PENGHAMBATAN PERKEMBANGAN SEL β PANKREAS PADA TIKUS DARI INDUK BUNTING YANG DIBERI ASAM VALPROAT SEBAGAI HEWAN MODEL DIABETES MELLITUS HADI SUNARYO

PENGHAMBATAN PERKEMBANGAN SEL β PANKREAS PADA TIKUS DARI INDUK BUNTING YANG DIBERI ASAM VALPROAT SEBAGAI HEWAN MODEL DIABETES MELLITUS

HADI SUNARYO

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Penghambatan Perkembangan Sel β Pankreas pada Tikus dari Induk Buntingyang Diberi Asam Valproat sebagai Hewan Model Diabetes Mellitus adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Agustus2014 Hadi Sunaryo NIM B161090061

RINGKASAN HADI SUNARYO. Penghambatan Perkembangan Sel β Pankreas pada Tikus dari Induk Buntingyang Diberi Asam Valproat sebagai Hewan Model Diabetes Mellitus. Dibimbing oleh BAMBANG KIRANADI, ADI WINARTO dan WASMEN MANALU. Diabetes mellitus merupakansuatukelompokpenyakitmetabolikdengankarakteristikhiperglikemia yang terjadikarenakelainansekresi insulin, kerja insulin ataukeduaduanya.Diabetes mellitus (DM)tipe 2 diawalidenganadanyakenaikanjumlah insulin secaraabsolut, yang berhubungandenganobesitasdankurangnyakegiatanfisik.Biasanyadimulaipadausia dewasa, bisakarenaadanyafaktorgenetikatautidak. Kondisiinidiawalidenganresistensi insulin yang kemudianakandiikutiolehpenurunanjumlahsel β sehinggasekresi insulin tidakdapatmemenuhikebutuhan. Penelitian pengembangan obatdanpencegahan diabetesmemerlukan hewan model yang sesuai dengan kondisi diabetes. Hewan model diabetes ada 2 kategori, yaitu tipe model karena genetik dan tipe model karena dapatan yang diperoleh dengan induksi diabetagon, seperti aloksan atau streptozotocin.Hewanmodel yang diperoleh dari seleksi perkawinan dan rekayasa genetik, memerlukan waktu lama serta biaya yang tinggi.Untuk model yang diperoleh dengan induksi diabetagon, kondisi kerusakan sel pankreas ada yang bersifat reversibel dan ada yang kerusakannya permanen.Hewan model yang kerusakan sel pankreasnyasangat parah tidak menggambarkan kejadian diabetestipe 2 yang diinginkan, karena tidak terjadihiperinsulinemiadanmempunyaikronologi yang berbedadengankejadianpadaperiodewaktu DM tipe 2. Obat yang dipakaidalampenelitianiniadalahasamvalproat yang merupakanobatantiepilepsidanantikankerdenganmekanismemenghambat histone deacetylaseberpotensi sebagai obat teratogenik.Pada masa perkembangan embrional asam valproat mempunyai dampak untuk menghambat histone deacetylase (HDAC inhibitor). Hal ini secara in vitrotelah terbukti dengan ditemukannya penekanan diferensiasi sel. Pemberian asam valproat kepada induk tikus bunting dalam periode perkembangan embrio diharapkan mendapat informasi lebih tentang kemungkinanterjadinyapenghambatanperkembanganpankreas. Diharapkanpemberianasamvalproatpadainduk bunting dapatmempengaruhiperkembanganselendokrinpankreassaat organogenesis terjadi.Berdasarkanperiodemasapembentukanpankreasembrio, pemberianasamvalproatpadainduktikus buntingakanmenyebabkanterjadinyagangguanperkembanganselβpankreastikus F1, sehinggaakandidapatkanhewanmodel diabetes yang sesuaidengankondisipatofisiologi diabetes. Penelitiandilakukandengantigatahappendekatan.Pertama, inginmengetahuiapakahpemberianasamvalproatpadamasakebuntingandapatmemp engaruhiperkembanganselendokrinpankreas.Padatahapiniinduktikusputih(Rattusn

overgicus L) galur Sparague Dawley usia 3-4 bulan dikawinkan dengan program timemating,dengan memasangkan tikus betina estrus dengan jantan pada satu kandang hingga terjadi perkawinandan dapat ditentukan umur kebuntingannya. Pada tahap ini asam valproatdosis tunggal 250 mg/kg BB tikus per oral diberikan pada induk bunting pada akhir masa kebuntingan untuk mendapatkan anakan tikus yang akan diamati perkembangan sel endokrin pankreasnya. Pengamatan dilakukan pada tikus F1 usia dewasa muda dengan mengambil pankreasnya dan diamati dengan pewarnaan Hemotoksilin Eosin. Pendekatankedua, mengevaluasiperkembanganselβpankreasdariinduk yang diberiasamvalproatpadaumurkebuntingan yang berbeda.Tahapinidiawalidengantime matinguntukmendapatkantikus bunting dengantigawaktupemberianasamvalproat yang berbedapadapascatrimesterpertama, yaituhari ke-9, ke-11, dan ke-18 kebuntingan. Pengamatan yang dilakukanmeliputikadarglukosadarah, konsentrasi insulin darah,danhistologiselendokrinpankreasdenganteknikimmunohistokimiamengguna kanantibodi anti-insulin dan anti-glukagon. Pendekatanketiga, mengevaluasipeluangtikus F1 dariinduk yang diberiasamvalproatpadaharikebuntingantertentusebagaihewan model diabetes mellitus tipe 2.Pemberianasamvalproatdilakukandenganwaktuberdasarkanevaluasipadatahapse belumnya. Parameter yang digunakanadalahkadarglukosadarah, insulin darah, dantrigliseridadarah, sertahistologidenganpewarnaanimmunohistokimia antibodi anti-insulin. Hasilpenelitianinidapatdisimpulkanbahwapenghambatanselendokrinpankre asdapatdilakukandenganpemberianasamvalproatpadamasakebuntinganindukpascat rimesterpertama.Penghambatanperkembanganselβdapatterjadidenganpemberianas amvalproatpadahari ke-9, 11, dan 18 masakebuntingan, menggambarkandinamikahormon insulin yang berbeda.Penghambatandiferensiasiselendokrinpankreasdenganmenggunakansubst anteratogenikpadamasaperkembanganembrio (organogenesis) dapatmenjadialternatifdalammendapatkantikus model diabetes mellitus tipe 2.Tikus model yang didapatmenggambarkankejadianhiperinsulinemiasebelumadanyahiperglikemiapad ausiadewasasepertigambarandiabetus mellitus tipe 2 yang ditemukanpadamanusia. Kata kunci: penghambatandiferensiasisel β, asamvalproatpenghambatsel β, hewan model diabetes.

SUMMARY HADI SUNARYO. Inhibition of β Cells Pancreas Development in Rats Bornto Mother AdministeredValproicAcidduring Pregnancy asAnimal Models for Diabetes Mellitus.Supervised by BAMBANG KIRANADI, ADI WINARTO andWASMEN MANALU. Diabetesmellitusisagroupof metabolic diseaseswithcharacteristicof hyperglycemiathat occursdue to abnormalinsulinsecretion, insulin actionor both.Type 2 diabetes ispreceded byan increase intheabsoluteamount of insulin, which isassociatedwithobesityandlack ofphysicalactivity. Usually diabetes mellitus beginsin adulthood, which could bedue togenetic predispositionornot. This conditionbegins withinsulin resistance,which will then befollowedbya decrease inthe number ofβcellinsulinsecretionand thelossof capability of the cells to produce insulin. Researchon drug developmentand diabetes preventionrequiresan appropriateanimal modelwithdiabetic pathological conditions. There are two categories of diabeticanimalmodelsnamelygenetical predisposition typemodel anddiabetagonictype model that is induced by alloxanorstreptozotocin.Productionof animalmodelsderivedfrommatingselectionandgeneticengineeringrequires longer times and high cost. For diabetagon induced models, the models produced may have reversible damage or total damage of pancreatic endocrine cells.Animalmodels with severe pancreatic cells damage will not show the incidenceof type 2 diabetes mellitus, but type 1 diabetes mellitus. This study usedvalproic acid as antiepileptic and anticancer drugs. It works as histonedeacetylase inhibitor, which is also known as teratogenic drug. During the embryonic development, valproic acidinhibits histone deacetylase (HDAC inhibitors). In vitro, valproic acid inhibits HDAC activity that eventually suppresses cell differentiation. Administration ofvalproicacidtopregnantmother ratsduringembryonic developmentperiodis expected toprovide moreinformationabout thepossibility ofinhibitingthedevelopment of thepancreas. It is expected thatthe provision ofvalproic acidina pregnantmothercanaffect the developmentof pancreaticendocrinecellsduringorganogenesis. Based on theperiod ofembryonicpancreasformation, administration ofvalproicacidinpregnantmotherwillresult inimpaired developmentof pancreaticβcellsof F1rats.These F1 rats could be used as animal modelsthathave the pathophysiological condition of diabetes. The study was conductedin three stagesapproach. The first stage was designedto studywhether theadministration ofvalproicacidduringpregnancycanaffect the development ofpancreaticendocrinecells. At this stage, the mother rats aged 3-4 months were mated with the time mating program, by mixing estrous female rats with males in

one cage until mating occurs. When the mating was occurred, the date of mating was determined the beginning of pregnancy.Atthis stage,a single dose of250 mg/kg BW valproicacidwas given tothe pregnant experimental ratsorallyat theend of pregnancy (day 18)toobtain ratpupsthatwillbe used to observe the development ofpancreaticendocrinecells. Observations were madeonyoungadultF1ratsby takingtheir pancreasorgans andthen were observedwithHemotoksilineosinstaining. The second approach was designed to evaluatethe development ofpancreaticβcellsofF1 rats born to mother administered valproicacidatdifferentages of gestation. This stage beganwith themating of the experimental rats. The positive pregnant experimental rats were divided into three groups of valproicacid administration based the age of pregnancy i.e., 9th, 11th, and 18thpregnancy. Observationswereconducted on theblood glucose and insulinconcentrationsandpancreaticendocrinecellhistologywithimmunohistochemi caltechniquesusinganti-insulin antibodiesandanti-glucagon. The third approach was designed to evaluatethe opportunityto produce animalmodel oftype 2 diabetes mellitusby administration of valproicacid to the mother at day 9 of pregnancy.The parameters measured were blood glucose, insulin, and triglycerides concentrations, andhistologyof β cells of pancreas by immunohistochemicalstainingwith anti-insulin antibodies. The results of the experiment could be concluded that inhibition of pancreatic endocrine cells can be done by administering valproic acid to pregnant mother during thepost first trimester of pregnancy. Inhibition of β cell development in F1 rats could be produced by administration of valproic acid on day 9, 11, and 18 of pregnancy as indicated by different dynamics of insulin secretions. Inhibition of pancreatic endocrine cell differentiation by using teratogenicsubstance during embryonic development (organogenesis) could be used as an alternative technique to produce type 2 diabetes mellitus rat model. The experimental model produced showed hyperinsulinemia syndrome before hyperglycemiasyndrome during adult ages as were occurred in humans. Keyword: Inhibition of β cells differentiation, valproic aciddisfunctionof β cells, animal models of diabetes.

©HakCiptaMilik IPB, Tahun 2014 HakCiptaDilindungiUndang-Undang Dilarangmengutipsebagianatauseluruhkaryatulisinitanpamencantumkanataumeny ebutkansumbernya.Pengutipanhanyauntukkepentinganpendidikan, penelitian, penulisankaryailmiah, penyusunanlaporan, penulisankritik, atautinjauansuatumasalah; danpengutipantersebuttidakmerugikankepentingan IPB Dilarangmengumumkandanmemperbanyaksebagianatauseluruhkaryatulisinidala mbentukapa pun tanpaizin IPB

PENGHAMBATAN PERKEMBANGAN SEL β PANKREAS PADA TIKUS DARI INDUK BUNTING YANG DIBERI ASAM VALPROAT PADA KEBUNTINGAN SEBAGAI HEWAN MODEL DIABETES MELLITUS

HADI SUNARYO

Disertasi sebagaisalahsatusyaratuntukmemperolehgelar Doktor pada Program StudiIlmu-ilmuFaaldanKhasiatObat

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014

PENGUJI LUAR KOMISI :

PengujipadaUjianTertutup: 1. Dr. drh. Hera Maheswari, M.Sc., AIF. (StafPengajarFakultasKedokteranHewan IPB) 2. Dr. drh. KetutMudite, M.Sc., PAVet. (StafPengajarFakultasKedokteranHewan IPB) Pelaksanaan : 10 Juli 2014

PengujipadaUjian Terbuka: 1. Prof. drh. DondinSajuthi, Ph.D (Guru BesarFakultasKedokteranHewan IPB) 2. Dr. dra. Retno Sari Andarjati, MS.,Apt (BagianFarmakologiFakultasFarmasiUniversitas Indonesia) Pelaksanaan : 14 Agustus 2014

JudulDisertasi:PenghambatanPerkembanganSelβ PankreaspadaTikusdariIndukBunting yang DiberiAsamValproatsebagaiHewan Model Diabetes Mellitus Nama :HadiSunaryo NIM : B161090061

Disetujuioleh KomisiPembimbing

Dr.IrBambangKiranadi, MSc Ketua

Drh. AdiWinarto, Ph.D., PAVet Anggota

Prof.Ir. WasmenManalu, Ph.D. Anggota Diketahuioleh

Ketua Program Studi IlmuFaaldanKhasiatObat

DekanSekolahPascasarjana

ProfDrdrh.AgikSuprayogi,MScAgr

DrIrDahrulSyah, MScAgr

TanggalUjian:14 Agustus 2014

Tanggal Lulus:

PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian ini ialah Penghambatan Perkembangan Sel β Pankreas pada Tikusdari Induk Buntingyang Diberi Asam Valproat sebagai Hewan Model Diabetes Mellitus. Penelitiandanpenulisandisertasiinidisusungunamemenuhipersyaratanuntukm emperolehgelardoktorpadaSekolahPascasarjana IPB.Penelitiandanpenulisandisertasiinitidaklepasdaribimbingandandoronganberba gaipihak, terutamaKomisiPembimbing.UntukituucapanterimakasihdanhormatsayakepadaBa pak Dr. Ir. BambangKiranadi, M.Sc (KetuaKomisiPembimbing), Bapak Prof. WasmenManalu, M.Sc., PhD.,danDrh. AdiWinarto, PhD., PAVet (AnggotaKomisiPembimbing) atasdorongan, arahan,dankerjakerasnyadalammembimbingpenelitiandanpenulisandisertasiini. SayajugamengucapkanterimakasihkepadaDekanSekolahPascasarjana IPB, Sekretaris Program SekolahPascasarjana IPB, Dekan FKH IPB, danKetua Program StudiIlmuFaaldanKhasiatObat IPB atasizindankesempatan yang diberikankepadasayauntukdapatmenempuhstudiPascasarjana di Program StudiIlmuFaaldanKhasiatObat IPB. Ucapan terima kasih jugapenulis sampaikankepadakaryawandanpimpinanlaboratorium di FKH IPB, pimpinandanstafdosensertakaryawanFakultasFarmasidanSains UHAMKA atassegalakemudahan yang diberikanuntukmembantujalannyapenelitiansehinggadisertasiinidapatselesai.Ungk apan terima kasihdanpenghargaanpenulispersembahkanuntukayahanda, ibunda sertaistritercintadananak-anakku (Azzam,Hanif, (Alm),bapakdanibumertua Faras,danRizqi) atas dukungandandoa yang tiadahentiselamapenulismenempuhpendidikan di Pascasarjana IPB. Dengansegalakerendahanhati, penulismenyadarimasihbanyakkekurangandankelemahandalampenulisandisertasii ni.Olehkarenaitu, kritikdan saran yang membangunsangatdiharapkanuntukperbaikandanpenyempurnaandisertasiini.Harap anpenulis, semogakaryailmiahinidapatbermanfaatbagipengembanganilmupengetahuandanke maslahatanumat.Amin.

Bogor, Agustus 2014 HadiSunaryo

i

DAFTAR ISI DAFTAR ISI

i

DAFTAR GAMBAR

ii

DAFTAR TABEL

iii

DAFTAR LAMPIRAN

iii

BAB 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Perumusan Masalah Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian Ruang Lingkup Penelitian Kebaruan Penelitian (Novelty) Hipotesis

1 1 2 3 3 4 4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA Diabetes Mellitus Hewan Model Diabetes Anatomi dan Fisiologi Pankreas Perkembangan Pankreas pada Embrio Manusia 9 Perkembangan Pankreas pada Tikus Sel Endokrin Pankreas dan Kompartemen Sel Eksokrin Penentuan Sel Endokrin Pankreas Asam Valproat Inhibitor Histone Deacetylase

4 4 4 7 8 10 10 11 12 13

BAB 3 EFEK PEMBERIAN ASAM VALPROAT PADA INDUK TIKUS BUNTING (Rattus norvegicus L.) TERHADAP SEL ENDOKRIN PANKREAS ANAKAN TIKUS 15 Pendahuluan 16 Bahan dan Metode 17 Hasil 18 Pembahasan 19 Simpulan 20 BAB 4 PENGHAMBATAN PERKEMBANGAN SEL β PANKREAS ANAKAN TIKUS DARI INDUK YANG MENERIMA ASAM VALPROAT PADA KEBUNTINGAN PASCATRIMESTER SATU21 Pendahuluan 22 Bahan dan Metode 23 Hasil 24 Pembahasan 28 Simpulan 32

ii

BAB 5 PERKEMBANGAN ANAK TIKUS (F1) ASAL INDUK PENERIMA ASAM VALPROAT SEBAGAI MODEL DIABETES MELLITUS33 Pendahuluan Bahan dan Metode Hasil Pembahasan Simpulan

34 35 35 39 41

BAB 6 PEMBAHASAN UMUM

42

BAB 7 SIMPULAN DAN SARAN

47

DAFTAR PUSTAKA

48

RIWAYAT HIDUP

61

DAFTAR GAMBAR Penyebab Kerusakan Sel β pada Patogenesis DM Tipe 2 Anatomi Pankreas Rumus Bangun Asam Valproat Skema tahapan HDACs dalam perkembangan sel endokrin pankreas Gambaran Histologi Pulau Langerhans Pankreas Tikus F1 DenganPewarnaan HE dalam Satu Lapang Pandang 3.2 Gambaran Histologi Sel Pankreas Tikus F1 dengan Pewarnaan HE 4.1 Rata-rata kadar glukosa darah tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat 250 mg/kg BB 4.2 Hasil pewarnaan immunohistokimia sel endokrin pankreas positif insulin tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat 250 mg/kg bb per oral pada umur 8 minggu. 4.3 Rata-rata konsentrasi insulin darah tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat 250 mg/kg bb per oral 4.4 Hasil pewarnaan immunohistokimia sel endokrin pankreas tikus umur 16 minggu dengan Ab anti insulin dan Ab anti glukagon27 5.1 Rata-rata kadar glukosa darah tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat 250 mg/kg bb per oral pada minggu ke-8, ke-16 and ke-24. 5.2 Hasil pewarnaan immunohistokimia positif insulin sel endokrin pankreas tikus F1 yang induknya diberi asam valproat 5.3 Rata-rata konsentrasi insulin darah tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat 250 mg/kg BB per oral pada minggu ke-16 dan ke-24 5.4Rata-rata kadar trigliserida darah tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat 250 mg/kg BB per oral pada minggu ke-16 dan ke-24 6. Populasi pulau Langerhans pankreas tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat dengan perbesaran 4x 2.1 2.2 2.3 2.4 3.1

DAFTAR TABEL

7 9 12 14 18 19 24

25 26

36 37 38 38 57

iii

3.1 Rerata Jumlah Pulau Langerhans Dalam Satu Lapang Pandang 3.2 Rerata Jumlah Sel Endokrin Pankreas Tikus F1 yang Induknya Diberi Asam Valproat Dosis 250 mg/kg BB 4.1 Data perkembangan sel endokrin serta kadar glukosa dan insulin darah anak tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat

18

31

DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4 5 6 7

Skema Kerja Penelitian Kadar Glukosa Darah Tikus F1 Umur 8 Minggu Kurva Standart Konsentrasi Insulin Data Parameter Darah Tikus (F1) Umur 16minggu Data Parameter Darah Tikus (F1) Umur 24minggu Jumlah pulau Langerhans dalam lapangpandang perbesaran 4x Populasi pulau Langerhans pankreas tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat 8 Protokol Penelitian 9 Riwayat Hidup

51 52 53 54 55 56 57 58 61

BAB 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Peningkatan kemakmuran dan perubahan gaya hidup di suatu negara, menyebabkan peningkatan prevalensi penyakit degeneratif, seperti penyakit jantung koroner (PJK), hipertensi, hiperlipidemia, diabetes dan lain-lain. Penelitian epidemiologi di Indonesia menunjukkan dari jumlah penduduk 200 juta orang, penderita diabetes melitus berkisar 1,4% hingga 1,6%. Pada tahun 1994 sekitar 2 sampai 5 juta orang Indonesia menderita diabetes mellitus (DM), 4 juta orang pada tahun 2000 dan 5 juta orang pada tahun 2010. Berdasarkan prevalensi sekitar 1,5% tersebut, maka di tahun 2020 pada saat peningkatan penduduk sebesar 40%, jumlah pasien diabetes akan meningkat sebesar 86% hingga 138% (Soegondoet al.2002). Kejadian diabetes mellitus pada saat ini banyak dimulai pada usia dewasa dan biasanya ada faktor genetik yang memperkuat dan kondisi ini diawali dengan resistensi insulin yang kemudian akan diikuti oleh penurunan jumlah sel β sehingga sekresi insulin tidak dapat memenuhi kebutuhan. Meskipun upaya penelitian dalam satu dekadedilakukan intensif, dasar genetik dalam peristiwa patogenesisdiabetesmasih kurang dipahami. Untuk melakukan penelitian dan pengembangan obat antidiabetes diperlukan hewan model yang sesuai dengan kondisi diabetes yang ada. Hewan model diabetes ada 2 kategori yaitu tipe diabetes karena genetik dan tipe diabetes karena dapatan yang diperoleh dengan induksi diabetagon seperti aloksan ataupun streptozotocin (Szkudelski2001; Nugroho 2006). Untuk model yang diperoleh dari seleksi perkawinan dan rekayasa genetik tingkat keberhasilan kurang dari 50% dan memerlukan waktu lama serta biaya yang sangat mahal. Sementara itu, untuk model yang diperoleh dengan induksi diabetagon, kondisi kerusakan sel pada pankreas ada yang bersifat reversibel dan ada yang kerusakannya permanen, serta menimbulkan kerusakan sel pankreas yang sangat parah sehingga tidak dapat menggambarkan kejadian diabetes yang diinginkan, karena tidak dihasilkan lagi insulin atau jumlahnya sangat kurang yang lebih identik dengan diabetes tipe 1 (Rees dan Alcolado2005). Pemberian beberapa obat atau senyawa kimia tertentu pada induk bunting akan berpengaruhpada perkembangan embrio. Kelainan atau anomali organ pada fetus dapat ditemukan seperti jantung tidak bersekat dengan sempurna, hambatan perkembangan sistem saraf pusat, rudimenter organ dan lain-lain. Hal ini dapat terjadi karena kemungkinan faktor luar berpengaruh pada proses proliferasi atau differensiasi sel selama masa perkembangan embrio. Obat yang dipakai dalam penelitian ini adalah asam valproat yang merupakan obat antiepilepsi dan antikanker yang berpotensi menghambat histone deacetylase(Christensenet al. 2011). Pemberian asam valproat kepada induk di beberapa titik di dalam periode perkembangan pankreas embrio diharapkan mendapatkan informasi lebih dalam tentang kemungkinan terjadinya penghambatan perkembangan organ pankreas.

