A NALÝZA PRŮMYSLOVÝCH VZORKŮ KOMPLEXONŮ POMOCÍ IZOTACHOFORÉZY (ITP) NÁVOD PRO LABORATORNÍ ÚLOHU
1.
ÚVOD Izotachoforéza je elektromigrační analytická metoda a může být definována jako
separace směsi ionogenních látek v roztoku průchodem elektrického proudu na samostatné zóny jednotlivých látek. Principem rozdělení původní homogenní zóny vzorku na jednotlivé zóny jeho složek jsou rozdílné hodnoty pohyblivosti jednotlivých látek. V této úloze bude izotachoforéza využita pro analýzu průmyslových vzorků komplexonů. Průmyslově vyráběná komplexační činidla obsahují jako hlavní složky nitrilotrioctovou kyselinu (NTA) nebo etylendiamintetraoctovou kyselinu (EDTA), resp. jejich sodné soli. Kromě těchto komplexonů však obsahují v malé míře i další látky, především nečistoty z výrobního procesu. Cílem laboratorní úlohy je provedení kvalitativní a kvantitativní analýzy předložených vzorků komplexonů typu A (NTA) a B (EDTA) pomocí izotachoforézy. Dílčím úkolem je výpočet efektivních pohyblivostí jednotlivých analytů dle uvedeného postupu. Podrobnější informace o izotachoforéze nebo o průmyslově vyráběných komplexačních činidlech, zejména jejich složení a vlastnostech, lze najít v doporučené literatuře, která je volně dostupná na internetu. Před začátkem laboratorního cvičení je vhodné se s touto literaturou seznámit.
2.
POMŮCKY A CHEMIKÁLIE
2.1.
CHEMIKÁLIE Chelaton 3, dihydrát, p.a., CAS: 6381-92-6, MR = 372,24, Lachema Brno Nitrilotrioctová kyselina, p.a., CAS 139-13-9, MR = 191,14, Fluka Iminodioctová kyselina, CAS: 142-73-4, MR = 133,10, Sigma Glykolová kyselina, pure, CAS: 79-14-1, MR = 76,05, Park Scientific Limited Octan amonný, p.a., CAS: 631-61-8, MR = 77,08, Lachema Brno Kyselina chlorovodíková, 1 mol l-1, p.a., CAS: 7647-01-0, MR = 36,46, J.T. Baker Octová kyselina, 99 %, p.a., CAS: 64-19-7, MR = 60,05, Lachema Brno Hydroxyetylcelulóza, CAS: 9004-62-0, Fluka Amoniak, 25 %, p.a., CAS: 1336-21-6, MR = 17,03, Penta Chrudim Mravenčí kyselina, MR = 46,03, Penta Chrudim Síran sodný, dekahydrát, MR = 322,19, Lachema Brno
1
2.2.
PŘÍSTROJOVÉ VYBAVENÍ Izotachoforetický analyzátor EA 102 s bezkontaktním vodivostním detektorem,
výrobce Villa Labeco, Spišská Nová Ves, Slovensko, sestavený pro jednokolonovou techniku s kolonou o průměru 300 µm a délce 90 mm a s dávkovacím kohoutem pro injektáž 30 µl vzorku. Řídící a vyhodnocovací software ITP PRO 32, výrobce KasComp, Ltd. Pro nastavení pH elektrolytů lze použít pH-metr pH/ion 510, výrobce Eutech Instruments, Singapore. Přístroj se po každém spuštění justuje kalibračními roztoky o pH 4,01, 7,00 a 10,00. K přípravě standardních roztoků lze použít analytické váhy s odečitatelnou hodnotou 0,0001 g, výrobce Ohaus Pioneer, USA, typ PA114. Váhy je nutné před použitím vždy justovat dle návodu.
3.
PRACOVNÍ POSTUP
3.1.
