Predikce diabetu 1.typu a výsledky studie mapující buněčnou reaktivitu proti diabetogenním autoantigenům
Úvod Etiopatogeneticky je zásadní role při vzniku diabetu 1.typu (T1D) připisována autoreaktivním T lymfocytům (polarizace ve směru Th1).
Úvod - pokračování prediabetes záchyt protilátek
manifestace diabetu
t CYTOKINY
T-lymf
ICA, GAD65A, IAA, IA2A
Makrofágy, Tc CYTOKINY
β buňka
B-lymf
β buňka
Standardizovaná incidence diabetu 1.typu pro děti ve věku 0-14 let (/100 000/rok) připraveno podle Cinek O., Šumník Z. a Vavřinec J.Dětský diabetes mellitus v České republice: stále více a čím dál dříve.Čas.Lék.čes., 2005, 144, pp.266-271.
20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 1989
1991
1993
1995
1997
1999
2001
2003
Co dělat? Vyléčit – neumíme, léčit – umíme, ALE… Zabránit vzniku – neumíme, ALE… nicméně v každém případě musí být opatření cílená na prevenci realizována nejpozději ve fázi prediabetu…proto také predikce
Program predikce diabetu 1.typu • Určení (ne)přítomnosti rizikových alel diabetogenních genů (HLA molekuly II.třídy), cca 40%genetické vnímavosti k T1D → určení celoživotního rizika pro vznik T1D • Protilátky proti GAD65, IA2 → určení středně-krátkodobého rizika pro vznik T1D
Kategorie genetického rizika DM 1 u prvostupňových příbuzných českých diabetických dětí
11%
11% 21%
35%
22%
Velmi vysoké
Zvýšené
Průměrné
Snížené
Velmi nízké Cinek O.
Progression to Diabetes vs Number of Autoantibodies (GAD, ICA512, Insulin)
Percent not Diabetic
100 80
3 Abs 2 Abs 1 Ab
60 40 20 0 0
2,5
5
7,5
10
12,5
2 6
1 4
15
Years of Follow-up 3 Ab n = 41 2 Abs n = 44 1 Abs n = 93
17 27 23
8 15 14
1 4 10
Verge et al. Diabetes, 1996;45;926
Co ale ty T lymfocyty?
Problém detekce autoreaktivních lymfocytů četnost autoreaktivních T-lymfocytů v periferní krvi - 1-10 buněk / 1 mil
The Immunology of Diabetes Society www.idsoc.org
Název projektu: DETEKCE ANTI-INZULÁRNÍ T BUNĚČNÉ ODPOVĚDI U PACIENTŮ S DIABETEM 1.TYPU A U JEJICH PRVOSTUPŇOVÝCH PŘÍBUZNÝCH Číslo projektu: NR 8127-3 Doba řešení: 1.1.2004 – 31.12.2006 Poskytovatel: IGA MZ ČR Hlavní řešitel: MUDr.Kateřina Štechová, PhD., Laboratoř autoimunitních onemocnění Pediatrické kliniky UK 2.LF, Praha Spoluřešitel: Doc.MUDr.František Saudek, DrSc., Klinika diabetologie Centra diabetologie IKEM, Praha
Anotované cíle projektu Hlavní cíl: Zavést a standardizovat laboratorní metodu umožňující sledovat
přítomnost a intenzitu T buněčné odpovědi zaměřené proti nejdůležitějším známým diabetogenním autoantigenům. Cílem bylo zlepšení diagnostiky osob potenciálně ohrožených vznikem diabetu (z okruhu prvostupňových příbuzných pacientů) a zlepšení sledování efektu imunointervenčních postupů. Vedlejší cíl: Ověřit, zda by popsaná metoda byla využitelná i v dalších aplikacích: Sledování průběhu (stavu T buněčné imunity) po transplantaci pankreatu (včetně event. transplantace ostrůvků) V diagnostice autoimunitního procesu u dospělých pacientů s diabetem 1.typu (LADA diabetes)
Hypotéza: cytokinová diagnostika umožní zachytit patologickou Th1 odpověď vůči diabetogenním autoantigenům (IFN-gamma x IL-4)
2003 • Proliferační test aktivace T lymfocytů • intracelulární stanovení cytokinů + stanovení povrchových markerů T lymfocytů • FACS stanovení aktivačních markerů • tetramerová analýza • ELISPOT, ELISA
Uspořádání studie Čerstvě izol. PBMNC + autoantigeny Autoprotilátky, C peptid, Klin.a anamn.data HLA typ.
Inkubace a pak
array analýza
protein micro
cytokinů z kult.supernatantu Reakce? Typ a intenzita.
