MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat
Porovnání metod vhodných pro uchování DNA a biologických vzorků Bakalářská práce
Vedoucí práce:
Vypracoval:
Ing. Petra Šrubařová
Iva Pavlištová
Brno 2010
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Porovnání metod vhodných pro uchování DNA a biologických vzorků vypracoval(a) samostatně a použil(a) jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.
dne………………………………………. podpis studenta ……………………….
PODĚKOVÁNÍ Tímto děkuji vedoucí mojí bakalářské práce Ing. Petře Šrubařové za poskytnutou pomoc, nezbytnou pro zpracování této práce, odborné konzultace a vedení. Dále bych chtěla poděkovat všem ostatním, kteří mi umožnili vyhledat podklady, poskytli materiály
a
zdroje,
ze
kterých
jsem
do
této
práce
čerpala.
ABSTRAKT Tato bakalářská práce je zaměřena zejména na deoxyribonukleovou kyselinu a problematiku metod, které se týkají uchování DNA a biologických vzorků v laboratorních podmínkách. Zkoumala jsem jednotlivé metody pro izolaci, uchování a následnou analýzu DNA. Zjišťovala jsem metody izolace DNA, dále jaká z uvedených metod je pro uchování DNA nejvhodnější a nejlépe zachová vzorek pro pozdější analýzu či manipulaci s DNA. Ke zjištění výsledků jsem využila poznatků ohledně kvality uchované DNA a porovnání metod mezi sebou.
Klíčová slova: Genetika, DNA, deoxyribonukleová kyselina, biologické vzorky, izolace, uchování.
ABSTRACT This bachelor work is focused mainly on deoxyribonucleic acid and methods for issues relating to the preservation of DNA and biological samples in laboratory conditions. I have examined various methods for isolation, storage and subsequent DNA analysis. I have examined methods of DNA isolation, then what of those methods is most suitable for preservation of DNA samples and best kept for later analysis and manipulation of DNA. To determine the results, I used the knowledge about the quality of preserved DNA and compare methods with each other.
Keywords: Genetics, DNA, deoxyribonucleic acid, biological samples, izolation, preservation
OBSAH 1
ÚVOD............................................................................................................. 7
2
CÍL PRÁCE.................................................................................................... 8
3
LITERÁRNÍ PŘEHLED ................................................................................ 9 3.1
DNA......................................................................................................... 9
3.1.1
Historie.............................................................................................. 9
3.1.2
Struktura............................................................................................ 9
3.2
Izolace DNA .......................................................................................... 11
3.3
Odběr biologických vzorků ................................................................... 12
3.3.1 3.4
Odběr spermatu............................................................................... 12
Media pro uchování DNA a biologických vzorků ................................ 12
3.4.1
Chitosan .......................................................................................... 12
3.4.1.1 Výroba chitosanu z jedlých hub.................................................. 13
4
3.4.2
Kapalný dusík ................................................................................. 13
3.4.3
Papírky Whatman ........................................................................... 14
MATERIÁL, METODIKA .......................................................................... 15 4.1
Metody izolace DNA............................................................................. 15
4.1.1
Izolace DNA fenol – chloroformovou metodou............................. 15
4.1.2
Izolace DNA pomocí resinu ........................................................... 15
4.1.3
Izolace DNA pomocí silikagelu ..................................................... 15
4.1.4
Pomocí pryskyřice Chelex.............................................................. 16
4.1.5
Izolace DNA pomocí magnetických částic .................................... 17
4.2
Metody uchování ................................................................................... 17
4.2.1
Uchovávání při pokojové teplotě.................................................... 18
4.2.1.1 Obecná charakteristika ................................................................ 18 4.2.1.2 Uchování slin při pokojové teplotě ............................................. 19 4.2.2
Uchovávání na speciálních papírcích Whatman............................. 19
4.2.2.1 Obecná charakteristika ................................................................ 19 4.2.2.2 Postup .......................................................................................... 19 5
4.2.3
Uchovávání pomocí chitosanu........................................................ 20
4.2.3.1 Obecná charakteristika ................................................................ 20 4.2.3.2 Skladování................................................................................... 21 4.2.4
Uchovávání biologických vzorků v kapalném dusíku ................... 21
4.2.4.1 Obecná charakteristika ................................................................ 21 4.2.4.2 Skladování................................................................................... 22 5
VÝSLEDKY A DISKUZE .......................................................................... 24
6
ZÁVĚR......................................................................................................... 26
7
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY.......................................................... 27
8
SEZNAM OBRÁZKŮ ................................................................................. 30
9
SEZNAM ZKRATEK .................................................................................. 31
6
1
ÚVOD Téma genetiky je dnes stále více a více probíráno. Věda se rozvíjí, výzkum pokračuje,
pokrok jde neustále kupředu. Dá se říct, že vše, co se genetiky týče, se týká především DNA (obecně NK). Ať už se jedná o její analýzu, izolaci nebo právě možností, jak ji lze uchovat tak, aby zůstala v co nejlepším (nedegradovaném) stavu. Právě na tyto možnosti uchování jsem se zaměřila, dnes je to téma aktuální a velice zajímavé. Především jsem se chtěla zaměřit na uchovávání na chitosanu, protože se touto metodou zabývají mnohé společnosti, jež provádějí různé výzkumy chitosanu se týkající. Neustále se hledají metody, které by byly pro uchování co nejlepší a zároveň co nejvíce použitelné právě pro Českou republiku. A myslím si, že chitosan je materiál, který má potenciál na to, aby splňoval všechny požadavky. A co třeba otázka umělé reprodukce? To je asi nejdůležitější oblast, jejíž úspěšnost závisí z velké míry právě na uchovaném biologickém materiálu, resp. spermatu. Tato problematika vždy byla řešena a bude řešena i nadále. Ať už kvůli lidem, ohroženým druhům zvířat nebo třeba genovým rezervám. Nejen proto je třeba studovat metody, jak lze DNA uchovat. Ať už jde o to zjistit, kdy a za jakých podmínek se vlastně DNA degraduje, za jakých podmínek udržet inseminační dávky nebo třeba o to, aby svět nebyl nudným místem bez výskytu ojedinělých druhů. Vždyť co má větší smysl než dát nový život pomocí genetických zdrojů, jež byly zachovány právě díky těmto metodám?
