PhD TÉZISEK. Dr. Talabér Gergely. PTE KK Immunológiai és Biotechnológiai Intézet. Témavezetők: Dr. Boldizsár Ferenc, Dr

PhD TÉZISEK A glukokortikoid hormon indukálta thymocyta apoptózis mechanizmusának vizsgálata: A mitokondriális glukokortikoid receptor transzlokáció és a thymus epithelsejtek szerepe

Dr. Talabér Gergely

PTE KK Immunológiai és Biotechnológiai Intézet Témavezetők: Dr. Boldizsár Ferenc, Dr. Berki Timea Programvezető: Prof. Dr. Németh Péter A Doktori Iskola vezetője: Prof. Dr. Lénárd László

Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Pécs

2010

TARTALOMJEGYZÉK

1. Rövidítések jegyzéke

4

2. Bevezetés

6

2.1. A glukokortikoid hormonok általános- és immunrendszerre kifejtett hatásai 2.2. A glukokortikoid receptor 2.3. A glukokortikoid receptor jelátviteli útvonalak áttekintése 2.3.1. Genomikus hatások 2.3.2. Nem-genomikus hatások 2.3.2.1. Direkt membrán hatás 2.3.2.2. Membrán GR 2.3.2.3. A GR citoplazmatikus interakciója más fehérjékkel 2.3.2.4. A GR mitokondriális transzlokációja 2.4. A T-sejtek és szerepük az immunhomeosztázis fenntartásában 2.5. A thymus fejlődése és sejtes összetevői 2.5.1. A thymus epithelialis sejtek és a cortex-medulla kompartmentalizáció 2.5.2. A T-sejtek érése és szelekciója a thymusban 2.5.2.1. A T-sejt fejlődés korai szakaszai 2.5.2.2. A szelekciós folyamatok (A T-sejt fejlődés késői szakasza) 2.5.2.3. A thymocyta szelekció affinitásmodellje 2.6. A GC-k hatása T-sejteken és a thymusban

6 7 8 8 9 9 9 10 10 12 13 14 15 16 18 20 21

3. Célkitűzések

24

4. Anyagok és módszerek

25

4.1. Kísérleti állatok 4.2. Sejtvonalak 4.3. Ellenanyagok 4.4. Thymocyta és thymus epithelsejt preparálás 4.5. In vivo és in vitro Dexamethasone kezelés 4.6. CMX-Ros feltöltés, sejtfelszíni és intracelluláris jelölések 4.7. Konfokális mikroszkópia 4.8. Digitális képelemzés, kvantitatív mikroszkópia 4.9. Szubcelluláris frakcionálás 4.10. Western-blot és denzitometria 4.11. Immunfluoreszcencia thymus metszeteken 4.12. Reaggregált thymus szerv kultúra (RTOC) 4.13. Real-time PCR 4.14. Statisztikai analízis

5. Eredmények

25 25 25 26 26 26 27 27 27 28 28 28 29 30

31

5.1. A GR sejten belüli eloszlásának/morfológiájának jellemzése a thymocyta alcsoportokon konfokális mikroszkópiával 31 5.2. A DP sejtekben a GR rövid idejű DX kezelés hatására a mitokondriumba transzlokálódik 31 5.3. A GR mitokondriális transzlokációjának kvantifikálása DP sejtekben 34 5.4 A thymocyta alcsoportok mitokondriális funkciójának vizsgálata CMX-Ros festéssel 35 5.5. A GR mitokondriális transzlokációjának megerősítése szubcelluláris frakcionálással és Western blottal 36 5.6. A thymus epitheliumban is expresszálódik a GR 38 5.7. Morfológiai változások in vivo DX-kezelés hatására thymus epitheliumban 39 5.8. Génexpressziós változások a thymus epitheliumban DX-kezelés hatására 41

2

5.9. A GC-expozició funkcionális következménye a thymus epitheliumra: csökken a T-sejt fejlődést támogató képesség

42

6. Összefoglalás, Megbeszélés

44

7. Az új eredmények összefoglalása

54

8. Publikációk

55

8.1. A tézis alapját képező közlemények 8.2. Idézhető absztraktok 8.3. Könyvfejezet 8.4. Előadások 8.5. Poszterek

55 55 56 56 57

9. Irodalomjegyzék

61

10. Köszönetnyilvánítás

72

11. Mellékletek (a PhD-tézisek alapját képező közlemények)

73

3

1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ACTH: adrenokortikotróp hormon AICD: activation induced cell death, aktiváció indukálta sejthalál AIRE: autoimmune regulatory element AP-1: activator protein 1 BSA: bovine serum albumine CMX-Ros: chloromethyl-X-Rosamine CyC: Cychrome CREB: cAMP-response element binding DBD: DNA-binding domain, DNS-kötő domén DIC: differenciál interferencia kontraszt DKK: Dickkopf DLL: Delta-like ligand DMSO: dimetil-szulfoxid DN: double negative, kettősen negatív DP: double positive, kettősen pozitív DX: Dexamethasone EpCAM: epithelial cell adhesion molecule ER: estrogen receptor, ösztrogénreceptor ERK: extracelluláris szignál által regulált kináz ETP: early thymic progenitor FCS: fetal calf serum FITC: fluoreszcein izotiocianát FGF: fibroblast growth factor, fibroblast növekedési faktor FLT3: FMS related tyrosine kinase 3 FoxN1: forkhead box N1 GC: glukokortikoid hormon GL: germline, csíravonal GR: glukokortikoid receptor GRE: glucocorticoid response element HRPO: horseradish-peroxidase, tormaperoxidáz IAP: inhibitors of apoptotic proteins IGF: insulin-like growth factor KGF: keratinocyte growth factor 4

Lck: leukocyte specific protein kinase Lef: Lymphoid enhancing factor LBD: ligand-binding domain, ligandkötő domén MAIT: mucosal associated invariant T-cell MAPK: mitogén aktivált protein kináz MFI: mean fluorescence intensity, átlag fluoreszcencia intenzitás MHC: major histocompatibility complex MLS: mitokondriális lokalizációs szignál MR1: MHC-related molecule 1 NFAT: nuclear factor of activated T cells NF-κB: nuclear factor kappa B NKT: natural-killer T-sejt P2A: protein phosphatase 2 A PE: phycoerythrine PBS: phosphate buffered saline PFA: paraformaldehid RAR: retinoic acid receptor, retinsavreceptor RXR: retinoid receptor alpha RTOC: reaggregate thymic organ culture, reaggregált thymus szerv kultúra SCA-1: stem cell antigen-1 SP: single positive, egyszeresen pozitív TBS: tris-buffered saline Tcf: T-cell factor TcR: T-sejt receptor TN: triple negative, hármas negatív TRA: tissue-related antigens ZAP-70: zéta-lánc asszociált protein-70

5

2. BEVEZETÉS 2.1. A glukokortikoid hormonok általános- és az immunrendszerre kifejtett hatásai A mellékvese által termelt glukokortikoid hormonoknak (GC-k) szerteágazó élettani hatásaik vannak: szabályozzák többek között a protein, lipid és glükóz anyagcserét; különböző fejlődés- és neurobiológiai folyamatokat regulálnak; valamint apoptózist okoznak [1]. A GC-k szekréciója pulzatilis (ultradián) módon, óránként történik, ezt a hypothalamus-hypophysis-mellékvese

tengely

szabályozza

az

adrenokortikotróp-

hormonon (ACTH) keresztül. A legismertebb GC-t, a kortizolt szekréciója után a vérben a kortikoszteroid-kötő fehérjék szállítják. A szabad kortizol a biológiailag aktív forma, amit a 11-β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz alakít kortizonná. A GC-bioszintézishez szükséges enzimek a mellékvesekérgen kívül, ektópiásan, más szövetekben is jelen vannak, például a thymusban [2] és a bélben [3] is szintetizálódnak és szekretálódnak biológiailag aktív GCk. A fent említett élettani hatások mellett, a GC-k alapvetően befolyásolják az immnunrendszer különböző sejtes elemeinek funkcióit (1. táblázat), így például a monocyták/makrofágok, granulocyták, fibroblastok, T- és endothel sejtek homeosztázisát [4,

5].

A

szintetikus

GC-analógokat

(pl.

Dexamethasone,

Methylprednisolone,

Triamcinolone) kiterjedten használják a klinikumban immunszuppresszív gyógyszerként különböző autoimmun és más betegségek kezelésében [5]. Monocyták/makrofágok Keringő sejtek számának csökkentése MHC II és Fc receptor expressziójának csökkentése Gyulladásos citokinek és prosztaglandinok szekréciójának csökkentése

T-sejtek

Keringő sejtek számának csökkentése IL-2 szekréciójának és hatásának csökkentése

Granulocyták

Eosinophil és basophil granulocyták számának csökkentése Cirkuláló neutrofil granulocyták számának emelése

Endothelsejtek

Érpermeabilitás csökkentése Adhéziós molekulák expressziójának csökkentése IL-1 és prosztaglandinok szekréciójának csökkentése

Fibroblastok

Proliferáció csökkentése Fibronectin és prosztaglandinok szekréciójának csökkentése

1. táblázat. A glukokortikoid hormonok hatásai immunkompetens sejteken (Stahn és munkatársai (Mol Cell Endocrinol 2007) alapján [5]).

6

2.2. A glukokortikoid receptor A GC-k intracelluláris receptoron, a glukokortikoid hormon receptoron (GR) keresztül fejtik ki hatásaikat. A GR a nukleáris receptor szupercsalád tagja, moduláris szerkezetű,

ligand-dependens

transzkripciós

faktor.

A

fehérje

tartalmaz

egy

transzkripcionális aktiváló domént (AF-1) az N-terminális régión belül, egy cinkujj DNSkötő domént (DBD), illetve egy ligandkötő domént (LBD). A GR nagy fokban konzervált fehérje, az egér és a patkány, valamint a humán GR aminosavsorrendje kb. 90%-ban egyezik meg [6]. Az 1. ábra a humán, patkány és az egér GR szerkezeti hasonlóságát mutatja, és az ismert tirozin és szerin foszforilációs helyeket is tartalmazza [7]. A humán GR-nek van alfa- és béta izoformája is (egérben és patkányban ezek nem találhatóak meg), melyek alternatív splicinggal jönnek létre: az alfa izoforma a domináns forma és ez a citoplazmában helyezkedik el, míg a béta konstitutívan a sejtmagban lokalizált [1]. A béta izoforma biológiai jelentősége ismeretlen, egyes szerzők szerint a szteroid-rezisztencia kialakulásában játszhat szerepet. A GR a legtöbb szövetben expresszálódik, különösen nagy mennyiségben a májban, agyban, vázizomban, tüdőben, csontban [8] és a thymusban.

1. ábra. A humán, patkány és az egér GR sematikus szerkezete és tirozin (T), valamint szerin (S) foszforilációs helyek, illetve a foszforilációt a megfelelő szerinen és tirozinon végző fehérjék zárójelben feltüntetve. AF-1: aktiváló domén, DBD: DNS-kötő domén, LBD: ligandkötő domén, CDK: ciklin-dependenskináz, DNA-PK: DNS-dependens protein kináz, ERK: extracelluláris szignál által regulált kináz, JNK: JunN-terminális kináz, GSK-3: glikogén-szintáz-kináz-3. Átvéve [7].

7

2.3. A glukokortikoid receptor jelátviteli útvonalak áttekintése A GR ligandkötés után különböző jelátviteli útvonalakat indíthat el, melyek magyarázzák egyrészt a lassan kifejlődő klasszikus, genomikus hatásokat, másrészt a rövidebb idő alatt létrejövő alternativ, nem-genomikus hatásokat. A jelenleg elfogadott főbb GR-jelátviteli útvonalakat a 2. ábra foglalja össze.

2. ábra. A GR jelátviteli útvonalak áttekintése (F. Boldizsár et al., 2010, átvéve)[9]

2.3.1. Genomikus hatások A GR a citoplazmában egy fehérjekomplexhez kapcsolódik (melynek tagjai a p23, a Hsp40, a Hsp56, a Hsp70, a Hsp-90 és különböző immunofillin fehérjék) [1] majd ligandkötés hatására erről a komplexről leválva dimerizálódik, ezután a sejtmagba transzlokálódik, ahol a DNS meghatározott konzervatív, palindrom szakaszaihoz, a GREkhez

(glucocorticoid

géntranszkripciót

response

szabályozza

element)

(GGRACAnnnTGTTCT)

(genomikus

hatás)

[1]

(2.

ábra).

kötődik

és

a

Tekintettel

a

géntranszkripció megváltoztatásához szükséges lépések időbeni lefolyására, a genomikus hatások általában órák alatt következnek be [1, 10]. A GR transzkripciós faktorként direkt (GRE tartalmú promotereken) és indirekt (más transzkripciós faktorokkal való kölcsönhatás) utakon is szabályozhatja a génátiródási folyamatokat [1]. Közvetlenül, bizonyos gének átírását serkenti (annexin-1, IL-10, IκB), míg egyesekét gátolja (IL-1β, IL2) attól függően, hogy a célgének pozitív GRE-t (pGRE) vagy negatív GRE-t (nGRE) 8

tartalmaznak [1]. A nGRE-k szekvenciája sokkal variábilisabb (ATYACnnTnTGATCn), mint a pGRE-ké [11]. A génreguláció negatív szabályozásakor a GR direkt kötődése szükséges az nGRE-hez. Emellett más transzkripciós faktorokhoz kapcsolódva (AP-1, NFκB, NFAT) [10], befolyásolja aktivitásukat, és ezen keresztül számos gén expressziós mintázatát megváltoztathatja. A GC-k ultradián módon szekretálódnak, ezért a GR DNS-hez való kötődése és leválása is szigorú periodicitást mutat. Ez csak a természetes GC-kra vonatkozik, a szintetikus GC-k, mint pl. a Dexamethasone sokkal erősebb affinitással kötődnek a hormonreceptorhoz, ezért jelentősen módosulhat a transzkripcionális program a természetes ligandokhoz képest, mivel a receptorkomplex-DNS kölcsönhatás az előbb említett ciklicitást nem tudja a megfelelő mértékben utánozni [12]. 2.3.2. Nem-genomikus hatások Az utóbbi 10 év kutatásai feltárták, hogy a GC-knak a klasszikustól eltérő nemgenomikus hatásai is vannak, amelyek a genomikus hatásokkal ellentétben, akár perceken belül is létrejöhetnek [10, 13]. 2.3.2.1. Direkt membránhatás A GC-k (különösen magas dózisban) képesek a membrántranszport-folyamatok és a membránpermeabilitás befolyásolására (befolyásolják a Na+/K+ cserét, illetve meggátolják a Na+-felvételt a sejtmembránban és elősegítik a H+-felvételt a mitokondriumba), bizonyos sejttípusokon, így thymocytákon is (2. ábra) [13, 14]. 2.3.2.2. Membrán GR Egyes GC-indukálta apoptózisra rezisztens sejtekben, például monocytákon és Bsejteken membrán-GR-t is azonosítottak, azonban ezen receptorforma által kiváltott jelátviteli hatások továbbra is ismeretlenek [15]. A membrán GR-t liposzómával konjugált fluoreszcens ellenanyagokkal mutatták ki áramlási cytometriás módszerrel, mivel ezek a molekulák nagyon alacsony mennyiségben lehetnek jelen a sejtmembránban [15]. Rheumatoid arthritisben és ankilotizáló spondilitiszben ezeknek a molekuláknak a gyakorisága B-sejteken és monocytákon megemelkedik, lehetséges, hogy ezekben a betegségekben ennek a GR izoformának patogenetikai szerepe van [16]. Az azonban nem ismert, hogy az éretlen T-sejteken (thymocytákon) expresszálódik-e valamelyik fejlődési stádiumban a membránban GR, illetve hogy más immunkompetens sejten megtalálható-e. 9

2.3.2.3 A GR citoplazmatikus interakciója más fehérjékkel A GR képes más citoplazmatikus fehérjékhez kapcsolódni és így különböző jelátviteli útvonalakat befolyásolni. Például Jurkat humán T-sejtes leukémia sejtvonalban, a T-sejt jelátvitelben kulcsszerepet betöltő ZAP-70 kináz a GR egyik molekuláris partnere (3. ábra) [17, 18]. Továbbá, szintén az előbbi sejtvonalban, a ZAP-70 a Hsp-90-nel és a GR-ral is asszociálódva, multimolekuláris komplexet képez, illetve a GR ligandkötés hatására még szorosabban asszociálódik a ZAP-70-nel. Mark Löwenberg és munkatársai aktivált primer humán CD4+ T-sejtekben az Lck és a Fyn fehérjéket találták a GR célpontjának [19, 20]. Eredményeik szerint a GR aktivált T-sejteken az TcR-Lck-Fyn multimolekuláris komplexhez kötődik, majd ligandkötés hatására ez a komplex disszociál. 2.3.2.4. A GR mitokondriális transzlokációja A legújabb eredmények szerint a GR a GC-indukálta apoptózisra érzékeny sejtekben, a GC-rezisztensekben nem, nemcsak a sejtmagba, hanem a mitokondriumba is transzlokálódik, és ezáltal képes egyelőre még ismeretlen mechanizmussal az apoptotikus kaszkádot aktiválni [21, 22]. A GR ligandkötő doménjében azonosítottak egy olyan szekvenciát (az 558-580 aminosav között), amely nagyfokú hasonlóságot mutat a citokróm oxidáz fehérjében található mitokondriális lokalizációs szignálszekvenciával (MLS) (3. ábra). Ennek ellenére a GR mitokondriális import folyamata egyelőre ismeretlen, viszont feltehetőleg hősokkfehérje-dependens lehet, mivel a GR-ben azonosított MLS-szerű szekvencia (az előbb említett 558-580 aminosav között) átfedést mutat egy Hsp-90 kötőhely szekvenciával is.

3. ábra. A GR lehetséges mitokondriális lokalizációs szekvenciája (MLS) a ligadkötő doménben, az 558-580 aminosav között összehasonlítva a citokróm oxidáz (COX) mitokondriális fehérje MLS-ével. Vörös betűvel a pozitív töltésű arginin és lizin, narancssárgával a hidrofil treonin, míg kékkel a hidrofób leucin, izoleucin, valin és triptofán. Az egyező aminasavak csillaggal jelölve. Átvéve [22].

A GR mitokondriális transzlokációja után lehetséges hatásmechanizmusként felvetődik (4. ábra): 1.) a mitokondriális membránpotenciál szabályozása 2.) a GR pro-,

10

illetve antiapoptotikus fehérjékhez való kötődése 3.) a mitokondriális DNS-hez való kötődés és a mitokondriális génátírás szabályozása [23], mivel a mitokondriális DNS-ben azonosítani véltek GRE-hez hasonló szekvenciákat [23]. 4.) A nukleáris receptorokon kívül egyéb transzkripciós faktorokat is azonosítottak a mitokondriumban, mint pl. NF-κB, AP-1, p53, NFAT, CREB [24], szerepük azonban nem teljesen ismert: néhány közülük fehérjékkel kapcsolódik össze a mitokondriumban, a többiek pedig a sejtmagban ismert mechanizmusokhoz hasonlóan a mitokondriális génátírást szabályozzák [25]. Mint ahogy a genomikus hatásoknál részletezésre került, a GR több transzkripciós faktorral is kölcsönhatásba léphet a sejtmagban, de újabb adatok szerint hasonló mechanizmussal ugyanezt a mitokondriumban is képes megtenni [26].

4. ábra: A mitokondriális GR lehetséges hatásmechanizmusai. Átvéve [9].

A nukleáris receptor szupercsalád tagjai közül nemcsak a GR, hanem más receptorok is képesek a mitokondriumba transzlokálódni, többek között a Nur77, androgén-

és

ösztrogén

receptorokat

is

azonosítottak

már

különböző

sejtek

mitokondriumában [27]. A mitokondriális szteroid receptorokat a 2. táblázat foglalja össze.

11

Receptor

Sejt- és szövettípus

Referencia

GR

patkány máj-, HeLa-, HepG2-sejtvonalak, T-sejtek (thymocyta)

[22, 28, 29]

ER-beta

HepG2, nyúl ovárium, uterus

[30, 31]

Androgen

spermatocyta, LNCaP-sejtvonal

[32]

Thyroid

patkány máj, Cardiomyocyták

[33, 34]

RXR

patkány máj

[35]

RAR

patkány máj

[36]

Nur77

T-sejtek, SNU-1 gyomordaganat-sejtvonal

[37, 38]

PPARgamma2

patkány máj

[39]

2. táblázat. A nukleáris receptorcsalád tagjai különböző sejttípusok mitokondriumában.(Psarra és mtársai: Steroid and thyroid hormone receptors in mitochondria [27])

2.4. A T-sejtek és szerepük az immunhomeosztázis fenntartásában A T-sejtek az adaptív immunrendszer fő sejtes alkotóelemei közé tartoznak a Bsejtek mellett. Antigénreceptoruk a T-sejt receptor (TcR), amely jól karakterizált egységekből épül fel. A heterodimer molekula láncösszetétele alapján αβ- és γδ- TcR-t különböztetünk

meg.