PŘÍPRAVA ELEKTROLYTŮ VEDOUCÍ ELEKTROLYT (LEADING) • 20 mmol l-1 HCl + GLY-GLY + 0,05 % HEC, pH = 3,10 5000 µl roztoku HCl o koncentraci 1,000 mol l-1 se pipetuje do analyticky čisté kádinky
o objemu 150 ml, ve které je přiměřené množství destilované vody. Kádinka se umístí na magnetickou míchačku a za neustálého míchání a kontroly pH za pomocí pH-metru se po malých dávkách přidává glycilglycin, až do hodnoty pH = 3,10. Nakonec se roztok kvantitativně převede do odměrné baňky o objemu 250 ml, přidá se 12,5 ml 1 % roztoku hydroxyetylcelulosy a doplní se po rysku destilovanou vodou. KONCOVÝ ELEKTROLYT (TERMINATING) • 20 mmol l-1 HAc + NH3, pH = 4,80 286 µl octové kyseliny (99 %, ρ = 1,06 g cm-1) se pipetuje do analyticky čisté kádinky o objemu 150 ml, ve které je přiměřené množství destilované vody. Kádinka se umístí na magnetickou míchačku a za neustálého míchání a kontroly pH za pomocí pH-metru se po velmi malých dávkách přidává zředěný roztok amoniaku, až do hodnoty pH = 4,80. Nakonec se roztok kvantitativně převede do odměrné baňky o objemu 250 ml a doplní se po rysku destilovanou vodou.
3.2.
PŘÍPRAVA STANDARDNÍCH ROZTOKŮ A VZORKŮ Pro účely kvantitativní analýzy se připraví zásobní standardní roztoky analyzovaných
látek o koncentraci 10 mmol l-1, které budou pro konkrétní analýzy dále ředěny na požadovanou koncentraci. Standardní roztoky se připraví do odměrných baněk o objemu 100 ml, přehled navážek jednotlivých látek je uveden v tabulce (viz Tabulka 1). V případě NTA je třeba roztok pro zvýšení rozpustnosti zalkalizovat 6 ml roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 1 mol l-1. Pokud některé ostatní standardní látky budou také špatně rozpustné, lze i k nim přidat přiměřené množství roztoku NaOH. 2
Tabulka 1
Přehled navážek pro přípravu standardních roztoků
Standard
Navážka [g]
Na2EDTA·2H2O
0,3722 0,1911 0,1331 0,0761 0,3222
NTA IDA GLYA Na2SO4·10H2O Standardní
roztok
mravenčí
kyseliny
se
připraví
pipetováním
39
µl
jejího
-1
koncentrovaného roztoku (96 %, ρ = 1,22 g cm ) do odměrné baňky o objemu 100 ml. Zásobní roztok vzorku komplexonů se pro analýzu připraví rozpuštěním 100 µl kapalného vzorku v destilované vodě a doplněním po rysku v odměrné baňce o objemu 10 ml. Vzhledem k tomu, že výsledný obsah jednotlivých komplexonů ve vzorku se uvádí v hmotnostních procentech, je třeba pipetovaný vzorek zvážit na analytických vahách.
3.3.
PRÁCE S PŘÍSTROJEM Obrázek 1 2
Schéma uspořádání izotachoforézy
1: rezervoár koncového elektrolytu; 2: dávkovací kohout; 3: separační kapilára; 4: bezkontaktní vodivostní detektor; 5: nádobka vedoucího elektrolytu; 6: membrána; 7: blok pro plnění systému vedoucím
1
elektrolytem; 8: plnicí ventil. 3
3.3.1.
PŘÍPRAVA PŘÍSTROJE
Izotachoforetický analyzátor se spustí hlavním vypínačem umístěným na zadní straně přístroje. Před aplikací pracovních elektrolytů 4
je
třeba
nejprve
všechny
části
přístroje
promýt
destilovanou vodou, a to následujícím způsobem. Zásobník
vedoucího
elektrolytu
se
několikrát
promyje
destilovanou vodou, která se z něj odsává stříkačkou s nasazenou hadičkou. Je třeba vše důkladně odsát i z prostoru před membránou. 5 6 7
8
Kapilára se propláchne stříkačkou s destilovanou vodou, která se opatrně aplikuje přes plnící ventil. Ventil se povoluje pomalu za stálého tlaku stříkačky, dokud není pozorován průtok kapaliny v odpadní hadičce. Dávkovací kohout při tom musí být v poloze 1 (viz Obrázek 3) a musí v něm být stříkačka s destilovanou vodou. Tlak vyvíjený na stříkačku musí být přiměřený, jinak by mohlo dojít k protržení membrány nebo k poškození kapiláry. Nakonec se destilovanou vodou promyje i zásobník s koncovým elektrolytem tak, že se obsah zásobníku vypouští přes dávkovací ventil, který se otočí do polohy 2 (viz Obrázek 3
3). Je vhodné před tímto krokem nadávkovat destilovanou vodu i místo vzorku – odstraní se tím bublinka, která by jinak bránila odtoku kapaliny ze zásobníku. Nebude-li kapalina sama odtékat, uzavře se zásobník krytem a kapalina se vytlačí vzduchem pomocí stříkačky. Po provedení výše popsaných úkonů je možné naplnit zásobníky příslušnými elektrolyty a zároveň naplnit kapiláru vedoucím elektrolytem stejným způsobem jako při promývání. Před samotným naplněním zásobníků je vhodné propláchnout je malým množstvím elektrolytu.