7
2
CÍL PRÁCE Cílem mojí bakalářské práce bylo především seznámit se s problematikou uchování
DNA a biologických vzorků v různých laboratorních podmínkách. Dále bylo mým cílem prozkoumat jednotlivé metody uchovávání a zvláště porovnat jejich výhody a nevýhody, jejich snadnost a dostupnost pro ČR. Zjišťovala jsem vhodnost jednotlivých metod pro uchování DNA pro následné genetické analýzy, jako je např. metoda PCR (polymerázová řetězová reakce), atd.
8
3
LITERÁRNÍ PŘEHLED
3.1 DNA
3.1.1
Historie Deoxyribonukleová kyselina je základní pilíř celé genetiky jakožto nositelka genetické
informace. Objevil ji v roce 1944 tým Oswalda T. Averyho. Dalšími poznatky se proslavil Erwin Chargaff. Nicméně opravdový zlom nastal popsáním modelu dvoušroubovice DNA, který předložili James Watson a Francis Crick. Tomuto objevu napomohly i RTG studie, které vypracoval Maurice Wilkins společně s Rosalindou Franklinovou (ŠÍPEK, 2005).
3.1.2
Struktura Molekulu DNA tvoří dva polynukleotidové řetězce (podle směru fosfodiesterových
vazeb rozlišujeme 3‘ konec a 5‘ konec). Molekula obsahuje čtyři dusíkaté báze – adenin (Obr. 1), guanin (Obr. 2), cytosin (Obr. 3), thymin (Obr. 4) (první dvě jsou deriváty purinu – purinové a druhé dvě deriváty pyrimidinu – pyrimidinové). Spolu se váže vždy jedna báze purinová a jedna pyrimidinová (A + T, C + G)., jsou spojené vodíkovými můstky. Konečný vzhled obvykle pravotočivé šroubovice, kterou označujeme jako double helix (Obr. 5), vytváří obě polynukleotidová vlákna (ŠÍPEK, 2005). Obě vlákna od sebe můžeme oddělit pomocí denaturace (ale nemusí to být trvalé, vlákna se mohou opět spojit, je možná i tzv. hybridizace) (ALBERTS, 2002). K té může dojít vlivem zejména změnou teploty (zvýšením), extrémní změnou pH, atd. Opětovné spojení řetězců je známo pod názvem reasociace (renaturace) DNA. (Šípek, 2005) Těchto procesů využíváme v DNA – diagnostice (slouží ke stanovení chorob na úrovni DNA; hledáme výskyt určitého signálu, který dokazuje přítomnost dané sekvence ve vzorku DNA (KOČÁREK, 2004).
9
Obr. č.1: Chemický vzorec struktury adeninu (PETERS, ).
Obr. č.2: Chemický vzorec struktury thyminu (PETERS).
Obr. č.3: Chemický vzorec struktury cytosinu (PETERS).
Obr. č.4: Chemický vzorec struktury guaninu (PETERS) .
10
Obr. č.5: Názorný obrázek dvoušroubovice DNA, protilehlé báze spojené mezi sebou vodíkovými vazbami (COLLINS, 2006).
3.2 Izolace DNA DNA a biologické vzorky DNA obsahující izolujeme z různých důvodů (zdravotnictví, ověřování původu, stanovování genetického typu, identifikace, rezervy,…) K izolaci se používají tkáně, které obsahují nativní buňky, popř. celé tělo (u malých živočichů). Nejsnadněji se dá DNA získat z krve, dále potom z mléka, svaloviny, spermatu, chlupových (vlasových) cibulek, obtížněji z trusu (ZIMA et al, 2004).
