Jedná se o volný, nerecenzovaný překlad kapitoly z knihy : Optical Biosensors, Present and Future, Edited by F.S. Liegler and Ch.A. R. Tait, Elsevier 2002, str. 277- 304. Přeložil : Leopold Cudzik Upravil a modifikoval : Miroslav Jelínek Obrázky upravil a modifikoval : Tomáš Kocourek
INTERFEROMETRICKÉ BIOSENZORY 1
Daniel P. Campbell, PhD. a 2Candice J. McCloskey, PhD. 1 Georgia Tech Research Institute, Atlanta, GA 30332 USA 2 Life University, School of Arts and Science, Marietta, GA 30060 USA Interferometrie je optická metoda, která sleduje rozdíly mezi dvěma optickými svazky, jež uběhly podobné dráhy. Pozorování biokonjugované reakce, která se odehrává v dráze jednoho ze svazků, tvoří základ biosensoru. Nejoblíbenější platformou interferometrických senzorů jsou planární vlnovody. Ty jsou preferovány z důvodu delší interakční dráhy. Evanescentní pole planárního vlnovodu je citlivé na změny indexu lomu materiálu, který je nad vlnovodem. Toto pole je schopné proniknout až do vzdálenosti 500 nm nad povrch vlnovodu. Pokud nad povrch umístíme chemicky aktivní vrstvu, chemická reakce se odehraje v tomto poli. Chemické i fyzikální interakce mění index lomu a tím ovlivňují rychlost šíření a fázi optického svazku (větší index lomu pak sníží rychlost šíření a naopak). Abychom mohli měřit tuto změnu, je potřeba umístit do blízkosti citlivého vlnovodu (citlivého na danou reakci), vlnovod referenční. Svazky z těchto dvou kanálů jsou pak opticky zkombinovány a vytvoří charakteristické interferenční proužky. Chemická, nebo fyzikální změna v senzorické části interferometru vede k posuvu interferenčních proužků. Toto posunutí je v prostoru charakterizováno sinusovkou (will shift producing sinusoidal output). V článku je prezentováno několik experimentálních uspořádání a jsou porovnány jejich citlivosti. Citlivost vzhledem k biochemické reakci je závislá na délce interakční oblasti a na rozsahu interakce mezi materiálem a evanescentním polem.
Princip činnosti Interferometrie je technika schopná měřit tři veličiny optického svazku podél dané dráhy: změnu délky trasy, změnu vlnové délky, nebo změnu rychlosti šíření. Změna některé z těchto veličin se projeví změnou fáze vlny: Ta je podle rovnice (1) závislá na délce dráhy L, indexu lomu n a na vlnové délce λ. Φ = 2π L
n λ
(1)
V oblasti biosenzorů se převážně uplatňuje závislost na indexu lomu. Biokonjugovaná reakce, jako např. navázání jednoho proteinu na druhý, má za následek změnu indexu lomu prostředí.
To pak přímo ovlivní rychlost šíření světla v daném prostředí. Abychom tuto změnu mohli měřit, je třeba sledovat rovněž referenční světelný svazek. Referenční svazek je potřeba vést v blízkosti měřícího svazku, nicméně nesmí dojit k jeho ovlivnění detekovanou událostí. Zkombinování měřícího svazku (ovlivněného detekovanou událostí) a referenčního vytvoří interferenční tmavé a světlé proužky. Chemická, nebo fyzikální změna v senzorickém ramenu interferometru vede k posuvu interferenčních proužků. Preferovaným typem interferometru v oblasti biosenzorů je Mach-Zenderův interferometr (nikoliv Michaelsonův důvěrně známý z FTIR). Michaelsonovým interferometrem se nejprve získá referenční interferogram, a poté interferogram za přítomnosti vzorku. Fourierova transformace jejich rozdílu nám poskytne spektrum vzorku. Mach-Zender je užíván častěji, protože v senzorové analýze je výhodné použít monochromatického zdroje světla. Rovněž přítomnost pohybujících se zrcadel (jako v případě FTIR) není vhodná. Tento interferometr také měří pouze reálnou část indexu lomu (ne imaginární část, tedy absorpci). Relativně jednoduchý mechanismus a elektronika Mach-Zenderova interferometru jej předurčují pro výrobu levných přenosných zařízení. Jednoduchost konstrukce může znamenat jistá omezení při měření ; to je vykompenzováno možností ovlivňovat složení a strukturu obou ramen interferometru. Nejjednodušší interferometry jsou konstruovány pomocí planárních vlnovodů.
Historie Základy teorie interference a první interferometrické pokusy byly provedeny Thomasem Youngem v roce 1803 (Young, 1803). Pozorovaný jev položil základ teorie o vlnovém původu světla. Od té doby se interferometre používala nejčastěji pro prostorových/objemová měření. Pokud biokonjugovaná reakce proběhne uvnitř objemu pevné látky, nelze na tomto objemu pozorovat žádnou změnu. Až v době, kdy se podařilo biokonjugovanou reakci zafixovat na povrch, bylo možno pokročit v oblasti vývoje biosenzorů. V roce 1983, Lukosz a Tiefenthaler(1983a; Tiefenthaler a Lukosz, 1984a) při experimentech s mřížkovými vazebními členy pro planární vlnovody objevili, že vlhkost vzduchu ovlivňuje jejich vlastnosti. Reakce vodních par ve vzduchu s evanescentním polem vlnovodu změnila velikost ideálního úhlu pro navázání světla do vlnovodu, a tedy účinnost vazebného členu. Další experimenty potvrdily možnost využít těchto vlivů pro měření koncentrace plynů a vlhkosti (Thiefenthaler a Lukosz, 1984a; 1985). Poté se autoři věnovali zkoumání vlivu biokonjugovaných reakcí na mřížkové vazební členy a biosenzorům na bázi interferometrické analýzy v planárních vlnovodech (Nellen et al. 1988; Lukosz a Tiefenthaler, 1988, 1989; Lukosz, 1991).
Technologie a současný stav Optické interferometrické biosenzory využívají poznatků několika velmi dynamicky se rozvíjejících oborů. Vlnovody a integrovaná optika se v široké míře uplatnily v oblasti telekomunikací. Technologie výroby, jako např. fotolitografie, leptání, či depozice jsou produkty polovodičového průmyslu. Kvalitní lasery a detektory jsou výsledkem pokroku v počítačové technice, kde se používají lasery v CD-ROM mechanikách a detektory např. ve webkamerách. Některé návrhy jsou převzaty z technologie MEMS. Technika biosenzorů se díky pokroku v těchto oblastech posouvá velmi rychle kupředu.
3.1
Vlnovody
Vlnovod je srdcem typického interferometrického senzoru. Vede světlo a zároveň se na jeho povrchu odehrává biokonjugovaná reakce. Délka vlnovodu určuje citlivost senzoru. Různé optické metody nabízí přibližně stejné citlivosti při stejných délkách interakční oblasti. Základními komponenty pro senzory jsou : laserový zdroj, vlnovod a detektor. Vlnovody poskytují prostor pro interferometrii, podobně jako optická vlákna. Optická vlákna jsou tvořena jádrem (core) z materiálu o vyšším indexu lomu a obalem (cladding) o nižším indexu lomu. Světlo se pak šíří jádrem díky totálnímu odrazu na rozhraní. Část elektromagnetického pole proniká i do obalu - tato část se nazývá evanescentní pole. Veškeré EM pole je omezeno objemem vlákna (tedy jádrem a obalem) a energie neproniká do okolního prostředí. Planární vlnovod si lze představit jako optické vlákno rozvinuté do roviny. Vrstva s vyšším indexem lomu (tedy ta, kterou je vedeno světlo) je teď nad oblastí s nižším indexem lomu. Evanescentní pole zasahuje i do oblasti nad vlnovodnou vrstvou a sleduje případné změny v indexu lomu nad vlnovodnou vrstvou.
Obrázek 1: Profil indexu lomu gradientního vlnovodu a vlnovodu se skokovou změnou indexu lomu (step-index).