3.3.2.
NASTAVENÍ SOFTWARE
Obrázek 2
Nastavení parametrů separace v programu ITP PRO 32
Parametry analýzy se nastaví v programu ITP PRO 32 příkazem Method (viz Obrázek
2). Polarita se nastaví na anionty, zvolí se spodní kolona, nejvyšší napěťový limit 15000 V a elektrický proud 100 µA. Maximální doba analýzy se volí dle potřeby, obvykle 20 minut. Pro analýzu je vždy zapnut vodivostní detektor. Stiskem tlačítka STOP lze analýzu po průchodu vzorku detektorem ručně ukončit.
3.3.3.
SPUŠTĚNÍ ANALÝZY
Před první analýzou se kapilára naplní vedoucím elektrolytem, dávkovací kohout je v poloze 1 a zároveň je v něm umístěna stříkačka se vzorkem. Při uzavírání plnícího ventilu musí být soustavně vyvíjen tlak na stříkačku, a to až do chvíle, kdy je ventil úplně uzavřen. Při tom je třeba pozorovat, zda se u něj nevytvořily bublinky vzduchu, které by rušily analýzu. Tento postup se dále provádí vždy po skončení separace nebo před začátkem nové analýzy, pokud došlo k vyjmutí stříkačky se vzorkem.
4
1
2
Obrázek 3
3
Polohy dávkovacího kohoutu
Pro analýzu se ze stříkačky nadávkuje malé množství vzorku (asi 100 µl), přitom je kohout v poloze 1. Po nadávkování přebytečný objem vzorku odteče do odpadní hadičky a kohout se otočí do polohy 2, ve které se ponechá jen několik málo sekund a ze zásobníku odteče trochu koncového elektrolytu. Pak se kohout přepne do polohy 3 a tím je vše připraveno pro separaci. Analýza se spustí tlačítkem REC v programu ITP PRO 32, který je přepnut v módu run, kde jsou již zadány parametry pro analýzu (viz 3.3.2.). Pokud po spuštění analýzy kolísá napětí, pravděpodobně se v kapiláře vyskytuje bublinka vzduchu, v tom případě je třeba proces zastavit a celý postup znovu opakovat.
3.3.4.
UKONČENÍ PRÁCE
Po skončení práce s přístrojem je třeba všechny části promýt destilovanou vodou, stejně jako na začátku (viz 3.3.1.). Všechny zásobníky, kapilára a dávkovací blok se po promytí naplní destilovanou vodou a stříkačky se ponechají připevněné. Po ukončení řídícího software je možné vypnout přístroj.
3.4.
ANALÝZA KOMPLEXONŮ
3.4.1.
KVALITATIVNÍ ANALÝZA
Charakteristickým údajem pro každou látku v daném elektrolytovém systému je relativní výška vlny (RSH, viz Rovnice 1). Porovnáním RSH zóny vzorku a RSH zóny standardní látky lze jednoduše identifikovat neznámou látku. V praxi je však vhodnější, zejména pokud izotachoforegram obsahuje více zón s blízkými hodnotami RSH, přidat přiměřené množství standardní látky přímo k samotnému vzorku. Konkrétní látka se pak zcela jasně přiřadí té zóně, jejíž délka se prodloužila. Rovnice 1
RSH X =
h X − hL hT − hL
[−]
RSH X ...... relativní výška vlny analytu [–] h X ............ výška vlny analytu [V] hL ............. výška vlny vedoucího elektrolytu [V] hT ............. výška vlny koncového elektrolytu [V] 5
3.4.2.
