Přínos stanovení DNA C. pneumoniae, C. trachomatis a M. pneumoniae amplifikačními metodami Marian Luhový
Laboratoře Mikrochem a.s.
Analytický přístup Komponenty
Přímý průkaz
DNA
morfologie biochemie růstové vlastnosti …
RNA
Antigeny
Nepřímý průkaz Protilátky
Kompletní mikroorganismus
Diagnostické metody Chlamydia/Mycoplasma Metoda
Specifikace
Materiál Citlivost Původce
McCoy, HeLa
výtěr
50-80%
C. trachomatis, pneumoniae
PPLO půda
výtěr, sputum
pod 60%
M. pneumoniae rutinně se neprovádí
ELISA výtěr (Imunochromat.)
50-80%
Chlamydia , Mycoplasma
MIF
výtěr
50-80%
Chlamydia, Mycoplasma
NAT
bez amplifikace
výtěr
NAAT
s amplifikací (PCR…)
výtěr, sputum, moč, punktát
Přímý průkaz Kultivace
Detekce antigenu
Chlamydia + Neisseria 80-99%
Chlamydia, Mycoplasma
Diagnostické metody Chlamydia/Mycoplasma
Metoda
Specifikace
Materiál Citlivost
Původce
Nepřímý průkaz – sérologické metody Rodově specifické LPS, HSP
ELISA – IgG, IgA, IgM
sérum
Interpretace?
Chlamydia , Mycoplasma
Druhově specifické MOMP
ELISA – IgG, IgA, IgM
sérum
Interpretace?
C. trachomatis, pneumoniae, M. pneumoniae
Specifické antigeny kombinace
W. Blot – IgG, IgA
sérum
Chlamydia , Mycoplasma
Vývojový cyklus chlamydií
A: EB - elementární tělísko (metabolicky neaktivní, vstupuje fagocytózou či endocytózou) B: Endozom - vakuola, kterou EB vstoupilo do buňky (fagosom) Inkluze - přestavba membrány endozomu pro ochranu proti fúzi s lysozomy a destrukci RB – retikulární tělísko (metabolicky vysoce aktivní ) C: T3SS sekretorní systém (injektisom) - sekrece efektorových bílkovin do cytoplasmy, ovlivnění signálových drah (blokace apoptózy - podněty proapoptotických stimulů) G: výstup EB z napadené buňky lýzou (zánikem) nebo exocytózou F1000Prime Rep. 2014; 6: 120.
Chlamydiová inkluze (IF a EM zobrazení)
Infection and Immunity, 68, 2000, 360-367
Vývojový cyklus chlamydií v nepříznivých podmínkách – perzistence Perzistence je navozená řadou exogenních a endogenních faktorů a po odstranění spouštěcího vlivu je zpravidla reverzibilní. Induktory perzistence Antibiotiky navozená: penicilin, ampicilin, chloramfenikol, kyselina nalidixová, sulfonamidy Imunologicky navozená: INF-gama (produkují T-helper buňky)obrana proti intracelulárním infekcím Indukovaná deficitem: železo, aminokyseliny
Vývojový cyklus chlamydií s odvětvením na aberantní formu RB EB elementární tělísko
ab-RB aberantní retikulární tělísko
RB retikulární tělísko
Y.M. AbdelRahman, R.J. Belland / FEMS Microbiology Reviews 29 (2005) 949–959
Perzistence chlamydií (in vitro, EM snímky)
KONTROLA
7000 X
PERZISTENCE
7000 X - velké inkluze se zvětšenými aberantními RB - RB se nedělí a nedozrávají do formy EB - je přítomná rozdílná sestava proteinů
Inhibice vývoje Chlamydií interferonem gama
Doporučená terapie infekcí Chlamydia trachomatis ATB
Dávka/den délka léčby dospělý
Doxycyklin
2x 100mg
7-10 dní
Azitromycin
1x 1000mg
1-denní, 3-denní, prolongovaně (1x týdně 3-6 týdnů)
Erytromycin
4x 500mg
7-10 dní
Roxitromycin
2x 150mg
7-14 dní
Klaritromycin
2x 500mg
7-14 dní
Ofloxacin
2x 200mg
10-14 dní
Ciprofloxacin
2x 500mg
10-14 dní, prolongovaně (1x 500mg 3-6 týdnů + aztromycin)
Spiramycin
2-3 x 3x106 IU
7-10 dní
Erytromycin
4x 500mg
7-10 dní
Amoxycilin
3x 500mg
14 dní
Azitromycin
1x 1000mg
Od II. trim., 1 denní, 3-denní: 1x 500mg
GRAVIDITA
Zranitelnost forem chlamydií během cyklu Neaktivní Narušení b. stěny NALC?