Nélkülözhetetlen

járulékos

egysége

még

a

T-sejtek

antigénreceptorának a CD3 molekula, mely szintén több különböző alegységből áll és funkciója, hogy az antigénfelismerés után elindítsa jelátviteli folyamatokat. A T-sejtek az antigént, melynek kémiai természete általában fehérje, az antigénbemutatás folyamata során ismerik fel, mely a CD4+ T-sejtek esetében az MHC II molekulakomplexen keresztül történik, a CD8+ T-sejtek esetében pedig az MHC I-en. A T-sejtek többlépcsős, bonyolult érési folyamata a csontvelőben kezdődik, majd a thymusban folytatódik, melynek végeredménye az a naiv, antigénnel még nem találkozott T-sejt készlet („repertoire”), amely a perifériás nyirokszervekbe vándorol, hogy effektorsejtekké differenciálódjon és ellássa feladatát. A T-sejtek régóta ismert két fő alcsoportja a CD4+ helper T-sejtek (Th), és a CD8+ citotoxikus T-sejtek mellett egyre bővülő ismeretekkel rendelkezünk a perifériás differenciáció során kialakuló helper T-sejt alcsoportokról: Th1, Th2, Th9, Th17, follikuláris T-helper illetve regulátor T-sejtek [40] (5. ábra). A naiv CD4+ helper T-sejtek perifériás differenciálódását főleg az határozza meg, hogy a sejtek milyen citokin miliőben aktiválódnak [40] (5. ábra). Vannak nem-konvencionális, azaz a hagyományos antigénfelismerésben részt nem vevő T-sejtek, ilyenek az NKT-sejtek (natural killer T-sejtek) és a MAIT (mucosal

12

associated invariant T-cells), amelyek glikolipid antigéneket ismernek fel. Az NKTsejteknek is több alcsoportjuk van, ezek főként CD1d-restrikcióval működhetnek [41], mig a MAIT-sejteknek az MR1-molekulán keresztül történik az antigénbemutatás [42], azonban egyelőre erről a sejtcsoportról még kevés adat áll rendelkezésre.

5. ábra. A CD4+ Th-sejtek differenciálódása és konverziója. Az egyes fejlődési irányokat a különböző citokinek és transzkripciós faktorok (dőlt betűvel) határozzák meg. (Liang Zhou és munkatársai alapján, 2009, Immunity [40]). RA = retinsav, iTreg=indukált regulátor T-sejt, Tfh = follikuláris T helper sejt. A Th9 fejlődési iránynál még nem ismert a meghatározó transzkripciós faktor.

2. 5. A thymus fejlődése és sejtes összetevői A thymus az elülső mediastinumban, szív fölött elhelyezkedő szerv, de egyes szerzők beszámolnak (csak egérben) nyaki elhelyezkedésről, ami egy működő, második thymust jelenthet [43]. Régóta ismert, hogy a thymus az életkor előrehaladtával, már az első életévtől kezdődően visszafejlődik [44]. Ez a folyamat az ún. thymus involúció, aminek eredményeképp a thymus helyén végül csak zsíros szövet marad vissza [45]. A thymus a 3. és 4. garattasakból kezd el fejlődni, az embryonális fejlődés 10-11. napján [46], amiben a „forkhead box” transzkripciós faktor családba tartozó Foxn1 molekula kulcsszerepet játszik [47]. A Foxn1 hiányában („nude egér”) a thymus epithelium kezdeti fejlődése zavartalan (ennek oka ismeretlen), azonban később a thymust nem kolonizálják a thymocyták, és emiatt a fejlődő thymusból csak egy üres, cisztózus képlet marad vissza [46]. A Foxn1 transzkripciós faktor expresszióját a Wnt-4 glikoprotein 13

molekula indukálja egyelőre még ismeretlen jelátviteli lépéseken keresztül [48]. Részleteiben még nem tisztázott, hogy a thymus későbbi fejlődésében milyen szerepet játszhat a Foxn1, újabb adatok alapján viszont úgy tűnik, hogy a thymus posztnatális fenntartása szempontjából is elengedhetetlen [49, 50]. 2.5.1. A thymus epithelialis sejtek (TEC) és a cortex-medulla kompartmentalizáció Az embrionális fejlődés kb. 14. napjára, a thymusban megfelelően kialakul a cortex-medulla kompartmentalizáció (sematikusan ábrázolva a 6. ábrán), kialakítva a megfelelő molekuláris és stróma környezetet a fejlődő T-sejteknek. Az első TEC fenotípusú sejtek kb. a 12. napon jelennek meg, majd a szervkezdemény centrumában kialakulnak a medullaris szigetek [51]. A TEC fejlődésének ezen szakasza még független a thymocytáktól, az első limfoid progenitorok kb. a 13. napon jelennek meg [51]. Az embryonális thymus mesenchymális sejtjei pedig elindítják a vaszkulárizációt kb. az embryonális fejlődés 14. napján. A mesenchyma FGF-7-et és FGF-10-et termel, melyek a medulla fejlődéséhez nagyon fontosak. Az epithelium további differenciálódása és szegregálódása a keratin (K) és más különböző gének expressziós-szintjeinek változásával függ össze. Minden TEC expresszálja a felszínén az EpCAM-molekulát, a medullaris epithelsejtek (mTEC) magasabb arányban, mint a corticalisak (cTEC), a cTEC ezen kívül pedig Ly51 marker koexpressziójával is azonosítható [52] (EpCAM+Ly51+), ez az antigén az mTEC felszínén nem található meg (EpCAM++Ly51-). Ezenkívül pedig az mTEC K5+K8-, a cTEC pedig K5-K8+ fenotípusúak [47]. A mindkét keratin tipust expresszáló, K5+K8+ epithelialis progenitorsejtekről egyelőre még kevés adat gyűlt össze [47, 53]. A cortex-medulla kompartmentalizáció minden esetben zavart szenved olyan egér modellekben, ahol a T-sejt fejlődés a korai stádiumokban blokkolt [47], ami azt mutatja, hogy a T-sejtek is meghatározó alakítói a thymus szerveződésének. A thymus epithelialis sejtek az általuk elfoglalt kompartmentben szekvenciális fejlődési programot követnek, amely során végül kialakul a morfológiailag és funkcionálisan is jól elkülönült kéreg- és velőállomány, amelyet 6. ábra mutat. A cTEC fejlődéséhez szükséges jelek feltehetőleg részben a legéretlenebb CD3-CD4-CD8- thymocytáktól származnak [54], mig az mTEC fejlődéséhez embrionálisan a CD4+CD3- nyirokszöveti indukálósejtek- (lymphoid tissue inducer cells-LTi) és posztnatálisan az egyszeresen pozitív (SP) érett T-sejtek által közvetített szignálok szükségesek [55, 56]. A cTEC-re jellemző markerek még a β5tthymoproteoszóma és a catepsin-L molekulák, az mTEC-re pedig az AIRE (autoimmune 14

regulatory element) transzkripciós faktor, mely molekulák jelentőségét később részletezem [57].

6. ábra. A thymus szöveti kompartmentjei, melyet a strómasejtek, a corticalis-(cTEC) és medullaris epithelsejtek (mTEC) foglalnak el. Az előbb említett TEC-alcsoportok a bipotens TEC progenitorokból származnak. Az mTEC differenciálódását a thymus fejlődése során a nyirokszöveti indukálósejtek (LTi) indítják el, ekkor az érett mTEC-re már jellemző az AIRE transzkripciós faktor expressziója. A thymus további fontos celluláris komponensei közé tartoznak még a myeloid eredetű dendritikus sejtek (DC-k), makrofágok és egyes mesenchymális sejtek (cMes) és fibroblastok. Az ábra a thymocyta alcsoportokat is feltünteti (DN, DP, SP). (Anderson & Jenkinson 2007, Nat Rev Immunol, átvéve [58])

2.5.2.A T-sejtek érése és szelekciója a thymusban A T-sejtek a thymusban egy többlépcsős, bonyolult fejlődési folyamatban vesznek részt, melynek végeredménye funkcióképes, saját antigénekkel szemben toleráns perifériára kikerülő naiv T-sejt készlet. A T-sejtek fejlődését 1.

thymocyták és a strómasejtek közötti direkt sejt-sejt kapcsolatok (Notch a thymocytákon és ligandpárja a Jagged thymus epithelsejteken) [46]

2.

strómasejtek által szekretált szolubilis molekulák –

15

ƒ citokinek (IL-7 [59-61]), ƒ kemokinek (CCL19, CCL25 [62]), ƒ a 19 tagból álló Wnt-glikoprotein-család tagjai (különösen a Wnt-4) [63, 64] és ƒ különféle hormonok (pl. GC-k) [65] - befolyásolják. A fejlődési szakaszok feloszthatóak korai (az éretlen sejtek proliferációja) és késői (szelekciós lépések és az érett sejtek kikerülése a perifériára) szakaszra [62]. 2.5.2.1. A T-sejt fejlődés korai szakasza A csontvelőből érkező T-sejt előalakok c-Kit receptort (CD117) expresszálnak, valamint jellemző még rájuk az FLT-3 kináz és a SCA-1 molekulák expressziója. A thymusba vándorlás és megtelepedés során nagy szerepe van a CCR9 molekulának (melynek ligandja a CCL25 kemokin) az éretlen sejtek felszínén [66, 67]. Az érési folyamat első szakasza során a thymocyták „kettős negatív” (DN) fenotípusúak, azaz sem CD4-et, sem CD8-at nem expresszálnak a felszínükön [62]. A DN stádium négy szakaszra osztható fel a sejtfelszíni CD25 és CD44 expressziójuk alapján: DN1 (vagy ETP: korai T-sejt progenitor), DN2, DN3, DN4 [66]. A legéretlenebb T-sejt alcsoportok jellemzői a 3. táblázatban kerültek összefoglalásra, a korai érési folyamatok lépéseit pedig a 7. ábra mutatja be sematikusan. A sejtek a DN2 stádiumban intenzív osztódáson mennek keresztül, ami a DN3 stádiumban leáll [66]. A DN2-stádiumban a progenitor sejtek differenciációs programja még „rugalmas”: ezek még dendritikus-sejt, monocyta, NK-sejt és hízósejt irányba is differenciálódhatnak [68]. Mivel ezeken a sejteken még nem expresszálódik T-sejt antigénreceptor és a CD3 molekula sem (ez alapján „triple negative”: TN-sejteknek is nevezik őket), azonban a DN3 stádiumban megkezdődik a TcR-gének átrendeződése és ezzel a plaszticitás is megszűnik, befejeződik a T-sejt irányba történő elköteleződés („lineage commintment”) [69]. A DN3b-sejteket az különbözteti meg a DN3a-sejtektől, hogy már sikeresen átrendezték a TcR β-lánc génjét (sikeres béta-szelekción mentek keresztül), a DN4-sejtek pedig már intracelluláris TcRbétát expresszálnak, ami a CD8, illetve valamivel később a CD4-gének bekapcsolásához és így fenotípusosan a kettős pozitív (double positive) (CD4+CD8+) DP-stádiumhoz vezet [66]. A DN3-sejteknél válhatnak le a γδ-T-sejtek, amelyek egy külön T-sejt vonalt képeznek, nem fehérje természetű antigéneket ismernek fel [66]. Ezek a sejtek érésük után szelekciós lépések nélkül azonnal elhagyják a thymust és főleg a mukózában, illetve a bőrben halmozódnak fel [70]. 16

A thymus epithelium a T-sejt fejlődés minden egyes lépéséhez biztosítja a megfelelő környezetet, ezekben a korai fázisokban az IL-7 és a strómasejtek felszínén expresszálódó Notch-ligandok (főleg a DLL1 és a DLL4) kritikusak. ETP

DN2a

DN2b

c-KIT

Magas

Magas

Közepes

Alacsony Alacsony Alacsony

CD44

Magas

Magas

Magas

Alacsony Alacsony Alacsony

CD25

Negatív

Magas

Magas

Magas

Magas

Magas

Magas

Magas

Magas

CD24

NegatívKözepes

DN3a

DN3b

KözepesMagas

DN4

Alacsony

CD27

Magas

Magas

Közepes

Alacsony

Magas

Magas

Thy-1

Alacsony

Magas

Magas

Magas

Magas

Magas

+

+

+

-

+

+

Proliferáció TcRβ átrendeződés

GL > DJ

GL > DJ

GL > DJ

DJ VDJ

+

VDJ

VDJ+

3. táblázat. Az éretlen T-sejt alcsoportok fenotípus-jellemzői [66]. A táblázat különböző markerek expressziós szintjét és a sejtproliferáció, valamint a TcR génátrendeződés mértékét mutatja az éretlen T-sejt alcsoportokon.

7. ábra. A T-sejt fejlődés korai stádiumai a thymusban. Részletesen lásd a szövegben. Átvéve (Rothenberg, 2008, Nat Rev Immunol [66])

17

2.5.2.2. A szelekciós folyamatok (A T-sejt fejlődés késői szakasza) A pozitív szelekció A DP-sejtek a cortexben közvetlen kapcsolatba kerülnek a cTEC-ekkel, amelyek MHC-n keresztül különböző peptideket prezentálnak nekik. A cTEC különleges proteoszómával (β5t-thymoproteoszóma) rendelkezik, amely ezeket a peptideket generálja [71, 72]. Lehetséges, hogy a thymoproteoszóma olyan kevésbé stabil peptideket generál, melyek alacsony affinitással kötődnek az MHC-komplexhez [73]. Ha a DP-sejtek nem tudnak az epithelialis sejtek MHC-jéhez kötődni és ezeket a peptideket nem tudják felismerni, apoptózissal elpusztulnak, mivel nem kapnak túlélési szignált („death by neglect”) [74] (8. ábra a). Az apoptotizáló sejtek aránya ebben a folyamatban kb. 90% [75], a túlélő, pozitívan szelektált sejtek viszont folytatják az érési folyamatot, és a medullába vándorolnak kemokinszignálok hatására (8. ábra b). Ebben kitüntetett szerepe van a kemokin jelek fogadásában a thymocyták felszínén expresszálódó CCR7-nek, amelynek ligandja a mTEC által szekretált CCL19 és CCL21 [76, 77]. A negatív szelekció A túlélő sejtek ezután negatív szelekción esnek át, amely a saját antigénekhez túl erősen kötődő, potenciálisan autoreaktív sejteket pusztítja el apoptózissal, az aktiváció indukálta sejthalál (AICD) mechanizmusával [78]. A thymusból kikerülő érett sejtek, CD4+ vagy CD8+ egyszeresen pozitív (SP) fenotípusúak [62]. A negatív szelekcióban nagy jelentősége van a medullaris thymus epithelsejteknek és a dendritikus sejteknek is [58, 74]. Az mTEC az egyszeresen pozitív sejteknek szöveti antigéneket expresszál bizonyos kombinációkban, hogy a thymuson kívül meg tudják különböztetni a sajátot a nem sajáttól [79]. A thymuson kívüli szövetek antigénjeit a legkülönbözőbb mértékben expresszálja az mTEC, példaként a pancreas fehérjéi közül az inzulin és a glutamát-dekarboxiláz, a központi idegrendszer antigénjei közül a myelin bázikus protein említhetőek [80]. Ezt az AIRE (autoimmune regulatory element) transzkripciós faktor szabályozza, amely egyúttal a fő mTEC marker is [57]. Annak a ténynek, hogy mTEC széles körben expresszál szöveti antigéneket (TRA- tissue related antigens, a jelenséget az irodalomban „promiscuous gene expression”-nak nevezik) a negatív szelekció során nagy jelentősége van az ún. centrális tolerancia kialakítása szempontjából [58]. A centrális tolerancia kialakulásának eredményeképp autoreaktív T-sejtek nem kerülhetnek ki a perifériára [58]. Az AIREhiányos egerekben több szervet is érintő autoimmun betegség alakul ki, gyulladásos infiltrációkkal és emelkedett szérum autoantitest koncentrációkkal [81]. Továbbá az AIRE18

nek humán mutációja is ismert, ez áll a monogénesen öröklődő APECED-szindróma (autoimmun

poliendokrinopátia-candidiasis-ektodermális

disztrófia)

patogenezisének

hátterében [82]. A

fent

említett

klasszikus

mechanizmus

mellett

újonnan

felfedezett

antigénprezentációs mechanizmusoknak is jelentősége van a centrális tolerancia kialakítása szempontjából [74]: az egyik a makroautofágia, a másik pedig az mTEC és a DC-k között történő intercelluláris antigéntranszfer (9. ábra). Makroautofágia során intracellulárisan sejtorganellumok és más sejtrészletek bontódnak le nem-lizoszómális úton, kétrétegű membránok segítségével [83]. A thymusban konstitutívan nagy aktivitású biológiai folyamatról van szó, ami nemcsak a cortexben, hanem a medullában is fontos az antigénprezentáció szabályozása szempontjából [84]. Ekkor nem exogén, hanem endogén antigének prezentálódnak az MHC II-n keresztül a szelektálódó thymocytáknak. Az intercelluláris antigéntranszfer során pedig az mTEC-ek MHC-peptidfragmentumokat tudnak átadni a helyi és a kívülről bevándorló DC-knek a medullában [85]. A szelekció és az érési folyamatok befejezése után az SP-sejtek 4-5 napot töltenek a medullában, majd az érésük befejezése után a perifériás nyirokszervekbe vándorolnak [62]. 8. ábra. A szelekciós folyamatok és a T-sejt export összefoglaló ábrája [62]. (a) A saját MHC molekulákat felismerni nem tudó DP-sejtek túlélési szignál hiányában apoptózissal elpusztulnak („death by neglect”), a saját MHC-hoz kötődni képes TcR-t expresszáló sejtek viszont túlélnek, azaz megtörténik a pozitív szelekció. A túlélő sejtek közül a negatív szelekció során a túl nagy affinitású TcR-ral rendelkező sejtek pusztulnak el. (b) A pozitívan

szelektált

kemokinszignálok

sejtek

(CCL19,

a

CCR7-t

CCL21)

célzó

hatására

a

medullába vándorolnak. A negatív szelekció során regulátoros T-sejtek is képződnek, bennük megjelenik a Foxp3 transzkripciós faktor. Az érés befejeztével a sejtek elhagyják a thymust és a perifériás nyirokszervekbe vándorolnak, ebben fontos szerepe van a szfingozin-1foszfátnak és a receptorának. Átvéve [62]

19

9. ábra. Az intercelluláris antigéntranszfer fő mechanizmusai a negatív szelekció során. Az mTEC MHC I-en és MHC II-n keresztül prezentál antigéneket, a TRA-expresszióját elősegíti a makroautofágia. Az mTEC apoptózisa során, illetve szekréciós mechanizmussal a thymikus DC-k felvehetik ezeket az antigéneket. Ahhoz, hogy a thymusban perifériás saját antigének expresszálódjanak, nagyban hozzájárulnak a thymusból kívülről érkező DC-k is. Átvéve [74].

2.5.2.3. A thymocyta szelekció affinitásmodellje A thymocyták szelekciója nagyban függhet attól, hogy antigénreceptoraikkal milyen erős kapcsolatot létesítenek a szelekciós folyamatok során a strómális sejtekkel, a pozitív szelekció során a cTEC-kel, a negatív szelekció során pedig az mTEC-kel [74]. Az affinitás modell szerint kötődés erősségétől (az antigénreceptor affinitásától) függően a sejtek apoptózissal elpusztulnak, vagy túlélnek (10. ábra), azaz a TcR ligandhoz való affinitása dönti el a szelektálódó sejt későbbi sorsát [74]. Egy bizonyos küszöbértéknél gyengébben kötődő sejtek mindenképpen elpusztulnak („death by neglect”). Ha az affinitás túl nagy, akkor a kötődő sejt nagy valószinűséggel autoreaktív és apoptózissal elpusztul a negatív szelekcióban [74]. A negatív szelekciós folyamat során természetes, Foxp3-at expresszáló, regulátor T-sejtek is képződnek, amelyeknek nagy szerepe van a periférián az antigénspecifikus immunszuppresszióban [86]. Az azonban nem teljesen ismert, hogy a Tsejt receptor kötődés mértéke hogyan befolyásolja a regulátoros T-sejtek fejlődését a thymusban [87]. Végül, ha a kötődés közepes affinitású, akkor bekövetkezhet a pozitív szelekció és naiv, érett T-sejtek képződnek, amelyek később effektorsejtekké differenciálódhatnak a periférián (10. ábra). A SP sejtek szfingozin-1-foszfát receptort expresszálnak (S1P-R), amely a keringésben magas koncentrációban található szfingozin20

1-foszfátot köti meg, így a sejtek kijutnak a keringésbe [88], ahonnan a perifériás szervekbe vándorolnak.

10. ábra. A T-sejt szelekció affinitásmodellje. A szelekciós folyamatok során az apoptózist a T-sejt receptor. MHC kötődés erőssége határozza meg. Ha a kötődés erőssége túl alacsony, a sejtek apoptózissal elpusztulnak („death by neglect”), a túlélő sejtek (pozitív szelekció) „közepes erősségű” T-sejt receptorral rendelkeznek. Az erős TcR-MHC kötődés pedig a negatív szelekcióban eredményez apoptózist. Átvéve [74].

