Polymorfismus genu EDNRB ve vztahu ke zbarvení a onemocnění u koní

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat

Polymorfismus genu EDNRB ve vztahu ke zbarvení a onemocnění u koní Diplomová práce

Vedoucí práce:

Vypracovala:

prof. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D.

Bc. Lucie Svobodová

Brno 2013 1

PROHLÁŠENÍ

Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Polymorfizmus genu EDNRB ve vztahu ke zbarvení a onemocnění u koní vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně.

dne………………………………. podpis diplomanta………………………………

2

PODĚKOVÁNÍ

Chtěla bych poděkovat Mgr. Zuzaně Vykoukalové, Ph.D. za velikou pomoc při práci v laboratoři a celkově za pomoc při psaní diplomové práce. Za pomoc s vyhodnocením statistiky děkuji doc. Ing. Tomáši Urbanovi, Ph.D. Za další nápady a pomoc děkuji Terce Sobíškové. Největší poděkování patří babičce Ing. Jitce Houškové za hlídání syna Filípka a celé mojí rodině za podporu při studiích. Poděkování patří také všem chovatelům a majitelům, kteří ochotně poskytli vzorky od svých koní a umožnili jejich fotografickou dokumentaci. Diplomová

práce

CZ.1.05/1.1.00/02.0068.

3

byla

zpracována

s

podporou

projektu

CEITEC

ABSTRAKT

Zbarvení srsti u koní je významné nejen z hlediska ochrany před predátory a vlivy počasí, ale má svůj význam při jejich identifikaci či jako plemenný znak. Strakatost typu frame overo je ovlivněna dominantní alelou frame FrF (L), která vzniká dinukleotidovou substitucí TC→AG v kodonu 118 genu EDNRB, způsobující záměnu aminokyseliny isoleucinu za lysin. Páření dvou jedinců s touto alelou se ale nedoporučuje - s 25% pravděpodobností se může narodit hříbě s tzv. OLWS (letální syndrom bílých hříbat). Postižená hříbata se rodí převážně celá bílá s modře pigmentovanou duhovkou a s neinervovanou částí trávicího traktu. Asi po 12-ti hodinách života vykazují příznaky koliky a za několik dní umírají. V nejasných případech je zapotřebí nechat určit genotypy rodičů v laboratoři. Hříbata s letálním syndromem značíme jako homozygoty L/L, jedince s frame vzorem jako heterozygoty L/N a koně bez mutace N/N. V této práci byl polymorfismus v genu EDNRB způsobující OLWS analyzován u 133 koní plemene paint horse. Detekce alely byla prováděna metodou AS-PCR a potvrzena u 27 koní vzorů frame overo, frame sabino a tovero. U těchto jedinců byl vzor frame dohledatelný v původu. U 109 jedinců vzorů tobiano, sabino, tovero a solid nebyla mutace detekována. Žádný žijící jedinec L/L nebyl zaznamenán.

klíčová slova: paint horse, OLWS, EDNRB, frame overo, letální syndrom bílých hříbat .

4

ABSTRACT

The frame overo coat pattern is characterised by spotting of irregular size, which usually occur on the middle of the side of the body and neck, and tends to have clear edges. Genetic control of the frame pattern is affected by dominant allele FrF (L). There was detected dinucleotid substitution TC→AG in codon 118 of the EDNBR gene, Ile118Lys mutation. Mating two horses that carry the allele is not recomended. There is 25% probability that the foal produced by this mating will have the OLWS syndrome (overo lethal white syndrome). These foals are predominantly white with blue iris and they have not innerved portions of the intestinal tract. The foal exhibites symptoms of colic in about 12 hours of birth and die within a few days. Genetical testing for the frame allele is available and it is recomended to have the horses tested to avoid the mating of two carriers. The foals with OLWS are analysed as homozygotes L/L, horses with frame pattern as L/N and horses without this mutation as N/N. Using the AS-PCR method, from the sample of 133 horses (American Paint Horse) the mutation was detected within 27 horses with the frame overo, frame sabino of tovero pattern. All these horses have the frame pattern inherited from their ancestors. 109 horses without the mutation were the tobiano, sabino or tovero pattern or solid colored. No one living L/L horse was found.

Key word: American Paint Horse, OLWS, EDNRB, Frame overo, lethal white foals syndrom

5

Obsah PROHLÁŠENÍ.................................................................................................................. 2 PODĚKOVÁNÍ ................................................................................................................ 3 ABSTRAKT ..................................................................................................................... 4 1 ÚVOD ............................................................................................................................ 7 2 CÍL ................................................................................................................................. 7 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED ............................................................................................... 8 3.1 American Paint Horse…………………………………………….………...……..8 3.1.1 Historie plemene ................................................................................................ 8 3.2 Základní zbarvení koní…………………………………………………………....9 3.2.1 Lokus Color C (MATP) .................................................................................... 9 3.2.2 Extension a Agouti lokus ................................................................................. 10 3.2.2.1 Lokus Extension E (MC1R) ..................................................................... 11 3.2.2.2 Lokus Agouti A (gen ASIP) ..................................................................... 11 3.2.3 Známé lokusy ovlivňující základní zbarvení koní ........................................... 11 3.3 White marks/odznaky (WM)…………………………………………………….12 3.4 základní vzory strakatosti………………………………………………………..14 3.4.1 Tobiano (KIT) .................................................................................................. 14 3.4.2 Overo ............................................................................................................... 18 3.4.2.1 Lokus sabino Sb (KIT) ............................................................................. 18 3.4.2.2 Lokus splashed white Spl (PAX3) ........................................................... 21 3.4.2.3 Lokus Frame Overo Fr (EDNRB) ........................................................... 23 3.4.2.3.1 Hříbě OLWS ze solid QH klisny…………..…………………………30 3.4.2.3.2 Waanderbung-Hirschsprung syndrome……………………..………..31 3.4.3 Tovero .............................................................................................................. 33 4 MATERIÁL A METODIKA....................................................................................... 35 4.1 Odběr vzorků…………...………..………………………………….……………35 4.2 Izolace DNA………………………..……………...……………...….…………..35

6

4.3 Detekce polymorfismu Ile118Lys mutace…………….……….…..………….…36 4.3.1 AS-PCR ............................................................................................................. 36 4.4 Statistické vyhodnocení .......................................................................................... 38 4.4.1 Frekvence genotypů a alel ................................................................................. 38 5 VÝSLEDKY ................................................................................................................ 39 5.1 Izolace DNA……………………………………………………………………..39 5.2 Stanovení genotypů polymorfismu Ile118Lys pomocí AS-PCR………………..39 5.3 Statistické vyhodnocení ........................................................................................ 40 5.3.1 Frekvence genotypů a alel Ile118Lys mutace genu EDNRB ........................... 40 5.3.2 Absolutní frekvence genotypů vzhledem k fenotypu jedinců ......................... 41 6 DISKUZE .................................................................................................................... 43 7 ZÁVĚR ........................................................................................................................ 45 8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ......................................................................... 46 9 SEZNAM OBRÁZKŮ ................................................................................................. 49 10 SEZNAM TABULEK ............................................................................................... 50 11 SEZNAM ZKRATEK ............................................................................................... 51 PŘÍLOHY ....................................................................................................................... 53 SEZNAM PŘÍLOH......................................................................................................... 54

7

1 ÚVOD Zbarvení srsti u divokých koní je významné z hlediska ochrany před predátory a vlivy počasí. U domestikovaných jedinců nabývá i dalšího významu jakou je identifikace či plemenný znak. V dnešní době jsou na barvu srsti kladeny vysoké nároky. Některá atraktivní a žádaná zbarvení jsou však asociována s různými chorobami nebo mohou být zcela letální. V současné době zažívá velký pokrok genetika barev - je již objasněna dědičnost většiny typů zbarvení. Jsou také detekovány mnohé příčinné mutace i jejich místo v genomu. Dnes se tedy nemusíme spoléhat na odhady výsledného zbarvení u hříbat pouze z rodokmenů, ale stačí laboratorně jedincům identifikovat genotyp pro zbarvení DNA testy. Díky určenému genotypu lze snadněji sestavit rodičovský pár, předpovědět zbarvení potomků a hlavně se vyvarovat možné letální sestavě genů. Strakatí koně jsou oblíbení po celém světě a vyskytují se u různých plemen. Některé plemenné knihy však nedovolují vůbec registrovat tyto jedince kvůli případným zdravotním komplikacím (př. American Quarter Horse – AQH). U plemene paint horse (PH) je však strakatý kůň chovatelským cílem a registruje tři základní typy strakatosti (tobiano, overo (frame, sabino, splashed white) a tovero). Vzor frame overo je geneticky podmíněn dominantní alelou FrF polymorfismu Ile118Lys v genu EDNRB. Tato alela však v homozygotní sestavě působí letálně na narozené hříbě. Vzor frame overo má sice zcela charakteristický fenotyp, ale díky vzájemnému křížení a interakci různých vzorů, může být mutace detekována i u zdánlivě jednobarevného koně plemene paint horse. Testování koní je tedy jedinou spolehlivou metodou jak určit zygotnost jedince a zajistit tak produkci životaschopných koní s žádaným zbarvením.

2 CÍL Cílem této práce je shromáždit dostupné informace o plemeni paint horse, popsat známé vzory strakatostí a jejich genetické založení, stanovit genotypy polymorfizmu Ile118Lis v genu EDNRB a vyhodnotit jejich asociace s fenotypem, dále pak stanovit frekvence alel a genotypů u daného souboru zvířat a vyhodnotit je pomocí statistiky.

7

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED Není-li uvedeno jinak v seznamu obrázku, tabulek a příloh; autor: Lucie Svobodová.

3.1 American Paint Horse V naší republice se představitelé plemene paint horse začali objevovat teprve na konci 20. století a roku 1995 byl založen Paint Horse Club ČR. Stejně jako u quarterů je hlavním požadavkem tzv. „dobytkářský ráz“. Typické je výrazné osvalení s pevnou kostrou způsobilé pro celodenní práci na ranči s dobytkem. U tohoto kompaktního koně je také kladen důraz na povahové vlastnosti. Důležitá je klidná povaha se smyslem pro samostatnou práci a pro práci s dobytkem, tzv. „cow sense“. Ohledně zbarvení je chovatelským cílem dosáhnout kontrastních vzorů, kdy barevná srst na pigmentované kůži se střídá se srstí bílou na nepigmentované pokožce. Minimálním požadavkem na zbarvení je alespoň jedna bílá skvrna, která má v průměru asi 5 cm a u převážně bílého koně musí být tato skvrna v kontrastní tmavé barvě. Klasické odznaky na hlavě a na končetinách nejsou brány v úvahu. V popisu zbarvení se vždy uvádí základní barva srsti a typ strakatosti př. bay tobiano. American Paint Horse Association (APHA) povoluje všechny typy zbarvení, kdy strakaté jedince registruje v základním registru (Regular Registry) a nestrakaté v registru jednobarevných paintů (Solid Paint Bred Registry). Asociace také registruje koně splňující minimální požadavek na zbarvení plemen QH a A1/1 u kterých se vyskytují také overo vzory strakatosti (czpha.cz).

