Uplatněná metodika MSM 2678846201 UM 4 - název:
Postup hlubokého zamrazování pilotních vzorků pro kontrolu stability výsledků analýz složení mléka a jejich dlouhou expiraci Uplatněná metodika a technicko-organizační doporučení, opatření a postupy v systému QA/QC (quality assurance/quality control, zajištění a řízení kvality) k řešení referenčněrutinních systémů analytických laboratoří k testaci kvality syrového mléka a pro zvýšení věrohodnosti výsledků.
I) Cíl uplatněné metodiky: Cílem je zajištění a zvýšení věrohodnosti výsledků a provozní jistoty managementu rutinních laboratoří při kontrole složení a kvality mléka pro účely kontroly užitkovosti (individuální vzorky mléka - podpora šlechtění zvířat) a proplácení mléka (bazénové vzorky mléka - zajištění kvality mléčného potravinového řetězce).
Náplň uplatněné metodiky: Implementace dosažených výsledků, získaných na základě předchozího výzkumu a vývoje v rámci řešení projektu MŠMT-ČR, MSM 2678846201 a v rámci koordinační a konzultační metodické činnosti Národní referenční laboratoře pro syrové mléko (NRL-SM) Rapotín do prostředí mlékařských analytických laboratoří Českomoravské společnosti chovatelů, a.s. Praha.
Zdroj uplatněné metodiky: projekt MŠMT-ČR, MSM 2678846201, Uplatnění evropského modelu multifunkčního zemědělství v LFA oblastech České republiky. Zpracovali dne: 9. 4. 2008 Oto Hanuš, Radoslava Jedelská, Václava Genčurová, Jaroslav Kopecký, Pavel Hering, Zdeněk Motyčka Agrovýzkum Rapotín, s.r.o. Uplatnění bylo provedeno zavedením všech principů metodiky od 10. 4. 2008.
II) Postup hlubokého zamrazování pilotních vzorků pro kontrolu stability výsledků analýz složení mléka a jejich dlouhou expiraci Struktura uplatněné metodiky: 1) Definice problému stability výsledků měření při analýzách mléka 2) Cíl uplatněné metodiky 3) Metodický postup přípravy hluboce zmražených referenčních pilotních vzorků mléka 4) Bezpečnost práce při manipulaci s pilotními vzorky 5) Aplikace výsledků měření hluboce zmražených pilotních vzorků mléka pro stabilitu rutinních instrumentálních měření mléka v laboratorní praxi 6) Použité literární prameny 1) Definice problému stability výsledků měření při analýzách mléka Podstatnou částí měření složek syrového mléka je nepřímá analýza na základě měření infračerveného spektra. Analýzy mléka jsou důležité pro potřeby kontroly užitkovosti dojnic k účelům genetického zušlechťování skotu a také k určení kvality mléka pro technologickozpracovatelské postupy. Je nezbytné přístroje pravidelně kalibrovat. Také kontrola časové stability měření je důležitá. Příprava pilotních vzorků pro zmíněné účely byla popsána, informace o stabilitě hluboce zmražených pilotů jsou však sporadické. Hluboké zmrazování pilotů by mělo zajistit jejich mikrobiologickou kvalitu. Nemělo by dojít k většímu makromolekulárnímu a buněčnému poškození mléčných složek. Rychlé hluboké zmražení by nemělo umožnit tvorbu větších krystalů v mléce. 2) Cíl uplatněné metodiky Pokud by hluboké zmražení nepoškodilo makromolekulární organické a buněčné struktury mléka, mohly by být pilotní vzorky ke kontrole stability měření automatických přístrojů pracujících na principu nepřímých metod využívány pro značně dlouhé intervaly bez změny šarže. Cílem uplatněné metodiky je zajistit stabilitu dlouhodobě uložených hluboce zmrazených pilotních vzorků a zajistit jejich využití ke kontrole stability měření mlékařských analytických přístrojů. Zvýšení stability a dlouhověkosti pilotních vzorků povede k zlepšení věrohodnosti analytických výsledků u mléka a tím následně také kvality a bezpečnosti mléčného potravinového řetězce. 