2. 6. A GC-k hatása T-sejteken és a thymusban A GC-k egyik régóta ismert hatása, hogy a thymus involúcióját [89, 90] és a perifériás T-sejtek [91], illetve a thymocyták apoptózisát okozzák [92, 93]. Újabb adatok szerint,

a

terápiásan

széles

körben

alkalmazott

immunszuppreszív

szerek

(cyclophosphamide, cyclosporine A), valamint a GC-analóg Dexamethasone (DX) blokkolják a thymus epithelsejtek funkcióját is [94]. Így tehát a GC therápia által kiváltott thymus involúcióban valószínűleg mind a thymocyták pusztulása, mind pedig az epithelsejtek funkciójának megváltozása szerepet játszhat. Bár a thymocyták GC-indukálta apoptózisáról az évek során sok adat gyűlt össze, a GC-k thymus epithelsejtekre kifejtett hatásai és szerepük a DX-indukálta thymus involúcióban még feltárásra várnak. A GR jelátviteli utak tanulmányozása több egérmodellben is lehetséges. GR knockout kimérakísérletek eredményei1, illetve az lck promoter alatt Cre-lox rendszerben csak a T sejtekben GR deficiens egérben kapott eredmények nem utaltak arra, hogy a thymus működéséhez és a T-sejtek fejlődéséhez a GR jelenléte esszenciális lenne [2, 95]. 1

A GR teljes hiánya klasszikus KO egérben letális fenotípust eredményez, a surfactans termelés elégtelensége

miatt kialakuló tüdőproblémák miatt, ezért ilyen egerek sejtjeivel csak kiméra kísérletek végezhetők. [2, 96]

21

Érdekes ugyanakkor, hogy GC hormont lokálisan a thymusban a strómaállományt alkotó epitheliális sejtek is szekretálják, sőt a legújabb kutatások szerint maguk a thymocyták is tudják termelni [97, 98]. Az utóbbi évek saját eredményei és más laboratóriumoké egyaránt azt mutatták, hogy a GC-k nemcsak a thymocyták apoptózisát okozhatják, hanem bizonyos körülmények között a túlélésükhöz is hozzájárulhatnak („kölcsönös antagonizmus modell”) [99], amely azt jelzi, hogy a GC hormon komplex a szelekciós szabályozási mechanizmusok szereplője lehet a thymusban. A „kölcsönös antagonizmus” elmélete szerint, ha a T-sejt egyszerre kap szignált a GR-n és a TcR-n keresztül, akkor túlél, szemben azzal, amikor külön a GR-n, illetve a TcR-n keresztül kap szignált, mert annak eredménye apoptózis lesz. A „kölcsönös antagonizmus” modellt munkacsoportunk in vivo adatokkal támasztotta alá [100] T-sejt receptor transzgenikus egérmodellben, magas dózisú GC és antigén egyidejű expozíciója a DP-sejtek szignifikánsan fokozott mértékű túlélését eredményezte a thymusban. Továbbá, alacsony dózisú glukokortikoidok önmagukban is in vivo a pozitív szelekció irányába tolták el a Tsejt érést T-sejt receptor transzgenikus egérmodellben, fokozva a DP-sejteken a CD69expressziót [101]. Érdekes, hogy a thymocyta alcsoportok közül a DP-sejtek a legérzékenyebbek a GC-indukálta apoptózisra, annak ellenére, hogy ezek a sejtek expresszálják a GR-t a legalacsonyabb mértékben, mind fehérje (áramlási citometriás adatok), mind mRNSszinten [92, 102], és a GC okozta GR downreguláció is defektív ezekben a sejtekben [102]. Továbbra sem ismert, hogy mi állhat ennek a fokozott GC-érzékenységnek a hátterében. Korábbi munkánk alapján, T-sejt receptor transzgenikus egérben a DP thymocyták GCindukálta apoptózisa már 4 órán belül mérhető a mitokondriális membránpotenciál csökkenésével, az Annexin V pozitivitás fokozódásával [100]. A túlélő DP-sejtekben pedig az antiapoptotikus Bcl-2 fehérje jelentősen emelkedett expresszióját találtuk [100]. Azonban a GR intracelluláris eloszlása és módosulásai a thymocytákban ezen folyamatok során még ismeretlen volt [95]. A GC-indukált apoptózis során különböző sejtekben (így thymocytákban is) több biokémiai változást azonosítottak: ezek a Ca2+-mobilizáció, az Src- és a Cdk2-kinázok aktivációja, majd ceramidképződés a foszfatidilinozitol-specifikus foszfolipáz C és a savanyú szfingomielináz aktivációjakor [95]. Továbbá, a jelátviteli kaszkád későbbi mediátorai (pl. kaszpázok) szerepéről is sok adat gyűlt össze a GC-indukálta apoptózisra vonatkozóan [95, 103]. Ezen mediátorok lehetséges szerepét a GC-indukálta apoptózis jelátvitelében a 4. táblázatban foglaltuk össze. 22

GC-indukálta apoptózis eddig azonosított biokémiai eseményei Esemény

Referencia

Ceramidképződés

[104]

Szabadgyök-képződés

[105]

Apoptózis inhibitor (IAP) fehérjék proteoszómális degradációja

[106]

Lizoszómák destabilizációja, cathepsin-B felszabadulása

[107]

IP3-receptor aktiváció

[108]

Bcl-2 családba tartozó Bim és Puma upregulációja

[109, 110]

Különböző kinázok aktivációja- PKC, Raf, 14-3-3 protein

[111]

Kaszpáz-3, -8 és -9 aktivációja

[112]

4. táblázat. A GC-indukálta apoptózis során azonosított biokémiai események. Átvéve [95]

Az előbb említett számos irodalmi adat más munkacsoportoktól, valamint a mi előző munkánk eredményei alapján felmerült, hogy alternatív GR-jelátviteli útvonalak (fehérje-fehérje kapcsolódások illetve más nemgenomikus hatások, pl. a mitokondriális membránpotenciál szabályozása) és a Bcl-2 fehérje érintettsége miatt a mitokondrális útvonal is aktívan részt vehetnek a DP-thymocyták GC-indukálta apoptózisában.

23

3. CÉLKITŰZÉSEK A bevezetőben részletezett kérdések alapján munkánk során az alábbi célokat tűztük ki: Mivel a GR mind a genomikus, mind a nem-genomikus GC hatások közvetítésében szerepet játszik, ezértvizsgálni kívántuk: 1. A GR celluláris eloszlását/morfológiáját thymocyta alcsoportokon. Mivel a morfológiai vizsgálatok során felmerült a mitokondriális GR jelenléte a thymocytákban, valamint esetleges részvétele az apoptózis folyamatok irányításában, ezért 2. A GR ligand indukált mitokondriális transzlokációját vizsgálni kívántuk thymocytákban különös tekintettel a GC-indukált apoptózisra érzékeny DPsejtekre. 3. Jellemezni kívántuk az in vitro nagydózisú GC kezelés mitokondriális funkcióra gyakorolt hatását. Munkánk másik részében a thymus epithelsejtek GC-indukált funkció zavara mögött rejlő molekuláris mechanizmusok vizsgálatát tűztük ki célul. 4. Elemezni szerettük volna in vivo a DX-kezelés thymus epithelialis sejtek szerveződésére gyakorolt hatását. 5. Jellemezni akartuk a thymus epithelialis sejtek altípusait, valamint a T-sejt fejlődést befolyásoló génjeik expresszióját in vivo DX-kezelés után. 6. Tanulmányozni kívántuk a DX-kezelt thymus epithelsejtek T-sejt fejlődést támogató funkciójának változását in vitro T-sejt fejlődés modellben.

24

4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. Kísérleti állatok Munkánk során 3-4 hetes BALB/c egerekkel dolgoztunk. Kísérleti állatainkat a kereskedelmi forgalomban kapható egértáppal etettük és megfelelő mennyiségű vízzel láttuk el. A kísérletes munkák megfelelnek a Pécsi Tudományegyetem Állatetikai Bizottsága által megállapított szabályoknak (#BA 02/2000-2/2006) 4.2. Sejtvonalak Sp-2 egér myeloma és RBL2H3 patkány bazofil leukémia sejtvonalakat használtuk munkánk során. A sejteket hagyományos 10% FCS tartalmú DMEM médiumban tenyésztettük, penicillin (10 egység/ml) és streptomycin (10 egység/ml) antibiotikum kombináció jelenlétében. 4.3. Ellenanyagok Kísérleteink során a következő antitesteket használtuk: a DP-sejtek mágneses szeparálása során a-CD4-FITC-t (YTS191.1 klón, [113]) és a-CD8-PE-t (53-6.7 klón, eBioscience). A thymus epithelsejtek izolálásakor és mágneses szelekciójakor a-CD45-t (IBL-3/16 klón, Dr. Balogh Péter) és a-EpCAM-FITC-t (G8.8-klón, [114]). A thymocyták konfokális mikroszkópos sejtfelszíni jelölésére során a-CD4-Pacific blue-t (RM4-5 klón, BD Biosciences) és a-CD8-Alexa Fluor 647-t (53-6.7 klón, BD Biosciences), áramlási cytometriás sejtfelszíni jelölésre a-CD4-FITC (YTS191.1, [113]) és a-CD8-CyC koktélt (Ly-2 klón, BD Biosciences). A GR-t intracellulárisan konfokális mikroszkópiával az Intézetünkben kifejlesztett a-GR egér monoklonális antitesttel detektáltuk (5E4-B1 klón [115]). Western-blotban a következő elsődleges ellenanyagokat használtuk: egér monoklonális aGR (5E4-B1), nyúl poliklonális a-histone H1 (Santa Cruz Biotechnology), egér monoklonális a-β-aktin (Sigma) és egér monoklonális anti-citokróm C (BD Biosciences). Másodlagos ellenanyagokként a-nyúl-HRPO-t és a-egér-HRPO-t használtunk (Hunnavix). Fagyasztott thymus metszeteken a következő antitesteket használtuk: a thymus epithelium jelölésére jelöletlen a-EpCAM-t vagy EpCAM-FITC-t (G8.8, [114]). A jelöletlen EpCAM után a-patkány Cy3 másodlagos antitesttel inkubáltuk a metszeteket. A kortex festésére aLy51-PE (BD-Biosciences) ellenanyagot használtunk. Az MHC II-t jelöletlen patkány aMHC II-vel (IBL-3/5 klón, Balogh Péter) detektáltuk, melyet a-patkány PE (BD 25

Biosciences) előhívás követett. A Wnt-4 molekulát kecske poliklonális a-Wnt-4-gyel (Abcam és a-kecske Northern Light 557-tel (R&D Systems) vizualizáltuk. 4.4. Thymocyta és thymus epithel sejt preparálás A kísérleti állatok feláldozása után thymusukat eltávolítottuk, mechanikusan disszociáltuk, majd a kapott szuszpenziót vattán átszűrtük. A sejtek viabilitását tripánkék festék kizárásos teszttel határoztuk meg. A DP-sejteket mágnesesen Easysep anti-PE (StemCell Technologies) szelekciós koktéllal, pozitív szelekcióval izoláltuk, a-CD4-FITC és a-CD8-PE antitestkoktéllal történő kettős jelölés után. Thymus epithelsejteket (EpCAM+-sejtek) RNS-izolálásra a thymus kollagenázzal való emésztése után, a CD45+ lymphoid sejtek deplécióját követően, szintén mágneses sejtszeparálással, EpCAM-FITC antitesttel történt jelölés után, pozitív szelekcióval izoláltuk. 4.5. In vivo és in vitro Dexamethasone kezelés In vivo, a kísérleti egereknek 20 mg/kg glukokortikoid-analóg Dexamethasone-t (DX) (Organon, Oradexon) adtunk (PBS-ben oldva) intraperitonealisan, a kontroll állatoknak pedig PBS-t. Az állatokat 24 óra, 72 óra, illetve 1 hét után áldoztuk fel. In vitro, a thymocytákat és a sejtvonalakat szérummentes médiumban, 1 µM DX-nal (Sigma) kezeltük 30 percig, a reakciót pedig jéghideg PBS-aziddal állítottuk le. A kontroll sejteket a megfelelő hígításban oldószerrel (a DX-t DMSO-ban tartottuk) kezeltük. 4.6. CMX-Ros feltöltés, sejtfelszíni és intracelluláris jelölések A mitokondriumok jelölésére és a mitokondriális funkció mérésére a CMX-Ros (chloromethyl-X-rosamine)(Invitrogen) mitokondriális indikátort használtuk 1 µg/ml-es koncentrációban [116]. A festéket az intakt mitokondriumok felhalmozzák, ahol fluoreszcens festékké alakul át. A vörös csatornában detektálható (áramlási cytometriával FL2-ben, ex. 579 nm, em: 599 nm). A feltöltést 37ºC fokon végeztük, 30 percig, szérummentes RPMI médiumban, a DX-kezeléssel párhuzamosan. A sejtfelszíni a-CD4 és a-CD8 jelölést (Pacific blue és Alexa fluor 647 fluorokrómokkal konfokális mikroszkópiára; és FITC, valamint CyC fluorokrómokkal áramlási cytometriára) jégen, jelölőpufferben (0,1 % BSA-t és 0,1 % NaN3-t tartalmazó PBS) 30 percig végeztük. Ezután jelölőpufferrel mostuk a sejteket, majd 20 percig 4%-os PFA fixálás következett, mely után 26

az Intézetünkben kifejlesztett monoklonális a-GR antitesttel (5E4-B1-klón [115]) jelöltük a sejteket intracellulárisan 0,1% szaponin tartalmú jelölőpufferben. A sejteket végül cytocentrifugával tárgylemezre centrifugáltuk, vagy FACSFix (0,5% PFA PBS-ben) oldatban tartottuk a flow cytometriás mérésig. Az áramlási cytometriás analízist a CellQuest programmal végeztük, 10.000 eseményt rögzítettünk, a törmeléket és az elpusztult sejteket morfológiájuk alapján kizártuk az analízisből [117], a thymocyta alcsoportokat pedig a sejtfelszíni CD4 és CD8 expresszió alapján különítettük el. A thymocyta

alcsoportok

CMX-Ros

átlagos

fluoreszcencia

intenzitását

(MFI)

hisztogramokon ábrázoltuk. 4.7. Konfokális mikroszkópia Az Olympus Fluoview 300 konfokális mikroszkópot és az Olympus Fluoview FV1000S-IX81 fotórendszert használtuk munkánkhoz. A jeleket négy különböző csatornában detektáltuk: DIC (differenciál interferencia kontraszt), a CD4-et UV közeli csatornában, a GR-t a FITC (zöld) csatornában, a CMX-Rost a vörös csatornában, a CD8at pedig a távoli vörösben. Szekvenciális pásztázási módot, valamint Kalman zajszűrést használtunk, hogy a spektrális átfedést a csatornák között elkerüljük. A jeleket 3-3 látótérben gyűjtöttünk és a CMX-Ros és a GR közötti morfológiai kapcsolatot (kolokalizáció) elemeztük. 4.8. Digitális képelemzés, kvantitatív mikroszkópia 100 kontroll és 100 DX-kezelt DP sejtben elemeztük a GR - CMX-Ros kolokalizáció mértékét. Az ImageJ szoftvert (http://rsb.info.nih.gov/ij) használtuk a kolokalizációs kiegészítő modullal (pluginnal). A szoftver a GR – CMX-Ros kolokalizált pontokat egy külön képen fehér pontokként jelenítette meg, amely pixeleket megszámoltuk majd ábrázoltuk [118, 119]. 4.9. Szubcelluláris frakcionálás A mitokondrium frakciók izolálásához mitokondrium izoláló kitet (Pierce) használtunk a gyári előírásokat követve, kisebb módosításokkal [120, 121]. Az oldószerrel- és DXkezelt thymocytákat megmostuk jéghideg PBS-ben, majd a sejteket lizáltuk. 800g-vel való centrifugálás után a magfrakciókat háromszor 0,5% NP-40 detergenst tartalmazó TBS pufferrel mostuk, majd a pelletet 10 %-os merkaptoetanolt is tartalmazó SDSmintapufferben (125 mM Tris, 4% SDS, 10% glycerol, 0,006% Brómfenolkék) vettük fel 27

és megfőztük. A posztnukleáris szupernatánst egyszer 3000g-vel 15 percig, majd 12000gvel 5 percig centrifugáltuk, a pelletet 10% merkaptoetanolt tartalmazó SDS-mintapufferben felvettük, majd megfőztük. Citoplazma frakcióként a 3000g utáni centrifugálási lépés szupernatánsát használtuk fel. 4.10. Western blot és denzitometria A sejtfrakciókat megfőztük és 7, 10 vagy 15%-os poliakrilamid gélen futtattuk meg. A géleket egy éjszakán át blottoltuk nitrocellulóz membránra a Bio-Rad Trans-Blot rendszer segítségével. A blottolás után a membránokat 2%-os BSA – vagy 1% tejpor tartalmú pufferrel (2% BSA, 10 mM Tris, 100 mM NaCl és 0.1% Tween 20, pH 7.4) telítettük. A blotokat anti-GR, anti-β-aktin, anti-citokróm c egér monoklonális antitestekkel, antihiszton-H1 nyúl poliklonális antitesttel inkubáltuk, majd a megfelelő anti-egér-HRPO és anti-nyúl-HRPO másodlagos ellenanyagokkal hívtunk elő. A blotokat denzitometriával analizáltuk, a GR relatív denzitásokat a megfelelő frakciókban az aktin, citokróm c, hiszton H1 csíkok denzitásához normalizáltuk. A denzitometriás méréseket a BioRad Quantityone szoftvercsomaggal végeztük el. 4.11. Immunfluoreszcencia thymus metszeteken Az egerek eltávolított thymusából 5-10 µm vastag fagyasztott metszeteket készítettünk, majd a következő ellenanyagokkal festettünk aceton fixálás és 5% BSA-tartalmú PBS pufferrel való telítés után: GR-FITC (5E4-B1) és EpCAM/a-patkány-Cy3; EpCAM-FITC és Ly51-PE; EpCAM-FITC és MHC II/a-patkány-PE, EpCAM-FITC együtt a poliklonális kecske Wnt-4/a-kecske-PE párral. A metszeteket Olympus fluoreszcens mikroszkóppal analizáltuk. 4.12. Reaggregált thymus szerv kultúra (RTOC) A thymus epithelsejteket a CD45 expresszió hiánya és az EpCAM pozitivitás alapján szelektáltuk mágnesesen (lásd 4.3. fejezet Thymocyta és thymus epithelsejt preparálás). A TN, éretlen thymocytákat (CD3-CD4-CD8-) kezeletlen felnőtt egérből, CD3/CD4/CD8 mágneses deplécióval izoláltuk. A thymus epithelsejteket 4:1 arányban centrifugáltuk össze a thymocytákkal, majd 1 hét után a kultúrákban a thymocyták CD4/CD8 expresszióját analizáltuk. Ahhoz, hogy az RTOC-ből származó thymocyta alcsoportokat helyesen el tudjuk különíteni, párhuzamosan festési kontrollként teljes thymocyta szuszpenzión is elvégeztük a CD4 és CD8 jelölést. 28

4.13. Real-time PCR A mágnesesen szeparált thymus epithelsejtekből RNeasy mini kit (Qiagen) segítségével RNS-t izoláltunk, majd DNase (Sigma) emésztés után „High Capacity RNA to cDNA Kit“ (Applied Biosystems) segítségével cDNS-t szintetizáltunk. A real-time PCR reakciót az „Sybrgreen master mix“ vagy „Taqman master mix“ (mindkettő Applied Biosystems) segítségével végeztük. A felhasznált primerek szekvenciái az 5. táblázatban olvashatóak.

29

Gén CD45 GR FoxN1 Keratin 5 (K5) Keratin 8 (K8) Keratin 14 (K14) Keratin 18 (K18) CIITA AIRE MHC I (H2D1) IL-7 Wnt4 18 s rRNA 18s rRNA Taqman

Forward primer

Reverse primer

5’-CCG GAA TTC CGG ATG GGT TTG TGG CT-3’ 5’-TGG TGT GCT CCG ATG A-3’ Applied Biosystems TaqMan probe PN4351272 (Mm00477457_m1) 5’-CCCTCT GAA CCT GCA AAT CG-3’ 5’-TCA GCT ACG GAA TGA GCT CCT T-3’ 5’-CCT CTG GCT CTC AGT CAT CCA-3’ 5’-CGC TTG GTG GAG GAT GGA-3’ 5’-CTA GCC AAG TCC CTC CTA AGG-3’ 5’-ACC TAA ACC AGT CCC GGA AAG-3’ 5’-ACCT GCA GTT CGC CTA TGA AG-3’ 5’-ACT ACA CCC ACC TCC CGC A-3’ 5’-CTC AAA GGC CTG ATC CAG AG-3’ 5’-GGG TCG GGA GTG GGT AAT TT–3’ Applied Biosystems TaqMan probe 4352656-0701012

5’-CCG CTC GAG CGG CTA ATC ACT GGG TG-3’ 5’-AGG GTA GGG GTA AGC-3’

5’-TGA TCT GCT CCC TCT CCT CAG T-3’ 5’-GTG GTG CGG CTG AAA GTG T-3’ 5’-TGC ACA TCC ATG ACC TTG GT -3’ 5’-TGC ACA GTT TGC ATG GAG TTG-3 5’-ATC TCA GAC TGA TCC TGG CAT-3’ 5’-CGA GGC TCC AGT GCT T-3’ 5’-CCG CCG TCC ACG TTT TC-3’ 5’-TCT CAG TAG TCT CTT TAG G-3’ 5’-TCA CAG CCA CAC TTC TCC AG-3’ 5’-AGA AAC GGC TAC CAC ATC CAA–3’

5. Táblázat: A real-time PCR során használt primerek listája.

4.14. Statisztikai analízis Munkánk során az adatokat átlag ± standard deviációként (SD) tüntettük fel és Student-féle

t-tesztet

használtunk

a

különböző

csoportok

eredményeinek

összehasonlítására, a p<0,05 eltérést fogadtuk el statisztikailag szignifikánsnak.