Planární uspořádání vlnovodu usnadňuje přidávání či výměnu optických členů na podložce, do vlnovodné vrstvy, či na tuto vrtsvu. Je možné zařadit mřížky, které umožňují navázat, či vyvázat světlo z vlnovodu, zrcadla, děliče svazku, nebo modulátory. Ke konstrukci vlnovodu lze použít jakýkoliv opticky transparentní materiál - nejčastěji sklo, nebo některé polymery. Citlivost planárního vlnovodu je dána indexem lomu vodivé vrstvy, tloušťkou vlnovodu a indexem lomu substrátu (podložky), který také přispívá k intenzitě evanescentního pole nad vlnovodnou vrstvou. S rostoucím rozdílem mezi indexy lomu substrátu (podložky) a vlnovodné vrstvy se zvyšuje citlivost vlnovodu. Rozlišujeme dvě hlavní skupiny planárních vlnovodů : vlnovody se skokovou změnou indexu lomu, tzv. stepindex vlnovody a vlnovody s postupnou změnou indexu lomu (gradientní vlnovody) - tzv. graded index (viz. Obrázek 1). Vlnovod s postupnou změnou indexu lomu je charakterizován plynulým přechodem indexu lomu mezi substrátem a vrchní vrstvou vlnovodu. Ta má velký index lomu, přičemž jeho velikost se plynule snižuje směrem k substrátu. Tento typ vlnovodu se nejčastěji vyrábí
iontovou výměnou, kdy v substrátu (nejčastěji sklo) jsou přítomné jednoduché ionty, jako např. sodík, které lze vyměnit za stříbrné, cesiové, draselné, lithiové, thaliové, případně i jiné jednoduché ionty. Substrát se umístí do solné lázně, která obsahuje iont, který chceme dodat do substrátu. Volba chemického prvku, koncentrace jeho iontů a doba působení lázně - to vše ovlivní hloubku difúze do substrátu, a tedy tloušťku vodivé vrstvy, počet vlastních módů a profil indexu lomu. Tato metoda se občas modifikuje přiložením elektrického pole na substrát v lázni; případně žíháním vrstvy po vyjmutí z lázně. Pro gradientní vlnovody byly publikovány docílené změny indexu lomu v povrchové vrstvě v rozmezí 0.003 až 0.1. (Millar a Hutchins, 1978; Walker a Wilkinson, 1983; Gato a Srivastava, 1996). Step-index vlnovody vykazují skokovou změnu profilu indexu lomu. Toho lze dosáhnout depozicí materiálu s vyšším indexem lomu na substrát s nižším indexem lomu. Pro tvorbu polymerových a sol-gel vlnovodů se používají depoziční metody jako např. spin-coating a dip-coating. Pro skleněné substráty se používají tradiční metody polovodičového průmyslu: chemická depozice z pevné fáze (CVD), napařování a naprašování. Tyto metody umožňují jemnou regulaci depozičního procesu a docílení požadované citlivosti vlnovodu. Z teorie vlnovodů plyne, že tloušťka vlnovodu se nemůže zmenšovat do nekonečna - při jisté tloušťce vrstvy už vlnovod není schopen vést světlo. Největší citlivosti je dosaženo právě poblíž této mezní šířky (tzv. cutoff). Čím více se vlnovod zužuje (čím je vlnovodná vrstva tenčí), tím silnější je evanescentní pole mimo něj. Stanovit citlivost vlnovodných struktur lze například umístěním slaného roztoku na povrch vlnovodu a následným interferometrickým měřením změny fáze optického svazku vedeného vlnovodem. S rostoucí koncentrací solného roztoku roste index lomu roztoku. Vlnovody s postupnou změnou indexu lomu jsou principiálně méně citlivé než step-index vlnovody. Je to dáno tím, že prostou iontovou výměnou nelze dosáhnout velkého kontrastu indexů lomu. Pokud chceme získat strukturu s velkým rozdílem indexů lomu, je třeba použít vlnovody se skokovou změnou n. Příklad: Substrát ze skla BK-7 byl ponořen na 20 minut do solné lázně, která obsahuje 0.25molárních procent AgNO3 v NaNO3 při teplotě 325°C. Došlo ke změně indexu lomu o 0.001. To vedlo k fázovému posunu procházejícího svazku o 0.22π rad na 1cm dráhy. Ve druhém případě byla deponována pomoci CVD technologie vrstva Si3N4 (110 nm silná) na tavený křemen. Stejná změna indexu lomu (o 0.001) na stejné dráze (1 cm) vyvolala fázový posuv o 7.6π rad. Tento třicetičtyřnásobný nárůst citlivosti je způsoben malým kontrastem indexu lomu v gradientním vlnovodu (pouze o několik tisícin), oproti rozdílu 0.4 v případě Si3N4 vlnovodu na taveném křemeni. Vlnovod je schopen vést světlo pouze při dosažení kritických hodnot rozdílu indexů lomu a tloušťky vlnovodné vrstvy. Toto chování vlnovodu je podrobně popsáno v literatuře (Nishihara, et.al., 1985a). Pro senzorové aplikace je nutné si uvědomit, že vedení světla je možné pouze při splnění podmínky příčné rezonance. Tato podmínka říká, že vedený svazek musí být prodělat fázový posuv 2π v pravidelných vzdálenostech podél vlnovodu. Matematicky je tato podmínka přepsána pro transverzálně elektrické pole TE (rovnice 2) a pro transverzálně magnetické pole (rovnice 3). Obě rovnice uvažují fázový posuv způsobený šířením v prostředí (2 k nf W cosθ) a posuvy způsobené odrazy na rozhraních.
1 2 2 2 2 (n f sin θ − n S ) 2kn f W cos θ − 2 tan − 1 n f cos θ
1 2 2 2 2 2 n f (n f sin θ − n S ) 2kn f W cos θ − 2 tan − 1 2 n f cos θ nS
kde
1 2 2 2 2 (n f sin θ − nC ) − 2 tan − 1 n f cos θ
= 2π m
1 2 2 2 2 2 n f (n f sin θ − nC ) − 2 tan − 1 2 n f cos θ nC
= 2π m
(2)
(3)
m – je módové číslo (0,1,2 ...) nf – index lomu vlnovodné vrstvy nc – index lomu svrchní vrstvy vlnovodu nS – index lomu substrátu W – tloušťka vlnovodné vrstvy v nm
Trasa paprsků a rozdělení energie ve vlnovodu pro první dva vlastní módy je na obrázku 2. Se zvětšující se tloušťkou vrstvy, případně se zvětšujícím se rozdílem indexů lomu vlnovodné vrstvy a substrátu, popř. vrchní vrstvy, se zvětšuje počet módů, které mohou být navázány. Povšimněte si rozdílu mezi rovnicemi (2) a (3) - viz násobící faktor ve výrazu tangens pro TM módy. Ve výsledku to znamená, že TM módy potřebují větší tloušťku vlnovodu, aby mohly být vedeny. V případě vedení módů TE i TM, jsou módy TE vedeny (soustředěny) blíže středu vlnovodu.
Obrázek 2:Dráha paprsků a rozdělení elektrického pole prvních dvou vedených módů
3.2
Metody navázání světla do vlnovodu
Prvním problémem, který je třeba vyřešit při senzorové analýze, je navázání světla do vlnovodu. Existují tři nejčastěji používané metody: endfiring (přímé navázání), navázání pomocí optického hranolu, nebo pomocí mřížkového vazebného členu (viz. Obrázek 3).
Přímé navázání je nejjednodušší způsob, jak vybudit vedený mód ve vlnovodu. Světlo se navazuje na počátek vlnovodu ve směru jeho šíření. Svazek je buď fokusován čočkou, nebo je zaveden optickým vláknem přímo k vlnovodné vrstvě. Maximální účinnosti je dosaženo v případě, že profil svazku odpovídá profilu vybuzeného módu (Nishihara, 1985b). Pro nultý mód, který je používán nejčastěji, tomu odpovídá Gaussovský profil. Je žádoucí, aby vlnovod měl maximální účinnost navázání světla a minimální rozptyl. Proto se počátek vlnovodu buď pečlivě leští, nebo, jako v případě křemíkových substrátů, štípe (cleaving). Ačkoliv lze dosáhnout velmi vysoké účinnosti navázání, nejsou pro interferometrické biosenzory požadavky tak přísné, a lze tolerovat jisté procento ztrát. Metoda přímého navázání funguje nejlépe pro vlnovody s větší šířkou vlnovodné vrstvy, např. pro vlnovody vytvořené iontovou výměnou. V případě step-index vlnovodů a vlnovodů z materiálů s vysokým indexem lomu, a pokud navíc chceme vybudit jen základní mód, je třeba pečlivě dbát na to, aby všechny optické členy byly justovány do jedné osy. Pokud má vlnovodná vrstva rozměr řádu 100 nm, pak jsou na vzájemné zjustování optických os laseru a vlnovodu kladeny velké požadavky. V případě použití kanálkových vlnovodů je justáž složitější. Problémy s vyrovnáním (justováním) celé soustavy do jedné osy ztěžuje integrování senzoru, hlavně v těch případech, kdy je nutné vlnovodný čip často měnit.
