PERBANDINGAN UJI HI DAN ELISA UNTUK MENGUKUR MATERNAL ANTIBODI ND PADA ANAK AYAM COMPARISON OF HI TEST AND ELISA FOR DETECTING ANTIBODY MATERNAL ND ON DAY OLD CHICK Oleh : Rahaju Ernawati* ABSTRACT This experiment was conducted to compare the sensitivity of Hemaglutination Inhibition Test (HI) and Enzym Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) to detect antibody maternal of Newcastle Disease. Fourty Day Old Chick (DOC) of layer as group I and fourty DOC of broiler as group II were used in this experiment. They were bled from heart puncture at 5 days old. All sera were tested by HI test and ELISA. The ELISA test resulted in higher antibody titres than HI test both in group I and group II. Sera of group I tested by HI and ELISA showed in a higher antibody titres than group II. PENDAHULUAN Penyakit ND (Newcastle Disease) pada ayam masih merupakan ancaman bagi para peternak di Indonesia. Kerugian akibat penyakit ini setiap tahun mencapai 340 milyar rupiah (Sofyan, 1996). Upaya menanggulangi dengan vaksinasi yang menggunakan berbagai vaksin dan berbagai program vaksinasi telah dilakukan, namun demikian seringkali titer antibodi yang dihasilkan tidak seperti yang diharapkan. Hal ini dapat disebabkan oleh berbagai faktor, baik faktor internal maupun eksternal. Untuk mengetahui keberhasilan program vaksinasi, secara berkala perlu dilakukan pemeriksaan serologik sehingga apabila hasilnya kurang memuaskan dapat segera dilakukan revaksinasi (Darjono, 1996). Berbagai uji serologi dapat dilakukan untuk evaluasi titer antibodi antara lain : Uji Hemaglutinasi Inhibisi (HI). Uji Pengikatan Komplemen (CFT), uji Virus Netralisasi maupun uji ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay) (Tizard, 1988). Uji HI lebih banyak dipakai karena selain mudah dan murah, uji ini spesifik dan dapat menunjukkan status kekebalan pada ayam. Pengalaman di lapangan menunjukkan bahwa ayam-ayam kebal terhadap serangan ND bila hasil titer antibodi HI tinggi (Philips, 1973).
—————————————— Lab. Virologi dan Imunologi FKH Unair
Uji ELISA lebih peka karena dapat mendeteksi sejumlah kecil protein antibodi dalam serum. Hanya membutuhkan serum dalam jumlah sedikit, namun biaya operasionalnya lebih mahal. Maternal antibodi pada anak ayam umur 1 minggu dapat dideteksi dengan uji ELISA, sedangkan dengan uji Virus Netralisasi hasilnya negatif (Gazela, 1980). Berdasarkan permasalahan tersebut, dikembangkan penelitian ini untuk mengetahui kepekaan uji HI dibandingkan dengan uji ELISA untuk mengukur titer antibodi maternal ND pada anak ayam. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada para peternak dalam memilih uji yang peka, mudah dan murah. METODE PENELITIAN Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Virologi dan Imunologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan Rancangan Randomized Group Posttest Only Design (Zainuddin, 1988). Data yang didapat dari penelitian ini dinyatakan dalam bentuk Log-2 dan diuji dengan uji Split-Plot dan dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Jujur, jika terdapat perbedaan yang bermakna (Steel and Torrie, 1980). Anak ayam petelur sebanyak 40 ekor sebagai kelompok I dan anak ayam pedaging sebanyak 40 ekor sebagai kelompok II digunakan dalam penelitian ini. Pada umur 