2 Berdasarkan kriteria keamanan obat bagi ibu hamil yang dilansir oleh FDA (Food and Drug Administration) asam valproat termasuk obat kategori C, yaitu golongan obat yang pada studi terhadap sistem reproduksi hewan percobaan menunjukkan adanya efek samping bagi janin. Sementara itu, pada wanita hamil belum ada studi terkontrol. Obat golongan ini hanya dapat dipergunakan jika manfaatnya lebih besar ketimbang risiko yang mungkin terjadi pada janin. Asam valproat mempunyai dampak untuk menghambat histone deacetylase (HDAC inhibitor) pada masa embrional. Pada sel kultur asam valproat menyebabkan hiperasetilasi histon. Secara in vitro asam valproat menghambat aktivitas HDAC dengan mengikat pusat katalisis dari HDACs.Akibatnya asam valproat menekan differensiasi sel (Gottlicher et al. 2001). Pada stem cell pada hari ke-9 pemberian asam valproat menyebabkan terjadinya hambatan differensiasi sel pankreas (Jorgensen et al. 2007). Pankreas tikus terbentuk pada masa organogenesis dari embrionik hari ke-8.5 sampai ke-14.5, pada periode ini jenis sel pankreas dapat ditentukan dan memiliki pola produk gen berdasarkan DNA dan RNA yang terbentuk untuk sel endokrin pankreas, sel eksokrin, dan faktor transkripsi. Aktivitas enzim eksokrin dan hormon endokrin selama pengembangan pankreas menyebabkan peristiwa transisi regulasi. Pada tikus embrionik hari ke-9.5 sampai ke-11.5terjadi transisi primer terkait dengan penentuan organ dan konversi sel predifferensiasi ke kondisi protodifferensiasi dilihat dari protein tingkat rendah pankreas yang muncul. Transisi sekunder pada tikus embrionik hari ke14.5 sampai ke-19.5 adalah konversi dari jaringan protodifferensia yakni sel dibedakan dengan peningkatan ukuran dalam pankreas, khususnya sintesis protein dan hilangnya kapasitas proliferasi. Transisi ketiga terjadi setelah kelahiran, yangmenunjukkan adaptasi untuk sintesis bergantungpada penyerapan makanan dan sekresi protein pankreas yang spesifik (Jorgensen et al. 2007). Penelitian ini dimaksudkan untuk melihat pengaruh asam valproat yang diberikan kepada induk tikus bunting pada perkembangan organ tikus F1 setelah dilahirkan. Diharapkan selama organogenesis pemberian asam valproat dapat mempengaruhi perkembangan sel endokrin. Berdasarkan periode masa pembentukan organ pankreas embrio, pemberian asam valproat pada induk kemungkinanbesardapat menyebabkan gangguan pertumbuhan pankreas, termasuk kerusakan pada sel β pankreas tikus (Hogan et al.1994). Oleh karena itu, perlu diteliti kemungkinan penghambatan sel β pankreas pada F1 setelah lahir. Perumusan Masalah Upaya untuk pencegahan yang lebih efektif pada penderita diabetes mellitus harus diawali dengan adanya hewan model yang sesuai dengan kondisi penderita diabetes mellitus. Saat ini, hewan model yang ada biasanya diinduksi dengan menggunakan diabetagon aloxan atau streptozotocin. Kondisi hewan model ini lebih mendekati diabetes tipe 1 dilihat dari kondisi kerusakan pankreas yang menyebabkan tidak dihasilkan lagi insulin atau jumlahnya sangat kurang. Saat ini yang banyak terjadi adalah diabetes tipe 2 yang baru terdiagnosa pada penderita di atas 40 tahun dan biasanya ada faktor genetik yang memperkuat. Kondisi diabetes tipe 2 biasanya diawali dengan resistensi insulin, kemudian akan diikuti kurangnya jumlah sekresi insulin. Hewan model yang sesuai dengan kondisi diabetes tipe 2 masih dibutuhkan,

3 sehingga penelitian pembuatan hewan model perlu dilakukan untuk mendapatkan hewan model diabetes yang sesuai dengan kondisi diabetes tipe 2. Pembentukan pankreas terjadi pada masa embrional yang bila dipengaruhi akan memungkinkan terjadinya penghambatan perkembangan pankreas, sehingga pada saat setelah dilahirkan nanti akan menghasilkan hewan model yang lebih sesuai dengan kondisi diabetes tipe 2 dan tidak perlu dilakukan induksi lagi dengan diabetagon. Kerusakan sel β pankreas dapat terjadi saat dimulainya organogenesis saat fetus mengalami perkembangan di rahim, bersamaan dengan perkembangan neuronal tube sebagai awal perkembangan sel saraf (Kuwabara et al. 2011). Organogenesis pankreas bergantung pada interaksi pensignalan dengan jaringan di sekelilingnya. Inisiasi pertumbuhan organ dan akibat ekspresi marker molekuler pada tahap awal pertumbuhan pankreas selama embriogenesis tikus terjadi mulai dari embrionik hari ke-8,5 sampai hari ke-14,5. Perkembangan saluran cerna ventral, termasuk hati dan pankreas bergantung pada ekspresi endodermal dari homeobox gene Hhex yang mengarahkan proliferasi dari endoderm ventral dan kontrol transisi morfogenetik dari sel endodermal epithelial (Jorgensen et al. 2007). Tujuan Penelitian Tujuan Umum Mendapatkan hewan model diabetes yang mengekspresikan gejala klinis dan patofisilogi diabetes mellitus tipe 2.

Tujuan Khusus Tujuan khusus penelitian ini adalah : 1. Mengetahui penghambatan perkembangan sel endokrin pankreas dan pulau Langerhan tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat pada akhir masa kebuntingan. 2. Mengevaluasi perkembangan sel β pankreas dari induk yang diberi asam valproat pada umur kebuntingan yang berbeda. 3. Mengevaluasi peluang tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat pada hari tertentu kebuntingan sebagai hewan model diabetes mellitus tipe 2.

Manfaat Penelitian 1. Keberhasilan pengembangan tikus model diabetus mellitus tipe 2 membuka peluang untuk melakukan penelitian dalam pencegahan kejadian diabetus mellitus tipe 2. 2. Pengembangan obat pancreatic endocrine cells protector

4

Ruang Lingkup Penelitian Penelitian yang dilakukan adalah pembuatan hewan model diabetes dengan pemberian asam valproat pada induk tikus bunting waktu tertentu sehingga dihasilkan anak tikus (F1) sebagai hewan model diabetes yang lebih sesuai dengan kondisi diabetes saat ini. Pengamatan dilakukan pada anak tikus (F1) dengan parameter kadar glukosa darah, kadar insulin darah dan trigliserida darah serta pengamatan histologi jaringan pankreas untuk melihat perkembangan sel beta dan sel alfa dengan teknik immunohistokimia. Kebaruan Penelitian (Novelty) 1. Ketersediaan Hewan model diabetes mellitus dengan patofisiologi kejadian diabetes mellitus dengan pendekatan epigenetik. 2. Metoda pengembangan tikus model dengan menggunakan teratogenic substance Hipotesis Pemberian Asam valproat pada induk tikus bunting akan menghambat perkembangan sel endokrin pankreas khususnya sel β tikus F1, jika diberikan pada masa kebuntingan pasca-trimester pertama sehingga dapat dikembangkan menjadi hewan model diabetes.

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA Diabetes Mellitus Diabetes Mellitus adalah gangguan metabolik kompleks yang ditandai oleh hiperglikemi (peningkatan kadar glukosa darah) yang disebabkan oleh berkurangnya sekresi insulin, aksi insulin atau keduanya. Dua tipe utama diabetes adalah tipe 1 (insulin-dependent diabetes/IDDM), dan tipe 2 (noninsulin-dependent diabetes/NIDDM). Tipe 1 disebabkan oleh autoimmun yang merusak insulin yang diproduksi oleh sel β pankreas, sedangkan diabetes tipe 2 dapat disebabkan oleh dua hal, yaitu penurunan sekresi insulin dan resistensi aksi insulin. Diabetes diasosiasikan dengan kematian prematur, yang dominan disebabkan karena penyakit aterosklerosis pembuluh darah. Komplikasi mikrovaskuler, yang dapat terlihat pada pembuluh kapiler pada mata, ginjal, dan saraf, sehingga dapat menyebabkan kematian (Holt dan Hanley2009). Sel hidup memerlukan sumber bahan bakar yang konstan. Dari bahan bakar tersebut akan didapat Adenosin Triphosphate (ATP) yang digunakan untuk mempertahankan fungsi dan pertumbuhan sel normal. Oleh karena itu, harus tercapai keseimbangan antara asupan karbohidrat, lemak, dan protein.Penyimpanan bahan-

5 bahan tersebut apabila terdapat dalam jumlah yang melebihi kebutuhan segera dimobilisasi, dan apabila dibutuhkan bahan-bahan tersebut disintesis. Keseimbangan antara kebutuhan dan ketersediaan disebut sebagai homeostasis metabolik. Terdapat tiga cara utama yang diperlukan untuk integrasi antarjaringan agar homeostasis metabolik dapat tercapai. Pertama, konsentrasi zat gizi atau metabolit dalam darah mempengaruhi kecepatan penggunaan dan penyimpanan zat-zat tersebut dalam jaringan yang berbeda. Kedua, hormon membawa pesan untuk masing-masing jaringan mengenai status fisiologis tubuh dan pasokan atau kebutuhan gizi. Ketiga, sistem saraf pusat menggunakan sinyal saraf untuk mengontrol metabolisme jaringan, secara langsung atau melalui pelepasan hormon (Marks et al.2000). Insulin adalah hormon anabolik utama yang mendorong penyimpanan zat gizi, penyimpanan glukosa sebagai glikogen di hati dan otot, perubahan glukosa menjadi triasilgliserol di hati dan penyimpanan di jaringan adiposa, serta penyerapan asam amino dan sintesis protein di otot rangka. Hormon ini juga meningkatkan sintesis albumin dan protein darah lainnya oleh hati. Insulin meningkatkan penggunaan glukosa sebagai bahan bakar dengan merangsang transpor glukosa ke dalam otot dan jaringan adiposa. Insulin bekerja menghambat mobilisasi bahan bakar pada saat yang sama. Pelepasan insulin ditentukan terutama oleh kadar glukosa darah, dan kadar tertinggi insulin terjadi sekitar 30-45 menit setelah makan makanan tinggi karbohidrat. Kadar insulin kembali ke tingkat basal seiring dengan penurunan kadar glukosa darah, sekitar 120 menit setelah makan (Marks et al.2000). Sejumlah faktor di luar konsentrasi glukosa darah dapat mengatur pelepasan insulin. Sekresi insulin ditingkatkan oleh asam amino, rangsangan saraf, dan hormon saluran cerna,sedangkan yang menurunkan sekresi insulin ialah hormon epinefrin. Pulau Langerhans pankreas diinervasi oleh sistem saraf autonom, termasuk cabang nervus vagus, yang membantu mengkoordinasikan pelepasan insulin dengan tindakan makan. Namun, sinyal dari sistem saraf pusat tidak diperlukan untuk sekresi insulin. Asam amino tertentu juga dapat merangsang sekresi insulin, walaupun jumlah insulin yang dilepaskan setelah makan makanan tinggi protein sangat jauh lebih rendah daripada setelah makan makanan tinggi karbohidrat. Polipeptida penghambat lambung, suatu hormon pada saluran pencernaan yang dilepaskan setelah masuknya makanan juga berperan menentukan awal pelepasan insulin. Epinefrin yang disekresikan sebagai respons terhadap puasa, stres, trauma, dan olahraga berat, menurunkan pelepasan insulin. ( Markset al.2000) Klasifikasi diabetes menurut WHO adalah sebagai berikut : 1. Diabetes tipe 1 (IDDM) Autoimun yang disebabkan karena peradangan sel β insulitis, menyebabkan timbulnya antibodi terhadap sel β yang disebutIslet Cell Antibody (ICA) sehingga menyebabkan hancurnya sel β. Penyebabnya diantaranya virus cocksakie, rubella,CMVdan herpes. 2. Diabetes tipe 2 Disebabkan karena interaksi antara predisposisi genetik dan faktor lingkungan yang menyebabkan defisiensi insulin dan resistensi insulin atau gabungan keduanya. 3. Diabetes tipe 3 (Secondary diabetes) Disebabkan karena gangguan endokrin, pankreatitis dan obat-obat tertentu. 4. Diabetes tipe 4 (Gestasional diabetes)

6 Penderita diabetes tipe 1, sel β pankreas mengalami kerusakan sehingga tidak mampu menghasilkan insulin yang diperlukan. Pada diabetes tipe 2 insulin dihasilkan, tapi tidak bekerja maksimal bisa disebabkan karena kerusakan sel β pankreas sehingga tidak mampu mensintesis insulin sesuai kebutuhan atau sekresi insulinnya yang terganggu (Holt dan Hanley2009). Menurut Holt dan Hanley (2009) diabetes mellitus dapat disebabkan oleh faktorfaktor sebagai berikut : a. Keturunan (genetik) Faktor genetik/keturunan biasanya memegang peranan penting pada mayoritas penderita diabetes melitus. b. Obesitas Kegemukan pada seseorang pada umumnya dapat menyebabkan gangguan kerja insulin, menjadi faktor risiko yang lazim bagi diabetes melitus tipe II. Obesitas berkaitan dengan resistensi insulin, menyebabkan kemungkinan gangguan toleransi glukosa dan diabetes melitus yang pada akhirnya terjadi pada pasien diabetes melitus tipe II sebagai akibat dari obesitasnya. c. Faktor lingkungan Faktor lingkungan yang menyebabkan tercetusnya diabetes melitus adalah gaya hidup kebarat-baratan, seperti restoran siap saji dan penghasilan per-kapita tinggi. d. Faktor demografi Kenaikan jumlah penderita diabetes melitus, salah satunya dipengaruhi oleh faktor demografi, yaitu jumlah penduduk meningkat, penduduk berumur di atas 40 tahun meningkat, dan adanya urbanisasi. e. Berkurangnya penyakit infeksi dan kurang gizi Berkurangnya penyakit infeksi dan kurang gizi diduga ada hubungannya dengan cara hidup yang berubah sesuai dengan bertambahnya kemakmuran yang tercermin dalam pendapatan per-kapita Indonesia sehingga menyebabkan peningkatan penyakit menahun, antara lain diabetes mellitus. f. Infeksi virus Faktor ekstrinsik yang mempengaruhi fungsi sel ß pankreas termasuk kerusakan yang disebabkan oleh virus seperti virus penyebab penyakit gondongan dan coxsackievirus B4, oleh zat kimia toksik atau oleh sitotoksin pengrusak dan pelepasan antibodi dari imunosit sensitasi.

7

Gambar 2.1 Penyebab Kerusakan Sel β pada Patogenesis DM Tipe 2 (Sumber : Holt dan Hanley 2009).

Hewan Model Diabetes Diabetes mellitus tipe 2 merupakan kelompok penyakit dengan karakteristik terjadinya resistensi insulin dan gangguan sel β Langerhans pankreas dalam mensekresi insulin. Hewan uji DM tipe 2 dapat dibuat dengan beberapa cara, yaitu: pemberian nutrisi yang dapat menstimulasi resistensi insulin, pankreatektomi parsial, pemberian senyawa diabetogenik, ataupun secara genetik. Perlakuan tersebut mengakibatkan terjadinya (1) penurunan respons jaringan perifer terhadap aksi insulin atau malfungsi reseptor insulin, (2) penurunan kemampuan sel β Langerhans pankreas dalam mensekresikan insulin. Kedua hal tersebut mengakibatkan peningkatan kadar glukosa darah seperti pada kondisi DM tipe 2. Contoh hewan uji DM tipe 2 adalah tikus Ob/Ob (defisiensi leptin), tikus db/db (defisiensi leptin), tikus Zucker (fa/fa) obese, tikus Diabetic Torri, tikus gurun obese, mencit tipe C57 BKs db, mencit tipe C57 BL ob, mencit tipe KK dan KKay, tikus tipe Goto-Kakizaki (GK), tikus Nagoya– Shibata–Yasuda (NSY) dan Psammomomys gerbils. Pemberian makanan kaya akan fruktosa pada tikus selama lebih dari 2 bulan akan menginduksi resistensi insulin. Dengan diabetogenik, pemberian senyawa toksik streptozotosin dosis 90 mg/kg BB secara i.p pada tikus neonatal akan menginduksi DM tipe 2 pada usia 6 minggu atau lebih(Nugroho 2006). Kompensasi obesitas maupun resistensi insulin merupakan tanda-tanda yang dapat mengarah pada kondisi DM tipe 2. Sekresi insulin normal bahkan cenderung meningkat (hiperinsulinemia) pada kondisi tersebut. Kondisi tersebut mengakibatkan desensitisasi reseptor insulin pada tahap postreseptor lebih lanjut mengakibatkan terjadinya resistensi insulin. Tikus Ob/Ob dan tikus Zucker (fa/fa) obese merupakan contoh untuk percobaan dengan kondisi di atas.Pada tikus db/db dan tikus Psammomomys gerbils, kondisi obesitas berkembang secara cepat, disertai

8 denganhiperglikemia sehingga mengakibatkan sel β pankreas dalam mensekresi insulin tidak dapat menangani kondisi hiperglikemia tersebut. Tikus tipe Goto-Kakizaki (GK), pada kondisi tikus dewasa diperoleh hiperglikemia yang stabil karena berkurangnya sekresi insulin dan juga resistensi insulin. Pada beberapa tikus setelah lahir, mempunyai jumlah pulau Langerhans yang kurang. Beberapa komplikasi yang mirip pada manusia juga dijumpai pada tikus GK dewasa antara lain: terjadi lesi pada ginjal, perubahan struktur saraf perifer, dan abnormalitas retina mata. Mirip dengan tikus GK, tikus Otsuka Long-Evans Tokushima fatty (OLETF) juga mengalami kondisi resistensi,tetapi kondisinya lebih ringan (toleransi glukosa). Kondisi seperti ini cocok untuk percobaan uji aktivitas obat dalam mencegah kondisi diabetes pada tahap toleransi glukosa(Nugroho 2006). Berdasarkan cara pembuatannya, hewan percobaan diabetes mellitus dibedakan menjadi dua yaitu : (1) terinduksi (induced), misalnya melalui pankreaktomi, senyawa kimia (diabetogenik), dan virus; (2) spontan (spontaneous), misalnya menggunakan tikus BB (bio breeding) atau mencit NOD (non-obese diabetic). Spontaneous animal models mempunyai karakteristik yang relatif sama dengan kondisi diabetes mellitus pada manusia meliputi gejala-gejala penyakit, imunologi, genetik maupun karakteristik klinik lainnya (Nugroho 2006). Hewan model yang diinduksi dengan diabetogenik umumnya menggunakan aloksan atau streptozotocin untuk merusak sel β pankreas. Aloksan digunakan untuk hewan model diabetes tipe 1 (IDDM) dengan dosis 65 mg/kg BB tikus secara intravena, atau 150 mg/kg BB tikus secara intraperitoneal. Streptozotocin (STZ) digunakan untuk menginduksi diabetes tipe 1 (IDDM) dengan dosis 40-60 mg/kg BB tikus secara intraperitoneal. STZ juga digunakan untuk induksi diabetes tipe 2 (NIDDM) dengan dosis 100 mg/kg BB tikus pada tikus neonatal, dan ditunggu pada minggu ke 8-10 setelah diberi STZ akan terjadi hiperglikemia, gangguan respons pada test toleransi glukosa dan hilangnya sensitivitas sel β terhadap glukosa(Szkudelski 2001). Anatomi dan Fisiologi Pankreas Pankreas merupakan organ panjang dan besar, membentang pada dinding abdomen di belakang lambung, panjangnya 12–15 cm dan berwarna merah muda keabuan. Kepala kelenjar berada di dalam duodenum dan ekornya memanjang sejauh limpa, badan pankreas berada diantara keduanya. Pankreas terdiri atas dua jaringan utama, yaitu acini terdiri dari 98% sel-sel dengan sekresi eksteren, yang memproduksi enzim-enzim cerna yang disalurkan ke duodenum dan pulau Langerhans dengan sekresi interen, yakni hormon-hormon (insulin dan glukagon) yang disalurkan langsung ke aliran darah(Evelyn 2006). Pankreas berfungsi sebagai kelenjar eksokrin dan endokrin. Fungsi eksokrin pankreas berkaitan dengan sintesis dan pengeluaran enzim-enzim pencernaan dan larutan natrium bikarbonat dari sel-sel khusus pankreas yang disebut sel asinus. Enzim-enzim yang dihasilkan pankreas antara lain tripsin yang bertanggungjawab untuk mencerna protein menjadi asam amino, amilase yang mengubah karbohidrat menjadi bentuk gula sederhana serta lipase yang bertanggungjawab untuk memecah lemak menjadi asam lemak. Enzim pankreatik dan larutan natrium bikarbonat berperan dalam proses pencernaan dan penyerapan makanan di usus halus(Corwin 2009).

