Daganat-kialakulásban szerepet játszó gének expresszió-változásai kémiai karcinogének hatására
Ph.D. ÉRTEKEZÉS
Gyöngyi Zoltán
PTE ÁOK Pécs, 2002. 1
Daganat-kialakulásban szerepet játszó gének expresszió-változásai kémiai karcinogének hatására
Ph.D. ÉRTEKEZÉS
Gyöngyi Zoltán
Programvezető: Dr. Soltész Gyula Témavezető: Dr. Ember István
Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Humán Közegészségtani Intézet Pécs, 2002.
2
Tartalom Köszönetnyilvánítás
4.
1.
5.
Bevezetés
1.1.
Kémiai karcinogenezis
11.
1.2.
In vivo génexpresszió vizsgálatok: Állatmodellek a korai génexpresszió emelkedésének vizsgálatára 13.
2.
Kérdések
19.
3.
Módszerek
21.
3.1.
A módszerek leírása
21.
3.2.
A kísérletek áttekintése
26.
4.
Eredmények és megbeszélés
4.1.
Eredmények
27. 27.
1. számú közlemény: Az in vivo onko/szuppresszorgén expresszió és karcinogén expozíció lehetséges összefüggései.
28.
2. számú közlemény: Changes in expression of onco- and suppressor genes in peripheral leukocytes - as potential biomarkers of chemical carcinogenesis in a surrogate tissue.
45.
3. számú közlemény: 1-nitropyrene induces elevated expression of oncogenes and tumor suppressor genes 24 hours after treatment in CBA/Ca mice.
50.
4. számú közlemény: ”Long-term” effects of 1-nitropyrene on oncogene and tumor suppressor gene expression.
55.
5. számú közlemény: Comparison of early onco/suppressor gene expressions in peripheral leukocytes and potential target organs of rats exposed to the carcinogenic 1-nitropyrene.
60.
6. számú közlemény: Effect of rancid oil on some onco/suppressor gene expression in vivo. A short-term study.
65.
7. számú közlemény: Effect of E-2-(4’-methoxybenzylidene)-1-benzosuberone on the 7,12-dimethylbenz(a)anthracene-induced onco/suppressor gene action in vivo II: a 48-hour
4.2.
experiment.
72.
Megbeszélés
83.
5.
Összefoglalás
91.
6.
Válaszok a feltett kérdésekre
94.
7.
Irodalom
95.
7.1.
A dolgozat elkészítéséhez felhasznált irodalom
95.
7.2.
A jelölt közleményei
100.
7.2.1.
Hazai folyóiratban megjelent cikk
100.
7.2.2.
Nemzetközi folyóiratokban megjelent cikkek
100.
7.2.3.
Előadások és poszterek hazai konferenciákon
101.
7.2.4.
Előadások és poszterek nemzetközi konferenciákon
102.
7.3.
A tézisek alapját képező, folyóiratban megjelent cikkek
104. 3
Köszönetnyilvánítás Szeretnék köszönetet mondani mindazoknak, akik a dolgozat elkészítéséhez hozzájárultak a Pécsi Tudományegyetem Humán Közegészségtani Intézetében és más intézetekben. Köszönetet mondok Prof. Dr. Boros Imrének, Prof. Dr. Dux Lászlónak, Prof. Dr. Kertai Pálnak, Prof. Dr. Morava Endrének, Prof. Dr. Seress Lászlónak, Prof. Dr. Szabad Jánosnak, Prof. Dr. Sipiczki Mátyásnak, Prof. Dr. Szeberényi Józsefnek, Prof. Dr. Szekeres Júliának, Dr. Ábrahám Hajnalkának, Dr. Berki Tímeának, Dr. Faust Zsuzsának, Grama Lászlónak, Jáksó Pálnak, Kerekes Irénnek, Dr. Kiss Istvánnak, Dr. Lustyik Györgynek, Dr. Nádasi Editnek, Dr. Németh Árpádnak, Dr. Perjési Pálnak, Dr. Sándor Jánosnak, Szabolcsi Péternek, Varjas Tímeának, Dr. Varga Csabának, valamint Brunnerné Bayer Zsuzsának, Csidei Jánosnénak, Fóris Máriának, Harth Csabánénak, Harth Klaudiának, Herczeg Mónikának, Mátyás Nándornénak, Orsós Zsuzsának, Pest Károlynénak, Szele Diánának és Wenczler Máriának, hogy munkájukkal hozzájárultak ahhoz, hogy a dolgozat elkészülhessen. Külön köszönetet mondok témavezetőmnek, Prof. Dr. Ember Istvánnak, hogy kezdettől fogva támogatta és segítette munkámat, valamint Dr. Csákvári Évának és Prof. Dr. Fischer Emilnek, hogy támogatták Pécsre kerülésemet. Megköszönöm még feleségemnek és családomnak, hogy munkámhoz nyugodt hátteret biztosítottak.
4
1. Bevezetés Minden betegség, így a daganatok esetén is a molekuláris biológiai módszerek minél korábbi alkalmazása egyre finomabb diagnózist biztosít a laboratóriumokban és a patológiában, így jobb túlélési esélyt ad a betegeknek. Ha minél korábbi molekuláris markereket vizsgálunk, nő az aspecifitás, ezért a korai molekuláris biológiai markereket általában nem diagnosztikai elemként, hanem a daganatos kockázatbecslés (rizikó) kvantifikálására használjuk és molekuláris-prediktív, korai, behatároló biomarkernek nevezzük őket. Alkalmazásuknál fontos még tudni, hogy nem egy, hanem több biomarker együttes vizsgálata szükséges az egyén, vagy a populáció veszélyeztetettségének megállapítására. A daganatbiológiában alkalmazott molekuláris genetikai -biológiai módszerek egyre jobb lehetőséget adnak a daganatkeletkezés korai észlelésére. Ezen belül a daganat-megelőzésben a magas rizikójú egyének és populáció azonosítására alkalmasak. A korai diagnosztika helyett elsősorban a primer prevencióban használhatók. A korai diagnosztika a molekuláris patológia része, a primer prevenció ezen oldala pedig a molekuláris epidemiológiáé. Más minőségi követelmények vannak a diagnosztikai marker, és az epidemiológiai marker oldalon. Mivel az utóbbi rizikóbecslésre szolgál, a követelmények kevésbé szigorúak. A daganatok primer prevenciójának alapfilozófiája az, hogy elkerüljük a daganatkeltő ágenssel való expozíciót. Ennek egy része társadalomtudományi megalapozottságú, és az egészségfejlesztés, egészségjobbítás, egészségnevelés kategóriájába tartozik, míg a másik része természettudományos megalapozottságú és a korai, behatároló, prediktív molekuláris - epidemiológiai biomarkerek fejlesztésén és alkalmazásán alapul. A molekuláris biológiai, -genetikai és molekuláris epidemiológiai módszerek egyre nagyobb szerephez jutnak a daganatok premorbid stádiumaiban, és a rutin diagnosztikában is (szekunder prevenció – kellő etikai és szakmai korlátokkal). Azonban egyre világosabb, hogy elsősorban a prevenció (primer prevenció) megalapozásában lesz szerepük. A primer és a szekunder prevenció morbiditást és mortalitást csökkentő hatása közismert. Becslések szerint a fejlett országokban 2000-ben a korspecifikus halálozás 13%-al csökkent a primer prevenció, és 6% -al a korai diagnózis és a szűrés jóvoltából. (1).
5
Az elmúlt évtizedekben a fejlett országokban megnőtt a daganatos megbetegedések jelentősége és részesedése a mortalitásban; a szív- és érrendszeri betegségek mögött második helyen állnak a halálozásban, miközben a fertőző betegségek visszaszorultak. A második helyet megőrizték annak ellenére, hogy néhány daganatnál a túlélési esély jelentősen megnőtt a terápia fejlődésével (gyermekkori Hodgkin-kór, csontszarkómák, leukémiák stb.). Magyarország az első helyen áll daganatos halálozásban, európai összehasonlításban a férfiak között (nők között a harmadik helyen) az 52 adatszolgáltató ország közül (2). A megelőzés hatékonyságát a laboratóriumban dolgozó szakemberek szempontjából a jól megválasztott biomarkerek segítségével lehet növelni a különböző krónikus nem fertőző betegségek, így a daganatok esetében is. A daganatok olyan genetikai betegségek (zömmel szomatikus genetikai elváltozások alapján), amelyek - közel 90%-ban - környezeti tényezőkkel idézhetők elő. Ilyen környezeti eredetű betegségek esetén a molekuláris és prediktív epidemiológiában biomarkereknek nevezzük azokat a molekulákat, melyek képesek jelezni az expozíciót, de a megváltozott funkciót is (korai hatás). Biomarkerként szerepelhet egy, a szervezetben normális körülmények között is megtalálható molekula mennyiségi, vagy minőségi változása, de a környezetből a szervezetbe került új molekula megjelenése is (3). Jelezhetik az expozíciót (az expozíció biomarkerei) a betegség kialakulása előtt, és segítségükkel felmérhetjük a biológiai hatást (a biológiai hatás biomarkerei). Ha a rákkeltő vegyületeket vizsgáljuk fontos lehet a vegyület mennyisége a szervezetben (belső dózis) és az eloszlása különösen az adott szerre érzékeny szervek (célszervek) között. Biomarkerek lehetnek a vegyület és metabolitjai, a DNS- és fehérje adduktok, a daganatok kialakulásában érintett protoonkogének, vagy a tumor szuppresszor gének mennyiségi és minőségi változásai (1. ábra). A policiklusos aromás szénhidrogénekkel való expozíció és a vérben mért addukt szintek illetve a vizeletben mért metabolitok mennyisége nem mindig ad pontos egyezést az epidemiológiai felmérések által gyűjtött adatokkal (4). Ezért is szükségesnek látszik új biomarkerek bevezetése, melyekkel pontosabb képet kaphatunk az expozícióról és a korai biológiai hatásról. Ehhez a daganatképződésben részt vevő gének alkalmazása lehet az egyik járható út (5).
6
HAGYOMÁNYOS EPIDEMIOLÓGIA EXPOZÍCIÓ →
→ BETEGSÉG
MOLEKULÁRIS EPIDEMIOLÓGIA
AZ EXPOZÍCIÓ MARKEREI
- - -
A HATÁS MARKEREI
A VEGYÜLET KÖRNYEZETI KONCENTRÁCIÓJA
DNS- ILL. FEHÉRJEADDUKTOK
KROMOSZÓMAABERRÁCIÓK, SCE, MUTÁCIÓK , ONKOGÉNAKTIVÁCIÓ
A VEGYÜLET VAGY METABOLITJAI A SZERVEZETBEN
EXPOZÍCIÓ → BELSŐ → BIOLÓGIAILAG → DÓZIS HATÁSOS DÓZIS
KORAI BIOLÓGIAI HATÁS
→
- - -
A BETEGSÉGET JELZŐ MARKEREK
PL. ABNORMÁLIS KÖPET- VAGY CERVIX CITOLÓGIA
KLASSZIKUS TUMOR MARKEREK PL. CEA, PSA
PL. METASZTÁZISSPECIFIKUS ONKOGÉNEK AKTIVÁCIÓJA
MEGVÁLTOZOTT → BETEGSÉG → SZÖVŐDMÉNYEK, STRUKTÚRA/ PROGNÓZIS FUNKCIÓ
EGYÉNI ÉRZÉKENYSÉG MARKEREI GENETIKUS/METABOLIKUS (P450, GST), DNS-REPAIR, TÁPLÁLTSÁGI-, IMMUNOLÓGIAI STÁTUSZ
1. ábra Molekuláris epidemiológia (6) 7
A daganatokhoz vezető út vírusos sugárzási kémiai
Beavatkozási lehetőség
ártalmak
Prokarcinogének Direkt karcinogének
expozíció elkerülése
Primer prevenció
Iniciáció
végső karcinogének
iniciált sejt
Promóció
genetikai változás
a karcinogén forma elkerülése
szelektív klonális expanzió
a genommal való interakció blokkolása
genetikai változás
növekedés gátlás
Kemoprevenció
preneoplasztikus sejt
Invázió
malignus tumor
Progresszió
klinikai daganat
sejt heterogenitás
korai diagnosztika
Szekunder prevenció
sebészeti, kemoterápia
Terápia
a relapszus és a metasztázis megelőzése
Tercier prevenció
Metasztázis 2. ábra Hatlépcsős környezetkémiai karcinogenezis (7)
8
A PREVENCIÓS SZINTEK VÁLTOZÁSA A MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA ALKALMAZÁSÁVAL START Expozíció Évtizedeket felölelő lappangási idő Daganat karcinogén hatások Megjelenés Progresszió Metasztázis lappangási idő szűkebb értelemben Onko/szuppresszorgének változásai korai daganat megelőző stádium Egyéb csak génszinten detektálható biomarker változások, preblasztomatózisok, benignus daganatok Morfológiai malignizáció Primer prevenció Primer prevenció kiterjesztett értelemben Szekunder prevenció szorosabb értelemben Szekunder prevenció tágabb értelemben Ez a periódus csak génszintű elváltozásnál értelmezhető, a molekuláris (genetikai) epidemiológia működési területe, ami kiterjeszthető a morfológiai malignizáció kezdetéig (Értelmezéstől függően fogható fel primer vagy szekunder prevenciónak)
Tercier prevenció klasszikus értelmezése Tercier prevenció kiterjesztett értelemben Tercier prevenció génszinten is
Géntechnológiai szintű megelőzés (repair, antisense-oligo, génsebészet) Szűkebb Kiterjesztett immunprevenció
Kemoprevenció szűkebb értelemben
KEMOPREVENCIÓ
értelemben vett immunprofilaxis (monoklonális antitestek Kiterjesztve a metasztázisokra is Klasszikus szűrés, műtét és terápia Új típusú kemoterápia: differenciálódás
3. ábra A prevenciós szintek változása a molekuláris biológia alkalmazásával (8)
9
Környezetünkben számos kémiai karcinogén fordul elő. Hatásukra mutációk érhetik a (proto)onkogéneket és tumor szuppresszor géneket és ennek következményeként génexpresszió-változásokat is tapasztalhatunk. A (proto)onkogének és tumor szuppresszor gének expressziójának változásai, és az azokat esetleg okozó szomatikus genetikai eltérések (mutáció, amplifikáció, stb.) már évekkel megelőzhetik a manifeszt daganat kialakulását, így már pretumoros, preblasztomatózisos (premorbid) állapotban is detektálhatók (9) és a gének elváltozásai úgynevezett “korai, behatároló biomarkerként” használhatók a kellő kísérleti és etikai standardok validálásával. A daganatkialakulás többlépcsős folyamatát figyelembe véve (10) feltételezhető, hogy a (proto)onkogéneket és tumor szuppresszor géneket ért véletlenszerű mutációk a génexpresszióban is kifejeződhetnek. Expressziójuk változása figyelmeztethet a veszélyre a betegség megjelenése előtt, vagy annak kezdetén, így lehetőség nyílhat a veszélyeztetett csoportok kiemelésére, a káros hatás megszüntetésére, mielőtt a betegség kialakulna (primer prevenció, intervenció, expozíció csökkentés) (2. és 3. ábra). Például a Ha-ras expresszió-emelkedése a kémiai karcinogén expozíciót is jelezhet (11), a p53 pedig a DNS károsodást (12). A megfelelő biológiai mintához azonban nem mindig könnyű hozzáférni, mert az embereket, főleg populációs szintű vizsgálatoknál, nem tehetjük ki nagy invazivitással járó eljárásoknak. Az állatkísérletekben jól vizsgálható célszerveket így más mintával kell helyettesíteni. Ilyen lehet a kilégzett levegő, a haj, a nyál, a vizelet és a vér, széklet, epe, hasnyál stb. (3). Génexpresszió-vizsgálatokra lehetőség van mRNS (Northern blot) és fehérje szinten (Western blot) is. Az utóbbi években elterjedt a DNS chip technológia, mellyel egyszerre akár több ezer gén expressziójáról kaphatunk információt, de megfelelő daganat-specifikus gén/marker hiányában a stádium-meghatározás és a terápia megtervezésébe vonható be hatékonyan. A chipek (markerek komplex vizsgálatára is alkalmasak) mellett a hagyományos molekuláris biológiai módszerek ugyancsak alkalmasak az expozíció kimutatására megfelelő gének kiválasztásával, nagyságrendekkel kisebb beruházással.