KVANTITATIVNÍ ANALÝZA
Analýza průmyslových vzorků komplexonů se provede po identifikaci jednotlivých zón metodou přídavku standardu. Postup pro přípravu roztoku pro analýzu je následující. Do plastové vialky se pipetuje 100 µl zásobního roztoku vzorku (viz 3.2.) a roztok se doplní na objem 1000 µl přidáním 900 µl destilované vody. Přídavky standardních látek se volí podle očekávané koncentrace analytu vždy podle pravidel metody přídavku standardu. Při jedné analýze lze pro urychlení práce přidávat i více standardních látek. Při přípravě roztoků s přídavkem standardu se postupuje tak, že se pipetuje 100 µl zásobního roztoku vzorku, x µl zásobního roztoku standardní látky (resp. látek) a (900 – x) µl destilované vody.
4.
VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ
4.1.
VYHODNOCENÍ ANALÝZY METODOU PŘÍPRAVKU STANDARDU Při analýze reálných vzorků je vhodnější metodou pro kvantitativní analýzu metoda
přídavku standardu. Princip této metody je stejný jako u metody kalibrační křivky, ovšem v tomto případě se přidávají známé koncentrace standardních látek přímo k analyzovanému vzorku. Tím se předejde možnému rozdílnému chování standardního roztoku a roztoku vzorku, které může být způsobeno např. vlivem matrice vzorku či odlišnou hodnotou pH. Analýza vzorku metodou přídavku standardu se provádí vždy v několika bodech, vhodně zvolených vzhledem k předpokládané koncentraci analytu ve vzorku. Vyhodnocení se provádí v programu MS Excel a z naměřených hodnot se pomocí funkce linregrese vypočtou parametry regresní rovnice a a b. Neznámá koncentrace analytu odpovídá průsečíku regresní přímky s osou x, resp. jeho absolutní hodnotě. Matematicky lze tuto výslednou hodnotu vypočítat dle Rovnice 2. Rovnice 2
x=
−b a
→ c=
−b a
[mmol l ] −1
c .............. koncentrace analytu [mmol l-1] a .............. směrnice přímky [s l mmol-1] b .............. souřadnice y průsečíku přímky s osou y [s] Reálný vzorek je pro analýzu vždy zředěn redestilovanou vodou. Po stanovení látkové koncentrace analytu ve zředěném roztoku metodou přídavku standardu se vypočte procentuální obsah analytu ve vzorku dle Rovnice 3.
6
Rovnice 3
w% =
c ⋅V ⋅ M ⋅ 100 m
[%]
w% ........... procentuální obsah analytu ve vzorku [%]
c .............. koncentrace analytu ve zředěném roztoku [mol l-1] V ............. celkový objem zředěného roztoku [l] M ............ molární hmotnost analytu [g mol-1]
m ............. navážka vzorku [g] 4.1.1.