9 Endokrin pankreas pada orang dewasa kira-kira terdiri dari 1 juta pulau Langerhans yang tersebar di seluruh kelenjar pankreas. Pulau Langerhans pankreas merupakan gabungan sel dengan diameter 75–500 µm (Katzung 2002). Walaupun pulau Langerhans mempunyai berat hanya 1–1,5 g dari jaringan pankreas tetapi sekresi endokrinnya mempunyai efek metabolik yang menonjol dan sangat diperlukan untuk kehidupan. Di dalam pulau Langerhans terdapat empat sel utama yaitu sel alfa (α) yang menghasilkan glukagon, sel beta (β) yang menghasilkan insulin, sel delta (δ) yang menghasilkan somatostatin dan sel PP yang menghasilkan Polipeptida pankreas(Underwood 1999).

Gambar 2.2. Gambar anatomi pankreas. ( Sumber : Agur, Anne M.R. dan Arthur FD. Grant’s Atlas Anatomy 12th ed.Wolters Kluwer. Canada.2009. Hlm 135)

Perkembangan Pankreas pada Embrio Manusia Pertumbuhan kraniokaudal juga berperan penting pada perkembangan saluran cerna,. Kedudukan lambung akan turun pada hari ke-41 dan pada hari ke-50 mencapai letak yang definitif. Terjadi pergeseran lekukan duodenum yang berbentuk huruf C ke arah retroperitoneal, pada saat yang sama lambung makin bergeser ke arah kiri dengan bagian pylorus pada posisi horizontal. Dari bagian duodenum yang menurun dan terletak di sebelah kanan columna vertebralis, muncul kedua kelenjar besar di perut bagian atas, yaitu hati dan pankreas. Pankreas eksokrin terbentuk dari dua cikal bakal, satu di ventral dan satu di dorsal. Pertama-tama terbentuk tunas dorsal pada dinding duodenum (kira-kira pada hari ke-26), yang membentuk sebagian besar badan (corpus) pankreas dan bergeser

10 secara horizontal pada dinding perut dorsal sampai ke limpa. Tidak lama setelah itu (hari ke-28), muncul lagi bakal pankreas ventral, yang menonjol dari dinding duodenum sedikit di bawah ventrikel hati dan ductus biliaris. Karena laju pertumbuhan yang tidak sama di sekeliling dinding usus, bakal ventral bergeser ke arah dorsal dan medial dengan ductus pancreaticus yang kelak bersatu menjadi ductus choledocus bersama ductus biliaris. Akhirnya kedua bakal pankreas menyatu sepenuhnya. Hanya sistem ductus pankreaticus yang masih menandakan asal-usul yang berbeda dari kedua bakal pankreas. Bakal ventral pankreas membentuk bagian belakang processus uncinatus dan bagian akhir ductus pancreaticus, sedangkan bakal dorsal membentuk bagian depan caput pancreatic, corpus dan cauda pancreatic beserta bagian utama sistem ductus pancreaticus. Ductus pancreaticus accessorius yang tidak selalu ada berasal dari bakal pankreas dorsal. Sel-sel tumbuh dari epitel ductus pancreaticuspada minggu ke-9, yang mengambil alih fungsi endokrin dan berdiferensiasi lebih lanjut menjadi pulau-pulau Langerhans. Ketika jaringan pankreas eksokrin pada masa janin tidak mempunyai arti fungsional, organ pulau Langerhans sudah lebih dahulu membentuk hormon. Pada pankreas janin, massa pulau-pulau Langerhans membentuk hampir 5% dari keseluruhan jaringan pankreas (pada orang dewasa 1,5%) dan terutama terdiri atas sel β penghasil insulin. Kenyataan ini menunjukkan bahwa insulin dan hormon-hormon terkait (contohnya somatomedin I dan II) memegang peranan pada proses pertumbuhan. Dengan demikian pankreas bersama-sama dengan hati merupakan organ fungsional yang penting untuk metabolisme embrio (Rohen 2003). Perkembangan Pankreas pada Tikus Pankreas tikus terbentuk pada tahap awal perkembangan pankreas selama embriogenesis pada masa organogenesis dari hari embrio e8.5-e14.5, di mana semua jenis sel pankreas menjadi ditentukan dan memiliki pola produk gen hormon endokrin pankreas, produk gen eksokrin, dan faktor transkripsi yang sangat penting. A. Selendokrinpankreas dankompartemen sel eksokrin Pankreas adalah organ bifungsional terdiri dari jaringan eksokrin dan sel endokrin.Jaringan eksokrin terorganisir dalam asinus yang mengeluarkan zymogens untuk tujuan pencernaan. Saluran sel pankreas ini mendukung fungsi eksokrin karena mengeluarkan bikarbonat untuk netralisasi asam lambung di duodenum. Pulau langerhans ditempati oleh jenis sel endokrin terdiri dari berberapa macamsel endokrin (Jorgensen et al. 2007). Selama perkembanganpankreas pada embrio tikusterjadi peristiwa transisi regulasi.Transisi primer adalah penentuan organ terjadi konversi sel predifferensiasi menjadi protodifferensiasi pada e8.5 – e10.5ditandai dengan munculnya protein tingkat rendah pankreas.Transisi sekunder adalah konversi dari protodifferensia ke sel pada e13.5-e16.5 ditandai dengan peningkatan ukuran sel pankreas yang mensintesis protein dan hilangnya kapasitas proliferasi.Transisi ketiga terjadi setelah kelahiran dan menunjukkan adaptasi untuk sintesis diatur dengan adanya penyerapan makanan dan sekresi protein pankreas yang spesifik(Jorgensen et al. 2007).

11 Jaringan pankreas berkembang pesat dari struktur kompak sel padat dan tumbuh beberapa kali lipat pada e10.5, membentuk struktur bercabang yang jelas dalam beberapa hari.Secara bersamaan, pola proses epitel Pdx1 dan Nkx6-1 mulai menyimpang, dan sel muncul di pinggiran yang mengekspresikan Pdx1 tetapi tidak Nkx6-1. Pola tersebut menjadi lebih jelas pada e13.5, dan e14.5 Pdx1 membentuk asinus, sedangkan Nkx6-1 menjadi terbatas pada bagian tengah dari epitel,dan di e12.5 usus telah dirotasi dan dua bagian dasar pankreas telah menyatu menjadi satu organ yang saling berhubungan (Jorgensen et al. 2007).. Bagian endokrin pankreas terdiri dari lima jenis sel yang berbeda, masingmasing ditandai dengan proses yang khas dari salah satu hormon peptida spesifik: glukagon dalam sel α, insulin dalam sel β, somatostatin dalam sel δ, polipeptida pankreas dalam sel PP, atau ghrelin dalam sel ε. Untuk mensintesis sel yang menghasilkan glukagon dan insulin pada e9.5, untuk somatostatin pada e13.5, dan untuk ghrelin dan PPy pada e10.5 (Jorgensen et al. 2007). Sel-sel asinar dari karboksipeptidase pankreas memproduksi amilase, kimotripsin, tripsin, ribonuklease, dan lipase yaitu enzim pencernaan yang bertanggung jawab atas degradasi hidrolitik karbohidrat, asam nukleat, protein, dan asam lemak dalam saluran pencernaan. Karboksipeptidase A (CPA) dan elastase dianggap penanda eksokrin awal, sedangkan amilase adalah penandaan produk eksokrin pankreas dari e14.5 pada tikus yang merupakan dasar dalam transisi sekunder(Jorgensen et al. 2007). B. Penentuan sel endokrin pankreas Pembentukan sel αterjadi pada e8.75, kemampuan untuk membentuk sel α relatifmenjadi sangat berkurang setelah e14.5.Kontribusi yang signifikan terhadap jumlah akhir sel α berkembang antara e14.5 sampai e16.5 karena merupakan waktu puncak berkembangnya jumlah sel endokrin pankreas tikus (Jorgensen et al. 2007). Faktor Pax4 dan Arx diidentifikasi sebagai pengatur sifat sel endokrin pankreas. Kehilangan salah satu dari gen atau hilangnya kedua gen tersebut pada tikus tidak berpengaruh terhadap jumlah sel endokrin melainkan mempengaruhi distribusi tipe sel endokrin. Pax4 dan Arxdapat dideteksi dalam pankreas tikus pada awal e9.5 oleh mRNA dalam hibridisasi in situ.Sebagian besar Pax4 pada e18.5 mengaktifkan hormon insulin, dan sebagian mengekspresikan glukagon.Selama embriogenesis, kekurangan Pax4 menyebabkan kehilangan dari sel β dan sel δ.Arx menjadi terbentuk terbatas pada pulau langerhans pada e12.5.Kekurangan Arx menunjukkan peningkatan jumlah sel β pada e15.5 serta peningkatan sel δ pada e18.5 (Jorgensen et al. 2007). Analisis tentang sel endokrinpankreas pada tikus Pax4/Arx homozigot ganda menunjukkan bahwa kehilangan yang simultan dari kedua gen dapat menyebabkan penurunan onset awal sel α dan sel β.Sel α dan sel β diganti dengan sel δ. Pax4 mendukung pembentukan area prekursor sel β dan sel δ dan diperlukan secara khusus untuk pengembangan dari prekursor sel β.PPY mengaktifkan jumlah sel yang normal dalam embrio, tetapi setelah lahir induksi PPY terjadi pada cadangan sel δ sebagai respon terhadap pemberian makanan (Jorgensen et al. 2007).

Asam Valproat

12 Asam valproat (asam n-dipropilasetat) merupakan asam karboksilat sederhana yang memiliki rantai cabang, dengan rumus bangun :

Gambar 2.3Rumusbangun asam valproat (asam n-dipropilasetat) (Sumber :Gilman 2008) Asam valproattidak berwarna sampai kuning muda, agak kental, cairan jernih dengan bau khas dan larut dalam air kristal, sangat hidroskopis dengan rasa garam, larut dalam air dan larut dalam alkohol, pKa = 4,8(Gilman 2008). Farmakokinetik (Katzung 2008) 1. Absorpsi Asam valproat diabsorpsi dengan cepat setelah pemberian oral dengan bioavailabilitas ≥ 80%. Kadar darah maksimal teramati dalam waktu 1-3 jam,dengan masa paruh 8-10 jam, kadar darah stabil setelah 48 jam terapi. Absorpsi asam valproat lebih lambat beberapa jam, jika obat tersebut diberikan dalam bentuk tablet salut enterik atau diberikan bersamaan waktu makan. 2. Distribusi Volume distribusi asam valproat sekitar 0,2 liter/kg. Jumlah yang terikat pada protein plasma biasanya 90%, tetapi bagian yang terikat berkurang jika konsentrasi total asam valproat ditingkatkan di atas rentang terapeutiknya. 3. Biotransformasi–Metabolisme Asam valproat sebagian besar (95%) mengalami metabolisme di hati. Metabolismenya di hati terjadi terutama oleh β-oksidasi. Asam valproat merupakan substrat bagi CYP2C9 dan CYP2C19, tetapi metabolisme oleh enzim memberikan eliminasi yang relatif kecil. Waktu paruh asam valproat sekitar 15 jam. 4. Ekskresi Rata-rata 20% dari obat asam valproat diekskresikan melalui urin dalam waktu 24 jam. Farmakodinamik(Katzung 2002) Asam valproat menghambat bangkitan berulang frekuensi tinggi dari saraf kultur yang sesuai dengan kadar obat untuk terapi. Kerja obat ini terhadap kejang parsial disebabkan oleh efeknya terhadap arus Na+. Beberapa penelitian menunjukkan adanya peningkatan kadar GABA di dalam otak setelah pemberian asam valproat, meskipun mekanismenya belum jelas. Salah satu efek dari asam valproat dengan

13 membantu dekarboksilase asam glutamat, suatu enzim yang berperan dalam mensintesis GABA (gamma-aminobutyric acid). Asam valproat pada konsentrasi sangat tinggi menghambat GABA-T dalam otak, sehingga meningkatkan kadar GABA dengan menghambat konversi GABA menjadi suksinik semi aldehid.Asam valproate pada dosis yang relatif rendah untuk menghilangkan kejang pentilenatetrazol, kadar GABA dalam otak tetap tidak berubah. Asam valproat menghasilkan reduksi pada kadar aspartat di dalam otak hewan pengerat. Asam valproat pada konsentrasi tinggi, dapat meningkatkan daya hantar kalium membran.Pada konsentrasi rendah akan menimbulkan hiperpolarisasi neuron. Penemuan ini menimbulkan spekulasi bahwa asam valproat bekerja langsung pada saluran kalium membran. Asam valproat bekerja dengan spektrum luas melalui beberapa mekanisme molekuler. Penggunaan Terapeutik Asam valproat efektif dalam penanganan absens epilepsi, epilepsi mioklonik, epilepsi parsial dan epilepsi tonik-klonik. Dosis awal biasanya 15 mg/kg BB, dan ditingkatkan tiap interval seminggu 5-10 mg/kg BB sehari sampai dosis maksimum 60 mg/kg BB. Dosis terbagi harus diberikan jika dosis total sehari melebihi 250 mg/kg BB (Goodman dan Gilman 2008).

Inhibitor Histone Deacetylase Inhibitor Histone Deacetylase (HDAC inhibitor) adalah golongan senyawa yang mengganggu fungsi deacetylase histon. Untuk melaksanakan ekspresi gen, sel harus mengontrol coiling dan uncoiling DNA yang diikat histon.Hal ini dilakukan dengan bantuan histone acetyl transferase(HAT), dimana residu lisin yaitu acetylatedalam inti histon dilepaskan dan menyebabkan transkripsi kromatin menjadi aktif. Sebaliknya deacetylase histone (HDAC) yang menghilangkan gugus asetil dari residu lisin untuk mengarahkan pembentukan kromatin dan transkripsi dihentikan. Modifikasi yang bersifat reversibel dari ekor terminal inti histon merupakan mekanisme epigenetik utama untuk remodeling struktur kromatin tingkat tinggi dalam mengendalikan ekspresi gen. Inhibitor HDAC (HDI) memblokir aksi ini dan dapat mengakibatkan hiperasetilasi histon, sehingga mempengaruhi ekspresi gen.Asetilasi histon dan deasetilasi memainkan peran penting dalam modulasi topologi kromatin dan regulasi transkripsi gen(Thiagalingam et al. 2003 dan Dokmanovic et al.2007).

14

Gambar 2.4 Skema tahapan HDACs dalam perkembangan sel endokrin pankreas.( Sumber: Christensen 2011)

15

BAB 3 EFEK PEMBERIAN ASAM VALPROAT PADA INDUK TIKUS BUNTING (Rattus norvegicus L.) PADA SEL ENDOKRIN PANKREAS ANAKAN TIKUS Abstrak Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian asam valproat pada sel endokrin pankreas anakan tikus. Induk tikus bunting dikelompokkan menjadi 2 kelompok, yaitu kelompok kontrol normal (A) dan kelompok B yang diberi asam valproat dosis tunggal 250 mg/kg BB secara oral pada hari kebuntingan ke-18. Anakan tikus (F1) diamati perkembangannya dan dievaluasi pankreasnya diambil dalam keadaan teranestesi untuk dilakukan pengamatan histologi dengan pewarnaan hemotoksilin eosin. Hasilnya pada tikus F1umur 8 dan 16 minggu histologi pankreas menunjukkan anak tikus (F1) dari kelompok yang induknya diberi asam valproat pada kebuntingan hari ke-18 jumlah populasi pulau Langerhans tidak ada perbedaan yang bermakna dibanding kontrol normal (p>0,05). Sedangkan jumlah sel endokrin pankreas terjadi perbedaan yang bermakna dibanding kontrol normal (p<0,05). Dapat disimpulkan bahwa pemberian asam valproat pada masa induk tikus bunting mengindikasikan adanya penghambatan perkembangan sel endokrin pankreas dari tikus F1. Kata kunci :asam valproat, sel endokrin pankreas, penghambatan sel endokrin

The Effectof Valproic Acid Administration of The Pregnant Rat (Rattus norvegicus L.) onPancreatic Endocrine Cells Developmentof Tillers Rat Abstract The aim of this research was to inhibit the growth and development of pancreatic endokrin cells of the offspring (F1) of rat treated with valproic acid doing the pregnancy. The pregnant females were divided into 2 groups, control normal (A) andB were treated with a single dose of valproic acid 250 mg/kg BW oraly at day 18th of pregnancy. The delivered litters (F1) at the same time, pancreatic tissues were collected under deep anastetion for histological study. The histologicalresult at the age of 8 and 16 weeks finding of litters (F1) of B showed nochange of islet langerhans population (p>0.05), of the endocrine cells pancreasshowed change (p<0.05). It can be concluded that treating valproic acid at pregnancy periode strongly indicate the inhibition of pancreatic endocrine cells function of its offspring (F1). Keyword: valproic acid, endocrine cells pancreas, inhibition endocrine cells.