11
3.3 Odběr biologických vzorků Odběr biologických vzorků činíme různými způsoby. Mezi nejčastější patří odběr krve (pomocí injekční stříkačky), stěry sliznic (např. tyčky od firmy Whatman), dále odběr spermatu (s pomocí druhého zvířete, fantomu)…
3.3.1
Odběr spermatu K odběru ejakulátu jsou používány rozmanité typy umělých vagín. Dnes jsou nejvíce
využívané zkrácené, 30 cm dlouhé vagíny vybavené sběračem z PE. Mezi stěnami vagíny je napuštěna voda tak, aby teplota vagíny při odběru dosahovala 38 – 40°C, před použitím je nutno namazat sterilní vazelínou a dofouknout vzduch na tlak cca 530 kPa. Vlastní odběr probíhá pomocí atrapy (fantomu), elektroejakulací, pomocí masáže ampulí chámovodu nebo odběrem na zvíře (býk, klisna) . Odběr se provádí v určené místnosti (LOUDA et al, 2001).
3.4 Media pro uchování DNA a biologických vzorků
3.4.1
Chitosan Jde o polysacharid, který je derivátem chitinu (Obr. 6) a má silné vazebné vlastnosti.
Jeho výzkum a využití se stále rozrůstá díky obnovitelnosti, nenáročnosti a sníženým nákladům. Je velmi odolný vůči vysokým teplotám. Využití nachází zejména jako „lepidlo“ pro lidskou tkáň. Pomáhá tak léčit popáleniny, hluboké rány nebo vředy, případně v optice, kosmetice, veterinární medicíně, ochraně životního prostředí. Pracuje se na výrobě implantátů, které by se postiženému vpravily a bez problémů by se vstřebaly. Do budoucna to má určitě cenu, v chitinu je potenciál (MAŘÍK, 2007). Dále ho lze používat jako dodávku pro očkovací látky, přinášející DNA a poskytující bílkoviny. Jeho velkým kladem je jeho vysoká bezpečnost, nevykazuje žádné vedlejší účinky, které by mohlo očkování tak jako u jiných látek způsobit (World intellectual property organization, 2006). Při resorpci do těla je chitosan degradován na N-acetylglukosamin a lysozym, přebytečný výsledný produkt je vylučován ve formě oxidu uhličitého (World intellectual property organization 2006).
12
Obr. č.6: Chemický vzorec chitosanu dle Hawortha (Nutrimart, 2005).
3.4.1.1 Výroba chitosanu z jedlých hub Houby mohou být kromě potravinářského využití zdrojem mnoha látek, např. polysacharidů. Zdrojem chitinu mohou být i např. odpady po zpracování jedlých hub a měkkýšů (jedlé houby rodu Agaricus nebo Pleurotus). Konkrétně se chitosan podařilo získat z Pleurotus ostreatus, Agaricus hortensis a Lycoperdon perlatum. Výnos chitosanu činí cca 3 – 7% z celkové sušiny těchto hub. Toto není pevně dáno, výnos chitosanu může být větší, použijeme-li přezrálé houby rodu Lycoperdon, které obsahují spóry (výnos se může zvýšit až na 40%). Pro úspěšný proces a výnos chitosanu je nutno dodržet vysoké teploty (rozmezí 120 – 130°C) a přítomnost alkalických hydroxidů při daných podmínkách. Proces je složitý, proto je cena chitosanu poněkud vyšší (BERAN et al, 2008).
3.4.2
Kapalný dusík Začátky se vztahují k 19. století, kdy v Německu Linde oddělil dusík na membránové
pumpě. Časem se zjistilo, že ještě lepší než kapalný dusík by bylo tekuté helium, ale protože by jeho použití bylo velice neekonomické (je více těkavé, má daleko horší údržnost než kapalný dusík), tak se od jeho používání upustilo a dnes se vše (sperma pro inseminační dávky) uchovává v dusíku (LOUDA et al, 2001).
13
3.4.3
Papírky Whatman Vše začalo v roce 1944 výzkumem s filtračním papírem. Do konce druhé světové
války se ucelila značka, známá dodnes jako Whatman. Postupně byly vyvinuty nové materiály a zahrnuty do filtrů. V roce 1968 byly již papírky Whatman rozšířené v laboratořích různě po světě (více než jiné značky) a filtry byly použité v dalších odvětvích (těhotenské testy, plovací vesty, filtry na kávu, sterilizátory, monitorování pro znečištění životního prostředí, atd…). Počátkem sedmdesátých let byla získána technologie výroby vysokotlaké kapalinové chromatografie, která se ukázala jako schopná metoda pro oddělení mnoha složitých vzorků. Následovalo v roce 1974 spojení firmy Reeve Angel International se značkou Whatman (Whatman, 2007). Dnes pomocí nových technologií FTA jsou stále objevovány další výhody pro uložení téměř jakéhokoliv vzorku pro analýzu DNA. Využití je zejména pro identifikaci trestních pachatelů, sledování původu potravin a jejich bezpečnosti, získání vzorků ze vzdálených míst a těžkého terénu (Whatman, 2007).