(+ ELISPOT a ELISA)
(Auto)antigeny • GAD 65 • GAD a.a. 247-279 509-528 524-543 • IA-2/R2 a.a.853-872 • Proinsulin, B ř. a.a.9-23 • (Hsp277 a.a.277-300) • PHA jako pozitivní kontrola IDS
Také ELISPOT +IL-4 Také ELISA
Pos
Pos
Neg
Neg
GCSF
GM-CSF
GRO
GRO -alfa
Pos
Pos
Neg
Neg
GCSF
GM-CSF
GRO
GRO -alfa
IL-1alfa
IL-2
IL-3
IL-5
IL-6
IL-7
IL-8
IL-10
IL-1alfa
IL-2
IL-3
IL-5
IL-6
IL-7
IL-8
IL-10
IL-13
IL-15
IFN-gamma
MCP-1
MCP-2
MCP-3
MIG
RANTES
IL-13
IL-15
IFN-gamma
MCP-1
MCP-2
MCP-3
MIG
RANTES
TGF-beta1
TNF-alfa
TNF-beta
blank
blank
blank
blank
Pos
TGF-beta1
TNF-alfa
TNF-beta
blank
blank
blank
blank
Pos
Soubor Finálně statisticky hodnocení
Plánovaný počet vyšetření na celou dobu řešení projektu
Počet osob, které vstoupily do projektu
recentní záchyt diabetu
60
112
60
Příbuzní
60
207 (rodiče 116, sourozenci 91)
60 bez autoprotil. +10 s protilátkami
zdravé kontroly
45
73
60
transplantovaní
15
10
10
Skupina
Vstupní kritéria žádné další přidružené autoimunitní choroby (kromě diabetu) nebo imunopatie náběr mezi 8. a 9. hodinou ráno nepřítomnost jakýchkoliv známek infekčního onemocnění nepřítomnost větší fyzické zátěže 24h před odběrem krve v případě pacientů s čerstvou manifestací diabetu byl náběr proveden 7 dní od stanovení diagnózy za předpokladu normalizace parametrů vnitřního prostředí (ionty, parametry acidobazické rovnováhy) a za předpokladu, že klinik nehodnotil diabetickou ketoacidózu při záchytu choroby jako těžkou (pH≤7,1). U pacientů s diabetem byl náběr proveden při glykémii v rozmezí 4-10 mmol/l.
Statistická analýza • • •
• •
Jelikož data nevykazovala normální rozložení, byly pro analýzu užity neparametrické metody. V rámci statistického vyhodnocení bylo v první fázi byla ověřována hypotéza, zda existuje vliv příslušnosti vyšetřované osoby k určité skupiny na produkci cytokinů a chemokinů v organismu. Hodnocení bylo provedeno Kruskal Wallisovým testem. Hladina významnosti byla zvolena α=0,05. Pokud byla nalezen statisticky významný rozdíl mezi všemi čtyřmi skupinami, bylo přistoupeno k mnohonásobnému porovnání (jednotlivé skupiny mezi sebou). Mnohonásobné porovnání bylo provedeno Mann – Whitney U testem s následnou korekcí hladiny významnosti – za signifikantní byly považovány hodnoty p<0,05/6, tj. p<0,0083. Pro proměnné, které statisticky významně odlišují porovnávané skupiny, bylo snahou nalézt také hladinu, na které jsou skupiny nejlépe odlišeny. Pro nalezení takového bodu byly použity ROC křivky.
Výsledky • Produkce cytokinů a chemokinů se mezi sledovanými skupinami lišila a to jak bazální – tak • i po specifické stimulaci. • Naprosto se svými výsledky vydělila skupina prvostupňových příbuzných s pozitivní alespoň jednou autoprotilátkou, tedy skupina, kterou je z hlediska brzkého vzniku diabetu 1.typu riziková.