30

5. EREDMÉNYEK 5.1. A GR sejten belüli eloszlásának/morfológiájának jellemzése a thymocyta alcsoportokon konfokális mikroszkópiával Korábbi munkánk során flow cytometriás mérésekkel és kvantitatív PCR-al is igazoltuk (más laboratórium eredményeivel egyezően [92]), hogy a DP-sejtek expresszálják a GR-t a legalacsonyabb szinten [93, 102]. A receptor intracelluláris eloszlása azonban ezekben a sejtekben nem volt ismert, ezért jelenlegi munkánk során ezt tisztáztuk először. A 11. ábrán a négy thymocyta alcsoport típusos GR festődését mutatjuk be. Áramlási cytometriával, valamint real-time PCR-ral kapott eredményeinkhez hasonlóan, a DPsejtekben (magenta) expresszálódik a legkevesebb GR az éretlen DN és az érett CD4 (kék), valamint a CD8+ SP (vörös) sejtekhez viszonyítva. Emellett eltérő festődési mintázatot is találtunk. Az 12. ábrán pedig a két legnagyobb thymocyta alcsoport, a DP-sejtek (7080%) (magenta) és a CD4+ SP-sejtek (10-15%) (kék) GR expresszióját hasonlítottuk össze. Az ábra E és F részén látható, hogy a DP sejtek sokkal alacsonyabb szinten expresszálják a GR-t, mint a CD4+ SP-sejtek, valamint a DP-sejtekben a GR eloszlása granulárisabb, a CD4+ SP-sejtekében pedig homogénebb (2. ábra E és F). A DP-sejtek granulárisabb jellegű festődési mintázata utalhat arra, hogy a GR ezekben a sejtekben mitokondriális elhelyezkedésű is lehet. A CMX-Ros – GR közötti átfedést mind a 4 kontroll thymocyta alcsoportban megvizsgáltuk és minden sejtcsoportban találtunk bizonyos szintű kolokalizációt (11. ábra, az 5. oszlop paneljei). 5.2. A DP sejtekben a GR rövid idejű DX kezelés hatására a mitokondriumba transzlokálódik A DP sejtekben tovább analizáltuk a CMX-Ros és a GR közötti morfológiai kapcsolatot és érdekes módon azt találtuk, hogy in vitro DX kezelés hatására a GR főleg a mitokondriumba, nem pedig a sejtmagba transzlokálódott. A 13. ábrán 5 kontroll (A) és 5 DX-kezelt (B) DP-sejtről készített felvétel látható. A CMX-Ros és GR kolokalizált területeket sárga szín jelzi.

31

11. ábra. A négy thymocyta alcsoport- DIC (differenciál interferencia kontraszt), CD4 és CD8 sejtfelszíni festődés alapján DN, DP (magenta), CD4+ SP (kék), CD8+ SP (piros) GR expressziója (zöld) és CMX-Ros festődése (narancs), illetve az összegzett képeken (5. oszlop paneljei) a CMX-Ros – GR kolokalizáció látható, amely sárga színnel ábrázolódik (fehér nyilakkal jelöltük).

12. ábra. DP és CD4+ SP sejtek GR-expressziójának morfológiai jellemzése konfokális mikroszkópiával. Egy látótér átnézeti képe (A-C), melyből reprezentatív sejteket ábrázoltunk (D-F). A magenta színű DP (E) sejtekben összehasonlíthatóan kevesebb a GR expresszió (F), mint a kékkel ábrázolódó CD4 SP sejtekben, valamint bennük homogénebb mintázat figyelhető meg.

32

A 13.

ábra.

DP-sejtek

GR

és

CMX-Ros

kolokalizációja kezelés nélkül (A) és in vitro DX kezelés után (B). 5 kontroll és 5 DX-kezelt reprezentatív sejtet ábrázoltunk. A GR DXkezelés

hatására

a

mitokondriumba

transzlokálódik, azonban a magban nem jelenik meg

DP

sejtekben.

A

GR-mitokondrium

kolokalizáció sárga színnel ábrázolódik (fehér nyilakkal jelöltük).

B B

33

14. ábra. A GR magi és mitokondriális transzlokációjának vizsgálata RBL2H3- és Sp2-sejtekben. Az RBL2H3-sejtekben már 10 perc után megfigyelhető volt a GR magi transzlokációja néhány sejtben (nem ábrázoltuk), amely 30 perc után a sejtek közel 100 %-ában látható volt. Az Sp2-sejtekben a GR 30 perc után sem transzlokálódott a sejtmagba. A sejteket morfológiai kontrollként használtuk.

Mivel a GR a DP-sejtekben nem transzlokálódott a sejtmagba, ezért morfológiai (és módszertani) kontrollként ugyanazon protokoll szerint elvégeztük a jelöléseket két sejtvonalon is, az Sp-2 egér myeloma- és az RBL2H3-patkány leukémia sejtvonalakon (14. ábra) is. Az Sp-2 sejtvonalban a GR nem transzlokálódott a magba 30 perces DX-kezelés hatására. Az RBL2H3-sejtvonalban a GR már 10 perces DX expozíció után a sejtmagba transzlokálódott, ez 30 perces expozíció után már teljes volt, tehát módszerünk alkalmas a GR transzlokáció szubcelluláris morfológiai vizsgálatára. 5.3. A GR mitokondriális transzlokációjának kvantifikálása DP sejtekben Ahhoz, hogy a GR mitokondriális transzlokációjának változását kvantitatív módon követni tudjuk, több látótérben véletlenszerűen kiválasztott 100 kontroll és 100 DX-kezelt DP-sejtben a CMX-Ros és a GR csatornában is detektálható, kolokalizált pixeleket meghatároztuk az ImageJ szoftvercsomag kolokalizációs pluginje segítségével. A 15. ábrán ábrázoltuk a kontroll és DX-kezelt DP sejtekben a CMX-Ros – GR kolokalizált pixelek számát. Érdekes, hogy a kontroll sejtekben is megfigyelhető volt kolokalizáció 34

alacsony szinten, amely valószínűleg azzal magyarázható, hogy a thymocyták a thymusban egy GC-gazdag mikrokörnyezetben találhatóak [102], ami már in vivo mitokondriális GR lokalizációt eredményezhet. Egy másik lehetséges magyarázat az lehet, hogy egy GR frakció eredendően a mitokondriumban is megtalálható, mint ahogy azt egyes sejtvonalakban is leírták [29]. 15. ábra. Az oszlopdiagramok a DP sejtekben konfokális mikroszkóppal észlelt mitokondrium–GR

kolokalizált

pixelek

abszolút számának átlagát ± SD mutatják. Az oldószerrel kezelt sejtekben is találtunk alapszintű kolokalizációt, amely in vitro DX kezelés hatására szignifikánsan nőtt (*, p<0,05)

5.4. A thymocyta alcsoportok mitokondriális funkciójának vizsgálata CMX-Ros festéssel A CMX-Ros áramlási cytometriás mérésre is használható, hiszen a fluoreszcencia intenzitás (MFI) a mitokondriális membránpotenciáltól függ. Sejtfelszíni jelölésekkel kombinálva meghatároztuk az egyes thymocyta alcsoportokban a CMX-Ros átlag fluoreszcencia intenzitást, amely a DP sejtekben bizonyult a legalacsonyabbnak összehasonlítva a DN, valamint a CD4+ és a CD8+ SP sejtekkel (16. ábra). A

B

16. ábra: Thymocyta alcsoportok CMX-Ros jelölődése. A thymocyta alcsoportok közül a DP sejtekben a legalacsonyabb a CMX-Ros átlag fluoreszcencia intenzitás (MFI) az éretlen DN és az érett CD4+ SP és CD8+ SP sejtekéhez viszonyítva. Az oszlopdiagramok az A panelen 3 független kísérlet átlagát ± szórását mutatják, a szignifikáns különbségeket *-gal jelöltük (p<0,05). A B panelen egy-egy kísérlet reprezentatív hisztogramjai a thymocyta alcsoportok CMX-Ros jelölődését mutatják.

35

A

B

17. ábra. A DP sejtekben 30 perces in vitro DX kezelés hatására csökken a CMX-Ros átlagfluoreszcencia intenzitás . Az A panelen az oszlopdiagramok 3 kísérlet átlagát ± szórását mutatják, a B panelen pedig egy kísérlet reprezentatív hisztogramjai láthatóak. A szignifikáns különbséget csillaggal jelöltük (p<0,05).

Mivel a DP sejtek a legérzékenyebbek a GC kiváltott apoptosisra, ezért vizsgáltuk a CMXRos MFI változásokat a DP-sejtekben DX hatására (17. ábra A és B). Harminc perc DXkezelés hatására szignifikáns CMX-Ros MFI csökkenést tapasztaltunk a DP-sejtekben, ami valószínűleg a mitokondriális funkció romlásának egyik korai indikátora. 5.5.

A

GR

mitokondriális

transzlokációjának

megerősítése

szubcelluláris

frakcionálással és Western blottal Ahhoz, hogy a morfológiai eredményeket Western-blottal is alátámasszuk, a thymocytákból citoplazma, mitokondrium és sejtmag frakciót izoláltunk. A szubcelluláris frakcionálást elvégeztük mind teljes thymocyta szuszpenzión (minden alcsoport benne van), illetve később tisztított DP-sejteken is. 3-4 hetes BALB/c egérben a thymocyták kb. 80%-a DP-sejt (19. A ábra, illetve [122]). A szeparálatlan sejtekben DX-kezelés hatására a GR szintje a citoplazmában szignifikánsan lecsökkent, míg egy határozott frakció vált detektálhatóvá a mitokondriumban és a sejtmagban (18. ábra). Az erős GR-reaktivitás a sejtmagban valószínűleg azzal magyarázható, hogy a többi thymocyta alcsoportban jóval magasabb a GR-expresszió, amely szignifikánsan hozzájárulhat a kapott magi reaktivitáshoz.

36

18. ábra. A GR intracelluláris eloszlását szubcelluláris frakcionálás után Western-blottal is megvizsgáltuk nem szortolt thymocytákon. A frakciók tisztáságának ellenőrzésére, illetve töltéskontrollként a citoplazma marker β-aktint, a mitokondrium marker citokróm c-t, illetve a sejtmagi marker hiszton H1-et alkalmaztuk. A képek egy reprezentatív Western-blotot, az oszlopdiagramok pedig a denzitometriás adatok 3 kísérlet átlag ± szórását mutatják. A szignifikáns csökkenést †-al, a növekedést pedig *-al jelöltük.

A szubcelluláris frakcionálást megismételtük mágneses sejtszeparálással tisztított DPsejteken is (a sejtek tisztaságát egy reprezentatív áramlási cytometriás denzitásploton mutatjuk a 19. A ábrán). Sikerült igazolnunk, hogy a DP sejtekben a GR valóban csak a mitokondriumba transzlokálódik, a sejtmagba nem (19. B ábra). Mivel feltételeztük, hogy a GR a mitokondriumban az apoptózis kaszkádot proapoptotikus

fehérjéken

keresztül

citoplazmatikus

partneréről,

a

Hsp-90

aktiválhatja, fehérjéről

valamint leválva,

ligandkötés esetleg

egy

után másik

hősokkfehérjével kapcsolódik, ezért a további munkánkban lehetséges mitokondriális fehérje célpontként a Bak és a Bax proapoptotikus fehérjéket, valamint a Hsp60-at vizsgáltuk.

A

fehérjeasszociációk

igazolására

mágnesesen

tisztított

DP-sejtek

mitokondriumából végeztünk immunprecipitációkat. Előzetes eredményeink alapján valószínűsítjük, hogy a GR a mitokondriumban a Hsp-60 és a Bak fehérjékhez asszociálódhat, ez azonban további megerősítést igényel (nem ábrázoltuk).

37

A

B

19. ábra. A szubcelluláris frakcionálást megismételtük pozitívan szelektált DP-sejteken. A tisztított sejtek 93%-a volt DPsejt (A), sejtfrakcionálás utáni Western-blot eredménye a B panelen látható. DP sejtekben DX kezelés hatására a GR csak a mitokondriumba transzlokálódott, a sejtmagba nem.

5.6. A thymus epitheliumban is expresszálódik a GR A thymus epithelialis sejtek fontos szerepet játszanak a T-sejtek fejlődésében (Bevezetés 2.5.1 A thymus epithelialis sejtek és a cortex-medulla kompartmentalizáció fejezete), azonban egyelőre elég kevés adat van arról, hogy a glukokortikoidok befolyásolják-e funkciójukat. Egy nemrég megjelent közlemény szerint magas dózisú DXkezelés lecsökkenti mind a kortikális, mind pedig a medulláris epithelialis sejtek számát [94]. Ezek alapján célunk volt azon molekulák azonosítása, amelyek ezt a folyamatot közvetíthetik. A GC-k hatásaikat nagyrészt a GR-en keresztül fejtik ki (lásd Bevezetés 2.3. fejezet: a GR jelátviteli útvonalak áttekintése), ezért elsőnek felmerült az a kérdés, vajon az egér primer thymus epithelium expresszál-e GR-t. Korábban leírták, hogy thymus epithelsejtvonal [123] és thymoma sejtek is [124] expresszálnak GR-t. A GR több szerv epithelialis kompartmentjének fenntartásához is szükséges, mint például a bőr [125] és a tüdő [126]. A 20. ábra A részén látható a thymocyták és epithelsejtek GR mRNSexpressziója (a CD45 gént a haemopoetikus sejtek marker génjeként használtuk) PCR technikával. A B panel fagyasztott thymus metszetek GR expresszióját mutatja, ahol az epithelialis kompartment (EPCAM+, jelen esetben piros) jórészt GR-re is pozitív (zöld).

38

A

B

20. ábra. GR expressziója a thymus epitheliumban. (A) RT-PCR reakcióval, illeve (B) fagyasztott thymus metszeteken EPCAM (vörös), GR (zöld) és DAPI festésekkel. Az ábra paneljai 3 kísérletből származó reprezentatív képeket mutatnak be.

5.7. Morfológiai változások in vivo DX-kezelés hatására thymus epitheliumban Immunfluoreszcens vizsgálatokkal kimutattuk, hogy egyszeri DX-kezelés után 24 órával a thymusban csökken az epithelialis sejteken az EpCAM és a Ly51 expressziója (21. ábra)(az EpCAM minden thymus epithelialis sejten expresszálódik, a Ly-51 pedig csak a corticalis epithelialis sejteken, mindkettő széles körben használt sejtfelszíni marker). Ezen két molekula expressziója 72 órával a DX-injekció után részleges, 168 óra után pedig majdnem teljes regeneráció jeleit mutatják morfológiailag. 21. ábra. EpCAM és Ly51 expressziójának M

vizsgálata

kontroll és DX-nal kezelt

K

egerek fagyasztott thymus metszetein (24, 72 és 168 órával az injekció után)

K M

immunfluoreszcenciával. 24 órával a DX-kezelés után csökkent EpCAM és Ly51

K

expresszió látszik, amely a M

cortex (K) és a medulla (M) érintettségét jelzi.

M

K

39

A továbbiakban a thymus epithelsejteken expresszálódó, a T-sejt fejlődést befolyásoló fehérjéket vizsgáltunk morfológiai szempontból a thymus epithelsejteken. Az MHC II jelenléte a thymus epithelialis sejteken fontos a megfelelő T-sejt készlet kialakításához [74], ezért vizsgáltuk expressziójának változását immunfluoreszcenciával. Az MHC II molekula (vörös) expresszió csökkenését 24 órával a DX kezelés után detektáltuk a thymus epithelsejteken (EpCAM-festést is alkalmazva).

22.

ábra.

epithelialis

Thymus sejteken

+

(EpCAM ,

zöld

kompartment) az MHC II (vörös)

csökkenése

24

órával a nagydózisú DXkezelés után in vivo. Az ábra

egy

képsorozatot

reprezentatív mutat

a

háromból.

Másik jelöltünk a Wnt-4 glikoprotein volt, melyről kimutatták, hogy a thymus epithelsejtek identitását meghatározó transzkripciós faktor, a Foxn1 expresszióját szabályozza [48]. A Wnt-molekulák szolubilis faktorként szintén elengedhetetlenek a thymus epithelium integritásának fenntartása szempontjából [48] (lásd Bevezetés 2.5 A thymus fejlődése és sejtes összetevői). A Wnt-ok közül a legnagyobb mennyiségben a Wnt4 termelődik a thymusban [64], ami fontos a thymus cellularitásának fenntartásában [127], ezért

jelen

munkánkban

is

ennek

az

expressziós

szintjét

vizsgáltuk

immunfluoreszcenciával. Az MHC II-höz hasonlóan EpCAM-festés (zöld) mellett a Wnt4 csökkent szintjjét (vörös) találtuk a thymus epithelsejteken.

23. ábra. A Wnt-4 (vörös) expressziójának csökkenése 24 órával a DX-injekció után thymus

epithelsejteken

kompartment)

in

reprezentatív

képsorozatot

háromból.

40

vivo.

(EpCAM+, Az

ábra mutat

zöld egy a

5.8. Génexpressziós változások a thymus epitheliumban DX-kezelés hatására Ezen morfológiai eltérések mellett, real-time PCR analízissel tisztított epithelialis sejtekben csökkent Foxn1 expressziót találtunk 24 óra után, amely érdekes módon nem érte el a kontroll értékét 1 héttel a kezelés után sem (24. ábra A). Továbbá csökkent keratin (K) 5, 8, 14 és 18 (a thymus epithelialis sejtek főbb markerei) mRNS-szinteket mértünk 24 órával a DX-kezelés után (24. ábra B). Ezen molekulák csökkent szintje is arra utal, hogy a DX-kezelés alapvetően megváltoztatja a thymus epithelialis sejtek fenotípusát és differenciálódási programját, mivel a Foxn1 és keratin molekulák expressziója a thymus epithelsejtek identitásának indikátora. A

B

24. ábra. Kontroll és DX-kezelt állatok thymus epitheliumának Foxn1 (A) K5, K8, K14 és K18 expressziója (B). Az oszlopdiagramok 3 kísérlet átlagát ± SD –át mutatják a kontroll (fehér), 24 (fekete) és 168 órával (szürke) az egyszeri DX beadása után a kezelt csoportokban. A függőleges tengely a 18S rRNS génre vonatkoztatott relatív génexpressziót mutatja.

A továbbiakban azon molekulák expresszióját vizsgáltuk a thymus epitheliumban, amelyeknek fontos szerepe lehet a T-sejtek fejlődése szempontjából. Az AIRE (autoimmune regulator), MHC I (H2D1-ként jelöltük) és CIITA (az MHC II expresszióját szabályozó transzaktivátor) molekuláknak fontos szerepük van abban, hogy autoreaktív T sejtek ne kerülhessenek ki a thymusból. Az AIRE transzkripciós faktor a velőállományban található epithelialis sejteken expresszálódik és thymuson kívüli szöveti antigének expresszióját szabályozza a thymusban, melyek a negatív szelekcióban játszanak szerepet (lásd: Bevezetés 2.5.2.2. negatív szelekció fejezete). Az AIRE, H2D1, CIITA, valamint az IL-7 expressziója (amely a thymusban a T-sejt előalakok proliferációját szabályozza) lecsökkent 24 órával a DX-kezelés után az epithelialis sejtekben, azonban 1 hét alatt mRNS szintjük visszatért a kezdeti szint közelébe (25. ábra).

41

25. ábra. Kontroll és DX-kezelt állatok AIRE,

thymus H2D1,

epitheliumának CIITA

és

IL-7

expresszióját real-time PCR-ral vizsgáltuk. Az oszlopdiagramok 3 kísérlet átlagát ± SD–át mutatják a kontroll (fehér), 24 (fekete) és 168 órával (szürke) az egyszeri DX kezelést

követően

csoportokban. tengely

a

a

A 18S

kezelt

függőleges rRNS

vonatkoztatott

génre relatív

génexpressziót mutatja.

A Foxn1 transzkripciós faktor alapvető fontosságú a thymus fejlődése szempontjából és minden thymus epithelsejt expresszálja [47]. A Wnt-4 és a Foxn1 közötti szoros kapcsolatot már megemlítettük a Bevezetésben és az előző fejezetben. A Wnt-4 szintje, a Foxn1 expressziós mintázatához és az immunfluoreszcenciával kapott eredményekhez hasonlóan csökkent 24 órával a DX-kezelés után és 1 hét után sem mutatott növekedést (26. ábra).

26. ábra. Kontroll és DX-kezelt állatok thymus epitheliumának Wnt-4 expressziója. Az oszlopdiagramok 3 kísérlet átlagát ± SD – át mutatják a kontroll (fehér), 24 (fekete) és 168 órával (szürke) az egyszeri DX kezelést követően a kezelt csoportokban. A függőleges tengely a 18S rRNS génre vonatkoztatott relatív génexpressziót mutatja.