3) Metodický postup přípravy hluboce zmražených referenčních pilotních vzorků mléka Použije se větší potřebný objem bazénového syrového kravského mléka o běžném složení (obsah tuku T od 3,5 do 4, 5 %; obsah hrubých bílkovin B od 3,0 do 3,6 %; obsah monohydrátu laktózy L od 4,7 do 5,1 %). Mléko stáda má mít počet somatických buněk PSB <400 tis./ml. Mléko se za chladových podmínek (<10 °C) ve vhodné uzavřené nádobě dopraví z mléčnice stáje na pracoviště. Zde se ohřeje ve vodní lázni za průběžného opatrného míchání na 35 °C. Za neustálého míchání se mléko rozleje (po 40 ml nebo více) do potřebného počtu (z hlediska spotřeby pilotů v čase podle standardního operačního postupu dané laboratoře) kvalitních plastových vzorkovnic o objemu 50 ml nebo více. Vzorkovnice mají být se šroubovacím uzávěrem pro zaručení potřebné těsnosti. Tím vznikne šarže pilotních vzorků, jako vnitřního standardu příslušné laboratoře. Jeden vzorek daného mléka se orientačně opakovaně změří na infraanalyzátoru a průtočném cytometru na obsahy T, B, L a PSB. O výsledcích tohoto měření se provede písemný záznam. Zhotovené pilotní vzorky se vkládají postupně do vhodné lázně s tekutým dusíkem a mžikově hluboce zamrazí (–196 °C). Zamražené se v lázni tekutého dusíku přepraví pilotní vzorky do mrazicího boxu s potřebnou kapacitou (–21 °C), kde jsou dlouhodobě uloženy, maximálně však po dobu jednoho roku.
4) Bezpečnost práce při manipulaci s pilotními vzorky Podle praktických metodických zkušeností není rychlé rozmrazování vzorků při velkém teplotním gradientu zcela bezpečným procesem. Vzorkovnice se mohou chovat explozivně, praskat a být zničeny. Je proto nezbytné použít pevné kvalitní plastové vzorkovnice se šroubovacím uzávěrem a rozmrazovat je až po postupném uvolnění teploty z –196 na –21 °C. Proti případnému zranění je nutné se chránit. Pracovník manipulující s pilotními vzorky mléka (při jejich převozu, přenosu do mrazicího boxu nebo rozmrazování) musí mít vhodný pracovní oděv nebo gumovou popřípadě plastovou ochrannou zástěru, pevnou obuv, vhodnou pokrývku hlavy a plexisklový obličejový ochranný štít nebo pracovní brýle. Dále je nutné dodržovat pravidla bezpečnosti práce platná při manipulaci s tekutým dusíkem. 5) Aplikace výsledků měření hluboce zmražených pilotních vzorků mléka pro stabilitu rutinních instrumentálních měření mléka v laboratorní praxi I) Příprava pilotního vzorku k měření Po pozvolném rozmrazení zmraženého pilotního vzorku mléka vyjmutého z mrazicího boxu v pokojové teplotě se vzorek ohřeje ve vodní lázni na 40 °C a důkladně ale opatrně překlápěním homogenizuje. Pak je měřen na příslušném infraanalyzátoru nebo čítači somatických buněk s rotačním diskem nebo průtočnou cytometrií, nebo přístroji kombinujícím tyto postupy podle příslušného platného standardního operačního postupu dané akreditované laboratoře. II) Stanovení referenční hodnoty pilota (RHP) Důkladně homogenizovaný pilotní vzorek je měřen vícekrát, minimálně však dvakrát, podle potřeby na obsahy tuku, bíkovin, laktózy, tukuprosté sušiny, koncentraci močoviny nebo počet somatických buněk. Toto měření se uskuteční bezprostředně po úspěšně provedené kalibraci konkrétního přístroje. Z výsledků měření daného ukazatele se vypočte aritmetický průměr který slouží jako referenční hodnota pro danou šarži pilotního vzorku a konkrétní přístroj. Pro stanovení referenční hodnoty pilota (RHP) je výhodnější použít vícenásobné měření dvou pilotních vzorků téže šarže. RHP pro daný mléčný ukazatel je platná pro kontrolu stability měření konkrétního přístroje po dobu mezikalibračního intervalu (až do přijetí (změny) nové kalibrace), pak se stanoví stejným způsobem nová RHP, nebo do konce dané šarže pilotního vzorku. III) Kontrolní diagram a stanovení limitních odchylek od RHP RHP slouží v následně graficky konstruovaném nebo tabulkově vedeném Shewhartově vývojovém diagramu jako hodnota střední (srovnávací) linie, resp. hodnota nulová (ČSN 57 0536) po dobu své relevantní platnosti. Horní