PENGHAMBATAN PEROKSIDASI LIPID SEL KHAMIR Candida sp. Y390 OLEH EKSTRAK DAGING BUAH SALAK BONGKOK (Salacca edulis Reinw

PENGHAMBATAN PEROKSIDASI LIPID SEL KHAMIR Candida sp. Y390 OLEH EKSTRAK DAGING BUAH SALAK BONGKOK (Salacca edulis Reinw.)

DEDE FALAHUDIN

PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

ABSTRAK DEDE FALAHUDIN. Penghambatan Peroksidasi Lipid Sel Khamir Candida sp.Y390 oleh Ekstrak Daging Buah Salak Bongkok (Salacca edulis Reinw.). Dibimbing oleh ANNA P. ROSWIEM dan EMAN KUSTAMAN. Salak Bongkok merupakan jenis salak yang berasal dari desa Bongkok, kecamatan Conggeang, Sumedang, Jawa Barat. Salak Bongkok diketahui memiliki senyawa aktif sebagai antioksidan dan menghambat asam urat secara in vitro. Penelitian ini dilakukan untuk menguji aktivitas antioksidasi ekstrak salak Bongkok secara in vivo menggunakan sel khamir Candida sp.Y390 sebagai model percobaan. Ekstrak salak daging buah Bongkok mengandung senyawa fenolik, alkaloid, flavonoid, saponin, dan tanin. Ekstrak salak muda dan tua konsentrasi 1200 ppm dan 2000 ppm bersifat prooksidan terhadap sel khamir Candida sp.Y390 kondisi normal. Ekstrak salak tua 200 ppm dapat menghambat peroksidasi lipid sel khamir yang diberi parasetamol 0.3% lebih tinggi yaitu sebesar 61.06% dibandingkan vitamin C 0.225 mg/mL yaitu sebesar 53.65%. Ekstrak daging buah salak tua 200 ppm sudah mampu menurunkan lipid peroksida sel khamir yang diberi parasetamol 0.3%.

ABSTRACT DEDE FALAHUDIN. Inhibition of Lipid Peroxidation Yeast Cell Candida sp. Y390 with flesh Extract of Bongkok Snake Fruit (Salacca edulis Reinw.). Under the direction of ANNA P. ROSWIEM and EMAN KUSTAMAN. Bongkok snake fruit comes from Bongkok village, Conggeang district, Sumedang, West Java. This fruit has bioactive molecule as antioxidant and inhibits ureic acid by in vitro assay. This research was done for determining antioxidant activity of Bongkok snake fruit crude extract by in vivo assay using yeast cell Candida sp.Y390 as experimental model. It’s crude extract has secondary metabolite compound such as alkaloid, saponin, flavonoid, phenolic, and tannin. Crude extract immature and mature snake fruit 1200 ppm and 2000 ppm has prooxidant activity for normal yeast cell. Mature fruit snake crude extract 200 ppm could inhibit lipid peroxidase of yeast cell which was treated by paracetamol 0.3% higher is 61.06% compared with Vitamin C 0.225 mg/mL is 53.65%. Mature snake fruit crude extract has been reduce peroxide lipid yeast cell that has treated by parasetamol 0.3%.

PENGHAMBATAN PEROKSIDASI LIPID SEL KHAMIR Candida sp. Y390 OLEH EKSTRAK DAGING BUAH SALAK BONGKOK (Salacca edulis Reinw.)

DEDE FALAHUDIN

Skripsi sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biokimia

PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

Judul Skripsi : Penghambatan Peroksidasi Lipid Sel Khamir Candida sp. Y390 oleh Ekstrak Daging Buah Salak Bongkok (Salacca edulis Reinw.) Nama : Dede Falahudin NRP : G 44104002

Disetujui Komisi Pembimbing

Dr. Anna P Roswiem, M.S. Ketua

Ir. Eman Kustaman Anggota

Diketahui

Dr. drh. Hasim, DEA. Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Tanggal lulus :

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Purwakarta pada tanggal 10 Mei 1985 sebagai anak pertama dari empat bersaudara pasangan Yasin dan Masfuroh. Tahun 2004 penulis lulus dari SMA (Plus) 1 Cisarua-Bandung dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPM (USMI) pada program studi Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA). Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah melaksanakan Praktik Lapang (PL) di PT Indolakto Sukabumi selama periode Juli sampai Agustus 2007, dan menyusun laporan dengan judul Uji Mutu Susu Kental Manis Secara Mikrobiologi. Selain itu, penulis aktif dalam organisasi kemahasiswaan, yaitu ketua departemen Sosial Kemasyarakatan (SOSMAS) pada Kesatuan Aksi Mahasiswa Muslim Indonesia (KAMMI) Daerah Bogor periode 2006-2008, dan departemen Kerohanian dan Kewirausahaan pada Community of Research and Education in Biochemistry (CREB’s) periode 2006-2007.

PRAKATA Puji dan syukur senantiasa terpanjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan April ini adalah antioksidan, dengan judul Penghambatan Peroksidasi Lipid Sel Khamir Candida sp. Y390 oleh Ekstrak Daging Buah Salak Bongkok (Salacca edulis Reinw.). Ungkapan terimakasih penulis ucapkan kepada semua pihak yang telah membantu selama kegiatan penelitian dan penyusunan karya ilmiah. Penulis mendapatkan banyak bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak, baik secara langsung maupun tidak langsung yang terlibat dalam pelaksanaannya. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Anna P Roswiem, MS selaku pembimbing utama, Ir. Eman Kustaman selaku pembimbing kedua dan Dr. Heddy Julistiono, MS selaku pembimbing lapangan serta semua karyawan di Balitbiologi LIPI. Penelitian ini dapat terlaksana atas bantuan dana proyek di Balitbiologi LIPI. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada keluarga di Subang, Purwakarta dan teman-teman Biokimia 41, Nanda, Andre, Avriadi teman satu bimbingan, semangat ya, untuk sahabat terbaik Mayang Arum yang selalu memberi dukungan moril, materil, doa dan semangat selama penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Tak lupa saya ucapkan terima kasih untuk saudara seperjuangan di KAMMI Bogor 2004-2008. Penulis menyadari penulisan karya ilmiah ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu diharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dari berbagai pihak. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi kita semua.

Bogor, Agustus 2008

Dede Falahudin

DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... ix DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... ix PENDAHULUAN ..............................................................................................

1

TINJAUAN PUSTAKA Tanaman Salak Bongkok (Salacca edulis Reinw.) .................................... Khamir Candida sp .................................................................................... Radikal Bebas dan Peroksidasi Lipid......................................................... Parasetamol. ............................................................................................... Antioksidan ................................................................................................ Vitamin C. ..................................................................................................

1 2 2 4 4 5

BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ......................................................................................... Metode ...................................................................................................... Analisis Statistik .......................................................................................

6 6 8

HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi Daging Buah Salak Bongkok ..................................................... Uji Fitokimia Daging Buah Salak Bongkok............................................... Kurva Pertumbuhan Sel Khamir Candida sp.Y390 ................................... Pengukuran Peroksidasi Lipid Sel Khamir Candida sp. Y390 dengan HPLC. ............................................................................................ Penentuan Konsentrasi Ekstrak Daging Buah Salak Bongkok .................. Penghambatan Peroksidasi Lipid oleh Ekstrak Daging Buah Salak Bongkok. ....................................................................................................

8 9 10 10 11 12

KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................................... 13 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 14 LAMPIRAN ...................................................................................................... 17

DAFTAR GAMBAR Halaman 1

Buah salak Bongkok (Salacca edulis Reinw.) ............................................

2

2

Sel khamir Candida sp. ................................................................................

2

3

Mekanisme pembentukan lipid peroksida ...................................................

3

4

Reaksi pembentukan MDA dari PUFA teroksidasi ......................................

3

5

Struktur kimia kompleks MDA-(TBA)2 ......................................................

4

6

Struktur parasetamol ....................................................................................

4

7

Pembentukan metabolit reaktif NAPQI hasil metabolisme parasetamol oleh enzim sitokrom P-450 ......................................................

4

Mekanisme pembentukan radikal bebas dari struktur parasetamol oleh enzim/H2O2 ...........................................................................................

4

Struktur dasar flavonoid ..............................................................................

5

8 9

10 Kurva pertumbuhan sel khamir Candida sp................................................. 10 11 Kurva standar TMP-(TBA)2 ........................................................................ 11 12 Bentuk puncak kromatogram kurva standar MDA-(TBA)2 .......................... 11 13 Bentuk puncak kromatogram perlakuan ekstrak 200 ppm (atas) dan kurva standar TMP-(TBA)2 (bawah)...................................................... 11 14 Konsentrasi lipid peroksida sel khamir dengan perlakuan ekstrak muda dan ekstrak tua .................................................................................... 12 15 Konsentrasi lipid peroksida sel khamir yang diberi perlakuan. ................... 13

DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1

Tahapan penelitian ...................................................................................... 18

2

Ekstraksi daging buah salakBongkok (Harbone 1287) ................................ 19

3

Rendemen ekstrak daging salak Bongkok muda dan tua ............................ 19

4

Pembuatan kurva pertumbuhan sel khamir ................................................... 20

5

Populasi rerata pertumbuhan khamir Candida sp ......................................... 20

6

Penentuan kurva standar TMP (Li et al. 2004) ........................................... 21

7

Kurva standar TMP ..................................................................................... 21

8

Pengukuran lipid peroksida suspensi sel khamir Candida sp. terhadap penambahan ekstrak daging buah salak muda dan tua .................. 22

9

Pengukuran lipid peroksida suspensi sel khamir Candida sp. terhadap penambahan ekstrak daging buah salak muda ............................... 23

10 Pengukuran lipid peroksida suspensi sel khamir Candida sp. terhadap penambahan ekstrak daging buah salak tua ................................... 24 11 Pengukuran lipid peroksida suspensi sel khamir Candida sp. pada penelitian utama ................................................................................... 25 12 Pengukuran lipid peroksida suspensi sel khamir Candida sp. pada penelitian utama ................................................................................... 26 13 Hasil pengolahan data kurva pertumbuhan sel khamir Candida sp. dengan metode ANOVA ............................................................................... 27 14 Hasil pengolahan lipid peroksida penelitian pendahuluan dengan metode ANOVA .............................................................................................. 27 15 Hasil pengolahan data lipid peroksida penelitian utama dengan metode ANOVA .......................................................................................................... 28 16 Hasil pengukuran konsentrasi MDA penelitian pendahuluan dan utama dengan metode HPLC ..................................................................................... 29

1

PENDAHULUAN Penggunaan bahan alam untuk pengobatan merupakan hal umum di Indonesia, semakin banyaknya produk ramuan tradisional baik yang diolah dengan teknologi modern maupun secara sederhana yang beredar di masyarakat. Jenis tumbuhan dan buah-buahan banyak digunakan sebagai obat alternatif karena mempunyai aktivitas sebagai antioksidasi untuk mengatasi penyakit degeneratif dan penuaan akibat senyawa radikal bebas. Senyawa fitokimia sebagai senyawa kimia dalam tanaman mempunyai peranan yang sangat penting bagi kesehatan termasuk fungsinya dalam pencegahan terhadap berbagai penyakit degeneratif dan penyakit infeksi. Beberapa senyawa fitokimia yang diketahui mempunyai fungsi fisiologis adalah karotenoid, fitosterol, saponin, glikosinolat, polifenol, inhibitor protease, monoterpen, fitoestrogen, turunan senyawa flavonoid, sulfida, alkaloid, dan asam fitat (Winarsi 2005, diacu dalam Risnawati 2007). Radikal bebas merupakan senyawa kimia yang sangat reaktif karena memiliki satu atau lebih elektron ganjil tidak berpasangan, dan dapat mengubah molekul menjadi suatu radikal (Hariyatmi 2004). Senyawa radikal bebas di dalam tubuh ditimbulkan oleh radiasi sinar ultraviolet, asap rokok, pestisida, polutan, aktifitas fisik individu dan hasil metabolisme senyawa obat. Radikal bebas akan menyebabkan peroksidasi lipid, peroksidasi protein, kerusakan DNA, dan degenerasi sel. Akumulasi dari kerusakan tersebut dapat menginduksi beberapa penyakit termasuk kardiovaskular, penuaan, kanker, imflamasi, dan penyakit degeneratif lainnya (Hsu et al. 2007). Upaya pengobatan untuk memperlambat proses penuaan dan penyakit degeneratif akibat radikal bebas telah banyak dilakukan namun membutuhkan biaya yang mahal dan menghasilkan efek samping yang lebih besar. Oleh karena itu, pengobatan beralih kepada tanaman obat yang mempunyai senyawa aktif sebagai antioksidan dan model penelitian pada tingkat sel. Penelitian sistem pertahanan terhadap radikal bebas pada organisme tingkat tinggi memiliki kemiripan mekanisme pertahanan dengan sel khamir sebagai sel eukariot sederhana. Sel khamir yang mengalami stres oksidatif dapat menjelaskan mekanisme terjadinya penuaan, apoptosis, dan kerusakan pada tingkat serta dapat menjelaskan sejumlah aktivitas antioksidan dan kompleksitas mekanisme terhadap stres oksidatif (Manon 2004; Moradas et al. 1996).

Berdasarkan kemiripan tersebut, penelitian ini menggunakan sel khamir sebagai model untuk pengujian antivitas antioksidasi ekstrak daging buah Salak Bongkok (Salacca edulis Reinw). Pengukurannya berdasarkan penghambatan peroksidasi lipid pada sel khamir Candida sp. yang diberi parasetamol. Penelitian ini bertujuan membuktikan efek pemberian ekstrak daging buah salak Bongkok terhadap penghambatan peroksidasi lipid pada sel khamir Candida sp. yang diberi parasetamol. Aktivitas antioksidasinya dibandingkan dengan vitamin C 0.225 mg/mL. Hipotesis penelitian ini yaitu ekstrak daging buah salak Bongkok dapat menghambat peroksidasi lipid sel khamir Candida sp. yang diberi parasetamol. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai khasiat ekstrak daging buah salak Bongkok sebagai antioksidan alami sehingga akan meningkatkan nilai ekonomis dan daya guna buah salak Bongkok serta penggunaan sel khamir sebagai model sederhana untuk bioesai stres oksidatif.