3.1.1 Historie plemene

Kdy se objevil první strakatý kůň je pro dnešní svět tajemstvím. Je však jisté, že tato mutace spadá do dávné historie díky nálezům jeskynních maleb zobrazující strakaté jedince. Historie plemene PH jak jí známe dnes, však začíná na začátku 16. století, kdy se španělský průzkumník Hernando Cortes plavil do Nového světa. Podle španělského historika, který cestoval s expedicí, bylo na palubě 16 koní, kdy jednoho z nich popsal jako „pinto“ s rozsáhlými odznaky na předních končetinách, druhého jako tmavého nevybělujícího bělouše se skvrnami. Jednalo se tedy o první záznamy o strakatých koních v Novém světě. Postupem času další evropští průzkumníci přivedli do dnešní 8

Ameriky nespočet koní různých plemen, především nejrůznější poníky z Anglie charakteristické odolností, pevnou konstitucí a vytrvalostí, koně španělských dobyvatelů již přivyklých práci s dobytkem a v pozdější době svou roli sehrál i anglický plnokrevník, jehož použili chovatelé ke zvýšení výkonnosti svých kříženců. Ve 20. století v Americe vznikalo postupně několik asociací, kam se tito koně mohli registrovat. American Paint Stock Horse Association založená 1962 registrovala strakaté jedince s cílem dosáhnout uznání painta za samostatné plemeno. American Paint Quarter Horse Association registrovala painty, kteří se narodili údajným jednobarevným quarterům, spadající do asociace American Quarter Horse, která byla založena kvůli záchraně mizejících dobytkářských koní, kdy již při založení této organizace bylo rozhodnuto, že strakatí quarteři budou z plemenné knihy vyřazeni. Vzhledem k tehdejším znalostem zákonů genetiky si tito lidé nedokázali vysvětlit, proč se strakatí koně mohou narodit i rodičům zdánlivě jednobarevným. Tito jedinci byli většinou fenotypu s rozsáhlými bílými odznaky na hlavě (tzv. lucernou) a se všemi vysoko bílými končetinami, s největší pravděpodobností byli tedy nositeli genu pro strakatost. Konečně roku 1965 došlo ke spojení APSHA a APQHA do asociace, kterou známe dnes American Paint Horse Association. Plemeno paint horse můžeme tedy brát jako barevnou variantu dobytkářského plemene quarter horse (APHA.com).

3.2 Základní zbarvení koní Níže v literárním přehledu uvádím pro lepší orientaci souhrn základních informací o zbarvení u koní a výčet známých ředících lokusů, jenž všechny APHA povoluje při registraci. V této práci budu užívat americké názvosloví, které nejpřesněji koresponduje s genetickým založením jedince.

3.2.1 Lokus Color C (MATP)

Lokus Color kóduje gen pro transportní protein asociovaný s membránou (MATP, membrane associated transporter protein), který rozhoduje o tom, zda se z prekurzorů barviva vytvoří pigment melanin (Mariat at al., 2003). Melanogeneze probíhá v melanocytech, kde leží buněčné organely melanosomy dvojího typu (eumelanosomy, phaeomelanosomy). Melaniny migrují pomocí mikrotubulů na vnější okraj buňky, kde 9

se pigmenty uvolňují pomocí exocytózy do epidermálních buněk, které jsou pak začleněny do okolních keratocytů (Thiruvenkadan et al., 2008). Vývoj melanocytů začíná již v embryonálním vývoji v oblasti neurální lišty, kde rovněž dochází k vývoji primárních senzorických a autonomních neuronů. Melaniny během embryonálního vývoje migrují do specifických míst na obou stranách těla. K dispozici jsou tři taková místa na hlavě (v blízkosti očí, uší a na temeni hlavy), šest míst po obou stranách těla a několik podél ocasu. Do těchto míst vstupují pigmentové buňky, které dále proliferují a migrují až do vlasových folikulů. Gen C vykazuje úplnou dominanci, téměř všichni savci mají tento gen, který v recesivní sestavě CcCc způsobuje nepřítomnost pigmentu. Tito jedinci vykazují červené zbarvení očí, růžové zbarvení kůže a bílé (albinotické) zbarvení srsti. Genotyp CcCc nebyl u koní zatím zaznamenán, většina plemen má obě alely dominantní CCCC. U koní je také na stejném lokusu alela CCr (cream), která je neúplně dominantní a má ředící efekt. Genotyp CcrCcr zesvětluje základní barvy tak intenzivně, že jsou jedinci s touto recesivní sestavou označováni jako albíni, i když pravými albíny nejsou (Jakubec, 1998; Sponenberg, 1996).

3.2.2 Extension a Agouti lokus

Základní zbarvení koní je podmíněno interakcí lokusů Extension (E) a Agouti (A). Lokus Extension se podílí na tvorbě pigmentu eumelaninu a phaeomelaninu a Agouti má vliv na distribuci černého pigmentu eumelaninu do jednotlivých částí těla viz tab.1.

Tab. 1 Interakce Extension a Agouti lokus (Sponenberg, 2009) Agouti locus

Extension lokus

Výsledná barva

AAA-

EEE-

bay/brown

AaAa

E EE-

black

AAA-

EeEe

sorrel/chestnut

AaAa

EeEe

sorrel/chestnut

10

3.2.2.1 Lokus Extension E (MC1R) Za tvorbu eumelaninu je zodpovědná dominantní alela EE a za tvorbu phaeomelaninu zase recesivní alela Ee genu MC1R. Lokus Extension kóduje melanokortinový receptor 1, který leží na povrchu melanonocytů. Produkce eumelaninu a phaeomelaninu je regulována interakcí genu MC1R s α-melanocyty stimulujícím hormonem (α-MSH) nebo agouti signálním proteinem (ASIP) (Sponenberg, 2009). MC1R je spolu s KIT genem

řazen do skupiny LG II lokalizovaném v oblasti ECA3p12 (Raudsepp et al., 1999).

3.2.2.2 Lokus Agouti A (gen ASIP) Dominantní alela AA genu pro Agouti-signaling-protein (ASIP) distribuuje černý pigment do okrajových částí těla (ocas, hříva, distální část končetin, špičky uší). Recesivní sestava AaAa distribuuje pigment rovnoměrně po celém těle za předpokladu, že je jedinec zároveň nositelem jedné dominantní alely EE genu MC1R. Sestava alel EeEe působí epistaticky vůči lokusu Agouti a zabraňuje jeho expresi. ASIP blokuje povrchový receptor pro α-MSH na melanocytech, v přítomnosti ASIP není možná stimulace α-MSH a je tvořen pouze phaeomelanin. V případě kdy není Agouti protein exprimován je produkován i eumelanin (Sponenberg, 2009).

3.2.3 Známé lokusy ovlivňující základní zbarvení koní

Další lokusy ovlivňující výsledné zbarvení koní můžeme rozdělit podle výsledného fenotypu do tří základních skupin viz Tab. 2.

11

Tab. 2 Lokusy ovlivňující základní zbarvení koní (Sponenberg, 2009) ředící

Cream (CR), Dun (D), Silver Dapple (Z), Flaxen (F), Pearl (Prl), Champagne (CH)

vybělující

Grey (G)

depigmentující

Roan (RN), Overo (O), Tobiano (TO), Sabino (SB), Manchado (MA), Splashed white (SPl), Leopard (LP), White (W), White marks (WM)

3.3 White marks/odznaky (WM) U koní se také vyskytují tzv. bílé odznaky, které se mohou projevit u všech kombinací barev, kromě zcela bílých koní, kde jejich projev je zastřen fenotypem, ale jejich genetické založení zůstává stejné (sabino, white, grey). U vzorů strakatosti odznaky rozšiřují jejich celkový projev. Typické odznaky u koní jsou tedy charakteristické projevem bílé srsti na nepigmentované růžové kůži s variabilní asymetrickou strukturou (tzv. parciální albinismus), na rozdíl od pravidelných bílých vzorů u divokých druhů zvířat. Ve studii lišek chovaných pro kožešiny sovětský genetik Belyaev (1979) objevil spontánně se vyskytující bílé odznaky v selektovaných (pro tzv. domácí chování) chovných liniích. Tyto experimenty ukázaly, že odznaky mohou být fyziologicky spojeny s vlastnostmi, které odlišují zdomestikované jedince od volně žijících populací (Bowling,

1996).

Domestikace

je

všeobecně

proces,

který

vede

k četným

morfologickým, fyziologickým a behaviorálním změnám, kde barva srsti je nejvíce zřejmá. Zatímco mnoho druhů ve volné přírodě vykazuje relativně jednotné zbarvení, domácí zvířata můžeme vidět v široké škále vzorů barev (Rieder, 2009). Odznaky mají dnes hlavní funkci v identifikaci a popisují se vždy topograficky. Žádní dva koně s bílými odznaky nemají stejné vzory, tato známá pestrost odznaků tedy odráží i velkou rozmanitost alel a negenetických vlivů působící na migraci melanocytů. Pro jakoukoli analýzu znaku s genetickou variancí je důležité rozumět vlivu prostředí na výslednou podobu znaku. Některé bílé odznaky mohou vzniknout destrukcí melanocytů v lokalizovaných oblastech jako následek úrazu bez genetického přičinění (tzv. získané odznaky) (Bowling, 1996).

12

Klíčem k zahrnutí negenetických vlivů je asymetrie odznaků na končetinách. Všechny čtyři nohy u jednotlivých koní mají přesně stejnou genetickou výbavu, ale i přesto může být jedna končetina bez odznaků, jiná se spěnkou či s vysoko bílou končetinou, vzniká nám tedy nekonečné množství různých kombinací. Pro klasický genetický výzkum, který se snaží pochopit vliv prostředí, je výhodné využívat k pozorování jednovaječná dvojčata, kdy lze pozorovat stejné pohlaví i barvu, ale totožnost bílých odznaků potvrzena být nemůže. Negenetické komponenty, které ovlivnily variabilní projev znaku nebyly zjištěny, ale přesto výzkum dramaticky ilustruje, že jakékoli úvahy o genetice odznaků musí zahrnovat pochopení, že ne všechny pozorované rozdíly mezi jedinci se zakládají v genech (Bowling, 1996). Woolf (1998) zjistil, že počet oblastí na hlavě s bílou srstí souvisí s počtem odznaků na končetinách, což nám ukazuje, že jsou založeny stejným genetickým mechanismem a jsou tedy ve vzájemné korelaci. Jeho údaje také potvrdily vliv základní barvy na projev odznaku (zbarvení sorrel se jeví s více odznaky jak bay či black) a na vliv pohlaví (samci mají širší bílé odznaky, než samice). Bílé skvrny na hlavě a znaky na končetinách jsou dnes asociovány s geny MC1R, KIT a MITF, kdy v závislosti na základním zbarvení způsobují primárně bílé odznaky. Vzhledem k interakci genu MC1R a KIT mají koně zbarvení sorrel/chestnut rozsáhlejší bílé odznaky, než jedinci bay nesoucí jednu alelu Ee (Sponenberg, 2009). U savců se prekurzory melanocytů zakládají již v neurální liště. Rawles (1947) ukázal, že u myší je melanoblast přítomný téměř ve všech oblastí integumenta, odkud dále migrují směrem k cílovým oblastem do distálních částí těla. Kompletní migrace a klonální proliferace melanoblastu v mesodermu zajišťuje plný počet melanocytů, což vede ke zcela pigmentovaným oblastem končetin. Přestože nám chybí vědecká potvrzení, je logické předpokládat, že bílé odznaky vyplívají z inhibice melanoblastu v distálních končetinách během zárodečného vývoje. Odznaky se, však projevují i bez podkladu růžové kůže, ale tyto plochy se vyskytují jako úzké oblasti na hlavě, končetinách a jako okrajové oblasti u větších skvrn. Tmavá kůže pod těmito odznaky je pravděpodobně důsledkem omezené migrace melanocytů z přilehlých pigmentovaných oblastí, kdy se tyto buňky později přemisťují a nemusí již proniknout strukturou chlupu tak, aby tato celá oblast zůstala pigmentovaná (Sponenberg, 2009). Nepigmentovaná srst je tedy důsledkem zablokované exprese melanocytů v typických oblastech charakteristických pro dané typy vzorů strakatostí. Kit-ligand 13

(Kitl) faktor kmenových buněk a mastocytů hraje klíčovou roli v rozvoji a udržení melanocytů u dospělých jedinců (Sponenberg, 2009).