10
1.1. Kémiai karcinogenezis A daganatok olyan genetikai betegségeknek tekinthetők, amelyek nagy százaléka (90%) indukálható kémiai anyagokkal (13). Környezetünkben számos rákkeltő anyag található, melyek a szervezetbe jutva makromolekulákhoz (DNS-hez, RNS-hez, vagy fehérjékhez) kapcsolódva adduktokat képeznek, így a megváltozott szerkezettel és működéssel a daganatkeletkezés potenciális kiindulópontjává válhatnak. Különösen veszélyes, pluripotens karcinogének a policiklusos aromás szénhidrogének (PAH). Olvadás- és forráspontjuk magas, így a lebegő porban részecskékhez kötve vannak jelen a levegőben. Apoláros lipofil molekulák, ezért könnyen áthatolnak a sejthártyán. A policiklusos aromás vegyületeket tartalmazó anyagok (például a korom és a kátrány) veszélyességére már korán rájöttek; hererák kapcsán kéményseprőknél, valamint bőrráknál aszfaltmunkásoknál (14) és más kísérletek is bizonyították rákkeltő hatásukat (15), de kátrány ecseteléssel pl. Magyarországon is előidéztek daganatokat már a 30-as években (16). A
vegyületcsoportba
tartozó
7,12-dimetil-benz[α]antracén
környezeti
(DMBA),
kémiai
amely
rákkeltő
anyag
foglalkozási
például
expozíciót
a
jelent
kőolajszármazékokkal dolgozók körében, de számos más foglalkozás esetében is, ahol fűtőolajat, gázolajat használnak, de sok van a dohányfüstben és a belső égésű motorok kipufogógázaiban is; ubiquiter vegyület (17). A DMBA egerekben, patkányokban leukémiát (18), limfómát, emlő- (19), bőr- (20) és emésztőrendszeri daganatokat indukál (21). Irodalmi adatok
szerint
DNS
adduktok
mutathatók
ki
in
vivo,
már
24
órával
7,12-dimetil-benz[α]antracén kezelés után SENCAR egérben, tehát a karcinogén molekulák és a DNS interakciója igen korán létrejön (22).
I. táblázat A kipufogógázok összetételének százalékos megoszlása a különböző motorok emissziója szerint (24) Jármű
CO
CH
NOx
Korom
SO2
Benzinüzemű
96
89
23,2
-
30
Dízelüzemű
4
10,6
76,8
100
70
A legjobban ismert indikátor molekula a 2,4-benzpirén és a metilkolantrén ismert rákkeltő. Egy másik policiklusos aromás szénhidrogén az 1-nitropirén (1-NP), mely az ipari kibocsátás mellett a diesel motorok kipufogógázában található meg jelentős mennyiségben 11
(23), ezért állandó expozíciót jelent a hétköznapi ember számára is. Az I. táblázat a kipufogógázok összetételének százalékos megoszlását mutatja a különböző motorok emissziója szerint (24). A DMBA-hoz hasonlóan a NP is számos daganat kialakulásáért felelős. Tüdőrák (25), emlő-adenokarcinóma, leukémia (26) és egyéb daganatok (27) kialakulását figyelték meg hatására. Nitroredukció során N-hidroxi-1-aminopirénné alakul, mely reakcióba lép a DNS-sel (guaninnal), N-(deoxiguanozin-8-il)-1-aminopirén adduktot képezve. A nitroredukción kívül gyűrű oxidációval és a két reakció együttessével is képződhetnek reaktív metabolitok. A 6-hidroxi-1-nitropirén és az 1-nitropirén mellett az 1-nitropirén-4,5-oxid és az 1-nitropirén-9,10-oxid bizonyult mutagénnek. Az addukt-analízis szerint az 1-nitropirén-9,10-oxid négyszer reaktívabb, mint az 1-nitropirén-4,5-oxid. A keletkezett addukt (N-(deoxiguanozin-8-il)-1-aminopirén) azonban a nitroredukciódól származik (28). A gyűrű-oxidált 1-nitropirén származékokról is bebizonyosodott, hogy képesek kölcsönhatásba lépni a DNS-sel, így adduktok képződhetnek nem csak a nitroredukció-, de a gyűrű-oxidáció eredményeként is. (29). Tekintettel arra, hogy a mutagén vegyületek 90 %-a karcinogén is (30), a karcinogén hatás korai kimutatására alkalmazott különböző mutagén tesztek jó koincidenciát mutatnak a karcinogenitással. A mutagén tesztekkel jó párhuzamot mutattak a korai (hasonló időben elvégzett) génexpressziós vizsgálatok, mint korai behatároló biomarkerek (31), és úgy tűnik ugyanúgy előre jelezhetik a potenciális karcinogenitást (vs. mutagenitást is). A karcinogenitás-mutagenitás közötti 90 %-os koincidencia tehát ezen a szinten is igazolást nyert. Brandt-Rauf szerint számos daganat, amely környezeti kémiai karcinogénekkel van kapcsolatban, gyakran asszociálódik aberráns génexpresszióval (12). A daganat-megelőző és daganatellenes vegyületek hatásait széles körben vizsgálják a környezeti karcinogének indukálta modellekben, különböző tesztrendszerekben (32). A flavonoidok közé sorolható kalkonok és származékaik számos biológiai hatással rendelkeznek.
Találhatók
közöttük
gyulladáscsökkentő,
antioxidáns,
sejtvédő
és
daganatellenes származékok. A Pécsi Tudományegyetem Orvosi Kémiai Intézetében is szintetizáltak kalkon származékokat (33). Némelyek programozott sejthalált indukáltak tumor-sejtvonalakon; az apoptotikus hatást a sejtstruktúrában levő sejtek morfológiai változásával követték nyomon. 56 származékot 60 különböző daganat-sejtvonalon vizsgálva az E-2-(4’-metoxi-benzilidén)-1-benzoszuberon (MBB) volt a leghatékonyabb (34).
12
1.2. In vivo génexpresszió vizsgálatok: Állatmodellek a korai génexpresszió emelkedésének vizsgálatára Az egészséges- és a tumorsejtek osztódását meghatározott gének szabályozzák (38). A szabályozás fontos eleme az érintett gének expresszióinak változása is. A génexpresszió igen gyorsan megtörténik; általában 5-20 perc telik el az mRNS szintéziséig és további néhány perc múlva az mRNS már a riboszómákhoz kötődik. Az mRNS lebomlásánál a féléletidő általában 4-24 óra, néha azonban hosszabb, vagy jóval rövidebb is lehet (39). A génexpresszió szabályozása összetett folyamat, mértéke sok tényező együttes hatásának eredője. Fontos a sejttípus-specifikus aktív kromatin mintázat létrehozása, fenntartása, az eukromatin (fellazult állapot, itt lehetséges átírás) létrejötte. Ezt az állapotot a DNS-el kölcsönhatásban levő fehérjék (hisztonok és más fehérjék) változása hozza létre, így a foszforilálás, az acetilálás, a metilálás, az ubiquitinálás és nem hiszton fehérjék kötődése. Továbbá a DNS-en aktivátor helyek vannak, ahova szabályozó fehérjék kötődhetnek. Az aktív kromatinban rendelkezésre álló gének transzkripciójának szabályozása elsősorban az RNS polimeráz működésének regulációját jelenti. Ez DNS oldalról promóter szekvenciákkal és enchancer szekvenciákkal történik. Fehérje oldalról a DNS-hez kapcsolódó
fehérjék
szabályoznak.
ezek
DNS-kötő
motívumokat
tartalmaznak
(hélix-fordulat-hélix (homeobox fehérjék) és leucin cipzár (hidrofób, dimerizáció)) A transzkripciót szabályozhatják karmester fehérjék (sejt- és szövetspecifikus génexpresszió kialakítása), sejtfelszíni receptorok, hormonális hatás ligand indukálta transzkripciós faktorokkal (szteroid - tiroid - D vitamin magreceptor család), anyagcsere-hatás, stresszválasz és környezeti hatás. Az mRNS-ek specifikus processzálása (splicing, editing (szekvenciát utólag meg lehet változtatni) CAA→UAA (STOP)), transzportjának sebessége is befolyásolja a génexpressziót. Végül az mRNS stabilitása is függ néhány tényezőtől, így az RNS kötő fehérjék megfelelő szekvenciákhoz történő kapcsolódásától (RN-áz védelem), nukleázok és az önhasítás aktivitásától és az RNS modifikálásától (feji 7-metil-guanozin és poli-A farok). A kémiai karcinogének vizsgálataiban kezdetekben a mutációkkal és a karcinogén anyag - DNS/fehérje molekulák kölcsönhatásából létrejött adduktok mérése és a génekben létrejött változások (mutációk, deléciók) kimutatása szerepelt (40). A karcinogenezis tanulmányozásával világossá vált, hogy egyes, a sejt osztódásának szabályozásáért felelős gének expressziója megváltozhat komplett karcinogének, iniciátorok és tumor promóter 13
vegyületek hatására is. A génexpresszió-változásának hátterében többnyire találunk mutációt is. Az 1. számú közlemény bemutatja, hogy a normális fiziológiás esetben is expresszálódhatnak (proto)onkogének és a tumor szuppresszor gének, szerepük van az egyedfejlődésben, a regenerációban és a stressz-válaszban, de jelezhetnek karcinogén hatást is. A II. táblázat a génexpresszió illetve a mRNS mennyiségi változásainak lehetőségeit mutatja be genotoxikus- (az örökítőanyag változásai) és epigenetikus karcinogének (a DNS-t közvetlenül nem érintő, de a génexpressziót, vagy a végrehajtó fehérjéket módosító vegyületek).
