Příloha I Provedení testu akutní toxicity se světélkujícími bakteriemi Vibrio fischeri metodou Flash (Standardní operační procedura – RECETOX)
Provedení testu akutní toxicity se světélkujícími bakteriemi Vibrio fischeri metodou Flash STANDARDNÍ OPERAČNÍ PROCEDURA
Název Provedení testu akutní toxicity se světélkujícími bakteriemi Vibrio fischeri metodou Flash (Luminescent bacteria flash test). Cíl Zavedení metodiky mikrodestičkového testu Flash pro interní potřeby laboratoří Výzkumného centra pro chemii životního prostředí a ekotoxikologii (RECETOX). Shrnutí Tato SOP navrhuje způsob provedení modifikovaného testu akutní toxicity s lyofilizovanými bakteriemi Vibrio fischeri se zřetelem k normě ČSN EN ISO 11348-3 Jakost vod – Stanovení inhibičního účinku vzorků vod na světelnou emisi Vibrio fischeri (Zkouška na luminiscenčních bakteriích) – Část 3: Metoda s lyofilizovanými bakteriemi. Procedura je primárně určena pro orientační zhodnocení toxického potenciálu barevných a zakalených vodných vzorků. Inhibice světelné emise Vibrio fischeri se stanovuje po 30s přímém kontaktu se vzorkem a toxický potenciál je odhadnut na základě výpočtu 50% efektivní koncentrace (EC50). Instrumentální vybavení Mrazák Lednička
Zkumavky 10 ml Stojan na zkumavky Mikrozkumavky Pipety mechanické Lázeň vodní termost. Třepačka
pro uskladnění lyofilizovaných bakterií při teplotě -18 °C až -20 °C. pro teplotní stabilizaci rekonstitučního roztoku (2% hm. NaCl) a pro uchovávání rehydratovaných bakterií v ledové lázni při teplotě 3 °C ± 3 °C. pro přípravu bakteriální suspenze, možno nesterilní. pro uchování zkumavek se stabilizující se bakteriální suspenzí ve vodní lázni při teplotě 15 °C ± 1 °C. 1,5 ml, s úzávěrem, nesterilní (EPPENDORF). 20–200 μl, 100–1000 μl. pro stabilizaci roztoků při teplotě 15 °C ± 1 °C. model MS2 Minishaker IKA pro třepání vzorků v mikrozkumavkách (IKA Werke GmbH, Staufen, Německo).
I
Mikrodestičkový test Flash
Mikrodestičky bílé
96jamkové, pro měření bakteriální luminiscence (Nunc, Roskilde, Dánsko). mikrodestičkový s dávkovačem, např. model LuminoSkan Ascent (Thermo LabSystems Oy, Helsinki, Finsko). např. model pH 526 s kombinovanou elektrodou s teplotním senzorem SenTix 41 (WTW, Weilheim Německo)
Luminometr pH-metr
Činidla Pro test se použijí standardní chemikálie definované kvality a destilovaná voda, příp. jinak upravená voda v odpovídající čistotě. Ředicí roztok a kontrola Roztoky pro úpravu pH vzorků Referenční toxikant
roztok chloridu sodného (20 g/l) ve vodě, s pH upraveným na hodnotu 7±0,2. roztok hydroxidu sodného c(NaOH) = 1 mol/l; roztok kyseliny chlorovodíkové c(HCl) = 1 mol/l. roztok dichromanu draselného (400 mg/l – odpovídá přibližně očekávané hodnoty EC50)
Příprava vzorků Pro test se použijí pevné vzorky s velikostí částic < 2 mm. Ke 100 mg sušiny sedimentu v polypropylenové mikrozkumavce (EPPENDORF) s víčkem se přidává 1 ml ředicího roztoku (2% hm. NaCl). Vzniklá suspenze se mixuje po dobu 5 min a uchovává při laboratorní teplotě. Před samotným měřením se doporučuje případně upravit pH vzorků na hodnotu 6–8, použitím 1M roztoku NaOH resp. 1M roztoku HCl. Z takto připravené „zásobní“ suspenze (100 mgsuš./ml) se ředěním vytvoří koncentrační řada vzorku podle schématu (obr. 1). Odebíraný podíl suspenze vzorku (ml)
0,5
100
0,5
50
0,5
25
0,5
12,5
0,5
6,25
0,5
3,13
0,5
1,56
0,5
0,78
0,39
Výsledná koncentrace (mgsuš./ml)
Obr. 1 Příprava koncentrační řady vzorku při testu Flash. Z homogenizované suspenze 100 mgsuš. vzorku v 1 ml 2% hm. NaCl se odebere 0,5 ml a přidá k 0,5 ml 2% hm. NaCl v sousední mikrozkumavce. Celý proces se několikrát opakuje
II
Standardní operační procedura (květen 2008)
Před pipetováním do bílé mikrodestičky se předpřipravené vzorky v mikrozkumavkách znovu krátce promíchají tak, aby bylo dosaženo maximální homogenity vzorku. Do předem definovaných jamek mikrodestičky se pipetuje 80 μl vzorku (plastové špičky pipet se na konci zastřihují, aby bylo možné odebrat požadovaný objem vzorku). Pipetování do mikrodestičky se řídí následujícími pravidly: •
vzorky se pipetují v duplikátech (obecně multiplikátech) umístěných vždy bezprostředně vedle sebe;
•
v každém řádku (A–H) mikrodestičky musí být alespoň jeden duplikát negativní kontroly (2% hm. NaCl);
•
ke každé koncentrační řadě vzorku musí být přiřazen alespoň jeden duplikát pozitivní kontroly (roztok K2Cr2O7 o koncentraci 400 mg/l).