a dolní limit povolené odchylky následného měření pilota od RHP lze vymezit v rozsahu stanovených příslušných nejistot výsledků měření akreditované laboratoře z validačních protokolů analytických metod. V jiném případě lze hodnoty horního a dolního limitu stanovit jako statistickou derivaci dvojnásobku směrodatné odchylky (95 %ní hladina pravděpodobnosti, že výsledek patří do souboru za předpokladu normální frekvenční distribuce výskytu chyb měření, se kterou lze počítat) z typické sekvence výsledků měření pilota pro daný mléčný ukazatel. Měly by být použity stejné horní a dolní limity v celé laboratoři v případě výskytu více přístrojů v laboratoři. IV) Kontrola stability měření přístroje Frekvenci procesu kontroly stability měření přístroje, tzn. pravidelného opakování měření pilota, lze stanovit podle konkrétních podmínek laboratoře. Tzn. podle konkrétní analytické potřeby, výkonu měření přístroje a popřípadě zásoby pilotních vzorků. Interval může být od více dní přes jeden den až po hodiny. Také lze interval vymezit podle počtu běžně měřených vzorků. Obecně se doporučuje interval maximálně dva dny, lépe jeden den (na počátku každého dne měření) nebo po 4 hodinách. O výsledcích odvozených RHP a následných měřeních pilota se vedou přesné záznamy ve k tomu účelu pro konkrétní přístroj vymezeném sešitu nebo knize s číslováním stránek a příslušnými časovými údaji. V) Obecná interpretace výsledků měření pilota
Pokud přesáhne aktuální hodnota kontrolního měření některého mléčného ukazatele pilotního vzorku stanovené limitní hodnoty (přípustný horní, nebo dolní limit) odchylky od platné RHP, doporučuje se připravit dalšího pilota a kontrolní měření opakovat. Splnění limitů od RHP opravňuje k následnému měření rutinních vzorků mléka v daném intervalu mezi kontrolami stability měření přístroje. Pokud limity nejsou při kontrolním měření opakovaně splněny, doporučuje se věnovat zvýšenou pozornost přístroji a podrobit ho podrobnější kontrole, údržbě, případně servisnímu zásahu. Náhodné překročení limitu (např. u jednoho mléčného ukazatele z více testovaných) bez trendu nemusí být vždy zásadně řešeno, ovšem opakované nadlimitní odchylky (neshoda výsledku měření), zejména s náznakem, nebo se zjevným trendem (systematickým driftem hladin měření přístroje směrem k jedné z limitních hodnot a zejména přes tuto hodnotu), je nutno protokolárně řešit a provést a zaznamenat nápravná opatření a jejich výsledek. Je vysoce pravděpodobné, že výskyt jak náhodných tak trendových neshod výsledků měření bude způsoben technickým stavem přístroje (zhoršená opakovatelnost nebo drifty měření v důsledku nestabilní homogenizace, čerpání, elektroniky, zanášení měřicích cel (špatná účinnost výplachu, chyby z přenosu)). Na vině ovšem může výjimečně být i zhoršená kvalita pilotního vzorku. To lze rozlišit především komparací shody neuspokojivých výsledků měření pilota u více přístrojů. Takový pilotní vzorek je nutno bezprostředně změnit a připravit nový. 6) Použité literární prameny při ověřování a validaci uplatněné metodiky BENDA, P.: The effect of some preservatives on natural microflora in milk samples. (In Czech) Vet. Med.-Czech, 40, 11, 1995: 359-364. ČSN 57 0530: Methods for testing of milk and milk products. (In Czech) 1972: ČNI Praha. ČSN 57 0536: Determination of milk composition by mid-infrared analyzer. (In Czech) 1999: ČNI Praha. ČSN EN ISO 13366-3: Milk – Enumeration of somatic cells – Part 3: Fluoro-opto-electronic method. (In Czech) 1998: ČNI Praha. GENČUROVÁ, V., HANUŠ, O., KOPECKÝ, J., JEDELSKÁ, R.: Effect of milk sample treatment before measurement for reading of somatic cell number by the Fossomatic apparatus. (In Czech) Živoč. Výr., 38, 6, 1993: 555-565. GRAPPIN, R.: Definition and evaluation of the overall accuracy of indirect methods