VÝPOČET NEJISTOT OBSAHU ANALYTŮ VE VZORKU
Metod pro výpočet nejistoty měření existuje několik. V případě vyhodnocení metody kalibrační křivky, resp. metody přídavku standardu, se vychází ze standardních chyb regresních parametrů a a b, které jsou vypočteny funkcí linregrese v programu MS Excel. Celková nejistota výsledku při stanovení koncentrace analytu ve vzorku metodou přídavku standardu je dána součtem jednotlivých příspěvků nejistot dle Rovnice 4. Tyto příspěvky jsou tvořeny standardní chybou dané konstanty a příslušného citlivostního koeficientu, který se vypočítá pomocí parciálních derivací Rovnice 2 (viz Rovnice 5 a Rovnice
6). 2
Rovnice 4
∂c ∂c u (c ) = s a ⋅ + s b ⋅ ∂a ∂b
2
[mmol l ]
u (c) ......... nejistota koncentrace analytu [mmol l-1] s a ............. standardní chyba koeficientu a [s l mmol-1] sb ............. standardní chyba koeficientu b [s]
∂c ........... citlivost na koeficient a [mmol2 s-1 l-2] ∂a ∂c ........... citlivost na koeficient b [mmol s-1 l-1] ∂b
Rovnice 5
∂c b =− 2 ∂a a
[mmol
2
s −1 l − 2
]
∂c ........... citlivost na koeficient a [mmol2 s-1 l-2] ∂a
a .............. směrnice přímky [s l mmol-1] b .............. souřadnice y průsečíku přímky s osou y [s]
7
−1
Rovnice 6
∂c 1 = ∂b a
[mmol s
−1
l −1
]
∂c ........... citlivost na koeficient b [mmol s-1 l-1] ∂b
a .............. směrnice přímky [s l mmol-1] Při výpočtu nejistoty procentuálního obsahu analytu ve vzorku je uvažován pouze příspěvek měřené koncentrace, neboť příspěvky vážení a měření objemu jsou v tomto případě zanedbatelné. Nejistota výsledku je rovna součinu nejistoty koncentrace analytu ve zředěném roztoku a příslušného citlivostního koeficientu (viz Rovnice 8) dle Rovnice 7.
Rovnice 7
∂w u ( w% ) = u (c) ⋅ % ∂c
2
[%]
u ( w% ) ...... nejistota procentuálního obsahu analytu ve vzorku [%] u (c) ......... nejistota koncentrace analytu ve zředěném roztoku [mmol l-1] ∂w% ........ citlivost na koncentraci analytu ve zředěném roztoku [% l mol-1] ∂c Rovnice 8
∂w% V ⋅ M = ⋅ 100 ∂c m
[l mol ] −1
∂w% ........ citlivost na koncentraci analytu ve zředěném roztoku [% l mol-1] ∂c V ............. celkový objem zředěného roztoku [l] M ............ molární hmotnost analytu [g mol-1]
m ............. navážka vzorku [g] Kromě absolutních nejistot lze také prezentovat nejistoty relativní, které možná lépe vypovídají o přesnosti stanovení. Relativní nejistota látkové koncentrace analytu ve zředěném roztoku vzorku se udává v procentech a vypočítá se dle Rovnice 9. Vzhledem k tomu, že v tomto případě vychází výpočet nejistoty procentuálního obsahu analytu ve vzorku pouze z příspěvku látkové koncentrace, jsou relativní nejistoty těchto dvou veličin totožné (viz Rovnice 10). Rovnice 9
u R (c ) =
u (c ) ⋅ 100 c
[%]
u R (c) ....... relativní nejistota koncentrace analytu ve zředěném roztoku [%] u (c) ......... nejistota koncentrace analytu ve zředěném roztoku [mmol l-1]
c .............. koncentrace analytu ve zředěném roztoku [mol l-1] 8
[%]
u R ( w% ) = u R (c)
Rovnice 10
u R ( w% ) .... relativní nejistota procentuálního obsahu analytu ve vzorku [%]
u R (c) ....... relativní nejistota koncentrace analytu ve zředěném roztoku [%] Vypočtená nejistota (viz Rovnice 7) odpovídá intervalu, ve kterém se s asi 67 % pravděpodobností nachází správná hodnota. Pro zahrnutí celého intervalu, který odpovídá skutečnosti s pravděpodobností 95 %, se nejistota násobí koeficientem k, jehož hodnota je v tomto případě 2 (pro 99,7 % pravděpodobnost platí k=3). Získá se tzv. rozšířená nejistota, která se prezentuje spolu s vypočtenou hodnotou a bez níž je výsledek neúplný.
U (c ) = k ⋅ u (c )
Rovnice 11
[mmol l ] −1
U (c) ........ rozšířená nejistota koncentrace analytu ve zředěném roztoku [mmol l-1] u (c) ......... nejistota koncentrace analytu ve zředěném roztoku [mmol l-1] k .............. koeficient rozšíření [–]
4.2.
VÝPOČET EFEKTIVNÍ POHYBLIVOSTI ANALYTŮ Výpočet efektivní pohyblivosti pomocí izotachoforézy vychází z porovnání výšky zóny
analytu a výšek zón standardních látek, jejichž pohyblivost je tabelována. Pro dosažení správného výsledku jsou nezbytné dvě standardní látky (viz Obrázek 4), pohyblivost se vypočítá dle Rovnice 12. Za jednu ze standardních látek je možné považovat vedoucí elektrolyt, potom lze tuto rovnici upravit do tvaru Rovnice 13.