5.9. A GC-expozició funkcionális következménye a thymus epitheliumra: csökken a T-sejt fejlődést támogató képesség Miután megvizsgáltuk a T-sejt fejlődés egyes molekuláris összetevőit, kíváncsiak voltunk arra, hogy a thymus epithelsejtek funkciója miként változik DX-kezelés hatására, azaz hogyan képesek érett T-sejteket generálni. Erre a reaggregált thymus szerv kultúra (RTOC) módszerét alkalmaztuk, amely során 200 ezer epithelsejtet és 50 ezer TN

42

thymocytát centrifugáltunk össze és 1 hétig inkubáltuk őket in vitro. Egy hét után a kultúrákból thymocytákat izoláltunk és sejtfelszíni CD4-CD8 festést végeztünk, hogy a thymocyta alcsoportok összetételét vizsgáljuk áramlási citométerrel. A DX-kezelt egerekből izolált epithelsejtek nem voltak képesek arra, hogy érett SP sejteket generáljanak, a kísérlet végén is csak DN sejtek voltak kimutathatók (27. ábra B, jobb oldal), míg a kontroll kultúrákban a thymocyta differenciáció a normál thymushoz hasonlóan zajlott (27. ábra B, középen). Ahhoz, hogy az RTOC-kból izolált thymocyta alcsoportokat ábrázoló dot-plotokat megfelelően értékelni tudjuk, párhuzamosan fiatal egérből thymocytákat izoláltunk és CD4-CD8 kettős jelölést végeztünk, amelynek egy reprezentatív eredménye a 27. ábra B részén baloldalt látható (festési kontroll).

A

B

Festési kontroll

RTOC Ktrl

DX

27. ábra.: DX-kezelt és kontroll állatok thymusából izolált thymus epithelsejtekből és DN thymocytákból reaggregált thymus szerv kultúra eredményének áramlási citometriás analízise. Az (A) panelen a DN thymocyták egy reprezentatív dot-plotja látható (a kultúra kezdetén). A (B) panelen egy festési kontroll thymocyta CD4/CD8 profil (bal oldalon), illetve az RTOC-kból 7 nap után izolált thymocyták CD4 és CD8 expressziója látható (jobb oldali panelek).

43

6. ÖSSZEFOGLALÁS, MEGBESZÉLÉS Kísérleteink során annak a már ismert ténynek mechanizmusát kerestük, hogy a thymusban fejlődő DP-sejtek GC-érzékenysége mely tényezőkkel függhet össze. Kiindulási pontként egyrészt saját korábbi eredményeinket használtuk fel, hogy annak ellenére, hogy a DP sejtek a legérzékenyebbek a GC-indukált apoptózisra, mégis bennük fejeződik ki a legalacsonyabb szinten a GR, tehát a GR expresszió szintje nem korrelál az apoptózis érzékenységgel. Másrészt irodalmi adatok szerint a GC-indukált apoptózisra érzékeny limfoid eredetű tumorsejt-vonalakban a GR a mitokondriumba is transzlokálódik ligandkötés hatására [21, 22]. Munkánk másik részében vizsgáltuk, hogy a terápiásan adott GC-k milyen hatást fejthetnek ki a thymus epithelsejtekre in vivo, melyek közeli kölcsönhatásban vannak a DP sejtekkel is. A GR ligandkötés nélkül a citoplazmában a Hsp-90 kliensfehérjét is tartalmazó multimolekuláris komplexhez kötődik, majd ligandkötés hatására arról leválva további jelátviteli eseményeket indít el (lásd Bevezetés 2.3. A glukokortikoid receptor jelátviteli útvonalak áttekintése), ezek egyike a mitokondriális transzlokáció. Eredményeink szerint a DP-thymocytákban rövididejű, nagydózisú in vitro szteroidkezelés hatására a GR főleg a mitokondriumba transzlokálódik. Továbbra sem ismert azonban annak a mechanizmusa, hogy milyen módon transzportálódik a GR a mitokondriumba. A GR ligandkötő doménjében (az 558-580 aminosavak között) leírtak olyan motívumokat, melyek hasonlóak a citokróm C oxidáz szekvenciájában található mitokondriális lokalizációs szignálhoz (Bevezetés 2.3.2.4 A GR mitokondriális transzlokációja, 3. ábra). Továbbá, GR-t nem expresszáló sejtvonalakba ilyen mitokondriális lokalizációs szignált is tartalmazó GR-t kódoló plazmidokat transzfektáltak, amelyekben az expresszálódó GR csak a mitokondriumba képes transzlokálódni, a sejtmagba viszont nem [21, 22]. Ezek a GR-variánsok ligandkötés hatására kivétel nélkül apoptózist okoztak. A GR pontosabb elhelyezkedését vizsgálva, GC-érzékeny sejtvonalakban, a GR a mitokondriális belső membránból kimutatható volt [21]. Meglepő módon, kezeletlen DP-sejtekben is megfigyelhető volt konfokális mikroszkópiával alacsony szintű GR-mitokondrium kolokalizáció, melyet már a DP-sejtek granuláris GR-festődési mintázata is felvetett. Ezek alapján a GR akár ligand-independens módon is jelen lehet a mitokondriumban [29], vagy mivel a DP sejtek a thymusban GC-gazdag mikrokörnyezetben helyezkednek el [102], ez szintén hozzájárulhat a mitokondriális lokalizációhoz.

44

A mitokondriumok fontos szerepet töltenek be az apoptotikus jelátviteli események során a jelek fogadásában és a sejthalál végső fázisának a lebonyolításában [128]. A GCindukálta apoptózis során eddigi irodalmi adatok alapján a mitokondriumnak is fontos szerepe lehet [95] (ld. Bevezetés 2.6. fejezete: A GC-k hatása T-sejteken és a thymusban). A thymocyta apoptózis során ceramid képződik, a mitokondriumban pedig jelentős mennyiségű szfingomielin-készlet található [129], amely hozzájárulhat a kaszpáz-kaszkád beindításához. A ceramidok aktiválják a protein foszfatáz 2A (PP2A) fehérjét, amely végül defoszforilálja a Bcl-2 fehérjét és ez apoptózishoz vezet [130]. Az apoptózis mitokondriális útvonala során oxigén-szabadgyökök képződnek, amit DX-indukálta thymocyta apoptózis vizsgálatokban is megerősítettek [131]. Kimutatták, hogy thymocyták mitokondriumában a komplex 3 termeli ezeket az oxigén-szabadgyököket az ubiquinone ciklusban [131]. Az előbb említett rendszerben fontos szerepe van a proteoszómák aktivitásának is: a Bcl-2 fehérjecsalád és az IAP (inhibitors of apoptosis proteins) molekula degradációja során a mitokondriális membrán permeabilitása fokozódik. Ennek további bizonyítéka, hogy az apoptózist a proteoszóma működésének gátlásával ki lehetett védeni. Korábbi munkánk során azt is kimutattuk, hogy magas dózisú DX T-sejt receptor transzgenikus egér thymusában, a túlélő DP-sejtekben megnövelte az antiapoptikus Bcl-2 szintjét, mely szintén a mitokondrium érintettségére utal ebben a folyamatban [100]. Mindezek az irodalmi adatok és saját előzetes eredményeink is [100] arra utalnak, hogy a GC-indukálta apoptózis közvetlenül a mitokondriumot célozza meg. Annak feltérképezéséhez, hogy a GR pontosan milyen mechanizmussal okozhat apoptózist a mitokondriális transzlokáció során, további vizsgálatok szükségesek. Mivel a GR 30 perc alatt transzlokálódott a mitokondriumba DP-sejtekben és ennek következményeként

nem-genomikus

úton

lecsökkentette

a

mitokondriális

membránpotenciált (ld. Bevezetés 2.3.2.4. fejezet, A GR mitokondriális transzlokációja), feltételezzük, hogy GC-indukálta DP-thymocyta apoptózis során a GR inkább fehérjefehérje kölcsönhatások útján fejti ki hatását és nem a mitokondriális DNS-hez kötődik. Rövid idejű, nagy dózisú methylprednisolone szintén csökkentette a mitokondriális funkciót concanavalin A-val stimulált patkány thymocytákon [14, 132], így lehetséges, hogy a GC-k ugyanazon a nemgenomikus módon hatnak a legtöbb GC-érzékeny sejtvonalra. Neuronokban (az idegszövetet érzékenyen érinti a stresszreguláció, így a GC-k is) a közelmúltban írták le, hogy a GR a citoplazmában asszociálódik a Bcl-2-vel, majd ez a komplex ligandkötés hatására a mitokondriumba transzlokálódik [133]. A Nur77 magreceptor, amelynek jelátvitele fontos szerepet játszik a thymocyták negatív szelekciója 45

során [134], mitokondriális transzlokációja szintén képes apoptózist kiváltani úgy, hogy a Bcl-2 fehérjét proapoptotikus fehérjévé konvertálja [37]. Feltételezzük, hogy hasonló mechanizmussal, a Bcl-2 fehérjecsalád tagjaival való kapcsolódáson keresztül okozhat apoptózist thymocytákban a mitokondriális GR is. További lehetséges fehérjepartner a GR mitokondriális transzlokációja során valamelyik hősokkfehérje lehet, hiszen a GR a citoplazmában a Hsp-90 és egyéb más hősokkfehérjékhez

kötődik,

ligandkötés

hatására

azokról

disszociálódik.

A

mitokondriumban is történhet ilyen asszociáció valamely másik hősokkfehérjével (Hsp-60, Hsp-70). Előzetes eredményeink arra utalnak, hogy a GR a mitokondriumban a Hsp-60 hősokkfehérjével és a Bak proapoptikus fehérjével kapcsolódik össze, de ez még további megerősítést igényel. Mindezek alapján úgy gondoljuk, hogy a mitokondriális GR által elindított jelátviteli folyamatokban tehát feltehetőleg mind a Bcl-2 fehérjecsalád tagjainak, mind a hősokkfehérjéknek fontos szerepe lehet. A mitokondriumban található hősokkfehérjék közül a Hsp-60 a mitokondrium belső membránjában található és a mitokondriumba történő fehérjeimportban segédkezik [135]. A Hsp-60 a legújabb adatok szerint egy Janus-arcú hősokkfehérje, mivel viselkedhet pro- és antiapoptotikus mediátorként

is

az

apoptotikus

stimulustól

és

sejttípustól

függően

[136].

A

cardiomyocytákat például úgy védi a programozott sejthaláltól, hogy komplexet képez a proapoptotikus Bax fehérjével és meggátolja annak áthelyeződését a mitokondrium külső membránjába [137]. Ezzel ellentétben, HeLa- és Jurkat-sejtvonalon végzett kísérletekben a Hsp-60 a kaszpáz-3-mal kapcsolódott össze, az apoptózis további eseményeit elősegítve [138]. További kísérletek elvégzését tervezzük annak kiderítésére, hogy a Hsp-60 milyen hatást fejt ki a GC-indukálta apoptózis során DP-thymocytákban. A

fenti

fehérje

interakciók

mellett

a

GR

a

klasszikus

sejtmagi

hatásmechanizmusához hasonlóan a mitokondriumba transzlokálódva kötődhet a DNS-hez ligandaktivált transzkripciós faktorként, illetve más transzkripciós faktorokhoz (pl. NF-κB) is. A mitokondriális genomban leírtak a GRE-hez hasonló szekvenciákat [23], illetve a magi transzkripciós faktorok közül néhányat (NFAT, NF-κB) különböző sejtvonalak mitokondriumában is azonosítottak (Bevezetés a 2.3.2.4. a GR mitokondriális transzlokációja fejezete) [25]. Nemrég leírták, hogy HEK-293 sejtvonalban a mitokondriális GR összekapcsolódik a thioredoxin-2 fehérjével [26]. A kapcsolódás következményeképp fokozódik a mitokondriális oxidatív foszforilációt irányító enzimek génjeinek átírása és a légzési lánc funkciója. Ebben a kísérletsorozatban a GR az NF-κB transzkripciós faktorhoz is kötődőtt a mitokondriumban, mert az NF-κB eredetileg gátolja 46

a mitokondriális oxidatív foszforilációt. Mivel a DP-thymocytákban kb. 30 perc alatt már jelentős mértékű mitokondriális GR-transzlokáció látszik, illetve a membránpotenciál is lecsökken, így kevésbé valószínű, hogy a GR a mitokondriális DNS-hez kötődve fejtené ki proapoptotikus hatását. A GR-nek, ahogy a bevezetésben részletesebben bemutatásra került, több tirozin és szerin foszforilációs helye is van. A GR megfelelő szerinmaradékokon történő foszforilációja szintén szerepet játszhat abban, hogy bizonyos sejttípusokban, így a DP thymocytákban a GR csak a mitokondriumba és nem a sejtmagba transzlokálódik. Hasonló jelenséget figyeltek meg az előbb is említett Nur77 esetében, melyet a thymocyta, illetve T-sejt apoptózis során a megfelelő szerinmaradékon történő foszforiláció irányít a mitokondriumba [139]. Előzőleg patkány agyszövetben (prefrontális agykéreg és hippocampus) pontosan jellemezték a GR-foszfoizoformák eloszlását az intracelluláris kompartmentekben [140] különböző stresszingerek hatására. Krónikus izoláció hatására a GR a 232-es szerinen foszforilálódott (ezen a szerinmaradékon a GR-t a ciklin-dependens kinázok foszforilálják, viszont az egér, a patkány és a humán foszforilációs helyek különböznek) és a mitokondriumba transzlokálódott, valamint ott a citokróm oxidáz gének expresszióját modulálta. Jelenleg thymocytákban nem ismert a GR szerin-foszfoizoformák eloszlása. Újabb, a mitokondriumok és a T-sejt jelátvitel összefonódására utaló érdekes eredmény, hogy a T-sejt aktiváció során a mitokondriumok T-sejtekben az immunológiai szinapszis köré csoportosulnak [141, 142]. Ez a transzlokáció kalcium-beáramlás dependens módon történik, de nem függ a kalcium-beáramlás pontos helyétől a mebránban. Az apoptotikus stimulusok során az endoplazmatikus retikulumból kiáramló kalciumot nagyrészt a mitokondrium veszi fel, ez mitokondriális duzzadást, valamint az átmenetileg permeabilitást biztosító pórus (permeability transition pore-PTP) megnyitását eredményezi [143], amely végül beindítja az apoptotikus kaszkádot. Nem ismert, hogy a rövididejű, nagy dózisú DX-kezelés befolyásolja-e a mitokondriumok polarizációját a Tsejt receptor körül, illetve arról sincs adat, hogy a DX hogyan hat thymocytákban a mitokondriális kalcium-homeosztázisra rövid és hosszú távon. Munkánk első részének eredményeit összefoglalva, adataink új információt nyújtanak az éretlen DP-thymocyták fokozott GC-érzékenységéről, melynek hátterében az egyik tényező a GR mitokondriális transzlokációja lehet, amely egy új alternatív GRjelátviteli útként különösen fontos lehet a thymocyták szelekciós folyamatainak és a GCindukálta apoptózis mechanizmusainak részletesebb megismerésében. Tekintettel arra, 47

hogy a thymocyták DX-indukálta apoptózis molekuláris mediátorairól sok, részben ellentmondásos adat gyűlt össze (Bevezetés 2.6. fejezet A GC hatások a T-sejteken és a thymusban fejezet, 4. táblázat), melyek szinte kivétel nélkül a teljes thymocyta populációkon (kb. 75-80%-a DP-sejt, 10-15%-a CD4+ SP-sejt vad-típusú egérben [122]) végzett vizsgálatokból származnak, ezért különösen fontosnak tarjuk, hogy jelen munkában az egyes thymocyta alcsoportokat elkülönítve vizsgáltuk. Vizsgálatsorozatunk második részének eredményei alapján megállapítottuk, hogy a thymocyták GC-indukálta masszív apoptózisa mellett a T-sejt szelekciós lépéseket irányító TEC-ek DX hatására károsodnak, képességük a T-sejt fejlődés szabályozására csökken. Mindezek hátterében molekuláris szinten főként a Wnt-4 molekula és a FoxN1 transzkripciós faktor expresszió csökkenése állhat más gének expresszióváltozása mellett, ami rámutat a terápiásan alkalmazott GC-k egy új hatására a thymusban, valamint új információkkal szolgál a DX-indukálta akut thymus involúció molekuláris és celluláris mechanizmusainak megértésében. Mivel a GR több más szerv epithelialis kompartmentjében (tüdő [126] és bőr [125]) expresszálódik és fontos szerepet tölt be azok integritásának fenntartásában, ezért megvizsgáltuk, hogy a thymusban a thymocytákon kívül a TEC-kompartmentben is expresszálódik-e. mRNS és fehérje (immunfluoreszcencia) szinten is igazoltuk, hogy a TEC-ek expresszálják a GR-t, tehát az általunk megfigyelt magas dózisú DX-kezelés által kiváltott hatások a TEC-eken nagy valószínűséggel közvetlenek lehetnek. Azonban nem elhanyagolható a „thymic crosstalk” [144, 145] sem, vagyis a thymocyta-thymus epithelsejt kapcsolat - „párbeszéd” - elmaradásából eredő következmények sem, melyek a thymocyták GC-indukálta apoptózisából származhatnak. Ennek során a thymocytákból a GC-indukálta apoptózis során toxikus metabolitok szabadulhatnak fel, ami negatívan hathat a TEC funkciókra. Kísérleteink során egyszeri, magas dózisú, az autoimmun kórképekben terápiás protokollként alkalmazott, szteroid lökésterápiának megfelelő adagú kortikoszteroidinjekciót adtunk az egereknek [146]. Jelen munkánkban nem vizsgáltuk, hogy milyen hatással van a strómaelemekre (különös tekintettel a TEC-ekre) az alacsony dózisú (in vivo 1-2 mg/kg, az általunk használt adag 20 mg/kg volt) DX. Irodalmi adatok alapján az alacsony dózisban alkalmazott DX tolerogén hatású is lehet: DC-T-sejt interakció során elősegítheti a regulátoros T-sejtek indukcióját [147, 148]. Laboratóriumunkban elvégzett kísérletek alapján az exogén alacsony dózisú DX elősegíti a thymocyták pozitív 48

szelekcióját T-sejt receptor transzgenikus egérmodellben [101] a CD69-expresszió növekedését előidézve. Szintén nem vizsgáltuk a nagy dózisú DX kezelésnak a thymus más fontos stróma elemeire (DC-k, fibroblastok) gyakorolt hatásait, bár a TEC-eken kívül a thymus többi strómasejtje, köztük a DC-k [149], valamint a fibroblastok is expresszálnak GR-t [150]. A thymus DC-k működését negatívan befolyásolják a GC-k [149], a thymus fibroblastokról azonban jelenleg nem áll rendelkezésre információ. A thymusban lévő DC-k, a TEC-ekkel együtt fontos szerepet töltenek a T-sejtek szelekciós folyamataiban és a centrális T-sejt tolerancia kialakításában [151]. Thymus DC-ket DX-nal kezelve csökkent citokin szekréciós kapacitást találtak (IL-1β és TNFα-downreguláció), valamint csökkent a sejtfelszíni CD80 adhéziós molekula szintje [149]. A DC-ken más adhéziós molekulák (CD86) szintje nem változott szignifikánsan, azonban fontos megjegyezni, hogy ezek az eredmények az in vitro fiziológiás dózisú DX (10-8 M) hatásait tükrözik [149]. Kevés adat van arról, hogy a thymusban lévő fibroblastok egész pontosan milyen szerepet töltenek be a T-sejt fejlődés során, ennek ellenére a TEC-k és a DC-k mögött „harmadik szereplőként” sorolják fel őket [152]. A thymus előbb említett mesenchymális elemei különböző inzulinszerű- és fibroblast-eredetű növekedési faktorokat, az IGF-1-et és IGF-2-t, valamint az FGF-7-et és a FGF-10-et termelnek [153, 154], ezért fontosak a TEC proliferáció és differenciálódás szabályozása szempontjából. A fibroblastok fontos szekretálói lehetnek ezeknek a molekuláknak, melyek többek között a thymus regenerációját irányíthatják, illetve különböző kemokineket (CCL19, CCL21) is termelhetnek. Eredményeink szerint nagy dózisú GC-k hatására a TEC-ek differenciálódási programja megváltozik, hiszen a TEC-alcsoportokra jellemző egyes keratinmolekulák (K5 a cTEC, K8 az mTEC markere, továbbá a K14 és a K18 is, amelyek közül a K14 a medulla belső részén található TEC-ekben, a K18 pedig főleg a kéreg alatti és kéreg-velő határon lokalizálódó TEC-ekben expresszálódik) expressziója csökken, a Foxn1 mRNS szintjével együtt. A Wnt-4 ismeretlen jelátviteli lépéseken keresztül szabályozza a Foxn1 szintjét a thymusban [48], tehát a két molekula expressziós mintázata szorosan összefügg, amit a mi jelen méréseink is alátámasztottak. A Foxn1 transzkripciós faktor szükséges a thymus zavartalan fejlődéséhez, de a thymus posztnatális fejlődésében betöltött szerepe nem teljesen tisztázott (ld. Bevezetés 2.5 A thymus fejlődése és sejtes összetevői fejezete). Nemrég azonban kiderült, hogy a FoxN1 a thymus posztnatális fejlődésének fenntartásához is szükséges (a FoxN1 expressziójának csökkenése indukálható transzgén 49

rendszerben a thymus epithelialis kompartmentjének degenerációját és így csökkent T-sejt számot eredményezett), azonban a Wnt-4 szerepét ezekben a kísérletekben nem vizsgálták [49, 50]. Továbbá, a Foxn1 kondícionális kiütésével (K5 és K18 promoterek által vezérelve) létrehozott transzgenikus egerek thymusában leginkább a medulláris epithelialis kompartment organizációja szenvedett defektust, összehasonlítva a cortexével [50]. A DX-kezelt egérből izolált thymus epithelsejtek egy hét alatt nem voltak képesek arra, hogy érett SP-sejteket generáljanak in vitro T-sejt fejlődés modellben (RTOC), amelynek hátterében valószínűleg a fenti génexpressziós változások állhatnak. Valószínű, hogy a blokád a DN-DP stádium közötti korai átmenetnél lehet, mivel a DP-sejtek száma szignifikánsan csökkent. A Wnt-glikoproteinek nélkülözhetetlen szolubilis faktorok a Tsejt fejlődés korai stádiumában. A Wnt-molekulák több alapvető biológiai folyamatot szabályoznak a thymuson kívül és belül: fontos szerepet töltenek be a thymus fejlődésében [155], a haematopoesisben [156] és a T-sejt differenciálódásban [157]. Továbbá a Wntmolekulák

expressziócsökkenése

valamint

antagonistáik

(Klotho-molekula)

megnövekedett expressziója szerepet játszik az öregedés folyamatainak elindításában is [158]. A Wnt-4 fordul elő legnagyobb mennyiségben a thymusban [64], ami fontos a thymus cellularitásának szabályozásában [127] és a korai limfoid progenitorok expanziójában [156]. Ezért az, hogy jelen RTOC-rendszerünkben a TN-sejtekből (CD3CD4-CD8-) nem tapasztaltuk DP-sejtek kiérését számottevően, egyrészt közvetlenül a Wnt4 expresszió csökkenésére vezethető vissza. Másik lehetséges magyarázat, hogy a Wnt-4 hiánya a T-cell factor 1 (Tcf1)/Lymphoid enhancing factor 1 (Lef1) transzkripciós faktorok aktivitás csökkenéséhez vezet. Ezen transzkripciós faktorok időzített expressziója a T-sejt fejlődés korai szakaszában a DN-DP átmenethez elengedhetetlen [157]. A DX direkt és indirekt módon is csökkentheti a Wnt-4 expresszióját: indirekt módon a Wnt-antagonista szekretált fehérje, a Dickkopf-1 (Dkk-1) expressziójának növelésén keresztül, ahogy azt csontszövetben és osteoblastokon végzett kísérletek eredményei alapján leírták [159, 160]. A Dkk-1 jelentőségét thymus szerkezet fenntartása szempontjából is bizonyították: a Dkk1-t indukálható rendszerben overexpresszáló egér thymusában kevesebb a TEC-progenitor, valamint jelentősen csökkent az összes TEC-alcsoport száma (a cTEC és az mTEC-é is), a kéreg-velő megfelelő organizációja zavart szenved, a thymus pedig súlyos fokban degenerált lesz [161]. A TEC-ekben zajló GC expozícióra bekövetkező finom jelátviteli változások és fehérje-, valamint géncélpontok azonosításához azonban további kísérletek elvégzése szükséges.