of milk analysis - aplication to calibration procedure and quality control in dairy laboratory. Bulletin of IDF, Doc. 208, IDF Provisional Standard 128, 1987: 3-12. HANUŠ, O., BENDA, P., GENČUROVÁ, V.: Tests of Milkofix a new preservative substance for milk samples used for the purposes of an infrarad analysis of basic milk composition. Part I. Checks of bacteriostatic and bactericidal abilities and interferential effect. (In Czech) Vet. Med. Praha, 37, 1, 1992 a: 21-31. HANUŠ, O., FICNAR, J., KOPECKÝ, J., JEDELSKÁ, R., BERANOVÁ, A., HAVLÍČKOVÁ, K.: A retrospective study of results and evolution of methodical design for preparation of urea milk calibration standard sets. (In Czech) Výzkum v chovu skotu, 2, 1997: 7-21. HANUŠ, O.- GENČUROVÁ, V.- ŽVÁČKOVÁ, I.: Tests of Milkofix a new preservative substance for milk samples used for the purposes of an infrarad analysis of basic milk composition. Part II.Checks of preservative effects in relation to the infrared analysis. (In Czech) Vet. Med. Praha, 37, 1, 1992 b: 33-43. HANUŠ, O., GENČUROVÁ, V., GABRIEL, B.: The effect of sample aging on the accuracy of an infrared analysis of basic milk composition. (In Czech) Vet. Med.-Czech, 37, 3, 1992 c: 149-160. HANUŠ, O., GENČUROVÁ, V., KOPECKÝ, J., GABRIEL, B.: The effect of a change in the discriminator level of fluorooptoelectronic determination of somatic cell counts on the results in raw milk and pasteurized milk samples. (In Czech) Živoč. Výr., 38, 5, 1993 a: 443-455. HANUŠ, O., GENČUROVÁ, V., GABRIEL, B., KOPECKÝ, J., JEDELSKÁ, R.: Calibration and accuracy control in determining somatic cell count in cows´ milk by means of the method Fossomatic. (In Czech) Živoč. Výr., 38, 10, 1993 b: 907-926.
HANUŠ, O., GENČUROVÁ, V., GABRIEL, B., ŽVÁČKOVÁ, I.: A comparison of the efficiency of Milkofix preservative substance with traditional preservatives used to determine somatic cell counts in milk samples by a fluoro-opto-electronic method. (In Czech) Vet. Med. Praha, 37, 2, 1992 d: 91-99. HANUŠ, O., HERING, P., MOTYČKA, Z., JEDELSKÁ, R.: Effect of milk samples freezing on practical interpretationability of individual somatic cell counts. (In Czech) Výzkum v chovu skotu, 2, 2002: 9-13. HANUŠ, O., HERING, P., FRELICH, J., JÍLEK, M., GENČUROVÁ, V., JEDELSKÁ, R.: Reliability of milk urea analyse results by various methods in use of artificial milk control samples. Czech J. Anim. Sci., 53, 4, 2008: 156-165. HANUŠ, O., JÍLEK, M., FICNAR, J., BERANOVÁ, A., JEDELSKÁ, R., HAVLÍČKOVÁ, K., MÍČOVÁ, Z.: Ways of preparing standards for calibration of indirect methods of determination of urea concentration in milk. (In Czech) Živoč. Výr., 40, 10, 1995 b: 441-451. HANUŠ, O., KLIMEŠ, M., MIHULA, P., KOZÁKOVÁ, A., JEDELSKÁ, R.: Impacts of the sampling of milk and the basic milk treatment on its freezing point and other compositional parameters. (In Czech) Výzkum v chovu skotu, 4, 2003: 10-17. HANUŠ, O., PONÍŽIL, A., KOPECKÝ, J., GABRIEL, B., JEDELSKÁ, R.: Dynamics of variations of calibration line setups at determination of somatic cell counts of Fossomatic apparatus with various discriminator levels. (In Czech) Vet. Med.-Czech, 38, 8, 1993 c: 497509. HANUŠ, O., SKYVA, J., HOFBAUER, J., KLOPČIČ, M., GENČUROVÁ, V., JEDELSKÁ, R.: Reliability of analytical methods applicable at milk urea determination. (In Czech) Acta univ. agric. et silvic. Mendel. Brun. (Brno), XLIX, 3, 2001: 143-154. HERING, P., HANUŠ, O., FRELICH, J., PYTLOUN, J., MACEK, A., JANŮ, L., KOPECKÝ, J.: Relationships between the results of various methods of urea analysis in native and enriched milk. Czech J. Anim. Sci., 53, 2, 2008: 64-76. KROGER, M.: Milk sample preservation. J. Dairy Sci., 68, 1985: 783-787. LINTNER, T. J., HEALD, C. W., EBERHART, R. J.: Somatic cell reference samples for calibration of milk somatic cell counting methods. J. Food Protect., 47, 1984: 694-696. NG-KWAI-HANG, K. F.