Obrázek 3: Metody navázání světla do vlnovodu: a) přímé navázání – endfiring; b) navazování optickým hranolem; c) navazování optickou mřížkou
Navázání světla pomocí optického hranolu umožňuje docílení vysoké účinnost navázání. Prizma musí být umístěna nad vlnovodnou vrstvou. Hranol vybudí mód ve vlnovodu tak, že dojde ke zfázování příchozí vlny s vlastním módem vlnovodu. Používají se prizmy s vysokým indexem lomu, jako např. z těžkého flintového skla (n=2.009), nebo z rutilu (TiO2 ; no = 2.584, ne = 2.872). Hranol musí být v těsném kontaktu s vlnovodnou vrstvou. Jelikož jsou hranol a vlnovod „tlačeny“ k sobě, je důležité, aby jejich povrchy byly pečlivě očištěny. Jakmile lze pozorovat interferenční proužky, nebo navázané světlo ve vlnovodu, je kontakt dostatečný. Stěna prizmy, která je v kontaktu s vlnovodem je velmi pečlivě leštěna a zabroušena tak, aby vznikla malá vzduchová mezera, kterou se světlo naváže do vlnovodu. K navázání světla dojde, když je splněna podmínka β = k nf sinθ , kde β je konstanta šíření, k je vlnové číslo 2π/λ a nf je index lomu vlnovodu. θ je úhel dopadu. V praxi tedy měníme úhel θ a tím si vybíráme, které módy budou vybuzeny ve vlnovodu. Nicméně použití hranolů výrobu senzoru komplikuje. Je nutno používat šroubového mechanismu pro zajištění dostatečného tlaku hranolu na vlnovod. Další komplikaci představuje otočný mechanismus pro změnu úhlu θ. V naší laboratoři (tj. laboratoři autora článku) se uspořádání s hranolem používá převážně pro testování kvality vlnovodů, a méně
často pro senzorovou analýzu. K největší komplikacím dochází když je cela používána v aplikacích s vodním roztokem. Izolace v kontaktu s vlnovodem obvykle způsobí vyvázáni světla z vlnovodu. Proto potřebuje vlnovod jistý způsob ochrany, která jej izoluje od cely a umožní šíření světla ve vlnovodu. Další obtíže nastávají v oblastech přechodu mezi hranolem a ochrannou celou, nebo mezi celou a vlastní oblastí senzoru. Z těchto důvodu jen málo výzkumných pracovišť používá hranoly pro navazování světla do vlnovodu. Třetí variantou je navázání světla do vlnovodu prostřednictvím mřížkového vazebného členu vyrobeného přímo ve vlnovodu. Mřížkový vazební člen je struktura s periodicky se měnícím profilem indexu lomu ve vlnovodné vrstvě, nebo v substrátu. Vyrábí se převážně ražením, leptáním, nebo iontovou výměnou. Ražení probíhá tak, že se komerčně vyráběná mřížka obtiskne do vlnovodu z měkkého materiálu, jako jsou např. sol-gely, nebo polymery. Například sol-gel (koloidní roztok) SiO2- TiO2 je nanesen na substrát technikou dip-coating a nechá se částečně vysušit. Poté je po dobu několika minut přitlačena k povrchu mřížková forma - tlakem 40- 50 kg (Lukosz a Tiefenhaler, 1983b; Hengerger a Lukosz 1986; Ramos et.al, 1996). Poté se forma uvolní a sušení se dokončí termicky. Při návrhu výrobního postupu je vždy zapotřebí uvažovat úbytky hmotnosit. Touto metodou byly vyrobeny mřížky o rozměrech v rozmezí 250 – 850 nm s účinností 10-25%. Lze použít i polymery - nicméně jsou tvrdší, nejsou tak inertní a mají větší dn/dt než sol-gely. Mřížkové vazební členy bývají pokryty ochrannou vrstvou např. SiO 2 tak, aby byly izolovány od vnějšího prostředí. Vrstva SiO2 pak tvoří vrchní vrstvu nad vlnovodnou vrstvou z SiO2/TiO2 a tyto materiály pak vytváří kontrast indexu lomu pro mřížku. Dalším způsobem výroby mřížek je použitím fotorezistů a fotomasek. Masku lze vyrobit mnoha způsoby. Jedním z nich je použitím dvou překřížených (protínajících se) laserových svazků. Vzor mřížky může být zaznamenán jak do vlnovodu, tak do substrátu. Vlastní mřížka je pak vyrobena leptáním reaktivními ionty, nebo chemickým leptáním (Hartman et. al, 1998). Opět se může přidat izolační vrstva z oxidu křemičitého jež chrání mřížku od okolí. Kontrast v profilu indexu lomu je pak dán buď rozhraním vlnovod/izolační vrstva, nebo vlnovod/substrát. Tyto mřížky mají podobnou účinnost, jako mřížky vytvořené ražením. Mřížky vyrobené iontovou výměnou mají menší rozdíl indexů lomu a jejich efektivita je tudíž nižší. Jednou z výhod, které mřížky nabízejí, je možnost navázat do vlnovodu světlo ze spodní strany. To umožňuje na vlnovod umístit testovací celu a testová kapalina je pak nad vlnovodem. Mřížkové vazební členy nejsou (ve srovnání s „end- firingem“) tak citlivé na justování do jedné optické osy. Vlnovodné čipy mohou být snadno vyměněny a získáváme tak „plug and play“ senzory. Mřížkové vazební členy nicméně nejsou vhodné pro navazování do kanálkových vlnovodů, protože tam ztrácíme jeden stupeň volnosti (oproti planárnímu vlnovodu). Rovněž nastavení požadovaného profilu svazku je obtížnější. Mřížky jsou rovněž citlivé na vlnovou délku (v závislosti na úhlu), což je výhodné, pokud nemáme monochromatický zdroj. Navíc, mřížkové členy o velkých rozměrech mohou sloužit se stejnou účinnosti pro více interferometrů na jednom čipu.
Obrázek 4:Schéma Mach-Zenderova interferometru
3.3
Interferometry
Z vlnovodu se šíří evanescentní pole, které je citlivé na změny v blízkém okolí povrchu vlnovodu. Umístíme- li do tohoto prostoru chemicky selektivní citlivou vrstvu, pak tato vrstva zprostředkovává kontakt mezi vnějším prostředím a světlem, které je vedeno vlnovodem. Chemická či fyzikální interakce prostředí s vlnovodem mění index lomu této vrstvy a tím ovlivňuje rychlost světla, či jeho fázi. Pro měření této změny je svazek zkombinován s referenčním za vzniku interferenčních proužků. Schéma měření je na obrázku 4. Dojde – li k fyzikální, nebo chemické interakci, pak to má za následek změnu posuvu interferenčních proužků, přičemž tento posuv sleduje průběh funkce sinus. Fázový posuv je definován pomocí efektivního indexu lomu neff, což je číslo charakteristické pro vlnovod a je závislé na indexech lomu vlnovodné vrstvy, substrátu i vrchní vrstvy. Na interakční délce L pak dochází k fázovému posuvu: Φ =
2π (∆ neff ) λ
(4)
Spodní detekční hodnota je dána šumem (jak termickým, tak mechanickým), dále vlnovodem, stabilitou laseru a charakteristikami detektoru. Typicky jsou detekovatelné změny indexu lomu v řádu 10-6 . Interferometrické senzory nabízí přímou „label-less“ biodetekci, eliminují vliv tepelného a mechanického šumu, parazitních signálů i změny indexu lomu bulkového (objemového) materiálu. Další výhodou interferometrických senzorů je možnost optické integrace pro další zvýšení stability, jejich kompaktnosti, rozměrů a nízká cena. Bylo studováno několik typů interferometrů. Každý má jiný způsob konfigurace senzorického a referenčního ramena, stejně tak se liší i uspořádáním směšovačů optických svazků z těchto ramen. Každé schéma má své výhody i nevýhody a neexistuje ideální konfigurace. Vláknové senzory, které potřebují nejen klasické, ale i vláknové optické členy, se zdají být poněkud těžkopádné pro praktické využití. Senzory se vyvinuly z několika druhů interferometrů. Převážně se jednalo o tato uspořádání: s diskrétními a oddělenými optickými dráhami, s „side-by- side“ kanály na jednom povrchu a s vrstevnatou strukturou v kolineárním uspořádání kanálů.