3.4 Základní vzory strakatosti Koně plemene PH se vyskytují ve čtyřech základních typech strakatosti, u kterých je přesně definován fenotyp. Všechny tyto vzory jsou patrné již od narození, zůstávají konstantní a působí ve vzájemné interakci, kdy tento tzv. kříženec v rámci zbarvení je označen jako tovero. Vzory strakatosti řadíme do skupiny tzv. depigmentující, kam také spadá vzor manchado, který u plemene PH nebyl zaznamenán a vzor Leopard vyskytující se jen u plemene Appaloosa a Knabstrubr (Sponenberg, 2009). Všechny vzory strakatosti vykazují společné komplexní vlastnosti s velkým fenotypovým rozptylem. Strakatost, jak jsem se již zmiňovala je výsledkem aberací ve vývoji melanocytů. Je to složitá genetická síť kontrolující proliferaci, migraci, diferenciaci a přežívání buněk produkujících pigment. Melanocyty vznikají během fetálního vývoje z melanoblastů, které vznikají v neurální liště a migrují přes vyvíjející se plod v zájmu dosažení své konečné polohy na těle. Pokud přežije málo migrujících melanoblastů, výsledkem je částečná nebo úplná depigmentace. Z genetického hlediska jsou vzory strakatosti komplexní zvláštností, kdy může dojít k různé kombinaci alel na několika lokusech. Je tedy nemožné předpovědět genotyp zvířete pouze na základě fenotypu (Hauswirth et al., 2012).

3.4.1 Tobiano (KIT)

Název vzoru tobiano pochází z Argentiny, kam v polovině 19. století přitáhl brazilský generál Tobías s vojskem na strakatých koních. Tento vzor strakatosti byl v Severní Americe velmi vzácný. Dnes patří tobiano mezi nejrozšířenější vzor u plemene PH, ale i u mnoha jiných plemen je velmi rozšířen (český teplokrevník, hucul, shetlandský pony, islandský pony, tennessee walking horse, american saddlebred, paso fino, irish cob atd.).

Tobiano se může projevit velmi variabilním fenotypem. Lze se setkat s koňmi téměř jednobarevnými s minimem bílé i s jedinci téměř bílými se zbytky základní barvy. Pigmentovaná srst vytváří charakteristické oválné či kulaté skvrny pokrývající jeden 14

případně oba boky, krk nebo hruď, přesahující v některém místě mezi ušima a ocasem hřbet s tendencí vertikálního uspořádání viz obr.1. V bílé srsti se také mohou vyskytnout tzv. inkoustové skvrny, které byly asociované s homozygotností ToToToTo. (viz přílohy I. obr.c) Jsou však zaznamenáni i heterozygoti ToToToto s těmito skvrnami. Hranice mezi bílou a tmavou barvou je tvořena pigmentovanou kůží překrytou bílými chlupy. Hlava bývá zpravidla tmavá, často s klasickými bílými odznaky. Oči tmavě pigmentované až na výjimky při rozsáhlejším odznaku na hlavě modré. Ocas a hříva bývají dvoubarevné. Končetiny jsou většinou celé bílé nebo alespoň od karpálních či hlezenních kloubů dolů. Na odznacích u končetin se mohou objevit tmavé skvrnky kolem korunky, které způsobují pigmentaci rohoviny i u bílých končetin. Minimálně exprimovaní tobiano mají pouze pravidelné bílé končetiny od karpů či hlezen dolů tzv. vysoko bílé. Na hlavě se mohou projevit i klasické odznaky. Podél hlavní hřbetní linie jsou často v hřívě nebo ocase bílé znaky viz obr.2. Maximálně exprimovaní jedinci mají zcela bílé tělo se zachovaným pigmentem v bocích a na hrudníku viz obr.3 (Sponenberg, 2009). Z fenotypu nelze přesně usuzovat zygotnost tobiano vzoru, ale kombinaci alel můžeme odvodit z potomstva, kdy přesnost predikce souvisí s počtem potomků viz tab. 3 (Sponenberg, 2009; Bowling, 1996). Tab. 3 Statistická zjištění predikce homozygotnosti tobiano vzoru (Bowling, 1996) Potomstvo z páření Tobiano ˣ solid

% pravděpodobnost homozygotnosti

5 tobiano

97 %

7 tobiano

99%

10 tobiano

99,9%

Dosud není znám mechanizmus, který ovlivňuje rozsah a umístění bílých skvrn, předpokládá se však vliv modifikujících genů exprimujících se pouze u strakatých koní. Gower (2000) uvádí příklad páření jednobarevného hřebce Rannock zbarvení chestnut s pěti různě exprimovanými klisnami vzoru tobiano. Všechna narozená hříbata byla téměř identického vzoru. Páření ukazuje na vliv modifikujících genů, které Rannock nese (Chalupová, 2008). DNA testy mohou také v budoucnu ukázat, zda je původ tobiano vzoru spjat s jedním plemenem nebo jestli jde o nezávislou mutaci, kdy jedinci nevykazují

15

společnou vazbu. Teorie jednoho předka je spíše nepravděpodobná z důvodu rozšíření vzoru tobiano po celém světě (Sponenberg, 2009). Bowling (1996) také uvádí testovací křížení vzorů tobiano a overo na příkladu křížení hřebce PH vzoru tovero s 42 klisnami solid plemen QH, A1/1. Byly zaznamenány tyto údaje: 9 jedinců solid, 10 tovero, 10 overo a 13 tobiano. Výsledky ukazují, že vzor tobiano se vzory overo nejsou ve vzájemné vazbě, ale pokud kůň zdědí oba tyto geny, působí ve vzájemné interakci typického fenotypu. Ze dvou jedinců vzoru tovero se může narodit i letální hříbě, ale existují i vzácné výjimky životaschopných bílých koní.

Obr. 1 Vzor tobiano

a)bay tobiano b) black tobiano Obr. 2 Minimálně exprimované vzory tobiano

16

a) black tobiano b) black tobiano Obr. 3 Maximálně exprimované vzory tobiano

Vzor tobiano je determinován autozomálně dominantní alelou ToTo chromosomu 3 intronu 13 v blízkosti lokusu KIT (známý jako růstový faktor melanocytů). Alela ToTo je způsobena inverzí genetického materiálu o 70 kB na KIT lokusu (Brookes et al., 2002; Raudsepp et al., 1999, Sponenberg, 2009)

Lokus KIT je asociován s vazbovou skupinou LG II s geny pro vazebné proteiny vitaminu D vázaný na bílkovinu Gc (group-specific component), s lokusy proteinů krevních skupin pro albumin (Al), dále esterázu (ES) a lokusu extension (E) a roan (Rn) (Sponenberg, 2009). Gen KIT také způsobuje bílou skvrnitost u člověka, prasete a myši. Studie pomocí PCR-RFLP prokázaly, že všichni vzorovaní tobiano nesou alelu určenou jako KM1 viz tab.4. U třech ze 104 plnokrevníků značených jako solid byla tato alela také detekována. V takovém případě mohlo jít pravděpodobně o minimální vyjádření znaku (Bowling, 1996; Brooks et al., 2002).

Tab. 4 Genotyp vzoru tobiano (Bowling, 1996) Tobiano

KM1KM1, KM1KM0

Not tobiano

KM0KM0

17

3.4.2 Overo

Overo vzor (stejně jako tobiano) se rozšířil při kolonizaci ze Španělska a v Jižní Americe už po staletí označoval jakékoli strakaté koně. Dnes díky vědeckým výzkumům víme, že pod toto základní označení spadají tři geneticky zcela odlišné verze zbarvení. U všech se však jedná o dominantní mutaci (Sponenberg, 2009). Geny způsobující overo strakatost se nemusí projevit ve fenotypu jedince, ale mohou se ukázat až po několika generacích, proto jsou tak často se vyskytující jedinci „cropout“ vždy overo. Kůň, který ve fenotypu nevykazuje žádné znaky overo typů strakatosti, může být stále přenašeč těchto vzorů a také je může stále předávat dál. Všeobecná charakteristika overo vzorů vykazuje pigmentovanou srst, která obvykle vytváří souvislý pruh na hřbetní linii od kohoutku až po kořen ocasu, kdy i končetiny s žíněmi bývají pigmentované. Bílá srst nikdy nepřebíhá přes hřbetní linii mezi kohoutkem a bedry a bílé skvrny na rozdíl od tobiano vzoru jsou nepravidelné až rozptýlené. Hlava bývá více bílá s častějším výskytem modrého oka tzv. rybího (APHA.com).

3.4.2.1 Lokus sabino Sb (KIT)

Termín sabino pochází pravděpodobně ze španělštiny a v doslovném překladu znamená „světlý“ nebo „skvrnitý“. V Mexiku a Argentině se tímto vzorem označují tečkovaní bělouši tzv. pstružáci a další zbylé vzory strakatosti. V Evropě a USA se používá označení sabino pro jedinečný vzor strakatosti (Sponenberg, 2009). Vzor sabino je běžný u clydesdaleských a shirských koní. V menší míře se může objevit i u tennessee walking horse, quarter horse, morgan u anglického plnokrevníka a u mnoha dalších. Minimální projevy vzoru jsou často přehlíženy nebo bývají zaměňovány za zbarvení roan, frame overo a tobiano vzory (skvrny se výjimečně mohou rozšířit i vertikálně). Sabina málo exprimovaná nemusí mít odznaky na hlavě. Nejspolehlivějším znakem takto značeného sabina je skvrna na bradě, skvrny na karpálních a hleznových kloubech, úzké rozšíření bílé na nohách tzv. údery blesku a prokvetlost viz obr.5. Sabino jako všechny vzory je nejvíce exprimované u zbarvení sorrel/chestnut a nejméně u black. Vzor je charakteristický ve středním projevu rozsáhlými bílými odznaky na hlavě a na končetinách (alespoň jedna, častěji dvě nebo všechny bílé), kdy skvrny

18

směřují od břicha dorzálně a jsou charakteristické neostrými okraji s typickou prokvetlostí viz obr.4. Vzor má všeobecně velmi variabilní projev od málo roztroušené bílé srsti po těle po zcela bílé koně (viz přílohy VIII. obr. F). Nejčastější je výskyt jedinců s pigmentací na uších, hrudníku, kořeni ocasu a podél hřbetní linie a ve slabinách. Oči jsou zřídkakdy modré nebo jen částečně. Prokvetlost nemusí být u hříbat patrná a s věkem se může rozšiřovat. Kůže může být v některých místech tečkovaná. Maximální projev sabino vzoru vykazuje skvrnité oblasti na uších, na kořeni ocasu, na bocích či hrudníku viz obr. 6. Kůň může mít pigmentované jen uši nebo je zcela bílý s tmavým okem (Sponenberg, 2009). U jedinců sabino bylo zaznamenáno i několik případů smrtící bílé. Je tedy pravděpodobné, že rodiče měli v původu frame koně a nesli mutaci Ile118Lys genu EDNRB (Hauswirth et al., 2012). Nedávné studie naznačují, že jde o několik vzorů ovlivněných více geny. Jedna mutace vedoucí k vzoru sabino je sabino-1 (SblSbl). Sekvenovaním se odhalila substituce T → A v intronu 16 KIT lokusu na chromozomu 3 (asociace se vzory tobiano a roan), která vede k přeskočení exonu 17 kódující část druhé domény tyrozin kinázy, kdy může dojít k částečně nebo zcela nefunkčnímu proteinu. Alela SblSbl se projevuje jako neúplně dominantní, kdy homozygoti jsou téměř úplně bílý a heterozygoti jsou charakterističtí bílými odznaky na dvou a více končetinách, bílou lysinou na hlavě, skvrnami s roztřepenými okraji a prokvetlostí na trupu. U 13 koní však nebyla SNP nalezena, tito jedinci vykazovali odlišný vzor sabino strakatosti, pravděpodobně se jednalo o další mutace v KIT genu nebo i v jiných genech (Brooks et Bailey, 2005). Sponenberg (2009) zkoumal potomky z jednobarevných klisen po pěti různě exprimovaných hřebcích sabino vzoru, kdy hřebci s větším poměrem bílé srsti měli vyšší procento skvrnitých potomků. Ze studie vyplývá, že v některých rodinách sabino hříbata produkují stejný poměr bílé jako rodiče. Takové pozorování je tedy v souladu s polygenní dědičností. U tohoto vzoru není neobvyklé, že strakatý jedinec určený jako sabino má v rodokmenu mnoho generací předků, kteří měli zcela standardní zbarvení s velkými odznaky. Plemena jako clydesdale či shirský kůň jsou šlechtěná záměrně na tyto extenzivní bílé odznaky na hlavě a končetinách bez projevu strakatosti po těle. V těchto případech se připařují strakatí koně s koněm, který má alespoň jednu nohu bílou a pokud chovatelé vyžadují strakaté jedince, tak páří koně v základní barvě se sabino v maximálním projevu.

