JUDUL PATOBIOLOGI HIPERGLIKEMIA PADA JARINGAN PANKREAS TIKUS

LAPORAN AKHIR PENELITIAN FUNDAMENTAL

JUDUL PATOBIOLOGI HIPERGLIKEMIA PADA JARINGAN PANKREAS TIKUS

Tahun ke 1 dari rencana 1 tahun

KETUA/ANGGOTA TIM

Prof. Dr. Drh. Iwan H. Utama, MS NIDN. 0006046109 Drh. I Made Kardena, MVS NIDN. 0010037902

Dibiaya dari Dana RM Universitas Udayana dengan surat Perjanjian Penugasan Penelitian No:175.59/UN14.2/ PNL.01.03.00/2013, Tanggal 16 Mei 2013

UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR-BALI Oktober, 2013 1

IIALAMAN PENGESAHAN Judul

:

Patobiologi Hiperglikemia pada Jaringan pankreas Tilars

Nama Lengkap

:

Prof Dr. drh. Iwan H. Utama, MS

NIDN

: 0006046109

Jabatan Fungsional

:

Program Studi

: Kedokteran Hewan

No. HP

: 081337755860

Alamat surel

: iwarihu2006@gnail. com

Peneliti/Pelaksana

Guu Besar

A-nggota ( 1)

Nama Lekap

: Drh. I Made Kardena,

NIDN

: 00i0037902

Perguruan Tinggi

: Universitas Udayana

Tahrur Pelaksanaan

:2013

Biaya TahuB e4'alan

: Rp. 48.020.000

Biaya Keseluruhan

:

MVS

Rp.48.020.000

Mengetahui

Denpasar, 30 Oktober 2013 Ketua Peneliti

f

Dr. drh. Iwan H. Utama, MS) NIPNTP 19610406198903 1 002

hfi?.'s,i:

RINGKASAN Pada kondisi hiperglikemia kronis, sebenarnya sel mengalami keracunan glukosa (toksisitas glukosa). Paparan kronis hiperglikemia dapat menyebabkan disfungsi seluler yang menetap atau dapat menjadi ireversibel, proses ini yang disebut toksisitas glukosa. Toksisitas glukosa merupakan awal mekanisme kerusakan sel melalui pembentukan radikal bebas atau spesies oksigen reaktif (ROS=reactive oxygen species) (Robertson, 2004). Produksi radikal bebas yang berlebihan, seperti hidrogen peroksida, superoksida anion, dan hidroksil dapat merusak komponen membran sel diantaranya lipid dan protein membran sel. Telah dilakukan penelitian mengenai patobiologis hiperglikemia pada jaringan pankreas tikus. Tujuanya adalah untuk mengetahui patobiologis jaringan pankreas tikus akibat hiperglikemia, yang meliputi kadar malonaldehida (MDA) pada pankreas, profil sel beta pankreas, dan gambaran histopatologi jaringan pankreas. Sebanyak 20 ekor tikus jantan putih strain Spraque dawley umur sekitar 2 bulan dengan bobot badan rata-rata 200 g digunakan dalam penelitian ini. Tikus percobaan dibagi menjadi 2 kelompok perlakuan, tiap perlakuan terdiri dari 10 ekor tikus. Tikus perlakuan kontrol dan Tikus perlakuan hiperglikemia (HG) diberikan larutan sukrosa 80% (w/v) secara oral dua kali sehari selama 2 bulan. Pengamatan dilakukan terhadap (1) analisis kadar glukosa darah dengan metode glucose oxidase biosensor menggunakan alat Blood glucose Test Meter GlucoDr™, (2) analisis kadar malonaldehida menggunakan metode spektrofotometri, (3) analisis sel beta pankreas secara imunohistokimia, dan (4) gambaran histopalogi pankreas tikus menggunakan pewarnaan Hematoksilin Eosin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tikus percobaan mengalami hiperglikemia selama 1 bulan dengan kadar glukosa akhir sebesar 139,5±5,2 mg/dl sedangkan kadar glukosa kelompok perlakuan kontrol rata-rata sebesar 97,8±4,3 mg/dl. Hiperglikemia menyebabkan terjadinya perubahan kondisi patobiologis pada jaringan pankreas, yaitu meningkatnya kadar malonaldehida (MDA) rata-rata 31,85 ± 5,69 picomol/g dan kelompok kontrol rata-rata 22,94 ± 3,82 picomol/g. Pada jaringan pankreas tikus yang mengalami hiperglikemia juga ditemukan degenerasi ringan, dan secara kualitatif terdapat penurunan massa sel beta. Kata-kata kunci: pankreas, hiperglikemia, malonaldehida, sel beta