50

Érdekes és fontos további kérdés a thymus regenerációja nagy dózisú GC kezelés után. A fentiek alapján a GC-k ugyan csökkentik a TEC funkcióit, de aztán bizonyos fokú regeneráció tapasztalható a vizsgált egy hetes intervallumon belül: bizonyos gének expressziója visszatér a kontroll szintre (AIRE, IL-7, MHC II), egyeseké viszont nem (Foxn1, Wnt-4). Egyrészt lehetséges, hogy a thymus teljes regenerációjához egy hétnél több

időre

van

szükség

(további

időpontok

vizsgálata

folyamatban

van

laboratóriumunkban), másrészt, az egyszer adott nagy GC-dózis maradandó károsodást is okozhat a TEC-ekben, illetve leállíthatja a TEC differenciálódási programját. A thymus regenerációról továbbá régóta ismert [92, 93, 100], hogy a DX kiváltotta in vivo DPthymocyta depléciót (már 4 órán belül mérhető) a DP-sejtek visszapótlódása követi, amely már a DX beadása utáni 5. napon megkezdődik, és fokozatosan visszatér kb. két héten belül, mely azt mutatja, hogy a thymocyták képesek repopulálni a thymust [162]. Ez egyben arra is utalhat, hogy in vivo a TEC regeneráció is megtörténik. Továbbra is ismeretlen azonban a thymus DX-ablációját követő regeneráció celluláris mechanizmusának azon része, hogy milyen módon pótlódnak vissza és milyen fenotípusváltozáson mennek keresztül a TEC-ek. A bevezetésben említett K5+K8+ TEC progenitorok lehetséges, hogy ebben az esetben a meglévő készletből pótolják az elpusztult sejteket [163]. Mivel az RTOC rendszerünk strómakomponense csak EpCAM+-TEC sejtekből tevődött össze és más strómasejtek nem voltak benne (DC-k, fibroblastok), feltehető, hogy a thymus és a TEC teljes regenerációjához az általuk biztosított megfelelő szöveti architektúra és faktorok is szükségesek. Eredményeink szerint a DX-kezelt egerekből izolált TEC in vitro 7 nap alatt nem volt képes érett T-sejteket generálni. A TEC viszont in vivo morfológiailag (EpCAM-expresszió visszatérése immunfluoreszcenciával) és mRNS-szinten is regenerációs jeleket (az AIRE, MHC II, IL-7 expresszió visszatérése 7 nap után) mutatott. A korábban említett mesenchyma-eredetű faktorok (FGF-ek, IGF-ek) (Bevezetés

2.5.1.

A

thymus

epithelialis

sejtek

(TEC)

és

a

cortex-medulla

kompartmentalizáció c. fejezete) is szükségesek a thymusban a TEC kompartment fenntartásához, így nagyon valószínű, hogy ezek hiányában a regeneráció sem lehet teljes. A thymus regeneráció kérdése azért igen jelentős, mert a különböző kórképekben alkalmazott terápiás eljárások során (radioaktív besugárzás, citosztatikus terápia, csontvelőtranszplantáció, graft-versus-host reakció és ezzel együtt a nagydózisú kortikoszteroid-therápia) fellépő thymus működés csökkenés komoly klinikai problémát jelent [164]. A fiziológiás öregedés folyamatában a thymus funkció csökkenése pedig jelentősen hozzájárulhat az autoimmun betegségek és különböző fertőző betegségek 51

gyakoribb előfordulásához [164]. Ezért jelenleg is sok kutatócsoport próbálkozik olyan T sejt pótló terápiás eljárások kifejlesztésével és alkalmazásával, melyekkel a thymus és ezzel együtt a TEC működését helyre lehetne állítani. Ez főleg különböző növekedési faktorok és citokinek adását jelenti (KGF, IL-7, IL-12, IL-15), de vannak más lehetőségek is (adoptív T-sejt traszfer). Ezek közül eddig a legígéretesebb eredmények a KGF-ral [165] és az IL-7-tel történő kezelések során születtek [166]. A KGF megegyezik az FGF-7 molekulával, amely a megbeszélés részben már korábban említésre került, mint a thymus mesenchymális elemei által szekretált és a TEC proliferációja és differenciálódása szempontjából fontos faktor. Természetesen jelen pillanatban még nem áll rendelkezésre univerzálisan használható hatékony thymus regenerációs eljárás, ezért különösen fontos minden olyan molekuláris szintű vizsgálat, amely ezzel a témával foglalkozik. Összefoglalva, munkánk során megállapítottuk, hogy a nagy dózisú GC kezelés hatása több szinten érvényesülhet a thymusban: a DP-thymocytákban masszív apoptózist vált ki (valószínűleg a nem-genomikus mitokondriális GR jelátvitelen keresztül); és a TEC-ek funkcióját károsítja (valószínűleg a Wnt-4 – FoxN1 szabályozási tengelyen keresztül). A thymusban zajló, DP-thymocytákat és TEC-et is érintő, nagydózisú GCexpozíció következményeiként fellépő molekuláris szintű folyamatokat az alábbi, 28. ábrán foglaljuk össze. Ezek alapján tovább szövődik a thymus epithelsejtek és a thymocyták közötti komplex molekuláris kölcsönhatások és finom jelátviteli útvonalak hálózata, hiszen a GC-indukálta változásoknak mind a thymus epithelsejtekben, mind a Tsejt prekurzorokban mélyreható térbeli és időbeli következményei vannak.

52

28. ábra. Nagy dózisú GC-expozíció hatására a thymusban bekövetkező molekuláris szintű folyamatok összefoglalása. A DP-thymocyták és a TEC-ek a T-sejt fejlődés során szoros kapcsolatban állnak egymással szolubilis faktorok és direkt sejt-sejt kapcsolatok révén. A DP-thymocyták fokozott GC-érzékenységének hátterében az egyik tényező a GR mitokondriális transzlokációja, amely a mitokondriumban feltehetőleg fehérje-fehérje kapcsolatokon keresztül okoz apoptózist. A célfehérjék a Hsp60, illetve a Bcl-2 fehérjecsalád proapoptotikus tagjai lehetnek (Bax, Bak). Irodalmi adatok alapján azonban nem zárható ki a mitokondriális génátírás szabályozása sem. A thymus fő strómasejtjei, a TEC működése szintén károsodik GC-k hatására: a T-sejt fejlődés fenntartásában fontos szerepet játszó gének expressziós szintje lecsökken (AIRE, MHC II és IL-7), de ezek 1 héttel a GC-kezelés után regenerációt mutatnak. A Wnt-4 és a Foxn1 gének expressziója azonban még 1 héttel a GC-kezelés után is alacsony marad. Mindezen gének expressziós szintjének változásai arra utalnak, hogy a GC-k befolyásolják a TEC differenciálódási programot.

53

7. Az új eredmények összefoglalása: 1. Morfológiailag jellemeztük a GR eloszlását a thymocyta populációkban amivel egyrészt alátámasztottuk eddigi áramlási cytometriával és real-time PCR-analízissel kapott adatainkat, másrészt megismertük a GR sejteken belüli pontosabb elhelyezkedését. 2. Kimutattuk, hogy a DP thymocytákban a GR ligandkötés hatására a mitokondriumba nem pedig a sejtmagba transzlokálódik, ezt a jelenséget konfokális mikroszkópiával és sejtfrakcionálás után Western-blottal is igazolni tudtuk. 3. Kontrol DP-sejtek mitokondirumában is megfigyelhető alap GR expresszió. 4. Megállapítottuk, hogy a DP-sejtekben a legalacsonyabb az alap mitokondriális membránpotenciál az összes thymocyta alcsoport közül. 5. Eredményeink szerint nagy dózisú, rövid idejű GC-kezelés DP-sejtekben a mitokondriális funkció romlásához vezet. 6. Igazoltuk mRNS- és fehérje szinten, hogy a thymus epithelsejtek GR-t expresszálnak. 7. In vivo nagy dózisú GC-kezelés negatívan befolyásolja a thymus epithelsejtek funkcióját, valamint a thymusban a kéreg-velő organizációt tönkreteszi. 8. In vivo nagy dózisú GC-kezelés hatására csökkent FoxN1 és keratin expressziót találtuk thymus epithelsejtekben, amely arra utal, hogy a thymus epithelsejtek differenciálódási programja a magas dózisú szteroid hatására megváltozik. 9. Továbbá, az epithel sejtekben a T-sejt fejlődéssel szoros kapcsolatban álló gének (AIRE, CIITA, MHC I, IL-7) expresszióját vizsgálva csökkent expressziós szinteket találtunk. 10. In vitro T-sejt fejlődés modellben, RTOC-ban kimutattuk, hogy az előzőleg in vivo DX-kezelésnek kitett TEC nem tudta teljes egészében támogatni a T-sejtek fejlődését

54

8. PUBLIKÁCIÓK: 8.1. A tézis alapját képező közlemények (összesített impakt faktoruk: 10,109): 1. Gergely Talabér, Ferenc Boldizsár, Domokos Bartis, László Pálinkás, Mariann Szabó, Gergely Berta, György Sétáló jr., Péter Németh, Timea Berki: Mitochondrial translocation of the glucocorticoid receptor in double-positive thymocytes correlates with their sensitivity to glucocorticoid-induced apoptosis. Int Immunol. 2009 Nov 21 (11): 1269-1276. [IF: 3,181*] 2. Ferenc Boldizsár, Gergely Talabér, Mariann Szabó, Domokos Bartis, László Pálinkás, Péter Németh, Timea Berki: Emerging pathways of non-genomic glucocorticoid (GC) signalling in T cells. Immunobiology 2009 Nov 9, epub ahead of print [IF: 3,464*] 3. László Pálinkás, Gergely Talabér, Ferenc Boldizsár, Domokos Bartis, Péter Németh, Timea Berki: Developmental shift in TcR-mediated rescue of thymocytes from glucocorticoid-induced apoptosis. Immunobiology 2008; 213 (1): 39-50. [IF: 3,464] 4. Gergely Talabér, Krisztián Kvell, Zoltán Varecza, Eric J. Jenkinson, Graham Anderson, Ferenc Boldizsár, Péter Németh, Timea Berki, Judit E. Pongrácz: Wnt-4 down-regulation is a characteristic feature of Dexamethasone (DX) induced reversible thymic epithelial depletion. (Publikációra előkészítve, Eur. J. Immunol.) *A legutóbbi (2008) elérhető impakt faktor adatok alapján. 8.2. Idézhető absztraktok: 1. Gergely Talabér, Ferenc Boldizsár, Domokos Bartis, László Pálinkás, Mariann Szabó, Péter Németh, Timea Berki: Mitochondrial translocation of the glucocorticoid receptor (GR) in double positive (DP) thymocytes might represent a novel apoptosis-regulating mechanism. Eur J Immunol, Vol. 39, S1, 2009

55

2. Mariann Szabo, Domokos Bartis, Krisztián Kvell, Tamás Czompoly, Gergely Talaber, Peter Nemeth, Timea Berki, Ferenc Boldizsar: Point mutations at various tyrosine residues in the ZAP-70 kinase influence TcR signaling and nongenomic glucocorticoid effects in Jurkat human T-cell line. Eur J Immunol, Vol. 39, S1, 2009 3. Domokos Bartis, Gergely Talabér, Judit Papp, Ferenc Boldizsár, Mariann Szabó, Péter Németh, Timea Berki: Non-genomic glucocorticoid hormone signal transduction effects on mast cells. Eur J Immunol, Vol. 39, S1, 2009 8.3. Könyvfejezet: Péter Engelmann, Gergely Talabér, Judit Bovári, Tamás Czömpöly, Krisztián Kvell, Timea Berki, Péter Németh: Fading Frontiers: The Way Innate Immune Cells and Molecular Components Affect Adaptive Immune Responses. In: New Research on Innate Immunity, Nova Science Publishers, 2008 8.4. Előadások:

Nemzetközi konferenciák: 1. Mariann Szabó, Ferenc Boldizsár, Domokos Bartis, Tamás Czömpöly, Krisztián Kvell, Gergely Talabér, Péter Németh, Timea Berki: Point mutations in various phosphorylation sites of the ZAP-70 kinase influence the T-cell signaling and rapid glucocorticoid effects in Jurkat human T cell line. 5th International Conference of Postgraduate Medical Students, Hradec Králové, Czech Republic, 2008 2. Gergely Talabér, Domokos Bartis, Ferenc Boldizsár, László Pálinkás, Mariann Szabó, Péter Németh, Timea Berki: New rapid action of glucocorticoids: the mitochondrial translocation of the glucocorticoid receptor. 4th International Summer School Immunogenetics, 2007, Pécs, Hungary 3. Gergely Talabér: Mitochondrial translocation of the glucocorticoid receptor (GR) in thymocytes underlies the mutually antagonistic signal model: ISCOMS 14th

56

International Student Congress of Medical Sciences, Groningen, The Netherlands, 2007

Hazai konferenciák: 1. Talabér Gergely, Boldizsár Ferenc, Bartis Domokos, Pálinkás László, Szabó Mariann, Németh Péter, Berki Timea: Egy új nemklasszikus szteroid hormon hatás: a mitokondriális glukokortikoid receptor timocitákban. Magyar Immunológiai Társaság Ifjúsági Konferenciája, 2009, Harkány 2. Berki Tímea, Bartis Domokos, Szabó Mariann, Talabér Gergely, Pálinkás László, Boldizsár Ferenc, Németh Péter: A glukokortikoid hormon gyors, nem genomikus hatásainak molekuláris mechanizmusai. 38. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg, 2008 3. Berki Timea, Talabér Gergely, Pálinkás László, Bartis Domokos, Boldizsár Ferenc, Németh Péter: A glukokortikoid receptor mitokondriális transzlokációjának szerepe a thymociták apoptózisában. 37. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg, 2007 8.5. Poszterek:

Nemzetközi konferenciák: 1. Gergely Talabér, Ferenc Boldizsár, Mariann Szabo, Domokos Bartis, Laszlo Palinkas, Peter Nemeth, Timea Berki: New glucocorticoid hormone signalling pathways in thymocyte selection and beyond. 7th International Congress on Autoimmunity, Ljubljana, 2010 2. Gergely Talabér, Ferenc Boldizsár, Domokos Bartis, Mariann Szabó, László Pálinkás, Péter Németh, Berki Timea: Mitochondrial translocation of the glucocorticoid receptor in double positive thymocytes and its possible role in thymocyte apoptosis. EMBO Nuclear Receptors Conference, Cavtat, Dubrovnik, 2009 57

3. Gergely Talabér, Domokos Bartis, Ferenc Boldizsár, Mariann Szabó, Péter Németh, Timea Berki: Short term glucocorticoid hormone treatment influences mast cell activation through non-genomic pathway. 15th efis-EJI Symposium on SIGNALS AND SIGNAL PROCESSING IN THE IMMUNE SYSTEM, Balatonoszod, Hungary, 2009 4. Gergely Talabér, Ferenc Boldizsár, Domokos Bartis, Mariann Szabó, László Pálinkás, Péter Németh, Timea Berki: Mitochondrial translocation of the glucocorticoid receptor (GR) in double positive (DP) thymocytes might represent a novel apoptosis regulating. 2nd European Congress of Immunology, Berlin, Germany, 2009 5. Gergely Talabér, Domokos Bartis, Ferenc Boldizsár,Mariann Szabó, László Pálinkás, Péter Németh, Timea Berki: The possible role of the mitochondrial glucocorticoid receptor in the differentation and apoptosis of thymocytes. XXIV. International ISAC Congress, Budapest, Hungary, 2008 6. Mariann Szabó, Domokos Bartis, Ferenc Boldizsár, Krisztián Kvell, Tamás Czömpöly, Gergely Talabér, Péter Németh, Timea Berki: Jurkat cells expressing ZAP-70 kinases with point mutations at phosphorylation sites show different calcium levels after CD3 crosslinking. XXIV. International ISAC Congress, Budapest, Hungary, 2008 7. Timea Berki, Domokos Bartis, Judit Papp, Mariann Szabó, Gergely Talabér, Ferenc Boldizsár, Péter Németh: Rapid non-genomic glucocorticoid effects on mast cells.XXIV. International ISAC Congress, Budapest, Hungary, 2008 8. Gergely Talabér, Ferenc Boldizsár, Domokos Bartis, László Pálinkás, Péter Németh and Timea Berki: Ligand induced mitochondrial translocation of the glucocorticoid receptor (GR) differs in thymocyte subpopulations. 14th EFIS-eji Symposium on Signals and Signal processing in the immune system, Balatonöszöd, Hungary, 2007

58

9. Gergely Talabér, László Pálinkás. Péter Németh, Timea Berki: Investigation of the thymic cytokines with multiplex microbead array: a possible role of the IL-5. 16th European Congress of Immunology, Paris, France, 2006. Hazai konferenciák: 1. Talabér Gergely, Boldizsár Ferenc, Bartis Domokos, Pálinkás László, Szabó Mariann, Németh Péter, Berki Timea: A glukokortikoid receptor (GR) mitokondriális transzlokációja kettős pozitív (DP) thymocytákban. 39. Membrán – Transzport Konferencia, 2009. Sümeg 2. Bartis Domokos, Talabér Gergely, Szabó Mariann, Papp Judit, Boldizsár Ferenc, Németh Péter, Berki Timea: Nem-genomikus glukokortikoid hormon hatások hasonlóságai és különbségei T-sejteken és hízósejteken. Magyar Immunológiai Társaság XXXVII. Vándorgyűlése, Budapest, 2008 3. Talabér Gergely, Bartis Domokos, Boldizsár Ferenc, Pálinkás László, Szabó Mariann, Németh Péter, Berki Timea: A glukokortikoid receptor mitokondriális transzlokációjának lehetséges szerepe a timocita apoptózis és szelekció során. Magyar Immunológiai Társaság XXXVII. Vándorgyűlése, Budapest, 2008 4. Szabó Mariann, Bartis Domokos, Boldizsár Ferenc, Talabér Gergely, Németh Péter, Berki Tímea: Rövid idejű, nagy dózisú glukokortikoid hormonkezelés nemgenomikus úton gátolja humán T helper sejtek aktivációját. 38. Membrán – Transzport Konferencia, 2008. Sümeg 5. Talabér Gergely, Bartis Domokos, Boldizsár Ferenc, Pálinkás László, Szabó Mariann, Németh Péter, Berki Tímea: Glükokortikoidreceptor mitochondrialis transzlokációjának mintázata heterogén a thymocytapopulációkban. Magyar Immunológiai Társaság XXXVI. Vándorgyűlése, Hajdúszoboszló, 2007 6. Bartis Domokos, Papp Judit, Szabó Mariann, Talabér Gergely, Boldizsár Ferenc, Németh Péter, Berki Tímea: A glükokortikoidhormon azonnali jelátviteli hatásainak in vitro vizsgálata patkány hízósejtvonalon. Magyar Immunológiai Társaság XXXVI. Vándorgyűlése, Hajdúszoboszló, 2007 59