II. táblázat A génexpresszió illetve a mRNS mennyiségi változásai Genotoxikus karcinogének mutációk transzlációs változások a nukleotidok mennyisége DNS metiláció DNS térbeli szerkezete transzkripciós faktorok Epigenetikus karcinogének RNS polimeráz enzim metilázok poli A szekvencia szintézisét végző enzim a splicing-ban közreműködő enzim az mRNS transzportja az mRNS lebontását végző RN-ázok aktivitása az mRNS stabilizálása, destabilizálása RNS ill. a tRNS mennyiségének változása fehérjeszintű változások
A sejtosztódás szabályozásában kulcsszerepet játszanak a (proto)onkogének és a tumor szuppresszor gének. Kémiai karcinogének indukálta tumorokban igen gyakran fordul elő a c-myc, a ras és a p53 gének (III. táblázat) mutációja, expresszió-változása (41). A sejtosztódásban és a karcinogenezisben betöltött központi szerepük miatt kulcsgéneknek 14
nevezik őket. III. táblázat A c-myc, ras és p53 gének által kódolt fehérjék funkciói és sejtben való elhelyezkedésük Gén
Funkció
Sejtben való elhelyezkedés
c-myc
transzkripciós faktor
sejtmag
ras
G-protein, jelátvitel
sejthártya
p53
transzkripciós faktor
sejtmag
Így felvetődik e gének expressziójának alkalmazhatósága behatároló biomarkerként, a karcinogenezis korai stádiumában, különös tekintettel arra, hogy kezdetben morfológiai elváltozások nem találhatók. Felhívják a figyelmet a többes hibalehetőségre; első lépésben az esetleg fennálló genotoxikus hatásra, a karcinogenezis iniciációjára, és további lépéseire, vagy egyszerűen csak a fokozott geno- vagy citotoxikus expozícióra, illetve epigenetikus hatásra (36,37). Leukémia modellekben már az 1980-as évektől vizsgálták a karcinogének és az onkogén expresszió közötti összefüggéseket, in vivo, majd később szolid tumorokban is. Ezek az adatok, a legutóbbi évekig elsősorban manifeszt daganatokra vonatkoztak (42,43). Azok a vizsgálatok, amelyek manifeszt humán tumorokra, pl. agydaganatokra, malignus limfómákra, leukémiákra, karcinogén exponált - de nem daganatos - humán populációra vonatkoztak, egyértelműen kimutatták, hogy - a morfológiailag (még) nem daganatos
-
területeken
is
detektálható
onkogén/szuppresszorgén
overexpresszió
(36,37,44,45). Hasonlóképpen pl. mielodiszpláziás szindrómában, cervix prekarcinózus állapotokban a manifeszt daganat kialakulása előtt kimutatható néhány onkogén emelkedett expressziója, mutációja, amplifikációja, vagy a metilációs mintázat változásai. Sikerült onko/szuppresszor génekre vonatkozó relatíve korai elváltozásokat találni pl. emlő, pajzsmirigy, hasnyálmirigy, fej-nyaki, stb. daganatokban (46). Korábbi adatok arra utalnak, hogy (proto)onkogén és tumor szuppresszor gén overexpresszió történik karcinogének hatására. A myc, ras és p53 gének szerepe számos daganatban ismert. Korai kulcsgénként tartják számon őket (10, 41,47). A p53 gén DNS károsodás hatásra expresszálódik (a C-terminális domén egyszálú DNS-t ismer fel). A gén terméke egy 53 kDa molekulatömegű foszfoprotein, tetramer formában aktív transzkripciós faktor (10 bázispár hosszú, gén promóterekben megtalálható 15
palindróm szekvenciát ismer fel). Olyan gének regulátora, melyek a sejtosztódást gátolják, vagy melyek a programozott sejthalált indítják el. Nem engedi a sejtet a G1-ből az S fázisba, ezáltal lehetőséget ad a DNS-szintézis előtti hibajavításra, vagy beindítja a programozott sejthalált (12). Jellegzetes módon inaktiválódik az általa szabályozott gének transzkripciója. Mivel
tetramer
formában
aktív
a
fehérje,
már
a
komplex
egyik
tagjának
konformáció-változása is elég a funkció kieséséhez (domináns-negatív mutáció). A gén jelentőségét mutatja, hogy az emberi daganatok több mint 50%-ára jellemző a vad típusú allél elvesztése (48). A c-myc gén egy 64 kDa-os sejtmagi fehérjét kódol. A c-Myc fehérje sejtciklust szabályozó transzkripciós faktorként működik a Max fehérjével heterodimert alkotva. A transzkripciós faktorokat korai géneknek is nevezik, mert mitogén hatásra gyorsan aktiválódnak. Jellemző a leucin zipzár (ez a dimerizációhoz kell) és a cink ujjak (DNS kötéshez szükséges). A c-myc jellemzően amplifikációval, expresszió-növekedéssel válik onkogéné, tehát a transzkript mennyisége nő, nem pedig a strukturgént ért mutáció folytán létrejött funkció-változás (mutáció) fokozza a mitogén hatást. A nyugvó sejtek c-myc expressziója alacsony. In vitro és in vivo kísérleti rendszerekben is a sejtosztódás mértékét növeli, melynek során a G1 fázis hossza rövidül és a sejt nem kerül a G0-ba. A regeneráció során expressziója emelkedik, a differenciáció során pedig csökken, sőt aktivitásának csökkenése szükséges a differenciációhoz (12,49). A ras géncsalád tagjai H-ras (nevét Harvey rágcsáló szarkóma vírus után kapta, Ha-ras-ként is írják), K-ras (nevét Kirsten rágcsáló szarkóma vírus után kapta, Ki-ras-ként is írják) és az N-ras, melyet neuroblasztómában találtak meg. A gének 188-189 aninosavból álló, 21 kDa-os, a sejthártya belső feléhez kötött G proteineket kódolnak, melyek receptorok által szabályozott intracelluláris jelátviteli rendszer tagjaiként közvetve a sejtmagban levő transzkripciós faktorokra hatnak. Mivel a fehérjék 21 kDaltonosak, p21ras-nak is nevezik őket. Számos receptor képes aktiválni a géncsalád tagjait és az aktivált Ras fehérjék is további jelátvivőket aktiválnak (például másodlagos hírvivőket, így ciklikus nukleotid-foszfázokat és inozitolt is). Az aktív Ras jellemzően a Raf-MEK-MAPK jelátviteli útvonalat aktiválja. A MAP kináz közvetve a c-myc-re is hat. Mutáció hatására konformációja megváltozhat, ez karcinogenezishez vezethet (12). A ras gének aktiválódnak leggyakrabban karcinogén hatására a daganat képződés iniciáció fázisában (11). A mutáns fehérje számos humán tumorban megtalálható, transzformálni képes sejteket, sejtvonalakat, mint az NIH 3T3-t, és elősegíti a Xenopus Laevis petesejtek érését. A protoonkogén az összes eukarióta sejtben megtalálható. Van néhány kritikus ponton levő aminosav, mint a Gly 12, Gly 13, Ala 59, Gln 16
61 és a Glu 63. A 61-es kodon a purin kötésért (GTP/GDP) felelős. A ras család tagjai a normáis funkció ellátásakor GDP-t, vagy GTP-t kötnek. Inaktív állapotban GDP-t, aktív állapotban GTP-t. A 61-es kodon mutációja erős konformációváltozással jár, a GTP-kötés erőssége jelentősen megnő, ami a fehérje állandó aktivitását eredményezi (50). A ras család 12-es, 13-as és 61-es kodonjában megfigyelhető mutációk hasnyálmirigy daganatokban 90-, vastagbél daganatokban és pajzsmirigy daganatokban 50-, tüdőráknál és mieloid leukémiák 30 %-ában figyelhető meg (51). Elsősorban a ras génekről, ezen belül is a Ha-ras génről található több irodalmi adat a PAH expozícióval kapcsolatban. DMBA kezelés hatására ras génben jellemzően a 61-es kodon második bázisában történik mutáció. A DMBA indukált leukémiákban kimutathatóan N-ras mutációt okoz (52). Három héttel a DMBA kezelés után a Ha-ras pontmutációja is kimutatható a 61-es kodonban (A→T-transzverzió történik, a vad típusú glutamin cserélődik leucinra). A bázis-szubsztitúció mellett a Ha-ras gén overexpressziója is megfigyelhető egyes hörcsög pofazacskó epitél sejtekben DMBA kezelés eredményeképpen in vivo. Szövettani eltérés azonban nem tapasztalható (53). A hörcsög pofazacskó epitél sejtekben in vivo DMBA kezelés után hamar megjelenik a Ha-ras overexpressziója és a karcinogenezis alatt
is
megmarad.
A
magas
Ha-ras
expresszió
azonban
csak
akkor
vezet
daganat-képződéshez, ha más gének is érintettek, mint például a c-erbB. (54). Kérdéses, hogy a 61-es kodon gyakori mutációja szükséges-e a Ha-ras magas expressziójához, hiszen a DMBA-val és különböző promóterekkel indukált bőrtumorokban a 61-es kodon mutációja nélkül is kimutatható Ha-ras expresszió-emelkedés a papillómákat és a bőrkarcinómát megelőző állapotban (preneoplasztikus stádium) is (55). Állatkísérletekben kialakult daganatokban is kimutatható a Ha-ras gén emelkedett expressziója (43,53). A munkaegészségtan is foglalkozik az expozíció monitorozásával. A kohómunkások policiklusos aromás szénhidrogénekkel való exponáltsága közismert és vérükben néhány esetben kimutatható a Ras és a Fes onkoproteinek magasabb expressziója; olyan emberek esetében akiknek a perifériás fehérvérsejtjeiben magas volt a benzpirén-adduktok mennyisége (5). Ez utóbbi tanulmány már a PAH expozíció biomarkereként kezeli a magas ras expressziót (molekuláris prediktív epidemiológiai biomarker). A karcinogén anyag hatását már a daganatot kialakulása előtt kimutathatjuk génexpresszió-vizsgálattal. Ebben az esetben az emelkedett expresszió prediktív jelentőségű és segítségével, a mutagenitási tesztekhez hasonlóan, a korai biológiai hatást detektálhatjuk. A korai, manifeszt daganatot megelőző génexpresszió vizsgálatra alkalmasak lehetnek CBA/Ca egerek, Long-Evans, vagy Fisher F344 patkányok. Ezek az állatok kémiai 17
karcinogénekre érzékenyek, korábban és gyakrabban alakul ki bennük daganat és kémiai karcinogénnel indukált génexpresszió-változás, amely a H-2 rendszerrel (embernél MHC) hozható összefüggésbe (a szenzitív CBA/Ca egereknek H-2k haplotípusuk van) (35). A c-myc, a ras és a p53 gének a daganat-kialakulásban a leggyakrabban érintettek. Korai behatároló biomarkerként való használhatóságukra is van már adat az irodalomban (36,37). A Pécsi Tudományegyetem Humán Közegészségtani Intézetében korábban kifejlesztett in vivo tesztrendszer alkalmas lehet kémiai karcinogének és kemoprotektív anyagok (pl. kalkonok) vizsgálatára is.
18
2. Kérdések A
bevezetőben
leírt
eredmények
indítottak
arra
bennünket,
hogy
kulcs
(proto)onkogének/szuppresszor gének expresszióját vizsgáljuk állatkísérletekben, mint potenciális molekuláris és prediktív epidemiológiai biomarkereket (intervenció illetve kemoprevenció) a primer prevenció hatékonyságának monitorozása.
Az ezek alapján megfogalmazódott kérdések: -
Makroszkópos- és mikroszkópos daganat megjelenése előtt történnek- e potenciális, marker értékű génexpresszió-változások karcinogén expozíció hatására?
-
Az esetlegesen korán meglévő elváltozások értékelhetők-e a premalignus és malignus stádiumban is?
-
Milyen összefüggés van a korai és a késői elváltozások között (diagnosztika, prevenció szempontjából)?
-
A célszervek mellett a perifériás vérből nyert fehérvérsejtek alkalmasak-e a karcinogén hatás
jelzésére,
hasonló
értékeket
mutatnak-e
a
célszervekben
mért
génexpresszió-változásokkal? -
A kémiai karcinogén indukálta génexpresszió-változást mennyiben lehet befolyásolni potenciális daganatmegelőző szerrel?
-
Alkalmas lehet-e az általunk felállított in vivo tesztrendszer más kemopreventívumok tesztelésére is?
A kérdések megválaszolására Ph.D. dolgozat kísérletes tematikája négy részre osztható: 1. A kémiai karcinogén expozíciót követő korai génexpresszió-változásokat - mint potenciális korai biomarkerek - vizsgálata különböző szervekben. 2. A kémiai karcinogén expozíciót követő hosszú távú génexpresszió-változások vizsgálata különböző szervekben. 3. Karcinogénnel indukált génexpresszió-változások egyidejű vizsgálata könnyen hozzáférhető biológiai mintában és a feltételezett célszervekben. 4. Karcinogénnel indukált génexpresszió-változások vizsgálata feltétélezetten daganatellenes hatású szer hatására különböző szervekben.
A c-myc, a ras és a p53 géneket választottuk vizsgálatainkhoz, mint a daganat-kialakulásban a leggyakrabban érintetteket. A már említett gyakori mutációkon és 19
amplifikációkon túl expressziójuk is megemelkedhet kémiai karcinogének hatására (45). Korai behatároló biomarkerként való használhatóságukra is van már adat az irodalomban (36,37). Karcinogén anyagok közül a DMBA-t, az 1-nitropirént és az avas olajat választottuk széles
körű
elterjedésük
miatt.
Daganatellenes
szernek
pedig
az
E-2-(4’-metoxi-benzilidén)-1-benzoszuberont. Mivel az emberi anyagcserét in vivo tesztrendszerekben lehet legjobban modellezni, ezért választottuk kémiai karcinogénre érzékeny állatokat a kísérletekhez. Ilyen tesztrendszerek alkalmasak lehetnek arra, hogy tovább
pontosíthassuk
a
(proto)onkogének
és
tumor
szuppresszor
gének
expresszió-változásainak biomarkerként való alkalmazhatóságát.
20
3. Anyag és módszer 3.1. A módszerek leírása A szöveti károsodás és a toxikus hatás megállapítására elektronmikroszkókos vizsgálatnak vetettük alá CBA/Ca egerek máját DMBA és 1-NP kezelés után 48 órával. A különböző szervekben megfigyelt korai (24-48 órás) és későbbi (1, 3, 6 és 12 hónap) génexpresszió-változásokat
egybevetettük
a
különböző
időpontokban
észlelt
génexpresszió-változásokkal és az irodalomban talált (12), illetve saját kísérleti rendszerünkben (a kísérletek összeállítása részletesen a közleményekben megtalálható) megfigyelt karcinogén indukálta génexpresszió és daganatok előfordulásával. A követéses vizsgálatban egy évig figyeltük a karcinogén expozícióra adott génexpresszió-választ. Az eredmények elemzése után következtetünk arra, hogy mely gének expresszió-változása alkalmas leginkább behatároló biomarkernek. A dot blot technikát egyszerű kezelhetősége és jó kvantifikálhatósága miatt választottuk. A korai, manifeszt daganatot megelőző génexpresszió vizsgálat humán diagnosztikában potenciális biomarkerként történő felhasználásának lehetőségét állatkísérletekben teszteltük. A kísérleteket részben CBA/Ca egerekkel végeztük. Ezek az állatok kémiai karcinogénekre érzékenyek, korábban és gyakrabban alakul ki bennük daganat és kémiai karcinogénnel indukált génexpresszió-változás, amely a H-2 rendszerrel (embernél MHC) hozható összefüggésbe (a szenzitív CBA/Ca egereknek H-2k haplotípusuk van) (35). Másrészt Long-Evans patkányokat alkalmaztunk kísérleteinkhez (ugyancsak érzékenyek karcinogén vegyületekre - lásd közlemények). Felvetődött a megfelelő oldószer kiválasztásának szükségessége is. Az apoláros policiklusos aromás vegyületek jól oldódnak DMSO-ban és olajban. Orális és i.p. (intraperitoneálisan - hasüregbe oltva) bejuttatva is aktív a DMBA a mikronukleusz teszt szerint. Más-más időpontban található a legtöbb mikronukleusz ha kukorica olajban, vagy DMSO-ban oldjuk a DMBA-t. Kukorica olajban oldva 24 óra körül van a csúcs, míg DMSO-ban oldva 48 óra körül figyelhető meg, az eritropoezis drámai csükkenése mellett (56). A fenti eredményeket megfontolva a kukorica olaj használata mellett döntöttünk.
