teknologi DNA sirkuler ini menarik perhatian rekombinasi DNA terbaru yang dunia ilmiah dikarenakan diperkenalkan oleh Gibson berperan pada grup. Teknik rekombinasi ini replikasi bakteri, seringkali pertama kali dipublikasikan merupakan penanda infeksi (seperti pada tahun 2009. Dalam misalnya pada sebuah tulisan komunikasi kasus infeksi SV40), dan terlebih lagi singkat, Daniel Gibson dengan sirkular DNA ini berpotensi untuk gamblang memaparkan proses dikembangkan lebih jauh untuk berbagai enzimatis perakitan molekul kepentingan di DNA yang berhasil bidang biologi molekuler. Riset menggabungkan molekul DNA intensif tentang rekombinasi DNA ini hingga ribuan kilobasa dalam rupa-rupanya satu kali reaksi isothermal menjadi inspirasi bagi kelompok riset yang lain untuk kali reaksi isothermal, teknik GA memoles teknik rekombinasi membutuhkan satu syarat penting, tersebut menjadi lebih mudah. yaitu rangkaian DNA yang dibuat Beberapa teknik pun melalui overlap/ tumpang tindih satu sama proses uji coba, selain lain, yang memiliki basa nukleotida denganenzim restriksi dan PCR, saling berpasangan satu sama teknologienzim ligase independen lain. (Li & Elledge 2007)pun diadopsi sebagai salah satu strategi Jauh sebelum teknik ini berhasil kloning. Hanya saja, kesemua dikembangkan, kisah sukses teknologi rekombinasi diatas strategi rekombinasi DNA dengan memiliki kekurangan berupa teknik yang dikembangkan oleh rentang waktu pengerjaan yang kelompok penelitian Gibson lebih lama, biaya yang lebih tinggi, bukanlah proses singkat. Pada dan terkadang tidak tahapan awal penelitian memungkinkan untuk melakukan pengembangan teknologi GA ini; modifikasi yang diperlukan pada khususnya sebelum mereka sekuen DNA. berhasil mengembangkannya menjadi satu tahap reaksi; Gibson

16

grup melakukan rekombinasi DNA melalui dua tahap reaksi.Kelompok penelitian tersebut melakukan rekombinasi yang bertujuan untuk menyisipkan sebuah fragmen DNA pada vektor PUC19(Gibson 2011). Proses rekombinasi dimulai dengan perbanyakan vektor E.colidengan kultur bakteri. Stok DNA yang sudah dipurifikasi dari vektor tersebut diperbanyak dengan teknik Polymerase Chain Reaction(PCR), yang merupakan satu teknik terbaik untuk penggandaan untai DNA.Teknik PCR ini memungkinkan kita untuk menggandakan DNA vektor dan insert sekaligus dengan penambahan bagian overlap sepanjang 40bp di sisi –N dan –C dari vektor (gambar 1A).Dua-tahap rekombinasi in-vitro bisa terlaksana dengan menggunakan enzim T4 DNA polymerase dan kombinasi dari enzim Taq DNA polimerase dan Taq DNA ligase. Dalam reaksi ini, Taq DNA polimerase bekerja sama seperti DNA polimerase manusia pada proses replikasi alami, hanya saja, jika DNA polimerase manusia akan rusak sesaat setelah berada dalam temperatur tinggi, maka Taq DNA polimerase masih bisa bertahan hingga 94ºC. Hal ini menjadi keuntungan tersendiri jika mengingat siklus PCR yang berulang-ulang hingga 20 atau 35 siklus menggunakan suhu 94-95ºC untuk setiap siklusnya, menjadikan Taq DNA polimerase enzim yang ideal bagi proses ini penggandaan DNA ini. Proses dua-tahap rekombinasi DNA yang pertama kali diperkenalkan oleh grup Gibson ini dikerjakan dengan cara sebagai berikut(Gibson 2011): 

Pada reaksi pertama; ujung 3’ dari fragmen DNA akan terpotong sepanjang beberapa basa hingga membentuk overhangpada ujung 3’ tersebut. Proses pemotongan sebagian DNA fragmen ini dilakukan oleh enzim T4 DNA polimerase

BioTrends Vol.6 No.2 Tahun 2015

pada suhu 37ºC, yang bertujuan untuk mengekspose bagian DNA yang overlap, baik pada insert DNA fragmen ataupun pada DNA vektor. Proses pemotongan tersebuthanya mungkin terjadi jika tanpa penambahan dNTPs, sedangkan dNTPs dibutuhkan sebagaisumberdaya basa tunggal A (Adenin), T (Tirosin), G (Guanin) dan C (Sitosin) yang penting pada saat merakit untaian DNA baru.Mengingat hal itu, pemberian dNTPs ditunda pada reaksi tahap pertama dan baru akan ditambahkan pada reaksi kedua. Setelah proses pemotongan ujung DNA dengan T4 Polimerase, enzim tersebut akan di inaktifasi pada suhu 75ºC, yang kemudian disertai dengan proses pendinginan secara lambat dan bertahap, proses pendinginan ini diharapkan bisa menginisiasi proses annealing(pelekatan) dari sisi yang saling overlap (tumpang tindih). 