16 Pendahuluan Teratogenik adalah sifat bahan yang dapat menghasilkan kecacatan tubuh pada kelahiran.Dalam istilah medis,teratogenik berarti terjadinya perkembangan tidak normal dari sel selama kehamilan yang menyebabkan kerusakan pada embrio sehinggapembentukanorgan-organberlangsung tidak sempurna atau terjadi cacat lahir(Loomis 1989). Aksi suatu zat yang berakibat pada kecacatan selama kebuntingan berhubungan erat dengan perkembangan fetus. Perkembangan fetus dibagi menjadi blastogenesis, organogenesis, histogenesis,dan pematangan fungsional. Pada organogenesis, terjadi proses pembentukan organ sehingga zat teratogen akan menyebabkan malformasi organ, jenis malformasi bergantung pada jenis teratogen. Histogenesis dan pematangan fungsionalbergantung pada suplai nutrisi dan diatur berbagai sistem hormon.Kerusakan sel β pankreas dapat terjadi sejak dimulai organogenesis di rahim, bersamaan dengan perkembangan neuronal tube sebagai awal perkembangan sel saraf (Kuwabara et al. 2011). Tahapan permulaan organogenesis pankreas bergantung pada interaksi pensignalan dengan jaringan di sekelilingnya. Inisiasi pertumbuhan organ dan akibat ekspresi marker molekuler pada tahap awal pertumbuhan pankreas terjadi selama embriogenesis tikus dari hari ke-8,5embrioniksampai hari ke-14,5. Perkembangan saluran cerna ventral, termasuk liver dan pankreas ventral, bergantung pada ekspresi endodermal homeobox gene Hhex yang mengarahkan proliferasi endoderm ventral dan kontrol transisi morfogenetik sel endodermal epithelial (Jorgensen et al. 2007). Wanita yang sedang hamil tidak selalu bebas dari penyakit, sehingga penggunaan obat tertentu terkadang menjadi suatu keharusan. Seperti pada wanita hamil yang mengalami gangguan atau penyakit susunan saraf pusat, seperti epilepsi.Penelitian retrospektifpada wanita hamil pengidap epilepsi yang mengkonsumsi obat asam valproat dapat menyebabkan cacat tuba neuralis dan jantung, cacat kraniofasial, dan tungkai (Sadler 2000). Berdasarkan kriteria keamanan obat bagi ibu hamil yang dilansir oleh FDA (Food and Drug Administration) asam valproat termasuk obat kategori C, yaitu golongan obat yang pada studi terhadap sistem reproduksi hewan percobaan menunjukkan adanya efek samping bagi janin. Pada wanita hamil belum ada studi terkontrol. Obat golongan ini hanya dapat dipergunakan jika manfaatnya lebih besar ketimbang risiko yang mungkin terjadi pada janin. Pada masa embrional, asam valproat mempunyai kemampuan untuk menghambat histone deacetylase (HDAC inhibitor). Asam valproat menyebabkan hiperasetilasi histon pada sel kultur. Secara in vitro asam valproat menghambat aktivitas HDAC dengan mengikat pusat katalisis dari HDACs dan akibatnya asam valproat menekan differensiasi sel (Christensenet al.2011). Pada stem cell pemberian asam valproat di hari ke-9 terjadi hambatan pada pengarahan differensiasi sel pankreas (Gottlicher et al. 2001). Secara umum, target kerja sifat teratogenik derivat asam valproatialah Peroxisome proliferator-activated receptors(PPARs).PPARsadalahliganfaktor transkripsiaktivasiyang memodulasitarget ekspresi gendalam liganendogendaneksogen. PPAR ligan dapat menyebabkan keracunan pada satu spesies melalui mekanisme aksi receptorindependent atau reseptor-dependent,

17 sementara spesies lain mungkin tahan terhadap efek ini.Mekanismenya melibatkan reseptor-dependent, dengan pendekatan gen silencing(Peraza et al. 2006). Dalam penelitian ini asam valproat diberikan pada pasca-trimester pertama tikus bunting, karena pada masa ini merupakan masa perkembanganpematangan dan pertumbuhan penyempurnaanfetus. Pengaruh buruk senyawa asing padafetus pada fase ini tidak berupamalformasi anatomik lagi, tetapi dapat berupa gangguan pertumbuhan terhadap fungsi-fungsi fisiologik atau biokimiawi organ. Apabila padapasca-trimester pertama atau masa Fetal Growth and Development tikus diberikan asam valproat maka pada prinsipnyaefeknyadismorfogenesis (Sadler 2000). Bahan dan Metode Bahan yang digunakan: asam valproat, etanol 70%, larutan NaCl, aqua dest, formalin 10%, ketamin, pewarnaHemotoksilin Eosin (HE), dan tikus putih (Rattus norvegicus L.) galur Sprague dawley. Hewan yang digunakan adalah tikus putih betina. Sebelum melakukan pengujian hewan diaklimatisasi selama 2 minggu dan diberi makan, minum ad libitum. Penetapan dosis didasarkan padaperhitungan kesetaraan antara manusia (70 kg) ke tikus (200 g) maka diperoleh dosis pemberian untuk tikus adalah dosis 250 mg/kg BB.Dosis ini didapat berdasarkan orientasi dosis yang dilakukan sebelumnya. Pengawinan hewan dilakukan pada masa estrus dengan memasukkan seekor tikus jantan ke kandang yang berisi seekor tikus betina pada sore hari. Keesokan paginya dilakukan pengamatan di daerah vagina, jika ditemukan sumbat vagina (vagina plug)maka tikus dinyatakan kawin, dilanjutkan dengan membuat apusan vagina.Apusan vagina dibuat dengan cara mengusapkan cottun bat dibagian vagina tikus betina, kemudian ditoreskan pada kaca objek dan diberikan cairan NaCl fisiologi. Sediaan diamatidenganmikroskop dengan pembesaran 40 x. Tikus dinyatakan kawin apabila ditemukan sperma dalam apusan vaginanya. Tikus yang terbukti kawin dinyatakan sebagai hari ke-0 dari kehamilan. Asam valproat diberikan secara oral pada induk tikus bunting hari ke-18. Tikus percobaan dibagi menjadi 2 kelompok dengan masing-masing kelompok terdiri atas6 tikus betina. Kelompok A merupakan kontrol normal yang diberikan aquadest. Kelompok B adalah kelompokyang diberikan dosis tunggal asam valproat 250 mg/kg BB per oral pada kebuntingan hari ke-18. Pembedahan dilakukan pada saat anak tikus berumur 8 dan 16 minggu. Pada pengujian ini tikus dianastesi dengan menggunakan ketamin secara intra peritoneal. Tikus diletakkan di atas papan bedah dengan posisi ventral menghadap peneliti. Bagian perut tikus dibedah dengan gunting, organ dikeluarkan dan disimpan pada vial berisi buffer formalin 10%.Pembuatan preparat histologi dilakukan dengan menggunakan metode pewarnaan Hemotoksilin Eosin (HE). Pankreas yang telah dipisahkan dimasukkan ke dalam cairan formalin 10%, kemudian dibuat preparat histologi dengan pewarnaan HE. Prosedur pembuatan preparat histologi adalah sebagai berikut: fiksasi, dehidrasi, pembeningan, infiltrasi dan penanaman(embedding), pemotongan, penempelan, dan pewarnaan. Metode pewarnaan HE: proses inidiawali dengan pewarnaan inti sel dengan hematoksilin selama 2 menit dengan cara meneteskan larutan hematoksilin di atas sayatan organ, lalu dicelup dalam air kran selama 5 menit, sambil dikontrol dibawah mikroskop untuk melihat hasil pewarnaan hematoksilin. Bila warna yang diharapkan

18 telah tercapai, kemudian preparat dicelup dengan destilasi water (DW) selama 5 menit. Dilanjutkan dengan pewarnaan sitoplasma sel dengan eosin 5 menit dengan cara meneteskan larutan eosin diatas sayatan organ, lalu dibilas dalam DW selama beberapa detik dan dilanjutkan dengan pengontrolan di bawah mikroskop untuk melihat hasil pewarnaan eosin. Dicuci dengan air kemudiandidehidrasi, clearing, mounting, kemudian preparat diberi 1 tetes entelan danobjek glass ditutup. Pengamatanmikroskopikdilakukan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 4x untuk melihat populasi dan menghitung jumlah rata-rata pulau Langerhans dalam satu lapang pandang. Mikroskop dengan perbesaran 40 x untuk pemeriksaan dan menghitung rata-rata jumlah sel pankreas dari 4 pulau Langerhans dalam setiap preparat. Data kuantitatif rata-rata jumlah pulau Langerhans dan sel endokrin pankreas anakan tikusdianalisis secara statistik menggunakan ANOVA satu arah. Hasil Tabel 3.1 Rerata Jumlah Pulau Langerhans Dalam Satu Lapang Pandang Kelompok

Rata-rata Jumlah Pulau Langerhans umur 8 minggu (dalam satu lapang pandang)

Rata-rata Jumlah Pulau Langerhans umur 16 minggu (dalam satu lapang pandang)

A

5.2+0.83

5+0.71

B

4.6+0.55

4.8+0.84

Tidak berbeda bermakna p>0,05 (Uji Anova satu arah). A : Kontrol normal. B: kelompok yang diberikan asam valproat 250 mg/kg BB per oral pada kebuntingan hari ke-18.

Gambar

3.1 Gambaran Histologi Pulau Langerhans Pankreas Tikus F1 dengan Pewarnaan Hemotoksilin-Eosin Dalam Satu Lapang Pandang. Jumlah pulau Langerhans tidak berbeda. A. Kelompok kontrol normal. B. Kelompok yang induknya diberi asam valproat dosis 250 mg/kg BB pada kebuntingan hari ke-18 umur 8 minggu. C. . Kelompok yang induknya diberi asam valproat dosis 250 mg/kg BB pada kebuntingan hari ke-18 umur 16 minggu.

19 Tabel 3.2 Rerata Jumlah Sel Endokrin Pankreas Tikus F1 yang Induknya Diberi Asam Valproat dosis 250 mg/kg BB. Jumlah Sel Jumlah sel Kelompok Tikus Umur 8minggu Umur 16minggu 1 90 100 A 2 120 119 3 110 109 Rerata 106,66+15,27 109,33+9,50 1 64 100 B 2 65 86 3 84 61 Rerata 71+11,26* 82,33+19,75* (*) menunjukkan ada perbedaan bermakna jumlah sel endokrin menurun p<0,05 (uji anova satu arah). A : Kontrol normal. B:kelompok yang diberikan asam valproat 250 mg/kg BB per oral pada kebuntingan hari ke-18.

Gambar

3.2 Gambaran Histologi Sel Pankreas Tikus F1 dengan Pewarnaan Hemotoksilin-Eosin. A. Kelompok kontrol normal. B. Kelompok yang induknya diberi asam valproat dosis 250 mg/kg BB pada kebuntingan hari ke-18 umur 8minggu.C.. Kelompok yang induknya diberi asam valproat dosis 250 mg/kg BB pada kebuntingan hari ke-18 umur 16minggu. Pembahasan

Rata-rata jumlah pulau Langerhans (Tabel 3.1) yang diperoleh, dianalisis secara statistik. Uji normalitas dengan menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov untuk mengetahui apakah populasi data terdistribusi normal atau tidak. Uji homogenitas menggunakan uji Levene untuk mengetahui apakah varian populasi homogen atau tidak. Uji Anova satu arah digunakan untuk mengetahui apakah rata-rata adalah sama atau berbeda bermakna. Hasil analisis statistik, diperoleh hasil uji Kolmogorov-Smirnovmenunjukkan bahwa (p>0,05) dan hasil uji Levene menunjukkan bahwa(p>0,05). Hal ini menunjukkan bahwa data terdistribusi normal dan homogen. Analisis dilanjutkan dengan metode Anova satu arah dan hasil yang didapat menunjukkan bahwa (p>0,05), artinya data jumlah populasi pulau Langerhans dalam satu lapang pandang

20 tidak berbeda bermakna. Sehingga dapat dikatakan pemberian asam valproat dosis 250 mg/kg BB padakebuntingan hari ke-18 tidak menyebabkan perubahan jumlah populasi pulau Langerhans (Gambar 3.1) Rata-rata jumlah sel endokrin pankreas (Tabel 3.2) yang diperoleh, dianalisis secara statistik. Uji normalitas dengan menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov untuk mengetahui apakah populasi data terdistribusi normal atau tidak. Uji homogenitas menggunakan uji Levene untuk mengetahui apakah varian populasi homogen atau tidak. Uji Anova satu arah digunakan untuk mengetahui apakah rata-rata adalah sama atau berbeda bermakna dan dilanjutkan dengan menggunakan uji Tukeyuntuk melihat perbedaan bermakna antar tiap kelompok perlakuan. Hasil penelitian dianalisis secara statistik, diperoleh hasil uji KolmogorovSmirnovmenunjukkan bahwa p>0,05 dan hasil uji Levene menunjukkan bahwap>0,05, artinya data terdistribusi normal dan homogen.Analisis dilanjutkan dengan metode Anova satu arah dan hasil yang didapat (p=0,000) menunjukkan bahwa (p<0,05) dannilai rata-rata mempunyai perbedaan bermakna antarkelompok perlakuan. Selanjutnya dilakukan analisa Tukey untuk melihat perbedaan yang bermakna dengan taraf signifikansi 5% antara kelompok normal (A)dan kelompok B yaitu tikus F1 yang induknya diberi asam valproat 250 mg/kg BB pada kebuntingan hari ke-18. Pada tikus F1 umur 8 minggu,kelompok tikus yang induknya diberi perlakuan dengan asam valproat dosis 250 mg/kg BBberbeda bermakna dengan kontrol normalterjadi penurunan jumlah sel endokrinnya.Pada tikus F1 umur 16 minggu kelompok tikus yang induknya diberi perlakuan dengan asam valproat 250 mg/kg BB pada kebuntingan hari ke-18 berbeda bermakna dengan kontrol normal terjadi penurunan jumlah sel endokrinnya. Penelitian ini menunjukkan pemberian asam valproat pada kebuntingan hari ke-18 dengan dosis tunggal250 mg/kg BB dapat menyebabkan penurunan jumlah sel endokrin pankreas anakan tikus, tetapi tidak mempengaruhi jumlah populasi pulau Langerhans pada tikus F1 yang induknya diberi asam valproat.Hubungan strukturaktivitas menunjukkan bahwa induksi asam valproat menyebabkan gangguan perkembanganembriosecara in vivo pada masa pematangan fungsional.Sifat teratogenikasam valproat mungkin melibatkanprogramselularyang kompleks danregulasiberbagaikegiatangen.PPARδmemainkan peranan utamadalam mekanisme aksi respons seluleruntukasam valproat. PPARδ diaktifkan secara selektif oleh asam valproat dimana PPARδmerupakan faktor pembatas dalam pengendalian diferensiasi sel (Werling et al.2001).Ada kemungkinanperubahan aktivitasHDACdapat mempengaruhifaktor transkripsiatau modifikasihistonekspresi genyang menginduksi(pre) proinsulindalam sekresiinsulin (Larsen et al. 2007). Simpulan Pemberian asam valproat dosis tunggal 250 mg/kg BB padainduk tikusbunting hari ke-18 tidak memberikan perubahan pada jumlah populasi pulau Langerhans. Pemberian asam valproat dosis tunggal250 mg/kg BB pada induk tikus bunting hari ke-18 dapat menyebabkan penurunan jumlah sel endokrinpankreas anakan tikus.

21

BAB 4 PENGHAMBATAN PERKEMBANGAN SEL β PANKREAS ANAKAN TIKUS DARI INDUK YANG MENERIMA ASAM VALPROAT PADA KEBUNTINGAN PASCA-TRIMESTER SATU Abstrak Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui adanya penghambatan fungsi sel β pankreas tikus F1 dari induk tikus bunting yang diberi asam valproat. Induk tikus bunting dikelompokkan menjadi 3, berdasarkan waktu pemberian asam valproat dosis tunggal (250 mg/kg BB) secara oral pada hari kebuntingan ke-9 (T9), ke-11(T11), dan ke-18 (T18). Anakan tikus (F1) diamati perkembangannya dan dievaluasi kadar glukosa darah dan hormon insulin darah pada umur 8, 16, dan 24 minggu. Pada waktu yang sama pankreas diambil dalam keadaan teranestesi untuk dilakukan pengamatan immunohistologi. Hasilnya pada umur 8 minggu kadar glukosa darah dan histologi pankreas menunjukkan anak tikus (F1) dari semua kelompok induk perlakuan tidak menunjukkan adanya perubahan. Pada tikus (F1) umur 16 dan 24 minggu pada kelompok T9 dan T11 terindikasi adanya peningkatan kadar glukosa darah dan insulin darah. Pada T18 yang meningkat hanya kadar glukosa darah, sedangkan konsentrasi insulin darah mengalami penurunan. Pada tikus (F1) dari T9, T11, dan T18 sel yang positif insulin mengalami penurunan, sedangkan sel yang positif glukagon hanya pada tikus (F1) dari T18 yang mengalami peningkatan hasil immunohistokimia. Dapat disimpulkan bahwa pemberian asam valproat pada masa induk tikus bunting mengindikasikan adanya penghambatan fungsi sel β pankreas dari tikus F1. Kata kunci : Panghambatan differensiasi selβ, asam valproat, disfungsi sel β. The Inhibition of Pancreatic β Cells Development in Rats Born to Mother Treated with Valproic Acid at Post-First Trimester of Pregnancy Abstract The aim of this research was to inhibit the growth and development of pancreatic islets β cells of the offspring (F1) of rat treated with valproic acid during post-trimester one of pregnancy. The pregnant females were divided into 3 groups, which were treated with a single dose of valproic acid (250 mg/kg BW) oraly at day 9th(T9), 11st(T11), and day 18th(T18) of pregnancy. The delivered litters (F1) were raised up and blood glucose and insulin concentrations were evaluated at the ages of 8,16, and 24 weeks. At the same time, pancreatic tissues were collected under deep anastetion for immunohistological study. The result of blood glucose value and histological finding of litters (F1) from all treated mothers showed no change at the age of 8 weeks. At the ages of 16 and 24 weeks, F1 of the T9 and T11 indicated an increaseof blood glucose and blood insulin concentrations. In rats born to T18mother, serum glucose concentrations were increase without changes in serum insulin concentrations.Insulinpositive cells slightly decreased on offspring (F1) of T9, T11, and T18. Increasing

22 glucagon positive cells only found on offspring (F1) of T18. It can be concluded that treating valproic acid at pregnancy periode strongly indicate an inhibition of pancreatic β cells function of its offspring (F1). Keyword: Inhibition of β cells differentiation, valproic acid, disfunction of β cells Pendahuluan Perkembangan awal embrio tikus berawal dari pembuahan sel telur oleh spermatozoa di bagian ampula dari oviduk dan membentuk zigot. Kemudian akan diikuti oleh proses pembelahan yang terjadi secara lambat di sepanjang ovidukbagian tuba falopi sampai di tempat terjadinya implantasi 4,5 hari setelah pembuahan.Bentuk morula kompak dicapai kira-kira 12 jam setelah pembelahan ketiga. Setelah bentuk morula tercapai embrio mulai memasuki tanduk rahim lewat hubungan utero-tubal junction. Di daerah ini embrio mulai membentuk blastosis, kemudian akan mengalami implantasi pada dinding tanduk rahim (Hogan et al.1994). Pada embrionik hari ke-5 sampai ke-6,5 masa implantasi. Embrionik hari ke-6,5 mulai terjadi gastrulasi dan dilanjutkan masa awal organogenesis (early organogenesis) sampai hari ke-10. Embrionik hari ke-10 sampai ke-14 adalah masa organogenesis. Dilanjutkan masa pertumbuhan fetus dan perkembangan (fetal growth and development) embrionik hari ke-14 sampai ke-19. Pankreas tikus terbentuk pada masa organogenesis dari kebuntingan (embrionik) hari ke-8.5 sampai ke-14.5. Pada periode ini jenis sel pankreas dapat ditentukan dan memiliki pola produk gen berdasarkan DNA dan RNA yang terbentuk untuk sel endokrin pankreas, sel eksokrin, dan faktor transkripsi. Aktivitas enzim eksokrin dan hormon endokrin selama pengembangan pankreas menyebabkan peristiwa transisi regulasi. Pada tikus embrionik hari ke-9.5 sampai ke-11.5terjadi transisi primer terkait dengan penentuan organ dan konversi sel predifferensiasi ke kondisi protodifferensiasi dilihat dari protein tingkat rendah pankreas yang muncul. Transisi sekunder pada tikus embrionik hari ke-14.5 sampai ke-19.5 adalah konversi dari jaringan protodifferensia yakni sel dibedakan dengan peningkatan ukuran dalam pankreas, khususnya sintesis protein dan hilangnya kapasitas proliferasi. Transisi ketiga terjadi setelah kelahiran, menunjukkan adaptasi untuk sintesis bergantungpada penyerapan makanan dan sekresi protein pankreas yang spesifik (Jorgensen et al. 2007). Kerusakan sel β pankreas dapat terjadi saat dimulainya organogenesis saat fetus mengalami perkembangan di rahim, bersamaan dengan perkembangan neuronal tube sebagai awal perkembangan sel saraf (Kuwabara et al. 2011). Organogenesis pankreas bergantung pada interaksi pensignalan dengan jaringan di sekelilingnya. Inisiasi pertumbuhan organ dan akibat ekspresi marker molekuler pada tahap awal pertumbuhan pankreas selama embriogenesis tikus terjadi dari embrionik hari ke-8,5 sampai hari ke-14,5. Perkembangan saluran cerna ventral termasuk hati dan pankreas bergantung pada ekspresi endodermal dari homeobox gene Hhex yang mengarahkan proliferasi dari endoderm ventral dan kontrol transisi morfogenetik dari sel endodermal epithelial (Jorgensen et al. 2007). Pemberian beberapa obat atau senyawa kimia tertentu pada induk bunting akan berpengaruh pada perkembangan embrio. Kelainan atau anomali organ pada fetus dapat ditemukan seperti jantung tidak bersekat dengan sempurna, hambatan