19

Obr. 4 Vzor sabino

Obr. 5 Minimálně exprimovaný vzor sabino

Obr. 6 Maximální projev vzoru frame/sabino

20

3.4.2.2 Lokus splashed white Spl (PAX3) Splashed white se u plemene paint horse vyskytuje jen zřídka, ale díky atraktivnímu zbarvení se postupně v chovu rozšiřuje. Výskyt vzoru byl zaznamenán také u plemen quarter horse, morgan, A1/1, welsch pony, islandský pony a shetland. U splashed white jsou typické bílé končetiny, stejně tak hlava a ventrální část trupu. Hranice mezi bílou a

pigmentovanou srstí je ostrá. Oči jsou často modré nebo jen částečně s tzv. čipy v dolní polovině duhovky doprovázené expresí bílých ploch. Minimálně značený vzor je podobný typu solid s odznaky s rozsáhlými bílými končetinami, někdy se skvrnou na břichu a hlavou obvykle kápovitého tvaru. Maximálně značení koně mají hlavu bílou, pigmentované uši, týl a krk viz obr.7. Vědci se naklání k hypotéze dominantního založení SplS. Vědci studovali koně z různých plemen a zjistili jednu příčinnou mutaci v genu PAX3 chromozomu 6 a tři mutace v genu MITF. Mutace v genu PAX3 byla zmapovaná pouze u koní vzoru splashed white. Tato mutace způsobuje podobný fenotyp u lidí a myší, kdy ovlivňuje vysoce konzervovaný cysteinový zbytek v párové doméně, která se účastní vazby na DNA. Vědci odhadují stáří mutace genu PAX3 jen na 24 let s výskytem pouze u plemen QH a PH. Ve studii však nebyl zaznamenán žádný kůň, který by nesl PAX3 alelu od obou rodičů. Na základě údajů ze studií na myších, je nepravděpodobné, že takový kůň by byl životaschopný. Patrně dochází k embryonálnímu úmrtí. Mnoho splashed white je také neslyšících, někteří chovatelé tvrdí, že jsou spíše hluší ti s bílou srstí kolem očí. Žádné studie o tomto vztahu však nejsou k dispozici. Všechny tři mutace MITF vedou ke srovnatelným fenotypům, podobné mutace byli také nalezeny u lidí, myší a psů. Jedna mutace v genu MITFN310S má sníženou schopnost vázat DNA. Vědci mutaci zmapovali u jednoho koně plemene Franches-Montagnes, jenž se narodil solid rodičům, kde způsobila nový vzor nazvaný macchiato. Vzor se podobá kombinaci bílé strakatosti s ředící alelou. Jedinec byl ve dvou letech testován, kdy se odhalila hluchota a nízká pohyblivost spermií. Podobné mutace u člověka způsobují Waardenburgův a Tietzův syndrom způsobující vady pigmentace a hluchotu. Mutace MITF

C280Sfs * 20

je výsledkem posuvné mutace za ztráty poloviny proteinu. MITF

prom1

ovlivňuje oblast na melanocyt specifickém promotoru. Mutace MITFprom1 vznikla asi před sto lety a vykazuje poměrně častý výskyt u několika moderních plemen. Koně homozygotní pro tuto alelu jsou životaschopní a projevují se s výraznější depigmentací 21

než heterozygoti. První dvě zmíněné alely MITF jsou extrémně vzácné. Data z myší opět naznačují, že tyto alely budou s největší pravděpodobností mít za následek vážné klinické projevy. Výzkumníci analyzovali celkem 239 koní (106 vzorů bílé strakatosti a 133 solid). Ze 106 kandidátů vzoru splashed white bylo 70 s alespoň minimálním projevem vzoru a 36 s extrémním projevem bílé. Celkem bylo zahrnuto 77 koní z plemene QH, PH a dále jiná plemena (plnokrevníci, islandský kůň, shetland pony, miniaturní kůň, odlenburský kůň) viz obr.8 a 9 (Hauswirth et al., 2012; Sponenberg, 2009).

Obr. 7 Vzor splashed white

22

Obr. 8 Minimální projevy vzoru splashed white (Hauswirth et al., 2012)

Obr. 9 Maximální projevy vzoru splashed white (Hauswirth et al., 2012)

3.4.2.3 Lokus Frame Overo Fr (EDNRB)

Tento typ zbarvení se vyskytuje jen u několika plemen, geneze většiny vzorů strakatosti se váže s koňmi španělského původu, ale vzhledem k častému výskytu sabino i frame u anglického plnokrevníka, který se ve velké míře využíval k zušlechtění amerických koní, lze předpokládat prapůvod tohoto vzoru zde. U vzoru frame overo jsou často 23

všechny končetiny pigmentované, nejméně je však jedna. Mohou se projevit klasické odznaky i modré oko v pigmentovaném okolí, ale barva očí nemůže být faktorem při určování vzoru. Klasické odznaky asociované s MC1R, KIT a MITF jsou s genem EDNRB ve vzájemné interakci a rozšiřují rozsah bílé srsti. Ocas bývá pigmentovaný. Typické jsou bílé skvrny uprostřed trupu a krku, které jsou zřetelně orámované (stále zůstávají více členité, než tobiano). Bílá je uspořádaná jakoby horizontálně a na rozdíl od zbarvení tobiano nezasahuje přes hřbetní linii. Hodně koní vykazuje ve fenotypu pigmentovaný horní pysk, který je v nesouladu s jinak bílou hlavou viz obr.12 (Sponenberg, 2009; Bowling, 1996). Minimálně značení frame overo jsou zcela bez skvrn s výraznou bílou hlavou (opak min. tobiano: bílé končetiny a tmavá hlava) viz obr. 13. Kombinace rozsáhlých bílých odznaků na hlavě s jednou bílou končetinou jsou neobvyklé. Klasické odznaky u solid koní jsou ve vzájemné korelaci jak na hlavě, tak i na končetinách. Středně až maximálně značení frame vykazuje téměř bílou hlavu, nízko pigmentované končetiny a rozsáhlé bíle orámované boky, kdy bílá může přesahovat přes horní linii nejčastěji v hřívě viz obr.14. Hříbata s letálním syndromem se rodí převážně nebo zcela bílá s několika tmavými pigmentovými okrsky v srsti a s modrýma očima a umírají během několika dní po porodu s příznaky koliky (viz příloha VIII). Žádní žijící homozygoti pro letální alelu nebyli zaznamenáni. Tato letalita je odlišná od jiných zbarvení (roan, white, splashed white) u kterých se v homozygotní sestavě předpokládá embryonální úmrtí. První výzkumy začaly až v roce 1996 a o rok později, tři různé nezávislé studie (Universita v Minnesotě v Californi a v Austrálii) identifikovaly DNA mutaci Ile118Lys genu EDNRB (Metallinos et al., 1998; Santschi et al., 1998; Yang et al., 1998). Yang et al. (1998) u koní identifikovali cDNA fragment genu EDNRB (endothelinový receptor B), který obsahoval 1329 bp, kódující 443 aminokyselin, jenž má sedm transmembránových domén s typickou sekvencí a topografickou strukturou spadající do skupiny GPCR (G protein-coupled receptor) viz Obr.10. U EDNRB byly prozatím nalezeny dvě isoformy

EDNRB a EDNRA. Komparativní sekvenování

ukázalo, že je gen mezi savci vysoce konzervován. Byl stanoven vysoký stupeň homologie, 85 až 91 % (člověk, skot, prase, krysa, myš) identické sekvence u EDNRB a u EDNRA (člověk, skot, myš) 55 % viz Obr. 11. Sekvenční analýzou spolu s AS-PCR amplifikací analyzovali restrikční místo, kde odhalili dinukleotidovou substituci TC→AG v kodonu 118 genu EDNRB ECA17, kde způsobuje uvnitř první 24

transmembránové domény záměnu isoleucinu za lysin (viz příloha X). Záměna v pořadí první transmembránové domény může narušit lokalizaci receptorů v plazmatické membráně nebo jeho signalizaci (Metallinos et al. 1998). Yang et al. (1998) také uvádí možnou mononukleotidovou mutaci odpovědnou za OLWS, kdy tato mutace nemusí být detekována AS-PCR. V takovém případě je vhodnější využít metodu RFLP.

Obr. 10 Schéma mutací EDNRB u koní, člověka a myši (Metallinos et al., 1998)

Obr. 11 EDNRA endothelin receptor A, EDNRB endothelin receptor B, hum-člověk, hor-kůň, bov-skot, mou-myš; (Yang et al., 1998)

Gen reguluje tvorbu buněk neurální lišty, z níž se diferencují střevní ganglia a melanocyty, kde díky inervaci dochází k intestinální aganglióze. Enterický semiautonomní systém trávicí trubice je modifikovaný parasympatikem a sympatikem, tvořící dva plexy kolem střeva: myenterický (mezi svaly střeva) a submukosální (ve 25

střevní sliznici). Systém umožňuje posunování obsahu trávicího traktu díky koordinovaným pohybům, regulací enzymů, kyselin a některých gastrointestinálních hormonů. U hříbat postižených OLWS byly odebrány vzorky na histologické vyšetření a bylo zjištěno, že jedinci postrádají myenterický plexus (Santchi, et al. 1998). Hříbata s OLWS tedy nemají inervovanou trávicí soustavu a potrava nemůže procházet dále. Ve vzácných případech může chybět část traktu tenkého střeva (Bowling, 1996). Onemocnění nelze řešit léčbou ani chirurgickým zákrokem. Hříbata postižená OLWS by měla být humánně uspána. Důležité je však s jistotou vědět, že hříbě je skutečně „lethal white“, neboť bílí koně mohou být rovněž výsledkem maximálního vyjádření jednoho nebo několika vzorů a jsou plně životaschopní. U vzoru frame dochází k úmrtí až po porodu, z důvodu prenatální výživy pupeční šňůrou (Sponenberg, 2009). Podobná mutace byla také zaznamenána u plemene clydesdale. Jedinci vykazovali projevy apatie s břišním napětím. Střevní defekt byl analyzován ve velkém kolonu, kde mikroskopická analýza zaznamenala absenci ganglia. Takto popsané onemocnění je rozdílné od OLWS. U clydesdale se nenarodila bílá hříbata a onemocnění se projevilo až kolem 4-9 měsíce. U tohoto plemene je obvyklý vzor sabino a onemocní je popsáno jako intestinální defekt abdominálního diskomfortu. Vzhledem k tomu, že sabino a frame overo spadají do stejné skupiny overo vzorů, lze předpokládat určitou podobnost (Bowling, 1996). Alela FrF je tedy dominantního založení s variabilní penetrancí. Dříve se soudilo, že je tato mutace recesivní, díky případům, kdy se frame overo narodil dvěma rodičům solid. Zpětnou kontrolou fenotypu bylo zjištěno, že někteří rodiče vykazovali zvláštní odznaky, téměř bílou hlavu se všemi pigmentovanými končetinami. Přezkoumáním záznamů plemenné knihy APHA vyšlo najevo, že frame se předává jako autozomálně dominantní znak, díky údajům z křížení dvou jedinců vzoru frame viz Tab. 5. (Bowling, 1996). Není také vyloučené, že kontrola vzoru frame je založená složitějším způsobem, než jen působením jedné dominantní alely. Tento neznámý vliv by mohl způsobit maskování vzoru. Na toto téma však neproběhly ještě žádné studie (Sponenberg, 2009). Tab. 5 Páření heterozygotů FrFFrf (Bowling, 1996) Alely