TINJAUAN PUSTAKA Tanaman Salak Bongkok (Salacca edulis Reinw.) Tanaman salak merupakan tanaman yang termasuk dalam suku Palmae (Arecaceae) (Gambar 1). Salak Jawa var. ‘Bongkok’ merupakan jenis salak jawa (Salacca zalacca (Gaertner) Voss.) diklasifikasikan ke dalam kingdom Plantae, kelas Magnolophyta, ordo Liliopsida, famili Arecales, genus Salacca dan species Salacca edulis Reinw. (Wikipedia 2008). Nama salak Bongkok berasal dari tempat salak ini, yaitu desa Bongkok, kecamatan Conggeang, Sumedang, Jawa Barat. Bentuk buah salak Bongkok dalam satu tandan ada dua macam yaitu lonjong panjang dan bulat pendek dengan rasa yang tidak begitu manis, asam, sepat, dan agak pahit. Kulit buahnya bersisik besar dan berwarna merah kecokelatan mengkilat. Bijinya besar dan dalam tiap buah terdapat 2-3 biji. Ukuran buahnya besar dengan diameter dapat mencapai 6 cm. Setiap rumpun dapat menghasilkan 5-7 tandan. Salak tumbuh baik di dataran rendah hingga ketinggian 500 m dpl dengan tipe iklim basah. Tipe tanah podsolik dan regosol atau latosol disenangi oleh tanaman salak. Lingkungan yang dikehendaki mempunyai pH 5-7, curah hujan 1500--3000 mm per tahun

2

dengan musim kering antara 4-6 bulan. Pada kondisi lingkungan yang sesuai, tanaman mulai berbuah pada umur tiga tahun. Tanaman salak muda lebih senang hidup di tempat teduh atau di bawah naungan. Oleh karena itu, umumnya salak ditanam di bawah tanaman duku, durian, atau pohon jinjing atau sengon (Albezia sp.) (BAPPENAS 2000). Kajian terhadap senyawa aktif buah salak dan kulitnya belum banyak diketahui. Penelitian yang dilakukan terhadap varietas salak Pondoh dan salak Kalimantan menunjukkan kandungan fitokimia paling banyak dalam ekstrak etanol 70% kulit dan daging buahnya yaitu flavonoid dan tanin (Sahputra 2008). Ekstrak etil asetat, etanol, dan air daging buah salak Bongkok mempunyai kandungan fitokimia yaitu flavonoid, alkaloid, terpenoid, katekin, tanin, kuinon, asam askorbat 8,37 mg/100 g. Aktivitas biologis ekstrak salak ini yaitu sebagai antiokisdan dalam meredam radikal bebas diphenyl-I-pichrilhydrazin (DPPH) pada konsentrasi 200 µg/mL, 400 µg/mL, dan 2000 µg/mL dan menghambat pembentukan asam urat sebesar 27.24% pada konsentrasi 0.2 µg/m (Priyatno et al. 2006).

(Gambar 2). Klasifikasi dari khamir Candida sp. yaitu termasuk kingdom Fungi, filum Ascomycota, kelas Hemiascomycetes, ordo Sacharomycetales, famili Candidaceae, genus Candida, dan spesies Candida sp. (Barnet et al. 1982).

Gambar 2 Khamir Candida sp. (TNZBIRT 2008).

Radikal Bebas dan Peroksidasi Lipid

Gambar 1 Buah Salak Bangkok (Salacca edulis Reinw.) (BAPPENAS 2000).

Khamir Candida sp. Khamir merupakan mikroorganisme bersel satu yang berukuran 5-20 mikron, bentuknya oval, atau bulat tak beraturan. Khamir dapat diisolasi dari manusia atau hewan berdarah panas, namun yang utama diisolasi dari tanah, air laut, produk fermentasi, hewan berdarah dingin, dan sebagainya. Sel khamir memiliki beberapa organel seperti badan Golgi, inti sel, mitokondria, vakuola sebagai tempat menyimpan cadangan nutrisi, sitoplasma, dinding sel yang mengandung glukan dan manan serta terdapat kitin dan protein, dan membran sel yang terdiri atas lipid dan protein

Radikal bebas merupakan senyawa kimia yang sangat reaktif karena memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan. Radikal bebas di dalam tubuh merupakan produk normal dari proses metabolisme makanan untuk menghasilkan energi. Radikal bebas berfungsi untuk memberikan perlindungan tubuh terhadap serangan bakteri dan parasit, namun tidak menyerang sasaran spesifik, sehingga akan menyerang asam lemak tidak jenuh ganda dari membran sel, struktur sel, dan DNA (Hariyatmi 2004). Spesies oksigen reaktif dan turunan radikal lainnya akan menginduksi terjadinya peroksidasi lipid yang akan merusak jaringan sebagai awal patogenesis penyakit (Tukozkan et al. 2006). Secara umum, peroksidasi lipid dibagi tiga tahap reaksi yaitu tahap inisiasi, propagasi, dan terminasi (Murray et al. 2001) (Gambar 3). Reaksi peroksidasi lipid diawali melalui pengambilan sebuah atom hidrogen dari gugus metilena (-CH2-) pada polyunsaturated fatty acid (PUFA) oleh radikal bebas menghasilkan radikal bebas lipid. Hal ini disebabkan adanya ikatan rangkap pada asam lemak yang dapat melemahkan ikatan antara atom C dan H yang berdekatan dengan ikatan rangkap,

3

sehingga atom H mudah diambil oleh radikal bebas. Setelah itu, terjadi proses propagasi dengan adanya penataan ulang untuk menstabilkan radikal bebas dengan membentuk diena terkonjugasi. Diena terkonjugasi jika bereaksi dengan O2 akan membentuk radikal lipid peroksil yang akan mengambil atom hidrogen pada rantai lipid selanjutnya sehingga terbentuk lipid hidroperoksida yang stabil pada suhu fisiologis atau suhu tubuh. Namun, lipid hidroperoksida akan dikatalisis oleh logam besi (Fe) dan tembaga (Cu) yang terdapat di dalam tubuh membentuk senyawa berbahaya seperti epoksida, keton, asam, dan aldehid. Senyawa aldehid yang dihasilkan dari peruraian hidroperoksida adalah malonaldehida (MDA), akrolein, dan 4hidroksinonenal (Perrone et al. 2008). Senyawa aldehid tersebut akan menyerang protein terutama pada gugus tiol (-SH) dan gugus amin (-NH2), sehingga enzim-enzim yang membutuhkan senyawa-senyawa tersebut untuk aktivitasnya akan terhambat. Selain itu, jalur lainnya yang ditempuh oleh lipid hidroperoksida yaitu membentuk peroksida siklik yang disebut endoperoksida. Tahap terakhir yaitu tahap terminasi yang terjadi ketika radikal lipid peroksida bereaksi dengan radikal bebas yang lain seperti senyawa antioksidan atau senyawa biologi yang lain. Konsentrasi lipid peroksida salah satunya dapat diukur melalui konsentrasi malondialdehida (MDA) sebagai produk akhir reaksi tersebut (Gambar 4). Menurut Tukozkan et al. (2006), MDA adalah senyawa dialdehida atau berkarbon tiga yang reaktif yang dihasilkan dari peroksidasi lipid pada membran sel (Gambar 5). MDA dalam material hayati terdapat dalam bentuk bebas atau membentuk ikatan silang dengan berbagai molekul dan merupakan penanda toksisitas sel, mutagenesis, dan penguraian lipid pada membran sel (Risnawati 2007). Konsentrasi MDA yang terakumulasi secara in vivo di dalam organ dan partikel subseluler dapat di ukur menggunakan uji asam 2tiobarbiturat (Uji TBA) (Ohkawa 1978). Metode ini telah lama digunakan untuk menguji kerusakan organ akibat peroksidasi lipid (Tukozkan et al. 2006). Metode TBA dimulai sejak Berneheim et al. (1948) dan Wilbur et al. (1949) menemukan adanya reaksi hasil oksidasi PUFA dengan TBA membentuk kompleks warna merah muda (Ohkawa et al. 1978). MDA akan bereaksi melalui penambahan nukleofilik karbon 1

MDA dengan karbon 5 TBA membentuk senyawa kompleks MDA-(TBA)2 yang berwarna merah muda dan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 532 nm. Warna merah yang terukur sebanding dengan tingkat peroksidasi lipid oleh radikal lipid, radikal lpid peroksil, dan radikal hidroksil (Tukozkan et al. 2006). Metode pengukuran kompleks MDA(TBA)2 dengan spektrofotometer sangat sederhana dan mudah diulang (reproducible), namun kurang spesifik karena TBA dapat bereaksi dengan senyawa berkarbonil lainnya seperti 2-alkenals, 2,4-alkenadials, dan 2,4hidroxyalkenals serta senyawa-senyawa non lipid lainnya seperti gula, asam amino, urea, biliverdin, glioksal, dan furfural aldehid (Nelsen et al. 1997

Gambar

Gambar 4

3

Mekanisme peroksida.

pembentukan

lipid

Reaksi pembentukan MDA dari PUFA’S teroksidasi

Gambar 5 Struktur kimia kompleks MDA-(TBA)2 (Wikipedia 2008).

4

Saat ini, metode uji TBA dikombinasikan dengan high performance liquid chromatography (HPLC) sehingga adanya metode HPLC-TBA assay. Metode ini dapat meningkatkan spesifikasi dan akurasi pengukuran konsentrasi kompleks MDA(TBA)2 (Lykkesfeldt 2001). Sensitifitas metode HPLC-TBA assay sudah dilaporkan oleh Young et al. (1991) dan Richard et al. (1992). Selain itu, pernyataan Tukozkan et al. (2006) yang menyatakan bahwa metode HPLC-TBA assay dengan derivatisasi 2.4dinitrophenylhydrazine (DNPH) menghasilkan pengukuran yang lebih akurat dibandingkan metode konvensional spektrofotometri (TBA assay).

unsur sel hati yang berikatan secara kovalen dengan radikal bebas yang mendorong terjadinya peroksidasi lipid sebagai awal terjadinya cidera sel sampai kematian sel atau nekrosis (Gambar 7). Pernyataan tersebut sejalan dengan apa yang diungkapkan oleh Kapiotis et al. (1997), parasetamol akan membentuk radikal bebas apabila berikatan dengan enzim atau H2O2 (Gambar 8).

Gambar 6 Struktur parasetamol (Gonzalez 2005)

Parasetamol Salah satu obat yang bersifat hepatotoksik adalan parasetamol. Senyawa ini merupakan kelompok obat para amino fenol yang berfungsi sebagai analgesik dan antipiretik (Gambar 6). Parasetamol memberikan efek yang sangat baik dan aman jika digunakan dalam dosis pengobatan yang tepat. Parasetamol diabsorbsi oleh tubuh dengan cepat dan hampir sempurna di saluran cerna. Setelah pemberian oral kadar puncak dalam plasma dicapai dalam 10-60 menit. Distribusi parasetamol terjadi dengan cepat dan merata ke hampir seluruh tubuh. Sekitar 25% parasetamol dalam darah terikat oleh protein plasma dan mempunyai waktu paruh 1,25-3 jam (Ganiswara 1995, diacu dalam Risnawati 2007). Parasetamol dimetabolisme di hati oleh sistem enzim mikrosomal. Jalur utama metabolisme parasetamol adalah melalui konjugasi dengan asam glukoronat (60%), asam sulfat (35%) dan sistein (3%). Sedangkan sebagian kecil melalui jalur lainnya yakni oleh sistem enzim mikrosom sitokrom P-450, parasetamol dimetabolisme menjadi metabolit reaktif antara yaitu Nasetil-p-benzokuinonimin (NAPQI). Pemakaian parasetamol dosis lazim, metabolit reaktif terbentuk dalam jumlah kecil dan diinaktivasi melalui konjugasi dengan glutation dan selanjutnya diekskresi dalam urin sebagai asam merkapturat. Namun, penggunaan parasetamol dosis tinggi atau toksik, jalur utama metabolisme parasetamol terlampaui, sehingga metabolisme jalur lain meningkat. Akibatnya glutation habis terpakai untuk menetralkan NAPQI yang terbentuk dalam jumlah berlebihan. Selanjutnya NAPQI akan berikatan dengan makromolekul unsur-

Gambar 7 Pembentukan metabolit reaktif NAPQ1 hasil metabolisme parasetamol oleh enzim sitokrom P-450 (Gonzalez 2005). OH

O H

Enzim/H 2 O2

*

NH O

NH

C O CH 3

C CH3

Parasetamol Free Radical

Parasetamol

Gambar 8 Mekanisme pembentukan radikal bebas dari struktur parasetamol oleh enzim/H2O2 (Kapiotis et al. 1997).

Antioksidan Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menunda, memperlambat, atau mencegah terjadinya autooksidasi oleh radikal bebas. Antioksidan terdiri atas enzim antioksidan dan mikronutrien antioksidan.. Enzim antioksidan dibentuk dalam tubuh, yaitu superoksida dismutase (SOD), glutation

5

peroksidase, katalase, dan glutation reduktase. Sedangkan mikronutrien antioksidan diantaranya betakaroten, vitamin C dan vitamin E. B-karoten merupakan scavenger (penyapu) oksigen tunggal, vitamin C pemulung superoksid dan radikal bebas yang lain, sedangkan vitamin E merupakan pemutus rantai peroksida lemak pada membran dan low density lipoprotein (LDL) ( Marks et al. 2000). Senyawa fenolik telah diketahui mempunyai aktivitas dalam menangkap radikal bebas. Senyawa fenolik diantaranya flavonoid, asam fenolat, stilbenes, lignan, lignin, dan tanin (Hsu et al. 2007). Flavonoid merupakan salah satu dari sekian banyak senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan oleh tanaman yang berperan sebagai antioksidan, yang bisa dijumpai pada bagian daun, akar, kayu, kulit, tepung sari, bunga dan biji. Flavonoid merupakan senyawa turunan dari heterosiklik 2-fenil-1,4-benzopiron (Gambar 9). Cincin benzena (cincin A) dihubungkan dengan cincin karbon hetero siklik (cincin C) dan karbon C-2 yang membawa gugus fenil (cincin B) sebagai substitusi (Cotelle 2001). Flavonoid di alam terdapat dalam dua bentuk, yaitu flavonoid glikosida (dengan gula terikat) dan flavonoid aglikon (flavonoid tanpa gula terikat). Flavonoid glikosida umumnya lebih larut dalam air, sebaliknya flavonoid aglikon lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform. Senyawa flavonoid tidak stabil terhadap pengaruh cahaya, oksidasi, dan perubahan kimia, sehingga apabila teroksidasi strukturnya akan berubah dan keaktifannya menurun bahkan hilang. Gugus 3’,4’-dihidroksi pada cincin B merupakan target radikal bebas yang berfungsi sebagai antioksidan yang didukung oleh ikatan ganda karbon C-2 dan C-3 yang berkonjugasi dengan gugus 4-keto. Sedangkan gugus 7,8-dihidroksi pada cincin A akan menurunkan aktivitas radikal bebas. Senyawa ini juga bertindak sebagai penampung baik radikal hidroksi dan superoksida, dengan demikian mampu melindingi lipid membran terhadap reaksi yang merusak (Robinson 1995). B O

A

C

O

Gambar 9 Struktur dasar flavonoid (Cotelle 2001).