3

PRAKATA Hiperglikemia adalah suatu keadaan dimana kadar glukosa darah melebihi kadar glukosa darah normal di dalam tubuh. Hiperglikemia dapat mendorong produksi radikal bebas yang berlebihan melalui proses posporilasi oksidatif glukosa. Radikal bebas yang berlebihan dapat menyebabkan kerusakan membran sel, tidak terkecuali sel jaringan pankreas. Selain itu, hiperglikemia kronis juga menyebabkan sel beta mengalami kelelahan karena harus mengsilkan hormone insulin. Kondisi kelelahan ini juga mempercepat kerusakan sel beta. Penelitian dengan judul: Patobiologi Hiperglikemia pada Jaringan Pankreas tikus, tahun 2013 telah selesai dilakukan. Subyek yang diteliti meliputi kadar malonaldehida (MDA) pada pankreas, profil sel beta pankreas, dan gambaran histopatologi jaringan pankreas. Bersama dengan telah selesainya penelitian ini, kami tim peneliti mengucapkan banyak terimakasih yang sebesar-besarnya kepada: 1. Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan Nasional dan Rektor Univesitas Udayana yang telah memberikan biaya penelitian dari Dana RM Universitas Udayana dengan surat Perjanjian Penugasan Penelitian No:175.59/UN14.2/ PNL.01.03.00/2013, Tanggal 16 Mei 2013. 2. Ketua Lembaga Penelitian Universitas Udayana, atas pengajuan dan pegesahan proposal ini. 3. Dekan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana, atas ijin dan kepercayaan untuk melakukan penelitian. 4. Kepada semua tenaga laboran yang telah membantu penelitian ini saya ucapkan banyak terimakasih. Semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat bagi temen sejawat yang berkecimpung mendalami hiiperglikemia dan juga bermanfaat dalam mengembangkan ilmu pengetahuan. Denpasar, 30 Oktober 2013 Tim Peneliti

4

DAFTAR ISI Halaman RINGKASAN ………………………………………………………………………

3

PRAKATA …………………………………………………………………………

4

DAFTAR ISI ………………………………………………………………………

5

DAFTAR TABEL …………………………………………………………………

6

DAFTAR GAMBAR ………………………………………………………………

6

DAFTAR LAMPIRAN ……………………………………………………………

6

BAB 1. PENDAHULUAN ………………………………………………………...

7

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ………………………………………………….

9

BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN …………………………….

12

BAB 4. METODE PENELITIAN …………………………………………………

13

BAB 5. HASIL DAN PEMBAHASAN ……………………………………………

16

BAB 6. KESIMPULAN DAN SARAN …………………………………………..

21

DAFTAR PUSTAKA ………………………………………………………………

22

LAMPIRAN ………………………………………………………………………...

24

5

DAFTAR TABEL Nomor

Teks

1. Kadar glukosa darah (mg/dl) tikus selama 8 minggu percobaan …………. 2. Rata-rata kadar malonaldehida (MDA) pada pankreas tikus percobaan …….

Halaman 17 18

DAFTAR GAMBAR Nomor

Teks

Halaman

1. Radikal bebas yang dihasilkan melalui jalur metabolisme glukosa pada kondisi hiperglikemia ……………………………………………………….

10

2. Profil kadar glukosa darah tikus selama 8 minggu percobaan …………….

16

3. Kadar Malonaldehida (MDA) pada pankreas tikus selama percobaan ……

18

4. Foto mikrograf pewarnaan imunohistokimia terhadap insulin pada sel beta jaringan pankreas …………………………………………….. ……………. 5. Foto mikrograf pulau Langerhans pankreas tikus pewarnaan HE ……….