Reaksi kedua adalah dengan melibatkan enzim Taq polymerase dan Taq ligase, dua enzim ini akan aktif pada suhu 45ºC dengan penambahan dNTPs.Taq Polimerase menggunakan sumber daya dNTPs untuk merekontruksi untai DNA baru, proses rekonstruksi ini dibarengi dengan proses repairing oleh Taq ligase untuk mengisi celah-celah diantara dua DNA asing yang masih mungkin belum sempurna. Dengan demikian, kolaborasi antara enzim Taq polymerase dan Taq ligase tersebut diharapkan bisa menghasilkan sambungan DNA yang tanpa celah.Aktivitas ini juga meminimalisir adanya kemungkinan kesalahan pada saat mengisi celah DNA yang tidak komplemen. (Gambar 1B).

Seperti yang telah dijabarkan diatas, bahwa reaksi dua-tahap rekombinasi DNA tersebut memiliki satu hal yang mungkin menjadikannya kurang efisien, fakta bahwa reaksi pertama dan kedua tidak bisa dikerjakan dalam satu reaksi adalah dikarenakan keberadaan dNTPs akan menghambat kerja enzim T4 DNA polymerase. Disisi lain, dNTPs adalah substansi yang diperlukan untuk mengisi celah di untai DNA yang kosong.Terlebih lagi, perbedaan suhu untuk reaksi pertama dan kedua sedikit ekstrim, yaitu 75ºC dan 45ºC. Maka dari itu penyempurnaan proses rekombinasi DNA ini kemudian dilakukan dengan penggunaan enzim eksonulease III. Enzim inibisa melakukan fungsi yang sama seperti enzim T4 DNA polymerase, yaitu mengeliminasi sebagian basa pada ujung 3’, namun kelebihannya, enzim T4 DNA polymerasetersebut tidak akan terhambat dengan keberadaan dNTPs pada larutan. Pada akhirnya, dengan cara ini rekombinasi DNA bisa dilakukan dengan satu tahap reaksi dengan menggunakan thermocycler.Hanya saja teknik rekombinasi DNA menggunakan eksonuklease III tetap memerlukan dua temperature yaitu pada suhu 37ºC dan 50ºC (Gambar 2). Pada perkembangan selanjutnya enzim T5 eksonuklease pun digunakan menggantikan enzim eksonuklease III, pada dasarnya dua enzim ini memiliki fungsi sama, hanya saja T5 eksonuklease akan memotong basa di ujung 5’ bukan di ujung 3’ seperti yang dilakukan oleh eksonuklease III. Kelebihan lain dari enzim T5 eksonuklease ini adalah kemudahan dalam proses pengaturan suhu selama reaksi berlangsung, dalam proses rekombinasinya enzim T5 eksonuklease hanya memerlukan satu kali pengaturan suhu pada 50ºC.

17

Nah bagaimanakah detail proses rekombinasi dengan enzim eksonuklease dan T4 DNA polimerase ini? Mari simak langkahnya (Gambar 2): 

Enzim T5 eksonuklease Enzim T5 eksonuklease adalah enzim yang pertama kali bertugas dalam proses perakitan DNA dengan teknik GA. Enzim ini bekerja dengan sedikit ‘memakan’ bagian ujung 5’ dari DNA, yang tujuannya adalah untuk memberi ruang bagi enzim lain bekerja menyatukan dua DNA yang asing satu sama lain.



Enzim Phusion dan Taq Ligase. Dua enzim ini mulai aktif bekerja saat suhu thermocycler mencapai 50ºC. Berbeda dengan enzim T5 eksonuklease yang aktif sejak saat ditambahkan ke dalam campuran DNA dan menjadi inaktif ketika suhu mencapai 50ºC. Saat T5 eksonuklease ‘memakan’ beberapa basa di ujung 5’ dan meninggalkan jejak berupa ujung DNA yang menggantung, maka enzim Phusion akan ‘mengisi’ ruang kosong antara DNA yang overlap. Pekerjaan enzim Phusion ini akan disempurnakan oleh Taq Ligase yang akan menutup celah-celah kecil antara dua DNA yang digabungkan dan sebagai hasil akhir, akan diperoleh satu DNA yang tersambung rapat tanpa celah.

Aplikasi Teknik Gilson Assembly Dalam artikel yang ditulis oleh Daniel Gibson dan Salvatore Rusello yang dipublikasikan oleh NEB, mereka memaparkan bahwa jika dibandingkan dengan kloning tradisional yang membutuhkan situs pemotongan enzim restriksi, dilanjutkan dengan ligasi dan konfirmasi dengan teknik PCR, metode kloning dengan Gibson Assembly terbilang lebih efisien, cepat dan mudah.