5 hari dilakukan pengambilan serum darah pada semua kelompok ayam. Serum diperoleh dengan cara mengambil darah langsung dari jantung pada tiap-tiap ekor ayam. Serum kemudian diperiksa terhadap antibodi ND dengan uji HI dan ELISA. Pelaksanaan Uji HI Uji HI mikroteknik prosedur beta terhadap sampel serum dilakukan menurut metode Allan (1978). Pada microplate 0.025 ml, serum yang diperiksa diencerkan dengan kelipatan 2, menggunakan larutan garam fisiologik pada lubang ke-1 sampai dengan lubang ke-12. Antigen ND 0.025 ml sebanyak 4 HAU ditambahkan pada lubang ke-1 sampai lubang ke-11. Lubang ke-12 digunakan sebagai kontrol eritrosit. Microplate yang sudah berisi serum dan antigen tersebut selanjutnya diinkubasikan selama 30 menit dalam suhu kamar, kemudian ditambahkan eritrosit ayam 0.5% sebanyak 0.05 ml pada semua lubang dan diinkubasikan lagi selama 30 menit pada suhu kamar, baru kemudian dibaca titernya. Pelaksanaan Uji ELISA Prosedur pemeriksaan ELISA : Coating antibodi dilakukan dengan cara mengisi buffer coating (karbonal 50 mmol/l) pada semua lubang microplate sebanyak 100 ul tiap-tiap lubang, kemudian serum ayam yang diperiksa
diisikan pada lubang 1 sampai 10 sebanyak 50 ul dan “dibloking” selama 24 o jam pada suhu 4 C. Selanjutnya antigen ND sebanyak 100 ul diisikan pada o semua lubang dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 C. Microplate kemudian dicuci dengan buffer pencuci (NaCl 154 mmol/l; 0.05% Triton X-100; 0.02% NaN3) sebanyak 3 kali. Antiserum ND 1:100 (dibuat dari mencit yang diimunisasi dengan vaksin ND strain LaSota) dimasukkan ke dalam tiap lubang sebanyak 100 ul o dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 C kemudian dicuci 3 kali. Ditambahkan konjugat rabbit antimous Ig-G alkaline phosphatase sebanyak 100 ul pada semua lubang, kemudian dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 405 nm. Sebagai kontrol digunakan antiserum ND positif yang telah diencerkan dengan kelipatan 2 dan dimasukkan pada lubang 11 dan 1 14 12 tiap baris (pengenceran berurutan dari 2 – 2 ). Kontrol antiserum ND negatif dimasukkan pada 2 lubang dari baris terakhir. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil pemeriksaan rata-rata titer antibodi dari kelompok I (ayam petelur) dan kelompok II (ayam pedaging) dengan menggunakan uji HI dan uji ELISA tertera pada Tabel 1 dan 2. Tabel 1 Hasil Pemeriksaan Titer Antibodi (log-2) Pada kelompok Ayam Petelur dan Pedaging dengan uji HI dan ELISA Kelompok Ayam Petelur Kelompok Ayam Pedaging HI ELISA HI ELISA Titer f Titer f Titer f Titer f 3 5 6 7
2 17 19 2
Jumlah
40
8 9 10 11 12
4 17 15 2 2 40
5 6 7 8
16 10 10 4
10 11 12
18 14 8
40
40
Keterangan : f = frekuensi besaran titer antibodi
Tabel 2 Rata-rata Titer Antibodi (log-2) Kelompok Ayam Petelur dan Pedaging yang Diuji dengan Uji HI dan ELISA Kelompok Ayam HI ELISA d b PETELUR 5.475 9.525 PEDAGING
6.050
c
10.750
a
Keterangan : Superskrip yang berbeda menunjukkan adanya perbedaan yang nyata (p<0.05)
Dari hasil analisis varian didapatkan adanya perbedaan yang sangat nyata (p<0.01) pada jenis ayam, jenis uji, maupun interaksinya. Dengan uji Beda Nyata Jujur didapatkan bahwa titer tertinggi adalah pada ayam pedaging yang diuji dengan ELISA dan berbeda nyata (p<0.05) dengan kelompok lainnya.