14
4
MATERIÁL, METODIKA
4.1 Metody izolace DNA
4.1.1
Izolace DNA fenol – chloroformovou metodou Tato metoda je relativně staršího data (r. 1987), ale i nadále často využívaná. Spočívá
v oddělení pomocí centrifugace roztoku obsahujícího fenol a vodné fáze; dále pak z rozdělení jednotlivých buněčných složek na základně jejich hydrofilních/fobních vlastností. Mezi oběma fázemi se tvoří prstenec, který je tvořen denaturovanými bílkovinami. Dále odebereme požadovanou fázi a srážení DNA, oddělení peletu, promývání, popř. rozpuštění požadované DNA. Pro zbavení se zbytků fenolu v roztoku se používá chloroform ve směsi s isoamylalkoholem (JANOCHOVÁ, 2009).
4.1.2
Izolace DNA pomocí resinu Resin využívá k vázání a uvolňování žádaného materiálu iontové výměny, jedná
se o skupinu metod. Základním principem metody je lyze buněk, interakce a následné napojení DNA na iontoměnič. Iontoměniče jsou různého druhu, ovšem v podstatě máme 2 typy – katexy a anexy (podle jejich náboje). Po navázání DNA pokračuje proces buď filtrací nebo centrifugací – proces závisí na druhu použité techniky. DNA se poté uvolní a je připravena ke skladování ve vhodném prostředí. Techniky máme dva typy – první technika využívá resinových částic v roztoku, druhá inkorporuje tyto částice do membrány (JANOCHOVÁ, 2009).
4.1.3
Izolace DNA pomocí silikagelu Tato metoda izolace je poměrně starší, ale je rychlá a jednoduchá. Její princip je
postaven na využití adsorpce na silikátový povrch, platí zde membránový princip. Jako silikátový povrch se dnes využívá uměle vyrobený silikagel (Obr. 7), dříve se používaly přirozené přírodní materiály (např. křemelina) (JANOCHOVÁ, 2009). DNA se naváže na silikagel pomocí přítomnosti chaotropních solí (typická chaotropní sůl pro reakci je např. gaunidium thiokyanát). Kontaminující složky odstraníme opakovaným promýváním chaotropní solí. Následně DNA zůstává přichycená na silikagel do té doby, dokud nepoužijeme eluční pufr (JANOCHOVÁ, 2009).
15
Obr. č.7: Silikagel (Wikipedia).
4.1.4
Pomocí pryskyřice Chelex Jedná se o metodu, která je používaná pro izolaci DNA tak, aby byla následně vhodná
pro metodu PCR. Velkou výhodou je její jednoduchost a efektivnost. Pro izolaci stačí velmi nízké množství tkáně, kterou promícháme, smícháme s Chelexem (Obr. 8) v množství 200 až 500 mikrolitrů, Chelex mající cca 20%. Vaříme po dobu deseti minut a poté ještě dáme rotovat po dobu 3 minut při 13000 otáčkách. Dále lze využít druhá varianta, která zahrnuje navíc i práci s kapalným dusíkem, vortex a inkubaci (VILLESEN, 2004)
16
Obr. č.8: Izolace DNA pomocí chelexu – DNA v supernatantu, chelex na dně (Florida International University).
4.1.5
Izolace DNA pomocí magnetických částic Tato metoda je novější, rozšiřuje se především v posledních letech. V této metodě je
využíváno magnetických a paramagnetických částic. Magnetickými částicemi nazýváme kulovité útvary, jejichž jádro je tvořeno maghemitem (chemický vzorec maghemitu je γFe2O3), popř. magnetitem (jeho chemický vzorec je Fe3O4), méně často samotným zlatem. Velikost útvarů se pohybuje v obvyklém rozmezí 5 nm až 100 µm. Jejich povrch váže vlákna DNA (obecně nukleových kyselin) (JANOCHOVÁ, 2009). Vlastní izolace probíhá přidáním magnetických částic k deoxyribonukleové kyselině a dojde k navázání molekul. Poté vezmeme magnet, přiblížíme ho ke zkumavce a tím dojde k přitažení magnetických částic, zatímco zbytek s nenavázanými částicemi se odstraní. Poté promyjeme, tím pomůžeme uvolnění DNA do roztoku (JANOCHOVÁ, 2009).
4.2 Metody uchování DNA uchováváme v mrazáku, na whatman papírkách při pokojové teplotě, na chitosanu. DNA se uchovává ve vodě pro potřeby metody PCR při -20°C (při dlouhodobém skladování je teplota nižší, cca -70°C). Rozmrazovat bychom měli co nejméně, při častém rozmrazování nám hrozí snížená kvalita DNA. Pozor musíme dávat také na inhibitory PCR (např.