Vlnovodné interferometry jsou důsledkem rozvoje telekomunikačního průmyslu. Ten vyvinul optická vlákna pro přenos signálu a planární vlnovody pro usnadnění integrace a manipulace se signálem. Zpočátku využívala optická vláknová interferometrie kombinaci klasické a vláknové optiky. S pokračujícím vývojem byly postupně všechny klasické optické členy nahrazeny členy vláknovými. Tyto struktury se jako senzory používaly převážně pro měření tlaku a teploty. Různé varianty vláknové interferometrie jsou popsány v souhrnném článku od Kinseyho (1990). Někteří vědci používali tyto senzory také pro biosenzorové aplikace například (Choquette a Locascio-Brown, 1994) měřili teplotu s cílem monitorování tepla vznikajícího při enzymatické reakci. Choquette umístil jeden reaktant na optické vlákno a vedle něj umístil referenční vlákno. Reakce katalýzy s peroxidem vodíku (H2O2) vyprodukovala teplo, které pak bylo měřeno interferometrem. (pozn. překl.: katalyza enzym, který katalyzuje odstranění toxického peroxidu vodíku z buňek. Přítomen ve všech živočišných orgánech). Vývoj vláknových interferometrů pak směřoval do oblastí akustiky, gyroskopie a do měření tlaku a teplot. V chemii se interferometry používaly převážně pro měření absorbance a fluorescence. Většina interferometrických měření se provádí planárními vlnovody. Planární uspořádání má výhodu (díky možnosti vyrobit velmi tenkou vrstvu) ve větším dosahu evanescentního pole. Dále umožňuje snadnější integraci optických komponent. Zásadním problémem vlnovodné interferometrie je v návrhu referenčního kanálu. Jelikož základním principem interferometre je měření rozdílu mezi senzorickým a referenčním kanálem, musí být druhý kanál (referenční) navržen tak, aby došlo k maximálnímu vynulování nežádoucích signálů. Signál pozadí má původ v tepelných jevech, mechanických změnách, případně ve změnách indexu lomu „bulkového“ materiálu. Dále je třeba vzít v potaz změnu indexu lomu vzorkovacího média a nespecifické reakce (čili další chemické reakce, které ovšem nechceme detekovat). Je žádoucí, aby referenční rameno bylo umístěno co nejblíže k senzorickému kanálu, a aby mělo stejnou strukturu, délku a i ostatní vlastnosti. Jediným rozdílem musí být citlivost na danou specifickou reakci, kterou chceme detekovat. Vláknová optika nemůže soupeřit s možnostmi vlnovodů, protože senzorové vlákno je fyzicky odděleno od referenčního vlákna. V případě planárních vlnovodných interferometrů jsou kanály umístěny na jedné struktuře a jsou od sebe vzdáleny méně než 1mm. Tato blízkost eliminuje tepelné, nebo mechanické vlivy na měření. Bohužel vliv lokálních změn indexu lomu materiálu nelze tímto způsobem zcela vyeliminovat a je třeba ji ve fluidní dynamice cely uvažovat. V ideálním systému by se změna indexu lomu projevila v obou kanálech současně. Existují dvě základní skupiny interferometrických konstrukcí: polarimetrické a dvou- módové interferometry. Tato uspořádání umožňují minimalizovat vlivy způsobené rozdíly mezi kanály. Trasy referenčního a senzorového svazku jsou v tomto případě kolineární, čili oba svazky procházejí stejným objemem vlnovodu a to eliminuje vliv tepelných a mechanických efektů, které se projevovaly v uspořádání se dvěma sousedními kanály. Nicméně i v tomto případě ovlivní bulkové změny indexu lomu výsledky měření. Index lomu ovlivňuje oba módy, nebo polarizaci. V uspořádání se dvěma kanály („side- by- side model“) je důležitý fluidní pohyb částic materiálu. V kolineárním uspořádání jsou změny bulkového indexu lomu detekovány současně, ale rozdílným způsobem - a to díky rozdílu v šíření evanescentního pole těchto dvou módů. Většina interferometrických schémat, včetně materiálů a výrobní technologie, byla převzata z oblasti telekomunikací. Děliče svazku, Y – uzly (symetrické rozvětvení buzené do společné větve) a modulátory se dodnes používají při návrhu a vývoji referenčních kanálů a pro docílení maximální detekce. Ranganath a Wang (1977) navrhli vlnovod využívající Mach-
Zenderův interferometrický modulátor; spíše než chemické změny jsou to elektronické interakce, které ovlivní fázi světla v kanálu inteferometru. Tento optický modulátor pomáhá odstínit vlnovod před nežádoucími vlivy okolí. Naopak senzory se snaží zvýraznit vliv okolí na fázi vedeného světla. Ramena interferometru slouží jako senzor (interrogator) a jako reference. Pokud je referenční rameno skryto pod inertní vrstvou a senzor je vystaven vnějším vlivům, dojde k ovlivnění světla v senzorickém ramenu díky změně indexu lomu okolí. Tyto indikované změny mohou být způsobeny specifickou interakcí, nespecifickou interakcí, nebo změnou indexu lomu prostředí Většinou se jedná o kombinaci všech výše uvedených vlivů. V případě detekce specifických jevů, jako např. vazeb antibody (protilátka) – antigen je referenčního kanál vystaven vlivu prostředí a tím se stane citlivým vůči nespecifickým, nebo bulkovým, změnám indexu lomu. Kvalitní návrh referenčního kanálu je zásadní pro maximalizaci detekce požadovaného analytu. Kanálkové Mach-Zenderovy interferometry mají kanálky vyrobeny „na“ nebo „v“ planární podložce. Y-spojky se používají pro rozdělování a slučování světelných svazků. Existují dva základní druhy kanálků: vzniklé iontovou výměnou (v substrátu) (Helmers et.al., 1996; Drapp et al., 1997; Luff et al. , 1998), nebo deponované pásky (Fisher a Müller, 1992; Brosinger et al. 1997; Schipper et al., 1997; Stamm et al., 1998; Weisser et al., 1999) (Obrázek 5). V prvním případě (u iontové výměny) se nejprve deponuje vzorovaná kovová maska, přičemž zůstává odkryta struktura kanálků. Pak se ponoří substrát s maskou do taveniny obsahující žádoucí iont. Ionty difundují do kanálků a vytvářejí vlnovodnou strukturu. Na senzorickou oblast je poté deponovaná vrchní vrstva.
Obrázek 5:Schéma dvou typů kanálkového Mach-Zenderova interferometru
Výroba páskových kanálkových vlnovodů probíhá deponováním vrstvy s vysokým indexem lomu na substrát z nižším indexem lomu. Vlastní kanálek z této vrstvy je pak vytvořen fotolitograficky, buďto vyleptáním, nebo tzv. technikou lift-off. Vlnovody pro obě metody musí být dostatečně dlouhé, protože divergenční úhel, který svírají ramena Y-členu musí být velmi malý. Je- li úhel malý, pak je vyžadována větší délka ramen tak, aby se kanálky dostatečně separovaly pro chemickou či biochemickou funkcionalizaci. Dalším stavebním blokem je zúžení do Y-členu (symetrické rozvětvení buzené do „výstupních větví“) ; také v tomto případě je potřeba pečlivý návrh členu, aby nedošlo ke konverzi energie do dalších příčných módů. Šířka kanálů musí být navržena tak, aby
neumožňovala šíření dalších příčných módů. Hrany kanálků musí být hladké, aby se minimalizoval rozptyl na nerovnostech - s tímto problém se setkáváme nejčastěji u deponovaných vlnovodů. Pro oba typy kanálkových přístrojů jsou snímací a referenční okna deponována na horní (svrchní) vlnovodnou strukturu. Světlo se naváže do jednoho konce vlnovodu buď pomocí fokuzační čočky, nebo optického vlákna pečlivě justovaného s osou vlnovodu (Nishihara et. al., 1985b). Pro vlnovody vyrobené na křemíkovém substrátu je možno použít V-groove ( Vdrážka) technologii pro srovnání členů do jedné osy (Fischer a Müller 1992)
Obrázek 6: Mach-Zender s trojvlnovodným vazebným členem
Kanálkový Mach-Zenderův interferometr je prostředkem k rozdělení světla z bodového zdroje do dvou, nebo více kanálů a ke zkombinování dvou signálů do jednoho kanálu interferenčního. Nicméně je obtížné nastavit pozici fáze výstupního signálu blízko kvadratury (quadrature; signál je v prostoru sinusový, pokud by detektor byl ve vrcholu sinusovky,měření by bylo málo citlivé, snahou je aby před měřením byl detektor v lineární oblasti funkce sinus a odchylka byla lépe měřitelná) , k dosažení maximální lineární citlivosti. Úmyslná změna indexu lomu (o známou hodnotu) v jednom z ramen zařízení umožní určit jak pozici fáze tak i minim a maxim na začátku experimentu. Kvadraturní problém lze zmírnit (Luff a Wilkinson, 1998) použitím vazebního členu se třívlnovodným vazebním členem – jako se používá v telekomunikačním průmyslu. Tento vazební člen (Obrázek 6) se skládá ze 3 paralelních (přilehlých, sousedních) vlnovodů; dvou ramen interferometru a třetího, umístěného mezi nimi. Výstupní signály jsou vzájemně mezi sebou rozfázovány o 2π/3. Alespoň jeden výstup se vždy nachází poblíž kvadratury. Součet všech tří výstupních signálů je konstantní a to umožňuje monitorování stability laserového záření, nebo změny absorpce v interferometru. Zajímavou variantou kanálkového Mach-Zenderova interferometru je Youngův interferometr (Brandenburg, 1997, Brandenburg et.al, 2000) (obr.7). Má useknutou druhou polovinu zařízení, nemá rekombinaci; a světlo po průchodu oběma větvemi propouští ven z vlnovodu (aniž by je předtím smísil). Díky divergenci výstupního svazku dojde v jisté vzdálenosti k překryvu signálů z vlnovodu a k vytvoření interferenčních vzorků. Youngův interferometr nepotřebuje žádnou přídavnou optiku a umožňuje kompletní pozorování interferenčních proužků. Při použití jednoho bodového detektoru mohou být pružky pro min a max
skanovány posunem detektoru nebo použitím zrcadla. Detekce proužků bez translace je možná použitím pole detektorů.
Obrázek 7:Schéma Youngova interferometru
Nevýhodou Youngova uspořádání je vzdálenost mezi výstupem vlnovodu a detektorem, která λL je potřebná pro dosažení maximálního rozlišení proužků. Perioda proužků je rovna , kde d L je vzdálenost od konce vlnovodu a d je vzdálenost mezi dvěma kanály. Jelikož interferenční proužky existují v prostoru, může být detektor umístěn v libovolné vzdálenosti a vzdálenost detektoru je často je dána vlastnostmi detektoru. Vzdálenost mezi kanály rovněž ovlivňuje velikost proužků. Jejich velikost se zvětšuje s klesající vzdáleností mezi kanály a je diktována minimální vzdáleností potřebnou pro funkcionalizaci detekce a pro referenční chemii. Použitím kombinace fotolitografických metod v kombinací se změnami povrchové energie se tato vzdálenost pohybuje v řádu 100 mikrometrů. Ne-kanálkový (bezkanálový) Mach-Zenderův interferometr dělí a slučuje svazky mimo čip (off-chip uspořádání). Namísto Y-členu jsou použity dělič svazku a čočky. Tento zjednodušený model (obrázek 4) se skládá ze slabového (destičkového) vlnovodu s detekčními a referenčními oblastmi definovanými detekční chemií a překryvovou vrstvou. Světlo není navazováno přímou metodou (end-firing). Častěji se tento systém používá buď pro navazování hranolem, nebo mřížkou vyrobenou ve vlnovodu. Nekanálkový MachZenderův interferometr se svazky kombinují nejčastěji pomocí čoček. Minimální vzdálenost kanálů je dána vlastnostmi děliče svazku, typicky 1mm – takže vzdálenost mezi interferenčními proužky je pak velmi malá. Proužky vznikají pouze v oblasti překryvu dvou svazků (convergence of beams). Mikroskopický objektiv poté rozšiřuje interferenční obrazec buďto na aperturu (štěrbinu) s bodovým detektorem, nebo na pole detektorů (bez použití štěrbiny). Umístění zrcadla do dráhy interferujících svazků (mezi objektiv a detektor) umožní mechanickou manipulaci s pozicí proužků, čehož lze využít jak pro určení minim a maxim, tak i pro nastavení bodového detektoru do oblasti kvadratury . Jedna praktická metoda pro určení minima a maxima interferenčních proužků a nastavení detektoru do kvadratury (Heideman a Kooyman, 1994) zahrnuje umístění fázového posuvu do jedné z větví interferometru. Fázový posuv je vlastně rotující skleněná destička umístěná vně vlnovodu.