21
Elektronmikroszkópos vizsgálat
Szövettani előkészítés: A vér kimosása a szervekből foszfát pufferrel (0,1 M, pH 7,4) Perfúziós fixálás (4% paraformaldehid + 1% glutáraldehid foszfát pufferben oldva) Utófixálás (kivett szerv) 1 éjelen át (4% paraformaldehid + 1% glutáraldehid, foszfát pufferben – immerziós fixálási módszerrel) Mosás foszfát pufferrel (0,1 M, pH 7,4) Utófixálás OsO4-al (2% OsO4 0,2 M foszfát pufferben oldva) 1 órán át 4 oC-on Mosás foszfát pufferrel (0,1 M, pH 7,4) Víztelenítés felszálló alkoholsorral (50-, 70-, 90-, 96%-os és abszolút alkohol), mosás 10-10 percig, a 70%-os alkoholnál uranil acetáttal blokkban kontrasztozva Mosás telített alkohollal 2x20 perc Mosás propilén-oxidban 2x5 perc Kezelés műgyanta (Durcupan): propilén-oxid 1:1 arányú keverékével 30 percig Kezelés műgyantával (Durcupan) 1 éjelen át Műgyanta (Durcupan) kicserélése Blokk készítés (zselatin kapszulába kerül a minta) Polimerizáció 48 órán át 56 oC-on Félvékony metszet készítése (festés toluidin oldattal) Ultravékony metszet készítése ultramikrotómmal (Leica Ultracut R)
Elektronmikroszkópos vizsgálat Jeol 1200-as transzmissziós elektronmikroszkópppal
22
RNS izolálás: Előkészítés: A cervikális diszlokációval elölt állatokból származó szervek mosása fiziológiás sóoldattal, homogenizálás Ultra Turrax T25 homogenizátorral 100 mg szövet/1 ml TRIZOL (GIBCO) oldatban.
Izolálás (1 ml homogenizátumból kiindulva): TRIZOL oldatban levő minta inkubálása szobahőn 5 percig 0,2 ml kloroform hozzáadása, minta összerázása kézzel (15 s) inkubálás szobahőn 2-3 percig Centrifugálás 12000 g-vel 15 percig 4 oC-on 0,5 ml izopropil alkohol hozzáadása a leszívott felülúszóhoz, inkubálás szobahőn 10 percig A felülúszót eltávolítjuk A csapadékot mossuk 70%-os etanollal, vortexelés Centrifugálás 7500 g-vel 5 percig 4 oC-on Minta szárítása, feloldása RN-áz mentes vízben, 10 perc inkubálás 55-60 oC-on A minta nukleinsav/fehérje arányának ellenőrzése fotometrálással (A260/A280>1,8) Az RNS blottolása: A blottert beáztatjuk DEPC-vízbe (DEPC: dietil-pirokarbonát), legalább 1 órára Fülke alatt megszárítjuk A membránt (Hybond+, Amersham) beáztatjuk 5XSSC-be (DEPC-es), 15 percre A membrán bal felső sarkát bevágjuk, ráhelyezzük a blotterre (Hoefer), bekapcsolt szívásnál szereljük össze a készüléket 50 µl 20x SSC-t (DEPC-es) átszívatunk minden lyukon Átszívatjuk a mintákat és a pozitív-negatív kontrollokat tartalmazó oldatokat (50-50 µl) 50 µl 20x SSC-t (DEPC-es) újra átszívatunk minden lyukon Szívás alatt szétszedjük a készüléket Membrán áztatása DEPC-es 0,4 n NaOH-ban 2 percig Membrán mosása DEPC-es 5x SSC-ben 1 percig UV fixálás 10 percig
23
DEPC-víz: Dietil-pirokarbonát 0,1%-os vizes oldata 20x SSC: 87,7 g NaCl 44,0 g trinátrium-citrát-dihidrát 500 ml-re kiegészítve 2x desztillált vízzel pH 7,0 (NaOH-val, vagy HCl-lel beállítva)
Hibridizálás (Amersham ECL kittel): Próba jelölése: Próba koncentrációjának beállítása a kitben levő vízzel 10 ng / µl-re Denaturálás 100 oC-on 5 percig Hűtés jégen 5 percig Centrifugálás 5s-ig Azonos mennyiségű jelölő reagens hozzáadása A jelölő reagenssel azonos mennyiségű glutáraldehid oldat hozzáadása Rövid (1 s) vortexelés Centrifugálás 5s-ig Inkubálás 37 oC-on 10 percig
Hibridizálás: A membránok előhibridizálása 15 percig 42 oC-on 0,125-0,25 ml / cm2 mennyiségű, a kit-hez tartozó hibridizációs pufferben A puffer leöntése A próba hozzáadása előmelegített pufferben Inkubálás 42 oC-on egy éjszakán át 42 oC-ra melegített “primary wash pufferrel” mosás 20 percig Előző mosás megismétlése 2x SSC-vel mosás szobahőn 5 percig, mosás ismétlése Detekciós oldat összemérése (detekciós komponensek 1:1 arányban)(0,125 ml / cm2 membrán), membránra engedése Inkubálás szobahőn 1 percig A felesleges detekciós oldat leitatása a membránról Folpack foliába csomagolás (buborékmentesen) 24
Röntgen kazettába helyezés Röntgenfilm behelyezése a kazettába, sötétszobában Film előhívása 15 perc elteltével Új film behelyezése, előhívása 0,5-2 óra múlva Az eredményt Quantiscan szoftver segítségével értékeljük ki
Primary wash puffer: 360 g urea (karbamid) 4,0 g SDS 25,0 ml 20x SSC 1 literre kiegészítve 2x desztillált vízzel
25
3.2. A kísérletek áttekintése:
Elektronmikroszkópos vizsgálat
1-NP és DMBA hatásának vizsgálata májban, rövid távú kísérlet DMBA indukált génexpresszióváltozások fehérvérsejtekben, rövid távú kísérletek
1-nitropirén indukált génexpresszió-változások szervekben, rövid távú kísérletek
1-nitropirén indukált génexpresszió-változások szervekben, hosszú távú kísérletek
1-NP indukált génexpresszióGénexpresszió-
változások fehérvérsejtekben
vizsgálatok
rövid távú kísérlet
Avas olaj hatásának vizsgálata a génexpresszióra szervekben, rövid távú kísérletek
DMBA és MBB interakciója, génexpresszió változások szervekben, rövid távú kísérlet
26
4. Eredmények és Megbeszélés 4.1.
Eredmények
4.2.
Az elektronmikroszkópos vizsgálat eredményei
Az elektronmikroszkópos vizsgálatot a sejtstruktúra elemzése céljából végeztük CBA/CA egerek májsejtjein. A kontroll csoportot i.p. oltottuk kukoricaolajjal, míg a kezelt csoportokat 1-nitropirénnel, illetve DMBA-val (mindkét esetben kukorica olajban oldva). A kapott képeket elemezve a sejtalkotók hasonló képet mutattak a kezelt és a kontroll csoportban 48 órával a kezelés után. Toxikus hatásra utaló sejtalkotó-deformitásokat nem találtunk (4. ábra).
4. ábra CBA/Ca egerek májsejtjeinek elektronmikroszkópos képei (a kép alján látható méretezés 200 nm-t mutat) a kezelés után 48 órával. Elsõ kép: kontroll, középsõ: 1-nitropirénnel kezelt, utolsó: 7,12-dimetilbenz(α)antracénnel kezelt.
Megállapítható tehát, hogy nem találtunk elektronmikroszkóppal kimutatható eltérést a májban kémiai karcinogén kezelés hatására az expozíciót követő 48 órával.
27
1. számú közlemény Gyöngyi Zoltán: Az in vivo onko/szuppresszorgén expresszió és karcinogén expozíció lehetséges összefüggései. Orvosképzés 5-6: 213-228, 1999.
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
2. számú közlemény Zoltán Gyöngyi, István Ember, István Kiss, Csaba Varga: Changes in expression of oncoand suppressor genes in peripheral leukocytes - as potential biomarkers of chemical carcinogenesis in a surrogate tissue. Anticancer Research 21(5): 3377-80, 2001.
45
46
47
48
49
3. számú közlemény István Ember, Zsuzsa Pusztai, Zoltán Gyöngyi, István Kiss: 1-nitropyrene induces elevated expression of oncogenes and tumor suppressor genes 24 hours after treatment in CBA/Ca mice. Anticancer Research 20(3): 1563-6, 2000.
50
51
52
53
54
4. számú közlemény Zoltán Gyöngyi, Edit Nádasi, Csaba Varga, István Kiss and István Ember: ”Long-term” effects of 1-nitropyrene on oncogene and tumor suppressor gene expression. Anticancer Research 21(6): 3937-3940, 2001.
55
56
57
58
59
5. számú közlemény István Ember, István Kiss, Zoltán Gyöngyi, Csaba Varga: Comparison of early onco/suppressor gene expressions in peripheral leukocytes and potential target organs of rats exposed to the carcinogenic 1-nitropyrene. European Journal of Cancer Prevention 9: 439-42, 2000.
60
61
62
63
64
6. számú közlemény Pál Perjési, Zoltán Pintér, Zoltán Gyöngyi and István Ember: Effect of rancid oil on some onco/suppressor gene expression in vivo. A short-term study. Anticancer Research 22: 225-230, 2002.
65
66
67
68
69
70
71
7. számú közlemény Pál Perjési, Zoltán Gyöngyi, Zsuzsa Bayer: Effect of E-2-(4’-methoxybenzylidene)1-benzosuberone on the 7,12-dimethylbenz(a)anthracene-induced onco/suppressor gene action in vivo II: a 48-hour experiment. Anticancer Research 20(3): 1839-48, 2000.
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
4.2. Megbeszélés 7,12-dimetil-benz(α)antracén például kátrányban, dohányfüstben, többször melegített sütésre használt olajokban található meg. Feltételezett humán karcinogén. Kísérleti állatokban többek között szarkómát, emlő karcinómát és leukémiát okoz. A DMBA-t a citokróm
P450
enzimcsalád
tagjai
metabolizálják.