FrF

Frf

FrF

FrFFrF - letální

FrFFrf –frame overo

Frf

FrFFrf - frame overo

FrfFrf - solid

26

Mnoho případů narození frame koně ze solid rodičů je zaznamenáno u anglického plnokrevníka, kde je známo několik rodin. První údaj o frame vzoru u plnokrevníků byl zaznamenán před 20 lety, ačkoli existují obrazy strakatých plnokrevníků z dřívějších dob, nezachovaly se bližší informace. Údajný první frame plnokrevník dnešní doby byl hřebec Tri Chrome zbarvení bay overo narozen 1991 po Blue Gazi (bay, 1978) z Miss Joslin (bay, 1981). Vykazoval typický fenotyp frame, jako mladý byl však kvůli zranění utracen. Další overo hřebec Blue Eyed Streaker narozen 1993 také po Blue Gazi z Bev´s Gilr (bay, 1978) dosud působí jako plemeník v USA na Echo Hill Farm, jeho potomstvo vykazuje vzor frame z 50 %. Další známou rodinou produkující vzor frame vychází z páření Pesty Axe (gray, 1977) a Torchys Rainbow (bay, 1976), kteří měli stejného otce Give Em The Axe (gray, 1965). Z tohoto páření se narodili dvě hříbata. Nite Spot (bay overo,1985) nesoucí geny jak pro vzor frame overo i sabino a Patchy Lassy (sorrel sabino,1989), která vykazuje charakteristický fenotyp sabino, ale vzhledem k jejím potomkům nese i mutaci genu EDNRB. V roce 2000 se jí narodil hřebeček Ellusive Quest, který vykazuje jak vzor sabino i frame overo (viz příloha IX). Stejné případy, kdy se narodí kůň s frame vzorem jsou zaznamenány i u plemene QH, který má plnokrevníky v původu. Tito koně překračující akceptované meze AQHA nemohou být registrováni jako QH, ale mohou být zapsáni právě jako overo u APHA. Okolo 500-ti „cropout koní“ bylo registrováno u APHA v době jejího založení z AQHA, kde v té době bylo registrováno 100 000 koní (allbreedpedigree.com,2013; Bowling, 1996). Tato čísla ukazují, že 1 z 200 potomků QH rodičů vykazoval rozsáhlé bílé odznaky. Žádná teorie však nemůže dostatečně vysvětlit výskyt těchto koní. Můžeme předpokládat, že došlo k mutacím, ale ty jsou vzácné a ojedinělé. Pravděpodobnější je výskyt takové sestavy alel, u kterých nedojde k vyjádření vzoru (Bowling, 1996). Metallinos et al. (1998) ve své práci testovali 138 koní různých plemen, kdy heterozygoty zaznamenali u všech koní frame overo, ale také u několika koní označených jako tobiano, tovero, solid i u plemen QH, A 1/1 a miniaturních koní. Metallinos et al. (1998) ve své práci však neuvádí zbarvení koní ostatních plemen, které otestovali jako N/L a doporučuje testovat všechna plemena u kterých se vyskytuje frame vzor. Santschi et al. (1998) testovali vzorky 22 hříbat s OLWS a všechny určili jako homozygoty pro LYS118. Jejich rodiče bez výjimky jako heterozygoty, kdy všichni vykazovali typický vzor frame overo až na jednu klisnu fenotypu solid. Celkem 10-20 % přenašečů mutace je maskováno jiným 27

vzorem nebo vykazují typ solid. Je tedy vysoce pravděpodobné, že další geny mohou ovlivnit expresy vzoru frame (Vrotsos et al., 2001). Vrotsos et al. (2001) testoval několik stovek koní, kde bylo 90 % PH a zbytek QH a A1/1 a strakatí koně jiných plemen. Všechna hříbata s OLWS byla homozygotní pro mutaci Ile118Lys genu EDNRB. Žijící jedinec s takovou sestavou alel také nebyl zaznamenán. Heterozygoti se objevily jak u všech vzorů strakatosti i u koní solid s bílými odznaky plemene PH i u plemene Miniature Horse, kdy jedinci byli zcela bez odznaků. Takové pozorování naznačuje vliv modifikačních genů v populaci Miniature Horse, který silně potlačuje frame vzor viz tab.6.

Tab. 6 Výskyt Ile118Lys mutace genu EDNRB (Vrotsos et al., 2001) zbarvení

počet koní

N/N

N/L

L/L

tobiano

109

98

11

0

frame overo

188

10

178

0

sabino

15

12

3

0

splashed white

26

23

3

0

„medicine hat“

13

4

9

0

bílí kůň

5

1

4

0

tovero

84

35

49

0

solid/NOT PH

146

120

26

0

white/NOT PH

5

1

4

0

OLWS

28

0

0

28

28

Obr. 12 Vzor frame overo

a) black overo

b) bay overo

Obr. 13 Minimální vyjádření frame overo

29

a) black overo

b) bay overo

Obr. 14 Střední projev frame overo

3.4.2.3.1 Hříbě OLWS ze solid QH klisny

QH klisna zbarvení chestnut s hvězdou protáhlou v nosní pruh a s bílou šňupkou na hlavě s tmavými skvrnami nad nozdrami a s bílou skvrnou v pravé nozdře byla připuštěna hřebcem PH zbarvení sorrel/frame overo. Březost a porod proběhly bez komplikací. Narozená klisnička začala do dvou hodin spontánně pít, projevovala se velmi aktivně a zvídavě. Neobvyklé bylo zbarvení hříběte, celé bílé s modrýma očima a také nebyla zaznamenána smolka viz obr.15. Zhruba mezi 12-16 hodinami života začalo hříbě projevovat první příznaky koliky. V rozmezí 24 hodin po porodu mělo hříbě silné bolesti břicha a stále se válelo. Hříbě vykazovalo zrychlený srdeční rytmus i dechovou frekvenci, rektální teplota byla v normě. Peristaltické pohyby byli nepatrné a smolka byla přítomna hluboko v rektu. Byla navržena podpůrná léčba minerálním olejem k uvolnění smolky a byly podány analgetika proti bolesti. Hříbě reagovalo zklidněním, ale příznaky koliky přetrvávaly i do dalšího dne, kdy byla doporučena eutanazie. Od hříběte i od matky byly odebrány krevní vzorky pro potvrzení OLWS. Matka byla stanovena jako heterozygot N/L a hříbě jako homozygot L/L. U hříběte byla také provedena pitva a histologické vyšetření. Hříbě mělo nafouklou břišní dutinu a postrádalo pigmentaci v kůži, kde bylo i málo aktivních chlupových folikulů. Játra a plíce byli naplněné. Kolon byl bez patogeneze až na chybějící ganglia. Malý kolon a rektum vykazovali bledou sliznici, většina trávicího traktu byla naplněná vzduchem. Dutina břišní obsahovala serosanguinální tekutinu, s předpokládaným posmrtným výskytem. 30

Heterozygoti N/L vykazují typický fenotyp, alela má však variabilní expresi a ve vzácných případech, kdy není gen EDNRB vyjádřen může být takoví jedinec typu solid. Nezbytné jsou tedy další studie, které vysvětlí sporadický výskyt letálních hříbat z nestrakatých rodičů. Dva heterozygoti podle klasické Mendlovi genetiky budou produkovat 25% letálních hříbat, záznamy z PK však ukazují na menší produkci. Je tedy pravděpodobné, že hříbata nebyla registrována nebo mohlo jít o embryonální úmrtí. Podle studií je více jak 95% frame overo heterozygotů N/L a méně jak 1% jsou jedinci typu solid (Lightbody, 2002).

Obr. 15 Hříbě s OLWS

3.4.2.3.2 Waandenburg-hirschsprung syndrome

Bowling (1996) popisuje pět genů u myší ovlivňující distribuci pigmentu a nervové prekurzory v embryonálním vývoji derivované z neurální lišty. Geny SPLOTCH (SP) letální strakatost (LS), MICROPHTHALMIA (MI), piebald (S) a dominantní megacolon (DOM). Piebald na chromozomu 14 u myší vytváří podobný fenotyp jako u OLWS, 10% z těchto homozygotů je hluchých a mají také aganglionózu tlustého střeva. Tato mutace u myší vykazuje letalitu ve třech týdnech stáří (Metallinos et al., 1998). Několik těchto mutací je homologní s lidským onemocněním Waardenburgův syndrom i s výše 31

popsanými mutacemi u koní. Komparativní genomika v případě konzervovaných segmentů na DNA slouží pro rychlý vývoj genových map u domestikovaných zvířat. Integrace tohoto přístupu s radiační hybridizací (RH-panely) představuje jednu z přímých způsobů jak získat fyzické a srovnávací mapy. ECA17 u koní je v současné době nejvíc prozkoumaným chromozomem, kde markery jsou distribuované v intervalech 1,4 Mb, zahrnující 75 markerů (56 genů, 19 mikrosatelitů) z nich je 50 specifických genů (Lee et al., 2004). Waardenburgův syndrom (WS) v lidské populaci je onemocnění charakterizované různým stupněm percepční hluchoty, kosterní dysmorfií a abnormalitami v pigmentaci kůže a vlasů. Typické jsou bílé prameny nebo bílé kožní skvrny, nápadně modré nebo heterochromatické duhovky. WS je vzácné autozomálně dominantní onemocnění s výskytem 1/40 000 živě narozených dětí. U 90% pacientů jsou postiženi i rodiče. WS vykazuje variabilní penetraci a několik klinických onemocnění. S WS bylo asociováno šest genů, jenž jsou nezbytné pro normální vývoj melanocytů PAX3, SOX10, MITF, SLUG, EDN3 a EDNRB. Geny EDNRB, EDN3 a SOX10 jsou zahrnuty do skupiny způsobující Waandenburg-hirschsprung syndrome, charakterizovaný navíc absencí ganglií v různě dlouhém úseku gastrointestinálního traktu. Onemocnění se projevuje již krátce po narození střevní neprůchodností s výskytem 1/5000 živě narozených dětí. Před postiženým úsekem střeva, který je zúžen se hromadí stolice a objevuje se zácpa. Může také docházet k zpětnému posunu a následnému zvracení. Břicho bývá na první pohled nafouklé a pohmatově citlivé. Mírnější formy nemoci mohou být diagnostikovány až v pozdějším věku. Pokud u novorozence do 48 hodin neodejde smolka je vyšetřen kolonoskopií či biopsií. Na rozdíl od koní je v tomto případě možná léčba, kdy terapie spočívá v odstranění postiženého úseku střeva a spojení zdravých úseků k sobě. Zákrok je velmi složitý a někdy vyžaduje více operací viz obr.16 (Verloes et al., 1993).