BioTrends Vol.6 No.2 Tahun 2015

Karenakeseluruhan proses penggandaan untai DNA vektor dan insert, penggunaan enzim restriksi dan enzim ligase, dilanjutkan dengan kloning dan transformasi bisa dikerjakan dalam waktu beberapa jam saja. Produk Gibson Assembly bisa langsung digunakan untuk transformasi ke dalam sel inang tanpa harus melewati proses purifikasi yang bisa berdampak mengurangi konsentrasi sampel DNA. Poin penting yang mungkin sedikit harus mendapatkan perhatian khusus adalah pada saat mendesain primer yang akan digunakan untuk proses assembly, karena setiap primer yang dibuat harus memiliki sisi overlap pada dua untai DNA yang berbeda. Namun saat ini, beberapa software bioinformatika berbayar mampu memberikan kemudahan dalam proses perakitan primer ini. Hal lain adalah ketepatan konsentrasi DNA vektor dan fragmen yang akan diinsersikan juga harus akurat. Dalam buku panduan teknik Gibson Assembly, dijelaskan bahwa konsentrasi yang dibutuhkan akan sangat dipengaruhi oleh banyaknya fragment DNA dan panjangnya fragment DNA yang akan di rekombinasi, yang secara umum juga akan menentukan efisiensi dari proses assembly DNA yang dilakukan.

kedepannya, akan mempengaruhi kecepatan proses perakitan DNA, dan utamanya akan sangat mempengaruhi proses sintesa genom, secara tidak langsung juga akan mempercepat proses riset di bidang-bidang terkait.

Li, MZ & Elledge, SJ 2007, 'Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC', Nat Methods, vol. 4, no. 3, pp. 251-6. Loenen, WAM, Dryden, DTF, Raleigh, EA, Wilson, GG & Murray, NE 2013, 'Highlights of the DNA cutters: a short history of the restriction enzymes', Nucleic Acids Research.

Daftar Pustaka

Borgi, I & Gargouri, A 2008, 'A spontaneous direct repeat deletion in the pGEX fusion vector decreases the expression level of recombinant proteins in Roop, RM, 2nd, Bellaire, BH, Escherichia coli', Protein Valderas, MW & Cardelli, JA Expr Purif, vol. 60, no. 1, pp. 2004, 'Adaptation of the 15-9. Brucellae to their intracellular niche', Mol Microbiol, vol. 52, no. 3, pp. Gellert, M 1967, 'Formation of covalent circles of lambda 621-30. DNA by E. coli extracts', Proceedings of the National Smith, HO & Welcox, KW 1970, 'A Academy of Sciences of the Restriction enzyme from United States of America, Hemophilus influenzae: I. vol. 57, no. 1, pp. 148-55. Purification and general properties', Journal of Molecular Biology, vol. 51, Gibson, DG 2011, 'Enzymatic assembly of overlapping no. 2, pp. 379-91. DNA fragments', Methods Enzymol, vol. 498, pp. 349- Vilchez, RA & Butel, JS 2004, 61. 'Emergent Human Pathogen Simian Virus 40 and Its Role in Cancer', Clinical Goff, SP & Berg, P 1977, Microbiology Reviews, vol. 'Structure and formation of circular dimers of simian 17, no. 3, pp. 495-508. virus 40 DNA', Journal of Virology, vol. 24, no. 1, pp. Zimmerman, SB, Little, JW, 295-302. Oshinsky, CK & Gellert, M Dalam kesempatan yang lebih 1967, 'Enzymatic joining of luas, teknik Gibson Assembly juga Jackson, DA, Symons, RH & Berg, DNA strands: a novel memungkinkan untuk P 1972, 'Biochemical reaction of diaplikasikan untuk beberapa hal Method for Inserting New diphosphopyridine nucleotide', Proceedings of lain, diantaranya untuk Genetic Information into the National Academy of merekonstruksi DNA yang DNA of Simian Virus 40: berukuran besar, Site-directed Sciences of the United Circular SV40 DNA mutagenesis, membuat fragment States of America, vol. 57, Molecules Containing DNA rantai ganda, dan juga pada Lambda Phage Genes and no. 6, pp. 1841-8. proses kombinasi-sintesis fragmen the Galactose Operon of DNA (Gibson and Russello). Escherichia coli', Proceedings of the National Dalam perkembangannya, teknik Academy of Sciences of the Gibson assembly telah United States of America, diperkenalkan secara luas dalam bentuk produk jadi di bawah brand vol. 69, no. 10, pp. 2904-9. NEB. Semua enzim yang dibutuhkan untuk proses Gibson Lehnman, IR 1974, 'DNA Ligase: Assembly dikonsentrasikan Structure, Mechanism, and didalam satu tube tunggal untuk Function', Science, vol. 186, proses satu reaksi isothermal yang no. 4166, pp. 790-7. mudah. Dengan teknik baru ini,

18