A
metabolitok
(főleg
dihidro-diol-epixidok) között számos, az eredeti vegyületnél aktívabb rákkeltő található. Mivel az MBB a citokróm P450 enzimcsalád tagjait gátolja, ezen reaktív metabolitok mennyisége is csökken, tehát adott DMBA dózis mellett kisebb a karcinogén hatás, ha MBB is jelen van. A továbbiakban a génexpresszió-változások hátterében levő eseményeket elemezzük. A 7,12-dimetil-benz[α]antracén in vitro es egér (bőr) kísérletek szerint az esetek 99 százalékában depurináló adduktokat képez (egy százalék a DNS-hez stabilan kötődik) a 12-es metil csoporton keresztül kapcsolódva N-7 pozícióban az adeninhez, vagy a guaninhoz. Ha a metil-csoportot etil-csoportra cseréljük le, akkor a molekula (7,12-dietil-benzantracén) elveszíti karcinogén hatását, de a 7-etil-12-metil-benzantracén a DMBA-hoz hasonló hatású. Néhány metabolit, de főként a diol-epoxid származékok erősebb karcinogének, mint maga a DMBA. A depurinálódással járó mutáció kialakulásának a menete: - a DMBA, vagy származéka az adeninhez (purin bázis) kötődik - az N-7 adenin addukt és a deoxiribóz hidrolízissel leválik - purin-hiányos hely keletkezik - a következő DNS szintézis során az adenin beépülése a legvalószínűbb a purin-hiányos hellyel szembe - a kódoló szál replikálódása során az adeninnel szembe timin épül be, így megtörténik a transzverzió 4 óra alatt 40000 purin-hiányos helyet figyeltek meg sejtenként 4 óra alatt, míg spontán 10000 keletkezik egy nap alatt A depurináció hatására A→T transzverzió keletkezik a H-ras 61-es kodonjában (57). Az 1-nitropirén az adenin helyett inkább a guaninhoz kaocsolódik. Az 1-NP elsősorban G→T transzverziót okoz Salmonella törzsben (61%), másodsorban G→C transzverziót (24%). Az eredmény azért érdekes, mert a tüdő daganatokban a p53 génben a G→T transzverzió a leggyakoribb bázis-szubsztitúció. (58). 83
Egyszeri DMBA adása után (i.p.) a májban AT transzverziók figyelhetők meg a Ha-ras 61-es kodon második bázisában. A mutáció a DMBA-ra jellemző (bőr- és emlőkarcinómákban is megfigyelhető). A Ha-ras mutációt hordozó daganatok adenómák voltak, míg a gyakrabban előforduló Ki-ras mutációk (13-as kodon) mind karcinómák (59). Az A→T transzverziókkal (Ha-ras) a májban adenómák voltak karcinómák helyett, de B6C3 F1 egerekben hepatokarcinómát találtak ezzel a mutációval. Érdekes ellentmondás, hogy a tumor promóterek használata csökkentette a Ha-ras 61-es kodon mutációinak számát. Az A→T transzverziók kezdeti magasabb száma ellenére a 61-es kodon C→A mutáció gyakoriságának növekedését figyelték meg, amit a szelektív osztódási előnnyel magyaráztak (60). Az 1-nitropirénre és a DMBA-ra jellemző bázis-változások nem feltétlenül csak a gén kódoló szakaszát érintik. A gén szabályozó szakaszát érintő változások a gén expresszióját változtathatják meg. A ras és a myc onkogének transzformálni képesek a sejteket, de jóindulatú daganatok alakulnak ki együttes aktiválódásukkal (a normálisnál magasabb expresszió), a rosszindulatú daganatok kialakulásához a p53 mutációjának is jelen kell lennie. A ras megnövekedett aktivitása és a mutáns p53 jelenléte nem elégséges a rosszindulatú daganat kialakulásához. Nem csak a különböző gének hathatnak egymás expressziójára, hanem az egy géncsaládba tartozó, hasonló funkciót ellátók is. Ez figyelhető meg például a ras géneknél. A kivülről bejuttatott ras gén overexpressziója a család másik két tagjánál is expreszió-növekedést okoz. A Ha-ras nem a sejtciklus progresszióján, vagy a DNS szintézisen keresztül fejtette ki a géncsalád másik két tagjának expresszió-emelkedését, hanem más útvonalon át (61). Bár a ras géneket elsősorban a sejtosztódás kapcsán emtítik, néhány sejttípus nem a sejtosztódás
felgyorsulásával
válaszol
az
emelkedett
ras
expresszióra,
hanem
differenciációval (PC12 feokromocitoma sejtvonal), vagy a sejtciklus megállásával a két ellenőrző ponton (REF2 embrió fibroblaszt sejtvonal). Az ellenőrző pontokon való megállás azonban a p53 génhez köthető. A helyzetet tovább bonyolítja, hogy a myc a p53 promoterére hat, ez utóbbi pedig az Rb gén ellenőrzése alatt áll (62). A
p53
elégtelen
működése
genetikai
instabilitáshoz
vezet,
mely
a
kromoszóma-mutációkban, aneuploid sejtek felszaporodásában jelenik meg. A hagyományos modell szerint a ras aktivációját a genetikai instabilitással párhuzamos, abból eredő eseménynek tartották. Agapova és mtsai. azonban arról számolnak be, hogy a ras növeli a genetikai instabilitást és egyes esetekben a p53 expresszióját. Ez utóbbi esetekben a 84
kromoszóma-törések és az aneuploidiák száma is csökkent, ami a ras okozta hatás kompenzálását mutatja a vad típusú p53 által. A G1 és a G2 végén levő ellenőrző pontokon megáll a sejtosztódás, ha alkiláló ágenssel kezeljük a sejteket abban az esetben, ha a tumor szuppresszor gének megfelelően működnek. Ha a sejtosztódás nem áll meg és a mutációkat nem javítja ki a sejt, akkor a hibák az utód sejtben is megjelennek. Azokban a sejtekben, ahol a p53 normálisan működött, ott az emelkedett ras expresszió nem volt képes megakadályozni, hogy a sejtosztódás megálljon az ellenőrző pontokon. (63). A vad típusú P53 fehérje nagyon alacsonyan expresszálódik alap esetben. A fehérje hiánya, vagy elégtelen működése a mutációk számának növekedéséhez, genetikai instabilitáshoz vezet. Számos tumorban megfigyelhető a p53 emelkedett expressziója, de ekkor a funkcióját ellátni nem képes, (a vad típusnál hosszabb féléletidejű) p53 mRNS-ről átíródó mutáns fehérje szaporodik fel. Gyakran fordul elő az, hogy egy sejten belül megtalálható a mutáns és a vad típusú forma is, de ekkor a domináns negatív mutáció elvének megfelelően a 4 fehérjéből álló komplex működésképtenné válik. A c-myc gén ugyancsak transzkripciós faktor. Antiszensz c-myc oligonukleotiddal bizonyították, hogy a magas c-myc expresszió magas p53 gén aktivitással párosul, a c-Myc/Max heterodimer a p53 gén pozitív regulátora. A magyarázat abban rejlik, hogy a p53 promótere tartalmaz egy szekvenciát (CACGTG) amelyhez a hélix-hurok-hélix és a leucin zipzárral rendelkező DNS-kötő fehérjék (mint a Myc) képesek kapcsolódni. (64) A p53 a sejtciklus megállítása és az apoptózis megindítása mellett egy ma még részleteiben nem ismert szabályozási mechanizmus tagjaként a differenciációban is részt vehet, így a különböző szövetek mellett például pre-B sejtes L12 leukémia, a promielocitás HL-60 es az eritroleukémia K562 sejtvonalakban. Expressziójának növekedésekor ezt a hatást is figyelembe kell venni (65, 66). Különösen a fehérvérsejtek vizsgálatakor vált fontossá a policiklusos aromás vegyületek és kiemelten a DMBA és metabolitjainak specifikus citotoxikus hatása. A citokróm P450 gének, mint korábban említettük, metabolizálják a policiklusos aromás vegyületeket és reaktív bomlástermékek keletkeznek. Néhány bomlásterméknek, csakúgy, mint a kiindulási vegyületnek nem csak genotoxikus, de immuntoxikus hatása is van. A DMBA magas dózisban inkább leukémiát okoz emlőkarcinóma helyett. Ez a hatás valószínűleg a DMBA immuntoxikus hatásával függ össze. A DMBA-t magát is immunszuppresszánsnak tartják, de egyes metabolitok is felelősek lehetnek a hatásért (19). A humorális és a sejt-közvetített immunválaszt is csökkentik. A P450-függő monooxigenáz rendszer különböző metabolitokat képez a DMBA-ból. Egyes metabolitok, mint a 3,4-diol 85
származék, jelentősen magasabb (65-szörös) immun-szuppresszív hatást mutat. Citokróm gátló vegyületekkel, mint az alfa-naftoflavonnal, gátolni lehet ezen vegyületek az immunválaszt elnyomó hatását (67). A CYP enzimgátlás, így a karcinogenezist befolyásolja. A kitettség jól mérhető a limfociták addukt szintjével, vagy a hemoglobin-addukt szinttel. Adott belső dózis mellett azonban más és más biológiai hatást észlelhetünk a metabolikus enzimek és a DNS hibajavítás egyénenkénti különbözősége miatt. Ezért kerestünk olyan biomarkert, mely a korai biológiai hatást mutatja a belső dózis helyett és ezen felül a daganatképződés igen korai történéseire is érzékeny. A testvér-kromatida kicserélődés és a kromoszóma aberrációk a korai biológiai hatás biomarkerei, de a daganatképződés korai jeleit nem mutatják ki. A génexpressziós vizsgálatainkban először a 7,12-dimetil-benz(α)antracént használtuk karcinogén anyagként. A c-myc, a Ha-ras és a p53 gén expresszióját, mint biomarkert vizsgáltuk a lehetséges célszervekben és a perifériás fehérvérsejtekben 24 és 48 órával a kezelés után. A kísérleti állatok nőstény Long-Evans patkányok voltak. A c-myc ebben a kísérletben sem mutatott magas expressziót a szervek többségében, csak a májban és a lépben mutatott emelkedést 24 órával a DMBA kezelés után. A Ha-ras emelkedés minden szervben és időpontban jelen volt a karcinogén kezelés hatására, de a 24 óránál mért értékek jelentősebb eltérést mutattak a kezelt csoportban a kontrollhoz képest. A p53 expresszió értékei a Ha-ras généhez hasonlóan a kontrollhoz képest magasabbak voltak a kezelt csoportban, de magasabbak voltak a Ha-ras értékeinél is. A fehérvérsejtekben mért expressziós mintázat a tüdőben észleltéhez volt hasonló. A c-myc expressziója két esetet kivéve nem volt kimutatható. A Ha-ras és a p53 gén esetében azonban egyöntetűen emelkedett expressziót mértünk a szervekben és a fehérvérsejtekben. Ezt az emelkedést a DMBA karcinogén hatásának tulajdonítjuk. A perifériás vérből izolált fehérvérsejtekben mért Ha-ras és p53 expresszió a szervekben mérthez volt hasonló, ezért a vér ebben a kísérleti rendszerben jó biológiai mintának tűnik, a fehérvérsejtekben mért Ha-ras és p53 expresszió pedig jó biomarkere a DMBA expozíciónak. Az utóbbi két gén expresszió-növekedése tehát jelezheti a karcinogén expozíciót, de nem minden karcinogén esetében ilyen egyértelmű az összefüggés. Az 1-nitropirén (1-NP) állatkísérletekben és humán epidemiológiai tanulmányok szerint is rákkeltőnek bizonyult. A diesel motorok kipufogógázában, a cigarettafüstben és a füstölt élelmiszerekben is megtalálható. Elsősorban az exponált szervben alakul ki daganat, így az embernél a tüdőben, állatkísérletekben emésztőrendszerben. Állatkísérletekben az 86
expozíciótól távolabbi szervekben is előfordul daganat; bőr alá oltva, vagy szájon át adva emlőrákot, leukémiát és hisztiocitómát is okozhat (26,68). Néhány foglalkozásnál különösen nagy az 1-NP expozíció veszélye, de a városi lakosság is exponálódhat különösen csúcsforgalomban (23). Az 1-nitropirénről már korábban kiderült, hogy képes néhány (proto)onkogén és tumor szuppresszor gén expresszióját megemelni CBA/Ca egerek különböző szerveiben 48 órával a kezelés után. Jelen kísérletben a H-ras, N-ras, K-ras, valamint a c-myc és a p53 gének expresszióját vizsgáltuk a különböző szervekben 24 órával az 1-nitropirén kezelés után. A következő szerveket vizsgáltuk: tüdő, timusz, vese, máj, lép, nyirokcsomó, csontvelő. A ras gének nem mutattak szignifikáns eltérést kezelés után a kontrollhoz képest. A c-myc expressziója emelkedett a lépben, a nyirokcsomókban és a csontvelőben. A p53 expressziója emelkedett a lépben és a csontvelőben, de csökkent a nyirokcsomókban. Az érintett szervekben mért génexpresszió-emelkedés úgy tűnik, hogy összefüggésbe hozható az 1-nitropirén leukemogén hatásával. A fenti állatkísérletben nem sikerült kimutatni a ras gének expresszió-változását tüdőben és más szervekben sem. Kétségtelen, hogy az állati és az emberi szervezet különböző, tehát mindenképpen modellről van szó, de a korábbi eredmények – ahol a H-ras 48 órával a kezelés után magas expressziót mutatott - birtokában kijelenthetjük, hogy nem az ember és a kísérleti állat különböző érzékenységéből adódik a ras gének expresszió eltérésének hiánya, hanem abból, hogy e gének 24 óránál későbbi időben aktiválódnak. A 4. közleményben az 1-nitropirén hosszú távú hatását vizsgáltuk a tüdőben, a májban és a vesében a c-myc, a Ha-ras és a p53 gének expressziójára, karcinogén hatásra érzékeny CBA/Ca egerek szerveiben egyszeri expozíciót követően egy héttel, egy hónappal, három hónappal, hat hónappal és egy évvel. Kísérletünkben a génexpresszió-változás, mint biomarker használhatóságát teszteltük olyan eseteket modellezve, ahol az expozíciót követően még rövidebb, hosszabb idő eltelik a biológiai minta vételéig. A kezelés után egy héttel emelkedett a p53 expresszió a májban, de a tüdőben és a vesében csökkent. A c-myc és a Ha-ras mRNS szint ugyanakkor nem változott ebben az időpontban. Egy hónappal a kezelés után a p53 expressziója nőtt a vesében és a májban –ez utóbbiban a Ha-ras-é is. A többi időpontban és szervben nem volt változás a vizsgált gének expressziójában. Az irodalmi adatok szerint az 1-nitropirénnek és metabolitjainak koncentrációja elsősorban a vesében, a májban és a tüdőben marad legtovább magas. A karcinogén anyag koncentrációjának változását hosszú távon nem követték a vizsgált gének expresszió87
változásai kísérletünkben (a hosszú távú karcinogén-indukciós tesztek folyamatban vannak). Annak ellenére, hogy a kovalensen kötött 1-nitropirén metabolitok szintje a tüdőben, a májban és a vesében marad legtovább magas, a megfigyelt daganatok - a tüdőt kivéve mégsem
ebben
a
három
szervben
fordulnak
elő
legnagyobb
számban.