7. Talabér Gergely, Pálinkás László, Németh Péter, Berki Timea: Hol találkoznak a kölcsönösen antagonista jelátviteli utak a timociták apoptózisa során? 36. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg, 2006 8. Pálinkás László, Talabér Gergely, Németh Péter, Berki Timea: A thymusban ható citokinek multiplex vizsgálata T-sejt receptor-transzgenikus egérmodellen. Magyar Immunológiai Társaság XXXV. Vándorgyűlése, Sopron, 2005 9. Talabér Gergely, Pálinkás László, Németh Péter, Berki Timea: A thymusban ható citokinek multiplex vizsgálata T-sejt receptor-transzgenikus egérmodellen. FACS User’s Meeting. Pécs, 2005 10. Pálinkás László, Talabér Gergely, Németh Péter, Berki Timea: A thymusban ható citokinek multiplex vizsgálata T-sejt receptor-transzgenikus egérmodellen. 35. Membrán – Transzport Konferencia, Sümeg, 2005

60

9. IRODALOMJEGYZÉK

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

13 14 15

Smoak, K. A. and Cidlowski, J. A., Mechanisms of glucocorticoid receptor signaling during inflammation. Mech Ageing Dev 2004. 125: 697-706. Jondal, M., Pazirandeh, A. and Okret, S., Different roles for glucocorticoids in thymocyte homeostasis? Trends Immunol 2004. 25: 595-600. Cima, I., Corazza, N., Dick, B., Fuhrer, A., Herren, S., Jakob, S., Ayuni, E., Mueller, C. and Brunner, T., Intestinal epithelial cells synthesize glucocorticoids and regulate T cell activation. J Exp Med 2004. 200: 1635-1646. Rhen, T. and Cidlowski, J. A., Antiinflammatory action of glucocorticoids--new mechanisms for old drugs. N Engl J Med 2005. 353: 1711-1723. Stahn, C., Lowenberg, M., Hommes, D. W. and Buttgereit, F., Molecular mechanisms of glucocorticoid action and selective glucocorticoid receptor agonists. Mol Cell Endocrinol 2007. 275: 71-78. Stolte, E. H., van Kemenade, B. M., Savelkoul, H. F. and Flik, G., Evolution of glucocorticoid receptors with different glucocorticoid sensitivity. J Endocrinol 2006. 190: 17-28. Galliher-Beckley, A. J. and Cidlowski, J. A., Emerging roles of glucocorticoid receptor phosphorylation in modulating glucocorticoid hormone action in health and disease. IUBMB Life 2009. 61: 979-986. Kalinyak, J. E., Dorin, R. I., Hoffman, A. R. and Perlman, A. J., Tissue-specific regulation of glucocorticoid receptor mRNA by dexamethasone. J Biol Chem 1987. 262: 10441-10444. Boldizsar, F., Talaber, G., Szabo, M., Bartis, D., Palinkas, L., Nemeth, P. and Berki, T., Emerging pathways of non-genomic glucocorticoid (GC) signalling in T cells. Immunobiology 2009. Lowenberg, M., Verhaar, A. P., van den Brink, G. R. and Hommes, D. W., Glucocorticoid signaling: a nongenomic mechanism for T-cell immunosuppression. Trends Mol Med 2007. 13: 158-163. Schoneveld, O. J., Gaemers, I. C. and Lamers, W. H., Mechanisms of glucocorticoid signalling. Biochim Biophys Acta 2004. 1680: 114-128. Stavreva, D. A., Wiench, M., John, S., Conway-Campbell, B. L., McKenna, M. A., Pooley, J. R., Johnson, T. A., Voss, T. C., Lightman, S. L. and Hager, G. L., Ultradian hormone stimulation induces glucocorticoid receptor-mediated pulses of gene transcription. Nat Cell Biol 2009. 11: 1093-1102. Buttgereit, F. and Scheffold, A., Rapid glucocorticoid effects on immune cells. Steroids 2002. 67: 529-534. Buttgereit, F., Burmester, G. R. and Brand, M. D., Bioenergetics of immune functions: fundamental and therapeutic aspects. Immunol Today 2000. 21: 192-199. Bartholome, B., Spies, C. M., Gaber, T., Schuchmann, S., Berki, T., Kunkel, D., Bienert, M., Radbruch, A., Burmester, G. R., Lauster, R., Scheffold, A. and Buttgereit, F., Membrane glucocorticoid receptors (mGCR) are expressed in

61

16

17 18

19

20

21 22 23 24 25 26

27 28

29

normal human peripheral blood mononuclear cells and up-regulated after in vitro stimulation and in patients with rheumatoid arthritis. Faseb J 2004. 18: 70-80. Tryc, A. B., Spies, C. M., Schneider, U., Kunkel, D., Berki, T., Sieper, J., Burmester, G. R., Radbruch, A., Scheffold, A. and Buttgereit, F., Membrane glucocorticoid receptor expression on peripheral blood mononuclear cells in patients with ankylosing spondylitis. J Rheumatol 2006. 33: 2249-2253. Bartis, D., Boldizsar, F., Szabo, M., Palinkas, L., Nemeth, P. and Berki, T., Dexamethasone induces rapid tyrosine-phosphorylation of ZAP-70 in Jurkat cells. J Steroid Biochem Mol Biol 2006. 98: 147-154. Bartis, D., Boldizsar, F., Kvell, K., Szabo, M., Palinkas, L., Nemeth, P., Monostori, E. and Berki, T., Intermolecular relations between the glucocorticoid receptor, ZAP-70 kinase, and Hsp-90. Biochem Biophys Res Commun 2007. 354: 253-258. Lowenberg, M., Verhaar, A. P., Bilderbeek, J., Marle, J., Buttgereit, F., Peppelenbosch, M. P., van Deventer, S. J. and Hommes, D. W., Glucocorticoids cause rapid dissociation of a T-cell-receptor-associated protein complex containing LCK and FYN. EMBO Rep 2006. 7: 1023-1029. Lowenberg, M., Tuynman, J., Bilderbeek, J., Gaber, T., Buttgereit, F., van Deventer, S., Peppelenbosch, M. and Hommes, D., Rapid immunosuppressive effects of glucocorticoids mediated through Lck and Fyn. Blood 2005. 106: 17031710. Sionov, R. V., Kfir, S., Zafrir, E., Cohen, O., Zilberman, Y. and Yefenof, E., Glucocorticoid-induced apoptosis revisited: a novel role for glucocorticoid receptor translocation to the mitochondria. Cell Cycle 2006. 5: 1017-1026. Sionov, R. V., Cohen, O., Kfir, S., Zilberman, Y. and Yefenof, E., Role of mitochondrial glucocorticoid receptor in glucocorticoid-induced apoptosis. J Exp Med 2006. 203: 189-201. Demonacos, C. V., Karayanni, N., Hatzoglou, E., Tsiriyiotis, C., Spandidos, D. A. and Sekeris, C. E., Mitochondrial genes as sites of primary action of steroid hormones. Steroids 1996. 61: 226-232. Psarra, A. M. and Sekeris, C. E., Glucocorticoid receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria and possible functions. Biochim Biophys Acta 2009. 1787: 431-436. Psarra, A. M. and Sekeris, C. E., Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: regulatory molecules in a new environment. Biochim Biophys Acta 2008. 1783: 1-11. Psarra, A. M., Hermann, S., Panayotou, G. and Spyrou, G., Interaction of mitochondrial thioredoxin with glucocorticoid receptor and NF-kappaB modulates glucocorticoid receptor and NF-kappaB signalling in HEK-293 cells. Biochem J 2009. 422: 521-531. Psarra, A. M. and Sekeris, C. E., Steroid and thyroid hormone receptors in mitochondria. IUBMB Life 2008. 60: 210-223. Demonacos, C., Tsawdaroglou, N. C., Djordjevic-Markovic, R., Papalopoulou, M., Galanopoulos, V., Papadogeorgaki, S. and Sekeris, C. E., Import of the glucocorticoid receptor into rat liver mitochondria in vivo and in vitro. J Steroid Biochem Mol Biol 1993. 46: 401-413. Scheller, K., Sekeris, C. E., Krohne, G., Hock, R., Hansen, I. A. and Scheer, U., Localization of glucocorticoid hormone receptors in mitochondria of human cells. Eur J Cell Biol 2000. 79: 299-307.

62

30 31 32

33 34

35

36 37 38

39

40 41 42

43

Moats, R. K., 2nd and Ramirez, V. D., Electron microscopic visualization of membrane-mediated uptake and translocation of estrogen-BSA:colloidal gold by hep G2 cells. J Endocrinol 2000. 166: 631-647. Monje, P. and Boland, R., Subcellular distribution of native estrogen receptor alpha and beta isoforms in rabbit uterus and ovary. J Cell Biochem 2001. 82: 467479. Solakidi, S., Psarra, A. M., Nikolaropoulos, S. and Sekeris, C. E., Estrogen receptors alpha and beta (ERalpha and ERbeta) and androgen receptor (AR) in human sperm: localization of ERbeta and AR in mitochondria of the midpiece. Hum Reprod 2005. 20: 3481-3487. Sterling, K., Campbell, G. A. and Brenner, M. A., Purification of the mitochondrial triiodothyronine (T3) receptor from rat liver. Trans Assoc Am Physicians 1983. 96: 324-335. Morrish, F., Buroker, N. E., Ge, M., Ning, X. H., Lopez-Guisa, J., Hockenbery, D. and Portman, M. A., Thyroid hormone receptor isoforms localize to cardiac mitochondrial matrix with potential for binding to receptor elements on mtDNA. Mitochondrion 2006. 6: 143-148. Casas, F., Daury, L., Grandemange, S., Busson, M., Seyer, P., Hatier, R., Carazo, A., Cabello, G. and Wrutniak-Cabello, C., Endocrine regulation of mitochondrial activity: involvement of truncated RXRalpha and c-Erb Aalpha1 proteins. Faseb J 2003. 17: 426-436. Berdanier, C. D., Everts, H. B., Hermoyian, C. and Mathews, C. E., Role of vitamin A in mitochondrial gene expression. Diabetes Res Clin Pract 2001. 54 Suppl 2: S11-27. Thompson, J. and Winoto, A., During negative selection, Nur77 family proteins translocate to mitochondria where they associate with Bcl-2 and expose its proapoptotic BH3 domain. J Exp Med 2008. 205: 1029-1036. Jeong, J. H., Park, J. S., Moon, B., Kim, M. C., Kim, J. K., Lee, S., Suh, H., Kim, N. D., Kim, J. M., Park, Y. C. and Yoo, Y. H., Orphan nuclear receptor Nur77 translocates to mitochondria in the early phase of apoptosis induced by synthetic chenodeoxycholic acid derivatives in human stomach cancer cell line SNU-1. Ann N Y Acad Sci 2003. 1010: 171-177. Casas, F., Domenjoud, L., Rochard, P., Hatier, R., Rodier, A., Daury, L., Bianchi, A., Kremarik-Bouillaud, P., Becuwe, P., Keller, J., Schohn, H., Wrutniak-Cabello, C., Cabello, G. and Dauca, M., A 45 kDa protein related to PPARgamma2, induced by peroxisome proliferators, is located in the mitochondrial matrix. FEBS Lett 2000. 478: 4-8. Zhou, L., Chong, M. M. and Littman, D. R., Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation. Immunity 2009. 30: 646-655. Brigl, M. and Brenner, M. B., How invariant natural killer T cells respond to infection by recognizing microbial or endogenous lipid antigens. Semin Immunol. 22: 79-86. Martin, E., Treiner, E., Duban, L., Guerri, L., Laude, H., Toly, C., Premel, V., Devys, A., Moura, I. C., Tilloy, F., Cherif, S., Vera, G., Latour, S., Soudais, C. and Lantz, O., Stepwise development of MAIT cells in mouse and human. PLoS Biol 2009. 7: e54. Terszowski, G., Muller, S. M., Bleul, C. C., Blum, C., Schirmbeck, R., Reimann, J., Pasquier, L. D., Amagai, T., Boehm, T. and Rodewald, H. R., Evidence for a functional second thymus in mice. Science 2006. 312: 284-287.

63

44 45 46 47 48

49 50 51 52 53 54 55

56

57 58 59 60 61

Steinmann, G. G., Klaus, B. and Muller-Hermelink, H. K., The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of puberty. A morphometric study. Scand J Immunol 1985. 22: 563-575. Hale, L. P., Histologic and molecular assessment of human thymus. Ann Diagn Pathol 2004. 8: 50-60. Anderson, G., Jenkinson, W. E., Jones, T., Parnell, S. M., Kinsella, F. A., White, A. J., Pongrac'z, J. E., Rossi, S. W. and Jenkinson, E. J., Establishment and functioning of intrathymic microenvironments. Immunol Rev 2006. 209: 10-27. Rodewald, H. R., Thymus organogenesis. Annu Rev Immunol 2008. 26: 355-388. Balciunaite, G., Keller, M. P., Balciunaite, E., Piali, L., Zuklys, S., Mathieu, Y. D., Gill, J., Boyd, R., Sussman, D. J. and Hollander, G. A., Wnt glycoproteins regulate the expression of FoxN1, the gene defective in nude mice. Nat Immunol 2002. 3: 1102-1108. Chen, L., Xiao, S. and Manley, N. R., Foxn1 is required to maintain the postnatal thymic microenvironment in a dosage-sensitive manner. Blood 2009. 113: 567-574. Cheng, L., Guo, J., Sun, L., Fu, J., Barnes, P. F., Metzger, D., Chambon, P., Oshima, R. G., Amagai, T. and Su, D. M., Postnatal tissue-specific disruption of transcription factor FoxN1 triggers acute thymic atrophy. J Biol Chem 2009. Gray, D. H., Ueno, T., Chidgey, A. P., Malin, M., Goldberg, G. L., Takahama, Y. and Boyd, R. L., Controlling the thymic microenvironment. Curr Opin Immunol 2005. 17: 137-143. Gray, D. H., Chidgey, A. P. and Boyd, R. L., Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry. J Immunol Methods 2002. 260: 15-28. Gill, J., Malin, M., Hollander, G. A. and Boyd, R., Generation of a complete thymic microenvironment by MTS24(+) thymic epithelial cells. Nat Immunol 2002. 3: 635-642. Shakib, S., Desanti, G. E., Jenkinson, W. E., Parnell, S. M., Jenkinson, E. J. and Anderson, G., Checkpoints in the development of thymic cortical epithelial cells. J Immunol 2009. 182: 130-137. Rossi, S. W., Kim, M. Y., Leibbrandt, A., Parnell, S. M., Jenkinson, W. E., Glanville, S. H., McConnell, F. M., Scott, H. S., Penninger, J. M., Jenkinson, E. J., Lane, P. J. and Anderson, G., RANK signals from CD4(+)3(-) inducer cells regulate development of Aire-expressing epithelial cells in the thymic medulla. J Exp Med 2007. 204: 1267-1272. Irla, M., Hugues, S., Gill, J., Nitta, T., Hikosaka, Y., Williams, I. R., Hubert, F. X., Scott, H. S., Takahama, Y., Hollander, G. A. and Reith, W., Autoantigenspecific interactions with CD4+ thymocytes control mature medullary thymic epithelial cell cellularity. Immunity 2008. 29: 451-463. Mathis, D. and Benoist, C., Aire. Annu Rev Immunol 2009. 27: 287-312. Anderson, G., Lane, P. J. and Jenkinson, E. J., Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance. Nat Rev Immunol 2007. 7: 954963. Yarilin, A. A. and Belyakov, I. M., Cytokines in the thymus: production and biological effects. Curr Med Chem 2004. 11: 447-464. Zamisch, M., Moore-Scott, B., Su, D. M., Lucas, P. J., Manley, N. and Richie, E. R., Ontogeny and regulation of IL-7-expressing thymic epithelial cells. J Immunol 2005. 174: 60-67. Fry, T. J. and Mackall, C. L., Interleukin-7: from bench to clinic. Blood 2002. 99: 3892-3904.

64

62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76

77

78 79 80

Takahama, Y., Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol 2006. 6: 127-135. Staal, F. J., Luis, T. C. and Tiemessen, M. M., WNT signalling in the immune system: WNT is spreading its wings. Nat Rev Immunol 2008. 8: 581-593. Pongracz, J., Hare, K., Harman, B., Anderson, G. and Jenkinson, E. J., Thymic epithelial cells provide WNT signals to developing thymocytes. Eur J Immunol 2003. 33: 1949-1956. Bommhardt, U., Beyer, M., Hunig, T. and Reichardt, H. M., Molecular and cellular mechanisms of T cell development. Cell Mol Life Sci 2004. 61: 263-280. Rothenberg, E. V., Moore, J. E. and Yui, M. A., Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nat Rev Immunol 2008. 8: 9-21. Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T. and Zuniga-Pflucker, J. C., Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity 2007. 26: 678-689. Rothenberg, E. V., Negotiation of the T lineage fate decision by transcriptionfactor interplay and microenvironmental signals. Immunity 2007. 26: 690-702. Taghon, T., Yui, M. A., Pant, R., Diamond, R. A. and Rothenberg, E. V., Developmental and molecular characterization of emerging beta- and gammadeltaselected pre-T cells in the adult mouse thymus. Immunity 2006. 24: 53-64. Nanno, M., Shiohara, T., Yamamoto, H., Kawakami, K. and Ishikawa, H., gammadelta T cells: firefighters or fire boosters in the front lines of inflammatory responses. Immunol Rev 2007. 215: 103-113. Nitta, T., Murata, S., Sasaki, K., Fujii, H., Ripen, A. M., Ishimaru, N., Koyasu, S., Tanaka, K. and Takahama, Y., Thymoproteasome shapes immunocompetent repertoire of CD8+ T cells. Immunity. 32: 29-40. Murata, S., Sasaki, K., Kishimoto, T., Niwa, S., Hayashi, H., Takahama, Y. and Tanaka, K., Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science 2007. 316: 1349-1353. Murata, S., Takahama, Y. and Tanaka, K., Thymoproteasome: probable role in generating positively selecting peptides. Curr Opin Immunol 2008. 20: 192-196. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G. and Kyewski, B., Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat Rev Immunol 2009. 9: 833-844. Egerton, M., Scollay, R. and Shortman, K., Kinetics of mature T-cell development in the thymus. Proc Natl Acad Sci U S A 1990. 87: 2579-2582. Kurobe, H., Liu, C., Ueno, T., Saito, F., Ohigashi, I., Seach, N., Arakaki, R., Hayashi, Y., Kitagawa, T., Lipp, M., Boyd, R. L. and Takahama, Y., CCR7dependent cortex-to-medulla migration of positively selected thymocytes is essential for establishing central tolerance. Immunity 2006. 24: 165-177. Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M. and Takahama, Y., CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens. Proc Natl Acad Sci U S A 2009. 106: 1712917133. Green, D. R., Droin, N. and Pinkoski, M., Activation-induced cell death in T cells. Immunol Rev 2003. 193: 70-81. Kyewski, B. and Derbinski, J., Self-representation in the thymus: an extended view. Nat Rev Immunol 2004. 4: 688-698. Gotter, J., Brors, B., Hergenhahn, M. and Kyewski, B., Medullary epithelial cells of the human thymus express a highly diverse selection of tissue-specific genes colocalized in chromosomal clusters. J Exp Med 2004. 199: 155-166.

65

81

82

83 84 85 86 87 88

89 90 91

92

93 94

95 96

Anderson, M. S., Venanzi, E. S., Klein, L., Chen, Z., Berzins, S. P., Turley, S. J., von Boehmer, H., Bronson, R., Dierich, A., Benoist, C. and Mathis, D., Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science 2002. 298: 1395-1401. Vogel, A., Strassburg, C. P., Obermayer-Straub, P., Brabant, G. and Manns, M. P., The genetic background of autoimmune polyendocrinopathy-candidiasisectodermal dystrophy and its autoimmune disease components. J Mol Med 2002. 80: 201-211. Yu, L., Strandberg, L. and Lenardo, M. J., The selectivity of autophagy and its role in cell death and survival. Autophagy 2008. 4: 567-573. Nedjic, J., Aichinger, M., Emmerich, J., Mizushima, N. and Klein, L., Autophagy in thymic epithelium shapes the T-cell repertoire and is essential for tolerance. Nature 2008. 455: 396-400. Koble, C. and Kyewski, B., The thymic medulla: a unique microenvironment for intercellular self-antigen transfer. J Exp Med 2009. 206: 1505-1513. Mills, K. H., Regulatory T cells: friend or foe in immunity to infection? Nat Rev Immunol 2004. 4: 841-855. Feuerer, M., Hill, J. A., Mathis, D. and Benoist, C., Foxp3+ regulatory T cells: differentiation, specification, subphenotypes. Nat Immunol 2009. 10: 689-695. Matloubian, M., Lo, C. G., Cinamon, G., Lesneski, M. J., Xu, Y., Brinkmann, V., Allende, M. L., Proia, R. L. and Cyster, J. G., Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1. Nature 2004. 427: 355-360. Blomgren, H. and Andersson, B., Characteristics of the immunocompetent cells in the mouse thymus: cell population changes during cortisone-induced atrophy and subsequent regeneration. Cell Immunol 1970. 1: 545-560. Boersma, W., Betel, I. and van der Westen, G., Thymic regeneration after dexamethasone treatment as a model for subpopulation development. Eur J Immunol 1979. 9: 45-52. Wust, S., van den Brandt, J., Tischner, D., Kleiman, A., Tuckermann, J. P., Gold, R., Luhder, F. and Reichardt, H. M., Peripheral T cells are the therapeutic targets of glucocorticoids in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol 2008. 180: 8434-8443. Wiegers, G. J., Knoflach, M., Bock, G., Niederegger, H., Dietrich, H., Falus, A., Boyd, R. and Wick, G., CD4(+)CD8(+)TCR(low) thymocytes express low levels of glucocorticoid receptors while being sensitive to glucocorticoid-induced apoptosis. Eur J Immunol 2001. 31: 2293-2301. Berki, T., Palinkas, L., Boldizsar, F. and Nemeth, P., Glucocorticoid (GC) sensitivity and GC receptor expression differ in thymocyte subpopulations. Int Immunol 2002. 14: 463-469. Fletcher, A. L., Lowen, T. E., Sakkal, S., Reiseger, J. J., Hammett, M. V., Seach, N., Scott, H. S., Boyd, R. L. and Chidgey, A. P., Ablation and regeneration of tolerance-inducing medullary thymic epithelial cells after cyclosporine, cyclophosphamide, and dexamethasone treatment. J Immunol 2009. 183: 823-831. Herold, M. J., McPherson, K. G. and Reichardt, H. M., Glucocorticoids in T cell apoptosis and function. Cell Mol Life Sci 2006. 63: 60-72. Zhan, Y., Funda, D. P., Every, A. L., Fundova, P., Purton, J. F., Liddicoat, D. R., Cole, T. J., Godfrey, D. I., Brady, J. L., Mannering, S. I., Harrison, L. C.