Vitamin C Vitamin C merupakan nutrien dan vitamin yang larut dalam air yang mempunyai sifat sebagai pereduksi (reducing agent). Vitamin C memegang peranan penting dalam sintesis hormon dan neurotransmiter serta sebagai kofaktor untuk beberapa enzim tubuh (Hambly 2000). Vitamin C merupakan antioksidan hidrofilik sehingga sangat berperan dalam sitoplasma sel. Vitamin ini menerima elekron tunggal dari superoksida, hidrogen peroksida, radikal peroksil, dan radikal hidroksil. Vitamin C juga berperan dalam memperbaiki radikal vitamin E menjadi vitamin E stabil. Nama kimianya yaitu asam l-askorbat (C6H8O6). Vitamin C diperoleh dari buah beri, buah-buahan sitrus, dan sayuran hijau (Hardesty 1998). Sifat antioksidan vitamin C disebabkan karena kemampuannya dalam mempengaruhi reaksi redoks-potensial reduksi zat-zat yang larut dalam air di dalam dan di luar sel dalam sistem biologis. Vitamin C yang larut dalam air dapat menangkap radikal bebas hasil samping proses oksidasi sehingga kerusakan jaringan dapat dicegah (Linder 1992). Asam askorbat mudah dioksidasi menghasilkan bentuk dehidro-asam askorbat dengan melepaskan dua atom hidrogen. Bentuk normal dan hasil oksidasinya di dalam tubuh berada dalam keadaan seimbang, namun aktivitas bentuk dehidronya kurang stabil didalam cairan tubuh. Vitamin C sangat sebsitif terhadap cahaya, panas, dan adanya ion logam (Hardesty 1998). Vitamin C dapat meningkatkan sistem kekebalan tubuh, menjaga kekuatan jaringan ikat (yang berfungsi mempercepat penyembuhan luka, luka bakar, serta patah tulang), memperkuat elastisitas jaringan ikat dan tulang rawan pada sela-sela sendi di tulang belakang (sehingga mencegah terjadinya nyeri punggung dan cedera akibat olahraga), meningkatkan penyerapan kalsium untuk pembentukan tulang, mempengaruhi pembentukan sel-sel darah merah pada sumsum tulang belakang, bahkan menghambat terbentuknya nitrosamin yang merupakan bahan yang bisa menyebabkan kanker (Hardesty 1998). Vitamin C pada kadar yang tinggi dapat bersifat racun bagi tubuh, sehingga menurut Julian (1969), Vitamin C dapat berfungsi sebagai antioksidan jika kadarnya dalam serum sebesar 5 mg/mL. Sedangkan pada konsentrasi maksimum 50 mg/mL, vitamin C berfungsi sebagai prooksidan sehingga dapat membunuh sel kanker, tetapi dapat juga membunuh sel normal (Yomes 2000).

6

BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah buah salak Bongkok yang diperoleh dari perkebunan masyarakat di desa Bongkok, kecamatan Conggeang, Sumedang, Jawa Barat; biakan khamir Candida sp. Y390 dari koleksi Balai Penelitian dan Pengembangan Bidang Mikrobiologi, Puslit Biologi, LIPI; Vitamin C dan parasetamol dari PT Kimia Farma, bakto pepton, ekstrak khamir, bakto agar, KH2PO4.3H2O, K2HPO4.3H2O, MgSO4.7H2O, ZnSO4.7H2O, MnSO4.H2O, CuSO4, glukosa, Metanol, gliserol, akuades steril, asam trikloroasetat (TCA) 75%, asam-2tiobarbiturat (TBA) 0.67%, dan 1,1,3,3,tetrametoksipropana (TMP) 0.1 mM sebagai larutan standar. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, shaker, autoklaf, laminar air flow hood, vortex, spatula segi empat, inkubator, penangas air, termometer, filter Whatman milipore 0.45?m, evaporator, mikropipet, neraca analitik, neraca kasar, sentrifus, tabung sentrifus, dan HPLC. Metode Ekstraksi Buah Salak Bongkok (Harbone 1987) Daging buah salak Bongkok diekstraksi menggunakan metode Harbone (1987) yang telah dimodifikasi. Daging buah salak Bongkok dibersihkan, dipotong kecil dan tipis, dikeringkan udara lalu dioven pada suhu 40-60ºC dan dibuat serbuk. Sebanyak 20 gram serbuk daging buah salak Bongkok diekstraksi menggunakan pelarut etanol 70% secara maserasi dengan perbandingan 1:5 (Raflizar 2006) selama 24 jam pada suhu ruang, maserasi dilakukan triplo atau sampai pelarut jernih. Hasil maserasi disaring untuk memisahkan filtrat dan ampas. Filtrat dipekatkan dengan evaporator vakum 40oC dan dilarutkan dengan etil asetat lalu dipekatkan kembali dengan evaporator vakum 40oC. Filtrat ekstrak kasar dikeringkan dengan oven pada suhu 40-60ºC. Ekstrak kasar daging buah salak Bongkok disimpan dalam lemari pendingin sampai digunakan untuk perlakuan. Uji Fitokimia Ekstrak Buah Salak Bongkok (Harbone 1987) Analisis fitokimia dilakukan secara kualitatif untuk mengetahui senyawa-senyawa

aktif yang terkandung dalam ekstrak daging buah salak Bongkok berdasarkan metode Harborne (1987). Senyawa yang diidentifikasi adalah alkaloid, saponin, flavonoid, senyawa fenolik, dan tanin. Uji Akaloid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak daging buah salak ditambahkan 5 mL kloroform dan 3 tetes amoniak. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan 2 tetes H2SO4 2M. Fraksi asam dibagi menjadi tiga tabung kemudian masing-masing ditambahkan pereaksi Dradedorf, Meyer dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih pada pereaksi Meyer, endapan merah pada perekasi Dragendorf, dan endapan coklat pada pereaksi Wagner. Uji Saponin. Sebanyak 0.1 gram ekstrak daging buah salak ditambahkan 5 mL akuades lalu dipanaskan selama 5 menit. Kemudian dikocok selama 5 menit. Busa yang terbentuk setinggi kurang lebih 1 cm dan tetap stabil setelah didiamkan selama 15 menit menunjukkan adanya saponin. Uji Flavonoid dan Senyawa Fenolik. Sebanyak 0.1 gram ekstrak daging buah salak ditambahkan dengan 5 metanol 30% kemudian dipanaskan selama 5 menit. Filtrat ditambahkan dengan H2SO4, terbentuknya warna merah karena penambahan H2SO4 menunjukkan adanya senyawa flavonoid., dan terbentuknya warna merah dengan penambahan NaOH menunjukkan adanya senyawa fenolik. Uji Tanin. Sebanyak 0.1 gram ekstrak daging buah salak ditambahkan 5 mL akuades kemudian dididihkan selama 5 menit. Kemudian disaring dan filtratnya ditambahkan dengan 5 tetes FeCl3 1% (b/v). Warna biru tua atau hitam kehijauan yang terbentuk menunjukkan adanya tanin. Pembuatan Media Media cair gliserol dibuat dalam gelas piala 1000 mL dengan komposisi 2.4 mL gliserol, 1.3 g K2HPO4.3H2O, 0.15 g MgSO4.7H2O, 3.0 g ekstrak khamir, 4.0 g bakto pepton, dan 10 mL larutan X (5.0 g ZnSO4.7H2O, 3.0 g MnSO4.H2O, 2.8 g CuSO4, dan 250 mL akuades), dilarutkan ke dalam 1 L akuades. Kemudian sebanyak 100 mL media dipindahkan ke dalam labu Erlenmeyer 250 mL, dan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121oC dan tekanan 1 atm selama 15 menit. Media yeast malt agar (YMA) dibuat dalam labu Elenmeyer 1 L dengan komposisi 3.0 g ekstrak khamir, 5.0 g bakto pepton, 20.0

7

g bakto agar, 10.0 glukosa, dan Ekstrak malt 3 g, kemudian dilarutkan dengan akuades sampai tepat 1 L sambil dipanaskan. Setelah itu, media YMA di simpan dalam labu Erlenmeyer 300 mL kurang lebih 200 mL dan disterilisasi selama 15 menit pada suhu 121oC, 1 atm. Dalam keadaan cukup hangat, sekitar 10-15 mL media dituang ke dalam cawan petri steril secara aseptis. Pembuatan Stok Kultur Sel Khamir Sel khamir Candida sp. Y 390 dari media agar miring (stok isolat) diinokulasikan secara aseptis sebanyak 2 Ose ke dalam media cair gliserol, lalu diinkubasi goyang dengan kecepatan 100 rpm selama 2 hari. Peremajaan kultur sel khamir dilakukan inokulasi ke dalam media gliserol baru setiap empat hari sekali sebanyak 1 mL. Pembuatan Kurva Pertumbuhan Khamir Candida sp. Y390

Sel

Kurva pertumbuhan sel khamir Candida sp. dibuat dari biakan Candida sp. umur 4 hari dengan cara sebanyak 1 mL biakan diinokulasikan ke dalam media gliserol cair yang baru, lalu dikocok. Sebelum diinkubasi goyang pada kecepatan 100 rpm, dihitung kepadatan sel khamir hari ke-0 dengan cara sebanyak 0.1 mL biakan khamir dari gliserol yang baru diencerkan dengan 0.9 mL akuades steril sampai pengenceran 10-5. Setelah itu, sebanyak 0.1 mL hasil pengenceran 10-3,10-4, dan 10-5 ditumbuhkan masing-masing dalam cawan petri yang berisi media YMA, diinkubasi pada suhu 35oC selama 2 hari. Jumlah koloni dihitung pada hari ketiga setelah ditumbuhkan. Media gliserol yang baru lalu inkubasi goyang pada kecepatan 100 rpm dan setiap hari dihitung kepadatan sel khamirnya untuk hari ke-1, 2, 3 dan 4. Kepadatan hari ke-1 ditumbuhkan hasil pengenceran 10-4, 10-5, 10-6, dan kepadatan hari ke-2, 3 dan 4 ditumbuhkan hasil pengenceran 10-5,10-6, dan 10-7. Semua seri pengenceran dilakukan triplo. Kurva pertumbuhan dibuat berdasarkan rataan kepadatan populasi sel khamir pada hari ke-0, 1, 2, 3, dan 4. Pengukuran Peroksidasi Lipid Sel Khamir (Li et al. 2004) Peroksidasi lipid sel khamir diukur berdasarkan konsentrasi MDA yang diukur dengan HPLC mengacu pada metode Li et al. (2004) yang telah dimodifikasi. Spesifikasi

HPLC yang digunakan yaitu HPLC shim-pack CLC – Kolom C8, ukuran kolom 6.0 mm ID x 150 mm, lampu UV panjang gelombang 532 nm, detektor seri SPD-20AV, fase gerak potasium fosfat (0.025 mol/L, pH 6.2) dan metanol dengan perbandingan 58% : 42% (v/v). Waktu alirnya yaitu 0.8 mL/menit. Larutan buffer potasium fosfat dibuat dengan cara melarutkan 3.4 gram KH2PO4 dengan 800 mL air akuabides steril dan ditepatkan pHnya dengan pH meter sampai 6.2. Setelah itu, larutan ditepatkan sampai 1 Liter dengan akuabides steril. Persiapan yang dilakukan sebelum sampel diukur dengan HPLC yaitu penyaringan larutan fase gerak dan sampel menggunakan penyaring Whatman 0.45 µm (Li et al. 2004). Penelitian ini terdiri dari penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Konsentrasi uji ekstrak daging buah salak Bongkok yang dibuat yaitu konsentrasi 50, 100 ppm, 200 ppm, 1200 ppm, dan 2000 ppm. Penelitian pendahuluan dilakukan untuk menentukan konsentrasi uji ekstrak daging buah salak Bongkok yang mempunyai aktivitas prooksidasi paling rendah. Penelitian utama dilakukan untuk mengukur aktivitas antioksidasi ekstrak salak Bongkok berdasarkan penghambatan peroksidasi lipid sel khamir Candida sp. Y390 yang diberi parasetamol 0.3%. Pembuatan Kurva Standar TMP (Li et al. 2004). Pembuatan kurva standar TMP dibuat dari larutan pereaksi 1,1,3,3 tetra metoksi propana (TMP) 6 M dan dibuat larutan stok TMP 60 µM. Setelah itu, larutan stok 60 µM dipipet sebanyak 10 µL, 20 µL, 30 µL, 40 µL, dan 50 µL kedalam tabung reaksi, lalu ditambah akuades steril sampai volume 1600 µL . Selanjutnya ditambah 0.4 mL TCA 75% dan 0.75 mL TBA 0.67%, dipanaskan pada suhu 95oC selama 60 menit, dan didinginkan pada suhu kamar, lalu disentrifugasi pada kecepatan 8200 G selama 5 menit. Lapisan atas yang terbentuk pada larutan diambil, serapannya diukur dengan HPLC UV-VIS panjang gelombang 532 nm. . Penentuan Konsentrasi Ekstrak Daging Buah Salak Bongkok. Sebanyak 400 mL biakan sel khamir dalam media cair gliserol umur dua hari disentrifus dengan kecepatan 5000 G selama 10 menit lalu di ambil bagian peletnya dan dibilas dengan akuades, setelah itu disentifus kembali dan peletnya diencerkan dengan akuades sampai 25 mL. Ke dalam tabung reaksi ulir dimasukan, untuk kontrol normal, 1 mL suspensi sel khamir, dan 0.6