23 perkembangan sistem saraf pusat, rudimenter organ dan lain-lain. Hal ini dapat terjadi karena kemungkinan faktor luar berpengaruh pada proses proliferasi atau differensiasi sel selama masa perkembangan embrio. Berdasarkan kriteria keamanan obat bagi ibu hamil yang dilansir oleh FDA (Food and Drug Administration) asam valproat termasuk obat kategori C, yaitu golongan obat yang pada studi terhadap sistem reproduksi hewan percobaan menunjukkan adanya efek samping bagi janin,sedangkan pada wanita hamil belum ada studi terkontrol. Obat golongan ini hanya dapat dipergunakan jika manfaatnya lebih besar ketimbang risiko yang mungkin terjadi pada janin. Pada masa embrional asam valproat mempunyai dampak untuk menghambat histone deacetylase (HDAC inhibitor). Asam valproat menyebabkan hiperasetilasi histon pada sel kultur. Secara in vitro asam valproat menghambat aktivitas HDAC dengan mengikat pusat katalisis dari HDACs, akibatnya asam valproat menekan differensiasi sel. Pada perlakuan dengan asam valproat di hari ke-9stem cell terjadi hambatan differensiasi sel pankreas(Gottlicher et al. 2001). Penelitian ini dimaksudkan untuk melihat pengaruh asam valproat yang diberikan kepada induk tikus bunting terhadap perkembangan organ tikus F1 setelah dilahirkan. Diharapkan pemberian asam valproat pada induk bunting dapat mempengaruhi perkembangan organ saat organogenesis terjadi. Berdasarkanperiode masa pembentukan organ pankreas embrio, pemberian asam valproat pada induk besar kemungkinan menyebabkangangguan pertumbuhan pankreas pada tikus termasuk kerusakan pada sel β pankreas tikus (Hoganet al. 1994). Oleh karena itu perlu diinvestigasi kemungkinan penghambatan sel β pankreas pada F1 setelah lahir (post natal). Obat yang dipakai dalam penelitian ini adalah asam valproat yang merupakan obat antiepilepsi dan antikanker yang berpotensi menghambat histone deacetylase(Christensenet al. 2011). Pemberian asam valproat kepada induk di beberapa titik di dalam periode perkembangan pankreas embrio diharapkan dapat informasi lebih dalam tentang kemungkinan terjadinya penghambatan perkembangan organ pankreas Bahan dan Metode Penelitian ini menggunakan tikus putih (Rattusnovergicus L) galur Sparague Dawley usia 3-4 bulan dan bobot badan 200-300 guntuk menghasilkan anakan. Bahan induksi adalah larutan asam valproat 250 mg/5 mL. Reagen yang digunakan untuk analisis darah : reagen kit glukosadan kit ELISA untuk analisis insulin. Pewarnaan sel endokrin pankreas menggunakan immunohistokimia Ab anti insulin dan anti glukagon. Penelitian diawali dengan persiapan induk bunting melalui program ”timemating” dengan memasangkan tikus betina estrus dan jantan pada satu kandang untuk mendapatkanpeluang kebuntingan yang lebih besar. Setelah terjadinya perkawinan dengan teridentifikasinya ”vaginal plug” keesokan harinya ditetapkan sebagai hari pertama kebuntingan. Induk betina bunting dikelompokkan berdasarkan waktu pemberian asam valproat, yaitu T9 diberi pada hari ke-9 kebuntingan, T11 pada hari ke-11 dan T18 pada hari ke-18.Dosis pemberian asam valproat adalah dosis tunggal sebesar 250 mg/kg bb tikus per oralpada semua kelompok induk kecuali kelompok kontrol. Selanjutnya induk dipelihara dengan pakan standar dan diberi air

24 minum ad libitum. Proses kelahiran dan pemeliharaan anak dilakukan oleh induk masing-masing hingga anak umur sapih. Evaluasi perkembangan sel endokrin pankreas tikus F1 dari semua kelompok induk perlakuan dilakukan dengan membandingkan dengan kelompok kontrol. Waktu evaluasi dilakukan pada umur 8. 16 dan 24 minggu. Parameter yang diamati dari sampel darah meliputi kadar glukosa darah dan kadar hormon insulin darah. Parameter lain adalah perubahan immunoreaktivitas sel β dan sel α dari sampel jaringan pankreas. Pengambilan sampel darah dan jaringan pankreas dilakukan dalam kondisi teranestesi dengan menggunakan kombinasi ketamin 5 mg/100 g BB dan xylazin 1 mg/100 g BB secara intraperitoneal. Hasil Hasil pengukuran kadar glukosa darah tikus F1 umur 8 minggu dari induk T9 menunjukkan adanya nilai kadar glukosa yang tidak berbeda jika dibandingkan dengan nilai kontrol normal (70 mg/dL). Pada umur yang sama tikus F1 kelompok T11 (90 mg/dL) dan T18 (100 mg/dL) menunjukkan adanya peningkatan kadar glukosa darah dibandingkan kelompok kontrol normal. Hasil pengamatan gula darah F1 pada umur 16 minggu dan 24 mingguterlihat ada peningkatan kadar glukosa darah pada semua kelompok baik T9, T11, dan T18 dibandingkan kelompok kontrol normal (Gambar 4.1).

120

Kadar Glukosa Darah (mg/dl)

97.52 100 80

85.97 74.66 72.99 69.16

95.7

90.29 89.29

99 98.16

80.2

71.7

60 40 20 0 N

T9

T11

T18

Kelompok Perlakuan

Gambar4.1 Rata-rata kadar glukosa darah tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat 250 mg/kg bb per oral pada minggu ke-8 () p=0,002,ke16 ( ) p=0,077 danke-24 ( ) p=0,072. N : kontrol normal, T9

25 : tikus F1 dari induk T9, T11 : tikus F1 dari induk T11, T18 : tikus F1 dari induk T18.

Pengamatan pulau langerhans pankreas tikus F1 dari induk T9, T11, dan T18 pada umur 8 minggu belum menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan dibanding kontrol normal dilihat dari hasil immunohistokimia (Gambar 4.2). Sel-sel yang positif insulin dengan persentase warna cokelat yang hampir sama menunjukkan gambaran sel beta yang masih mempunyai kemampuan yang sama menghasilkan insulin pada usia tikus F1 umur 8 minggu.

Gambar 4.2Hasil pewarnaan immunohistokimia sel endokrin pankreas dengan anti insulin pada umur 8 minggu.A : kontrol normal,B : tikus F1 dari induk T9 yang diberi perlakuan asam valproat.

Hasil pengukuran kadar insulin darah tikus F1 dari T9 pada minggu ke-16 dan 24 menunjukkan adanya peningkatan dibanding kontrol normal (Gambar 4.3). Kadar insulin tikus F1 dari induk T11 tidak menunjukkan perbedaan yang bermakna pada umur 16 minggu, tetapi pada tikus F1 umur 24 minggu menunjukkan peningkatan kadar insulin darah dibandingkan kelompok kontrol normal. Pada kelompok tikus F1 umur 16 dan 24 minggu dari induk T18 terjadi penurunan kadar insulin dibandingkan kelompok kontrol normal.

26

Kadar Insulin Darah (ηg/ml)

0.9 0.762

0.8 0.7

0.622

0.6

0.5

0.5

0.4 0.3 0.2

0.249 0.151

0.101

0.066

0.1

0.075

0 N

T9

T11

T18

Kelompok Perlakuan

Gambar4.3Rata-rata konsentrasiinsulin darah tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat 250 mg/kg BB per oral pada minggu ke-16 ( )dan ke-24 ( ). N : kontrol normal, T9 : tikus F1 dari induk T9, T11 : tikus F1 dari induk T11, T18 : tikus F1 dari induk T18.

27

Gambar 4.4Hasil pewarnaan immunohistokimia sel endokrin pankreas tikus umur 16 minggu dengan Ab anti insulin dan Ab anti glukagon A. Kontrol normal sel positif insulin. B. Kontrol normal sel positif glukagon. C. Kelompok T9 sel positif insulin. D. Kelompok T9 sel positif glukagon. E. Kelompok T11 sel positif insulin. F. Kelompok T11 sel positif glukagon. G. Kelompok T18 sel positif insulin. H. Kelompok T18 sel positif glukagon

28 Pembahasan Kadar glukosa darah (Gambar 4.1) terlihat adanya peningkatan pada kelompok T9 dengan trend yang meningkat pada tikus F1 dari umur 8, 16, dan 24 minggu. Pada kelompok T11 peningkatan kadar glukosa relatif stabil dari umur 8, 16, dan 24 minggu. Hasil pengukuran kadar glukosa darah tikus F1 umur 8 minggu dari induk T9 menunjukkan adanya nilai kadar glukosa yang tidak berbeda dengan nilai kontrol normal (70 mg/dL). Pada umur yang sama tikus F1 kelompok T11 (90 mg/dL) dan T18 (100 mg/dL) menunjukkan adanya peningkatan kadar glukosa darah dibandingkan kelompok kontrol normal. Hasil pengamatan gula darah F1 pada umur 16 minggu dan 24 minggu terlihat ada peningkatan kadar glukosa darah pada semua kelompok baik T9, T11, dan T18 dibandingkan kelompok kontrol normal, sedangkan pada F1 kelompok kontrol normal (N) kadar glukosa darah relatif tidak berfluktuasi dari umur 8, 16, dan 24 minggu. Tikus F1 dari induk T9, T11, dan T18 pada umur 8 minggu dilihat dari parameter kadar glukosa dan histologi pankreas belum menunjukkan adanya perbedaan yang bermakna jika dibandingkan dengan kontrol normal. Kondisi fisiologi antara tikus F1 yang induknya diberi asam valproat pada masa kebuntingan dengan tikus kontrol normal juga menunjukkan tidak adanya perbedaan yang bermakna jika dilihat kadar glukosa darah. Kondisi ini menunjukkan sel beta pankreas masih cukup secara jumlah dan kemampuan menghasilkan insulin sehingga kadar glukosa darah masih dapat terkontrol. Hasil pengukuran kadar insulin darah tikus F1 dari T9 pada minggu ke-16 dan 24 menunjukkan adanya peningkatan dibanding kontrol normal (Gambar 4.3). Kondisi ini menunjukkan adanya hiperinsulinemia yang terjadi karena adanya usaha mengontrol kenaikan kadar glukosa darah (Gambar 4.1).Kadar insulin tikus F1 dari induk T11 tidak menunjukkan perbedaan yang bermakna pada umur 16 minggu, tetapi pada tikus F1 umur 24 minggu menunjukkan peningkatan kadar insulin darah dibandingkan kelompok kontrol normal. Pada kelompok tikus F1 umur 16 dan 24 minggu dari induk T18 terjadi penurunan kadar insulin dibandingkan kelompok kontrol normal. Peningkatan kadar insulin darah tikus F1 dari induk T9 pada umur 16 minggu dan 24 minggu (Gambar 4.3) menunjukkan keselarasan dengan hasil perubahan histomorfologi sel β yang menunjukkan penurunan immuno reaktivitas sel β terhadap antibodi anti insulin. Penurunan imunoreaktivitas sel β yang adadapat mengindikasikan bahwa sel β pankreas berusaha melepas hormon insulin lebih banyak ke sirkulasi darah sehingga kadar insulin dalam selakan menurun pada akhirnya (Gambar 4.4.C).Pada sel β pankreas peningkatan kadar glukosa interstitial akan masuk ke dalam sel melalui tranporter glukosa(GLUT2). Glukosa akan mengalami metabolism membentuk ATP. ATP akan menyebabkan menutupnya kanal ion K+ sehingga terjadi depolarisasi pankreas, yang diikuti masuknya Ca2+ke dalam sel β sehingga menyebabkan terjadinya sekresi insulin dari sel β dan menyebabkan meningkatnya konsentrasi insulin pada darah. Peran insulin dalam penyerapan glukosa kedalam sel dimulai dari ditangkapnya insulin oleh reseptor pada membran sel, kemudian kompleks insulin-reseptor akan mengaktifkan ATP-ase membran sehingga memecah ATP menjadi ADP. Kompleks insulin-reseptor ini akan memberi signal untuk

29 mengaktifkan tranporter glukosa (GLUT-4) sehingga siap untuk menerima dan memindahkan glukosa dari luar ke dalam sel (Lienheard et al. 2003). Pada pengamatan pulau langerhans tikus normal umur 16 minggu dari hasil immuno reaktivitas, sel yang positif insulin menggerombol di tengah dan mengisi sebagian besar pulau langerhans pankreas (Gambar 4.4.A). Pada sel endokrin pankreas bagian pinggir/tepi tikus F1 kontrol berderet sel endokrin yang positif glukagon (Gambar 4.4.B), gambaran demikian sejalan dengan hasil yang dilaporkan oleh Riedelet al. (2012). Pengamatan pulau langerhans pankreas tikus F1 dari induk T9 umur 16 minggu menunjukkan hasil immuno reaktivitas dengan intensitas yang sama dengan kontrol normal.Tetapi terjadi penurunan populasi sel β(berkurangnya warna cokelat dalam sitoplasma yang menunjukkan berkurangnya jumlah sel β)meskipun dilihat dari pola sebaran sel beta masih sama dengan hasil kontrol normal (Gambar 4.4.C). Pengamatan pulau langerhans pankreas tikus F1dari induk T9 umur 16 minggu menunjukkan tidak adanya perbedaan yang signifikan dibanding kontrol normal dilihat dari sebaran sel alfa yang menghasilkan glukagon baik dari warna cokelat hasil immuno reaktivitas maupun pada pola sebaran sel alfa yang berada di bagian tepi pulau langerhans pankreas tikus (Gambar 4.4.D). Secara umum, penurunan imunoreaktivitas mengindikasikan dua kondisi yakni pertama adanya penurunan fungsi saja atau sedang meningkatkan pelepasan insulin ke sistem sirkulasi bila populasi sel tidak mengalami perubahan. Kedua bermakna tanda adanya proses kematian bila disertai dengan penurunan populasi sel endokrin pankreas yang dimaksud. Dilihat gambaran histologi sel pankreas yang menghasilkan insulin dengan metode pada kelompok perlakuan T9 menunjukkan sudah terjadinya penurunan imunoreaktivitas pada beberapa sel endokrin yang menghasilkan insulin jika dibandingkan dengan kelompok kontrol normal pada tikus F1 umur 16 minggu. Hal ini bisa terjadi karena adanya dua kemungkinan, pertama karena sel-sel beta pulau langerhans pankreas tikus sudah tidak mampu menghasilkan insulin atau karena adanya peningkatan sekresi insulin ke darah untuk mengontrol kadar gula darah yang meningkat;kedua, hal ini bisa terjadi bersamaan sehingga kerusakan sel beta pankreas akan semakin parah. Kondisi inilah yang biasanya terjadi pada penderita diabetes tipe 2. Awal kerusakan sel beta pankreas terjadi secara perlahan, tetapi terus berlangsung sehingga pada saat usia tertentu sel beta pankreasnya sudah tidak mampu lagi mensintesis dan mensekresikan hormon insulin. Pada pengamatan pulau langerhans pankreas tikus F1 dari induk T11 pada umur 16 minggu menunjukkan adanya penurunan intensitas warna cokelat dilihat dari hasil immuno reaktivitasdibanding kontrol normal.Tetapi populasi sel beta yang menghasilkan insulin tidak berkurang (Gambar 4.4.E). Pada pengamatan pulau langerhans pankreas tikus F1 dari induk T11 pada umur 16 minggu menunjukkan tidak adanya perbedaan yang signifikan dilihat dari hasil immuno reaktivitas sebaran sel alfa yang menghasilkan glukagon dengan tidak berkurangnya warna cokelat pada bagian tepi pulau langerhans hasil immunohistokimia dibanding kontrol normal (Gambar 4.4.F).Gambaran sel βkelompok ini sangat mungkin merupakan gambaran yang sangat jelas dari

30 pengaruh penghambatan asam valproat yang sangat berpengaruh pada fungsi selβpada waktu dewasa. Demikian juga pada pulau langerhans pankreas tikus F1 dari induk T18 pada umur 16 minggu menunjukkan adanya penurunan intensitas warna cokelat yang dilihat dari hasil immuno reaktivitas dibanding kontrol normal.Populasi sel βbeta yang menghasilkan insulin juga menurun dengan berkurangnya sel yang memberikan warna cokelat hasil immunohistokimia(Gambar 4.4.G). Tetapi pada pulau langerhans pankreas tikus F1dari induk T18 umur 16 minggu menunjukkan adanya peningkatan sebaran sel alfa yang menghasilkan glukagon dengan terdapatnya warna cokelat yang menyebar dari tepi sampai bagian tengah pulau langerhans hasil immunohistokimia (Gambar 4.4.H).Penurunan imunoreaktivitas pada sel β dan alfa sangat kuat mengindikasikan bahwa pemberian asam valproat pada kebuntingan hari ke 18 berdampak pada kedua sel endokrin pankreas dari F1. Hal ini dapat dipahami mengingat pada hari ke-18 kebuntingan sel endokrin pankreas sudah berkembang jauh lebih banyak perkembangannya yang dimulai dari hari ke-8,5 kebuntingan (Jorgensen et al. 2007). Kedua sel endokrin pankreas baik sel β maupun alfa yang sedang berkembang dan mengalami diferensiasi terhambat oleh adanya asam valproat yang mampu bekerja pada histone deacetylase. Gambaran immunohistokimia sel pankreas yang menghasilkan glukagon menunjukkan bahwa pada kelompok T9 dan T11 sel yang menghasilkan glukagon hanya terdapat pada bagian tepi saja sama dengan kontrol normal (N). Hal ini menunjukkan bahwa pada kelompok T9 dan T11 kerusakan sel pulau langerhans pankreas terjadi pada sel beta penghasil insulin. Ada kemungkinanperubahan aktivitasHDACdapat mempengaruhifaktor transkripsiatau modifikasihistonekspresi genyang menginduksi(pre) proinsulindalam sekresiinsulin (Larsenet al.2007).Asam valproat mempengaruhiekspresi genCYP3A4dangen MDR1 (Cervenyet al. 2007).

31

Tabel 4.1 Data perkembangan sel endokrin sertakadar glukosa dan insulin darah anak tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat Induksi Parameter Umur Anakan Tikus (F1) Induk 8 minggu 16 minggu 24 minggu Bunting Glukosa darah Normal Peningkatan Peningkatan Hari Ke-9 Insulin darah Normal Peningkatan Peningkatan Sel β Normal Penurunan Penurunan Sel α Normal Normal Normal Glukosa darah Insulin darah Sel β Sel α

Peningkatan

Peningkatan

Peningkatan

Normal Normal Normal

Normal Penurunan Normal

Peningkatan Penurunan Normal

Glukosa darah Insulin darah Hari Ke-18 Sel β Sel α

Peningkatan Normal Normal Normal

Peningkatan Penurunan Penurunan Peningkatan

Peningkatan Penurunan Penurunan Peningkatan

Hari Ke-11

Pada kelompok T18 hasil immunohistokimia sel pankreas yang positif glukagon menyebar dari tepi sampai ke tengah. Hal ini dapat terjadi karena adanya peningkatan jumlah dan penyebaran sel alfa pada pulau langerhans pankreas. Pada kondisi ini juga terjadi penurunan jumlah sel beta pulau langerhans pankreas yang menghasilkan insulin. Sifat teratogenik derivat asam valproat dengan target kerja Peroxisome proliferator-activated receptors(PPARs).PPARsadalahliganfaktor transkripsiaktivasiyang memodulasitarget ekspresi gendalam liganendogendaneksogen. PPAR ligan dapat menyebabkan keracunan pada satu spesies melalui mekanisme aksi receptorindependent atau reseptor-dependent, sementara spesies lain mungkin tahan terhadap efek ini.Mekanismenya melibatkan reseptor-dependent, dengan pendekatan gen silencing(Peraza et al. 2006). PPARα dan PPARγ tidak spesifik untuk derivat asam valproat, PPARδ spesifik untuk teratogenik derivat asam valproat, tetapi tidak ada ikatan langsung asam valproat dengan PPARδ (Lampen et al.2001). Hubungan struktur-aktivitas menunjukkan bahwa induksi asam valproat menyebabkan gangguan perkembanganembriosecara in vivo.Sifat teratogenikasam valproat mungkin melibatkanprogramselularyang kompleks danregulasiberbagaikegiatangen.PPARδmemainkan peranan utamadalam mekanisme aksi respon seluleruntukasam valproat. PPARδ diaktifkan secara selektif oleh asam valproat dimana PPARδmerupakan faktor pembatas dalam pengendalian diferensiasi sel (Werling et al. 2001).

32

Simpulan Tikus anakan yang induknya diberi asam valproat dosis 250 mg/kg bb pasca trimester pertama hingga umur 8 minggu belum menunjukkan penurunan jumlah sel β. Tikus anakan yang induknya diberi asam valproat pasca trimester pertamapada umur 16 dan 24 minggu menunjukkan peningkatan kadar glukosa darah. Tikus anakan pada umur 16 dan 24 minggu yang induknya diberi asam valproat pada kebuntingan hari ke-9 dan ke-11kadar insulin darahnya meningkat. Tikus anakan yang induknya diberi asam valproatpada kebuntingan hari ke-18 terjadi penurunan kadar insulin darah. Tikus anakan umur 16 dan 24 minggu yang induknya diberi asam valproat pasca trimester pertama terjadi penurunan jumlah sel β pulau langerhans pankreas.