A
génexpresszió-változás mint biomarker pedig, a korábbi- és jelen kísérleteink eredményeit összevetve, úgy tűnik, hogy inkább a karcinogén expozíciót közvetlenül követő (egy-két nap), korai biológiai hatás kimutatásra alkalmas, mint a hosszú távú, a karcinogén expozíciót hetekkel, hónapokkal követő változások jelzésére. Mivel az 1-nitropirén a foglalkozási expozíciókon túl széles rétegeket érinthet (városi lakosság) indokolt lehet egy olyan biomarker vizsgálata, mely az expozícióból eredő korai biológiai hatást, esetleg a betegség korai felismerését is lehetővé teheti humán populációban. A fenti megfontolásokat figyelembe véve világos, hogy jól hozzáférhető biológiai mintát kell választani, mely jól jellemzi a célszervekben végbement változásokat és nem jelent nagy invazivitást. Korábbi kísérleteink alapján a c-myc, a H-ras és a p53 gén expresszióját, mint biomarkert vizsgáltuk a tüdőben, májban, nyirokcsomóban, vesében és a lépben, mint lehetséges célszervekben és a perifériás vér fehérvérsejtekben, mint helyettesítő szövet sejtjeiben 24 és 48 órával a kezelés után. Kísérleti állatoknak karcinogénekre érzékeny nőstény Long-Evans patkányokat választottunk. A c-myc expresszióját nem sikerült kimutatni egyik csoportban és időpontban sem. A 24 órás mérési időpontban a Ha-ras expressziója emelkedett mindegyik szervben, kivéve a nyirokcsomót. A 48. órában mért Ha-ras expresszió is magasabb a kontrollénál. A p53 expressziója volt a legmagasabb a három gén közül a kezelt és a kontroll állatokban egyaránt. Az eredmények szerint a c-myc nem használható a karcinogén expozíció és a daganatképződés korai markereként, mert az expressziója nem volt mérhető. Jelen kísérletünkben a fehérvérsejtekben mért Ha-ras és p53 expresszió csak a lépben mérttel korrelált. Korábbi kísérletünkben, ahol CBA/Ca egereket használtunk, a p53, a c-myc és a Ha-ras a csontvelőben, a nyirokcsomóban és a lépben mutatott magas expressziót. Mivel emberben az 1-nitropirén tüdőrákot okoz, mi is a tüdőben és a fehérvérsejtekben vártunk hasonló hatást. Az eredmény azonban elmaradt, amit a különböző expozíciós úttal és/vagy a fajok közötti különbözőséggel tudjuk magyarázni. A problémára a belégzéssel bejuttatott 1-nitropirénnel végzett állatkísérlet adhat választ. Az 1-nitropirénnel végzett kísérletünkben nem mutatott a fehérvérsejtekben mért Ha-ras és p53 expresszió olyan egyértelmű összefüggést a szervekben mérttel, mint a DMBA-nál. 88
Az étolajok, mint a kukorica olaj (többszörösen telítetlen zsírsavakat tartalmaz) hosszas tárolás, vagy sütés után kellemetlen szagúak és ízűek lesznek. Autooxidációjuk folytán hidroxiperoxidok és a további kémiai átalakulások eredményeképpen további átrendezett és rövidebb láncú termékek keletkeznek, melyek reakcióba lépnek lipidekkel, nukleinsavakkal és fehérjékkel. Az étolajok oxidálódásával olyan termékek keletkeznek, amelyek citotoxikus és mutagén hatással rendelkeznek, fogyasztásuk komoly rizikótényező a lakosságra, különösen a magyar lakosság részére. Kísérletünkben azt vizsgáltuk, hogy a genotoxikus hatást kísérik-e a kiválasztott gének expresszió-változásai. A c-myc, Ha-ras és a p53 gének expresszióját vizsgáljuk nőstény CBA/Ca egerek májában, tüdejében, veséjében, timuszában és lépében. A kukorica olajat négy évig tároltuk szobahőmérsékleten. Az állatokat három csoportra osztottuk. Az első csoportban levők fiziológiás sóoldatot kaptak hasüregbe oltva, a másodikban friss olajat, a harmadikban pedig avas olajat A gáz kromatográfia-molekulatömeg meghatározással (GC-MS) jellemeztük a friss és az avas olaj közötti különbséget. Az anilízissel a hexanálból átalakult hexanálsavat és további eljárással oxidált molekulákat sikerült kimutatni az avas olajban. A peroxid érték és a savassági érték jóval magasabb volt az avas olajban, mint a frissben. A génexpressziós vizsgálatok szerint a Ha-ras és a c-myc mRNS szint minden szervben egyöntetűen magasabb volt az avas olajjal oltott állatokban, mint a két kontroll csoportban. A p53 expressziója hasonlóan emelkedett volt minden szervben a timuszt kivéve. A Ha-ras magas expressziója különösen fontos, mert nem csak a genotoxikus hatásra utal, de a kémiai anyagokkal indukált daganatképződés korai jeleként is felfogható. Ez egybevág az avas olaj korábban bizonyított mutagén hatásával. A p53 gén pedig DNS károsodás hatására lép működésbe, megállítja a sejtciklust, lehetőséget adva a hibák kijavítására, vagy a programozott sejthalálra, így emelkedett expressziója a DNS károsító hatást jelzi. Az omega-6 típusú többszörösen telítetlen zsírsavakat tartalmazó olajok tumor promóter hatással rendelkeznek. A fenti eredményeink azonban felvetik azt, hogy egyes omega-6 többszörösen telítetlen zsírsavakat tartalmazó olajak nem csak tumor promóter, de karcinogén hatással is rendelkezhetnek. Az
E-2-(4’-metoxi-benzilidén)-1-benzoszuberon
(MBB)
kalkon-származék;
a
kalkonok a flavoniodok közé sorolhatók. A kalkonok a magasabb rendű növények széles körében előfordulnak, a vegyületcsoport tagjai között találhatók gyulladáscsökkentők, antioxidánsok, citoprotektív és daganatellenes hatású származékok. A kalkonok nem 89
reagálnak a nukleinsavak amino- és hidroxil-csoportjaival, így a daganatellenes hatást - sok manapság használt terápiás szerrel ellentétben - nukleinsav károsítás nélkül érik el. Korábbi kísérletek szerint az MBB citotoxikus különböző daganatból származó sejtvonalra; az összes teszt alapján 11-szer hatékonyabb volt, mint a referencia vegyület, a melphalan. Mi H-2k haplotípusú, karcinogén anyagokra érzékeny hím és nőstény CBA/Ca egereket használtunk a kísérletben. Ha-ras, c-myc és p53 gének expresszió-változását vizsgáltuk DMBA kezelés után és ennek a hatásnak a módosulását abban az esetben, ha egyszerre adjuk az MBB-t a DMBA-val, vagy ha egyiket, vagy másikat 24 órával korábban (potenciális kemoprevenciós tesztrendszer). Eredményként változatos képet kaptunk a gének expressziójáról a különböző szervekben. A hím állatok májában volt megfigyelhető génexpresszió csökkenés MBB hatására mindhárom vizsgált gén esetében, attól függetlenül, hogy kezeltük-e DMBA-val, vagy sem. Az MBB csökkentette a DMBA indukált c-myc és a Ha-ras expressziót azokban a csoportokban, ahol az állatok a DMBA kezeléssel egy időben, vagy előtte kaptak MBB-t. Ez a hatás antikarcinogén (kemopreventív) hatásra enged következtetni. A p53 viszont összességében emelkedett expressziót mutatott az MBB kezelés hatására. A p53 megnövekedett expressziója az osztódás fázisától függően megállítja a sejtciklust és időt hagy a sejtnek a keletkezett DNS károsodások kijavítására, vagy beindítja a programozott sejthalált. Valószínűsítjük ez utóbbi funkció túlsúlyát kísérletünkben, mivel már korábban bebizonyosodott, hogy az MBB apoptózist indukál Jurkat T sejtvonalban.
90
5. Összefoglalás Az irodalmi adatok és a Pécsi Tudományegyetem Humán Közegészségtani Intézetben eddig elvégzett kísérletek alapján körvonalazódnak a későbbiekben feltehetőleg a humán prevencióban-predikcióban esetleg diagnosztikában is használható módszerek, melyek alapján a daganat-kialakulásában közvetlenül részt vevő onkogének és tumor szuppresszor gének expresszió-változásai behatároló biomarkerként használhatók a jövőben. Ha molekuláris epidemiológiai alapon értékeljük a daganat-kialakulást (mint ahogyan egyre több daganatfajta esetén lehet ilyen "step by step" modellt felépíteni - lásd 1. számú közlemény), akkor jogosan merül fel a kérdés, hogy a hosszú látencia idő alatt a morfológiai malignizáció megjelenése előtt, de már az iniciáció + promóció (környezeti-kémiai) karcinogén hatása után a lappangó daganatkialakulás alatt is kell, hogy legyenek génszintű elváltozások (génexpresszió szinten is), amelyekről feltételezhetjük, hogy ezek, használható molekuláris-prediktív epidemiológiai biomarkernek bizonyulhatnak. A “step by step” onko/szuppresszor gén szintű történések vizsgálata pedig felfedheti a karcinogenezis egészen korai lépéseit is. A génexpressziót a prediktív medicina követéses, illetve a molekuláris epidemiológiai jellegű vizsgálatokban, a preventív medicina pedig aspecifikus, behatároló biomarkereként alkalmazhatja a korai expozíció, illetve a korai premorbid stádium felismerése mellett, míg a kuratív medicina a diagnosztikában használhatja majd. A kémiai karcinogénnel történt expozíciót a fehérvérsejtekből származó DNS, RNS és fehérjék vizsgálata is korán jelezheti a már jól ismert adduktok mellett, és a target szervek vizsgálata helyett. Előnye a könnyű hozzáférhetőség, ugyanakkor hátránya aspecificitása, bizonytalansága, individuális variabilitása, éppen ezért szükséges a nagyszámú vizsgálat és a kérdés az, hogy mennyire megbízható markere az expozíciónak, így mennyire valid információ nyerhető belőle. Hangsúlyozandó, hogy a génexpresszió - mint potenciális biomarker - vizsgálatok (fehérjére, vagy RNS-re vonatkozó), a szérumból, illetve fehérvérsejtekből, a magas rizikójú, exponált populáció markereiként, de semmiféleképpen nem korai önálló diagnosztikus, és főleg nem individuális diagnosztikus jelekként alkalmazhatók, hanem populációs szinten használhatók (munkahelyeken és más közösségekben vizsgálható az expozíció). Így az RNS vizsgálati módszereket, rizikóbecslésre, vagy behatároló markerekként lehet használni, összevetve fehérje szintű vizsgálatokkal, akár sejtpopuláció szinten is (pl. áramlási citometria). 91
A biomarkerek használatának vannak korlátai. Ezek közé tartozik, ha a célszervben történt hatást nem tudjuk megfelelően mérni, ha nem kellően jó az érzékenység és a specificitás, ha nagy az egyéni eltérés a biomarker szintje és a biológiai hatás között. Az emberi extrapolációnál újabb megoldandó kérdések bukkannak fel: -
az emberi expozíció általában krónikus kis dózisú expozíció, a modellek emberi interpretációja pedig egyszeri nagy dózisból indul ki
-
az expozíció mikor történt, milyen hosszan tartott
-
a biomarker validitása - életkortól, tápláltsági, egészségi állapottól, egyéni érzékenységtől függetlenül mutatja-e a biomarker a biológiai hatást
-
intervenció - mely értéknél milyen intervenció szükséges
-
etikai kérdések - a szűrésekre igaz alapszabály betartása tűnik célszerűnek, tehát ha van megfelelő eszköz a kezünkben ahhoz, hogy megszüntessük az expozíciót, vagy képesek vagyunk megelőzni a betegséget, akkor szabad használni az adott, egyébként valid biomarkert. Több biomarker egyidejű használatával megbízhatóbb adatokat kaphatunk az
expozícióról és a biológiai hatásról. A génmutációk, valamint a (proto)onkogének és a tumor szuppresszor gének expresszió-változásai is behatároló biomarkerként használhatók, populáció szintjén jelezhetik a karcinogén expozíciót és a korai biológiai hatást. Az adatok egyéni értékelése ugyancsak az expozícióra hívhatja fel a figyelmet, mely további, megerősítő vizsgálatokat igényelhet, mivel az egyéni genetikai háttér és az ebből adódó egyéni érzékenység is befolyásolhatja a mért értékeket, a tényleges biológiai hatást. A megfelelő gének kiválasztásával a betegség klinikai megjelenése előtt beavatkozhatunk, és elkerülhetjük a betegség kialakulását a további expozíció megszüntetésével, esetleg kemoprevencióval. Az egyént és a populációt ért környezeti hatás megértéséhez szükség van a környezet és a gének kölcsönhatásának jobb ismeretére ahhoz, hogy a kockázatot meg tudjuk becsülni. A környezeti hatások károsítják a géneket, ezt a károsító mechanizmust is meg kell érteni. Az egyes gének szerepének megismerése a genetikai betegségek (tágan ide lehet venni a daganatokat is) kialakulásában lehetőséget ad a prognózisra és a megelőzésre.
92
A molekuláris-genetikai epidemiológia felhasználási lehetőségei (69): -
A közegészségügy számára felhasználható adatok nyerése emberi génekről és ezek interakciójáról, így a megelőzhető rizikótényezőkről.
-
A betegségek megelőzésére alkalmas és közegészségügyi programokban alkalmazható genetikai tesztek kifejlesztése.
-
Populáción értelmezett megelőzőprogramokban használható géneltérések mérése a morbiditás csökkentése érdekében.
-
A genetikai kutatásokhoz újabb adatokat szolgáltat.
-
A gentikai rizikótényezőkről újabb információhoz juthatunk. A tézisben szereplő kutatásokkal a gén-környezet és gén-gén kölcsönhatások
megértéséhez is közelebb kerülhetünk, segít abban, hogy pontosabb képet kapjunk a karcinogén aktiválással és a korai biológiai hatással kapcsolatos gének aktiválódásának hálozatát. Az utóbbi években megjelent a DNS chip technológia, egyre jobban kiszorítva a hagyományos molekuláris biológiai módszereket. Segítségével rövid idő alatt nagy számú információt kaphatunk többek között a gének expresszió-változásairól. Új tudományágak születettek, nevezetesen a toxikogenomika és a farmakogenomika, melyek a toxikus anyagok, illetve új terápiás szerek génszintű hatásait vizsgálják. Ezt az utat járva a nagy számú gén egyidejű vizsgálatával. mRNS reverz transzkripción alapuló cDNS-é való átírás utáni génexpressziós mintázatot vizsgáló chipekkel további biomarkerként használható géneket találhatunk. A közeljövőben olyan chipeket szándékozunk használni, melyeket kifejezetten toxikológiai, farmakológiai vizsgálatokra terveztek. A további célkitűzésekben az eddig feltárt RNS-szintű vizsgálatok összehasonlítását tervezzük áramlási citometriával (onkoproteinek vizsgálata) és morfológiailag kontrollálható módszerekkel (FISH, in situ hibridizáció) pontosan azért, mert a daganatos betegségek intervenciójában igen hasznosan alkalmazható kemopreventívumok egyik hatékony elő-szűrő (preszkríning) modelljeként funkcionálhat állatmodellünk.