8

mL akuades; perlakuan ekstrak daging buah muda dan tua salak Bongkok , dimasukkan 1 mL biakan sel khamir, 0.3 mL akuades, dan 0.3 mL ekstrak daging buah muda dan tua salak bongkok konsentrasi 50, 100, 200, 1200, dan 2000 ppm. Semua campuran diinkubasi dengan penggojokan dengan kecepatan 100 rpm selama 2 jam. Pengukuran MDA dilakukan dengan cara campuran suspensi sel (+ 1.6 mL) di tambah 0.4 mL TCA 75% (b/v) dan dikocok dengan vorteks. Setelah itu, ditambahkan 0.75 mL TBA 0,67% (b/v) dikocok dan ditutup rapat lalu di panaskan dalam penangas air bersuhu 95 oC selama 1 jam dan didinginkan dalam suhu ruang. Setelah dingin, sebanyak + 1,5 mL campuran dimasukkan kedalam mikrotube 2 mL lalu disentrifus pada 8200 G selama 5 menit, supernatannya diambil sebanyak 0,9 mL kemudian masing-masing larutan tersebut disaring dengan penyaring Whatman 0.45 µm dan diukur dengan HPLC dengan panjang gelombang 532 nm. Konsentrasi MDA ditentukan dengan membandingkan luas area terhadap kurva standar dan hasilnya dinyatakan dalam satuan konsentrasi nM MDA/106 colony forming unit (CFU). Pengukuran Penghambatan Peroksidasi Lipid Sel Khamir Candida sp. Y390 oleh Ekstrak Daging Buah Salak Bongkok. Sebanyak 400 mL biakan sel khamir dalam media cair gliserol umur dua hari disentrifus dengan kecepatan 5000 G selama 10 menit, suhu 20-27 oC, lalu di ambil bagian peletnya dan dibilas dengan akuades, setelah itu disentrifus kembali dan peletnya diencerkan dengan akuades sampai 25 mL. Ke dalam tabung reaksi ulir dimasukan, untuk kontrol normal, 1 mL suspensi sel khamir, dan 0.6 mL akuades; kontrol positif dimasukkan 1 mL suspensi biakan sel khamir, 0.3 akuades, dan 0.3 mL parasetamol 1.6% sehingga konsentrasi akhir dalam larutan sebesar 0.3%; perlakuan vitamin C normal dimasukkan 1 mL suspensi sel khamir, 0.3 mL akuades, dan 0.3 mL vitamin C 1.2 mg/mL sehingga konsentrasi akhir dalam larutan sebesar 0.225 mg/mL; perlakuan vitamin C stres parasetamol dimasukkan 1 mL suspensi sel khamir, 0.3 mL vitamin C 1.2 mg/mL sehingga konsentrasi akhir dalam larutan sebesar 0.225 mg/mL dan 0.3 mL parasetamol 1.6% sehingga konsentrasi akhir dalam larutan sebesar 0.3%; perlakuan ekstrak salak normal, dimasukkan 1 mL biakan sel khamir, 0.3 mL akuades, dan 0.3 mL ekstrak etil asetat daging buah muda atau tua salak bongkok konsentrasi terpilih;

perlakuan ekstrak salak stres parasetamol , dimasukkan 1 mL biakan sel khamir, 0.3 mL parasetamol 1.6% sehingga konsentrasi akhir dalam larutan sebesar 0.3%; dan 0.3 mL ekstrak salak konsentrasi terpilih. Semua perlakuan dilakukan triplo. Semua campuran diinkubasi dengan penggojokan dengan kecepatan 100 rpm selama 2 jam. Pengukuran MDA dilakukan dengan cara campuran suspensi sel (+ 1.6 mL) di tambah 0.4 mL TCA 75% (b/v) dan dikocok dengan vorteks. Setelah itu, ditambahkan 0.75 mL TBA 0,67% (b/v) dikocok dan ditutup rapat lalu di panaskan dalam penangas air bersuhu 95 oC selama 1 jam dan didinginkan dalam suhu ruang. Setelah dingin, sebanyak + 1,5 mL campuran dimasukkan kedalam mikrotube 2 mL lalu disentrifus pada 8200 G selama 5 menit, supernatannya diambil sebanyak 0,9 mL kemudian masing-masing larutan tersebut disaring dengan penyaring Whatman 0.45 µm dan diukur dengan HPLC dengan panjang gelombang 532 nm. Konsentrasi MDA ditentukan dengan membandingkan luas area terhadap kurva standar dan hasilnya dinyatakan dalam satuan konsentrasi nM MDA/106 CFU. Analisis Statistik Rancangan penelitian yang digunakan yaitu metode rancangan acak lengkap lengkap (RAL). Analisis data dilakukan dengan peranti lunak program SPSS 14.0 for Windows Evaluation Version metode ANOVA. Jika pengaruh perlakuan berbeda nyata dilakukan analisis lanjut dengan uji Duncan pada selang kepercayaan 95% (Mattjik 2000).

HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi Daging Buah Salak Bongkok Buah salak yang digunakan dalam penelitian ini merupakan varietas Bongkok yang mempunyai daging buah tebal. Umur salak yang digunakan yaitu salak muda yang berumur 3 bulan dan salak tua yang berumur 6 bulan. Ciri salak muda adalah bentuk sisik akan lebih rapat, berwarna coklat gelap , dan daging buah masih keras, sedangkan salak tua mempunyai bentuk sisik yang lebih renggang, berwarna coklat kekuningan, dan daging buah lebih lunak serta menempel pada bijinya atau istilahnya “masir”. Bagian salak yang digunakan dalam penelitian ini adalah daging buahnya. Seperti halnya daging buah-buahan secara umum

9

mudah busuk dan teroksidasi secara enzimatik, daging buah salak di simpan dalam bentuk simplisia kering. Sebelum dibuat bentuk simplisia kering, irisan daging buah dikering udara dalam suhu kamar selama 2 jam dan dikering oven selama 3 hari sampai kering. Hal ini dilakukan untuk mencegah terjadinya kerusakan senyawa aktif akibat adanya proses enzimatik pencoklatan. Daging buah salak yang sudah dalam bentuk serbuk simplisia kering diekstrak dengan metode maserasi. Kelebihan metode ini dibandingkan metode ekstraksi lainnya yaitu sederhana dan dapat mengekstrak senyawa aktif dalam tanaman yang relatif kurang tahan terhadap panas (Meloan 1999, diacu dalam Alawiah 2007). Jumlah rendemen hasil ekstraksi dipengaruhi oleh perbandingan bahan dan jumlah pelarut. Perbandingan bahan dan pelarut yang digunakan dalam penelitian ini yaitu 1:5 (Raflizar 2006). Pelarut yang digunakan yaitu etanol 70%. Maserasi pertama menggunakan etanol 70% lalu setelah menjadi ekstrak kasar hasil rotavapor, ekstrak kasar pekat dibilas dengan etil asetat dan dirotavapor kembali. Pemilihan etanol 70% sebagai pelarut karena etanol 70% memiliki kelebihan dalam mengekstrak tanaman yaitu dapat mengekstrak senyawa aktif yang bersifat polar dan nonpolar karena mempunyai dua gugus aktif yang beda kepolarannya. Kedua gugus aktif tersebut yaitu gugus hidroksil yang polar dan gugus alkil yang nonpolar. Senyawa yang dapat larut dalam etanol 70% diantaranya senyawa flavonoid, saponin, tannin, dan senyawa aktif lainnya. Disamping itu, etanol 70 % mempunyai titik didih yang rendah sehingga mudah diuapkan. Pembilasan ekstrak pekat oleh etil asetat dilakukan untuk menghilangkan pengaruh etanol yang terbukti bersifat prooksidan terhadap khamir (Yomes 2006). Meskipun secara teoritis sifat toksiknya tidak berbeda antara etanol 70% dan etil asetat, namun etil asetat tidak terlalu toksik dibandingkan etanol 70% terhadap sel khamir Candida sp.. Pembilasan ini tidak mempengaruhi terhadap jumlah rendemen ekstrak daging buah salak yang dihasilkan. Rendemen yang dihasilkan untuk daging salak muda lebih kecil dibandingkan salak tua (Tabel 1). Salah satu penyebabnya yaitu adanya perbedaan kadar air yang lebih besar pada daging buah salak tua dibandingkan daging buah salak muda. Kadar air yang tinggi dapat melarutkan senyawa-senyawa larut air seperti karbohidrat, resin, dan gum, sehingga senyawa ini ikut terekstrak (Sahputra

2008). Ekstrak kasr yang dihasilkan berwarna coklat dengan aroma yang khas. Tabel 1 Rendemen ekstrak daging salak Bongkok muda dan tua Sampel Daging salak muda Daging salak tua

Rendemen (%) 41.67 56.67

Uji Fitokimia Daging Buah Salak Bongkok Sampel ekstrak salak diuji fitokimia untuk mengetahui senyawa aktif yang diharapkan berperan sebagai senyawa antioksidan. Hasil penapisan fitokimia secara kualitatif dengan metode Harborne (1987) yang telah dimodifikasi menunjukkan bahwa ekstrak daging buah salak muda mengandung senyawa aktif alkaloid, saponin, dan tanin sedangkan ekstrak daging buah salak tua mengandung senyawa aktif alkaloid, flavonoid, saponin, dan tanin (Tabel 2). Senyawa aktif dalam ekstrak muda hasil penapisan fitokimia tidak menghasilkan uji positif untuk flavonoid dan senyawa fenolik. Hal ini diduga kadarnya sangat sedikit sehingga tidak terukur pada pengukuran secara kualitatif. Hasil ini sesuai dengan penelitian Sahputra (2008) bahwa ekstrak daging buah salak muda varietas Kalimantan dan Pondoh memiliki kadar flavonoid yang sedikit. Mekanisme penghambatan peroksidasi lipid olek ekstrak salak Bongkok diperkirakan karena adanya senyawa saponin, flavonoid, alkaloid, fenolik dan tanin yang berperan sebagai antioksidan. Antioksidan flavonoid berfungsi sebagai pencegahan radikal bebas dengan mendonorkan hidrogen yang akan menghasilkan radikal flavonoid.

Tabel 2 Hasil uji fitokimia ekstrak daging buah salak Bongkok Uji Alkaloid Saponin Flavonoid Fenolik Tanin Keterngan : Tanda (-) Tanda (+) Alkaloid Saponin Flavonoid Fenolik Tanin

Hasil Salak muda ++ ++ +++

Salak tua +++ ++ + + +++

: tidak terdeteksi : intensitas reaksi positif : Sedikit endapan (+) – banyak endapan (+++) : sedikit busa (+) – banyak bisa (+++) : Merah (+) – merah tua (+++) : Merah (+) – merah tua (+++) : Hijau(+) – Hijau kehitaman (+++)

10

Pengukuran jumlah sel khamir Candida sp. Y390 dilakukan untuk melihat populasi yang tumbuh dan waktu inkubasi biakan khamir mulai mengalami fase stasioner. Jumlah populasi sel khamir pada hari ke-0 yaitu sebesar 0.92x106 CFU/ mL, hari ke-1 sebesar 16.5x106 CFU/mL, hari ke-2 sebesar 58. x106 CFU/mL, hari ke-3 sebesar 62.5x106 CFU/mL, dan hari ke-4 sebesar 56.5x106 CFU/mL. Berdasarkan kurva pertumbuhan yang dihasilkan, sel khamir mengalami beberapa fase tumbuh yaitu fase lag, fase log, fase shift diauksik, fase post-diauksik, dan fase stationer (Gambar 10). Khamir Candida sp. yang ditumbuhkan pada media gliserol tidak mengalami fase post-diauksik, namun langsung mengalami fase stasioner. Hal ini karena Candida sp. sangat rentan terhadap etanol yang biasanya digunakan sebagai sumber energi dalam fase post-diauksik (Lisnawati 2004). Fase lag terjadi sebagai awal pertumbuhan khamir secara eksponensial. Lama dan pola fase ini dipengaruhi oleh strain khamir, umur sel khamir dalam stok awal, dan komposisi médium tumbuhnya. Sel khamir pada fase ini mulai melakukan adaptasi dan mempersiapkan diri untuk melakukan pembelahan. Fase lag terjadi mulai hari ke-0 sampai hari ke-1. Setelah itu, sel khamir akan mengalami fase log. Lama fase log dipengaruhi oleh komposisi médium, temperatur, dan jumlah sel per unit volume. Fase log terjadi mulai hari ke-1 sampai hari ke-2. Peningkatan jumlah sel pada fase ini sangat cepat dengan penggunaan nutrisi yang semakin banyak. Sel khamir akan mengalami fase shif diauksik dan fase stationer mulai hari ke-2 sampai hari ke-3. Fase shift diauksik merupakan fase sesaat sebelum fase stasioner. Pada fase tersebut proses fermentasi mulai berkurang dengan habisnya glukosa dan berlanjut ke proses respirasi. Populasi sel akan meningkat sedikit dan akan relatif stabil sampai fase stasioner. Pada fase stasioner, sel khamir akan mensekresikan metabolit

70 6

Kurva Pertumbuhan Sel Khamir Candida sp. Y390

sekunder untuk mempertahankan diri dari stres oksidatif akibat akumulasi produk metabolisme yang bersifat toksik (Lisnawati 2007). Hasil uji lanjut dihasilkan bahwa populasi hari ke-2, 3, dan 4 memiliki perbedaan yang tidak signifikan pada selang kepercayaan 0.05. Oleh sebab itu, dapat dikatakan khamir mulai memasuki fase stasioner setelah inkubasi 2 hari. Hasil ini menjadi standar waktu inkubasi untuk melakukan perlakuan pada penelitian selanjutnya. Pengukuran peroksidasi lipid dilakukan pada awal fase stasioner saat proses metabolisme sel mulai menurun. Hal ini dilakukan supaya hasil pengukuran peroksidasi lipid tidak dipengaruhi oleh aktivitas metabolisme laju pertumbuhan sel khamir (Risnawati 2007). Rataan total sel khamir yang tumbuh pada media gliserol didapatkan sebesar 48.6x106 CFU/mL.

Kepadatan sel 10 (CFU/mL)

Saponin digunakan sebagai sebagai antikanker, antitumor, antiperadangan, antivirus, antidiabetes, dan antifungal (Hsu et al. 2007). Larson (1988) melaporkan bahwa senyawa fenolik memegang peranan penting dalam mencegah secara preventif kerusakan hati, kanker, dan kerusakan akibat proses penuaan.