33

BAB 5 PERKEMBANGAN ANAK TIKUS (F1) ASAL INDUK PENERIMA ASAM VALPROAT SEBAGAI MODEL DIABETES MELLITUS Abstrak Tujuan penelitian ini ialah untuk mengembangkan model diabetes yang sesuai kondisi patofisiologi diabetes. Induk tikus yang telah bunting dibagi dalam 2 kelompok, satu kelompok diberi asam valproat 250 mg/kg BB per oral pada kebuntingan hari ke-9 dan kelompok lain sebagai kontrol. Pada umur anak tikus (F1) 8, 16, dan 24 minggu diambil sampel darah untuk dianalisis kadar glukosa, kadar insulin dan trigliserida. Pada waktu yang sama, jaringan pankreas diambil dalam kondisi teranestesi untuk dilakukan immumunohistokimia. Hasil pengukuran kadar glukosa dan histologi pada tikus (F1) umur 8 minggu belum menunjukkan adanya perbedaan yang bermakna dibanding kontrol normal. Pada tikus (F1) umur 16 dan 24 minggu kadar glukosa darah dan konsentrasi insulin serum menunjukkan peningkatan yang signifikan, sedangkan sel yang positif insulin menurun. Dapat diambil kesimpulan pemberian asam valproat pada tikus pada hari ke-9 kebuntingan dapat menghambat fungsi sel β pankreas. Dengan demikian dapat diindikasikan tikus (F1) yang induknya diberi asam valproat pada masa kebuntingan dapat menyebabkan sindrom metabolik yang dimulai pada umur 16 minggu dan berlanjut sampai usia tua. Kata kunci : Asam Valproat,penghambatan sel β, disfungsi sel β.

Development of Rats (F1) born to Mother Administered Valproic Acid at Pregnancy as a Diabetic Mellitus Model Abstract The aim of this research was to develop a diabetic model that is fit to the pathophysiology of diabetic condition. The pregnant female rats were divided into 2 groups, one group was orally treated by a single dose of valproic acid (250 mg/kg BW) on day 9th of pregnancy and the other was a control. Atthe ages of 8,16 and 24 weeks the blood samples of litters (F1) were taken for glucose, insulin and triglyceride determination. At the same time, pancreatic tissues were collected under deep anesthetic condition for immunohistological study. Results of blood glucose concentrations and histological finding of litters (F1) indicated that at the age of 8 weeks both had showed a similar pattern as compared to control. At the ages of 16 and 24 weeks, blood glucose and insulin level showed a significant increase, while positive insulin cells slightly decreased in number. It can be concluded that treating rat with valproic acid on days 9 of gestation will inhibit pancreatic β cells function. There is an indication that F1 of valproic acid treated pregnant mother start showing a metabolic syndrome at 16 weeks and being pronounce by aging. Keyword:valproic acid,inhibition of β cells, dysfunction of β cells

34 Pendahuluan Kejadian diabetes mellitus pada saat ini banyak dimulai pada usia dewasa dan biasanya ada faktor genetik yang memperkuat dan kondisi ini diawali dengan resistensi insulin yang kemudian akan diikuti oleh penurunan jumlah sel β sehingga sekresi insulin tidak dapat memenuhi kebutuhan (Marks 2000). Meskipun upaya penelitian dalam satu dekadedilakukan intensif, dasar genetik dalam peristiwa patogenesisdiabetesmasih kurang dipahami. Diabetesadalah sindrommultigenikkompleksterutama karenadisfungsi sel β pankreasyang berhubungan dengan tingkat resistensiinsulin (Gray 2005). Hewan model diabetes ada 2 kategori, yaitu tipe model karena genetik dan tipe model karena dapatan yang diperoleh dengan induksi diabetagon, seperti aloksan ataupun streptozotocin (Nugroho2006). Untuk model yang diperoleh dari seleksi perkawinan dan rekayasa genetik tingkat keberhasilan kurang dari 50% dan memerlukan waktu lama serta biaya yang sangat mahal. Sementara itu, untuk model yang diperoleh dengan induksi diabetagon, kondisi kerusakan sel pada pankreas ada yang bersifat reversibel dan ada yang kerusakannya permanen, serta menimbulkan kerusakan sel pankreas yang sangat parah sehingga tidak dapat menggambarkan kejadian diabetes yang diinginkan, karena tidak dihasilkan lagi insulin atau jumlahnya sangat kurang yang lebih identik dengan diabetes tipe 1 (Szkudelski 2001). Kerusakan sel β pankreas dapat terjadi sejak dimulai organogenesis di rahim, bersamaan dengan perkembangan neuronal tube sebagai awal perkembangan sel saraf(Kuwabaraetal.2011). Tahapan permulaan organogenesis pankreas bergantung pada interaksi signaling dengan jaringan di sekelilingnya. Inisiasi pertumbuhan organ dan akibat ekspresi marker molekuler pada tahap awal pertumbuhan pankreas selama embriogenesis tikus dari embrionik hari ke8,5 sampai hari ke-14,5. Perkembangan saluran cerna ventral, termasuk liver dan pankreas ventral, bergantung pada ekspresi endodermal homeobox gene Hhex yang mengarahkan proliferasi endoderm ventral dan kontrol transisi morfogenetik sel endodermal epithelial (Jorgensen 2007). Pada masa embrional, asam valproat mempunyai kemampuan untuk menghambat histone deacetylase (HDAC inhibitor). Asam valproat menyebabkan hiperasetilasi histon pada sel kultur dan in vivo. Secara in vitro asam valproat menghambat aktivitas HDAC dengan mengikat pusat katalisis dari HDACs dan akibatnya asam valproat menekan differensiasi sel (Christensenet al.2011) Pada stem cell pemberian asam valproat di hari ke-9 terjadi hambatan pada pengarahan differensiasi sel pankreas (Gottlicher et al. 2001). Melihat kronologi pembentukan organ pankreas selama pertumbuhan embrio, maka dapat diprediksi bahwa gangguan pertumbuhan pankreas pada tikus akan menghasilkan kerusakan pada sel β tikus (Hogan et al.1994).Oleh karena itu perlu diinvestigasi kemungkinan pembuatan tikus diabetes dengan menghambat perkembangan sel atau organ pada tahap embrio. Penelitian ini dirancang untuk mempelajari pengaruh pemberian obat atau senyawa kimia yang dapat mempengaruhi organogenesis, terutama pada perkembangan sel β pankreas. Obat yang dipakai adalah asam valproat yang memiliki mekanisme kerja menghambat histone deacetylase(Christensenet al.2011). Ketika terjadi gangguan perkembangan sel β pankreas maka diharapkan akan menjadi hewan

35 model yang dapat menggambarkan patogenesis diabetes mellitus yang mirip dengan kejadian di manusia. Tujuan penelitian ini ialah untuk mendapatkan hewan model yang sesuai dengan patofisiologi diabetes dan mampu mengekspresikan gejala klinis diabetes. Diharapkan secara in vivo pemberian asam valproat pada tikus bunting hari ke-9 akan mendapatkan anak tikus (F1) yang mendekati kondisi diabetes.

Bahan dan Metode Tikus yang digunakan adalah tikus putih (Rattusnovergicus L) galur Sparague Dawley betina usia 3-4 bulan dan bobot badan 200-300 g sebagai indukan. Bahan induksi adalah asam valproat yang diberikan pada induk bunting dengan dosis tunggal 250 mg/kg BB per oral pada umur kebuntingan 9 hari. Anak yang di dapat disusukan ke induk hingga masa sapih. Selanjutnya anakan dipisah dan diberi pakan standar dan air minum ad libitum. Tahap persiapan untuk kebuntingan induk dengan program time mating menyatukan seekor tikus betina estrus dan jantan dalam satu kandang. Hari pertama kebuntingan ditetapkan bila vaginal plug terdeteksi keberadaannya pada keesokan harinya. Induk bunting yang telah diberi asam valproat dipelihara sampai melahirkan dan membesarkan anaknya hingga lepas sapih. Anak yang telah terpisah dari induknya dibesarkan dan dilakukan pengambilan sampel darah dan jaringan pada umur 8, 16 dan 24 minggu dengan parameter sampel darah yaitu kadar glukosa, kadar insulin dan kadar trigliserida. Jaringan pankreas diambil dan dilakukan histomorfologi untuk melihat perubahan sel endokrin pankreas yaitu sel β dan sel α. Pengambilan sampel darah dan jaringan dilakukan dalam kondisi teranestesi. Pengukuran kadar glukosa menggunakan metode tes kolorimetri enzimatik yaitu Glucose kits based / GOD-PAP. Kadar insulin darah pada serum diukur dengan metode ELISA menggunakan Ultra sensitive rat insulin immunoassay kit. Kadar trigliserida darah diukur menggunakan metode tes kolorimetri enzimatik GPO-PAP dengan LCF. Pewarnaan jaringan pankreas secara immunohistokimia menggunakan Ab anti insulin dan Ab anti glukagon, kemudian divisualisasikan dengan DAB.

Hasil Hasil pengamatan kadar glukosa darah tikus F1 umur 8 minggu dari induk yang diberi asam valproat pada kebuntingan hari ke-9 belum menunjukkan adanya peningkatan kadar glukosa dibandingkan kontrol normal. Peningkatan kadar glukosa darah baru terjadi pada tikus F1 umur 16 minggu dibandingkan kelompok kontrol normal. Peningkatan kadar glukosa darah lebih tinggi terlihat pada tikus F1 umur 24 minggu dibandingkan kelompok kontrol normal (Gambar 5.1).

36

120 97.52

Kadar Glukosa Darah (mg/dl)

100 80

85.97 74.66

71.7

72.99

69.16

60 40 20 0 Minggu ke-8

Minggu ke-16

Minggu ke-24

Kelompok Perlakuan

Gambar 5.1 Rata-rata kadar glukosa darah tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat 250 mg/kg bb per oral pada minggu ke-8,ke-16 and ke-24. ( ) :kontrol normal, ( ) : tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat pada kebuntingan hari ke-9.

Pengamatan hasil immunohistokimia pankreas tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat pada umur 8 minggu belum menunjukkan adanya perbedaan dibanding kontrol normal terhadap immuno-reaktivitassel-sel insulin (Gambar 5.2A). Sel-sel yang positif insulin dengan intensitas warna cokelat yang hampir sama menunjukkan kemampuan menghasilkan insulin relatif sama pada tikus F1 umur 8 minggu dengan kemampuan yang sama dengan kontrol. Tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat pada umur 8 minggu dilihat dari parameter kadar glukosa darah dan histologi pankreas belum menunjukkan adanya perbedaan yang bermakna jika dibandingkan dengan kontrol normal. Kondisi fisiologi antara tikus F1 yang induknya diberi asam valproat pada masa kehamilan dengan tikus kontrol normal juga menunjukkan tidak adanya perbedaan yang bermakna jika dilihat kadar glukosa darah. Kondisi ini menunjukkan sel β pankreas masih memadai secara jumlah dan kemampuan menghasilkan insulin sehingga kadar glukosa darah masih dapat terkontrol (Gambar 5. 2 A).

37

Gambar 5.2 Hasil pewarnaan immunohistokimia positif insulin sel endokrin pulau Langerhans pankreas tikus F1 yang induknya diberi asam valproat. A. Kontrol normal B. Sel endokrin pankreas umur 8 minggu, intensitas immunoreaktivitas masih kuat dan populasi sel yang positif insulin masih dominan di sebagian besar pulau Langerhans. C. Sel endokrin pankreas umur 16 minggu, terjadi pengurangan intensitas immuno-reaktivitas dan populasi sel yang positif insulin berkurang.

Hasil pengukuran kadar insulin darah tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat pada minggu ke-16 dan 24 menunjukkan adanya peningkatankonsentrasi insulin dalam darah dibanding kontrol normal (Gambar 5.3). Kondisi ini menunjukkan adanya hiperinsulinemia yang terjadi karena adanya usaha mengontrol kenaikan kadar glukosa darah. Hasil ini sejalan dengan perubahan histomorfologi sel β yang menunjukkan penurunan immuno reaktivitas sel β terhadap antibodi anti-insulin. Kondisi demikian menggambarkan bahwa sel β berusaha melepas hormon insulin ke sirkulasi darah sehingga kadar insulin yang tertinggal dalam sel menurun (Gambar 5.2C). Peningkatan kadar insulin dalam darah sangat mungkin terkait dengan upaya menjaga kenormalan kadar glukosa darah.

38

Kadar Insulin Darah (ng/ml)

0.9 0.762

0.8 0.7 0.6

0.5

0.5 0.4 0.249

0.3 0.2

0.101

0.1 0 Minggu Ke-16

Minggu Ke-24

Kelompok Perlakuan Gambar 5.3Rata-rata konsentrasi insulin darah tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat 250 mg/kg BB per oral pada minggu ke-16 dan ke-24. ( ):kontrol normal,( ) : tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat pada kebuntingan hari ke-9.. Pengamatan kadar trigliserida darah tikus F1pada umur 16 minggudari induk yang diberi asam valproat menunjukkan adanya peningkatan. Tetapi pada umur 24 minggu tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan dibanding kelompok kontrol normal (Gambar 5.5).

Kadar Trigliserida darah (mg/ml)

90

77.957

80

75.269

70 60 50 40 30 20

20.967 11.823

10 0 Minggu ke-16

Minggu ke-24

Kelompok Perlakuan Gambar 5.4Rata-rata kadar trigliserida darah tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat 250 mg/kg BB per oral pada minggu ke-16 dan ke-24. ( ): kontrol normal, ( ) : tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat pada kebuntingan hari ke-9.

39 Pembahasan Pengamatan pulau langerhans pankreas tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat pada umur 8 minggu belum menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan dibanding kontrol normal dilihat dari hasil immunoreaktivitas(Gambar 5.2A dan 5.2B). Tikus F1 umur 8 minggu, intensitas warna cokelat yang terbentuk sebagai hasil immuno-reaktivitas sel yang positif insulin menunjukkan sel β pankreas tikus F1 yang induknya diberi asam valproat pada kebuntingan harike-9 menghasilkan insulin dalam jumlah yang tidak berbeda nyata atau sama dengan kontrol normal. Kondisi fisiologi antara tikus F1 yang induknya diberi asam valproat pada masa kebuntingan hari ke-9 dengan tikus kontrol normal juga menunjukkan tidak adanya perbedaan yang bermakna jika dilihat kadar glukosa darah. Kondisi ini menunjukkan sel β pankreas masih memadai secara jumlah dan kemampuan menghasilkan insulin sehingga kadar glukosa darah masih dapat terkontrol (Gambar 5.2B). Hasil pengukuran kadar insulin darah tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat pada minggu ke-16 dan 24 menunjukkan adanya peningkatankonsentrasi insulin dalam darah dibanding kontrol normal (Gambar 5.3). Kondisi ini menunjukkan adanya hiperinsulinemia yang terjadi karena adanya usaha mengontrol kenaikan kadar glukosa darah (Gambar 5.1). Hasil ini sejalan dengan perubahan histomorfologi sel β pankreas yang menunjukkan penurunan immuno reaktivitas sel β pankreas terhadap antibodi antiinsulin.Kondisi demikian menggambarkan bahwa sel β berusaha melepas hormon insulin ke sirkulasi darah sehingga kadar insulin yang tertinggal dalam sel menurun (Gambar 5.2C). Peningkatan kadar insulin dalam darah sangat mungkin terkait dengan upaya menjaga nilai kadar glukosa. Pada sel β pankreas glukosa akan masuk ke dalam sel melalui tranporter glukosa (GLUT-2). Glukosa akan mengalami metabolisme membentuk ATP. ATP akan menyebabkan menutupnya kanal ion K+ sehingga terjadi depolarisasi pankreas, yang diikuti masuknya Ca2+ ke dalam sel β sehingga menyebabkan terjadinya sekresi insulin dari sel β dan menyebabkan meningkatnya konsentrasi insulin pada darah. Penyerapan glukosa kedalam sel dimulai dari ditangkapnya insulin oleh reseptor pada membran sel, kemudian kompleks insulin-reseptor akan mengaktifkan ATP-ase membran sehingga memecah ATP menjadi ADP. Kompleks insulin-reseptor ini akan memberi signal untuk mengaktifkan tranporter glukosa (GLUT-4) sehingga siap untuk menerima dan memindahkan glukosa dari luar ke dalam sel (Lienhardet al.2002). Pada pengamatan pulau langerhans tikus normal, hasil immuno reaktivitas sel yang positif insulin menggambarkan sebagian besar sel pulau langerhans pankreas tikus positif insulin (Gambar 5.2.A). Dilihat dari hasil immuno reaktivitasnya terlihat sel yang tidak positif insulin berderet di bagian tepi pulau Langerhans pankreas yang kemungkinan besar adalah sel α. Pewarnaan pada pulau langerhans pankreas tikus F1 umur 16 minggu dari induk yang diberi asam valproat menunjukkan hasil immuno reaktivitas terhadap antibodi anti insulin terlihat menurun, dengan ditemukan adanya sel endokrin dengan warna cokelat pudar dibandingkan kontrol normal (Gambar

40 5.2C). Lebih dari itu populasi sel yang positif terhadap anti insulin yang kuat tidak sebanyak yang ditemukan pada minggu sebelumnya. Hasil pengamatan terhadap immuno reaktivitas anti-glukagon menunjukkan gambaran yang tidak berbeda dari kontrol.Gambaran immunohistokimia sel pankreas yang menghasilkan glukagon menunjukkan bahwa pada kelompok tikus F1 yang induknya diberi asam valproat sel yang menghasilkan glukagon hanya terdapat pada bagian tepi saja sama dengan kontrol normal (Riedelet al.2012). Hal ini menunjukkan bahwa pada kelompok tikus F1 yang induknya diberi asam valproat, kerusakan sel pulau langerhans pankreas terjadi pada sel beta penghasil insulin. Ada kemungkinanperubahan aktivitasHDACdapat mempengaruhifaktor transkripsiatau modifikasihistonekspresi genyang menginduksi(pre) proinsulindalam sekresiinsulin (Larsenet al.2007). Asam valproat mempengaruhiekspresi genCYP3A4dangen MDR1(Cervenyet al.2007). Penurunan populasi sel endokrin yang menghasilkan insulin pada tikus F1 umur 16 minggu dapat terjadi karena adanya dua kemungkinan, pertama karena sel-sel beta pulau langerhans pankreas tikus sudah tidak memadai menghasilkan insulin atau karena adanya peningkatan sekresi insulin ke darah untuk mengontrol kadar gula darah yang meningkat, sehingga terjadi hiper sekresi insulin. Kedua hal ini bisa terjadi bersamaan sehingga kerusakan sel beta pankreas akan semakin parah. Hal ini mengindikasikan bahwa tikus F1 mengalami perubahan yang mendekati kondisi kejadian diabetes. Hasil evaluasi parameter glukosa darah, kadar insulin, dan gambaran histologis sel endokrin pada umur 16 dan 24 minggu menunjukkan kecenderungan yang kuat bahwa metabolisme glukosa tikus F1 mulai terganggu pada umur 16 minggu (dewasa). Pemberian asam valproat di hari ke-9 masa kebuntingan akan meningkatkan sekresi hormon insulin yang signifikan mulai usia tikus F1 16 minggu dan berlangsung hingga 24 minggu. Gambaran immunohistokimia mendukung fakta tersebut. Jumlah sel β pakreas menurun dengan immunoraktivitas yang kuat ( jumlah sel endokrin menurun tetapi menghasilkan insulin yang tinggi). Kondisi inilah yang biasanya terjadi pada penderita diabetes tipe 2 yang proses kerusakan sel β pankreas awalnya terjadi perlahan, tetapi terus berlangsung sehingga pada saat usia tertentu sel β pankreasnya sudah tidak mampu lagi mensintesis dan mensekresikan hormon insulin. Hipertrigliseridemia merupakan salah satu faktor risiko terjadinya sindrom metabolik (Holt dan Hanley 2007; Kahn et al.2006). Peningkatan kadar trigliserida darah pada tikus F1 umur 16 minggu dapat terjadi karena tidak efektifnya kerja insulin. Salah satu efek insulin adalah untuk merangsang pembentukan lipoprotein lipase (LPL), suatu enzim yang melekat ke sel endotel kapiler di otot dan jaringan adiposa. Insulin seharusnya merangsang sel adiposa untuk mensintesis dan menyekresikan LPL, yang menghidrolisis trigliserida dalam kilomikron VLDL. Pada kondisi hewan percobaan ini, kadar insulin darah tinggi tetapi kadar glukosa darah tetap meningkat. Hal ini menunjukkan kemungkinan terjadinya resistensi inisulin. Dengan demikian, efek insulin dalam merangsang pembentukan LPL juga menurun, yang menyebabkan hidrolisis trigliserida dalam kilomikron dan VLDL berkurang dan menimbulkan hipertrigliseridemia (Marks et al.2000).