Doporučené umístění vzorků v mikrodestičce schematicky shrnuje obr. 2.
A B C D E F G H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
C1 C6 C1 C6 C1 NK NK
C1 C6 C1 C6 C1 NK NK
C2 C7 C2 C7 NK C6
C2 C7 C2 C7 NK C6
C3 C8 C3 NK C2 C7
C3 C8 C3 NK C2 C7
C4 C9 NK C8 C3 C8
C4 C9 NK C8 C3 C8
C5 NK C4 C9 C4 C9
C5 NK C4 C9 C4 C9
11 NK NK PK C5 PK C5 PK
12 NK NK PK C5 PK C5 PK
vz. 1 vz. 2 vz. 3
Obr. 2 Příklad rozmístění vzorků v mikrodestičce při provádění testu Flash (NK – negativní kontrola, PK – pozitivní kontrola, Cn – příslušná koncentrace sedimentu ve vzorku, kde n ≥ 0)
Takto připravená mikrodestička se nechá 30 min temperovat ve vodní lázni při teplotě 15 °C ± 1 °C. Příprava bakteriální suspenze Lyofilizované bakterie Vibrio fischeri NRRL B-11177 jsou dostupné v ampulkovém formátu (lahvička EHK). Příprava bakteriální suspenze, používané pro test Flash, probíhá ve dvou krocích: •
rehydratace (rekonstituce) bakterií – přidáním 0,5 ml vychlazeného (4°C) 2% hm. NaCl do lahvičky EHK, provzdušnění pipetou (vzniklý bakteriální koncentrát se ponechá nejméně 15 min v ledové lázni v lednici);
•
příprava bakteriální suspenze pro test – odběr 150 ml rehydratovaných bakterií z koncentrátu do 5 ml vychlazeného 2% hm. NaCl.
Připravená bakteriální suspenze se nechá 30 min temperovat ve vodní lázni při teplotě 15 °C ± 1 °C.
III
Mikrodestičkový test Flash
Příprava luminometru K měření se používá mikrodestičkový luminometr LuminoSkan Ascent, který je umístěn v jedné z klimatizovaných laboratoří RECETOX. Chystáme-li se provádět test déle než 10 min, je žádoucí místnost (a tím i luminometr) předem vychladit na 15 °C ± 1 °C (trvá přibližně 4 hod.). Luminometr je vybaven dvěma dávkovači, z nichž se pro test standardně použije dávkovač 1 . Ten se kvůli vyčištění nejprve propláchne destilovanou vodou (přidržením tlačítka PRIME–EMPTY, popř. s využitím ekvivalentního příkazu v obsluhujícím programu). Následuje propláchnutí roztokem 2% hm. NaCl. Poté se do celého objemu dávkovače vpraví připravená bakteriální suspenze. Takto přichystaný dávkovač se zasune do zdířky M . Zkumavka s bakteriální suspenzí je po celou dobu testu umístěna v kádince s vodou o teplotě 15 °C ± 1 °C uvnitř luminometru. Příprava programu a měření luminiscence Programové vybavení je realizováno systémem Ascent Software (verze 2.6). Protokol pro test Flash je přednastaven v souboru FLASHX1.SEL . Nastavení parametrů na jednotlivých záložkách aplikace je zobrazeno na obr. 3. Na záložce General je třeba upřesnit oblast měření (Area definition). Po vložení mikrodestičky se vzorky probíhá vlastní měření kinetiky luminiscence v každé jamce jako celek ve třech bezprostředně navazujících krocích: •
nástřik vzorku a měření bioluminiscence v čase 0–2 s – na záložce Dispense and Measure nastaven objem vstřikované bakteriální suspenze na 20 μl, měření probíhá v módu Monitor, s integračním časem 40 ms, celkem 32× (obr. 3A);
•
promíchávání vzorku – na záložce Shake nastaven celkový čas promíchávání na 25 s (obr. 3B);
•
měření inhibice luminiscence v čase 29–31 s – na záložce Measurement nastaven mód měření Monitor, integrační čas 40 ms, počet měření 34 (obr. 3C).