32

Obr. 16 Waandenburg-hirschsprung syndrome

3.4.3 Tovero

Kombinace všech vzorů vykazuje aditivní účinek, čím více alel různých vzorů jedinec nese, tím vykazuje ve fenotypu více bílé nebo je bílý zcela. Takový jedinec je významný v chovném programu, protože produkuje převahu strakatých koní ze solid klisen. Problém však nastává v případě, kdy je kůň heterozygot i pro vzor frame. V takové situaci by měli nechat chovatelé svým koním určit genotyp. Nejideálnější je samozřejmě chovný jedinec s homozygotní sestavou,

ale homozygotnost se u

strakatých vzorů omezuje jen na vzory tobiano, sabino-1 a splashed white MITF

prom1

.

V blízkosti KIT lokusu leží většina vzorů jako tobiano, sabino-1, splashed white a mohou se dědit ve vazbě. Heterozygoti se solid klisnami produkují strakaté jedince s 50% pravděpodobností a heterozygot na dvou lokusech se solid klisnami vykazuje již 75% úspěšnost na strakaté potomky. V závislosti na síle vazby mohou někteří heterozygoti vykazovat téměř 100 % strakatých hříbat (Sponenberg, 2009). Ze spojení tobiano a overo koně se může narodit hříbě, které nese charakteristické znaky od obou vzorů a je označen jako tovero. U takových kombinací je často obtížné rozlišit z fenotypu jednotlivé vzory, z důvodů možného potlačení jednoho z nich. V extrémních případech jsou koně zcela tmaví s bílou hlavou nebo zcela bílí. Vzor tovero lze všeobecně charakterizovat tmavou pigmentací kolem uší, někdy s rozšířením na čelo nebo až k očím s pigmentací kolem huby s rozšiřující se tendencí k žuchvám. 33

Jedno nebo obě oči mohou být modré. Mohou se vyskytovat skvrny na hrudi s rozšířením ke krku, ve slabinách nebo u kořene ocasu různého rozsahu viz obr.17. Jedinci označení jako „medicine hat“ mají pigmentovanou jen krajinu okolo uší viz obr.18. Tito koně mohou být výsledkem homozygotního sabino vzoru, tovero (overo/tobiano ), sabino/overo nebo sabino/tobiano vzorů. Je také pravděpodobné, že na všechny vzory strakatosti působí spolu s vlivem prostředí v prenatálním vývoji několik genů malého účinku, jenž společně ovlivňují množství a rozložení bílé (Sponenberg, 2009).

a) sorrel tovero

b) bay tovero Obr. 17 Vzor tovero

Obr. 18 Maximální projev vzoru tovero (medicine hat)

34

4 MATERIÁL A METODIKA

4.1 Odběr vzorků Analýzy byly prováděny u 133 koní plemene PH, z nichž u 95 byly nejprve odebírány žíně pro izolaci DNA. Vytržený svazek žíní z hřívy nebo ocasu (cca 20 cibulek) byl uložen do plastikového sáčku na zip a uchováván do doby izolace DNA při -20 °C pro další analýzy. U těchto jedinců byl také zaznamenán fenotyp včetně fotografické dokumentace. Zbylé vzorky (38 jedinců) byly dohledány v DNA bance uložené na ÚMFGZ AF MENDELU v Brně. Z celkového počtu 133 koní bylo 71 tobiano, 14 frame overo, 5 frame sabino, 2 sabino, 16 tovero a 25 solid.

4.2 Izolace DNA DNA byla izolována z chlupových cibulek pomocí GeneElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kitu (Sigma). Postup izolace Do 1,5 ml zkumavky byly odstřiženy chlupové cibulky (cca 10) a inkubovány v 180 µl pufru LS-T a 20 µl proteinázy K, při 55 °C do dalšího dne. K lyzátu bylo přidáno 200 µl pufru LS-C, vortexováno 15 s, inkubováno 10 min. při 70 °C. Do kolony ve 2 ml centrifugační zkumavce bylo napipetováno 500 µl pufru CPS, centrifugováno 13000 rpm/1 min. Obsah centrifugační zkumavky vylit. K lyzátu přidáno 200 µl ethanolu (96-100%), vortexováno 5-10 s. Lyzát s ethanolem přepipetován do připravené kolony, centrifugován při 8200 rpm/1 min. Odpad z centrifugační zkumavky vylit a přidáno 500 µl pufru WS, centrifugováno při 8200 rpm/1min. Odpad z centrifugační zkumavky vylit a přidáno 500 µl pufru WS, centrifugováno při 13000 rpm/3min. Odpad z centrifugační zkumavky vylit a dodatečně centrifugováno při 13000 rpm/1min.

35

Kolonka byla přemístěna do sterilní 2 ml zkumavky, připipetováno 100 µl ES pufru, inkubováno 5 min při pokojové teplotě a centrifugováno při 8200 rpm/1min. Získaný izolát byl uchován při -20°C k dalším analýzám (GeneElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit).

Výsledek izolace byl ověřen na 1% agarózovém gelu (60 ml pufr TBE, 0,6 g agarózy) elektroforézou při 120 V. Na gel bylo nanášeno 5 µl markeru M1kb (Gene Ruler DNA ladder Thermo Fisher Scientific, Inc.; Waltham, MA, USA; rozsah fragmentů 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250 bp) a 5 µl každého vzorku izolované DNA, smíchaných s 1 µl nanášecího pufru (40% roztok sacharózy smíchaný s bromfenolovou modří). DNA na gelu byla vizualizována pomocí EtBr za použití UV světla. Shodný způsob vizualizace byl použit u všech dalších analýz.

4.3 Detekce polymorfizmu Ile118Lys genu EDNRB Genotypy polymorfismu Ile118Lys byly detekovány pomocí alelově specifické PCR (AS-PCR) a následně na gelové agarózové elektroforéze. Primery pro amplifikaci byly převzaty z původní práce Santschi et al. (1998), složení reakční směsi a podmínky amplifikace byly optimalizovány pro použité reagencie a termální cykler.

4.3.1 AS-PCR

Primery: přímý primer pro Ile118 (1A): 58-GTTCGTGCTGGGCATCATC-38 Lys118 (2A): 58-GTTCGTGCTGGGCATCAAG-38 zpětný primer pro Ile118 (1B): 58-GTGCAGCAAGTCTCCCAGAG-38 Lys118 (2B): 58-GGGGATGTCAATGATGATGTG-38

Velikost PCR produktu pro alelu Ile118: 118 bp Velikost PCR produktu pro alele Lys118: 136 bp

36

Složení PCR reakční směsi Celkový objem 6,25 µl 4,325 µl H2O 0,625 µl AmpliTaq® 10x PCR Buffer (Life Technologies Corp., Carlsbad, USA) 0,375 µl Mg2+ (MgCl2 25 m/M) 0,125 µl dNTP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) – 10 mM směs nukleotidů 0,125 µl prA (IDT Inc., Coralville, USA) – přímý primer (1A nebo 2A) o koncentraci 10 pmol/µl) 0,125 µl prB (IDT Inc., Coralville, USA) – zpětný primer (1B nebo 2B) o koncentraci 10 pmol/µl) 0,05 µl AmpliTaq Gold Polymerase (Life Technologies Corp., Carlsbad, USA) 0,5 µl denaturované DNA

Teplotní profil AS-PCR reakce: úvodní denaturace 95 °C/5 min. 35 cyklů -

denaturace 95 °C/30 s

-

annealing 56 °C/2 min

-

elongace 72 °C/45 s

závěrečná elongace 72 °C/7 min

Amplifikace probíhala v termálním cykleru Veriti® (Life Technologies Corp., Carlsbad, USA).

PCR produkt byl vizualizován na 2% agarózovém gelu (60 ml pufr TBE, 1,2 g agarózy). Použitý marker Gene Ruler 50 bp DNA ladder; rozsah fragmentů: 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 150, 100, 50 bp; Thermo Fisher Scientific, Inc.; Waltham, MA, USA). PCR primery spolu s reagenciemi vytváří produkt na 136 bp v místě substituce alely Lys118 a v oblasti 118 bp tvoří produkt původní alely Ile118.

37

4.4 STATISTICKÉ VYHODNOCENÍ

4.4.1 Frekvence genotypů a alel

Základní vzorce pro výpočet genetické variability viz tab. 7 a 8 (Urban, 2008).

Tab. 7 Výpočet frekvencí genotypů (Urban, 2008) genotypy

absolutní frekvence

relativní frekvence

AA

D

d=D/N

Aa

H

h=H/N

aa

R

r=R/N

Ʃ

D+H+R=N

d+h+r=1

Tab. 8 Výpočet frekvencí alel (Urban, 2008) alely

absolutní frekvence

relativní frekvence

A

P = 2D + H

p = (2D + H)/2N = P/2N

a

Q = 2R + H

q = (2R + H)/2N = Q/2N

Ʃ

P + Q = 2N

p+q=1

D, H, R = absolutní frekvence genotypů d, h, r = relativní frekvence genotypů P, Q = absolutní frekvence alel p, q = relativní frekvence alel N = absolutní frekvence všech jedinců

38

5 VÝSLEDKY

5.1 Izolace DNA DNA izolována z chlupových cibulek pomocí GeneElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kitu (Sigma) proběhla úspěšně u všech testovaných jedinců viz obr.19.

Obr. 19 Izolace DNA

5.2 Stanovení genotypů polymorfismu Ile118Lys pomocí AS-PCR Izolovaná DNA byla použita pro analýzu polymorfismu Ile118Lys v genu EDNRB, genotypy byly detekovány pomocí metody alelově specifické PCR. Při stanovení podmínek pro amplifikace PCR produktů se vycházelo s způvodní práce Santschi et al. (1998). Podmínky v této práci (složení reakční směsi i teplotní profil amplifikace) se jevili jako optimální i v našich laboratorních podmínkách a jsou uvedeny v kapitole 4.3 Detekce polymorfismu Ile118Lys v genu EDNRB. Výsledky PCR byly ověřovány pomocí elektroforézy, amplifikací vznikaly pouze fragmenty očekávané velikosti, tj. 118 bp pro alelu Ile118 a 136 bp pro alelu Lys118 viz. obr. 20. Amplifikace se úspěšně podařila u všech 133 analyzovaných vzorků. Výsledné genotypy byly dále statisticky vyhodnoceny.

39

Obr. 20 Stanovení genotypů Ile118Lys mutace genu EDNRB AS-PCR

5.3 Statistické vyhodnocení

5.3.1 Frekvence genotypů a alel Ile118Lys mutace genu EDNRB

V tabulce 9 a 10 jsou uvedeny genotypové a alelové četnosti Ile118Lys mutace genu EDNRB, které jsou vypočítány podle vzorců uvedených v kap. 4.4.1. Z vybraného souboru koní byla relativní frekvence alely L stanovena na 0,1015 a relativní frekvence genotypu NL na 0,2030 výskytu v populaci.