- HAYES, J. F.: Effects of potassium dichromate and sample storage time on fat and protein by Milko-Scan and on protein and casein by a modified Pro-Milk Mk II method. J. Dairy Sci., 65, 1982: 1895-1899. SJAUNJA, L. O.: Studies on milk analysis of individual cow milk samples. I. Infrared spectrophotometry for analysis of fat, protein and lactose in milk. Acta Agric. Scand., 34, 1984 a: 249-259. SJAUNJA, L. O.: Studies on milk analysis of individual cow milk samples. II. Factors affecting milk analyses by infrared technique under laboratory conditions. Acta Agric. Scand., 34, 1984 b: 260-272. SJAUNJA, L. O.: Studies on milk analysis of individual cow milk samples. III. The effect of different treatments on infrared analyses. Acta Agric. Scand., 34, 1984 c: 273-285. SJAUNJA, L. O., PHILIPSSON, J., LUNDSTRÖM, K., SWENSSON, CH.: Studies on milk analysis of individual cow milk samples. IV. Factors affecting milk analyses in a routine system by automated apparatuses. Acta Agric. Scand., 34, 1984: 286-299. SJAUNJA, L. O., ANDERSSON, I.: Laboratory experiments with a new infrared (IR) milk analyzer, the Milko-Scan 605. Acta Agric. Scand., 35, 1985: 345-352. SZIJARTO, L. F., BARNUM, D. A.: Preparation, use and evaluation of standards developed for simultaneous monitoring of Coulter and Fossomatic electronic cell counting instruments in Ontario. J. Food Protect., 47, 3, 1984: 227-231. SZIJARTO, L. F., HARDING, F., HILL, A. R., MELICHERCIK, J.: Cooling systems for transport of unpreserved milk samples. J. Dairy Sci., 73, 1990: 2299-2308. VINES, D. T., JENNY, B. F., WRIGHT, R. E., GRIMES, L. W.: Variation in milk fat, protein and somatic cell count from four dairy herd improvement laboratories. J. Dairy Sci., 69, 1986:
2219-2223. VOORT VAN DE, F. R., KERMASHA, S., SMITH, J. P., MILLS, B. L., NG-KWAI-HANG, K. F.: A study of the stability of record of performance milk samples for infrared milk analysis. J. Dairy Sci., 70, 1987: 1515-1523.
III) Předání uplatněné metodiky Postup hlubokého zamrazování pilotních vzorků pro kontrolu stability výsledků analýz složení mléka a jejich dlouhou expiraci: vyvinutá uplatněná metodika byla předána do užívání laboratoří pro kontrolu kvality a složení syrového mléka ČMSCH a.s. Praha v elektronické i písemné formě 11. 4. 2008. Jedná se o inovovaný postup.
IV) Závěr - Kontrola uplatnění metodiky: -
kontrola aplikace uplatněné metodiky je proveditelná prostřednictvím revize dokladů a dokumentů o prováděných pracovních postupech a výsledcích při kontrole stability výsledků měření infraanalyzátorů v laboratořích rozborů mléka v Buštěhradu a v Brně-Tuřanech, tedy na pracovištích klienta ČMSCH a.s. Praha a jeho webových stránkách;
-
uplatněná metodika a technicko-organizační doporučení, opatření a postupy v systému QA/QC (quality assurance/quality control, zajištění a řízení kvality) k řešení referenčně-rutinních systémů analytických laboratoří k testaci kvality syrového mléka a pro zvýšení věrohodnosti výsledků;
-
uplatněná metodika byla zpracována v sedmi exemplářích a předána v kroužkové vazbě na příslušná pracoviště.
Přílohy, dokumenty a doklady: technická řešení a postupy této uplatněné metodiky byly zejména podpořeny výsledky vlastního výzkumu, vývoje a empirických poznatků, které byly publikovány. Datum: 11. 4. 2008 Za zhotovitele: Doc. Dr. Ing. Oto Hanuš Agrovýzkum Rapotín, s.r.o.
Za uživatele: Ing. Zdeněk Růžička Českomoravská společnost chovatelů, a.s., Praha
.................................................
.......................................................
Výsledky řešení metodického problému byly formou vyhodnocení experimentů zpracovány pro publikace v recenzovaném vědeckém a odborném tisku.