62.5

60

58

56.5

50 40 30 20

16.5

10 0.92

0 0

1

2

3

4

Hari ke-

Hari ke-

Gambar 1 Kurva pertumbuhan khamir Candida sp.

Gambar 10 Kurva pertumbuhan sel khamir Candida sp.

Pengukuran Peroksidasi Lipid Sel Khamir Candida sp. Y390 dengan HPLC Data HPLC yang digunakan untuk mempresentasikan adanya kompleks MDA(TBA)2 dalam sampel yaitu bentuk puncak kromatogram, luas area dan waktu retensi kompleks MDA-(TBA)2. Konsentrasi MDA diukur berdasarkan kurva standar kompleks TMP-(TBA)2. Tetrametoksipropana (TMP) digunakan sebagai pengganti MDA karena memiliki struktur yang mirip dan lebih stabil dibandingkan MDA murni sebagai hasil akhir peroksidasi lipid (Ohkawa et al. 1978, Lykkesfeldt 2001). Prinsipnya kurva stándar yaitu semakin tinggi konsentrasi TMP maka semakin tinggi pula jumlah lipid teroksidasi. Persamaan kurva standar TMP yang didapatkan yaitu y= 128711x +10716 ; R2 = 0.9832 (Gambar 11). Nilai R2 persamaannya sedikit lebih besar dari hasil penelitian yang sudah dilakukan oleh Lykkesfeldt (2001) dengan nilai R2 yaitu 0.96. Berdasarkan

11

Luas area

Luas area (mV)

gambar kromatogram, kompleks TMP(TBA)2 yang dibawa oleh fase gerak akan muncul dengan tinggi puncak yang akan semakin tinggi dengan semakin tinggi konsentrasi kompleks TMP-(TBA)2 (Gambar 12). Waktu retensi kompleks TMP-(TBA)2 mempunyai rentang waktu antara menit ke04.45 sampai menit ke- 05.02. Luas area dan waktu retensi setiap puncak kromatogram dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu konsentrasi dan pH fase gerak, laju alir sampel tiapmenit, proses penyaringan sampel dan fase gerak, serta kondisi kolom HPLC (Carbonneau et al. 1991). Pembuatan kurva standar TMP-(TBA)2 perlu dilakukan karena banyak faktor yang berperan dalam menghasilkan luas area dan waktu retensi hasil pengukuran. 800000 700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 0

y = 128711x + 10716 R2 = 0.9832

0.375

0.75

1.125

1.5

1.875

Konsentrasi MDA(µM) (uM) Konsentrasi TMP

Grafik Kurva standar Malonildehida (MDA) 2 Gambar 11 2Kurva standar TMP-(TBA)

memperlihatkan bahwa HPLC dapat memberikan hasil pengukuran yang spesifik terhadap kompleks MDA-TBA pada panjang gelombang 532 nm (Tukozkan et al. 2006). Konsentrasi lipid peroksida sel khamir yang ditambah ekstrak salak muda 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm, 1200 ppm, dan 2000 ppm masing-masing yaitu sebesar (33.791 + 6.054), (61.244 + 47.759), (63.750 + 57.841), (376.657 + 35.490), (1056.155 + 102.705) nM MDA/106 CFU (Gambar 14). Adanya kenaikan lipid peroksida setelah diberi ekstrak salak sesuai dengan pernyataan Perrone et al. (2008) bahwa sel khamir sangat peka terhadap senyawa asing yang dapat menimbulkan stres oksidatif pada konsentrasi tertentu. Senyawa asing yang dapat menginduksi terjadinya stres oksidatif dinamakan prooksidan (Wiseman 2000). Adapun konsentrasi lipid peroksida yang ditambah ekstrak salak tua 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm, 1200 ppm, dan 2000 ppm yaitu sebesar (35.959 + 25.477), (114.085 + 26.132), (141.369 + 30.967), (462.510 + 57.981), (811.421 + 190.407) nM MDA/106 CFU. Secara statistik, konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, dan 200 ppm untuk ekstrak salak muda dan tua tidak berbeda nyata pada taraf kepercayan 0.05 dengan kontrol normal, sehingga pada konsentrasi tersebut ekstrak daging buah salak mempunyai aktivitas antioksidasi.

uV

7.5

50000

Luas area (mV)

Luas area (mV)

55000

45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000

5.0

MDA-(TBA)2

2.5

0.0

5000

0.0

0 1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

1.0

min

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

min

Waktu Retensi (menit)

Gambar 12 Bentuk puncak kromatogram kurva standar TMP-(TBA)2.

Penentuan Konsentrasi Ekstrak Daging Buah Salak Bongkok Pengukuran konsentrasi MDA sel khamir dilakukan untuk melihat pengaruh ekstrak yang tidak menimbulkan kematian pada sel khamir Candida sp.. Hasil pengukuran dengan HPLC terhadap sampel yang dibandingkan dengan standar MDA-TBA menghasilkan kesesuaian waktu retensi dan letak puncak kromatogramnya (Gambar 13). Hal ini

Luas area (mV)

Waktu Retensi (menit)

6

TMP-(TBA)2

5 4 3 2 1 0 0

1

2

3

4

5

6

7

m

Waktu Retensi (menit)

Gambar 13 Kromatogram standar TMP-(TBA)2 (atas) dan sampel salak (bawah).

12

konsentrasi lipid peroksida (nM MDA/106 CFU)

1200

daripada prooksidan terhadap sel khamir Candida sp. yang diberi parasetamol 0.3%.

1056.155

1000

811.421

800 600

Penghambatan Peroksidasi Lipid oleh Ekstrak DagingBuah Salak Bongkok

462.51 376.657

400 200 10.444

114.085 141.369 35.95961.244 63.75 33.791

0 0

50

100

200

1200

2000

konsentrasi ekstrak salak (ppm)

Gambar 14 Konsentrasi lipid peroksida sel khamir yang diberi perlakuan ekstrak salak (merah = salak muda, kuning = salak tua).

Berdasarkan uji lanjut pada taraf kepercayaan 0.05, konsentrasi 1200 ppm dan 2000 ppm berbeda nyata terhadap kontrol normal. Hasil tersebut menunjukkan bahwa ekstrak daging buah salak konsentrasi 1200 ppm dan 2000 ppm bersifat prooksidan terhadap sel khamir. Senyawa aktif dalam tumbuhan seperti flavonoid akan bersifat prooksidan dalam konsentrasi dan kondisi tertentu. Aktivitas prooksidasi terhadap sel khamir dapat menyebabkan kematian pada sel khamir. Hal ini disebabkan adanya kerusakan membran yang berpengaruh terhadap tekanan osmotik dan fungsi organ sel yang mendorong ke arah kematian sel. Kerusakan membran sel khamir ini salah satunya disebabkan oleh peroksidasi lipid. Ekstrak daging buah salak Bongkok umur tua 200 ppm dipilih untuk penelitian utama karena ada beberapa hal yaitu kandungan senyawa aktif dalam ekstrak salak tua lebih banyak menghasilkan nilai uji positif dibandingkan ekstrak salak muda, dan berdasarkan uji lanjut konsentrasi 200 ppm tidak berbeda nyata dengan konsentrasi ekstrak 50 ppm dan 100 ppm. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak 200 ppm dengan pengenceran yang tidak terlalu besar dapat menghasilkan aktivitas antioksidasi yang tidak berbeda nyata dengan pengenceran 100 ppm dan 50 ppm. Aktivitas senyawa aktif dengan pengenceran sangat besar untuk konsentrasi 50 ppm dan 100 ppm menghasilkan pengukuran lipid peroksida yang tidak stabil karena banyak faktor yang mempengaruhi selam proses pengukuran. Berdasarkan hasil-hasil yang sudah diperoleh, ekstrak daging buah salak tua konsentrasi 200 ppm diharapkan memiliki potensi sebagai antioksidan lebih dominan

Kenaikan konsentrasi lipid peroksida yang ditambah ekstrak salak 200 ppm, vitamin C 0.225 mg/mL, parasetamol 0.3% dan ekstrak salak 200 ppm, parasetamol 0.3 % dan vitamin C 0.225 mg/mL, dan parasetamol 0.3 % yaitu sebesar (33.791 + 6.054), (61.244 + 47.759), (63.750 + 57.841), (376.657 + 35.490), (1056.155 + 102.705) nM MDA/106 CFU (Gambar 15). Berdasarkan hasil uji statistik pada taraf kepercayaan 0.05, pemberian parasetamol 0.3% dalam campuran menaikkan konsentrasi lipid peroksida yang signifikan dibandingkan kontrol normal dan perlakuan yang lain. Konsentrasi lipid peroksida sel yang diberi vitamin C 0.225 mg/mL dan kontrol normal tidak saling berbeda nyata, tetapi berbeda nyata dengan sel khamir yang diberi ekstrak salak & parasetamol 0.3% dan vitamin C 0.225 mg/mL & parasetamol 0.3%. Konsentrasi lipid peroksida sel khamir yang diberi ekstrak salak 200 ppm tidak berbeda nyata dengan sel khamir yang diberi ekstrak salak & parasetamol 0.3%, vitamin C 0.225 mg/mL & parasetamol 0.3%, dan vitamin C 0.225 mg/mL. Adanya kenaikan yang cukup besar pada penambahan parasetamol 0.3% memperkuat hasil penelitian Risnawati (2007) bahwa pemberian parasetamol 0.3% memberikan efek stres oksidatif yang signifikan namun tidak mematikan sel khamir dibandingkan dengan pemberian parasetamol konsentrasi rendah. Stres oksidatif yang terjadi pada sel khamir karena adanya metabolisme yang dilakukan oleh sitokrom P450 di dalam sel khamir terhadap senyawa asing yang masuk, seperti senyawa aktif dalam ekstrak tumbuhan dan obat-obatan. Parasetamol telah dimetabolisme oleh sel khamir dengan bantuan enzim intraseluler dan ekstraseluler. Namun metabolisme yang memperlihatkan hasil yang berbeda setelah beberapa jam inkubasi yaitu oleh enzim intraseluler. Hasil metabolisme parasetamol oleh sitokrom P450 akan menghasilkan senyawa yang sangat toksik dan tidak stabil yaitu NAPQI dan metabolit elektrofilik yang akan bereaksi dengan makromolekul sel. Adanya peningkatan spesies prooksidan intraseluler seperti H2O2, radikal hidroksil (*OH), dan radikal anion superoksida (O2-) menjadi salah

13

satu faktor penyebab stres oksidatif pada sel khamir (Gonzalez 2005). Sitokrom P450 akan menggunakan H+ dari NADPH untuk mereduksi O2 menjadi H2O2 dan radikal anion superoksida. NAPQI dan metabolit elektrofilik hasil samping metabolisme parasetamol akan menyerang mitokondria, PUFAs membran sel, gugus SH- pada protein membran sel dan merusak fungsi organ sel yang mendorong kearah kematian sel (Gonzalez 2005). Ekstrak salak 200 ppm dan vitamin C 0.225 mg/mL menaikan konsentrasi lipid peroksida dibandingkan kontrol normal sebesar 41.70% dan 23.99%. Berdasarkan uji lanjut pada taraf kepercayaan 0.05, kenaikan lipid peroksida oleh ekstrak salak 200 ppm dan vitamin C 0.225 mg/mL tidak berbeda nyata secara signifikan dengan kontrol normal, sehingga adanya kenaikan lipid peroksida tersebut bukan disebabkan sebagai aktivitas prooksidasi tetapi sebagai respon normal sel khamir terhadap senyawa asing. Meskipun demikian, sifat prooksidan ekstrak salak tidak terlalu berbahaya jika dibandingkan vitamin C karena sifat senyawa flavonoid pada ekstrak salak cenderung menstabilkan radikal hidroksil dengan cara memberikan atom hidrogen kepada radikal bebas membentuk senyawa stabil (Cotelle 2001). Adanya kenaikan konsentrasi lipid peroksida sel khamir yang diberi vitamin C 0.225 mg/mL sama seperti yang dilaporkan oleh Yomes (2006) bahwa vitamin C 0.225 mg/mL dapat menimbulkan stres oksidatif pada suspensi sel khamir yaitu sebesar 18.48%. Kenaikan peroksidasi lipid yang diberi parasetamol dan ekstrak salak secara bersamaan dapat menaikkan konsentrasi lipid peroksida dibanding kontrol normal, namun masih dibawah kenaikan konsentrasi yang disebabkan oleh parasetamol 0.3%. Hal ini menunjukkan adanya penghambatan peroksidasi lipid oleh ekstrak salak yang berbeda nyata dibandingkan kontrol positif yaitu sebesar 61.06%. Ekstrak salak Bongkok mempunyai aktivitas antioksidasi secara in vitro dengan menghambat oksidasi DPPH (Priyatno et al. 2006). Mekanisme penghambatan peroksidasi lipid oleh ekstrak salak yaitu adanya gugus hidroksil bersifat reduktor yang akan mendonorkan hidrogen untuk senyawa NAPQI dan metabolit eletrofilik. Flavonoid dan saponin berperan dalam menangkap radikal lipid peroksil, oksigen tunggal, radikal hidroksil, dan anion superoksida yang tergantung pada ion logam.

Gambar 15 konsentrasi lipid peroksida suspensi sel khamir yang diberi perlakuan.

Mekanisme flavonoid sebagai antioksidan atau prooksidan bergantung pada potensial redoks lingkungan biologi sel, ketersediaan ion logam dan konsentrasi flavonoid. Senyawa NAPQI dan metabolit elektrofilik yang sudah terikat oleh senyawa aktif dalam ekstrak salak akan stabil sehigga tidak akan menyerang lipid membran atau protein membran. Pemberian parasetamol 0.3% dan vitamin C 0.225 mg/mL secara bersamaan dapat menaikkan konsentrasi lipid peroksida bandingkan kontrol normal. Namun masih dibawah kenaikan konsentrasi lipid peroksida yang diberi parasetamol 0.3%. Hasil ini menunjukkan ada penghambatan peroksidasi lipid pada sel khamir yaitu sebesar 53.65%. Berdasarkan hasil yang didapatkan, penghambatan peroksidasi lipid pada sel khamir lebih tinggi dilakukan oleh ekstrak salak 200 ppm dibandingkan vitamin C 0.225 mg/mL. Hal ini diduga karena adanya beberapa senyawa aktif dalam ekstrak yang berperan lebih besar dalam menetralisir aktivitas radikal bebas akibat metabolisme parasetamol dibandingkan vitamin C.

SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Ekstrak daging buah salak Bongkok mengandung senyawa aktif diantaranya senyawa fenolik, alkaloid, saponin, flavonoid, dan tanin. Ekstrak salak muda dan tua konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, dan 200 ppm bersifat sebagai antioksidan, dan konsentrasi 1200 ppm serta 2000 ppm lebih bersifat

14

prooksidan terhadap sel khamir Candida sp.Y390 pada kondisi normal. Konsentrasi ekstrak salak tua 200 ppm dapat menghambat peroksidasi lipid sel khamir yang diberi parasetamol 0.3% lebih tinggi yaitu sebesar 61.06% dibandingkan vitamin C 0.225 mg/mL yaitu sebesar 53.65%. Ekstrak daging buah salak tua 200 ppm mampu melindungi sel khamir dengan menurunkan konsentrasi lipid peroksida sel khamir yang diberi parasetamol 0.3%. Saran Penelitian lanjutan perlu diuji sifat antioksidasi maupun prooksidasi ekstrak daging buah salak dengan pelarut berbeda dan kondisi daging buah yang masih segar. Uji penghambatan dengan kertas cakram, uji viabilitas dan variasi waktu inkubasi perlakuan serta pengukuran parasetamol yang tersisa.

Cotelle N. 2001. Role of flavonoids in oxidative stress. Current Topics in Med Chem 1: 569-590. Gonzalez FJ. 2005. Role of cytochromes P450 in chemical toxicity and oxidative stress: studies with CYP2E1. Mutation Res 569 : 101–110. Hambly RJ. 2000. DNA injury : prevention by antioxidants. Di dalam : Wiseman H, Goldfarb P, Rigway T, Wiseman A, editor. Biomolecular free radical toxicity : causes and prevention. New York : J Willey : 58-60. Hardesty D. 1998. Biochemical properties of vitamin C. J Biochem : 1-3. Harbone JB. 1987. Metode Fitokimia. Padmawinata K, Soediro I, penerjemah; Niksolihin S, Editor. Bandung : ITB Press. Terjemahan dari : Phytochemical Methode.

DAFTAR PUSTAKA Alawiah L. 2007. Ekstrak etanol rumput mutiara (Hedyotis corymbosa (L.) Lam.) sebagai antihepatotoksik pada tikus putih yang diinduksi parasetamol [skripsi]. Bogor: FMIPA IPB. [Anonim]. 2005. Salak [terhubung berkala]. http://www.iptek.net.id/ind/pd tanobat / view.php?id=54.[ 5 Maret 2008]. [BAPPENAS] Badan Pengembangan Pembangunan Nasional. 2000. Salak (Salacca edulis Reinw.) [terhubung berkala]. http://www.ristek.go.id [ 5 Maret 2008]. Barnet JA, Payne RW, Yarrow D. 1982. Yeast : Characteristic and Identification. Ed. Ke-3. Chambridge : United Kingdom Univ. Berneheim F, Berneheim MLC, Wilbur KM. 1948. The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation product of certain lipids. J Biol chem 174 : 257-264. Carbonneau MA, Peuchant E, Canioni DP, Clerc M. 1991. Free and bound malondialdehyde measured as thiobarbituric acid adduct by HPLC in serum and plasma. Clin Chem 37/8 : 1423-1429.

Hariyatmi. 2004. Kemampuan Vitamin E sebagai antioksidan terhadap radikal bebas pada lanjut usia. MIPA 1: 52 – 60. Hsu

CY, Chan YP, Chang J. 2007. Antioxidant activity of extract from Polygonum cuspidatum. Biol Res 40: 1321

Sahputra FM. 2008. Potensi ekstrak kulit dan daging buah salak sebagai antidiabetik [skripsi]. Bogor: FMIPA IPB. Julian K. 1969. Cancer and vitamin C what are the fact?. J Biochem : 1-4. Kapiotis S, Sengoelge G, Held I, Seelos B, Hermann M, Gmeiner MK. 1997. Paracetamol catalyzes myeloperoxidaseinitiated lipid oxidation in LDL. Am Heart Assoc 17 : 2855-2860. Kartikawati D. 1999. Studi efek protektif vitamin C terhadap respon imun dan enzim antioksidan pada mencit yang dipapar paraquat [tesis]. Bogor: Institut Pertanian Bogor, Program Pasca Sarjana. Larson RA . 1988. The antioxidants of higher plants. Phytochemistry 27: 969-978. Li K, Shang X, Chen Y. 2004. High performance liquid chromatrography

15

detection of lipid peroxidation in human seminal plasma and its application to male infertility. Clin Chim Acta. 340 : 199-203. Linder, MC. 1992. Biokimia Nutrisi dan Metabolisme. Parakkasi A, penerjemah. Jakarta : UI Press. Terjemahan dari :. Nutritional Biochemistry and Metabolism. Lisnawati Y. 2004. Aktivitas antioksidan Vitamin C dan teh hijau berdasarkan resistensi etanol pada sel khamir Candida sp. [skripsi]. Bogor : FMIPA IPB. Lykkesfeldt J. 2001. Determination of malondialdehyde as thiobarbituric acid adduct in biological samples by HPLC with fluorescence detection : comparison with ultraviolet visible spectrophotometry. Clin Chem 47 : 1725-1727. Manon S. 2004. Utilization of yeast to investigate the role of lipid oxidation in cell death. Antiox redox signal 6: 259267. Marks DB, Marks AD, Smith CM. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar : Sebuah Pendekatan Klinis. Pendit BU, penerjemah, Suyono J, Sadikin V, Madra LI, editor. Jakarta : EGC. Terjemahan dari : Basic Medical Biochemistry : A Clinical Approach. Mattjik AA. 2002. Rancangan Percobaan. Bogor: IPB Pr. Moradas FP, Costa V, Piper P, Mager W. 1996. The molecular defences againt reactive oxygen species in yeast. Mol Microbiol. 19: 651-658. Muchtadi D. 1978. Perubahan fisiko kimia buah salak kalengan selama penyimpanan [tesis]. Bogor : Institut Pertanian Bogor, Sekolah Pasca Sarjana. Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. 2001. Biokimia Harper. Ed ke-25. Hartanto A, penerjemah. Jakarta : EGC. Terjemahan dari : Harper Biochemistry. Nielsen F, Mikkelsen BB, Nielsen JB, Andersen HR, Grandjean P. 1997. Plasma malondialdehyde as biomarker for

oxidative stress: reference interval and effects of life-style factors. Clin Chem 43 : 1209-1214. Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. 1978. Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid. J Lipid Res 19: 10531057. Perrone GG, Tan XS, Dawes WI. 2008. Reactive oxygen species and yeast apoptosis. Biochim Biophys Acta XX: 115. Priyatno LHA, Ibrahim S, Adnyana IK, Sukandar EY. 2006. Aktivitas antioksidan ekstrak daging buah salak varietas Bongkok (Salacca edulis Reinw.). Acta Phar Indonesia 1: 24-27. Raflizar, Adimunca C, Tuminah S. 2006. Dekok daun Paliasa (Kleinhovia hospita Linn.) sebagai obat radang hati akut. Cermin Dunia Kedokteran 150 : 10-14. Richard MJ, Guiraud P, Meo J, Favier A. 1992. High-performance liquid chromatography separation of malondialdehyde–thiobarbituric acid adduct in biological materials (plasma and human cells) using a commercially available reagent. J Chromatogr 577: 9– 18. Risnawati A. 2007. Efek pro-oksidasi dan anti-oksidasi teh hijau (camellia sinensis) pada khamir Candida sp. Y390 yang diperlakukan dengan parasetamol berdasarkan peroksidasi lipid [skripsi]. Jakarta : FMIPA ISTN. Saono S, Gandjar I. 1974. Hydrocarbon utilizing soil yeasts from oil fields in Tjepu region (Central Java), Indonesia. Ann Bogorienses V: 123-129. [TNZBIRT] The New Zealand Baking Industry Research Trust. 2008. Bread Ingredients [terhubung berkala]. http://www.bakeinfo.co.nz/school/school _info/bread_ingredients.php#top [ 11 September 2008]. Tukozkan N, Erdamar H, Seven I. 2006. Mesurement of total malondialdehyde in plasma and tissue by high-performance liquid chromatrography and thiobarbituric acid assay. Firat tip Dergisi 11 : 88-92.

16

Wilbur KM, Bernheim F, Shapiro OW. 1949. The thiobarbituric acid reagent as a test for oxidation of unsaturated fatty acids by various agents. Arch Biochem 24: 305313. Wiseman H, Rigway T. 2000. Membran lipid and lipoprotein by antioxidants. Di dalam :,Biomolecular free radical toxicity : causes and prevention. New York : J Willey. Yomes T. 2000. Sifat prooksidan dan antioksidan vitamin C dan teh hijau pada sel Khamir Candida sp. Y390 berdasarkan peroksidasi lipid [skripsi]. Bogor : FMIPA IPB. Young IS, Trimble ER. 1991. Measurement of malondialdehyde in plasma by high performance liquid chromatography with fluorimetric detection. Ann Clin Biochem 28:504-508. .

17

LAMPIRAN

18

Lampiran 1 Tahapan penelitian Ekstraksi daging buah salak Bongkok

Uji fitokimia

Peremajaan sel khamir

Pembuatan kurva standar TMP

Pembuatan stok kultur khamir Pembuatan kurva pertumbuhan sel khamir Penentuan konsentrasi ekstrak daging buah salak Bongkok Pengukuran penghambatan peroksidasi lipid sel khamir yang diberi parasetamol 0.3% oleh ekstrak daging buah salak Bongkok dan

Analisa statistik

19

Lampiran 2 Ekstraksi daging buah salak Bongkok (Harbone 1987) Daging buah salak Bongkok kering Maserasi dengan etanol 70% Saring filtrat Rotavapor 40oC sampai pekat Bilas dengan etil asetat Rotavapor 40oC sampai pekat Dikeringkan dalam oven 40-60oC hingga kering Estrak kasar

Lampiran 3 Rendemen ekstrak daging buah salak Bongkok muda dan tua Sampel Bobot sampel Bobot ekstrak Rendemen (g) (g) (%) Daging buah salak muda 60 25.16 41.93 Daging buah salak tua 60 34.26 57.10 Cara Perhitungan : Rendemen (%) = Bobot ekstrak x 100% Bobot sampel = 25.16 x 100% = 41.93% 60

20

Lampiran 4 Pembuatan kurva pertumbuhan sel khamir 1 ml 0 .1 ml 0.1 m l

0 .1 ml

0 .1 m l

0 .1 ml

0 .1 ml

0.1 m l

n=3 0.9 m l

10-1

0.9 m l

10-2

0 .9 m l

10-3

0 .1 ml

0 .9 ml

10-4

0 .1 ml

0 .9 ml

0 .9 m l 0 .9 m l

10-5

10 -6

0.9 m l

10-7

0 .1 ml

Hari ke-0 Hitung koloni

Hari ke-1 : 10-4, 10-5, 10-6 Hari ke-2,3, dan 4 : 10-5, 10-6, 10-7

Lampiran 5 Populasi rerata pertumbuhan khamir Candida sp. Hari ke- Jumlah koloni Kepadatan sel 106 (CFU/mL) 0 0.92 0.92 1 16.5 16.5 2 58.0 58.0 3 62.5 62.5 4 56.5 56.5 Total kepadatan sel 48.6 Keterangan : Tingkat pengenceran 105 kali. Perhitungan (misalkan jumlah koloni 0.92 koloni) : Kepadatan sel (CFU/mL) = Jumlah koloni x faktor pengenceran Volume biakan yang diinokulasikan = 0.92 koloni x 105 0.1 mL = 0.92 x 106 CFU/mL CFU/mL : Colony Forming Unit/mL

21

Lampiran 6 Penentuan kurva standar TMP (Li et al. 2004) larutan stok pereaksi 1,1,3,3-tetrametoksi propana (TMP) 6M diencerkan dengan akuades TMP 60 ?M. diencerkan dengan akuades 0.375, 0.75, 1.125, 1.5, 1.875 ?M

+ 0.4 mL TCA 75% dan 0.75 mL TBA 0.67%,

Panaskan pada T 95oC, 60 menit Dinginkan Sentifuse pada 8200 G, 5 menit Diambil lapisan atas Saring dengan filter whatman 0.45?m Ukur dengan HPLC panjang gelombang 532nm

Luas area

Lampiran 7 kurva standar 1,1,3,3-tetrametoksi propana (TMP) Konsentasi MDA (µM) Luas area 0.375 133.954 0.750 276.745 1.125 416.690 1.500 481.941 1.875 674.910 800000 700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 0

y = 128711x + 10716 R 2 = 0.9832

0.375

0.75

1.125

1.5

1.875

Konsentrasi MDA (uM)

Gambar 16 Kurva propana Grafikstandar 2 Kurva1,1,3,3-tetrametoksi standar Malonildehida (MDA)(TMP)

22

Lampiran 8 Penentuan lipid peroksida suspensi sel khamir pada penelitian pendahuluan. Biakan khamir 400 mL

Sentrifus 5000 G, 10 menit, ambil peletnya dibilas + akuades, dan disentrifus kembali, peletnya + akuades = 25 mL Suspensi sel 1 mL

Kontrol normal + Akuades n=3

Ekstrak daging muda Konsentrasi

Ekstrak daging tua Konsentrasi

A= 50 ppm B=100 ppm C= 200 ppm D= 1200 ppm E = 2000 ppm +

A= 50 ppm B=100 ppm C= 200 ppm D= 1200 ppm E = 2000 ppm +

Akuades n=3

Akuades n=3

Inkubasi dengan penggojokan 100 rpm, 60 menit Suspensi sel + 0.4 mL TCA 75% (b/v) dikocok

Blanko 1.6 mL akuades + 0.4 mL TCA 75 % Dikocok

+0.75 mL TBA 0.67% (b/v), dikocok dan ditutup rapat Panaskan pada T 95oC, 60 menit, Dinginkan Sentifuse pada 8200 G, 5 menit Diambil lapisan atas Ukur dengan HPLC

23

Lampiran 9 Pengukuran lipid peroksida sel khamir Candida sp. terhadap penambahan ekstrak daging buah salak muda Perlakuan

Kontrol normal Ekstrak salak 50 ppm Ekstrak salak 100 ppm Ekstrak salak 200 ppm Ekstrak salak 1200 ppm Ekstrak salak 2000 ppm