SIGNÁL
TERMINATING
B
X hB A LEADING
hX hA
BASE LINE
ČAS Obrázek 4
Výpočet efektivní pohyblivosti porovnáním výšek zón analytu a standardů 9
Běžnější parametr charakterizující výšku zóny analytu je relativní výška zóny RSH, kterou navíc software vypočítá automaticky pro každou zónu a není třeba její hodnotu ručně odečítat z izotachoforegramu. Výpočet efektivní pohyblivosti lze dosazením z Rovnice 1 do
Rovnice 13 upravit do tvaru Rovnice 14.
µ X = µ A ⋅ µB ⋅
Rovnice 12
1
Rovnice 13
µX 1
Rovnice 14
µ
µX
hB − h A µ A ⋅ (h X − h A ) − µ B ⋅ (h X − hB )
=
1 1 hX ⋅ + − µ L µ B µ L hB
=
1 1 RSH X ⋅ + − µ L µ B µ L RSH B
1
[10
9
1
V s m −2
[10
9
[10
−9
m 2 V −1 s −1
]
]
V s m −2
]
............. efektivní pohyblivost [10-9 m2 V-1 s-1]
h .............. výška zóny [V] RSH ........ relativní výška zóny [–] A, B ......... první a druhá standardní látka s tabelovanou pohyblivostí L .............. vedoucí elektrolyt X ............. stanovovaný analyt Uvedeným způsobem se v této úloze stanoví pohyblivosti NTA, EDTA a IDA za daných podmínek. Jako standardní látky, jejichž pohyblivosti jsou tabelovány, lze zvolit vedoucí chloridové ionty a hydroxyacetátový anion (viz Tabulka 2). Hodnoty µ a pKa chloridových a hydroxyacetátových aniontů
Tabulka 2
µ [10 -
Cl HOCH2COO
-9
2
-1
-1
pKa
m V s ]
79,1 42,4
-2 3,886
Kyselina chlorovodíková je silná kyselina a při pH vedoucího elektrolytu je tedy plně disociovaná. To ovšem neplatí u hydroxyoctové kyseliny, neboť při dané hodnotě pH jsou v roztoku zastoupeny obě její acidobazické formy. Její efektivní pohyblivost za podmínek použitého systému se vypočítá dle Rovnice 15. Rovnice 15
µ pH µ
µ pH = µ ⋅
1 1 + 10 pK A − pH
[10
−9
m 2 V −1 s −1
]
.......... efektivní pohyblivost iontu při dané hodnotě pH [10-9 m2 V-1 s-1]
............. tabelovaná absolutní pohyblivost iontu [10-9 m2 V-1 s-1]
pK a ......... disociační konstanta hydroxyoctové kyseliny 10
pH .......... hodnota pH zóny hydroxyoctové kyseliny Výpočet efektivních pohyblivostí jednotlivých analytů se provede dle Rovnice 14 ze všech hodnot RSH naměřených při analýzách. Jako výsledek se uvede průměr vypočtených hodnot a jeho nejistota se stanoví ze směrodatné odchylky výběru souboru vypočtených efektivních pohyblivostí, uvede se též rozšířená nejistota pro k=2 .
5.
6. 1.
PROTOKOL •
Standardní údaje (jméno, datum...), úvod
•
Stručný postup, v případě odchylky od návodu uvést důvod
•
Naměřená kvalitativní a kvantitativní data přehledně zpracovaná v tabulkách
•
Výsledky vypočtené dle uvedeného postupu vč. grafů, přehledně prezentované
•
Diskuze jednotlivých částí úlohy včetně výsledků, závěr
DOPORUČENÁ LITERATURA Kvasnička, F.: CITP v analýze potravin, dostupné na http://www.vscht.cz/ktk/www_324/lab/cze/cze_itp.pdf
2.
Březina, J.: Elektromigrační techniky v analýze chelatujících činidel, Diplomová práce, Masarykova univerzita, Brno 2010
11