41 Asam valproat akan mempengaruhi Peroxisome proliferator-activated receptors(PPARs). PPARsadalahliganfaktor transkripsiaktivasiyang memodulasitarget ekspresi gendalamliganendogendaneksogen. Mekanismenya melibatkan reseptor-dependent, dengan pendekatan gen silencing(Perazaet al.2006). PPARα dan PPARγ tidak spesifik untuk derivat asam valproat, PPARδ spesifik untuk teratogenik derivat asam valproat, tetapi tidak ada ikatan langsung antara asam valproat dan PPARδ (Lampen et al. 2001). Hubungan strukturaktivitas menunjukkan bahwa induksi asam valproat menyebabkan gangguan perkembanganembriosecara in vivo.Sifat teratogenikasam valproat mungkin terkait denganprogramselularyang kompleks danregulasiberbagaikegiatangen.PPARδmemainkan peranan utamadalam mekanisme aksi respons selulerterhadapasam valproat. PPARδ yang diaktifkan secara selektif oleh asam valproat merupakan faktor pembatas dalam pengendalian diferensiasi sel (Werlinget al. 2001). Penurunan sel βsesuai dengan penelitian pada stem cell. Simpulan Anak tikus (F1) dari induk yang menerima asam valproat dosis 250 mg/kg BB hingga umur 8 minggu belum menunjukkan adanya penurunan jumlah sel β pankreas.Perubahan nilai parameter pada umur 16 dan 24 minggu menunjukkan kecenderungan yang kuat bahwa tikus F1 dari induk yang menerima asam valproat dosis 250 mg/kg BB pada kebuntingan hari ke-9dapat berkembang menjadi tikus diabetes tipe 2.

42 BAB 6 PEMBAHASAN UMUM Pemilihan Asam Valproat Asam valproat merupakan obat anti-epilepsi dan mulai digunakan sebagai obat antikanker berdasarkan aktivitasnya sebagai penghambat histone deacetylase yang dapat menghambat proliferasi sel. Berdasarkan analisis secara statistik menunjukkan bahwa pemberian asam valproat pada dosis 250 mg/kg BB dapat menyebabkan penurunan jumlah sel endokrin pankreas anakan tikus (F1). Hubungan struktur-aktivitas menunjukkan bahwa induksi asam valproat menyebabkan gangguan perkembanganembriosecara in vivo.Sifat teratogenikasam valproat mungkin melibatkanprogramselularyang kompleks danregulasiberbagaikegiatangen.PPARδmemainkan peranan utamadalam mekanisme aksi respons seluleruntukasam valproat. PPARδ diaktifkan secara selektif oleh asam valproat dimana PPARδmerupakan faktor pembatas dalam pengendalian diferensiasi sel (Werling et al. 2001).Ada kemungkinanperubahan aktivitasHDACdapat mempengaruhifaktor transkripsiatau modifikasihistonekspresi genyang menginduksi(pre) proinsulindalam sekresiinsulin (Larsen et al. 2007). Pemberian Asam Valproat pada Kebuntingan Hari ke-9 (embrionik ke-9) Masa kebuntingan pada tikus umumnya 20 hari, umumnya dikelompokkan menjadi 4 periode, yaitu : hari ke 0-5 adalah masa cleavage danblastulasi; hari ke 5-10 adalah masa implantasi, gastrulasidanorganogenesis awal (early organogenesis); hari ke 10-14 adalah masa organogenesis; hari ke 14-19 adalah masa pertumbuhan fetus dan perkembangan (Fetal growthandDevelopment). Hari kebuntingan ke-9 (embrionik ke-9) dipilih sebagai salah satu waktu pemberian asam valproat karena masa tersebut adalah tahap perkembangan awal organ yang akan mempunyai fungsi sesuai kebutuhan tubuh. Berdasarkan penelitian pada stem cell diketahui bahwa pemberian asam valproat pada hari ke-9 pertumbuhan sel akan menghambat perkembangan sel endokrin pankreas (Jorgensen et al. 2007). Dengan demikian, diharapkan secara in vivo dapat memberikanpengaruh yang sama pada penghambatan perkembangan sel endokrin pankreas dari anak tikus (F1) yang induknya diberi asam valproat pada hari kebuntingan ke-9 (embrionik ke-9). Hasil pengamatan kadar glukosa darah tikus F1 umur 8 minggu dari induk yang diberi asam valproat pada kebuntingan hari ke-9 belum menunjukkan adanya peningkatan kadar glukosa dibandingkan kontrol normal. Tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat pada umur 8 minggu dilihat dari parameter kadar glukosa dan histologi pankreas belum menunjukkan adanya perbedaan yang bermakna jika dibandingkan dengan kontrol normal. Kondisi fisiologi antara tikus F1 yang induknya diberi asam valproat pada masa kehamilan dengan tikus kontrol normal juga menunjukkan tidak adanya perbedaan yang bermakna jika dilihat kadar glukosa darah. Kondisi ini menunjukkan sel β pankreas masih cukup secara jumlah dan kemampuan menghasilkan insulin sehingga kadar glukosa darah masih dapat terkontrol

43 Pada tikus F1 umur 16 dan 24 minggu ada peningkatan kadar glukosa darah dibandingkan kelompok kontrol normal. Hasil pengukuran kadar insulin darah tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat pada minggu ke-16 dan 24 menunjukkan adanya peningkatankonsentrasi insulin dalam darah dibanding kontrol normal. Kondisi ini menunjukkan adanya hiperinsulinemia yang terjadi karena adanya usaha mengontrol kenaikan kadar glukosa darah. Hasil ini sejalan dengan perubahan histomorfologi sel β yang menunjukkan penurunan immuno reaktivitas sel β terhadap antibodi anti-insulin. Kondisi demikian menggambarkan bahwa sel β berusaha melepas hormon insulin ke sirkulasi darah sehingga kadar insulin yang tertinggal dalam sel menurun. Peningkatan kadar insulin dalam darah sangat mungkin terkait dengan upaya menjaga nilai kadar glukosa. Penurunan populasi sel endokrin yang menghasilkan insulin pada tikus F1 umur 16 minggu dapat terjadi karena adanya dua kemungkinan, pertama karena sel-sel beta pulau langerhans pankreas tikus sudah tidak mampu menghasilkan insulin atau karena adanya peningkatan sekresi insulin ke darah untuk mengontrol kadar gula darah yang meningkat. Kedua hal ini bisa terjadi bersamaan sehingga kerusakan sel beta pankreas akan semakin parah. Hal ini mengindikasikan bahwa tikus F1 mengalami perubahan yang mendekati kondisi kejadian diabetes. Hasil evaluasi parameter glukosa darah, kadar insulin, dan gambaran histologis sel endokrin pada umur 16 dan 24 minggu mengindikasikan bahwa metabolisme glukosa tikus F1 mulai terganggu pada umur 16 minggu (dewasa). Pengamatan kadar trigliserida darah tikus F1pada umur 16 minggudari induk yang diberi asam valproat menunjukkan adanya peningkatan. Tetapi pada umur 24 minggu tidak menunjukkan perbedaan yang bermakna dibanding kelompok kontrol normal (Gambar 5.4).Peningkatan kadar trigliserida darah pada tikus F1 umur 16 minggu dapat terjadi karena tidak efektifnya kerja insulin. Salah satu efek insulin adalah untuk merangsang pembentukan lipoprotein lipase (LPL), suatu enzim yang melekat ke sel endotel kapiler di otot dan jaringan adiposa. Insulin seharusnya merangsang sel adiposa untuk mensintesis dan menyekresikan LPL, yang menghidrolisis trigliserida dalam kilomikron VLDL. Pada kondisi hewan percobaan ini, kadar insulin darah tinggi tetapi kadar glukosa darah tetap meningkat. Hal ini menunjukkan kemungkinan terjadinya resistensi inisulin. Dengan demikian, efek insulin dalam merangsang pembentukan LPL juga menurun, yang menyebabkan hidrolisis trigliserida dalam kilomikron dan VLDL berkurang dan menimbulkan hipertrigliseridemia (Marks et al.2000).Hipertrigliseridemia merupakan salah satu faktor risiko terjadinya sindrom metabolik (Holt dan Hanley 2007; Kahn et al.2006). Pemberian Asam Valproat pada Kebuntingan Hari ke-11 (embrionik ke-11) Hari kebuntingan ke-11 (embrionik ke-11) dipilih sebagai salah satu waktu pemberian asam valproat karena masa tersebut adalah masa organogenesis dimana selama periode ini fetus mengalami pertumbuhan dan perkembangan organ sesuai dengan fungsinya. Hasil pengukuran kadar glukosa darah tikus F1 umur 8 minggu dari induk T11 menunjukkan adanya peningkatan kadar glukosa darah dibandingkan kelompok kontrol normal. Hasil pengamatan gula darah F1 pada umur 16 minggu dan 24 mingguterlihat ada peningkatan kadar glukosa darah pada kelompokT11 dibandingkan

44 kelompok kontrol normal. Pada kelompok T11, peningkatan kadar glukosa relatif stabil dari umur 8, 16, dan 24 minggu. Pengamatan pulau langerhans pankreas tikus F1 dari induk T11 pada umur 8 minggu belum menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan dibanding kontrol normal dilihat dari hasil immunohistokimia (Gambar 4.2). Sel-sel yang positif insulin dengan persentase warna cokelat yang hampir sama menunjukkan gambaran sel beta yang masih mampu menghasilkan insulin pada usia tikus F1 umur 8 minggu dengan kemampuan yang sama. Tikus F1 dari induk T11 pada umur 8 minggu dilihat dari parameter kadar glukosa dan histologi pankreas belum menunjukkan adanya perbedaan yang bermakna jika dibandingkan dengan kontrol normal. Kondisi fisiologi antara tikus F1 yang induknya diberi asam valproat pada masa kebuntingan dengan tikus kontrol normal juga menunjukkan tidak adanya perbedaan yang bermakna jika dilihat kadar glukosa darah. Kondisi ini menunjukkan sel beta pankreas masih cukup secara jumlah dan kemampuan menghasilkan insulin sehingga kadar glukosa darah masih dapat terkontrol. Kadar insulin tikus F1 dari induk T11 tidak menunjukkan perbedaan yang bermakna pada umur 16 minggu, tetapi pada tikus F1 umur 24 minggu menunjukkan peningkatan kadar insulin darah dibandingkan kelompok kontrol normal. Pada pengamatan pulau langerhans pankreas tikus F1 dari induk T11 pada umur 16 minggu menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan dilihat dari hasil immuno reaktivitas sebaran sel beta yang menghasilkan insulin dengan berkurangnya warna cokelat hasil immunohistokimia dibanding kontrol normal (Gambar 4.4.E). Pada pengamatan pulau langerhans pankreas tikus F1 dari induk T11 pada umur 16 minggu menunjukkan tidak adanya perbedaan yang signifikan dilihat dari hasil immuno reaktivitas sebaran sel alfa yang menghasilkan glukagon dengan tidak berkurangnya warna cokelat pada bagian tepi pulau langerhans hasil immunohistokimia dibanding kontrol normal (Gambar 4.4.F). Gambaran sel βkelompok ini sangat mungkin merupakan gambaran yang sangat jelas dari pengaruh penghambatan asam valproat yang sangat berpengaruh pada fungsi selβyangdimasa dewasa. Gambaran immunohistokimia sel pankreas yang menghasilkan glukagon menunjukkan bahwa pada kelompok T11, sel yang menghasilkan glukagon hanya terdapat pada bagian tepi saja sama dengan kontrol normal (N). Hal ini menunjukkan bahwa pada kelompok T11 kerusakan sel pulau langerhans pankreas terjadi pada sel beta penghasil insulin. Ada kemungkinanperubahan aktivitasHDACdapat mempengaruhifaktor transkripsiatau modifikasihistonekspresi genyang menginduksi(pre) proinsulindalam sekresiinsulin (Larsen et al. 2007).Asam valproat mempengaruhiekspresi genCYP3A4dangen MDR1 (Cervenyet al. 2007). Pengamatan kadar trigliserida darah tikus F1pada umur 16 minggudari induk yang diberi asam valproat menunjukkan adanya peningkatan. Tetapi pada umur 24 minggu tidak menunjukkan perbedaan yang bermakna dibanding kelompok kontrol normal (Gambar 5.4).Peningkatan kadar trigliserida darah pada tikus F1 umur 16 minggu dapat terjadi karena tidak efektifnya kerja insulin.Salah satu efek insulin adalah untuk merangsang pembentukan lipoprotein lipase (LPL), suatu enzim yang melekat ke sel endotel kapiler di otot dan jaringan adiposa. Insulin seharusnya merangsang sel adiposa untuk mensintesis dan menyekresikan LPL, yang menghidrolisis trigliserida dalam kilomikron VLDL. Pada kondisi hewan percobaan ini, kadar insulin darah tinggi tetapi kadar glukosa darah tetap meningkat. Hal ini

45 menunjukkan kemungkinan terjadinya resistensi inisulin. Dengan demikian, efek insulin dalam merangsang pembentukan LPL juga menurun, yang menyebabkan hidrolisis trigliserida dalam kilomikron dan VLDL berkurang dan menimbulkan hipertrigliseridemia (Marks et al.2000). Pemberian Asam Valproat pada Kebuntingan Hari ke-18 (embrionik ke-18) Hari kebuntingan ke-18 (embrionik ke-18) dipilih sebagai salah satu waktu pemberian asam valproat karena masa tersebut adalah periode pertumbuhan dan perkembangan fetus (Fetal growthandDevelopment). Pada periode ini, organ-organ yang telah terbentuk mengalami perkembangan sesuai dengan fungsinya, termasuk perkembangan sel endokrin pankreas. Hasil pengukuran kadar glukosa darah tikus F1 umur 8 minggu dari induk T18menunjukkan adanya peningkatan kadar glukosa darah dibandingkan kelompok kontrol normal. Haasil pengamatan gula darah F1 pada umur 16 minggu dan 24 mingguterlihat ada peningkatan kadar glukosa darah pada T18 dibandingkan kelompok kontrol normal. Pengamatan pulau langerhans pankreas tikus F1 dari induk T18 pada umur 8 minggu belum menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan dibanding kontrol normal dilihat dari hasil immunohistokimia (Gambar 4.2). Sel-sel yang positif insulin dengan persentase warna cokelat yang hampir sama menunjukkan gambaran sel beta yang masih mampu menghasilkan insulin pada usia tikus F1 umur 8 minggu dengan kemampuan yang sama. Pada tikus F1 umur 16 dan 24 minggu dari induk T18 terjadi penurunan kadar insulin yang signifikan dibandingkan kelompok kontrol normal (gambar 4.3). Penurunan kadar insulin darah yang terjadi signifikan sehingga diprediksi sudah terjadi penurunan sekresi insulin dari sel β pankreas. Pada pulau langerhans pankreas tikus F1 dari induk T18 pada umur 16 minggu menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan ditandai dengan berkurangnya sebaran sel beta yang menghasilkan insulin dilihat dari berkurangnya warna cokelat hasil immunohistokimia dibanding kontrol normal (Gambar 4.4.G). Pada pulau langerhans pankreas tikus F1dari induk T18 umur 16 minggu menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan dilihat dari hasil immuno reaktivitas sebaran sel alfa yang menghasilkan glukagon dengan terdapatnya warna cokelat yang menyebar dari tepi sampai bagian tengah pulau langerhans hasil immunohistokimia (Gambar 4.4.H). Perubahan imunoreaktivitas pada sel β dan alfa sangat kuat mengindikasikan bahwa pemberian asam valproat pada kebuntingan hari ke-18 berdampak pada kedua sel endokrin pankreas dari F1. Hal ini dapat dipahami mengingat pada hari ke-18 kebuntingan, sel endokrin pankreas sudah berkembang jauh lebih banyak perkembangannya yang dimulai dari hari ke-8,5 kebuntingan (Jorgensen et al. 2007). Kedua sel endokrin pankreas baik sel β maupun alfa yang sedang berkembang dan mengalami deferensiasi terpengaruh oleh adanya asam valproat yang mampu bekerja pada histone deacetylase. Pada kondisi ini terjadi penurunan fungsi sel β pankreas pulau langerhans pankreas yang menghasilkan insulin.Hasil immunohistokimia sel pankreas yang positif glukagon menyebar dari tepi sampai ke tengah.Hal ini dapat terjadi karena adanya peningkatan jumlah dan penyebaran sel alfa pada pulau langerhans pankreas.Ada kemungkinanperubahan aktivitasHDACdapat

46 mempengaruhifaktor transkripsiatau modifikasihistonekspresi genyang menginduksi(pre) proinsulindalam sekresiinsulin (Larsen et al. 2007). Hubungan struktur-aktivitas menunjukkan bahwa induksi asam valproat menyebabkan gangguan perkembanganembriosecara in vivo.Sifat teratogenikasam valproat mungkin melibatkanprogramselularyang kompleks danregulasiberbagaikegiatangen.PPARδmemainkan peranan utamadalam mekanisme aksi respons seluleruntukasam valproat. PPARδ diaktifkan secara selektif oleh asam valproat dimana PPARδmerupakan faktor pembatas dalam pengendalian diferensiasi sel (Werling et al. 2001). Hasil penelitian ini secara keseluruhan menunjukkan pemberian asam valproat di hari ke-9, ke-11 maupun ke-18 pada masa kebuntingan (pasca-trimester pertama) akan mengarah kemunculan diabetes dari tikus F1 yang dihasilkan. Tikus F1 umur 16 dan 24 minggu yang induknya diberi asam valproat pada kebuntingan hari ke-9, ke-11, dan ke-18 (pasca-trimester pertama) terjadi penurunan jumlah sel β pankreas.

47 BAB 7 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Penghambatan sel endokrin pankreas dapat dilakukan dengan pemberian asam valproat pada masa kebuntingan induk pasca trimester pertama. Penghambatan perkembangan sel β dapat terjadi dengan pemberian asam valproat pada hari ke 9, 11, dan 18 masa kebuntingan, menggambarkan dinamika hormon insulin yang berbeda. Penghambatan deferensiasi sel endokrin pankreas dengan menggunakan substan teratogenik pada masa perkembangan embrio (organogenesis) dapat menjadi alternatif dalam mendapatkan tikus model diabetes mellitus tipe 2.Tikus model yang didapat menggambarkan kejadian diabetus mellitus tipe 2 pada usia dewasa sebagaimana ditemukan pada manusia.

Saran Untuk melihat kondisi hewan model diabetes yang terjadi perlu dilakukan pengamatan hewan model dengan umur yang lebih panjang dengan berbagai parameter diabetes dan kondisi organ lainnya.

48

DAFTAR PUSTAKA Cerveny L, Svecova L, Azenbacherova E, Vrzal R, Staud F, Dvorak Z, Ultricova J, Azenbacher P, and Pavek P.2007. Valproic Acid Induces CYP3A4 and MDR1 Gene Expression by Activation of Constitutive Androstane Receptor and Pregnane X Receptor Pathways, Drug Metabolism and Disposition.35(7): 1033-1041. Cetin Y, Aunis D, Badert MF, Galindot E, Jorns A. 1993.Chromostatin, a chromogranin A-derived bioactive peptide, is present in human pancreatic insulin (β) cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Medical Sciences, 90: 2360-2364. Christensen DP, Dahllof M, Lundh M, Rasmussen D N, Nielsen MD, Billestrup N, Grunnet LG, and Maundrup PT. 2011.Histone Deacetylase (HDAC) Inhibition as a Novel Treatment for Diabetes Mellitus, Mol Med. 17(56):378-390. Corwin EJ. 2009. Buku Saku Patofisiologi. Edisi III. Terjemahan: Nike Budhi Subekti. Buku Kedokteran EGC. Jakarta. Hlm. 618, 619, 624–627. Dokmanovic M, Clarke C, Marks PA. 2007. Histone Deacetylase Inhibitors: Overview and Perspectives. Molecular Cancer Research 5 (10): 981–9. doi:10.1158/1541-7786.MCR-07-0324. PMID 17951399. Evelyn CP. 2006. Anatomi dan Fisiologi Untuk Paramedis,Terjemahan: Sri Yuliani Handoyo. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta. Hlm. 207. Fritsche L, Weigert C, Haring HU, dan Lehmann R. 2008. How Insulin Receptor Substrate Protein Regulate the Metabolic Capacity of the Liver – Implication for Health and Disease.Current Medicinal Chem 15:1316-1329. GilmanAlfred Goodman. 2008. Dasar Farmakologi Terapi. Edisi X. Buku Kedokteran EGC. Jakarta. hlm. 506, 521-522. Gottlicher M, Minucci S, Zhu P, Kramer OH, Schimpf A, Giavara S,Sleeman JP, Coco FL, Nervi C, Pelicci PG, dan Heinzel T. 2001. Valproic acid defines a novel class of HDAC inhibitors inducing differentiation of transformed cells,The EMBO Journal. 20(24): 6969-6978. Gray, SGdan De Meyts P.2005.Role of histone and transcription factor acetylation in diabetes pathogenesis. Diabetes Metab. Res. Rev.21: 416–433. doi: 10.1002/dmrr.559. Hogan B, Beddington R, Costantini F, Lacy E. 1994.Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual. Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA. Holt RIG and Hanley A. 2007. Essenstial Endrocrinology and Diabetes. 5th edition Massachussets : Blackwell Publishing. 216-263. Jorgensen MC, Ahnfelt RJ, Hald J, Madsen OD,Serup P, and Hecksher-Sorensen J.2007.An Illustrated Review of Early Pancreas Development in the Mouse.Endocrine Reviews, The Endocrine Society.28 (6):685-705. Kahn SE, Hull RL, Utzschneider KM. 2006. Mechanism Linking Obesity to Insulin Resistance and Type 2 Diabetes.Nature. 444(14):840-846. Katzung BG. 2002.Farmakologi Dasar dan Klinik. Edisi I. Terjemahan: Staf Dosen Farmakologi FK UNAIR. Buku Kedokteran EGC. Jakarta. hlm. 111-112.