Heideman (Heideman et. al., 1994, 1996) používal při svém výzkumu elektrooptický material ZnO2, který umístil do jedné z větví interferometru. Aplikací elektrického pole na tento materiál došlo ke změně indexu lomu a tedy k fázovému posuvu. To samozřejmě způsobilo posun interferenčního obrazu. Tímto mechanizmem můžeme nastavit detektor do lineární, nejcitlivější polohy, do tzv. kvadratury. Samozřejmě můžeme také měřit napětí na elektrooptickém členu a poté kvantifikovat změny efektivního indexu lomu Neff při vlastním měření. Výhoda vlnovodu použitého v nekanálkovém Mach-Zenderově interferometru je ve snadné výrobě vlnovodu, což umožňuje a ulehčuje měření různých úloh v detekční chemii. Hlavní nevýhodou je požadavek na zařazení vícenásobných optických členů do detekčního schématu. Tyto vícenásobné komponenty zvyšují celkový mechanický šum detektoru a najednou lze použít pouze jeden interferometr. Nekanálková varianta Youngova interferometru použije výstupy z dvou ramen vlnovodu a difraktuje je na štěrbině (Hradetsky a Brandenburg, 2000). Pokud vezmeme v úvahu přirozenou divergenci laserového svazku, budou tyto dva svazky spolu po jisté době interagovat a vytvoří interferenční obrazec bez použití další externí výstupní optiky. V souosém (kolineárním) uspořádání lze u polarimetrických nebo diferenčních interferometrů minimalizovat teplotní a mechanické vlivy (Stamm a Lukosz, 1993,1994; Lukosz 1995). V tomto uspořádání (Obrázek 8) se senzorický a referenční svazek šíří společně stejným objemem vlnovodu. Detekovaná událost se potom objeví díky rozdílům v rozšířeném evanescenčním poli těchto dvou polarizací příčného elektrického a magnetického pole. Jak již bylo zmíněno TE mód se šíří v tenčí vrstvě než mód TM. Tlustší vlnovod povede TE módy a umožní šíření TM módů. Evanescentní pole TM módu je nad vlnovodem silnější než pole TE. Mezimódové interferometry využívají různé citlivost jednotlivých vedených módů na fyzikální a chemické změny nad vlnovodem. Různé fázové posuvy různých módů pak poskytují možnost kvantifikovat daný jev.
Obrázek 8:Schéma diferenčního(polarimetrického) interferometru
Obě polarizace jsou navázány do vlnovodu rotováním (otočením) laserového záření o úhel asi 45° od normály. Jednotlivé polarizace mají různé účinnosti navázání a šíření a abychom dosáhli u obou stejných úrovní, je potřeba jednu z polarizací ovlivnit, naklonitt (biasing). Obě polarizace se šíří vlnovodem , s tím, že fáze TM polarizace je více ovlivněna než polarizace TE. Oba svazky jsou poté vyvázány, a odděleny děličem svazku, dvěma Wollastonovými hranoly, a čtvrtvlnnou a půlvlnnou destičkou a jsou navedeny na čtyři fotodetektory, kde je proměřen fázový rozdíl.(Lukosz et al., 1997).
Toto erejové uspořádání může být dále zjednodušeno. Jednou možností je použití Wollastonova hranolu a polarizátoru, další variantou je pak použití mřížky, čočky a polarizátoru, s tím že výsledný interferenční obrazec je poté zaznamenán na CCD čip (Lukosz et al., 1997). Tato dvě uspořádání generují interferenční obrazce buď ortogonální (v prvním případě), nebo mimo- osový, čímž se otevírá možnost umístění vícenásobných senzorů na jednom substrátu a možnost použití pro analýzu pouze jednoho 2D pole detektorů (Lukosz et al., 1997). Aby bylo možno využít maximálně polarimertického schématu, je nutné, aby vlnovod byl pečlivě navržen tak, aby maximalizoval rozdíl v citlivostmi dvěma (oběma) módy. Nejlepších výsledků se dosahuje použitím jednomódových „step-index“ vlnovodů, jejichž tloušťka je jen o málo větší, než kolik potřebuje první TM mód pro šíření. První výzkumy probíhaly na vlnovodech vytvořených metodou sol-gel z TiO2-SiO2 s indexy lomu 1.8-2.0 a tloušťkou vrstvy asi 200 nm. Referenční kanál interferometru je při měření rovněž ovlivněn a tím se potlačí rozdíl mezi TE a TM módy (v tomto případě jeho roli hraje TE mód). V závislosti na typu vlnovodu je možno tento negativní jev omezit až na 50% v porovnání s interferometry s oddělenými kanály („side- by side“ Mach Zender interferometr). Je třeba zmínit, že TE a TM módy reagují různě na změnu indexu lomu materiálu vlnovodu (bulk materialu). Špatně navržená reference sníží citlivost interferometru vůči detekované události a sníží schopnost kompenzovat změny indexu lomu bulkového materiálu. To co získáme vysokou teplotní a mechanickou stabilitou tohoto uspořádání nemusí stačit pro vykompenzování zmíněných problémů, pokud nejsme schopni minimalizovat změny indexu lomu bulkového materiálu vlnovodu, a změny vzniklé díky zvýšení specifických vazeb nad vazby nespecifické. Polarimetrické, nebo rozdílové (diference) interferometry, nejsou schopny rozlišit mezi detekovanou událostí a změnou indexu lomu bulkového materiálu, případně změnou teploty. Nicméně existuje způsob jak se vyrovnat s tímto nedostatkem a to současným použitím dvou vlnových délek; tak obdržíme další informaci, abychom byli schopni odlišit vliv reakce a vliv změn indexu lomu materiálu, nebo vliv reakce a vliv teploty (ale není možno odlišit ovlivnění teplotou a změnou indexu lomu) (Stamm et al., 1998). Toto uspořádání vyžaduje použití dalšího laseru; v tomto případě se k He-Ne laseru (633nm) přidal Ar- ion laser (488nm). Lze použít i polovodičové lasery. Tím jsme ovšem omezení pouze na přímé navázání světla (endfiring) – tedy pokud se chceme vyhnout problémům, které vznikají při navazování mřížkou (pro každý laser je potřeba nastavit jiný úhel navázání). Pro zajímavost, bylo rovněž navrženo provést rozlišení těchto dvou efektů použitím dvou interferometrů s vlnovody o různých tloušťkách, ale operujícími na stejné vlnové délce. Citlivost, kterou má vlnovod na dvou různých vlnových délkách lze popsat pomocí analogie s popisem modelu vlnovodu na dvou vlnových délkách, při jedné tloušťce vlnovodu. (Lukosz 1995). Také v Mach-Zenderově interferometru se dvěma sousedními kanály („side by side“) je třeba započítat mimo vlivu detekované události rovněž vlivy změn indexu lomu materiálu a teploty. Nevýhodou těchto kompaktních senzorů je právě nutnost zařazení vícenásobných optických zařízení k analýze výstupu jak z polarizačního , tak z diferenčního interferometru. V posledních pracech (Koster et al., 2000) došlo k integrování polarizační optiky přímo na vlnovodný čip (Obrázek 9). Součástí zařízení je také konvertor polarizace, jež je schopen proměnit část energie jednoduše (singly) polarizovaného TE módu do energie TM módu. Tyto dva svazky poté procházejí detekční oblastí. Za touto oblastí je umístěn další polarizační konvertor umožňující jejich smísení. Poté jsou oba módy postupně vyvázány. Celé zařízeni zakončuje detektor integrovaný na křemíkovém substrátu. Pouze laser zůstává externí.