pufr
TE,
který
by
byl
jinak
17
velmi
vhodný
vzhledem
ke
prodloužení délky skladovatelnosti DNA, na kterou má pozitivní vliv) (KNOLL, VYKOUKALOVÁ, 2002). DNA uchováváme v DNA bankách (v každé zemi, důležitý je uložený počet vzorků především kvůli zdravotnictví – úrazům, turistům přijíždějícím do země, apod.) (anonym, 2004). Dále jsou DNA banky důležité kvůli nepředvídatelným událostem a katastrofám, kdy ukládáme genomickou DNA předem (World intellectual property organization, 2006). Genomická DNA zde slouží jako materiál pro prokázání otcovství, jako zdroj identity (jednotlivé testy), skladování předků, dále např. pro identifikaci genetických nemocí, popř. analýzu genetických poruch (World intellectual property organization, 2006). Problémem je rychlá degenerace DNA, která může nastat právě při pokojové teplotě. Proto se DNA skladuje především zmrazená (World intellectual property organization, 2004). Genomická DNA je konkrétně skladována zmražená, kůže a krev při -20°C nebo -70°C (World intellectual property organization, 2006) . Pro dobré uchování DNA je nutné, abychom DNA skladovali stabilně a při odpovídající teplotě; pokud možno jednoduchou a efektivní metodou (nenáročnou na náklady), pro více druhů odebraných vzorků DNA (nejen pro jeden určitý druh vzorku) aniž by byly poškozeny a v určitém omezeném prostoru (World intellectual property organization, 2004). Biologické vzorky uchováváme v tekutém dusíku, při pokojové teplotě, na chitosanu a whatman papírcích.
4.2.1
Uchovávání při pokojové teplotě
4.2.1.1 Obecná charakteristika Uchování genomické DNA při pokojové teplotě je důležité zejména pro výhodu, kterou je neporušení DNA. Na rozdíl od např. tekutého dusíku, kdy je velké riziko degradace DNA díky opakovanému rozmrazování a zmrazování (WILKINSON et al., 2008). Při pokojové teplotě lze vzorky skladovat bez úhony po dobu delší než 12 měsíců, uložené v tlumivém roztoku. Pokusy se svalovou tkání při pokojové teplotě byly úspěšné, když byly uloženy v tlumivém roztoku v množství 5 – 1000 mg (US National Library of Medicine, 2007).
18
4.2.1.2 Uchování slin při pokojové teplotě Pufr umožňuje dlouhodobé uchování slin při pokojové teplotě. Sliny mohou být takto uchovány po dobu až 6 měsíců bez toho, aby došlo k zjistitelné
degradaci DNA. Pokojová
teplota ideální pro tento způsob je stanovena na 25°C, pokusy byly úspěšné i při 55°C. Velkou výhodou této metody je neporušenost DNA bez známek degradace (NORGEN, 2009).
4.2.2
Uchovávání na speciálních papírcích Whatman
4.2.2.1 Obecná charakteristika Papírky Whatman (Obr. 9) představují rychlou a nenáročnou metodu, jak se dají uchovat vzorky krve pro analýzu DNA. DNA je stabilizována téměř ihned a můžeme ji skladovat při pokojové teplotě (použití není nijak omezeno, dá se analyzovat kdykoli). Nemusíme nijak chladit (FTA zabrání činnosti negativních patogenů, takže vzorky jsou naprosto bezpečné pro manipulaci). Tato metoda je nejrychlejší způsobem, jak uchovat krev a DNA pro metodu PCR (Whatman, 2007).
4.2.2.2 Postup Aplikujeme všechnu krev (nebo kostní morek, vyčištěnou srst,…) na FTA kartu. Poté vyjmeme terčík a dáme ho do PCR zkumavky. Následně 3x promyjeme s činidlem (FTA) a 2x pufrem TE-1. Po každém promytí pufr odlijeme. Vysušíme terčík v PCR zkumavce. Přidáme PCR master mix přímo na terčík a namnožíme pomocí PCR reakce (Whatman, 2007).
19
Obr. č.9: Whatman papírek (Whatman, 2007).
4.2.3
Uchovávání pomocí chitosanu
4.2.3.1 Obecná charakteristika Tato nověji vynalezená metoda je účinná na dlouhodobější uložení DNA při pokojové teplotě a stabilizovaném stavu DNA (MAŘÍK, 2006). Spojení chitosanu a DNA totiž umožňuje trvale uchovat DNA, aniž by došlo k jejímu rozkladu DNA nukleázami (DNase I a DNase II). Pokud je do buněk in vitro vstříknut komplex chitosanu a plazmidové DNA, je spouštěna exprese vkládajícího genu. Efekt je určen na základě molekulové hmotnosti chitosanu, poměru chitosanu k DNA (detailně poměr fosfátů záporně nabité molekuly DNA k dusíku kladně nabité molekuly chitosanu). Pokud bychom nechali plazmidovou DNA při pokojové teplotě bez zásahu, byl by plazmid DNA degradován během pouhých několika málo hodin, zatímco ve sloučenině s chitosanem je možné jej ukládat po dobu nejméně 3 měsíců a více (World intellectual property organization, 2006). Ovšem zatím nebyla provedena studie o možnosti trvale uchovávat genomickou DNA savců nebo uchovávat DNA při pokojové teplotě v komplexu s chitosanem. Problémem je také, že prozatím nebyly vyrobeny vhodné výrobky pro takovéto ukládání DNA s chitosanem. Vynálezem je nová metoda pro skladování genomické DNA živočichů, kdy je DNA ve směsi s ve vodě rozpustným chitosanem, stabilní spojení chrání DNA před rozkladem na deoxyribonuklázy a může být tedy skladována po delší dobu při pokojové teplotě ve stabilizovaném stavu (World intellectual property organization, 2006).