Celá procedura se inicializuje příkazem START a je plně automatizovaná, nevyžadující další dodatečnou obsluhu. Vyhodnocení testu Po ukončení měření aplikační software Asent 2.6 automaticky nabídne tabulku s výsledky na záložce Results. Výsledky jsou seřazeny na dvou kartách: karta DispenseandMeasure1 se vztahuje k měření iniciální fáze (0–2 s), karta Measure1 zachycuje výsledky měření ve finální fázi experimentu (29–30 s). Tyto honoty je třeba obvyklým způsobem vykopírovat do vhodného tabulkového editoru, kde probíhá vlastní vyhodnocení (kalkulace) výsledků.
IV
Standardní operační procedura (květen 2008)
Obr. 3 Příklad nastavení obecných parametrů v programu Ascent Software (version 2.6) před zahájením testu Flash (A – kontrola nástřiku bakteriální suspenze a měření počáteční fáze; B – kontrola třepání vzorku; C – kontrola měření v závěrečné fázi experimentu)
V
Mikrodestičkový test Flash
Výpočet inhibice bakteriální luminiscence Z naměřených, chronologicky uspořádaných hodnot intenzity bakteriální luminiscence (vyjádřena jako RLU) je spočtena maximální intenzita světelné emise (SMAX) jako: S MAX
1 i = 24 = ∑ Si ; 17 i =8
kde Si je intenzita bioluminiscence v i-tém měření od zahájení iniciální fáze měření (krok Dispense and Measure). Podobně se počítá intezita bakteriální světelné emise v čase 30 s od zahájení měření (S30 s) jako: S 30 s =
1 i =10 ∑ Si ; 17 i = 27
kde Si je intenzita bioluminiscence v i-tém měření od zahájení závěrečné fáze měření (krok Measure). Procentuální inhibice bioluminiscence (INH%) se pro každý testovaný vzorek odvozuje z příslušných hodnot SMAX a S30s podle vztahu:
INH % = 100 −
S 30 s ⋅ 100; KF ⋅ S MAX
kde parametr KF označuje tzv. korekční faktor, definovaný vztahem:
KF =
S 30 s ( NK ) ; S MAX ( NK )
kde SMAX(NK) a S30s(NK) jsou příslušné hodnoty zjištěné v odpovídájící negativní kontrole (2% hm. roztoku NaCl). Odvození parametru EC50 Odvození 50% efektivní koncentrace (EC50) se provádí standardním způsobem (např. s využitím softwaru GraphPad Prism 4.0 for Windows). Používá se obvykle 9 vzorků, ředicí faktor je 1:1. Validační kritéria Výsledky testu lze považovat za platné, jestliže: •
intenzita bakteriální luminiscence v bodě SMAX, vyjádřená v relativních jednotkách luminiscence (RLU), je větší než 0,2;
•
průměrný korekční faktor (KF) > 0,8;
VI
Standardní operační procedura (květen 2008)
•
hodnoty inhibice v jednotlivých duplikátech se od sebe neliší o více než 5 % u negativních kontrol, nebo více než 20 % u vzorků;
•
referenční toxikant (K2Cr2O7) způsobuje inhibici 20–80 % při koncentraci 380 mg/l.
Všechny tyto podmínky musí být splněny současně. Závěrečná poznámka Tento materiál vznikl pro interní potřebu laboratoří RECETOX. Vychází ze specifických podmínek tohoto prostředí a je pro toto prostředí optimalizovaný. Zároveň však existuje v každém kroku několik variantních přístupů, které ponechávají možnost popsaný test Flash dále přizpůsobovat a upravovat. Bližší informace Tomáš Čáp
[email protected]
V Brně, květen 2008
VII