Obrázek 9: Schéma integrovaného polarimetrického (diferenčního) interferometru
Další návrh diferenčního interferometru (Hartman et al., 1988) využívá toho, že při stejné polarizaci mají různé módy různá evanescentní pole. Přestože toto uspořádání bylo patentováno (Hartman, 1990), nikdy nedošlo k jeho použití jako biosenzoru. Různé módy potřebují pro navázání různé úhly a tato podmínka přináší velké komplikace. Žádoucí pro senzorickou analýzu je zařízení, které je schopno zpracovat více analytů najednou, nebo v rychlém sledu bez větší potřeby přestávek, nebo výměny čipů. Toho lze dosáhnout pomocí několika nekanálkových Mach-Zenderových interferometrů na jednom čipu (Hartman et al., 1998). Tento čip obsahuje 13 interferometrů na ploše 1 x 2cm. Záření laseru je nasměrováno na širokou mřížku, která zavede světlo do všech interferometrů najednou. Vlnovod je tvořen vrstvou Si 3N4 deponovanou na skleněném substrátu. Délka kanálů je definovaná vzory z tlusté vrstvy SiO2. Vlastní senzorická oblast (senzorická chemie) je umístěna uvnitř kanálů. Kanály jsou definovány spíše immobilizovanými chemickými procesy na povrchu vlnovodu, než vlastními světelnými svazky. Široké svazky jsou zkombinovány a poté prochází postupně reflektorem, děličem svazku a dalším reflektorem. Výsledný interfereční signál je vyvázán další širokou mřížkou a soustava interferenčních proužků je pak analyzována detektorovým erejem (Obrázek 10). Počet navržených interferometrů je v tomto případě je určen minimálním rozlišením detektoru. Je zapotřebí alespoň tří pixelů pro získání sinusovky interferenčního vzorku. Nedávný pokles cen detektorů a zvětšení jejich rozlišení zvýšily počet interferometrů, jež je možno umístit na jeden čip. Pole USB (Univerzální sériová sběrnice) kamer nabízí rozlišení 2 bodů na úrovni 10-15μm, což odpovídá hustotě zhruba 50 interferometrů na čtvereční centimetr.
Obrázek 10: Schéma čipu s třinácti integrovanými nekanálkovými Mach-Zenderovými interferometry
3.4.
Další interferometrické metody
V posledním desetiletí 20.století bylo navrženo několik dalších interferometrických principů. Jsou to především: Fabry-Perotova interference pomocí bílého světla, Zeemanova interferometrie, vrstevnatý Youngův interferometr , a fázová informace z povrchového resonančního plazmonu. První efekt (Farbry- Perotovo přiblížení) bylo pozorováno na konci vláken a na povrchu pórovitého křemíkového čipu (Gauglitz et al., 1993). Změna tloušťky a indexu lomu je v tomto případě způsobena navázáním proteinů, nebo vydutím povrchu vlákna v důsledku navázání polymeru na konec vlákna. To ovlivní délku optické dráhy bílého světla. Interference mezi příchozím a odraženým svazkem vytvoří Fabry-Perotovy interferenční proužky. Další změna reflektivity v důsledku chemické aktivity pak tyto proužky posouvá. Velikost posuvu tuto aktivitu kvantifikuje. Tento druh spektroskopie nicméně trpí malou citlivostí, protože změna optické dráhy je velmi malá v porovnání s délkou vlnovodu. Druhý jev, tedy interference tvořené porézním křemíkovým substrátem způsobil rozruch, když byl poprvé prezentován (Lin et al., 1997). Bylo to dáno skutečností, že bylo dosaženo nečekaně vysoké citlivosti. Tento materiál obsahuje vyleptané póry což velmi zvětšuje plochu povrchu. Bílé světlo dopadající na porézní povrch se odrazí jak od povrchu, tak i od dna pórů. Tyto dva odrazy spolu interferují a vytvářejí Fabry- Perotovy proužky. Pokud je v pórech nanesena protilátka (antibody) a ta je poté vystavená konjugovanému antigenu, pak se nterferenční proužky posunou. I když je rozdíl optických drah malý a póry jsou hluboké pouze 1-5 μm, je posuv proužků příliš velký, aby jej bylo možno přičíst pouze změně nanesené látky. Uvažovalo se, že chemická reakce se mění s koncentraci nosičů náboje v polovodiči a to díky vazbám. Další analýza ovšem ukázala, že výsledky daného pokusu byly chybné; že pozorovaný velký posun proužků byl způsoben oxidací pórů (Dancil, et al., 1999). Nicméně tento efekt byl dále prozkoumáván pro další využití při detekci fluorofosfátových nervových činidel vzniklých při leptání SiO2 produktem hydrolýzy HF (Sohn et al., 2000). Efekty doprovázející leptání základního materiálu byly použity také v technice planárních vlnovodů, a to dokonce ve větším měřítku díky zvětšené délce optické trasy. Campbel (nepublikováno) tímto způsobem snadno monitoroval rychlost leptání vlnovodu z Si 3N4 při špatných podmínkách, pH 8, a stanovil ji na méně než 2Å/hod. Zeemanova interferometrie využívá Zeemanův laser a planární vlnovod. Tento interferometr využívá dvou frekvencí, které jsou generovány Zeemanovým laserem. V tomto případě jsou od sebe vzdáleny 250kHz (Grace et al., 1997). Dva módy se poté šíří vlnovodem a fázový rozdíl mezi módy se akumuluje v důsledku chemických změn na detekčním povrchu. Sinusová rozdílová frekvence 250kHz vznikne, když se zkombinují dva módy. Lze ji poté měřit na výstupu a porovnávat ji s referenčním svazkem z laseru. Fázový rozdíl indikuje změnu na povrchu vlnovodu. Ačkoliv se v tomto případě jednalo o chemický senzor, může být tato technika použita rovněž při měření biokonjugovaných reakcí. Stejně jako v případě polarimetrické interferometrie, je i toto souosé uspořádání náchylné k chybám v důsledků změn indexu lomu bulkového materiálu. Vrstevnatý Youngův interferometr byl objeven nedávno (Cross et al., 1999). Vlnovody jsou naskládány na sobě a mezi nimi je umístěna ochranná (buffer) vrstva. Difrakcí světla na výstupu jsou poté tvořeny interferenční vzory. Tento elegantní přístup je velmi užitečný v oblasti chemických senzorů, pokud je požadována ponořená (burried) reference. Nicméně
v případě biosenzorů skrytý referenční kanál snižuje akumulování chyb v důsledku změn bulkového indexu lomu. A nakonec, Nikitin použil unikátní přístup při měření změny fáze, která se obvykle neměří při experimentech s povrchovou plazmonovou rezonancí (SPR) (Kabashin a Nikitin, 1998; Grigorenko et al., 1999; Nikitin et al., 1999). Interferometr s otevřenou dráhou využívá pokovený povrch SPR prismy – stejně v jako již popsaném uspořádání Mach-Zenderova interferometru s rozšířeným svazkem. Odražený svazek opouštějící prismu je zkombinován s referenčním svazkem a produkuje interferenci. Na základě měření několika plynů byla stanovena citlivost měření indexu lomu na 4 x 10 -8. Je možné také snímání povrchu. Tento přístup může snadno najít uplatnění při zkoumání genomu a bílkovin bez potřeby flourescenčních a kolorimetrických štítků (label).
3.5.
Funkcionalizace povrchu
Po zvolení vhodného převodníku je na jeho povrchu imobilizován biokonjugovaný receptor. Skleněný povrch, jako např. Si3N4, TiO2, nebo SiO2 je zaplněn (populated) hydroxylovou skupinou. V případě . Si3N4 pouhé vyčištění povrchu způsobí nahrazení aminových skupin hydroxidy. Pro chemii umístění proteinů na povrch se využívá metod vyvinutých pro afinitní chromatografii. Na toto téma bylo napsáno několik knih (Hermanson, 1996). Pro připevnění (zachycení) reaktivních funkčních skupin na skleněný povrch se využívá organosilanové chemie. Tyto silany obvykle zreagují do aminových, karboxaldehydových (carboxaldehyde), nebo sulfhydrylových skupin. Proteinový receptor se naváže na aminovou skupinu po předchozí oxidaci, nebo se naváže po redukčním aminování (reductice amination).na karboxyaldehydovou skupinu. Sulfhydryly budou tvořit disulfidové vazby s cysteiny. Další schéma popisuje zachycení proteinu A na povrch, s následným zachycením (vazbou) k Fc části protilátky. Avidin se také používá jako funkcionalizovaný povrch pro biotinylated proteiny a DNA. Využívá se silné vazebné konstanty mezi avidinem a biotinem. Následné vyplnění mezer proteiny slouží k minimalizování nespecifických vazeb. S referenčním ramenem interferometrického senzoru (používá- li se v převodníku jedno rameno) je nakládáno podobně. Cílem je vytvořit referenční kanál zcela stejný, jako senzorický, kromě citlivosti na danou reakci. To bohužel není tak snadné. Zvláště při klinických testech dochází často i k jiným (nespecifickým) vazbám s volnými (errant) proteiny. Vynulování tohoto parazitního (nespecifického) signálu není tedy nikdy snadné. Velký pokrok v eliminování těchto parazitních reakcí byl učiněn použitím povrchů, které zabraňovaly adsorpci proteinů. Polyetylén glykoly a jejich deriváty na sebe upoutaly největší pozornost a vypadá to, že fungují docela dobře. Byly testovány i další materiály, jako amidy, fosfoamidy, močovina, a různé sloučeniny polyetylén glokolů (Chapman et al., 2000). Právě schopnost omezit parazitní reakce nastavuje limit kolineárního polarimetrického uspořádání. Je to tím, že jak specifické, tak parazitní reakce jsou z hlediska převodníku identické. Uspořádání interferometru se dvěmi sousedními kanály je těmito reakcemi rovněž omezeno. Pokud převládají parazitní (nespecifické) vazby, pak lze pozorovat pouze velmi malé změny. Oddělená analýza obou ramen může alespoň kvantifikovat poměr signál/šum a určit spolehlivost detekce.