93
6. Válaszok a feltett kérdésekre -
A c-myc, ras és a p53 gének közül a ras és a p53 gének képesek voltak jelezni karcinogén anyagok (1-nitropirén, DMBA, és az avas olaj) expozíciójának korai hatását expressziójuk emelkedésével 24 és 48 órával a kezelés után az állatok szerveiben.
-
Az expozíciót követő későbbi időpontokban (1, 3, 6 és 12 hónappal a kezelés után) azonban az 1-nitropirén esetében nem tudtunk kimutatni a karcinogén expozícióra utaló expresszió-változást a vizsgált szervekben és génekben. A karcinogén anyag hatására bekövetkező
génexpresszió-emelkedés
tehát
átmenetinek
mondható
kísérleti
rendszerünkben (korai, behatároló biomarker). -
A perifériás vérből származó fehérvérsejtekben mért génexpresszió-emelkedés az esetek zömében jó összefüggést mutat a célszervekben mértekkel. Az 1-nitropirén esetében kevésbé, a DMBA esetében kifejezettebben utalt a Ha-ras és a p53 expresszió-emelkedés a karcinogén expozícióra a fehérvérsejtekben.
-
A karcinogén anyaggal (DMBA) indukált rövid távú génexpresszió-emelkedést csökkenteni tudtuk potenciális daganatellenes szer (MBB) egyidejű adásával ras és a p53 gének
esetében.
Ez
utóbbi
eredmény
megerősíti
azt,
hogy
e
két
gén
expresszió-emelkedése a karcinogén hatást jelzi, mivel az MBB a reaktív karcinogén metabolitok kialakulásának gátlásával csökkenti az aktív karcinogén formák mennyiségét, így az azok indukálta génexpresszió következetesen alacsonyabb volt.
94
7. Irodalom 7.1.
A dolgozat elkészítéséhez felhasznált irodalom
1. Adami HO, Day NE, Trichopoulos D and Willett WC: Primary and secondary prevention in the reduction of cancer morbidity and mortality. Eur J Cancer 37(l 8): S118-27. 2001. 2. Kertai P: Megelőző orvostan 456. oldal Medicina, Budapest, 1999. 3. Silbergeld EK, Davis DL: Role of biomarkers in identifying and uderstanding environmentally induced disease. Clin Chem 40(7): 1363-1367, 1994. 4. Scherer G, Frank S, Riedel K, Meger-Kossien I, Renner T: Biomonitoring of exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons of nonoccupationally exposed persons. Cancer Epid Biomarkers Prev 9: 373-380, 2000. 5. Brandt-Rauf PW, Smith S, Perera FP, Niman HL, Yohannan W, Hemminki K, Santella RM: Serum oncogene proteins in foundry workers. J Soc Occup Med 40(1): 11-14, 1990. 6. Ember I, Kiss I, Sándor J: Daganatepidemiológia Daganatprevenció In: Ádány R, Kásler M, Ember I, Kopper L, Thurzó L (eds) Az onkológia alapjai Medicina 34, 1997. 7. Ember I, Kiss I, Sándor J: Daganatepidemiológia Daganatprevenció In: Ádány R, Kásler M, Ember I, Kopper L, Thurzó L (eds) Az onkológia alapjai Medicina 21, 1997. 8. Ember I, Kiss I, Sándor J: Daganatepidemiológia Daganatprevenció In: Ádány R, Kásler M, Ember I, Kopper L, Thurzó L (eds) Az onkológia alapjai Medicina 43, 1997. 9. Talaska G, Roh J, Zhou Q: Molecular biomarkers of occupational lung cancer. Yonsei Med J 37(1): 1-18, 1996. 10. Fearon ER and Vogelstein: Identification of chromosome 18q gene altered in colorectal cancers. Science 247: 49-56, 1990. 11. Stanley K.A.: Molecular aspect of chemical carcinogenesis: The role of oncogenes and tumor suppressor genes. Toxicology 96: 173-194. 1995. 12. Brandt-Rauf PW, Pincus MR: Molecular markers of carcinogenesis. PharmacolTher 77(2):135-48 1998. 13. Pitot HC: Principles of cancer biology: Chemical carcinogenesis. In: DeVita VT Jr, Hellmann S, Rosenberg SA (eds) Cancer principles & Practice of oncology, 2nd edition Vol.1. Lippincott, Philadelphia, 79-99, 1985. 14. Kertai P: Megelőző orvostan 470. oldal Medicina, Budapest, 1999.
95
15. Yamagiwa K, Ichikawa K.: Experimentelle Studie über die Pathogenese der Epithelialgeschwülste. Mitt Med Fac Kaiserl Univ Tokyo (15):295-344, 1915. 16. Borza J és Melly B in: Munkaegészségtan (szerk.: Gortvay Gy), Budapest Novák R és tsa. 29-34, 1939. 17. Melendez-Colon VJ, Lunch A, Seidel A, Baird WM: Cancer initiation by polycyclic aromatic hydrocarbons results from formation of stable DNA adducts rather than apurinic sites. Carcinogenesis 20(10): 1885-91, 1999. 18. Peterson HP, Feldges A, von Wangenheim KH, Feinendegen LE: Preleukemic proliferative
changes
in
murine
bone
marrow
after
single
and
multiple
7,12-dimethylbenz(a)anthracene (DMBA)–applications. Leuk Res 17(1): 43-9, 1993. 19. Qing WG, Conti CJ, LaBate M, Johnston D, Slaga TJ and MacLeod MC: Induction of mammary
cancer
and
lymphoma
by
multiple
oral
doses
of
7,12-
dimethylbenz(α)anthracene in SENCAR mice. Carcinogenesis 18(3): 553-559, 1997. 20. Park KK, Kim YS: Tumor associated proteins of rat skin tumor induced by 7,12-dimethylbenz(a)anthracene. Yonsei-Med-J 30(3): 219-34, 1989. 21. Perrin C, Astre C, Broquerie E, Saint Aubert B, Joyeux H: Lingual fibrosarcoma induced by 7,12-dimethylbenz(a)anthracene in the rat. J Oral Pathol Med 19(1): 13-5, 1990. 22. Morse MA, Baird WM, Carlson GP: Distribution, Covalent binding and DNA adduct formation of 7,12 Dimethylbenz/a/anthracen in SENCAR and Balb/c mice following topical and oral administration. Cancer Res 47: 4571-4575, 1988. 23. Zwirner Baier I and Neumann HG: Polycyclic nitroarenes (nitro PAHs) as biomarker of exposure to diesel exhaust. Mutat-Res 441(1): 135-44, 1999. 24. Ember I: Környezetegészségtan (II) 7. oldal. POTE jegyzet, Pécs, 1993. 25. Tokiwa H, Nakanishi Y, Sera N, Hara N, Inuzuka S: Analysis of environmental carcinogens associated with the incidence of lung cancer. Toxicol-Lett 99(1): 33-41, 1998. 26. Imaida K, Lee MS, Land SJ, Wang CY, King CM: Carcinogenicity of nitropyrenes in the newborn female rat. Carcinogenesis 16(12): 3027-30, 1995. 27. Odagiri Y, Adachi S, Katayama H, Matsushita H, Takemoto K: Carcinogenic effects of mixture of nitropyrene in F344 rats following its repeated oral administrations. Dev Toxicol Env Sci 13: 291-307, 1986.
96
28. Beland FA, Smith BA, Thornton-Manning JR and Heflich RH: Metabolic activation of the 1-nitropyrene to a mammalian cell mutagen and carcinogen. Xenobiotica 22(9/10): 1121-1133, 1992. 29. Roy AK, Upadhyaya, Evans FE and El-Bayoumy K: Structural characterization of major adducts formed by reaction of 4,5-epoxy-4,5-dihidro-1-nitropyrene. Carcinogenesis 12(4): 577-581, 1991. 30. McCann J, Ames BN: Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/ microsome test: assay of 300 chemicals: discussion. Proc Natl Acad Sci 73(3): 950-954, 1976. 31. Nath J, Krishna G: Safety screening of drugs in cancer therapy. Acta Haematol 99(3): 138-47, 1998. 32. MacGregor JT, Casciano D, Muller L. Strategies and testing methods for identifying mutagenic risks. Mutat Res 455(1-2):3-20, 2000. 33. Perjési P, Bayer Zs, Ember I: Effect of E-2-(4’-methoxybenzylidene)-1-benzosuberone on the 7,12-dimethylbenz(a)anthracene-induced onco/suppressor gene action in vivo I: a 24-hour experiment. Anticancer Res 20 (1): 475-82, 2000. 34. Dimmock JR, Kampedu NM, Nazarali AJ, Kowalchuk TP, Motaganahalli N, Quail JW, Mykytiuk PA, Audette GF, Prasad L, Perjési P, Allen TM, Santos CL, Szydlowski J, DeClercq E, Balzarini J: Conformational and quantitative structure-activity relationship study of cytotoxic 2-arylidenebenzocycloalkanones. J Med Chem 42(8): 1358-1366, 1999. 35. Ember I, Nowrasteh G, Kiss I: Different H-2 complexes given altered susceptibility for chemical carcinogen induced oncogene expression. Anticancer Res 19: 1181-1186, 1996. 36. Ember I, Kiss I, Gombkötő G, Müller É, Szeremi M: Oncogene and suppressor gene expression as a biomarker for ethylene oxide exposure. Cancer Det Prev 22(3): 241-5, 1998. 37. Ember I, Kiss I, Málovics I: Oncogene and tumour suppressor gene expression changes in persons exposed to ethylene oxide. Eur J Cancer Prev 7(2):167-8, 1998. 38. Dictor M, Ehinger M, Mertens F, Akervall J, Wennerberg J: Abnormal cell cycle regulation in malignancy. Am J Clin Pathol 112(1): S40-52, 1999. 39. Lewin B ed.:Genes V. Oxford University Press : 256, 1995. 40. Hemminki K, Kumar R, Bykov VJ, Louhelainen J, Vodicka P: Future research directions in the use of biomarkers. Environ Health Perspect 104 (3): 459-64, 1996. 97
41. Lewin B ed.:Genes V. Oxford University Press : 1193-1218, 1995. 42. Kertai P, Ember I, Uzvölgyi É: DMBA indukálta myeloid leukémia F344 patkányokban. Magy Belorv Arch 40: 187-197, 1987. 43. Arany I, Rády P: Az onkogének szerepe a kémiai karcinogenezis többlépcsős folyamatában. Magyar Onkológia 36: 2-11, 1991. 44. Field IK: Molecular and genetic analysis reveas chromosomal deletinus genetic alterations and expression.of oncogenes/tumor suppressor genes in the progression of head and neck cancer In: Current perspectives on molecular and cellular oncology. Spandidos P (ed) 119-153. Vol 1. Part B.Press Ltd .IAI Press Ltd, London, 1992. 45. Spandidos D (ed): Current perspectives of molecular and cellular oncology. Mechanism of gene regulation. Vol 1. Part A. J. A.I. press London, 1994. 46. El Mahdani N, Vaillant C, Guiguet M, Prévot S, Bertrand V, Bernard C, Perc R, Bereziat G, Hermelin E: Overexpression of p53 mRNA in colorectal cancer and its relationship to p53 gene mutation. Brit J Cancer 75(4): 528-536, 1997. 47. Brandt-Rauf PW: Biomarkers of gene expression. Growth factors and oncoproteins. Environm Health Persp 105, 4: 807-816, 1997. 48. Harris CC, Holstein M: Clinical implications of the p53 tumor suppressor gene. New Engl J Med 10: 1318-1329, 1993. 49. Amendola P: Course of c-myc mRNA expression in the regenerating mouse testis determined by competitive reverse trascriptase polymerase chain reaction. DNA Cell Biol 13(11): 1099-1107, 1994. 50. Liwo A, Gibson KD, Scheraga HA, Brandt-Rauf PW, Monaco R and Pincus MR: Comparison of low energy conformations of an oncogenic and a non-oncogenic p21 protein, neither of which binds GTP or GDP. J Prot Chem 13(2): 237-251, 1994. 51. Bos JL: ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Res 49(17): 4682-4689, 1989. 52. Osaka M, Matsuo S, Koh T, Liang P, Kinoshita H, Maeda S, Sugiyama T: N-ras mutation in 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)-induced erythroleukemia in Long-Evans rats. Cancer Letters 91: 25-31, 1995. 53. Kwong YY, Husain Z and Biswas DK: c-Ha-ras gene mutation and activation precede pathological changes in DMBA-induced in vivo carcinogenesis. Oncogene 7(8): 1481-1489, 1992.
