Příprava vzorků pro proteomickou analýzu

Příprava vzorků pro proteomickou analýzu

1) Úvod 

Proteomické analýzy mohou být naprosto odlišné cíle...    



Detekce změn v mozkové kůře při Alzheimerově chorobě Identifikace plazmatických markerů karcinomu prsu Co stojí za rezistencí 3 kmenů stejné bakterie Jakým mechanismem působí léčivo na nádorové buňky

→ od plánování proteomické analýzy je nutné myslet na povahu vzorků a jejich zpracování

1) Úvod 

Nejdůležitější faktory ovlivňující zpracování vzorků:  

Druh biologického materiálu Cíl vlastní analýzy 



Identifikace, kvantifikace, analýza PTM atd.

Plánované proteomické metody 

Gel-based analýza (metody založené na gelech) 



„Shotgun“ analýza 



Příprava vzorků na separační krok , příprava vzorků na identifikaci Příprava na on-line analýzu LC-MS/MS

MS profilování,...

1) Úvod 

Zpracování vzorků musí zabezpečit:  

Proteiny musí být před analýzou řádně rozpuštěny Proteiny by měly být co nejčistější 



Proteiny by měly zůstat v původním stavu 





→ nutné odstranit interferujících příměsí → zabezpečení ochrany před nežádoucími modifikacemi

Dostatečný výtěžek proteinů

Proteiny v buňkách a tělních tekutinách představují majoritní komponentu (mimo vody) → snadnější příprava a není je nutné specificky izolovat (oproti izolaci nukleových kyselin)

2) Kroky v přípravě vzorků 



A) Proteiny musí být před analýzou rozpuštěny 1) Homogenizace orgánů, tkání 

Metody 

  



Mechanické homogenizátory Rozetření tkáně v kapalném dusíku Homogenizace třepáním s pevnými kuličkami Enzymatická homogenizace

Získáte → buňky, shluky buněk




A) Proteiny musí být před analýzou rozpuštěny 2) Další dezintegrace buněk, shluků buněk 

Metody 

 

Osmotická lýza Ultrazvuk (20–50 kHz) French-press (20,000–30,000 psi nebo 140–210 MPa) 



Obrovský tlakový skok

Získáte → proteiny, komplexy proteinů




A) Proteiny musí být před analýzou rozpuštěny 2) Další dezintegrace buněk, shluků buněk 

Metody 

Opakované zmrazování/rozmrazování 





Tvorba krystalů > dezintegrace buněk

Rozpuštění v detergentech (viz. dále)

Získáte → proteiny, komplexy proteinů




A) Proteiny musí být před analýzou rozpuštěny 3) Extrakce a solubilizace proteinů a jejich komplexů 

Činidla používaná pro extrakci a solubilizaci proteinů: 

Detergenty – jak denaturující tak nedenaturující 



Ionogenní 

Dodecylsulfát sodný – silně denaturující



Deoxycholát sodný – nedenaturující



CHAPS – zwitterion, spíše nedenaturující

Neionogenní 

Triton X100 – nedenaturující






Chaotropní činidla – omezují vodíkové vazby a elektrostatické interakce, jsou denaturující 

Močovina



Guanidin hydrochlorid






Pozor na inkompatibility činidel: 

Nekompatibilní s SDS elektroforézou 



Nekompatibilní s izoelektrickou fokusací 



Ionogenní detergenty, ale ne zwitteriony

Nekompatibilní s enzymatickým štěpením 



Vysoká koncentrace chaotropních činidel

Vysoká koncentrace denaturujících činidel

Nekompatibilní s HPLC separací 

Detergenty nejsou obecně kompatibilní se separacemi na reverzních fázích





Činidla používaná pro přerušení disulfidických můstků 



Redukční činidla 

Dithiothreitol (DTT)



Tris(2-karboxyethyl)fosfin hydrochlorid (TCEP)

-SH modifikační činidla (zabraňují opětovné tvorbě –S-S-) 