3.6.
Aplikace
Literatura uvádí různá interferometrická uspořádání. Ve většině z nich bylo cílem ukázat jejich citlivost a všestrannost. Výzkum se nesnažil o vytvoření speciálních řešení pro konkrétní úlohy, převážně proto, že schopnost senzoru detekovat selektivně je odvislá od
převodníku (transduktoru). Vědomi si toho, vědci se snažili spíše vyhodnotit jednotlivé konstrukce s obecně použitelnou biokonjugovanou látkou. Hodně jich využilo IgG/anti-IgG test. Jako vzorky DNA se používaly části řetězce s 20ti páry bází. (Schneider et al., 1997). V některých případech se použilo celých buněk, jako např Salmonella (Schneider et al., 1997; Seo et al., 1999). Všechny používaly přímý label-free detekční systém využívají přirozených schopností interferometru. Jeden z pokusů jak zvýšit citlivost představuje tzv. sandwichová zkouška. V tomto uspořádání, poté, co první dávka protilátek zreagovala s antigenem, přišla na řadu ještě další část protilátky. Tyto částice mohly být spojeny s mikročásticemi (zlata, polystyrén). Tyto mikročástice zajistily zesílení signálu, protože mikročástice výrazně zvýšily změny indexu lomu (Schneider et al., 2000). Jako testovací úloha pro použití vlnovodných interferometrů se ustálilo detekování atrazinu, tj. herbicidu obsaženém v pitné vodě. Nejprve byl syntetizován atrazinový hapten (tj. část antigenu, která reaguje s protilátkou) a ten byl poté kovalentně připevněn k vlnovodu. Vzorek pitné vody se poté kápnul na vlnovod. V dalším kroku se do vody přidala protilátka atrazinu. Rozpuštěný herbicid poté reaguje s hapteny na povrchu vlnovodu. Pokud se v roztoku už nenachází žádný volný atrazin, pak došlo k navázání na hapten a tedy můžeme detekovat velký signál. Na druhou stranu, malý signál znamená malé množství navázaného atrazinu. Takto lze detekovat až 0.1μg/L, nebo 0.1 ppb atrazinu (Schipper a Bergevoet, 1997; Schipper a Rauchalles, 1998). Jelikož zachycený biokomjugát není protein, povrch lze regenerovat bez ztráty jeho aktivity a je připraven k další analýze. Nepřímé zkoušky analogické s tradiční zkouškou ELISA, s interferometrem jako čtečkou, byly zkoumány pouze zběžně (Campbell a Hartman, 1998). Výhodou tohoto přístupu je možnost opětovného použití senzoru pro další měření, nicméně ELISA s sebou přináší jisté kroky navíc. Není nutné, aby senzor měřil změnu barvy. Může detekovat jiný produkt enzymatické reakce, jako např. čpavek z moči. Pro doplnění: ostatní klinicky relevantní analyty jako čpavek a pH mohou být rovněž detekovány interferometry. V případě, že vrstva analytu je tlustší než evanescentní pole jsou blokovány efekty způsobené parazitními reakcemi a změny indexu lomu materiálu. Tlustá vrstva poskytuje dostatek reaktivního materiálu pro detekci sub-ppm množství amoniaku a pH ve vodných roztocích lze určit s přesností 0.01 (Campbell a Moore, 1998). Přestože se většina příkladů biosenzorů netýkala obtížných úloh lze konstatovat, že interferometry slouží pro detekci analytu v krvi, v různých sérech a v případě Salmonelly ve zbytcích kuřecích těl.
Výhody a omezení Bylo uvedeno mnoho příkladů interferometrických a reflektrometrických vlnovodů. Každý z nich byl otestován, jak reaguje na biokonjugovanou vazebnou reakci. Bylo by nefér je přímo porovnávat. Citlivosti vlnovodných interferometrů jsou z podstaty ekvivalentní. Reflektometrické a vláknové interferometry jsou daleko méně citlivé, kvůli svým omezením; kratké optické dráhy pro reflektometrické, potažmo malé evanescentního pole v případě optického vlákna. Interferometry mohou být připraveny z různých materiálů použitých jak ve vlnovodu, tak v substrátu. Volba záleží jen na výrobních kapacitách výrobce. Pokud by všichni výzkumníci mohli používat stejné materiály a tloušťky vrstev, nebyly by žádné rozdíly v detekčních
minimech, daných citlivostí vlnovodu a změnou neff. To by vedlo k univerzálnímu limitu detekovatelnosti 1pg/mm2 povrchu. To co nakonec omezuje detekovatelnost jsou fyzikální parametry: detekční schéma, schopnost potlačit mechanický a termický šum, vazebné konstanty biokonjugovaných látek a fluidicita. Výzkumník může kontrolovat také další aspekty, jako je mechanika vzorku, difúze a variace indexu lomu materiálu. Hlavní výhodou interferometru je jeho schopnost detekovat jakoukoliv chemickou reakci, protože každá reakce změní index lomu. Tedy není potřeba žádných značkovačů, sledování barvy, nebo rezonančních efektů, abychom pozorovali signál o reakci. Interferometr nabízí univerzální platformu pro měření libovolných chemických dějů. Ale jeho největší přednost znamená zároveň i jeho limit. Jelikož je citlivý na jakoukoliv chemickou událost, reaguje na každou změnu, jak detekovanou, tak i na parazitní reakci, na teplotu, nebo na změnu indexu lomu bulkového materiálu. Tedy návrh senzoru musí být cílený a reference vhodně zvolena, aby došlo ke oslabení vedlejších vlivů. Referenční rameno by nemělo reagovat na danou reakci a zároveň minimalizovat vliv pozadí, které ovlivňuje index lomu. Interferometr také potřebuje přesný návrh, aby byl schopen eliminovat jiné signály. Vysoké ceny laserů a detektorů se v průběhu let snížily a neměly by představovat významnější bariéru při vývoji interferometrických i jiných optických senzorů. V mnoha institucích se již vyskytují systémy pro depozici tenkých vrstev vhodných pro výrobu vlnovodů. Pokud ne, sol-gelový vlnovod je levnou a přizpůsobivou variantou. Limitním faktorem v současné době je spíše elektronika a software pro zpracovaní a vyhodnocení dat. Byl by to velký skok pro mnoho lidí mít místo senzoru připoutaného k počítači, kompletní samonosnou senzorovou jednotku.
Možnosti zdokonalování současného provedení Kromě polarimetrického uspořádání, kdy je zapotřebí 4 detektorů, se senzory běžně konstruují s jediným detektorem. Použití jednoho detektoru umožnilo udržet cenu zařízení nízko. Nicméně samotným detektorem nejsme schopni určit v jaké části detekční sinusovky se pohybujeme, což limituje možnost přesné kvantifikace fázové změny. Skenování interferenčního proužku vyžaduje mechanické zařízení, které umožňuje umístit detektor do kvadratury. Elektrooptická zařízení fázového posunu budou posouvat fázi a potlačovat tak mechanický šum. Nicméně více navzorkovaných bodů podél křivky zlepšuje detekční možnosti. Tři body definují funkci sinus, ale pole detektorů umožní navzorkovat i více bodů. Vícenásobná detekce dalších interferenčních proužků je možná pokud máme dostatečné malou rozteč pixelů. Po pádu cen polí detektorů z tisíce dolarů na padesát dolarů za USB kameru není důvod používat cokoliv jiného. Zpracování několika interferenčních proužků nám nabízí rozlišení ve fází 0.01 rad. Tato analýza nám rovněž dovoluje odlišit mezi změnou intenzity a změnou fáze, čímž lze eliminovat vliv fluktuací laseru, nebo změnu absorbance vzorku. Jak vzrůstá rozlišení interferometru, projevují se další zdroje chyb, které je třeba potlačit tak, aby došlo k plnému rozvinutí potenciálu interferometrů. Kontrola teploty vzorku a převodníku umožňuje minimalizovat tepelný šum. K tomuto se používá hlavně Peltierův článek. Mechanický šum lze omezit integrováním většiny optické dráhy přímo do vlnovodu. Mřížky, zrcadla, děliče svazku a detektory již byly integrovány na jeden čip. Pouze laser zůstává externí. Je jen otázkou času, kdy dojde k integrování také laseru, alespoň v nějaké hybridní formě.