Tab. 9 Výpočet frekvencí genotypů Ile118Lys mutace genu EDNRB genotypy

absolutní frekvence

relativní frekvence

LL

0

d=0

NL

27

h=0,2030

NN

106

r=0,7970

Ʃ

0 + 27 + 106 = 133

0 + 0,2030 + 0,7970 = 1

Tab. 10 Výpočet frekvencí alel Ile118Lys mutace genu EDNRB alely

absolutní frekvence

relativní frekvence

L

P = 27

p = 0,1015

N

Q = 239

q = 0,8985

Ʃ

27 + 239 = 266

0,1015+ 0,8985 = 1

40

5.3.2 Absolutní frekvence genotypů vzhledem k fenotypu jedinců

Z tabulky 11 vyplívá, že mutace Ile118Lys genu EDNRB je asociována se vzorem strakatosti frame overo, frame sabino a tovero. U vzorů tobiano, sabino a solid nebyla mutace detekována. Ze souboru 133 koní plemene PH bylo detekováno 27 koní s mutací Ile118Lys genu EDNRB a 106 s původní alelou viz tab.11.

Tab. 11 Absolutní frekvence genotypů vzhledem k fenotypu jedinců vzor strakatosti

počet koní

N/N

N/L

L/L

tobiano

71

71

0

0

frame overo

14

0

14

0

frame sabino

5

0

5

0

sabino

2

2

0

0

tovero

16

8

8

0

solid

25

25

0

0

Ʃ

133

106

27

0

U 23 z 27 koní s mutací Ile118Lys genu EDNRB byl zaznamenán, alespoň jeden rodič fenotypu frame overo. U zbylých 4 jedinců byl vzor frame dohledatelný v původu až u prarodičů, přímí rodiče vykazovali již zbarvení tovero s pravděpodobnou přítomnou mutací Ile118Lys. U 8 jedinců bez frame vzoru s přímým rodičem frame overo nebyla mutace zaznamenána. Z těchto osmi testovaných vzorků, byl jeden kůň fenotypu tovero z rodičů tobiano a frame overo. V takovém případě fenotyp odpovídá

údajnému

křížení, ale mutace Ile118Lys nebyla přítomna. Dominantní alela FrF vykazuje 50% (1:1) dědičnost v případě páření s jedinci, kteří nenesou tuto alelu. Ve vybraném souboru zvířat vykazovala dědičnost alely FrF výrazně odlišný poměr (1:2) viz tab.12.

41

Tab. 12 Vzory strakatosti s přímým předkem frame overo vzor strakatosti

N/N

N/L

L/L

tobiano

2

0

0

frame overo

0

11

0

frame sabino

0

5

0

sabino

1

0

0

tovero

1

7

0

solid

4

0

0

Ʃ (100%)

8 (25,8%)

23 (74,2%)

0

42

6 DISKUZE Bylo testováno 133 koní plemene paint horse. Metodou AS-PCR byla analyzována dinukleotidová substituce kodonu 118 genu EDNRB u 27 koní. U vzoru frame overo a frame sabino byla mutace detekována ve všech případech. Vzor tovero vykazoval mutaci z 50ti%. Výsledky odpovídají genetickému založení dominantní alely FrF i s její asociací se zbarvením frame overo. Při bližším prozkoumání původu těchto jedinců byly však nalezeny nesrovnalosti. Jedna klisna zbarvení tovero z rodičů tobiano a frame overo nenesla dominantní alelu FrF. Je jasné, že kombinací tobiano a frame overo vzorů vznikají jedinci tovero. U všech testovaných koní takového spojení byla mutace detekovaná, až na tento případ. Další zvláštností je testované hříbě tovero s alelou FrF po tobiano hřebci a z matky tovero, u kterých mutace detekována nebyla. V původu matky je zřejmý výskyt frame overo zbarvení. Je tedy otázkou, zdali je AS-PCR spolehlivou

metodou.

Yang

et

al.

(1998)

ve

své

práci

uvádí

možnou

mononukleotidovou mutaci odpovědnou za OLWS, kdy tato mutace nemusí být detekována AS-PCR. V takovém případě doporučuje využít metodu PCR-RFLP, aby se mohla vyloučit možnost špatně určené parentity. Jedinci tovero u kterých mutace nebyla detekovaná, byli z rodičů tobiano nebo tovero vzoru. Nastává tedy další otázka, jakého genotypu jsou tito jedinci pro ostatní vzory strakatosti a jak velký vliv mají tzv. klasické odznaky na rozšíření bílé srsti? V testovaném souboru zvířat jsem nezaznamenala vzory sabino-1 a splashed white. Všichni jedinci byli vzorů tobiano, frame overo, sabino (polygeního založení dosud neznámých genů) a tovero. Jsou tedy tovero koně, kteří nenesou alelu FrF kombinací jiných vzorů? Četnost genotypu NL u koní byla stanovena na 0,2030 a četnost alely L na 0,1015. U koní s přímým předkem frame overo jsem zaznamenala dědičnost sledované alely v poměru 1:2. Takový poměr by byl shodný v případě páření dvou jedinců frame overo. Ve výsledcích, byl však očekáván poměr 1:1, z důvodu známého letálního projevu v případě křížení dvou koní frame a z důvodu nižší frekvence četnosti alely. Z tak malého souboru testovaných zvířat nelze vytvářet jednoznačné závěry, ale každý chovatel plemene paint horse by měl znát tuto problematiku a dva takové jedince spolu vůbec nekřížit.

43

Metallinos et al. (1998) ve sých studiích testovali 138 koní různých plemen, kdy heterozygoty N/L zaznamenali u všech 42 koní frame overo. Z těchto testovaných jedinců bylo u 14-ti koní zaznamenáno hříbě s letálním syndromem. U jednoho koně typu solid plemene paint horse, jednoho s tobiano vzorem a u dvou koní plemene QH. Ve své práci doporučují testovat všechna plemena u kterých se vyskytuje vzor frame overo. Santschi et al. (1998) testovali vzorky 22 hříbat s OLWS a všechny určili jako homozygoty pro LYS118 mutaci. Jejich rodiče bez výjimky jako heterozygoty, kde všichni vykazovali typický vzor frame overo, až na jednu klisnu fenotypu solid. Santschi et al. (1998) ani Metallinos et al. (1998) neuvádí podrobný popis ani fotografie jedinců jiných vzorů a koní solid u kterých byla mutace zaznamenaná. Vrotsos et al. (2001) ve své studii testovali plemena PH, QH, Miniature Horse a A1/1. Všechna hříbata s OLWS byla také homozygotní pro mutaci Ile118Lys genu EDNRB. Heterozygoti N/L se objevily jak u všech vzorů strakatosti (tobiano, sabino, splashed white) tak i u koní solid s bílými odznaky plemene PH i u plemene Miniature Horse, kdy jedinci byli zcela bez odznaků. Takové pozorování naznačuje vliv modifikačních genů v populaci miniaturních koní, který silně potlačuje frame vzor. Dnes již není nutné testovat hříbata s OLWS a typické jedince frame overo, ale koně jiných vzorů, kteří mohou být skrytými přenašeči mutace. Takové studie by mohly odhalit příčinu a vliv dnes neznámých genů, které potlačují frame vzor. Žijící jedinec s dominantní sestavou alel nebyl zaznamenán v žádné studii.

44

7 ZÁVĚR Cílem této práce bylo stanovení genotypů polymorfizmu Ile118Lys v genu EDNRB a vyhodnocení jejich asociace s fenotypem. Jedinci, u kterých byla mutace Lys118 analyzovaná, vykazovali odpovídající fenotyp. U hříběte s alelou FrF nebyla mutace potvrzena u rodičů a jeden kůň zbarvení tovero z páření tobiano a frame overo odpovídal fenotypem, alela FrF však u něho potvrzena nebyla. Případ nové mutace u hříběte je nepravděpodobný, přiklonila bych se k teorii špatně určené parentity nebo k možné mononukleotidové mutaci. Bylo by tedy dobré ověřit spolehlivost metody ASPCR sekvenováním nebo jinou metodou testování tohoto polymorfismu, např. PCRRFLP. Mutaci Ile118Lys genu EDNRB jsem nezaznamenala u jiných vzorů ani u koní solid, na rozdíl od zahraničních studií. Narození hříběte s OLWS ze solid klisny je všeobecně znám. V takovém případě bych se přiklonila k názoru o vlivu dalších genů, které mohou zastřít frame overo vzor. Výskyt mutace u koní jiných vzorů může být spíše způsoben špatně určeným fenotypem. V takovém případě by bylo ideální otestovat rodiče i potomky na jiné vzory strakatosti a dohledat jaká zbarvení má jedinec v původu. Poslední otázkou zůstává jaké genetické založení má jedinec tovero z křížení frame overo a tobiano, když nenese mutaci Ile118Lys genu EDNRB? Je zřejmé, že problematika overo vzorů není zcela objasněna. Bylo by vhodné navrhnout nové studie a zaobírat se jedinci, u kterých je mutace známá, ale nevykazují frame overo vzor.

45

8 SEZNAM POUŽITÉ LITARATURY Allbreedpedigree.com.

[online].

2013.

©2013

[cit.

2013-4-3].

Dostupné

na:

˂www.allbreedpedigree.com˃

American Paint Horse Association. [online]. 2013. ©2013 [cit. 2013-4-3]. Dostupné na: ˂http://www.apha.com/˃

Bowling A.T., 1996. Horse genetics. CABI. USA. 200 s.

Brooks S. A., Terry R. B., Bailey E. 2002. A PCR-RFLP for KIT associated with tobiano spotting pattern in horses. Animal Genetics. 33. 301–303 s.

Brooks S. A., Bailey E. 2005. Exon skipping in the KIT gene causes a Sabino spotting pattern in horses. Mammalian Genome. 16 (11). 893–902 s.

Hauswirth R., Haase B., Blatter M., Brooks S. A., Burger D., et al. 2012. Mutations in MITF and PAX3 Cause „Splashed White“ and Other White Spotting Phenotypes in Horses. PLoS GENET. 8(4).

Chalupová P. 2008. Detekce polymorfizmu genu KIT a jeho vztah ke zbarvení u koní. Diplomová práce (in MS, dep. knihovna MENDELU v Brně). MZLU v Brně. Brno. 108 s.

Jakubec V. 1998. Nové poznatky v dědičnosti barev koní. Náš chov. 9. 47 s.

Lee E. J., Raudsepp T., Kata S. R., Adelson D., Womack J. E., Skow L. C., Chowdhary B. P. 2004. A 1.4-Mb interval RH map of horse chromosome 17 provides detailed comparison with human and mouse homologues. 83(2). 203-15 s.

Lightbody T. Foal with Overo lethal white syndrome born to a registered quarter horse mare. 2002. 43(9). 715-717 s. Mariat D., Taourit S., Guérin G. 2003. A mutation in the MATP gene causes the cream coat colour in the horse. Genet. Sel. Evol. 35. 119–133 s.

46

Metallinos D. L., Bowling A. T., Rine J. 1998. A missense mutation in the endothelin-B receptor gene is asspciated with Lethal White Foal Syndrome: an equine version of Hirschpring Disease. Mammalian Genome. 9. 426-431 s.

Paint Horse Club ČR, o. s. [online]. 2013. © 2009-2012 [cit. 2013-4-3]. Dostupné na: ˂http://www.czpha.cz/˃

Raudsepp T., Kijas J., Godard S., Guérin G., Andersson L., Chowdhary BP. 1999. Comparison of horse chromosome 3 with donkey and human chromosomes by crossspecies painting and heterologous FISH mapping. Mamm Genome. 10(3). 277-82 s. Rawles M. E. 1947. Origin of Pigment Cells from Neural Crest in the Mouse Embryo. Chicago

Journals. Physiologocal

Zoology.

Vol. 20. No. 3. Dostupné na:

˂http://www.jstor.org/discover/10.2307/30151958?uid=3737856&uid=2&uid=4&sid=2 1102033985151˃ Rieder S. 2009. Molecular tests for coat colours in horses. J. Anim. Breed. Genet. 126. 415424 s.