Amid kyseliny 2-jodoctové 



O +

Lze kombinovat s DTT i TCEP

Methylmethanthiosulfonát 

Protein

SH

Nelze kombinovat s DTT

Protein

SH

+

I

O NH2

OO S S H3C CH3

Protein

S

Protein

NH2

S

S

CH3




B) Proteiny by měly v co nejčistějším stavu Odstranění interferujících složek biologického materiálu:  

Solí, NK, lipidů, artificiálně přidaných látek Metody 

Dialýza  

Hnací silou je osmóza, membránou proteiny neprochází Prochází jen nízkomolekulární látky - snaží se naředit v okolním prostředí






Gelová chromatografie (filtrace) 

V porézním gelu malé látky penetrují hlouběji a pobývají v něm delší čas než velké molekuly






Ultrafiltrace   

Především v centrifugačním provedení Membrány o dobře definované porozitě 3 kDa, 10 kDa, 50 kDa, 100 kDa atd.






Precipitace proteinů



Snížení rozpustnost proteinů změnou prostředí Přidání organického rozpouštědla - nejčastěji Změny pH (někdy v kombinaci s přidáním org. rozpouštědla) Změna iontové síly - přidání síranu amonného (výjimečně)



Odstředění precipitátu a oddělení supernatantu s nečistotami

  


C) Proteiny by měly zůstat původním stavu 

Ochrana proti proteolýze 

Inhibitory proteáz   



Denaturace 



Denaturované proteiny ztrácí aktivitu

Ochlazení 



EDTA – chelatace iontů nutných pro aktivitu proteáz Fenylmethylsulfonyl flourid – ireverzibilní inhibitor proteáz Leupeptin, pepsation, aprotinin, bestain – inhibitory proteáz

Vždy pracovat „na ledě“

Pozor na inkompatibility činidel: 

Inhibitory proteáz brání zdárný průběh štěpení proteinů


C) Proteiny by měly zůstat původním stavu 

Zabránit defosforylaci 

Inhibitory fosfatáz 



Fluorid sodný, vanadičitan sodný

Zabránit vzniku vedlejších reakcí 

Karbamylace proteinů močovinou za vyšší teploty  

Pracovat s čerstvými roztoky močoviny Vzorky s močovinou zahřívat max. na 37 °C O

O Protein 

NH2

+

H2N

NH2

Protein

NH2

Vedlejší reakce amid kyseliny 2-jodoctové s NH2 skupinami 

Deaktivovat nezreagovaný amid kyseliny 2-jodoctové pomocí DTT


D) Stanovení koncentrace proteinů ve vzorku  



Spektrofotometrické metody 



Stanovení absorbance specifického barevného produktu

Spektrofotometrické metody 



Zjištění výtěžnosti přípravy vzorků Krok je nezbytný pro všechny další analýzy

Stanovení přímé absorbance komponent proteinů

Fluorimetrické metody 

Zatím méně rozšířené




D) Stanovení koncentrace proteinů ve vzorku Spektrofotometrické metody 

Stanovení absorbance specifického barevného produktu 

Metoda dle Bradforda 

Barvivo Coomassie briliantová modř G-250 mění v přítomnosti proteinů zabarvení z červeného na modré s novým abospčním maximem při 595 nm





Stanovení absorbance specifického barevného produktu 

Bicinchoninová metoda (BCA) 

Alkalická redukce měďnatého iontu peptidovými vazbami proteinů na měďný a následná chelatace kys. bicinchoninovou → červené zabarvení





Stanovení přímé absorbance komponent proteinů 





Měření absorbance při 280 nm Vlnová délka, kde absorbují aromatické aminokyseliny → stanovení je citlivé na obsah těchto aminokyselin v proteinu → slouží pro přibližné zjištění koncentrace proteinů Metoda není příliš specifická




D) Stanovení koncentrace proteinů ve vzorku Fluorimetrické metody  



Zatím nejsou příliš rozšířené Obecně jsou citlivější než ostatní Dva principy:  

Fluorofor se váže přímo na protein Fluorofor se váže na detergent navázaný na protein


D) Stanovení koncentrace proteinů ve vzorku 

S různými metodami pro stanovení koncentrace interferuje celá řada látek – vždy ale záleží na jejich koncentraci:

Činidlo EDTA Dithiothreitol (DTT) SDS Guanidine•HCl Močovina

Koncentrace kompatibilní s BCA 10mM 1mM 5.0% 4M 3M

3) Hlavní inkompatibility v proteomických analýzách 

A) Metody založené na gelech 

Hlavní inkompatibility: 

SDS elektroforéza  



Isoelektrická fokusace:  



Všechny látky obsahující primární aminy

Štěpení proteinu v gelu 



Nerozpuštěné, precipitující proteiny Nabité látky (sole, SDS), NK

DIGE značení 



Nekompletní redukce -S-SVysoké koncentrace solí, močoviny

Většinou bez problémů, nutné je ale dobře odstranit barvu

Analýzy vzniklých peptidů pomocí hmotnostní spektrometrie 

Sole, detergenty – záleží na typu ionizace

3) Hlavní inkompatibility v proteomických analýzách


Postup přípravy gelu s proteinem pro identifikaci na MALDI-MS Odbarvovací pufr

Ekvilibrační pufr

Proteáza

 Acetonitril

Odbarvení gelu

Vyříznutí z gelu

Vyrovnání pH na optimum pro proteázu

Voyager Spec #1[BP = 1306.9, 6104] 1306.881

100

Vznik peptidů Extrakce peptidů

6103.5

1709.082

90

1663.141

80 1354.887

70

60

% Intensity



50

MALDI-TOF

1725.074 40

791.423 30

1585.938

3186.818 1712.115 1701.136

20

10

2459.550

1344.872

781.161 765.147

749.151 935.548 717.133 711.144 827.155 785.145 905.192

1309.871 1051.586 1030.198

0 700

1230.313 1181.740

1260

1366.854 1391.931

1728.131 1588.927 1593.906 1744.149 1528.959 1809.125 1532.150 1678.095

3202.846

2268.313 2815.839 2002.415

1820

2138.493 2151.444

2309.385 2345.179

2380 Mass (m/z)

2462.550

3189.750 2624.634 2568.154

2819.506 2851.312 2940

3030.527

3172.889 3244.882 0 3500

Matrice



Postup přípravy proteinů pro DIGE 

Pozor na interference s DIGE značením - založeno na reakci s NH2


B) Metody shotgun proteomiky 

Hlavní inkompatibility: 

Enzymatické štěpení se provádí v roztoku:   

Inhibitory proteas Denaturující činidla (detergenty, chaotropní činidla) Činidla měnící pH mimo optimum pro aktivitu proteolytického enzymu   



Trypsin – pH 7-9 Pepsin – pH 3-5 Asp-N - pH 4-9

Identifikace pomocí hmotnostní spektrometrie 

MALDI-MS 



Přítomnost solí a dalších nečistot ve směsi peptidů

LC-ESI-MS  

Detergenty – dobrou volbou jsou odbouratelné detergenty (pH labilní apod.) Přítomnost solí nevadí pokud je použita C18 separace

3) Hlavní inkompatibility v proteomických analýzách


Postup přípravy roztoku s proteinem pro shotgun analýzu Štěpící pufr

Proteáza

LC/MSMS Proteiny Vznik peptidů P 175 MS0206 19'

09-Nov-2006

Q06-10196

17:54:42

1: TOF MS ES+ BPI 1.93e3

100

%



0 10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00

45.00

50.00

55.00

60.00

65.00

70.00

75.00

80.00

Time 85.00



Kvantifikační metody shotgun proteomiky často zahrnují kovalentní značení peptidů značkami nesoucími těžké izotopy 

 

Např.: iTRAQ, ICAT, reduktivní dimethylace formaldehydem apod.

Tyto metody přinášejí přísnější požadavky na čistotu vzorku Nejsnadnější metoda pro přečištění peptidů 

C18 nebo SCX Solid Phase Extraction (SPE)

Instrumentace pro elektroforézu

Softwarové hodnocení 2D gelů http://www.nonlinear.com/products/progenesis/samespots/ analysis-workflow/video-demo/

Příprava vzorků pro proteomickou analýzu

Recommend Documents