DRL+vs DV Cytokin (chemokin)
MannWhitney U test (exact p-hodnota)
Sensitivita
GCSF
p=0,001
GM-CSF
Specificita
Plocha pod křivkou
P-hodnota pro ROC křivku
0,833
1,0
0,944
p=0,006
p=0,001
0,889
0,75
0,8958
p=0,015
IL-1 alfa
p=0,003
0,833
1,0
0,9583
p=0,005
IL-2
p=0,003
0,61
1,0
0,8958
p=0,015
IL-3
p<0,001
0,889
1,0
0,972
p=0,004
IL-5
p<0,001
0,778
1,0
0,9514
p=0,006
IL-7
p=0,002
0,833
0,75
0,8819
p=0,019
IL-13
p<0,001
0,944
1,0
0,972
p=0,004
MIG
p=0,001
0,833
0,75
0,889
p=0,017
TGF beta
p=0,003
0,667
1,0
0,8403
p=0,037
TNF alfa
p<0,001
0,889
1,0
0,9514
p=0,006
ROC křivka pro IL-5 DV vs DRL+
ROC křivka pro IL-13 DV vs DRL+
IL-5 a IL-13
%intenzity
%intenzity
p<0,001
p<0,001 (oba)
p=0,002 p=0,002
p=0,001
IL-5 a IL-13 korelace D IL-5
IL-13
IL-3 (r=0,883), IL-2 (r=0,834) a IL-6 (r=0,803)
DV IL-1alpha (r=0,880)
DRL IL-10 (r=0,879), MCP-1 (r=0,846), TNF-alpha (r=0,823) IL-1alpha (r=0,931), TNF-beta (r=0,873) a IL-7 (r= 0,846)
DRL(HR) IL-8 (r=0,941)
IFN-gamma P=0,006 P=0,003 %intenzity spotu
P=0,006
Změna reaktivity po specifické stimulaci jednotlivými autoantigeny • Po stimulaci směsí diabetogenních autoantigenů byly zjištěny následující statisticky signifikantní rozdíly (pozn.byl použit Wilcoxonův párový neparametrický test, kdy za signifikantní je považováno p<0,05: • u pacientů s diabetem byl významný pokles v produkci IL-3 (p=0,008) a IL-15 (p=0,038). • U příbuzných bez protilátek byl signifikantní pokles IL-1 (p=0,013) a MCP-2 (p=0,045). • U příbuzných s protilátkami byl pozorován signifikantní nárůst produkce IL-6 (p=0,043). Ve skupině zdravých kontrol nebyly pozorovány statisticky signifikantní rozdíly mezi bazální produkcí a produkcí po stimulaci autoantigeny.
Odpověď na stimulaci jednotlivými autoantigeny uváděny průměrné hodnoty pro TNF-beta v pg/ml Skupina
NK
GAD65-1
GAD65-2
GAD65-3
GAD65
IA2 peptid
PI peptid
Směs auto ag
D
100
170
201
166
150
143
121
140
DV
170
174
165
171
175
170
153
173
DRL
21
60
53
73
33
100
124
65
DRLHR
26
139
153
235
154
179
107
126
Rozdílná reaktivita proti jednotlivým autoantigenům u příbuzného s pozitivními autoprotilátkami stanovená metodou ELISA IFN gamma (pg/ml)
TNF beta (pg/ml)
IL4 (pg/ml)
IL6 (pg/ml)
IL10 (pg/ml)
bazální produkce
9
15
0
78
199
produkce stimulovaná směsí autoantigenů
2
114
0
2
50
4
80
0
8
91
6
303
0
HIGH
586
1
79
0
28
184
12
150
0
80
201
2
83
0
26
223
3
160
0
HIGH
53
GAD65-1 GAD65-2 GAD65-3 Celá molekula GAD65 proinzulín tyrozinfosfatáza IA2
Srovnání jednotlivých metod cytokinové a chemokinové detekce Největší přednost(i)
Největší zápor(y)
Proveditelnost
Dostupnost kitů (v ČR)
Proteinová micrroarray
Simultánní detekce mnoha parametrů, ideální screeningová metoda
U některých látek vyšší detekční limit, metoda není kvantitativní
Není obtížná, Pro záznam výsledku nutný scanner nebo digitální fotoaparát a program analýzy obrazu.
Dobrá, spektrum nabízejících firem je ale úzké
ELISPOT
Detekce na úrovni jedné buňky
Pracnost, každý cytokin nutno analyzovat zvlášť (s duálními kity nakonec nebyla dobrá zkušenost)
Z uvedených metod subjektivně nejpracnější, poněkud problémy s analýzou (nutný alespoň nějaký program analýzy obrazu, ideálně ELISPOT reader, ale je drahý)
Špatná, ale dobrá v rámci EU
ELISA
Kvantitativní výsledek v konkrétní koncentraci
Každý cytokin nutno analyzovat zvlášť
Není obtížná, nutný ELISA reader, ten je ale většinou běžně dostupný
Široká nabídka od mnoha firem
Další výstupy projektu Reaktivita PBMC na polyklonální aktivátor (PHA) Vliv dalších faktorů na produkci cytokinů a chemokinů posuzovaný pomocí proteinové microarray Pohlaví Genetické riziko Věk Pozitivita autoprotilátek, C peptid, FPIR Denní doba (Ráno vs odpoledne) Pohybová zátěž Vliv stavu metabolismu a glykémie na výsledek Reaktivita čerstvě izolovaných PBMC vs kryoprezervovaných Změna reaktivity v čase Transplantovaní
Děkuji za pozornost ☺