98
54. Husain Z, Fei YB, Roy S, Solt DB, Polverini PJ and Biswas DK: Sequential expression and cooperative interaction of c-Ha-ras and c-erbB genes in in vivo chemical carcinogenesis. Proc Natl Acad Sci 86(4): 1264-1268, 1989. 55. Pelling JC, Fischer SM, Neades R, Strawhecker J and Schweickert L: Elevated expression and point mutation of the Ha-ras proto-oncogene in mouse skin tumors by benzoyl peroxide and other promoting agents. Carcinogenesis 8(10): 1481-1484, 1987. 56. Ashby J and Mirkova E: Re-evaluation of the need of multiple sampling times in the bone marrow micronucleus assay: Result for DMBA. Env Mol Mutagenesis 10: 297-305, 1987. 57. Chakravarti D, Pelling JC Cavalieri EL and Rogan EG: Relating aromatic hydrocarbon-induced DNA adducts and c-H-ras mutations in mouse skin papillomas: The role of apurinic sites. Proc Natl Acad Sci. 92: 10422-10426, 1995. 58. Watanabe T, Takashima M, Kasai T and Hirayama T: Comparison of the mutational specificity induced by environmental genotoxin nitrated polycyclic aromatic hydrocarbons in Salmonella typhimurium his genes. Mutat Res 394: 103-112, 1997. 59. Manam S, Storer RD, Prahalada S, Leander KR, Kraynak AR, Ledwith BJ, vanZwieten MJ, Bradley MO and Nichols WW: Activation of the Ha-, Ki-, and N-ras in chemically induced liver tumors from CD-1 mice. Cancer Res 52: 3347-3352, 1992. 60. Manam S, Shinder GA, Joslyn DJ, Kraynak AR, Hammermeister CL, Leander KR, Ledwith BJ, Prahalada S, vanZwieten J and Nichols WW: Dose-related changes in the profile of ras mutations in chemically induced CD-1 mouse liver tumors. Carcinogenesis 16(5): 1113-1119, 1995. 61. Quincoces AF, Polanco I, Thomson T and Leon J: Positive autoregulation of ras gene expression in fibroblasts. FEBS Letters 416(3): 317-323, 1997. 62. Taylor WR, Egan SE, Mowat M, Greenberg AH and Wrigth JA: Evidence for synergistic interactions between ras, myc and a mutant form of p53 in cellular transformation and tumor dissemination. Oncogene 7: 1383-1390, 1992. 63. Agapova LS, Ivanov AV, Sablina AA, Kopnin PB, Sokova OI, Chumakov PM and Kopnin BP: p53-dependent effects of RAS oncogene on chromosome stability and cell cycle checkpoints. Oncogene 18: 3135-3142, 1999. 64. Roy B, Beamon J Balint E and Reisman D: Transactivation of the human p53 tumor suppressor gene by c-myc/max contributes to elevated mutant p53 expression in some tumors. Mol Cell Biol 14(12): 7805-7815, 1994. 99
65. Chylicki K, Ehinger M, Svedberg H, Bergh G, Olsson I and Gullberg U: p53-mediated differentiation of the erythroleukemia cell line K562. Cell Growth Differentiation 11: 315-324, 2000. 66. Tang PP and Wang FF: Induction of IW32 erythroleukemia cell differentiation by p53 is dependent on protein tyrosine phosphatase. Leukemia 14: 1292-1300, 2000. 67. Ladics GS, Kawabata TT and White KL: Suppression of the in vitro humoral immune response of mouse splenocytes by 7,12-dimethylbenz(a)anthracene metabolites and inhibition of immunosuppression by alpha-naphthoflavone. Toxicol Appl Pharmacol 110(1): 31-44, 1991. 68. El Bayoumy K, Chae YH, Upadhayaya P, Rivenson A, Kurtzke C, Reddy B, Hech SS: comparative tumorigenicity of benzo(a)pirene, 1-nitropyrene and 2-amino-1-methyl-6phenylimidazo(4,5)pyridine administered by gavage to female CD rats. Carcinogenesis 16: 431-434, 1995.
69. Khoury MJ: 1997: Genetic epidemiology and the future of disease prevention and public health. Epidemiol Rev 19(1): 75-80, 1997.
7.2. A jelölt közleményei 7.2.1. Hazai folyóiratban megjelent cikk: Gyöngyi Zoltán: Az in vivo onko/szuppresszorgén expresszió és karcinogén expozíció lehetséges összefüggései. Orvosképzés 1999 (5-6) 192-207.
7.2.2. Nemzetközi folyóiratokban megjelent cikkek: Zoltán Gyöngyi and Gábor Somlyai: Deuterium depletion can decrease the expression of c-myc, Ha-ras and p53 gene in carcinogen-treated mice. In vivo 2000 14 (3): 437-40. István Ember, Zsuzsa Pusztai, Zoltán Gyöngyi, István Kiss: 1-nitropyrene induces elevated expression of oncogenes and tumor suppressor genes 24 hours after treatment in CBA/Ca mice. Anticancer Research 2000 20 (3): 1563-6. Pál Perjési, Zoltán Gyöngyi, Zsuzsa Bayer: Effect of E-2-(4’-methoxybenzylidene)1-benzosuberone on the 7,12-dimethylbenz(a)anthracene- induced onco/suppressor gene action in vivo II: a 48-hour experiment. Anticancer Research 2000 20 (3): 1839-48. István Ember, István Kiss, Zoltán Gyöngyi, Csaba Varga: Comparison of early onco/suppressor gene expressions in peripheral leukocytes and potential target organs of 100
rats exposed to the carcinogenic 1-nitropyrene. European Journal of Cancer Prevention 2000 9: 439-42. Zoltán Gyöngyi, István Ember, István Kiss, Csaba Varga: Changes in expression of oncoand suppressor genes in peripheral leukocytes - as potential biomarkers of chemical carcinogenesis in a surrogate tissue. Anticancer Research 2001 21 (5): 3377-80. Zoltán Gyöngyi, Edit Nádasi, Csaba Varga, István Kiss and István Ember: ”Long-term” effects of 1-nitropyrene on oncogene and tumor suppressor gene expression. Anticancer Research. 2001 21 (6): 3937-3940. Pál Perjési, Zoltán Pintér, Zoltán Gyöngyi and István Ember: Effect of rancid oil on some onco/suppressor gene expression in vivo. A short-term study. Anticancer Research 2002 22: 225-230. István Ember, Zoltán Gyöngyi, István Kiss, Nowrasteh Ghodratollah and István Arany: The possible relationship between onco/suppressor gene expression and carcinogen exposure in vivo: Evaluation of a potential biomarker in preventive and predictive medicine. Anticancer Research 2002 22(4): 2109-2116.
7.2.3. Előadások és poszterek hazai konferenciákon: Balogh I, Gyöngyi Z, Molnár M, Benkő Zs, Sipiczki M: Új sterilitásgének izolálása és jellemzése Schizosaccharomyces pombe-nél. Debrecen, A Magyar Genetikusok Egyesülete III. Konferenciája 1994. Kerekes Irén, Gyöngyi Zoltán: A kromoszóma szegregáció molekuláris biológiája: a Muslica Horka génjének szerepe. Szeged, III. Ph.D. Előadói Napok (előadás) 1997. május 12-13. Kerekes Irén, Boros Imre, Horváth Zoltán, Gyöngyi Zoltán, Szabad János: A kromoszóma szegregációban szerepet játszó Drosophila Horka gén izolálása. Siófok IV. Magyar Genetikai Kongresszus 1999. április 11-14. Gyöngyi Zoltán, Somlyai Gábor: Csökkentett deutérium-tartalmú víz hatása korai génexpresszióra. A Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztálya 4. Munkaértekezlete 1999. május 10-13. Gyöngyi Zoltán, Perjési Pál és Ember István: Gyűrűs kalkonszármazékok daganatellenes hatásának vizsgálata. Hajdúszoboszló, Magyar Kemoterápiai Társaság XV. Konferenciája 2000. június 7-9.
101
Ember István, Kiss István, Varga Csaba, Gyöngyi Zoltán: A prevencióban alkalmazható új biomarkerek – potenciális lehetőségek. Debrecen, Magyar Higiénikusok Társasága Nemzeti Kongresszusa 2000. szeptember 20-22. Gyöngyi Zoltán, Grama László, Varga Csaba, Ember István: Áramlási citometria a prevencióban. Debrecen, Magyar Higiénikusok Társasága Nemzeti Kongresszusa 2000. szeptember 20-22. Varga Csaba, Gyöngyi Zoltán, Nádasi Edit, Varjas Tímea, Kiss István és Ember István: DNS száltörés, mint az alacsony dózisú sugárexpozíció biomarkere, és alkalmazása népegészségügyi vizsgálatokban. Gyula, Népegészségügyi Tudományos Társaság X. Nagygyűlése 2001. április 26-28. Gyöngyi Zoltán: Karcinogén anyagok hatása a fehérvérsejtek ras és p53 expressziójára. Pécs, Fiatal Onkológusok Fóruma 2001 május 11. Varjas Tímea, Gyöngyi Zoltán és Ember István: Új molekuláris biológiai módszerek a prevencióban. Nyíregyháza, NETT XI. Nagygyűlése 2002 április 11-13.
7.2.4. Előadások és poszterek nemzetközi konferenciákon: István Ember, István Kiss, Zoltán Gyöngyi: Onco and suppressor gene expression is useful biomarker of the early step on chemical carcinogenesis. The Biology and Genetics of Early Detection and Chemoprevention of Cancer. Bal Harbour, Florida, USA, 1999, October 6-10. István Ember, István Kiss, Zoltán Gyöngyi: Onco and suppressor gene expression is good biomarker of the early detection of chemical carcinogenesis expression. Conference on Screening and Early Detection of Cancer Develodment of a European Strategy. Vienna, Austria,1999, November 18-19. Pál Perjési, Zoltán Gyöngyi and István Ember: Effect MBB, a cyclic chalcone analogue, on the DMBA-induced onco/suppressor gene action in vivo. „Short term” studies. Tumor Prevention and Genetics. St. Gallen, Switzerland, 2000, February 17-19. Zoltán Gyöngyi, László Grama and István Ember: Investigation of p53 and Ha-ras gene expression changes as biomarkers of carcinogenic exposure. Tumor Prevention and Genetics St. Gallen, Switzerland, 2000, February 17-19. István Ember, István Kiss, Zoltán Gyöngyi, Csaba Varga, Pál Perjési: In inbred, sensitive mice could be induce in vivo oncogene expression with chemical carcionogens and could
102
be use as an early potential biomarker. Mouse Models of Cancer. La Jolla, California, USA, 2000, November 29- December 3. Gábor Somlyai, Gábor Jancsó, György Jákli, Tamás Berkényi, Zoltán Gyöngyi: The biological effect of deuterium-depleted water, a possible new tool in cancer therapy. International conference on new anticancer agents. Kapandriti, Athens, Greece, 2001, June 9-12. Zoltán Gyöngyi, Pál Perjési and István Ember: Effect of MBB a cyclic chalcome analogue, on DMBA-induced expression of onco/suppressor genes. Short term studies. International conference on new anticancer agents. Kapandriti, Athens, Greece, 2001, June 9-12. Árpád Németh, Zoltán Gyöngyi, Lajos Olasz, Zoltán Nyárády, Ágoston Ember and István Ember: The effect of cisplatin on early oncogene activation in vivo. International conference on new anticancer agents. Kapandriti, Athens, Greece, 2001, June 9-12. Gyula Kulcsár, Zsuzsa Brunner-Bayer, Zoltán Gyöngyi: Effect of a mixture of natural substances on carcinogen-treated mice. International conference on new anticancer agents. Kapandriti, Athens, Greece, 2001, June 9-12. Tímea Varjas, Edit Nádasi, Zsuzsa Pusztai, István Ember, Zoltán Gyöngyi, Andrey Durnev, István Kiss: Anticarcinogenic effect of Bemitil (an antioxidant compound) in a gene expression model. International conference on new anticancer agents. Kapandriti, Athens, Greece, 2001, June 9-12. Zoltán Gyöngyi and Gábor Somlyai: Effect of deuterium depletion on carcinogen induced gene expression. International conference on new anticancer agents. Kapandriti, Athens, Greece, 2001, June 9-12. István Ember, István Kiss, Zoltán Gyöngyi, Csaba Varga, Edit Nádasi: Onco and suppressor gene expression is a useful approximate biomarkers of early steps in chemical carcinogenesis. 18th International conference on human tumor markers. Riga, Latvia, 2001, June 17-20. Gábor Somlyai, Gábor Jancsó, György Jákli, Tamás Berkényi, Gábor Laskay, Zoltán Gyöngyi: The biological effect of deuterium-depleted water, a possible new tool in cancer therapy. The 8th symposium on analytical and environmental problems. Szeged, Hungary, 2001, October 1. István Ember, István Kiss, János Sándor, Csaba Varga, Zoltán Gyöngyi, Tímea Varjas, Ghodratollah Nowrasteh, Edit Nádasi, Árpád Németh: New molecular epidemiological biomarker in cancer prevention. Moleclar Epidemiology in Preventive Medicine Achievements ans New Challenges Krakow, Poland, 2002, June 20-22. 103
7.3. A tézisek alapját képező, folyóiratban megjelent közlemények
Gyöngyi Zoltán: Az in vivo onko/szuppresszorgén expresszió és karcinogén expozíció lehetséges összefüggései. Orvosképzés 5-6: 213-228, 1999. Zoltán Gyöngyi, István Ember, István Kiss, Csaba Varga: Changes in expression of oncoand suppressor genes in peripheral leukocytes - as potential biomarkers of chemical carcinogenesis in a surrogate tissue. Anticancer Research 21(5): 3377-80, 2001. István Ember, Zsuzsa Pusztai, Zoltán Gyöngyi, István Kiss: 1-nitropyrene induces elevated expression of oncogenes and tumor suppressor genes 24 hours after treatment in CBA/Ca mice. Anticancer Research 20(3): 1563-6, 2000. Zoltán Gyöngyi, Edit Nádasi, Csaba Varga, István Kiss and István Ember: ”Long-term” effects of 1-nitropyrene on oncogene and tumor suppressor gene expression. Anticancer Research 21(6): 3937-3940, 2001. István Ember, István Kiss, Zoltán Gyöngyi, Csaba Varga: Comparison of early onco/suppressor gene expressions in peripheral leukocytes and potential target organs of rats exposed to the carcinogenic 1-nitropyrene. European Journal of Cancer Prevention 9: 439-42, 2000. Pál Perjési, Zoltán Pintér, Zoltán Gyöngyi and István Ember: Effect of rancid oil on some onco/suppressor gene expression in vivo. A short-term study. Anticancer Research 22: 225-230, 2002. Pál Perjési, Zoltán Gyöngyi, Zsuzsa Bayer: Effect of E-2-(4’-methoxybenzylidene)-1benzosuberone on the 7,12-dimethylbenz(a)anthracene-induced onco/suppressor gene action in vivo II: a 48-hour experiment. Anticancer Research 20(3): 1839-48, 2000.
104