Aby se omezil chemický šum je potřeba ještě omezit vliv proudění při vkládání vzorku. Jakmile je vzorek umístěn do testovací cely nad vlnovodem, dojde ke změně indexu lomu. Může to být jen malá změna, ale obě ramena interferometru ji musí postřehnout současně, jinak dojde k jejich rozfázování. Někteří výzkumníci navrhují ignorovat počáteční data a soustředit se až na následnou fázi změn způsobených detekcí. To může být správný postup, pokud ovšem nemáte automatizovanou linku na více vzorků, kde se tok může konstantně měnit. Blízkost senzorické a referenční větve senzoru tento rozdíl může minimalizovat. Kolineární polarimetry nemají problém s laterálními změnami indexu lomu, ale vertikální změny kompenzovány nejsou. Fluidicitě (vlivu proudění) a návrhu cel se musí věnovat další výzkum. Rychlost detekce je dána rychlostí difúze analytu k povrchu senzoru. Difuze velkých proteinů je pomalá a může trvat až hodinu, než senzor dosáhne rovnovážného stavu. Vhodný design fluidního systému může zrychlit pohyb proteinu (analytu) k povrchu senzoru. Dvoudimenzionální struktura senzoru nevyužívá v současnosti zcela oblast evanescentního pole. Vývoj třídimenzionálních matric by mohl vést ke zvětšení interakční oblasti a tím ke zkrácení detekčního času. Vývoj interferometrických senzorů se vydal po dvou rozbíhavých cestách, obě jsou vedeny aplikacemi. Jedna vede k integraci všech optických komponent: se zdrojem, vlnovodem a detektorem na jednom čipu. Tento přístup umožní vytvořit senzor pro delší dobu použití. Tento typ senzoru by se mohl uplatnit jako samostatný dlouhodobý senzor pro monitorování potravin a pro detekci bioteroristických látek. Druhou cestou je konstrukce jednoduchého vlnovodu s minimálními náklady, jež může být po použití recyklován. Tyto vlnovody budou obsahovat pouze otvory pro navázaní a vyvázaní světla se budou vhodné pro klinické aplikace, kde je následné zničení nejlepší prevencí před možností kontaminace. Tento typ senzoru bude obsahovat zdroj, optiku, detektor a procesor. Bude působit jako „plug and play“ zařízení do optického systému. S pomocí chemiků, kteří vyvinou způsob jak aktivovat povrch senzoru pro detekci požadované látky bez parazitních interferencí, a za současného rozvoje fluidic designu a dalšímu zlevňování a zlepšování technik zpracování signálu a jeho interpretace může nabrat rozvoj biosenzorů v budoucnu „rychlost světla“.
6. Poděkování Autoři by rádi poděkovali Sheree Collinsové z GTRI za dodání obrázků použitých v této kapitole
7. Literatura Brandenburg, A., 1997, Sens. Actuators B 38, 266. Brandenburg, A., R.Krauter, M.Künzel a H. Schulte, 2000, Appl. Opt. 39, 6396 Brosinger, F., H. Freimuth, M. Lacher, W. Ehrfeld, E. Gedig, A. Katerkamp, F. Spencer, K. Cammann, 1997, Sens. Actuators B 44, 350. Campbell, D.P., N.F. Hartman, J.V. Suggs, J.L. Moore a J.M. Cobb, 1998, Proc. SPIE 3253, 20. Campbell, D.P., J.L. Moore, J.M. Cobb, N.F. Hartman, B.H. Schneider a M.G. Venugopul, 1998, Proc. SPIE 3540. 153.
Chapman, R.G., E.Ostuni, S. Takayama, R.E. Holmlin, L. Yan a G.M. Whitesides, 2000, J.Am. Chem. Soc. 122, 8303. Choquette, S.J. a L.Locascio-Brown, 1994, Sens. Actuators B 22, 89. Cross, G., Y. Ren a N.J.Freeman, 1999, J. Appl. Phys. 86, 6483 Dancil, K-P.S., D.P. Greiner, a M.J. Sailor, 1999, J.Am. Chem. Soc. 121, 7925 Drapp, B., J.Piehler, A. Brecht, G. Granglitz, B.J. Luff, J.S. Wilkinson a J. Ingenhoff, 1997, Sens. Actuators B 38, 277. Fisher, K. a J. Muller, 1992, Sens. Actuators B 9, 209. Gato, L. a R. Srivastava, 1996, Opt. Commun. 123, 483. Gauglitz, G., A. Brecht, G.Kraus, a W.Nahm, 1993, Sens. Actuators B 11, 21. Grace, K.M., K. Shrouf,S. Honkanen, P. Ägräs, P. Katila, M. Leppihalme, R.G Johnston, X. Yang, B. Swanson, B. and N. Peyghambarian, 1997, Electronic Lett. 33, 1651. Grigorenko, A.N., P.I. Nikitin a A.V. Kabashin, 1999, Appl. Phys. Lett. 75, 3917. Hartman, N.F., D.P. Campbell a M.Gross, 1988a, Proc. IEEE-LEOS ’88,298. Hartman, N., 1990, U.S. Patent No. 4,940,328. Hartman, N.F., J.Cobb a J.G. Edwards, 1998b, Proc. SPIE 3537,302. Heideman, R.G., R.P.H. Kooyman a J. Greve, 1994, Biosen. Bioelectron. 9, 33. Heideman, R.G. ,G.J. Veldhuis, E.W.H. Jager a P.V. Lambeck, 1996, Sens. Actuators B 35, 23. Helmers, H., P.Greco, R. Rustad, R.Kherrat, G. Bouvier a P.Benech, 1996, Appl. Opt. 35, 676. Hermanson, G.T., 1996, Bioconjugate Techniques, Academia Press, San Diego, 785 pp. Heuberger, K. a W. Lukosz, 1986, Appl. Opt. 25, 1499. Hradetzky, D. a A. Brandenburg, 2000, Europtrode V, 169 Kabashin, A.V. a P.I. Nikitin, 1998, Opt. Commun. 150, 5. Kersey, A.D., 1990, Proc. SPIE 1367, 2. Koster, T., N. Posthuma a P.Lambeck, 2000, Europtrode V, 179. Lin, V.S.-Y, K.Motesharei, K-P.S. Dancil, M.J.Sailor a M.R. Ghadiri, 1997,Science 278, 840. Luff, B.J., J.S. Wilkinson, J.Piehler, U. Hollenback, J. Ingenhoff a N. Fabricius, 1998, J. Lightwave Tech. 16, 583. Lukosz, W. a K. Tiefenthaler, 1983a, 2nd Eur. Conf. Integrated Optics, Florence, IEEE Conf. Proc. 227, 152. Lukosz, W. a K.Tiefenthaler, 1983b, Optics Lett. 8, 537. Lukosz, W. a K. Tiefenthaler, 1988, Sens. Actuators 15, 273. Lukosz, W. a K. Tiefenthaler, 1989, J.Opt. Soc Am. B 6, 209 Lukosz, W. , 1995, Sens. Actuators B., 29, 37. Lukosz, W. , C. Stamm, H.R. Moser, R. Ryf a J. Dübendorfer, J., 1997, Sens. Actuators B. 38, 316. Millar, C.A. a R.H. Hutchins, 1978, J.Phys. D; Appl. Phys. 11, 1567 Nellen, Ph.M., K. Tiefenthaler a W. Lukosz, 1988, Sens. Actuators B 15, 285. Nikitin, P.I., A.A. Beloglazov, V.E. Kochergin, M.V. Valeiko, a T.I. Ksrenevich, 1999, Sens. Actuators B, 54, 43 Nishihara, H., M. Haruna, T. Suhara, 1985a, Optical Integrated Circuits, Mgraw-Hill, USA Chapter 2 Nishihara, H., M. Haruna, T. Suhara, 1985b, Optical Integrated Circuits, Mgraw-Hill, USA, p.226. Ramos, B.L., S.J. Choquette a N.F.Fell, Jr., 1996, Anal. Chem. 68, 1245. Ranganath, T.R. a S.Wang, 1977, IEEE, J. Quantum Electron. QE-13, 290. Schipper, E.F., A.J.H. Bergeovet, R.P.H., Kooyman, B. Hock a J. Greve, 1997, Anal. Chim. Acta 341, 171.
Schipper, E.F., A.M. Brugman, C. Dominiguez, L.M. Lechuga, R.P.H. Kooyman a J.Greve, 1997, Sens. Actuators B 40, 147. Schipper, E.F., S. Rauchalles, R.P.H, Kooyman, B. Hock a J.Greve, 1998, Anal. Chem. 70, 1192. Schneider, B.H., J.G. Edwards a N.F. Hartman, 1997, Clin. Chem. 43, 1757. Schneider, B.H., E.L.Dickinson, M.D. Vack, J.V. Hoijer, a L.V., Howard, 2000, Biosens. Bioelectron. 15, 13. Seo, K.H., R.E. Brackett, N.F. Hartman, N.F. a D.P. Campbell, 1999, J. Food Protecte. 62, 431. Sohn, H., S Létant, M.J.Sailor, a W.C. Trogler, 2000, J.Am. Chem. Soc. 122, 5399. Stamm, Ch. a W.Lukosz, 1993, Sens. Actuators B 11, 177. Stamm, Ch. a W.Lukosz, 1994, Sens. Actuators B 18, 183 Stamm, Ch., R. Dangel, a W.Lukosz, 1998, Opt. Commun. 1253, 347. Tiefenthaler, K. a W. Lukosz, 1984a, Optics Lett. 9, 137 Tiefenthaler, K. a W. Lukosz, 1984b, Proc. SPIE, 514, 215. Tiefenthaler, K. a W. Lukosz, 1985, Thin Solid Films 126, 205. Tiefenthaler, K. a W. Lukosz, 1989 , J.Opt. Soc. Am. B 3, 209. Walker. R.G. a C.D.W. Wilkinson, 1983, Appl. Opt. 22, 1029. Weisser, M., G. Tovar, S. Mittler – Neher, W. Knoll, F. Brosinger, H. Greimuth, M.Lacher a W.Ehrfeld, 1999, Biosens. Bioelectron. 14, 409. Young, T. , 1804, Phil. Trans. R. Soc. London 94, 1. Tiefenthaler, K. a W. Lukosz, 1984a, Optics Lett. 9, 137