20
4.2.3.2 Skladování Podmínky pro bezpečné uchování DNA jsou takové, že metoda musí být jednoduchá a efektivní, bez nuceného využití zvláštních přístrojů (techniky) a vysokých nákladů; DNA vzorky by měly obsahovat plazmidovou DNA, genomickou DNA a cDNA lidí, zvířat, rostlin a bakterií; DNA musí být skladována ve stabilizovaném stavu (nesmí docházet k degradaci); vzorek DNA by musí být skladován za použití jednoduchého média v omezeném prostoru; vzorky by měly být použitelné pro jednotlivé analýzy, studium a klinická vyšetření; DNA karta by měla být funkční jako DNA banka pro skladování osobní DNA a ukládání genetických informací (World intellectual property organization, 2006).
4.2.4
Uchovávání biologických vzorků v kapalném dusíku
4.2.4.1 Obecná charakteristika Kapalný dusík o teplotě -196°C je dnes nejlevnějším, nejbezpečnějším, dobře skladovatelným a nejpoužívanějším materiálem pro uchování biologického materiálu (především inseminační dávky). Je to bezbarvá, čirá, nehořlavá kapalina bez chuti a zápachu (Obr. 10). Dusík nepodléhá korozi. Má schopnost vyvíjet velký tlak, proto kontejnery na uchování nesmí být uzavřeny pevně, ale pouze polystyrénovou zátkou. Pro výrobu kapalného dusíku používáme zkapalnění atmosférického dusíku (Liquid nitrogen, 2006). Velkým nebezpečím může být potřísnění – vznikají obdobné zranění jako popáleniny různého rozsahu, proto musíme používat ochranné pomůcky (ochranné brýle, pevná obuv, rukavice, bílý plášť, vesta). Nadýcháním se dusíku dochází k nevolnosti, zvracení, následnému upadnutí do bezvědomí a smrti. V těle dochází k vyvázání vazeb na hemoglobin. Největším nebezpečím je asi to, že člověk si jen stěží uvědomí přítomnost dusíku. Nikdo by neměl vstupovat do místnosti, kde je koncentrace kyslíku nižší než 19,5%, nemá-li k dispozici dýchací přístroj nebo respirátor (Liquid nitrogen,2006).
21
Obr. č. 10: Kapalný dusík (Newinfo2day).
4.2.4.2 Skladování Biologický materiál uchovaný v kapalném dusíku je třeba skladovat ve speciálních kontejnerech, umístěných v dobře větrané a chladné místnosti. Větrání musí být dobře zajištěno, aby se zabránilo vdechování dusíku a následnému bezvědomí. V místnosti jsou požadované rovné podlahy beze spár, z nehořlavého materiálu. Vlastní kontejner je dvou až tříplášťová nádoba ze slitin (především hliník). Mezi plášti je vakuum, případně práškový izolant (tzv. sorbent). Důležitý je pojistný přetlakový ventil, jehož funkce je zabránit možné explozi. Kvůli odpařování je nutná lehce dosedající zátka a kontejner neuzavíráme napevno, pouze touto zátkou (polystyrén). V případě pevné těsnicí zátky by mohlo dojít k roztržení kontejneru a explozi. Kapalný dusík do něj pravidelně doléváme, musíme sledovat teplotu (pro inseminační dávky je kritická teplota cca -60°C až -55°C), která se liší dle výšky hladiny KN (Tab. 1). Kontejnery jsou různých rozměrů a objemů (dle funkce,např. manipulační nebo velké zásobní na čistý kapalný dusík), dle jejich objemu zvažujeme i jejich čištění a dezinfekci (vedeme evidenci) (LOUDA et al, 2001). Nevýhodou je to, že je potřeba velmi nízkých teplot a speciálního drahého zařízení, takže tato metoda je výrazně náročnější na náklady (World intellectual property organization, 2004).
22
Tabulka č.1: Teploty v kontejneru při rozmanité výšce hladiny kapalného dusíku (LOUDA et al, 2001).