Luas area

Konsentrasi MDA (µM)

Lipid peroksida (nM MDA/106 CFU) 18,404 11,180 1,749 40,365 32,562 28,446 6,884 96,467 80,381 22,850

Waktu retensi

12558 11835 10891 14756 13975 13563 11405 20371 18761 13003 21190

0,014 0,009 0,001 0,031 0,025 0,022 0,005 0,075 0,063 0,018 0,081

51477

0,317

407,261

4,975

44520

0,263

4,989

49245 109839 111160 128267

0,299 0,770 0,780 0,913

337,751 384,960 990,382 1003,580

104,650

1174,504

4.461 4.433 4.417 5.060 5.075 5.084 5,052 5,064 5,064 4,988 4,957

4,968 4,969 4,968 4,967

Contoh perhitungan MDA Kepadatan sel : 48.6 x 106/mL Jumlah biakan awal : 400 ml Volume biakan akhir : 25 ml Volume yang diambil : 1 ml 1 ml Kepadatan sel dalam 1 ml = 400 ml (48.6 x 106/ml) 25 ml = 777.6 x 106/ml y = ax + b dimana y = luas area x = konsentrasi malondialdehida (µM) y = 128711x + 10716 x = (y-10716)/ 128711 µM Misalkan : y = 12558 x = (12558-10716)/ 128711 µM x = 0.014 µM x = 14 x 103 nM konsentrasi MDA Jumlah lipid peroksida = jumlah biakan dalam 1 ml = 14 x 103 nM 777.6 x 106/ml = 18.04 nM/ 106 CFU

Rata-rata lipid peroksida (nM MDA/106 CFU)

10,444 + 8,351

33,791 + 6,054

61,244 + 47,759

63,750 + 57,841

376,657 + 35,491

1056.155 + 102,705

24

Lampiran 10 Pengukuran lipid peroksida suspensi sel khamir Candida sp. terhadap penambahan ekstrak daging buah salak tua Perlakuan

Kontrol negatif Ekstrak salak 50 ppm Ekstrak salak 100 ppm Ekstrak salak 200 ppm Ekstrak salak 1200 ppm Ekstrak salak 2000 ppm

Luas area 12558 11835 10891 13873 17057

Konsentrasi MDA (µM) 0,014 0,009 0,001 0,025 0,049

12015 20434 20823

0,010 0,076 0,079

25146 21367 25959 27269

0,112 0,083 0,118 0,129

50426 59203 61391

0,309 0,377 0,394

70240 99546 105997

0,462 0,690 0,740

Lipid peroksida (nM MDA/106 CFU) 18,404 11,180 1,749 31,543 63,356 12,979 97,097 100,983 144,176 106,419 152,300 165,388 396,760 484,455 506,316 594,730 887,540 951,994

Waktu retensi

Rata-rata lipid peroksida (nM MDA/106 CFU)

4.461 10,444 + 8,351

4.433 4.417 5,07 4,574

35,959 + 25,477

4.433 4,564 4,577

114,085 + 26,132

4,556 4,958 4,964 4,567

141,369 + 30,967

4,949 4,961 4,961

462,510 + 57,981

4,967 4,966 4,97

811,421 + 190,407

Contoh perhitungan MDA Kepadatan sel : 48.6 x 106/mL Jumlah biakan awal : 400 ml Volume biakan akhir : 25 ml Volume yang diambil : 1 ml 1 ml Kepadatan sel dalam 1 ml = 400 ml (48.6 x 106/ml) 25 ml = 777.6 x 106/ml y = ax + b dimana y = luas area x = konsentrasi malondialdehida (µM) y = 128711x + 10716 x = (y-10716)/ 128711 µM Misalkan : y = 12558 x = (12558-10716)/ 128711 µM x = 0.014 µM x = 14 x 103 nM konsentrasi MDA Jumlah lipid peroksida = jumlah biakan dalam 1 ml = 14 x 103 nM 777.6 x 106/ml = 18.04 nM/ 106 CFU

25

Lampiran 11 Pengukuran lipid peroksida suspensi sel khamir pada penelitian utama Biakan khamir 400 mL

Sentrifus 5000 G, 10 menit, ambil peletnya dibilas, sentrifus kembali, peletnya + akuades = 25 mL Suspensi sel 1 mL

Kontrol normal + 2 Akuades n=3

Pembanding normal Akuades3 + Vitamin C 0.225 mg/mL

n=3

Kontrol positif Akuades + Parasetamol 0.3% n=3

Pembanding stres oksidatif 4 Parasetamol 0.3% + Vitamin C 0.225 mg/mL n=3

Perlakuan normal Akuades + ekstrak daging buah salak Bongkok n=3

5

Perlakuan stres oksidatif Parasetamol 0.3% + ekstrak daging buah salak Bongkok n=3

Inkubasi dengan penggojokan 100 rpm, 60 menit

Suspensi sel + 0.4 mL TCA 75% (b/v) dikocok

Blanko 1.6 mL akuades + 0.4 mL TCA 75 % Dikocok

+ 0.75 mL TBA 0.67% (b/v), dikocok dan ditutup rapat

Panaskan pada T 95oC, 60 menit, Dinginkan Sentifuse pada 8200 G, 5 menit Diambil lapisan atas Diukur dengan HPLC

26

Lampiran 12 Pengukuran lipid peroksida suspensi sel khamir Candida sp. pada penelitian utama Lipid peroksida Rata-rata lipid Luas Konsentrasi Waktu Perlakuan (nM peroksida (nM area MDA (µM) retensi MDA/106 MDA/106 CFU) CFU) Kontrol Normal

21806 19580 20719

0,086 0,069 0,078

110,805 88,564 99,944

4,463 4,58 4,569

99.771 + 11.1215

Ekstrak Tua 200 ppm

21367 25959 27269

0,083 0,118 0,129

106,419

141.369 + 30.966

Vitamin C 0.225 mg/mL Ekstrak Tua 200 ppm + Parasetam ol 0.3 % Vitamin C 0.225 mg/mL + Parasetam ol 0.3 %

22448 23477 23367

0,091 0,099 0,098

152,300 165,388 117,220 127,501 126,402

4,958 4,964 4,567 4,597 4,742 4,729

123.707 + 5.645

26503

0,123

157,735

4,621

32335

0,168

216,005

4,585

27969

0,134

172,382

4,571

29768

0,148

190,357

4,616

31239

0,159

205,054

4,627

35999

0,196

252,614

4,501

44758

0,264

340,129

4,49

44789

0,265

340,438

4,514

Parasetam ol 0.3%

Contoh perhitungan MDA Kepadatan sel : 48.6 x 106/mL Jumlah biakan awal : 300 ml Volume biakan akhir : 18.75 ml Volume yang diambil : 1 ml

1 ml Kepadatan sel dalam 1 ml

300 ml

=

(48.6 x 106/ml)

18.75 ml = 777.6 x 106/ml y = ax + b dimana y = luas area x = konsentrasi malondialdehida (µM) y = 128711x + 10716 x = (y-10716)/ 128711 µM Misalkan : y = 12558 x = (12558-10716)/ 128711 µM x = 0.014 µM = 14 x 103 nM Konsentrasi lipid peroksida =

konsentrasi MDA jumlah biakan dalam 1 ml

= 14 x 103 nM 777.6 x 106/ml = 18.04 nM/ 106 CFU

182.040 + 30.311

197.705 + 10.392

311.060 + 50.616

27

Lampiran 13 Hasil pengolahan data kurva pertumbuhan sel khamir Candida sp. dengan metode ANOVA Kurva pertumbuhan Sumber keragaman

Jumlah kuadrat (JK)

Derajat bebas (DB)

Perlakuan Galat Total

7661.779

Kuadrat tengah (KT)

F hitung

4

1915.445

191.533

6

31.922

7853.312

10

60.004

P value

.000

Uji Duncan kurva pertumbuhan hari ke-

Ulangan (N)

Kepadatan sel (CFU/mL) 1 .920000

2

3

hari ke-0

3

hari ke-1

2

hari ke-4

2

56.500000

hari ke-2

2

58.000000

hari ke-3

2

Sig.

16.500000

62.500000 1.000

1.000

.328

Keterangan : Selang kepercayaan Alfa (a) = 0.05

Lampiran 14 Hasil pengolahan data lipid peroksida sel khamir Candida sp. terhadap ekstrak daging buah salak tua dan muda dengan metode ANOVA ANOVA

konsentrasi lipid peroksida (nM MDA/106 CFU) ekstrak salak muda dan tua Sumber keragaman

Jumlah kuadrat (JK)

Perlakuan

3731117.0 60 115551.51 5 3846668.5 75

Galat Total

Derajat bebas (DB)

Kuadrat tengah (KT)

10

373111,706

21

5502,453

31

F hitung 67,808

P value

,000

28

Lanjutan lampiran 14 Hasil pengolahan data lipid peroksida sel khamir Candida sp. terhadap ekstrak daging buah salak tua dan muda dengan metode ANOVA Uji Duncan ekstrak salak muda dan tua Ulangan (N)

perlakuan

Lipid peroksida (nM MDA/106 CFU)

kontrol normal

3

1 10,44433

ekstrak salak muda 50 ppm

3

33,79100

ekstrak salak tua 50 ppm

3

35,95933

ekstrak salak muda 100 ppm

3

61,24400

ekstrak salak muda 200 ppm

2

63,75000

3

114,08533

3

141,36900

ekstrak salak tua 100 ppm ekstrak salak tua 200 ppm

2

3

ekstrak salak muda 1200 ppm

3

376,65733

ekstrak salak tua 1200 ppm

3

462,51033

ekstrak salak tua 2000 ppm

3

ekstrak salak muda 2000 ppm

3

4

811,42133 1056. 15533

Sig.

,077

,180

1,000

1,000

Keterangan : Selang kepercayaan Alfa (a) = 0.05

Lampiran 15 Hasil pengolahan data lipid peroksida sel khamir Candida sp. pada penelitian utama dengan metode ANOVA ANOVA

Sumber keragaman

Jumlah kuadrat (JK)

Derajat bebas (DB)

Kuadrat tengah (KT)

Perlakuan Galat Total

84979.145

5

16995.829

9298.657

11

845.332

94277.802

16

F hitung 20.105

P value

.000

29

Lanjutan lampiran 15 Hasil pengolahan data lipid peroksida suspensi sel khamir Candida sp. pada peneliyian utama dengan metode ANOVA Uji Duncan peroksidasi lipid sel khamir Lipid peroksida (nM MDA/106 Ulangan CFU) perlakuan (N) kontrol normal

3

1 99.77100

Vitamin C 1.6 mg/mL

3

123.70767

3

141.36900

ekstrak salak tua 200 ppm

2

3

141.36900

ekstrak salak tua 200 ppm + parasetamol 0.3%

3

182.04067

Vitamin C 1.6 mg/mL + parasetamol 0.3%

2

197.70550

Parasetamol 0.3%

3

311.06033

Sig.

.137

.052

1.000

Keterangan : Selang kepercayaan Alfa (a) = 0.05

Lampiran 16 Hasil pengukuran HPLC Kurva standar TMP Komparasi standar (10,20,30,40,50)(merah, biru, coklat, biru muda, ungu) uV 55000 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

min

Standar 10 mAU

TMP-(TBA)2 10.0 7.5 5.0 2.5 0.0 0.0

Peak# 3

1.0

ID# 4

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.636 1.00

4.0

5.0

Area 133954

6.0

Height 10983

7.0

Mark

min

Peak Start Peak End Area% 4.308 5.325 79.4704

30

Lanjutan lampiran 16 Hasil pengukuran HPLC Standar 20 mAU

TMP-(TBA)2

20 15 10 5 0 2.0

Peak# 8

ID# 4

3.0

4.0

5.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.636 1.00

6.0

Area 276745

Height 23537

7.0

Mark

min

Peak Start Peak End Area% 4.325 5.300 53.8522

standar 30 mAU

TMP-(TBA)2

35 30 25 20 15 10 5 0 0.0

Peak# 3

1.0

ID# 4

2.0

3.0

4.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.620 1.00

5.0

Area 416690

6.0

Height 35588

7.0

Mark

min

Peak Start Peak End Area% 4.308 5.292 79.9555

standar 40 mAU

TMP-(TBA)2

40 30 20 10 0 0.0

Peak# 4

1.0

ID# 4

2.0

3.0

4.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.620 1.00

5.0

Area 481941

6.0

Height 41408

7.0

Mark

min

Peak Start Peak End Area% 4.300 5.267 74.9008

standar 50 mAU 60

TMP-(TBA)2

50 40 30 20 10 0 0.0

Peak# 4

1.0

ID# 4

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.628 1.00

4.0

5.0

Area 674910

6.0

Height 58028

7.0

Mark

min

Peak Start Peak End Area% 4.292 5.292 74.9628

31

Lanjutan lampiran 16 Hasil pengukuran HPLC Penentuan konsentrasi salak Kontrol normal-1 mAU 7.5 5.0 2.5