Santschi E. M., Purdy A.K., Valberg S.J., Vrotsos P.D., Kaese H., Mickelson J.R. 1998. Endothelin receptro B polymorphism associated with lethal white foal syndrome in horses. mammalian Genome. 9. 306-309 s.

Sponenberg D. P. 2009. Equine Color Genetics. Wiley-Blackwell. 3. ed. WileyBlackwell. USA. 277 s. Thiruvenkadan A. K., Kandasamy N., Panneerselvam S. 2008. Coat colour inheritance in horses. Livestock Science. 117. 109-129 s.

Urban T. Virtuální svět genetiky 3 – genetika kvantitativních znaků [online]. 2013. © 2008 [cit. 2013-4-3]. Dostupné na: ˂http://user.mendelu.cz/urban/vsg3/pop/popul3b.html˃

47

Verloes A., Elmer C., Lacombe D., Heinrichs C., Rebuffat E., Demarquez L., Moncla A., Adam E. 1993. Ondine-Hirschsprung syndrome (Haddad syndrome). 152. 75-77 s. Dostupné na: ˂http://link.springer.com/article/10.1007/BF02072522˃

Vrotsos P. D., Santschi E. M., Diplomate ACVS, Mickelson J. R. 2001. The Impact of the Mutation Causing Overo Lethal White Syndrome on White Patterning in Horses. Pediatric Medicine. 47. 385-391 s.

Woolf C. M. 1998. Directional and anteroposterior asymmetry of common white markings in the legs of the Arabian horse: response to selection. Kluwer Academic Publishers. 101. 199-208 s.

Woolf C. M. 1993. Does homozygosity contribute to the asymmetry of common white leg markings in the Arabian horse? Kluwer Academic Publishers. 89. 25-33 s.

Yang G. C., Croaker D., Zhang A. L., Manglick P., Cartmill T., Cass D. 1998. A dinucleotide mutation in the endothelin-B receptor gene is associated with lethal white foal syndrome (LWFS); a horse variant of Hirschsprung disease (HSCR). Human Molecular Genetics. Vol. 7, No. 6, 1047–1052 s.

48

9 SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1 Vzor tobiano ˂ http://horse911.com/kb/entry/580/˃ Obr. 2 Minimálně exprimované vzory tobiano a)bay tobiano b)black tobiano; foto: Pavla Chalupová Obr. 3 Maximálně exprimované vzory tobiano a) black tobiano b)black tobiano Obr. 4 Vzor sabino ˂ http://horse911.com/kb/entry/580/ ˃ Obr. 5 Minimálně exprimovaný vzor sabino; foto: Pavla Chalupová Obr. 6 Maximální a minimální projev vzoru frame/sabino Obr. 7 Vzor splashed white ˂ http://horse911.com/kb/entry/580/ ˃ Obr. 8 Minimální projevy vzoru splashed white; (Hauswirth et al., 2012) Obr. 9 Maximální projevy vzoru splashed white; (Hauswirth et al., 2012) Obr. 10 Schéma mutací EDNRB u koní, člověka a myši; (Metallinos et al., 1998) Obr. 11 Dendogram – homologie sekvence aminokyselin EDNRB genu (Yang et al., 1998) Obr. 12 Vzor overo ˂ http://horse911.com/kb/entry/580/ ˃ Obr. 13 Minimální vyjádření frame overo a)black overo b) bay overo foto: Pavla Chalupová Obr. 14 Střední projev frame overo a)black overo b) bay overo Obr. 15 Hříbě s OLWS ˂http://australianheavyhorseforums.createforumhosting.com/could-someoneexplain-olws-terminology-please-t2113.html˃

Obr. 16 Waandenburg-hirschsprung syndrome Obr. 17 Vzor tovero a) tovero b) bay tovero Obr. 18 Maximální projev vzoru tovero Obr. 19 Ověření výsledku izolace Obr. 20 Stanovení genotypů Ile118Lys mutace genu EDNRB AS-PCR

49

10 SEZNAM TABULEK Tab. 1 Interakce Extension a Agouti lokus (Sponenberg, 2009) Tab. 2 Lokusy ovlivňující základní zbarvení koní (Sponenberg, 2009) Tab. 3 Statistická zjištění predikce homozygotnosti tobiano vzoru (Bowling, 1996) Tab. 4 Genotyp vzoru tobiano (Bowling, 1996) Tab. 5 Páření heterozygotů FrFFrf (Bowling, 1996) Tab. 6 Výskyt Ile118Lys mutace genu EDNRB (Vrotsos et al., 2001) Tab. 7 Výpočet frekvencí genotypů (Urban, 2008) Tab. 8 Výpočet frekvencí alel (Urban, 2008) Tab. 9 Výpočet frekvencí genotypů Ile118Lys mutace genu EDNRB Tab. 10 Výpočet frekvencí alel Ile118Lsy mutace genu EDNRB Tab. 11 Absolutní frekvence genotypů vzhledem k fenotypu jedinců Tab. 12 Vzory strakatosti s přímým předkem frame overo

50

11 SEZNAM ZKRATEK A – adenin APH – American Paint Horse APHA – American Paint Horse Association APSHA – American Paint Stock Horse Association APQHA – American Paint Quarter Horse Association AS-PCR – alelově specifická PCR ASIP – agouti signální protein α-MSH – alfa melanocyty stimulující hormon AQH – American Quarter Horse AQHA – American Quarter Horse Assciation A1/1 – anglický plnokrevník bp – páry bazí C – cytosin Cropout – strakatý potomek jednobarevných rodičů ECA – Equus caballus (označuje koňský chromozom) EDNRB – endothelin receptor type B (endothelinový receptor B) G – guanin Gc – Group Specific Component GPCR – G protein coupled receptor kB – kilobase KIT – tyrozin kináza KITLG – KIT ligand L – letální alela LG – linkage group (vazbová skupina) LS – levá strana MATP – membrane associated transporter protein (membránový transportní protein) MC1R – melanocortinový 1 receptor MITF – microphthalmia-associated transcription factor N – negativní pro letální alelu OLWS – Owero lethal white syndrom (syndrom smrtící bílé u hříbat) PAX3 – Paired box 3 51

PCR – polymerase chain reaction (polymerázová řetězová reakce) PH – paint horse PHC – paint horse club PS – pravá strana QH – quarter horse RFLP – restriction fragment length polymorphism (polymorfizmus délky restrikčních fragmentů) RH-panely – radiační hybridní panel rpm – rounds per minute (otáčky za minutu) SNP – single nucleotide polymorphism (jednonukleotidový polymorfizmus) Solid – kůň základního zbarvení (mohou se projevit tzv, klasické odznaky) T – thymin TaqI – polymeráza (termostabilní enzym izolovaný z Thermus aquaticus) TBE – Tris-borátový pufr TRPM1 – transient receptor potential cation channel, subfamily M member 1 (melastatin) WM – white marks (bílé odznaky)

52

PŘÍLOHY

53

SEZNAM PŘÍLOH Příloha I

Zbarvení a vzory 1 Obr. A Sorrel tobiano Obr. B Dun tobiano Obr. C Black tobiano (KM1KM1) Obr. D Black tobiano (KM1KM0) Obr. E Red roan tobiano Obr. F Brown tobiano; foto. Pavla Chalupová Obr. G Bay tobiano; foto: Pavla Chalupoví Obr. H Bay tobiano; foto: Pavla Chalupová

Příloha II

Zbarvení a vzory 2 Obr. A Bay overo; ˂ http://www.bwhr.cz/ ˃ Obr. B. Palomino overo; foto: Michal Havel Obr. C Brown overo Obr. D Black overo Obr. E Bay overo Obr. F Sorrel overo Obr. G Smoky black overo PS; foto: Pavla Chalupová Obr. H Smoky black overo LS; foto: Pavla Chalupová Obr. I Sorrel overo; foto: Pavla Chalupová Obr. J Bay overo; foto: Pavla Chalupová

Příloha III

Zbarvení a vzory 3 Obr. A Sorrel frame sabino Obr. B Sorrel frame sabino

Příloha IV

Zbarvení a vzory 4 Obr. A Sorrel sabino Obr. B Sorrel sabino; foto: Pavla Chalupová

54

Příloha V

Zbarvení a vzory 5 Obr. A Sorrel tovero Obr. B Sorrel tovero Obr. C Bay tovero Obr. D Bay tovero

Příloha VI

Koně solid Obr. A Red dun Obr. B Black Obr. C Palomino Obr. D Brown

Příloha VII

Zbarvení očí Obr. A Částečně modré oko Obr. B Modré oko Obr. C Modré oko Obr. D Tmavé oko Obr. E Částečně modré oko Obr. F Modré oko

Příloha VIII

OLWS Obr. A Matka frame overo;˂ http://rosevalleyranch.blogspot.cz/˃ Obr. B Matka solid s alelou FrF Obr. C Modré oko Obr. D tmavá srst na kořeni ocasu Obr. E Tmavá srst na temeni hlavy Obr. F Žijící bílý kůň, oko tmavě pigmentované, vzor sabino

foto:

˂http://australianheavyhorseforums.createforumhosting.com/could-someone-explain-olws-

terminology-please-t2113.html˃ (Obr.

Příloha IX Příloha X

B, C, D, E, F)

Vzor overo u A1/1; foto: ˂http://www.whitehorseproductions.com/tbcolor3.html ˃ Sekvence genu EDNRB

55

Zbarvení a vzory 1

Obr. A Sorrel tobiano

Obr. B Dun tobiano

Obr. C Black tobiano (KM1KM1)

Obr. D Black tobiano (KM1KM0)

Obr. E Red roan tobiano

Obr. F Brown tobiano

56

Obr. G Bay tobiano

Obr. H Bay tobiano

Zbarvení a vzory 2

Obr. A Bay overo

Obr. B Palomino overo

Obr. C Brown overo

Obr. D Black overo

57

Obr. E Bay overo

Obr. F Sorrel overo

Obr. G Smoky black overo PS

Obr. H Smoky black overo LS

Obr. I Sorrel overo

Obr. J Bay overo

58

Zbarvení a vzory 3

Obr. A Sorrel frame sabino

Obr. B Sorrel frame sabino

Zbarvení a vzory 4

Obr. A Chestnut sabino

Obr. B Sorrel sabino

59

Zbarvení a vzory 5

Obr. A Sorrel tovero

Obr. B Sorrel tovero

Obr. C Bay tovero

Obr. D Bay tovero

Zbarvení a vzory 6

Obr. A Red dun

Obr. B Black

60

Obr. C Palomino

Obr. D Brown

Zbarvení očí

Obr. A Částečně modré oko

Obr. B Modré oko

Obr. C Modré oko

Obr. D Tmavé oko

61

Obr. E Částečně modré oko

Obr. F Modré oko

OLWS

Obr. B Matka solid s alelou FfF

Obr. A Matka frame overo

Obr. C Modré oko (poranění v okolí oka z důvodu válení při bolestech)

62

Obr. D Tmavá srst na kořeni ocasu

Obr. E Tmavá srst na temeni hlavy

63

Obr. F Žijící bílý kůň, oko tmavě pigmentované, vzor sabino

Vzor overo u A 1/1

Obr. A Tri Chrome

Obr. B Blue Eyed Streaker

64

Obr. C Nite Spot

Obr. D Patchy Lassy

Sekvence genu EDNRB - cDNA sekvence aminokyselin koně Ile118Lys mutace genu EDNRB. Umístění sedmi transmembránových domén je podtženo a označeno římskými číslicemi. Pozice oligonukleotidových primerů jsou označeni podtržením. Přístupové číslo sekvence AF03890 (Santschi, 1998).

65

66