BK -10
BK -35
BK -200
Hloubka v cm
Teplota °C
Teplota °C
Teplota °C
10
-70
-58
-30
15
-150
-132
-70
20
-188
-182
-111
25
-190
-190
-153
30
-190
-191
-176
35
-191
-192
-184
45
-193
-193
-191
50
-196
-196
-193
Výška hladiny dusíku
3 cm
21 cm
30 cm
23
5
VÝSLEDKY A DISKUZE Která ze zde uvedených metod je nejlevnější, nejdostupnější, nejefektivnější a
nejspolehlivěji zajistí dokonalé uchování DNA a biologických vzorků pro další použití? To je předmětem diskuze, ovšem najít metodu, která splňuje všechny tyto požadavky, není v současné době úplně nejsnazší. Zdá se mi být velmi dobrá možnost uchovávat DNA při pokojové teplotě, protože na to nejsou potřeba nějaké zvláštní náročné podmínky a nedochází snadno k degradaci díky neopatrnému zacházení, jak je to např. u kapalného dusíku. Příznivé je i to, že náklady nejsou příliš vysoké. Naopak kapalný dusík je ověřená metoda způsobu uchovávání inseminačních dávek, jakožto i na velmi dlouhou dobu. Je to však metoda nákladná a nezřídka dojde k poškození dávky (BM) a nemožnosti ji efektivně použít. To je asi největší riziko, rychlá degradace vlivem neopatrné manipulace a špatně provedeného zmrazování a rozmrazování. Nicméně, tato metoda je velice zaběhlá a úspěšná při odborném zacházení, můj názor je, že tuto metodu z hlediska uchování ID (spermatu) jen tak něco „nevystrnadí.“ Chitosan je stále více do hloubky zkoumán a jeví se mi jako dobrá potenciální možnost do budoucna. Potěšující je zejména snadná výroba, ale myslím si, že to zatím ještě trochu pokulhává z hlediska výše nákladů a ne zcela dokončeného výzkumu. Papírky Whatman se zde moc nepoužívají. Ale tato metoda se zdá být také dobrá, je levná, nenáročná a nežádá si nějaké speciální požadavky. Z hlediska co nejmenší možnosti degradace DNA mi připadá nejlepší metoda uchování při pokojové teplotě. Ale záleží konkrétně na vzorku, který chceme uchovat a také na jak dlouhou dobu. Např. zmíněné inseminační dávky těžko budeme uchovávat nezmrazené, jelikož spermie mají stanovené podmínky, aby dávka zůstala funkční. Avšak každá metoda má svá pro a proti (Tab. 2).
24
Tabulka č.2: Shrnutí výhod a nevýhod jednotlivých metod uchování
VÝHODY
NEVÝHODY
Pokojová
nenáročné, netřeba
možná pouze kratší doba skladování
teplota
drahých zařízení, levné
Kapalný
osvědčený způsob,
zdraví nebezpečné, vysoké riziko
dusík
nejlevnější,
poškození vlivem rozmrazování, potřeba
nejdostupnější
speciálního zařízení
velký potenciál, neustálý
drahé, nepříliš dobře dostupné
Chitosan
rozvoj Papírky
nenáročné, jednoduchý
riziko poškození papírku při skladování,
Whatman
způsob, rychlé
nepříliš rozšířená metoda
25
6
ZÁVĚR Zaměřením této bakalářské práce bylo prozkoumat metody uchování DNA a
biologických vzorků a vzájemně porovnat a posoudit, jestli je lepší uchování při pokojové teplotě, v kapalném dusíku, na papírkách Whatman nebo na chitosanu. Posuzování se provádí především podle kvality uchování DNA (aby došlo k co nejmenší degradaci a tím pádem poškození), dále jsou důležitými hledisky výše nákladů, efektivnost využití a dostupnost. Navíc mi připadá, že se zde hodně drží i osvědčené metody, jako je např. kapalný dusík. I když si myslím, že inseminační dávky jsou jedny z nejdůležitějších materiálů jak u zvířat, tak hlavně u lidí a jejich skladování by se nemělo podceňovat. A pokud je kapalný dusík bez problémů a dávky nejsou příliš poškozovány neodbornou manipulací, asi těžko tento způsob uchování jen tak něco změní. Problematika konzervace spermatu je řešena od 40. let 20. století, bouřlivý rozvoj zažila po druhé světové válce a od té doby je neustále zdokonalována. V tomto směru si myslím, že jde o jeden ze souboru velmi užitečných objevů nejen současných, ale hlavně do budoucnosti (již jsem zmínila např. genové rezervy). Řekla bych, že tuto problematiku by lidé rozhodně neměli podceňovat, pro „běžného“ člověka je to sice téma nepříliš v popředí zájmu, ale genetika je základ a od ní se odvíjí vše. Ať už nás napadne reprodukce, zdravotnictví, zločiny, katastrofy, kdy je třeba identifikace či biologický (genetický) materiál. Kdo z nás ví, jestli se to jednou nebude týkat přímo i jeho?
26
7
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
1
ALBERTS, B. Molecular Biology of the Cell. New York: Garland Science, 2002.
1549 s. ISBN 0-8153-4072-9.
2
Air products [online]. 2006 [cit. 2010-04-20]. Liquid nitrogen. Dostupné z WWW:
.
3
BERAN, Miloš, et al. Výzkumný ústav potravinářský Praha [online]. 2008 [cit. 2010-
04-21]. Isolation and characterization of chitosans from edible mushrooms. Dostupné z WWW: .
4
COLLINS, Francis. National Human Genome Research Institute : National Institutes
of Health [online]. 2005 [cit. 2010-04-21]. Double helix. Dostupné z WWW: .
5
JANOCHOVÁ, Jana. Izolace DNA: Výtěžnost a kvalita [online]. Brno : Masarykova
univerzita, 2009. 48 s. Bakalářská práce. Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta. Dostupné
z
WWW:
_VYTEZNOST_A_KVALITA.doc>.
6
KNOLL, Aleš; VYKOUKALOVÁ, Zuzana. Molekulární genetika zvířat : Metody
detekce polymorfizmů DNA genů. 1. Vyd. Mendelova univerzita v Brně : Mendelu, 2002. 168 s. ISBN 80-7157-616-6.