66

97 98 99 100 101 102

103 104

105 106 107 108 109

110

111 112

and Lew, A. M., TCR-mediated activation promotes GITR upregulation in T cells and resistance to glucocorticoid-induced death. Int Immunol 2004. 16: 1315-1321. Qiao, S., Chen, L., Okret, S. and Jondal, M., Age-related synthesis of glucocorticoids in thymocytes. Exp Cell Res 2008. 314: 3027-3035. Qiao, S., Okret, S. and Jondal, M., Thymocyte-synthesized glucocorticoids play a role in thymocyte homeostasis and are down-regulated by adrenocorticotropic hormone. Endocrinology 2009. 150: 4163-4169. Vacchio, M. S. and Ashwell, J. D., Glucocorticoids and thymocyte development. Semin Immunol 2000. 12: 475-485. Palinkas, L., Talaber, G., Boldizsar, F., Bartis, D., Nemeth, P. and Berki, T., Developmental shift in TcR-mediated rescue of thymocytes from glucocorticoidinduced apoptosis. Immunobiology 2008. 213: 39-50. Boldizsar, F., Palinkas, L., Bartis, D., Nemeth, P. and Berki, T., Antigen and glucocorticoid hormone (GC) induce positive selection of DP thymocytes in a TcR transgenic mouse model. Immunol Lett 2003. 90: 97-102. Boldizsar, F., Palinkas, L., Czompoly, T., Bartis, D., Nemeth, P. and Berki, T., Low glucocorticoid receptor (GR), high Dig2 and low Bcl-2 expression in double positive thymocytes of BALB/c mice indicates their endogenous glucocorticoid hormone exposure. Immunobiology 2006. 211: 785-796. Wang, D., Muller, N., McPherson, K. G. and Reichardt, H. M., Glucocorticoids engage different signal transduction pathways to induce apoptosis in thymocytes and mature T cells. J Immunol 2006. 176: 1695-1702. Cifone, M. G., Migliorati, G., Parroni, R., Marchetti, C., Millimaggi, D., Santoni, A. and Riccardi, C., Dexamethasone-induced thymocyte apoptosis: apoptotic signal involves the sequential activation of phosphoinositide-specific phospholipase C, acidic sphingomyelinase, and caspases. Blood 1999. 93: 22822296. Reth, M., Hydrogen peroxide as second messenger in lymphocyte activation. Nat Immunol 2002. 3: 1129-1134. Yang, Y., Fang, S., Jensen, J. P., Weissman, A. M. and Ashwell, J. D., Ubiquitin protein ligase activity of IAPs and their degradation in proteasomes in response to apoptotic stimuli. Science 2000. 288: 874-877. Michallet, M. C., Saltel, F., Preville, X., Flacher, M., Revillard, J. P. and Genestier, L., Cathepsin-B-dependent apoptosis triggered by antithymocyte globulins: a novel mechanism of T-cell depletion. Blood 2003. 102: 3719-3726. Jayaraman, T. and Marks, A. R., T cells deficient in inositol 1,4,5-trisphosphate receptor are resistant to apoptosis. Mol Cell Biol 1997. 17: 3005-3012. Wang, Z., Malone, M. H., He, H., McColl, K. S. and Distelhorst, C. W., Microarray analysis uncovers the induction of the proapoptotic BH3-only protein Bim in multiple models of glucocorticoid-induced apoptosis. J Biol Chem 2003. 278: 23861-23867. Han, J., Flemington, C., Houghton, A. B., Gu, Z., Zambetti, G. P., Lutz, R. J., Zhu, L. and Chittenden, T., Expression of bbc3, a pro-apoptotic BH3-only gene, is regulated by diverse cell death and survival signals. Proc Natl Acad Sci U S A 2001. 98: 11318-11323. Gottlicher, M., Heck, S. and Herrlich, P., Transcriptional cross-talk, the second mode of steroid hormone receptor action. J Mol Med 1998. 76: 480-489. Marchetti, M. C., Di Marco, B., Cifone, G., Migliorati, G. and Riccardi, C., Dexamethasone-induced apoptosis of thymocytes: role of glucocorticoid receptorassociated Src kinase and caspase-8 activation. Blood 2003. 101: 585-593.

67

113 114 115 116 117 118

119

120 121

122 123 124

125 126 127 128

Cobbold, S. P., Jayasuriya, A., Nash, A., Prospero, T. D. and Waldmann, H., Therapy with monoclonal antibodies by elimination of T-cell subsets in vivo. Nature 1984. 312: 548-551. Farr, A., Nelson, A., Truex, J. and Hosier, S., Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium. J Histochem Cytochem 1991. 39: 645-653. Berki, T., Kumanovics, G., Kumanovics, A., Falus, A., Ujhelyi, E. and Nemeth, P., Production and flow cytometric application of a monoclonal anti-glucocorticoid receptor antibody. J Immunol Methods 1998. 214: 19-27. Pendergrass, W., Wolf, N. and Poot, M., Efficacy of MitoTracker Green and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues. Cytometry A 2004. 61: 162-169. Curnow, S. J., Barad, M., Brun-Roubereau, N. and Schmitt-Verhulst, A. M., Flow-cytometric analysis of apoptotic and nonapoptotic T-cell receptor-transgenic thymocytes following in vitro presentation of antigen. Cytometry 1994. 16: 41-48. Inai, T., Mancuso, M., Hashizume, H., Baffert, F., Haskell, A., Baluk, P., HuLowe, D. D., Shalinsky, D. R., Thurston, G., Yancopoulos, G. D. and McDonald, D. M., Inhibition of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Signaling in Cancer Causes Loss of Endothelial Fenestrations, Regression of Tumor Vessels, and Appearance of Basement Membrane Ghosts. Am J Pathol 2004. 165: 35-52. Mancuso, M. R., Davis, R., Norberg, S. M., O'Brien, S., Sennino, B., Nakahara, T., Yao, V. J., Inai, T., Brooks, P., Freimark, B., Shalinsky, D. R., Hu-Lowe, D. D. and McDonald, D. M., Rapid vascular regrowth in tumors after reversal of VEGF inhibition. J Clin Invest 2006. 116: 2610-2621. Stasik, I., Rapak, A., Ziolo, E. and Strzadala, L., The mitochondrial localization of RelB and NFATx in immature T cells. Cell Mol Biol Lett 2008. 13: 493-501. Stasik, I., Rapak, A., Kalas, W., Ziolo, E. and Strzadala, L., Ionomycin-induced apoptosis of thymocytes is independent of Nur77 NBRE or NurRE binding, but is accompanied by Nur77 mitochondrial targeting. Biochim Biophys Acta 2007. 1773: 1483-1490. Oh, S. H. and Kim, K., Expression of interleukin-1 receptors in the later period of foetal thymic organ culture and during suspension culture of thymocytes from aged mice. Immunol Cell Biol 1999. 77: 491-498. Dardenne, M., Itoh, T. and Homo-Delarche, F., Presence of glucocorticoid receptors in cultured thymic epithelial cells. Cell Immunol 1986. 100: 112-118. Funakoshi, Y., Shiono, H., Inoue, M., Kadota, Y., Ohta, M., Matsuda, H., Okumura, M. and Eimoto, T., Glucocorticoids induce G1 cell cycle arrest in human neoplastic thymic epithelial cells. J Cancer Res Clin Oncol 2005. 131: 314322. Bayo, P., Sanchis, A., Bravo, A., Cascallana, J. L., Buder, K., Tuckermann, J., Schutz, G. and Perez, P., Glucocorticoid receptor is required for skin barrier competence. Endocrinology 2008. 149: 1377-1388. Manwani, N., Gagnon, S., Post, M., Joza, S., Muglia, L., Cornejo, S., Kaplan, F. and Sweezey, N. B., Reduced Viability of Mice with Lung Epithelial-Specific Knockout of Glucocorticoid Receptor. Am J Respir Cell Mol Biol 2009. Mulroy, T., McMahon, J. A., Burakoff, S. J., McMahon, A. P. and Sen, J., Wnt-1 and Wnt-4 regulate thymic cellularity. Eur J Immunol 2002. 32: 967-971. Goldenthal, M. J. and Marin-Garcia, J., Mitochondrial signaling pathways: a receiver/integrator organelle. Mol Cell Biochem 2004. 262: 1-16.

68

129 130 131 132

133

134 135 136 137 138

139 140

141 142

143 144 145

Birbes, H., Luberto, C., Hsu, Y. T., El Bawab, S., Hannun, Y. A. and Obeid, L. M., A mitochondrial pool of sphingomyelin is involved in TNFalpha-induced Bax translocation to mitochondria. Biochem J 2005. 386: 445-451. Ruvolo, P. P., Deng, X., Ito, T., Carr, B. K. and May, W. S., Ceramide induces Bcl2 dephosphorylation via a mechanism involving mitochondrial PP2A. J Biol Chem 1999. 274: 20296-20300. Tonomura, N., McLaughlin, K., Grimm, L., Goldsby, R. A. and Osborne, B. A., Glucocorticoid-induced apoptosis of thymocytes: requirement of proteasomedependent mitochondrial activity. J Immunol 2003. 170: 2469-2478. Buttgereit, F., Grant, A., Muller, M. and Brand, M. D., The effects of methylprednisolone on oxidative phosphorylation in Concanavalin-A-stimulated thymocytes. Top-down elasticity analysis and control analysis. Eur J Biochem 1994. 223: 513-519. Du, J., Wang, Y., Hunter, R., Wei, Y., Blumenthal, R., Falke, C., Khairova, R., Zhou, R., Yuan, P., Machado-Vieira, R., McEwen, B. S. and Manji, H. K., Dynamic regulation of mitochondrial function by glucocorticoids. Proc Natl Acad Sci U S A 2009. 106: 3543-3548. Sohn, S. J., Thompson, J. and Winoto, A., Apoptosis during negative selection of autoreactive thymocytes. Curr Opin Immunol 2007. 19: 510-515. Deocaris, C. C., Kaul, S. C. and Wadhwa, R., On the brotherhood of the mitochondrial chaperones mortalin and heat shock protein 60. Cell Stress Chaperones 2006. 11: 116-128. Chandra, D., Choy, G. and Tang, D. G., Cytosolic Accumulation of HSP60 during Apoptosis with or without Apparent Mitochondrial Release. Journal of Biological Chemistry 2007. 282: 31289-31301. Kirchhoff, S. R., Gupta, S. and Knowlton, A. A., Cytosolic heat shock protein 60, apoptosis, and myocardial injury. Circulation 2002. 105: 2899-2904. Xanthoudakis, S., Roy, S., Rasper, D., Hennessey, T., Aubin, Y., Cassady, R., Tawa, P., Ruel, R., Rosen, A. and Nicholson, D. W., Hsp60 accelerates the maturation of pro-caspase-3 by upstream activator proteases during apoptosis. EMBO J 1999. 18: 2049-2056. Wang, A., Rud, J., Olson, C. M., Jr., Anguita, J. and Osborne, B. A., Phosphorylation of Nur77 by the MEK-ERK-RSK cascade induces mitochondrial translocation and apoptosis in T cells. J Immunol 2009. 183: 3268-3277. Adzic, M., Djordjevic, A., Demonacos, C., Krstic-Demonacos, M. and Radojcic, M. B., The role of phosphorylated glucocorticoid receptor in mitochondrial functions and apoptotic signalling in brain tissue of stressed Wistar rats. Int J Biochem Cell Biol 2009. 41: 2181-2188. Schwindling, C., Quintana, A., Krause, E. and Hoth, M., Mitochondria positioning controls local calcium influx in T cells. J Immunol. 184: 184-190. Quintana, A., Schwindling, C., Wenning, A. S., Becherer, U., Rettig, J., Schwarz, E. C. and Hoth, M., T cell activation requires mitochondrial translocation to the immunological synapse. Proc Natl Acad Sci U S A 2007. 104: 14418-14423. Giacomello, M., Drago, I., Pizzo, P. and Pozzan, T., Mitochondrial Ca2+ as a key regulator of cell life and death. Cell Death Differ 2007. 14: 1267-1274. van Ewijk, W., Shores, E. W. and Singer, A., Crosstalk in the mouse thymus. Immunol Today 1994. 15: 214-217. Shores, E. W., Van Ewijk, W. and Singer, A., Disorganization and restoration of thymic medullary epithelial cells in T cell receptor-negative scid mice: evidence

69

146 147 148

149 150 151 152 153 154 155

156

157

158

159 160

that receptor-bearing lymphocytes influence maturation of the thymic microenvironment. Eur J Immunol 1991. 21: 1657-1661. Franchin, G. and Diamond, B., Pulse steroids: how much is enough? Autoimmun Rev 2006. 5: 111-113. Unger, W. W., Laban, S., Kleijwegt, F. S., van der Slik, A. R. and Roep, B. O., Induction of Treg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3 or dexamethasone: differential role for PD-L1. Eur J Immunol 2009. 39: 3147-3159. Hamdi, H., Godot, V., Maillot, M. C., Prejean, M. V., Cohen, N., Krzysiek, R., Lemoine, F. M., Zou, W. and Emilie, D., Induction of antigen-specific regulatory T lymphocytes by human dendritic cells expressing the glucocorticoid-induced leucine zipper. Blood 2007. 110: 211-219. Sacedon, R., Vicente, A., Varas, A., Jimenez, E., Munoz, J. J. and Zapata, A. G., Glucocorticoid-mediated regulation of thymic dendritic cell function. Int Immunol 1999. 11: 1217-1224. Aronow, L., Effects of glucocorticoids on fibroblasts. Monogr Endocrinol 1979. 12: 327-340. Proietto, A. I., van Dommelen, S. and Wu, L., The impact of circulating dendritic cells on the development and differentiation of thymocytes. Immunol Cell Biol 2009. 87: 39-45. Gray, D. H., Tull, D., Ueno, T., Seach, N., Classon, B. J., Chidgey, A., McConville, M. J. and Boyd, R. L., A unique thymic fibroblast population revealed by the monoclonal antibody MTS-15. J Immunol 2007. 178: 4956-4965. Jenkinson, W. E., Jenkinson, E. J. and Anderson, G., Differential requirement for mesenchyme in the proliferation and maturation of thymic epithelial progenitors. J Exp Med 2003. 198: 325-332. Jenkinson, W. E., Rossi, S. W., Parnell, S. M., Jenkinson, E. J. and Anderson, G., PDGFRalpha-expressing mesenchyme regulates thymus growth and the availability of intrathymic niches. Blood 2007. 109: 954-960. Zuklys, S., Gill, J., Keller, M. P., Hauri-Hohl, M., Zhanybekova, S., Balciunaite, G., Na, K. J., Jeker, L. T., Hafen, K., Tsukamoto, N., Amagai, T., Taketo, M. M., Krenger, W. and Hollander, G. A., Stabilized beta-catenin in thymic epithelial cells blocks thymus development and function. J Immunol 2009. 182: 2997-3007. Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G. and Perreault, C., The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling. Immunity 2008. 29: 57-67. Staal, F. J., Meeldijk, J., Moerer, P., Jay, P., van de Weerdt, B. C., Vainio, S., Nolan, G. P. and Clevers, H., Wnt signaling is required for thymocyte development and activates Tcf-1 mediated transcription. Eur J Immunol 2001. 31: 285-293. Liu, H., Fergusson, M. M., Castilho, R. M., Liu, J., Cao, L., Chen, J., Malide, D., Rovira, II, Schimel, D., Kuo, C. J., Gutkind, J. S., Hwang, P. M. and Finkel, T., Augmented Wnt signaling in a mammalian model of accelerated aging. Science 2007. 317: 803-806. Mak, W., Shao, X., Dunstan, C. R., Seibel, M. J. and Zhou, H., Biphasic glucocorticoid-dependent regulation of Wnt expression and its inhibitors in mature osteoblastic cells. Calcif Tissue Int 2009. 85: 538-545. Yao, W., Cheng, Z., Busse, C., Pham, A., Nakamura, M. C. and Lane, N. E., Glucocorticoid excess in mice results in early activation of osteoclastogenesis and

70

161 162

163

164 165

166

adipogenesis and prolonged suppression of osteogenesis: a longitudinal study of gene expression in bone tissue from glucocorticoid-treated mice. Arthritis Rheum 2008. 58: 1674-1686. Osada, M., Jardine, L., Misir, R., Andl, T., Millar, S. E. and Pezzano, M., DKK1 mediated inhibition of Wnt signaling in postnatal mice leads to loss of TEC progenitors and thymic degeneration. PLoS One. 5: e9062. Zubkova, I., Mostowski, H. and Zaitseva, M., Up-regulation of IL-7, stromalderived factor-1 alpha, thymus-expressed chemokine, and secondary lymphoid tissue chemokine gene expression in the stromal cells in response to thymocyte depletion: implication for thymus reconstitution. J Immunol 2005. 175: 2321-2330. Popa, I., Zubkova, I., Medvedovic, M., Romantseva, T., Mostowski, H., Boyd, R. and Zaitseva, M., Regeneration of the adult thymus is preceded by the expansion of K5+K8+ epithelial cell progenitors and by increased expression of Trp63, cMyc and Tcf3 transcription factors in the thymic stroma. Int Immunol 2007. 19: 1249-1260. Lynch, H. E., Goldberg, G. L., Chidgey, A., Van den Brink, M. R., Boyd, R. and Sempowski, G. D., Thymic involution and immune reconstitution. Trends Immunol 2009. 30: 366-373. Rossi, S. W., Jeker, L. T., Ueno, T., Kuse, S., Keller, M. P., Zuklys, S., Gudkov, A. V., Takahama, Y., Krenger, W., Blazar, B. R. and Hollander, G. A., Keratinocyte growth factor (KGF) enhances postnatal T-cell development via enhancements in proliferation and function of thymic epithelial cells. Blood 2007. 109: 3803-3811. Henson, S. M., Snelgrove, R., Hussell, T., Wells, D. J. and Aspinall, R., An IL-7 fusion protein that shows increased thymopoietic ability. J Immunol 2005. 175: 4112-4118.

71

10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Mindenek előtt köszönettel tartozom témavezetőimnek, Dr. Boldizsár Ferencnek és Dr. Berki Timeának, akik lehetővé tették, hogy bekapcsolódjak ebbe a kutatómunkába és végig támogatták megvalósítását. Köszönet illeti Dr. Németh Péter intézetvezető professzort, aki lehetővé tette, hogy az Intézet PhD-programjába bekapcsolódjak. Köszönet Dr. Pálinkás László útmutatásainak, aki mellett TDK-hallgatóként dolgoztam. Dr. Bartis Domokos és Dr. Szabó Mariann munkatársaimnak az értékes szakmai segítségéért. Csöngei Veronika kolléganőmnek a kézirat kritikus átolvasásáért. Dr. Balogh Péternek az a-CD45 és az a-MHC II antitestekért és a hasznos szakmai tanácsokért. Köszönet illeti Dr. Pongrácz Juditot, aki nagy fokban hozzájárult, hogy a PhD-munka thymus epithelialis sejtekkel foglalkozó része megvalósításra kerüljön. Köszönöm Dr. Kvell Krisztián és Varecza Zoltán munkatársaimnak a real-time PCR mérésekben nyújtott segítséget. Köszönet Dr. Berta Gergelynek és ifj. Dr. Sétáló Györgynek (PTE, Orvosi Biológiai Intézet) a konfokális mikroszkópia során nyújtott segítségükért. Köszönet illeti az Immunológiai és Biotechnológiai Intézet minden munkatársát, akik valamilyen formában mindig támogattak a munka során. Végül, de nem utolsósorban köszönöm családom támogatását.

72

11. MELLÉKLETEK A PhD-tézisek alapját képező közlemények

73