Velmi snížená aktivita metronidazol
Aktivní ATB
Tropismus a klinické projevy chlamydií Druh
Sérotyp Lokalizace
Akutní infekce
Následné komplikace
C. trachomatis
A-C
spojivky
konjunktivitida
slepota
C. trachomatis
D-K
anogenitální sliznice, uretra, cervix, rektum
konjunktivitida a pneumonie novorozenců uretritida, epididymitida, prostatitida, cervicitida, endometritida, salpingitida, akutní perihepatitida
záněty pánevního dna tubární neplodnost karcinomy? ateroskleróza astma reaktivní artritida
C. trachomatis
L1,2,2a,3
genitální sliznice, lymfocyty, monocyty
gen. ulcerace, lymfadenopatie
lymfogranuloma venerum
C. pneumoniae
respirační epitel
Infekce HCD a DCD, pneumonie
? asociace s kardiovaskulárními nemocemi (ateroskleróza) astma neurologické nemoci (roztroušená skleróza, Alzheimerova nemoc)
C. psittaci
respirace, systém
pneumonie
hepatitida
Odpovídající vzorek: metoda amplifikační (RT-PCR)
patogen: Chlamydia trachomatis Vzorek, lokalita
Výpovědní Poznámky hodnota
stěr (děložní čípek)
vysoká
vysoká citlivost, snížená vypovídací schopnost při migraci infekce (vejcovody…)
stěr (uretra)
vysoká
vysoká citlivost
výtěr vysoká (spojivkový vak)
vysoká citlivost
moč
variabilní
vysoká u mužů při správně provedeném odběru, méně vhodná u žen
ejakulát
vysoká
hledání lokalizace
punktát, výpotek
variabilní
vysoká v případě správné lokalizace
Odpovídající vzorek: metoda amplifikační (RT-PCR)
patogen: Chlamydia pneumoniae Vzorek, lokalita
Výpovědní hodnota
nazofaryngeální výtěr
vysoká
BAL, sputum, tracheální aspirát, bronchiální sekret, pleurální výpotek
vysoká
biopsie
variabilní
Poznámky
vysoká v případě správné lokalizace
Odpovídající vzorek: metoda amplifikační (RT-PCR)
patogen: Mycoplasma pneumoniae Vzorek, lokalita
Výpovědní hodnota
nazofaryngeální výtěr
vysoká
BAL, sputum, tracheální aspirát, bronchiální sekret, pleurální výpotek
vysoká
Poznámky
PCR – polymerázová řetězová reakce Krok 1: denaturace Čas: 30s t: 95 oC
Krok 2: nasedání Čas: 30s t: 60 oC
Krok 3: prodlužování Čas: 60s t: 72 oC
Výsledkem kopírování úseku DNA vymezeného primery je značný nárůst počtu kopií odpovídající ohraničené oblasti původní DNA molekuly 4. cyklus
vymezený úsek 3. cyklus
Exponenciální amplifikace
2. cyklus
templátová DNA
35. cyklus
1. cyklus
22 = 4 kopie
23 = 8 kopií
16 kopií
32 kopií
236 = 68 biliónů kopií
Výsledkem procesu RT-PCR je rovněž kopírování úseku DNA vymezeného primery navíc s ekvivalentním nárůstem počtu fluorescenčních molekul 4. cyklus
vymezený úsek 3. cyklus
Exponenciální amplifikace
2. cyklus
templátová DNA
35. cyklus
1. cyklus
22 = 4 kopie
23 = 8 kopií
16 kopií
32 kopií
236 = 68 biliónů kopií
Grafický výstup: fluorescence = f (cyklů) Fluorescence
Opakovatelnost – zkušený operátor
Threshold
Počet cyklů
RT-PCR cyklér (Rotorgene 6000)
Činnost: manipulace se vzorkem, zpracování vzorku Zařízení/postup: laminární box Cíl: ochrana pracovníka před mikroorganismem, omezení kontaminace (mezivzorkové, z pracovníka)