19 20

DAFTAR LAMPIRAN Nomor

Teks

Halaman

1. Biodata Personalia Tenaga peneliti …………………………………..

24

2. Draft Artikel Ilmiah …………………………………………………..

31

6

BAB 1. PENDAHULUAN

Manusia dan juga hewan tidak luput dari keadaan stres oksidatif dengan tingkat keparahan dan penyebab berbeda dan dapat menghasilkan jumlah radikal bebas dalam tubuh melebihi jumlah antioksidan endogen. Pada kondisi stres oksidatif dapat terjadi kerusakan sel akibat radikal bebas bila kemampuan mekanisme pertahanan tubuh seperti enzim antioksidan seluler menurun. Oleh karena itu perlu dilakukan usaha-usaha dalam mencegah terjadinya stres oksidatif atau mencegah pencetus terbentuknya radikal bebas di dalam tubuh yang berlebihan, misalnya mencegah supaya tidak terjadi kondisi hiperglikemia kronis. Kebanyakan populasi di belahan dunia, termasuk di Indonesia mengkonsumsi karbohidrat dalam jumlah tinggi. Disadari atau tidak bahwa sedari kecil kita telah terpapar dengan karbohidrat melalui menu makan yang dihidangkan sehari-hari, bahkan terasa belum komplit apabila menu kita tidak mengandung glukosa (gula). Kelebihan karbohidrat (glukosa) di dalam tubuh yang sering disebut dengan hiperglikemia merupakan titik awal terjadinya pembentukan radikal bebas melalui berbagai mekanisme metabolisme biokimiawi (Robertson, 2004). Stres oksidatif adalah suatu kondisi yang berhubungan dengan peningkatan kecepatan kerusakan sel akibat radikal bebas. Hal ini disebabkan oleh ketidak seimbangan antara pembentukan radial bebas dan aktivitas pertahanan antioksidan. Kondisi yang berhubungan dengan peningkatan produksi radikal bebas meliputi berbagai proses kimia kompleks dalam tubuh yang melibatkan aktivitas organel mitokondria terutama dalam menghasilkan ATP (Newsholme et al., 2007). Pada keadaan glukotoksisiti (Robertson et al., 2004), proses pagositosis dalam sistim imun, infeksi, dan inflamasi (Freisleben, 2001), serta terpapar dengan bahan kimia dan zat diabetogenik (Szkuldelski 2001) menyebabkan terbentuknya radikal bebas yang tinggi di dalam tubuh . Karbohidrat tidak saja penting dalam makanan manusia sebagai sumber energi, tetapi karena bahan pangan berkarbohidrat tinggi berlimpah dan murah bila dibandingkan dengan protein dan lemak. Oleh karena itu, karbohidrat menjadi bagian utama makanan di hampir semua bagian di dunia.

Studi epidemiologi menunjukkan ada kaitan erat antara status

kesehatan dan usia harapan hidup manusia dengan pola konsumsinya. Masyarakat di daerah yang banyak mengkonsumsi gula, lemak dan garam misalnya, ternyata lebih banyak ditemukan sebagai penderita penyakit degeneratif.

7

Pemberian jumlah karbohidrat yang berlebih dalam jangka waktu lama dapat menimbulkan apa yang disebut dengan hiperglikemia. Hiperglikemia kronis cenderung menimbulkan efek yang tidak baik bagi kesehatan tubuh. Hiperglikemia kronis cenderung mendorong terbentuknya radikal bebas yang dapat merusak komponen sel (lipid, karbohidrat, protein, dan DNA) (Robertson, 2004). Kerusakan oksidatif tersebut merupakan cikal bakal munculnya penyakit degeneratif, misalnya seperti diabetes. Pada kondisi hiperglikemia, sel beta pankreas akan merespon dengan cara mengeluarkan insulin. Insulin berfungsi untuk menurunkan kadar glukosa darah melalui mekanisme memasukan glukosa ke dalam sel untuk selanjutnya mengalami metabolisme (Dominiczak, 2005). Jika kejadian hiperglikemia berlangsung lama (kronis), maka sel beta secara terus menerus menghasilkan insulin. Kondisi ini dapat menyebabkan sel beta mengalami kelelahan bahkan kerusakan sehingga produksi insulin bisa jadi berkurang. Dilain pihak, pada keadaan hiperglikemia, glukosa akan cenderung mengalami metabolisme kearah pembentukan radikal bebas (Robertson, 2004). Radikal bebas yang terbentuk akan bereaksi dengan komponen membran sel. Reaksi berantai