MDA-(TBA)2 0.0 0.0 Peak# 8

ID# 5

1.0

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.461 0.76

4.0

5.0

Area 12558

Height 913

6.0 Mark

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 4.142 4.750 11.6639

Kontrol normal-2 mAU

7.5

5.0

2.5

MDA-(TBA)2

0.0 0.0

Peak# 7

1.0

ID# 5

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.433 0.71

4.0

Area 11835

5.0

Height 1095

6.0

Mark

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 4.192 4.775 16.0733

Kontrol normal-3 mAU 7.5

MDA(TBA)2

5.0 2.5 0.0 0.0

Peak# 9

ID# 5

1.0

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.417 0.66

4.0

Area 10891

5.0

Height 1195

6.0

Mark

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 4.283 4.700 17.6997

32

Lanjutan lampiran 16 Hasil pengukuran HPLC Ekstrak Muda 50-1 6

mAU

5

4

MDA-TBA

3

2

1

0 0.0

Peak# 8

1.0

ID# 1

2.0

3.0

4.0

Name Ret. Time Conc. MDA-TBA 5.060

5.0

6.0

Area 0.00

7.0

Height 14756

min

Mark 1063

Peak Start Peak End Area% 4.867 6.033 19.5537

Ekstrak muda 50-2 mAU 7 6 5

MDA-TBA

4 3 2 1 0 0.0

Peak# 8

1.0

ID# 1

2.0

3.0

4.0

Name Ret. Time Conc. MDA-TBA 5.075

5.0

6.0

Area 0.00

7.0

Height 13975

min

Mark 1126

Peak Start Peak End Area% 4.883 5.533 15.4663

Ekstrak muda 50-3 mAU 7 6 5

MDA-TBA

4 3 2 1 0 0.0

Peak# 8

1.0

ID# 1

2.0

3.0

4.0

Name Ret. Time Conc. MDA-TBA 5.084

5.0

6.0

Area 0.00

7.0

Height 13563

min

Mark 1105

Peak Start Peak End Area% 4.892 5.550 14.4928

Ekstrak muda 100-1 mAU

5

4

MDA-TBA

3

2

1

0 0.0

Peak# 7

1.0

ID# 1

2.0

3.0

4.0

Name Ret. Time Conc. MDA-TBA 5.052

5.0

Area 0.00

6.0

7.0

Height 11405

min

Mark 813

Peak Start Peak End Area% 4.850 5.508 17.5426

33

Lanjutan lampiran 16 Hasil pengukuran HPLC Ekstrak muda 100-2 7

mAU

6 5 4

MDA-TBA

3 2 1 0 0.0

Peak# 7

1.0

ID# 1

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. MDA-TBA 5.064

4.0

5.0

Area 0.00

Height 20371

4.0

5.0

Area 0.00

Height 18761

6.0

Mark 1113

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 4.675 6.308 22.7532

Ekstrak muda 100-3 mAU 7 6 5

MDA-TBA

4 3 2 1 0 0.0

Peak# 7

1.0

ID# 1

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. MDA-TBA 5.064

6.0

Mark 1122

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 4.700 6.275 20.0016

Esktrak muda 200-1 mAU

MDA-(TBA)2

1.75 1.50 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 0.0

Peak# 6

1.0

ID# 1

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.988 0.10

4.0

Area 13003

5.0

Height 943

6.0

Mark

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 4.750 5.650 51.8700

Muda 200-2 mA U 50 40 30 20 10

MDA-(TBA)2

0 1.0

0.0

Peak# 8

ID# 8

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.992 0.00

4.0

Area 10629

5.0

Height 1150

6.0

Mark

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 4.850 5.150 2.9379

34

Lanjutan lampiran 16 Hasil pengukuran HPLC Muda 200-3 mAU 8 7 6 5 4 3

MDA-(TBA)2

2 1 0 0.0

Peak# 6

1.0

ID# 1

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.957 0.17

4.0

Area 21190

5.0

Height 1681

6.0

Mark

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 4.792 5.583 32.920

Muda 1200-1 mAU 15.0 12.5 10.0 7.5

MDA-(TBA)2

5.0 2.5 0.0 0.0

Peak# 8

ID# 1

1.0

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.975 0.41

4.0

Area 51477

5.0

Height 4033

6.0

Mark

7.0

min

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 4.800 5.625 31.2537

Muda 1200-2 mAU

20

15

10

MDA-(TBA)2 5

0 0.0

Peak# 8

1.0

ID# 1

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.989 0.36

4.0

Area 44520

5.0

Height 3516

6.0

Mark

Peak Start Peak End Area% 4.817 5.392 21.6267

Muda 1200-3 mAU

12.5 10.0 7.5

MDA-(TBA)2

5.0 2.5 0.0 0.0

Peak#

ID#

1.0

Name

2.0

3.0

Ret. Time Conc.

4.0

Area

5.0

Height

6.0

Mark

7.0

min

Peak Start Peak End Area%

35

9

1

unknown 4.968

0.40

49245

3937

4.800

5.408

33.7401

Lanjutan lampiran 16 Hasil pengukuran HPLC Muda 2000-1 mAU 20.0 17.5 15.0 12.5

MDA-(TBA)2

10.0 7.5 5.0 2.5 0.0 0.0

Peak# 7

1.0

ID# 1

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.969 0.88

4.0

5.0

Area 109839

Height 8572

6.0

Mark

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 4.792 5.433 36.2317

Muda 2000-2 mAU 22.5 20.0 17.5 15.0 12.5

MDA-(TBA)2

10.0 7.5 5.0 2.5 0.0 0.0

Peak# 7

1.0

ID# 1

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.968 0.89

4.0

5.0

Area 111160

Height 8644

6.0

Mark

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 4.800 5.658 37.360

Muda 2000-3 22.5

mAU

20.0 17.5 15.0

MDA-(TBA)2

12.5 10.0 7.5 5.0 2.5 0.0 0.0

Peak# 7

1.0

ID# 1

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.967 1.03

4.0

Area 128267

5.0

Height 9887

6.0

Mark

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 4.792 5.658 40.5313

Tua 50-1 6

mAU

5 4 3

MDA-(TBA)2

2 1 0 0.0

Peak# 8

1.0

ID# 1

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 5.070 0.46

4.0

Area 13873

5.0

Height 1049

6.0

Mark

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 4.892 5.592 18.8111

36

Lanjutan lampiran 16 Hasil pengukuran HPLC Ekstrak tua 50-2 mAU

7.5

5.0

MDA-(TBA)2

2.5

0.0 0.0

Peak# 7

1.0

ID# 5

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.433 0.72

4.0

Area 12015

5.0

Height 1203

6.0

Mark

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 4.217 4.792 15.8370

Ekstrak Tua 50-3 7.5

mAU

5.0

MDA-(TBA)2

2.5

0.0 0.0

Peak# 8

1.0

ID# 5

2.0

3.0

4.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.574 0.10

5.0

Area 17057

6.0

Height 1626

7.0

Mark

min

Peak Start Peak End Area% 4.400 4.908 21.1130

Tua 200-1 mAU 7.5 5.0

MDA-(TBA)2

2.5 0.0 0.0 Peak# 7

ID# 5

1.0

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.567 0.16

4.0

5.0

Area 27269

Height 2058

6.0 Mark

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 4.392 5.175 29.3797

Tua 200-2 mAU 9 8 7 6 5 4 3

MDA-(TBA)2

2 1 0 0.0

Peak# 7

1.0

ID# 1

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.958 0.17

4.0

Area 21367

5.0

Height 1598

6.0

Mark

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 4.783 5.683 27.6281

37

Lanjutan lampiran 16 Hasil pengukuran HPLC Tua 200-3 mAU 10.0

7.5

5.0

MDA-(TBA)2

2.5

0.0 0.0

Peak# 7

1.0

ID# 1

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.964 0.21

4.0

Area 25959

5.0

Height 1921

6.0

Mark

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 4.792 5.717 26.4255

Tua 1200-1 mAU 10.0 7.5

MDA-(TBA)2

5.0 2.5 0.0 0.0

Peak# 7

1.0

ID# 1

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.949 0.40

4.0

Area 50426

5.0

Height 3868

6.0

Mark

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 4.758 5.642 27.0858

Tua 1200-2 mAU 15.0 12.5 10.0

MDA-(TBA)2

7.5 5.0 2.5 0.0 0.0

Peak# 6

1.0

ID# 1

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.961 0.48

4.0

Area 59203

5.0

Height 4730

6.0

Mark

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 4.792 5.383 30.2117

Tua 1200-3 17.5

mAU

15.0 12.5 10.0 7.5

MDA-(TBA)2

5.0 2.5 0.0 0.0

Peak# 6

1.0

ID# 1

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.961 0.49

4.0

Area 61391

5.0

Height 4906

6.0

Mark

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 4.792 5.375 30.1750

38

Lanjutan lampiran 16 Hasil pengukuran HPLC Tua 2000-1 mAU 15.0 12.5 10.0

MDA-(TBA)2

7.5 5.0 2.5

Peak# 8

0.0 0.0

ID#

1.0

Name

2.0

3.0

Ret. Time Conc. 7.196 0.00

4.0

5.0

Area 10196

Height 279

Mark

6.0

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 6.625 7.967 4.658

Tua 2000-2 20.0

mAU

17.5 15.0 12.5

MDA-(TBA)2

10.0 7.5 5.0 2.5 0.0 0.0

Peak# 7

ID# 1

1.0

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.966 0.80

4.0

5.0

Area 99546

Height 7917

6.0

Mark

7.0

min

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 4.792 5.408 34.2450

Tua 2000-3 mAU 17.5 15.0 12.5

MDA-(TBA)2

10.0 7.5 5.0 2.5 0.0 0.0

Peak# 6

1.0

ID# 1

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.970 0.85

4.0

Area 105997

5.0

Height 8356

6.0

Mark

Peak Start Peak End Area% 4.792 5.442 31.5722

Data HPLC penelitian utama Kontrol normal-1 mAU

5.0

2.5

MDA-(TBA)2 0.0

0.0

Peak# 6

1.0

ID# 5

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.580 0.11

4.0

Area 19580

5.0

Height 1659

6.0

Mark

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 4.375 4.942 24.3397

39

Lanjutan Lampiran 16 Hasil pengukuran HPLC Kontrol normal-2 mAU 7.5

5.0

MDA-(TBA)2 2.5

0.0 0.0

Peak# 7

1.0

ID# 5

2.0

3.0

4.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.569 0.12

5.0

Area 20719

6.0

Height 1855

7.0

Mark

min

Peak Start Peak End Area% 4.383 4.925 22.4702

Kontrol normal-3 mAU 3.0 2.5 2.0

MDA-(TBA)2

1.5 1.0 0.5 0.0 -0.5 0.0

Peak# 6

1.0

ID# 4

2.0

3.0

4.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.463 0.16

5.0

Area 21806

6.0

Height 1664

7.0

Mark

min

Peak Start Peak End Area% 4.283 5.100 36.1257

T200-1 mAU 8 7 6 5 4 3

MDA-(TBA)2

2 1 0 0.0

Peak# 5

1.0

ID# 4

2.0

3.0

4.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.767 0.18

5.0

Area 23835

6.0

Height 1751

7.0

Mark

min

Peak Start Peak End Area% 4.517 5.325 25.8819

Tua 200-2 mAU 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0.0

Peak# 7

ID# 1

MDA-(TBA)2

1.0

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.958 0.17

4.0

Area 21367

5.0

Height 1598

6.0

Mark

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 4.783 5.683 27.6281

40

Lanjutan lampiran 16 Hasil pengukuran HPLC Tua 200-3 mAU 10.0

7.5

5.0

MDA-(TBA)2 2.5

0.0 0.0

Peak# 7

1.0

ID# 1

2.0

3.0

4.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.964 0.21

5.0

Area 25959

6.0

Height 1921

7.0

Mark

min

Peak Start Peak End Area% 4.792 5.717 26.4255

C-1 mAU

7.5

5.0

MDA-(TBA)2

2.5

0.0 0.0

Peak# 5

1.0

ID# 4

2.0

3.0

4.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.742 0.18

5.0

Area 23477

6.0

Height 1570

7.0

Mark

min

Peak Start Peak End Area% 4.342 5.317 25.876

C-2 mAU

7.5

5.0

MDA-(TBA)2

2.5

0.0 0.0

Peak# 5

1.0

ID# 4

2.0

3.0

4.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.729 0.17

5.0

Area 23367

6.0

Height 1554

7.0

Mark

min

Peak Start Peak End Area% 4.358 5.308 25.9660

C-3 mAU 10.0 7.5 5.0

MDA-(TBA)2

2.5 0.0 0.0

Peak# 4

1.0

ID# 4

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.597 0.03

4.0

5.0

Area 22448

6.0

Height 1679

7.0

Mark

min

Peak Start Peak End Area% 4.108 4.992 22.8699

41

Lanjutan lampiran 16 Hasil pengukuran HPLC TP-1 mAU 10.0

7.5

5.0

MDA-(TBA)2 2.5

0.0 0.0

Peak# 6

1.0

ID# 5

2.0

3.0

4.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.571 0.16

5.0

Area 27969

6.0

Height 1946

7.0

Mark

min

Peak Start Peak End Area% 4.383 5.150 22.3561

TP-2 mAU

7.5

5.0

MDA-(TBA)2

2.5

0.0 0.0

Peak# 4

1.0

ID# 4

2.0

3.0

4.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.585 0.24

5.0

Area 32335

6.0

Height 2372

7.0

Mark

min

Peak Start Peak End Area% 4.100 5.208 30.7455

TP-3 mAU 10.0

7.5

5.0

MDA-(TBA)2 2.5

0.0 0.0

Peak# 4

1.0

ID# 4

2.0

3.0

4.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.621 0.04

5.0

Area 26503

6.0

Height 2010

7.0

Mark

min

Peak Start Peak End Area% 4.075 5.008 24.9014

VP-1 mAU 7 6 5 4

MDA-(TBA)2

3 2 1 0 0.0

Peak# 5

1.0

ID# 4

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.616 0.22

4.0

5.0

Area 29768

6.0

Height 2302

7.0

Mark

min

Peak Start Peak End Area% 4.142 5.175 31.3507

42

Lanjutan lampiran 16 Hasil pengukuran HPLC VP-2 mAU

7.5

5.0

MDA-(TBA)2

2.5

0.0 0.0

Peak# 5

1.0

ID# 4

2.0

3.0

4.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.627 0.23

5.0

Area 31239

6.0

Height 2211

7.0

Mark

min

Peak Start Peak End Area% 4.175 5.575 28.3341

P-1 mAU 7 6 5

MDA-(TBA)2

4 3 2 1 0

Peak# 5

0.0

ID# 4

1.0

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.501 0.27

4.0

Area 35999

5.0

Height 3514

6.0

Mark

7.0

min

Peak Start Peak End Area% 4.358 5.008 28.1092

P-2 mAU 10.0 7.5

MDA-(TBA)2

5.0 2.5 0.0 0.0

Peak# 6

1.0

ID# 4

2.0

3.0

4.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.490 0.33

5.0

Area 44758

6.0

Height 4073

7.0

Mark

min

Peak Start Peak End Area% 4.358 5.017 27.7727

p-3 mAU 12.5 10.0 7.5

MDA-(TBA)2

5.0 2.5 0.0 0.0

Peak# 7

1.0

ID# 4

2.0

3.0

Name Ret. Time Conc. unknown 4.514 0.33

4.0

5.0

Area 44789

6.0

Height 4301

7.0

Mark

min

Peak Start Peak End Area% 4.375 5.017 27.4627

1

2

3

This document was created with Win2PDF available at http://www.daneprairie.com. The unregistered version of Win2PDF is for evaluation or non-commercial use only.