Činnost: manipulace se vzorkem, zpracování vzorku Zařízení/postup: mikrocentrifuga Cíl: centrifugací před každým otevřením nádobky zabránit kontaminaci z víčka (mezivzorková)
Činnost: záznamy o manipulaci se vzorkem, řazení, průběh Zařízení/postup: evidence Cíl: zpětná kontrola úrovně rizika, omezení vydání falešně pozitivního nálezu (mezivzorková kontaminace)
OK
Činnost: záznamy o manipulaci se vzorkem, řazení, průběh Zařízení/postup: evidence Cíl: zpětná kontrola úrovně rizika, omezení vydání falešně pozitivního nálezu (mezivzorková kontaminace)
OK
Činnost: záznamy o manipulaci se vzorkem, řazení, průběh Zařízení/postup: evidence Cíl: zpětná kontrola úrovně rizika, omezení vydání falešně pozitivního nálezu (mezivzorková kontaminace)
!!!
Činnost: manipulace se vzorkem, zpracování vzorku Zařízení/postup: odměřování objemu, přesun alikvotu Cíl: ochrana mikropipety před kontaminací aerosolem, omezení kontaminace (mezivzorkové)
Činnost: dekontaminace povrchů od DNA a RNA Zařízení/postup: působení aktivních přípravků (SAVO) Cíl: ochrana pracovníka před mikroorganismem, omezení kontaminace obecně (mezivzorkové, z pracovníka, z jiných zdrojů)
Činnost: dekontaminace prostředí od DNA a RNA Zařízení/postup: UV lampy Cíl: ochrana pracovníka před mikroorganismem, omezení kontaminace obecně (mezivzorkové, z pracovníka, z jiných zdrojů)
Činnost: příprava čistých komponent do PCR Zařízení/postup: DNA stanice - box Cíl: omezení kontaminace (obecně z prostředí)
Činnost: dekontaminace DNA stanice k práci Zařízení/postup: UV lampy DNA stanice - box Cíl: omezení kontaminace (obecně z prostředí)
Správný vzorek pro amplifikační metody? Aby amplifikační DNA/RNA metody poskytovaly správné a odpovídající kvalitativní a kvantitativní údaje, je nutné respektovat podstatu těchto metod. PCR a RT-PCR jsou metodami přímého průkazu přítomnosti genetického materiálu (DNA či RNA).
Odpovídající správný vzorek (odběrový materiál) je tedy takový, kde lze očekávat výskyt mikroorganismu případně jeho DNA-RNA (i částečně fragmentované).
Porovnání přínosu typu vyšetření pro stanovení patogena PCR (amplifikace NK)
Serologie
Přímý průkaz (kvalita odběru !)
Nepřímý průkaz (kvalita vyjádření imunitní reakce !)
Nezávislost na dynamice imunitní odpovědi
Závislý na dynamice hladiny tříd protilátek
Vysoká citlivost a specifita
V kombinaci s WB (konfirmace) vysoká specifita
Optimální pro akutní infekce (vysoké množství patogena v primárním ložisku)
V časné fázi primární infekce teprve počátek změny hladiny protilátek - 2 odběry pro sledování dynamiky
Nebezpečí falešné pozitivity při nedodržení zásad odběru a práce se vzorkem pro amplifikační metody
Nebezpečí hrozí pouze při záměně vzorku
Reinfekce - reaktivace je snáze zachytitelná (primární ložisko)
Dynamika protilátek nemusí být výrazně vyjádřena