radikal bebas tersebut menyebabkan

kerusakan pada membran sel. Kondisi hiperglikemia tersebut akan menyebabkan perubahan patobiologi pada pankreas sehingga perlu dilakukan pengamatan terhadap kadar MDA pankreas, sel beta pankreas, gambaran histopatologi pankreas serta kerusakan DNA melalui analisis 8-hidroksi2-deoksiguanosin pada plasma. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui patobiologis hiperglikemia terhadap jaringan pankreas tikus, yang meliputi kadar malonaldehida (MDA) pada pankreas, profil sel beta pankreas, dan gambaran histopatologi jaringan pankreas. Temuan yang ditargetkan/luaran, yaitu publikasi ilmiah dijurnal ilmiah nasional terakreditasi, dan serangkaian pengetahuan dasar (basic knowledge) tentang pengaruh hiperglikemia terhadap pankreas akan sangat bermanfaat dalam penyiapan bahan ajar mata kuliah Biokimia II, khususnya materi metabolisme karbohidrat.

8

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA Kemajuan pengetahuan di bidang biokimia, biologi molekuler, imunohistokimia dan patologi telah mendukung hipotesis bahwa radikal bebas berperan dalam perubahan berbagai fungsi tubuh sehingga berpengaruh terhadap resiko timbulnya penyakit. Dengan pengetahuan ini telah banyak dihasilkan temuan-temuan bahan hayati yang sangat berguna dalam usaha pencegahan maupun pengobatan penyakit non-infeksius, stres oksidatif,

dan penyakit

degeneratif seperti diabetes, aterosklerosis. Penyakit diabetes merupakan sindroma multifaktor yang secara metabolik dikarakterisasi dengan kondisi hiperglikemia kronis yang timbul akibat ketidakmampuan pankreas memproduksi insulin yang cukup atau ketidakmampuan tubuh menggunakan insulin secara efektif (Auroma et al. 2006). Faktor penyebab penyakit diabetes meliputi faktor genetik, obesitas, radikal bebas, sistem kekebalan (Virtanen dan Knip 2003). Hiperglikemia bisa dibuat dengan diet tinggi karbohidrat untuk waktu yang lama, pankreatomi (pengangkatan pankreas) atau pemberian agen diabetogenik seperti aloksan dan streptozotocin (Szkudelski, 2001). Dalam keadaan normal diet karbohidrat menyebabkan kenaikan kadar glukosa darah yang selanjutnya akan merangsang sekresi insulin dari sel β pulau Langerhans pankreas. Diet karbohidrat yang lama akan menyebabkan kelelahan sel β pankreas yang berakibat rusaknya sel β tersebut sehingga akan terjadi hiperglikemia. Hiperglikemia kronis dapat mendorong produksi radikal bebas yang berlebihan dari proses posporilasi oksidatif glukosa. Menurut Robertson (2004), dalam keadaan hipergikemia akan terjadi pembentukan radikal oksigen spesies (ROS) arau radikal bebas yang berlebihan. Beberapa jalur metabolisme biokimia yang terlibat dalam mekanisme pembentukan ROS, diantaranya (1) autooksidasi glukosa, (2) pembentukan dikarbonil dan glikation, (3) aktivasi protein kinase C (PKC activation), (4) metabolisme sorbitol, (5) metabolisme heksosamin dan (6) posporilasi oksidatif. Pembentukan radikal bebas yang belebihan pada keadaan hiperglikemia dapat memicu penurunan kandungan enzim antioksidan dan kerusakan jaringan pada pankreas. Hal inilah yang dapat menyebabkan terjadinya salah penyakit degeneratif yaitu diabetes. Kondisi hiperglikemia kronis dan jalur biokimia metabolisme

glukosa sampai

menghasilkan ROS diperlihatkan pada Gambar 1.