Dari Tabel 1 dan 2 terlihat bahwa rata-rata titer antibodi pada kelompok ayam pedaging secara nyata lebih tinggi dari pada kelompok ayam petelur, baik dengan uji HI maupun uji ELISA. Perbedaan titer antibodi antara ayam petelur dengan ayam pedaging menurut standar masih mempunyai nilai proteksi yang sama apabila dilakukan uji tantang di lapangan. Menurut 4 6 Allan (1978) rata-rata titer antibodi 2 -2 menunjukkan angka mortalitas 0% bila ditantang dengan virus lapangan. Adanya perbedaan rata-rata titer antibodi antara dua kelompok ini diduga disebabkan karena program vaksinasi yang berbeda pada induk ayam pedaging dan induk ayam petelur. Diduga pada saat ayam bertelur, titer antibodi induk ayam pedaging lebih tinggi dibanding titer antibodi induk ayam petelur. Antibodi asal induk dalam bentuk Ig G ditransfer dari serum induk ke dalam kuning telur ketika telur masih di dalam ovarium. Ig G dalam kuning telur sepadan dengan titer Ig G dalam serum induk. Dalam perkembangan embrio, Ig G dalam kuning telur akan diserap tubuh sehingga dapat dijumpai dalam sirkulasi darah (Heller, 1977). Dengan uji ELISA rata-rata antibodi pada kelompok ayam pedaging dan kelompok ayam petelur lebih tinggi dibanding dengan uji HI. Uji ELISA lebih peka karena dapat mendeteksi sampai 0.0005 ug protein per-ml antibodi bila dibandingkan dengan uji HI (0.005 ug protein/ml) (Tizard, 1988). Meskipun ELISA lebih peka dibandingkan dengan uji HI namun tidak bisa menggambarkan titer proteksi dan titer yang menyebabkan penurunan produksi telur (Miers, et al. 1983). KESIMPULAN DAN SARAN Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa: 1) Terdapat perbedaan rata-rata titer antibodi maternal ND bila diuji dengan uji HI dan uji ELISA, baik pada kelompok ayam pedaging maupun kelompok ayam petelur; dan 2) Rata-rata titer antibodi bila diuji dengan uji ELISA menunjukkan titer yang lebih tinggi dibandingkan dengan hasil uji HI pada kedua kelompok ayam. Adapun saran yang diajukan adalah sebagai berikut: diperlukan adanya penelitian lanjutan dengan uji tantang untuk mengetahui nilai proteksivitas uji HI maupun uji ELISA. DAFTAR PUSTAKA Allan, W. H., V. E. Lancaster and B. Toth. 1978. Their Production and use ND Vaccines. FAO. Rome. Italy. 1-159 Darjono. 1996. Kecenderungan Penyakit Unggas di Jawa Tengah tahun 1996. Poultry Indonesia. 193 : 147-149
Gazela. Z. and R. A. Bankowski. 1980. Comparison of Tissue Culture Virus Neutralization Test and the Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay for Measurement Antibodies to Infectious Bronchitis. Avian Dis. Vol. 25 : 121 Heller, E. D. , D. Ben Natman and M. Perek. 1997. The Transfer of Newcastle Term Antibody from the Laying hen to egg and the chick. Research in vet. Science. 22 : 376-379 Miers, L.A., R. A. Baanskroski, J. C. Zee. 1983. Optimizing the Enzym Linked Immuno Sorbent Assay for Evaluating Immunity of Chickens to Newcastle Disease. Avian Dis. Vol. 27 : 1112-1125 Philips, J. M. 1973. Vaccination Againts Newcastle Disease. An Assesment of Hemaglutination Inhibition Titres Obtained from Field Samples. Vet. Rec. 93 : 577 – 583 Sofyan, S. 1996. Peranan Vaksinasi Newcastle Disease (ND) terhadap Peningkatan Populasi dan Produksi Ayam Buras serta Dampaknya Ditinjau dari Sudut Ekonomi Veteriner. Poultry Indonesia. 194 : 28 Steel, R. G. D. and J. H. Torrie. 1980. Principles and Produceres of Statistics. A nd Biochemical Aprroach. 2 ed. International Student. Tizard, I. A. dalam Partadireja, M. 1988. Pengantar Immunologi Veteriner. Edisi 2. Airlangga Univ. Press. Surabaya. Indonesia Zainuddin, M. 1988. Metodologi Penelitian. Diktat Kuliah Pasca Sarjana. Unair. Surabaya.