7
KOČÁREK, Eduard. Genetika, obecná genetika a cytogenetika, molekulární biologie,
biotechnologie, genomika. 1. Vyd. Praha : Scientia, 2004. 210 s. ISBN 80-7183-326-6.
8
LOUDA, František, et al. Inseminace hospodářských zvířat se základy biotechnických
metod. Praha : Česká zemědělská univerzita v Praze, Agronomická fakulta, 2001. 232 s. ISBN 80-213-0702-1.
27
9
MAŘÍK, Martin. Nové lepidlo pro chirurgy. Hospodářské noviny [online]. 14.6.2006,
[cit. 2010-04-13]. Dostupný z WWW: .
10
NORGEN [online]. 2009 [cit. 2010-04-22]. Saliva DNA Preservation Buffer (2X).
Dostupné z WWW: .
11
Nutrimart : Your Health Food Store [online]. 2005 [cit. 2010-04-27]. Dostupné z
WWW: .
12
Pubmed US National Library of Medicine : National Institutes of Health [online].
4.9.2007 [cit. 2010-04-25]. Room temperature DNA preservation of soft tissue for rapid DNA extraction: an addition to the disaster victim identification investigators toolkit?. Dostupné z WWW: .
13
PETERS, Kristian. Korseby online [online]. 1999 [cit. 2010-04-27]. Dostupné z
WWW: .
14
Soubor:Silica gel.jpg In Wikipedia : the free encyclopedia [online]. St. Petersburg
(Florida)
:
Wikipedia
Foundation,
,
[cit.
2010-04-25].
Dostupné
z
WWW:
.
15
ŠÍPEK, Antonín. Genetika - Váš zdroj informací o genetice [online]. 2005 [cit. 2010-
04-07]. DNA & RNA. Dostupné z WWW: .
16
VILLESEN, Palle. A simple chelex extraction protocol [online]. Bioinformatics
Research Centre : Aarhus University, 2004. 1 s. Referát. Aarhus University. Dostupné z WWW: .
17
Whatman : Leadership in separations technology for the life sciences [online]. 2007
[cit. 2010-04-13]. Dostupné z WWW: .
28
18
WILKINSON, Steven, et al. Biomatrica [online]. 2008 [cit. 2010-04-25]. Room
temperature preservation of gDNA quality in tissue specimens and culture cells with DNAgard™.
Dostupné
z
WWW:
.
19
World intellectual property organization [online]. 16.03.2006 [cit. 2010-04-13].
Method for storing DNA by using chitosan, and products using the methods. Dostupné z WWW: .
20
World intellectual property organization [online]. 06.05.2004 [cit. 2010-04-13]. DNA
storing
medium
and
method
of
storing
DNA.
Dostupné
z
WWW:
.
21
ZIMA, Jan, et al. Genetické metody v zoologii. 1. Vyd. Praha : Karolinum, 2004. 239
s. ISBN 80-246-0795-6.
29
8
SEZNAM OBRÁZKŮ •
Obr. č.1 – Chemická struktura adeninu; PETERS (http://www.korseby.net/computer/templates/chem_adenin.png)
•
Obr. č.2 – Chemická struktura thyminu; PETERS (http://www.korseby.net/computer/templates/chem_thymin.png)
•
13
Obr. č.7 – Silikagel; Wikipedia (http://cs.wikipedia.org/wiki/Soubor:Silica_gel.jpg)
•
11
Obr. č.6 – Haworthův vzorec chitosanu; Nutrimart, 2005 (http://www.nutrimart.com/images/bulk/chitosan.gif)
•
10
Obr. č.5 – Názorný obrázek dvoušroubovice DNA; COLLINS, 2007 (http://www.genome.gov/glossary/index.cfm?id=53)
•
10
Obr. č.4 – Chemická struktura guaninu; PETERS (http://www.korseby.net/computer/templates/chem_guanin.png)
•
10
Obr. č.3 – Chemická struktura cytosinu; PETERS (http://www.korseby.net/computer/templates/chem_cytosin.png)
•
10
16
Obr. č.8 – Izolace DNA pomocí chelexu; Florida International University (http://bioserv.fiu.edu/~biolab/labs/1010/fall%202008/Task%20Sheets%20Fall%2020 08/chelex%20extraction.jpg)
•
17
Obr. č.9 – Papírek Whatman; Whatman, 2007 (http://www.whatman.com/References/WGP_1351_Blood_B.pdf)
•
20
Obr. č.10 – Kapalný dusík; New info 2day (http://www.newinfo2day.com/wpcontent/uploads/2009/03/liquid-nitrogen.jpg)
30
22
9
SEZNAM ZKRATEK
DNA – deoxyribonukleová kyselina NK – nukleové kyseliny PCR – polymerázová řetězová reakce ID – inseminační dávka PE – polyethylen gDNA – genomická deoxyribonukleová kyselin atd. – a tak dále např. – například popř. – popřípadě A – adenin T – thymin C – cytosin G – guanin BM – biologický materiál KN – kapalný dusík
31