9

Hiperglikemia kronis

ROS

stres oksidatif

Enzim antioksidan -SOD -Glutation peroksidase -Katalase

Disfungsi sel beta Gambar 1. Radikal bebas yang dihasilkan melalui jalur metabolisme glukosa pada kondisi hiperglikemia (Robertson, 2004). Percobaan pada tikus menunjukkan pemberian vitamin E pada tikus dalam kondisi hiperglikemia dapat mencegah pembentukan malonaldehida (MDA) tetapi tidak berpengaruh terhadap kadar glukosa darah (Suarsana et al, 2011). Penelitian pada tikus yang diinjeksi dengan streptozotocin dosis 65mg/kg intraperitoneal (IP) menujukkan kadar glukosa darah mencapai 400 mg/dl, dan kadar malonaldehida (MDA) darah 171 nmol/100 ml. Kenaikan kadar MDA juga diiukuti dengan kenaikan kadar enzim superoksida dismutase (SOD) 539 IU/mg Hb dan glutation peroksidase (GPx) 17 IU/mg Hb, dan jumlah sel beta menurun disertai dengan degenerasi (Rasal et al., 2008). Hasil penelitian Kim et al (2006) menunjukkan tikus yang diinduksi dengan zat diabetogenik aloksan menyebabkan kadar glukosa darah meningkat sebesar 507 mg/dl. Selain itu, terjadi kerusakan pada hati yang ditandai dengan meningkatnya ensim GOT, GPT dan LDH masing-masing 288; 161; dan 1167 unit/l. Total kolesterol meningkat sebesar 76 mg/dl dan triasilgliserida sebesar 262 mg/dl. Semua kadar yang disebutkan diatas jauh melebihi kadar normal. Tubuh memiliki sistem pertahanan antioksidan enzimatik maupun non-enzimatik untuk menetralkan pengaruh toksik senyawa radikal bebas. Peran antioksidan ini dapat diartikan sebagai suatu fungsi homeostasis dari organsime untuk menanggulangi akibat-akibat merusak dari stres oksidatif terhadap jaringan dan organ yang terpengaruh (Asikin 2001; Soewoto 2001). Antioksidan enzimatik meliputi superoksidae dismutase (SOD), glutation peroksidase (GPx) dan katalase. Enzim SOD berperan dalam dismutasi radikal anion superoksida menjadi 10

hidrogen peroksida, sedangkan

GPx dan katalase berperan dalam detoksifikasi hidrogen

peroksida menjadi air dan oksigen. Antioksidan non-enzimatik meliputi nutrien seperti vitamin (α-tokoferol, vitamin C, vitamin A), tranferin, laktoferin, seruloplasmin, dan senyawa bioaktif yang tergolong senyawa fitokimia seperti derivat fenol, flavonoid. Sifat reaktif ROS dan berbagai oksidan lainnya dapat berakibat toksik bagi sel dengan perannya memulai rangkaian reaksi peroksidasi lipid menghasilkan berbagai radikal, hidroperoksida, dan aldehida khususnya malonaldehida (MDA) (Luczaj dan Skrzydlewska, 2003). MDA merupakan salah satu produk akhir pada peroksidasi lipid. Kadar MDA akan meningkat pada kondisi tekanan stres oksidatif meningkat, pada berbagai kondisi patologis, dan infeksi sebaliknya kadar MDA akan rendah bila sistim pertahanan antioksidannya baik. Pengukuran kadar peroksidasi lipid digunakan sebagai indikator stres oksidatif pada sel dan jaringan. Peroksidasi lipid bersifat tidak stabil dan terurai menghasilkan sejumlah senyawa termasuk senyawa karbonil yang aktif. Peroksidasi asam lemak tidak jenuh ganda terurai menghasilkan malonaldehid (MDA) dan 4-hidroksialkenal (Tug et al., 2005). Hasil peroksidasi lipid dapat diperiksa dengan berbagai cara, baik tidak langsung seperti pembentukan konjugat MDA dengan asam tiobarbiturat (TBARs) atau langsung dengan HPLC. Pengukuran MDA dianggap mudah dilakukan baik dengan cara spektrofotometri atau fluorometrik (Chonti et al., 1991). MDA juga dapat