49 Kuwabara T. Kagalwala M, Akizuki S, Warashina M, Sanosaka T, Nakashima K, Gage FH, Asashima M. 2011.Insulin Biosynthesis in Neuronal Progenitors Derived from Adult Hippocampus and The OlfactoryBulb, EMBO Mol Med, 3:742-754. Lampen A, Carlberg C, Nau H. 2001. Peroxisome Proliferator-Activated Receptor δ Is A Specific Sensor for Teratogenic Valproic Acid Derivatives, European Journal of Pharmacology. 431: 25-33. Larsen LM, Tonnesen SG, Storling RJ, Jorgensen S, Mascagni P, Dinarcello CA, Billestrup N, Poulsen TM. 2007. Inhibition of Histone Deacetylases Prevents Cytokine-induced Toxicity in Beta Cells, Dibetolgia. 50:779-789. Lewis EC, Blaabjerg L, Starling J, Ronn SG, Mascagni P, Dinarello CA and MandrupPoulsen T. 2011. The Oral Histone Deacetylase Inhibitor ITF2357 Reduces Cytokines and Protects Islet β Cells in Vivo and In Vitro, Mol Med 17(56):369-377. Lienhard GE, Slout JW,James DE,Mueckler M. 2002. How Cells Absord Glucose. J.of Scientific American.3:235-238. Loomis TA. 1989. Toksikologi Dasar.Edisi III. Terjemahan: Drs Imono A Donatus. IKIP Press. Semarang. Hlm. 242-243. Marks DB, Marks AD, Smith CM. 2000.Basic Medical Biochemistry : A Clinical Approach, William and Wilkins. 381-578. Nugroho AE. 2006. Animal Models Of Diabetes Mellitus : Pathology And Mechanism Of Some Diabetogenics, Biodiversitas. 7(4):378-382. Peraza MA, Burdick AD, Marin HE, Gonzales FJ, and Peters JM. 2006. The Toxicology of Ligands for Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPAR), Toxicological Sciences. 90(2): 269–295. Rees D and Alcolado J (2005). Animal models of diabetes mellitus. Diabet Med22, 359-370. Riedel MJ, Asadi A, Wang R, Ao Z, Warnock GL, Kieffer TJ. 2012. Immunohistochemical Caharacterisation of Cells Co-producing Insulin and Glucagon in The Developing Human Pancreas, Diabetolgia. 55:372-381. Rohen JW. 2003.Embriologi Fungsional : Perkembangan Sistem Fungsi Organ Manusia, Edisi 2, terjemahan : Harjadi Widjaja, Penerbit Buku Kedokteran EGC, hlm 95-99. Sacks DB, Arnold M, Bakris GL, Bruns DE. 2011.Guidelines and Recommendations for Laboratory Analysis in theDiagnosis and Management of Diabetes Mellitus, , Diabetes Care, volume 34. Sadler. 2000. Malformasi Konginetaldalam Embriologi Kedokteran Langman. Edisi VII. EGC. Jakarta. hlm 122. Soegondo S, Soewondo P, Subekti I. 2002. Penatalaksanaan Diabetes Melitus Terpadu. Jakarta : Pusat Diabetes dan Lipid. Szkudelski T. 2001.The Mechanism of Alloxan and Streptozotocin Action in B Cells of the Rat Pancreas, Physiol. Res. 50: 536-546. Thiagalingam SAM, Cheng KH, Lee HJ, Mineva N, Arunthathi, Ponte JF. 2003. Histone Deacetylases: Unique Players in Shaping the Epigenetic Histone Code. Annals of the New York Academy of Sciences 983: 84–100. doi:10.1111/j.1749-6632.2003.tb05964.x. PMID 12724214.

50 Thorel F, Ne’pote V, Avril I, Kohno K, Desgraz R, Chera S, Harera PL. 2010. Conversion of adult pancreatic α-cells to β-cells after extreme b-cell loss, Natutre, 464. doi : 1038/nature08894. Underwood JCE. 1999. Patologi Umum dan Sistematik. Edisi II. Buku Kedokteran EGC. Jakarta. Hlm. 536-539. Vogel WH, Scholkens BA, Sandows J, Muller G, Vogel WFD. 2002. Drug Discovery and Evaluation : Pharmacological Assays. Berlin : Springer. Werling U, Siehler S, Litfin M, Nau H, Gottlicher M. 2001.Induction of Differentiation in F9 Cells and Activation of Peroxisome ProliferatorActivated Receptor δ by Valproic Acid and its Teratogenic Derivatives, Mol Pharmacol. 59: 1269-1276.

51 Lampiran 1 Skema kerja penelitian

Tikus betina dan jantan Time Mating

Umur kebuntingan

T9

T11 Hari ke-9

Diberi asam valproat

Tikus F1 Umur 8 minggu

T18 Hari ke-11

Hari ke-18

250 mg/kg BB per oral

Tikus F1 Tikus F1 Umur 16 minggu Umur 24 minggu

-

Kadar Glukosa Darah Kadar Insulin Darah Kadar Trigliserida Darah

Immunohistokimia - Sel β - Sel α

52 Lampiran 2 Kadar glukosa darah tikus F1 umur 8 minggu

Kelompok Normal

Tikus 1 2 3 rerata

Glukosa (mg/dL) 79 70 75 74.666+4,509

T9

1 2 3 rerata

72 74 69 71.666+2,516

T11

1 2 3 rerata

106 90 91 95.666+8,962*

T18

1 89 2 103 3 105 rerata 99+8,717* *Angka yang diberi tanda menunjukkan perbedaan yang signifikan p<0.05 (uji anova satu arah). N T 9 T 11 T 18

: Kelompok kontrol normal : Kelompok tikus F1 yang diberi asam valproat pada masa embrional hari ke-9. : Kelompok tikus F1 yang diberi asam valproat pada masa embrional hari ke-11. : Kelompok tikus F1 yang diberi asam valproat pada masa embrional hari ke-18.

53

Absorban (450 nm)

Lampiran 3Kurva standart konsentrasi insulin.

2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

y = 1.1379x + 0.1533 R² = 0.9663

0

0.5

1

1.5

Konsentrasi Insulin (ng/ml)

Keterangan : Persamaan regresi linear y = 1,1379x + 0,1533

2

54 Lampiran 4 Data parameter darah tikus F1 umur 16 minggu Glukosa Insulin Tikus (mg/dL) Trigliserida(mg/dL) (ng/dL) 1 62.559 8.05 0.175 2 80.103 17.742 0.04 3 76.303 9.677 0.088 N rerata 72.988 11.823 0.101 SD 9.229 5.190 0.068 1 79.147 9.677 0.062 2 78.673 9.677 0.991 T9 3 100.081 43.548 0.449 rerata 85.967* 20.967* 0.500* SD 12.225 19.555 0.466 1 102.844 87.097 0.168 2 86.507 27.419 0.151 3 81.517 19.355 0.134 T11 rerata 90.289* 44.623* 0.151 SD 11.155 37.003 0.017 1 92.611 64.5126 0.025 2 96.716 43.548 0.169 3 105.142 41.935 0.004 T18 rerata 98.156* 49.998* 0.066* SD 6.388 12.595 0.089 *Angka dengan tanda menunjukkan perbedaan yang signifikan (p<0.05) dibanding dengan kontrol normal. N : Kelompok kontrol normal T 9 : Kelompok tikus F1 yang diberi asam valproat pada masa embrional hari ke-9. T 11 : Kelompok tikus F1 yang diberi asam valproat pada masa embrional hari ke-11. T 18 : Kelompok tikus F1 yang diberi asam valproat pada masa embrional hari ke-18. Kelompok

55 Lampiran 5Data parameter darah tikus F1 umur 24 minggu

Glukosa Trigliserida Insulin Tikus (mg/dL) (mg/dL) (ng/dL) 1 73.934 48.387 0.249 2 76.635 124.194 0.433 3 56.919 61.29 0.066 N rerata 69.162 77.957 0.249 SD 10.688 40.558 0.183 1 97.156 50 0.164 2 105.213 58.065 1.359 3 90.19 117.742 0.762 T9 rerata 97.519* 75.269 0.761* SD 7.518 37.003 0.597 1 95.261 83.871 0.81 2 73.564 83.871 0.622 3 99.052 80.645 0.434 T11 rerata 89.292* 82.795 0.622* SD 13.752 1.862 0.188 1 68.929 98.387 0.075 2 77.829 100 0.06 3 93.839 69.355 0.091 T18 rerata 80.199* 89.247 0.075* SD 12.622 17.246 0.015 *Angka dengan tanda menunjukkan perbedaan yang signifikan (p<0.05) dibanding dengan kontrol normal. N : Kelompok kontrol normal T 9 : Kelompok tikus F1 yang diberi asam valproat pada masa embrional hari ke-9 T 11 : Kelompok tikus F1 yang diberi asam valproat pada masa embrional hari ke-11 T 18 : Kelompok tikus F1 yang diberi asam valproat pada masa embrional hari ke-18 Kelompok

56 Lampiran 6Jumlah pulau Langerhans dalam lapangpandang perbesaran 4x

Kelompok

Rata-rata Jumlah Pulau Langerhans (dalam satu lapang pandang)

1

N

5

2

T9

2

3

T11

3

4

T18

4

N : Kelompok kontrol normal T 9 : Kelompok tikus F1 yang diberi asam valproat pada masa embrional hari ke-9 T 11 : Kelompok tikus F1 yang diberi asam valproat pada masa embrional hari ke-11 T 18 : Kelompok tikus F1 yang diberi asam valproat pada masa embrional hari ke-18

57 Lampiran 7Populasi pulau Langerhans pankreas tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat

Gambar 6 Populasi pulau Langerhans pankreas tikus F1 dari induk yang diberi asam valproat dengan perbesaran 4x. A :Kelompok kontrol normal B : Kelompok tikus F1 yang diberi asam valproat pada masa embrional hari ke-9 C : Kelompok tikus F1 yang diberi asam valproat pada masa embrional hari ke-11 D : Kelompok tikus F1 yang diberi asam valproat pada masa embrional hari ke-18

58 Lampiran 8. Protokol Penelitian

Protokol Penelitian Protokol penelitian yang digunakan sudah mendapat pengesahan dari Komite Etik Hewan Fakultas Kedokteran Hewan IPB dengan mengacu protokol penanganan hewan pada penelitian internasional. Hewan percobaan pada penelitian ini menggunakan tikus betina Sprague Dawley(Rattus novergicus L) dengan umur 3-4 bulan dengan bobot badan 200-300 gram. Penelitian ini dimulai dengan penyiapan tikus betina untuk dikawinkan. Tikus betina yang estrus dipasangkan dengan tikus jantan dalam satu kandang untuk mendapatkan waktu yang tepat terjadinya perkawinan. Setelah perkawinan diidentifikasi vaginal plug untuk melihat adanya sperma. Ketika sperma dapat diidentifikasi dalam vaginal plug, hari berikutnya ditetapkan sebagai hari pertama kebuntingan (embrional hari ke-1). Induk tikus bunting dikelompokkan menjadi 4 kelompok untuk pemberian asam valproat, yaitu Kelompok kontrol normal (N) yang tidak diberi asam valproat, kelompok T9 yang diberi asam valproat pada kebuntingan hari ke-9, kelompok T11 yang diberi asam valproat pada kebuntingan hari ke-11, dan kelompok T18 yang diberi asam valproat pada kebuntingan hari ke-18. Asam Valproat diberikan dengan dosis 250 mg/kg BB secara oral. Periode penelitian berikutnya adalah pemeliharaan induk tikus bunting dengan pemberian pakan standar dan air minum ad libitum. Setelah induk tikus melahirkan anaknya (tikus F1), tikus F1 dipelihara oleh induknya sampai lepas sapih dan dipelihara sampai dewasa hingga umur yang ditetapkan untuk dilakukan pengamatan. Perkembangan sel endokirin pankreas tikus F1 dievaluasi dengan mengukur kadar glukosa pada umur 8, 16, dan 24 minggu, dan mengukur konsentrasi insulin pada umur 16 dan 24 minggu. Kondisi sel β pankreas dievaluasi dengan teknik immunohistokimia pada umur 8 dan 16 minggu dan sel α pankreas dievaluasi pada umur 16 minggu. Pengambilan darah dan jaringan pankreas dilakukan setelah tikus dianestesi dengan ketamin (5mg/100g BB) dan Xylazin (1 mg/100g BB) secara intra peritoneal. Setelah teranestesi sampel darah diambil dari jantung menggunakan syring 3 mL kemudian diambil serumnya untuk pengukuran kadar glukosa darah, kadar trigliserida darah dan konsentrasi insulin darah. Jaringan pankreas diisolasi dan dicuci dengan cairan fisiologis NaCl 0,9% dan direndam dalam paraformaldehid 4% untuk dievaluasi dengan pewarnaan immunohistokimia. Pengukuran Kadar Glukosa Darah Kadar glukosa darah diukur menggunakan metode enzimatik kolorimetri dengan memakai Glucose kits based/GOD-PAP (Human, Germany), dengan prinsip oksidasi glukosa. Dengan adanya oksigen, glukosa dioksidasi oleh enzim untuk membentuk asam glukoronat dan hydrogen peroksida. Dengan enzim peroksidase, hidrogen peroksida akan melepaskan oksigen untuk mengoksidasi kromogen. Dengan demikian terbentuk senyawa yang berwarna yang dapat dikorelasikan dengan konsentrasi glukosa sampel. Oksidasi glukosa deangan enzim relatif spesifik.

59 Absorbansi senyawa yang terbentuk diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 546 nm. Untuk pengukuran konsentrasi serum glukosa dengan mereaksikan 10 μL larutan standar glukosa (100 mg/dL) dan sampel serum dengan 1000 μL reagen kit glukosa (Human, Germany), diinkubasi selama 10 menit pada temperatur ruang. Absorbansi standar dan sampel serum diukur dengan spektrofotometer ( Hitachi U2001) pada panjang gelombang 546 nm. Sampel serum kadar glukosanya dapat dikalkulasi dengan nilai absorbansi standar dan dikalikan 100 mg/dL. Pengukuran Kadar Trigliserida Serum Pengukuran kadar triglserida serum dengan metode enzimatik menggunakan GPO-PAP dengan Lipid Clearing Faktor (LCF) (Human, Germany). Kadar trigliserida serum diukur dengan mereaksikan 10 mL larutan trigliserida dan sampel serum dengan reagen kit trigliserida dan diinkubasi selama 10 menit pada temperatur kamar. Nilai absorbansi standar dan sampel serum diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 546 nm. Konsentrasi trigliserida pada sampel dapat dihitung dengan membandingkan absorbansinya dengan larutan standar dan dikalikan 200 mg/dL. Pengukuran Konsentrasi Insulin Serum Pengukuran konsentrasi insulin serum dengan metode ELISA dimana prosedur dan protokol mengikuti petunjuk produk (kit Ultrasensitive Rat Insulin Immunoassay, Antinbody and Immunoassay Service, Hong Kong). Pengukurannya menggunakan ELISA two-site. Mikro plat akan dilapisi dengan antibodi insulin monoklonal. Standar dan sampel ditambahkan pada wells dan di ko-inkubasi dengan antibodi konjugasi monoklonal mengunakan horseradish peroksidase (HRP enzim). Standar dan sampel dimasukkan kedalam wells dan diinkubasi dengan antibodi konjugasi monoklonal dengan enzim horseradish peroksida (HRP ). Setelah fase pencucian, larutan substrat ditambahkan dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu kamar. Setelah inkubasi larutan stop ditambahkan dalam wells. Nilai absorbansi sampel didapatkan dengan menggunakan micro plate reader (Benchmark) dengan panjang gelombang 450 nm. Absorbansi konsentrasi insulin dapat diukur dengan absorbansi sampel dengan kurva standar insulin. Pengamatan MIkroskopik Jaringan pankreas dipotong dengan ukuran + 0,5 cm2 dan menggunakan tissue basket untuk dehidrasi dengan alkohol 70%, 80%, 90%, 95% dan alkohol absolut. Kemudian jaringan dibersihkan dalam xylol. Proses infiltrasi paraffin dilakukan dalam inkubator pada temperatur yang stabil. Proses embedding dilakukan menggunakan embedding tissue processor dan terbentuknya blok paraffin yang siap untuk dipotong.

60 Pemotongan dan penempelan ( Sectioning and Affixing ) Pemotongan blok paraffin dilakukan dengan menggunakan mikrotom rotary dengan ketebalan 4-5 μm dan penempelan pada objek glass kemudian pengeringan dengan hot plate. Jaringan pada tissue slide siap untuk pewarnaan. Immunostaining pada Pulau Langerhans Pankreas Pengamatan pada sel yang mensekresikan insulin dan sel yang mensekresikan glukagon menggunakan pewarnaan immunohistokimia dengan antibodi anti-insulin dan anti-glukagon. Dengan visualisasi menggunakan kromogen DAB, yang akan memberikan warna cokelat untuk yang positif sel endokrin yaitu sel β dan α. Proses pewarnaan dimulai dengan deparafinisasi dari tissue slide dan rehidrasi serta pencucian dengan PBS. Pewarnaan insulin dimulai dari dengan peroksidase endogen menggunakan larutan peroksida (H202) 1% dalam metanol dengan suasana gelap, selanjutnya dicuci dengan PBS 2 kali selama 10 menit. Kemudian dilanjutkan dengan inkubasi serum normal selama 45 menit dan dicuci dengan PBS 3 kali. Diberikan larutan antibodi primer (insulin atau glukagon) konsentrasi 1:1000 dan diinkubasi pada suhu 4oC selama semalam. Setelah itu slide dicuci dengan PBS 3 kali dan dinkubasi dengan antibodi sekunder DEPS (Dako Envision Peroxidase System)pada temperature kamar selama 45 menit. Kemudian dicuci dengan PBS 3 kali, setelah itu divisualisasi dengan DAB dan dicuci dengan aquabidest (stoping point). Pengamatan menggunakan mikroskop cahaya yang dilengkapi kamera.

61

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 25 Juni 1972 sebagai anak bungsu dari lima bersaudara pasangan Sumardi Hardjo dan Siti Yaparni (alm). Pendidikan sarjana ditempuh di Jurusan Farmasi, Fakultas MIPA Universitas Indonesia, lulus pada tahun 1996. Pada tahun 2001, penulis diterima di Departemen Farmasi bidang khusus Farmakologi dan Toksikologi Program Pascasarjana Institut Teknologi Bandung (ITB) dan menamatkannya pada tahun 2004. Kesempatan untuk melanjutkan ke program doktor pada Program Studi Ilmu-ilmu Faal dan Khasiat Obat (IFO) Departemen Anatomi Fisiologi dan Farmakologi FKH Sekolah Pascasarjana IPB diperoleh pada tahun 2009. Beasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh dari Dikti Kementrian Pendidikan dan Kebudayaan Republik Indonesia. Penulis bekerja sebagai Dosen di Fakultas Farmasi dan Sains Universitas Muhammadiyah Prof. Dr. HAMKA sejak tahun 2000. Mengajar mata kuliah farmakologi, diamanahkan sebagai Ketua Program Studi Farmasi dari tahun 20052012, dan pada tahun 2013 diamanahkan sebagai Wakil Dekan I bidang akademik.Selama mengikuti pendidikan S-3 penulis tetap menjalankan tugas mengajar sebagai dosen, juga sebagai ketua peneliti di Farmasi UHAMKA pada penelitian hibah bersaing yang didanai dikti selama 2 tahun. Selama mengikuti program S-3, penulis menjadi anggota Ikatan Apoteker Indonesia dan anggota Asosiasi Pendidikan Tinggi Farmasi Indonesia (APTFI). Sebuah artikel akan diterbitkan dengan judul Perkembangan Anak Tikus (F1) Asal Induk Penerima Asam Valproat sebagai Model Diabetes Mellitus pada Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia (JIFI) Volume 12 No.2, Edisi September 2014. Artikel lain berjudul Inhibition of Pancreatic Β Cells Development in Rats Born of Mother Administered Valproic Acid on Day 11 or 18 of Pregnancy akan diterbitkan pada jurnal International Journal of Pharmacology sedang dalam external evaluation manuscript no 65652-IJP-ANSI tahun 2014. Karya-karya ilmiah tersebut merupakan bagian dari program S-3 penulis.