ditemukan pada urine pada kondisi dimana terjadi peningkatan

peroksidasi lipid seperti pada keadaan defisiensi vitamin E, kadar ion Fe yang tinggi dan kadar kolesterol atau asam lemak poli tidak jenuh (FUPA) yang tinggi dalam jaringan (Draper et al., 1984). Radikal bebas dapat menyerang protein dan menghasilkan karbonil dan asam-asam amino termodifikasi termasuk metionin sulfoksida dan peroksida protein. Modifikasi protein diprakarsai oleh radikal hidroksil yang utamanya mengoksidasi rantai samping asam-asam amino untuk menghasilkan ikatan silang antara protein dan menyebabkan protein terfragmentasi. Protein mempunyai banyak tempat reaktif yang dapat dirusak selama stres oksidatif, tetapi sangat menarik pada

tiga peristiwa yang dapat diukur (Thomas, 1999).

Pertama, radikal bebas reaktif seperti radikal hidroksil dapat memecah protein di dalam plasma, dan produk pecahannya adalah suatu protein spesifik yang dapat dideteksi. Kedua, protein mengandung sisi ikatan metal yang secara khusus sangat peka terhadap kejadian oksidatif melalui interaksi dengan metal. Reaksi ini umumnya menghasilkan modifikasi produk yang ireversible. Terakhir, banyak protein intraseluler mempunyai gugus sulfidril, 11

reaktif

pada residu sistein spesifik

spesifik

yang dapat dimodifikasi (oksidasi)

menjadi bentuk

(disulfides) yang dapat direduksi kembali melalui proses metabolik. Petanda

kerusakan protein akibat serangkain reaksi tersebut diatas adalah karbonil, 8-deoskiguanosin, thiol, dan protrin oksidai lainnya. Menurut Asikin (2000), analisis 8-hidroksi-2-deoksiguanosin dapat digunakan untuk mengukur produk kerusakan sel akibat stres oskidatif. Senyawa 8-hidroksi-2-deoksiguanosin terbentuk pada proses perbaikan DNA yang mengalami kerusakan akibat proses penuaan, dan penyakit degeneratif. Kadarnya dapat diukur di dalam plasma, serum atau urin dengan teknik ELISA

BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN 3.1. Tujuan Pelitian Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui patobiologis hiperglikemia terhadap jaringan pankreas tikus, yang meliputi kadar malonaldehida (MDA) pada pankreas, profil sel beta pankreas, dan gambaran histopatologi jaringan pankreas.

3.2. Manfaat Penelitian Dapat memberi informasi mengenai efek atau gambaran patobiologis jaringan pankreas pada tikus dalam kondisi hiperglikemia. Dengan demikian dapat dihindari terjadinya kondisi hiperglikemia dalam kondisi berkepanjangan.

12

BAB 4. METODE PENELITIAN

Tempat Penelitian Penelitian dilakukan di laboratorium Biokimia Veteriner FKH, dan Lab. Patologi BBVet Denpasar.

Bahan dan Alat penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: Tikus strain spraque dawley umur 2 bulan, kandang tikus dan perlengkapannya, pakan tikus, syring 2,5 cc, canul, dan sukrosa. Bahan pemeriksaan kadar MDA (sigma): TEP (1,1,3,3-tetraethoxypropane) (T-9889), BHT (butylated hydroxytoluene), TCA (thricloroacetic) (ACS Reagent) (T-9159), TBA (thio barbituric acid) dan 0.25 N HCl, dan strip test glukosa. Larutan H2O2, Serum normal (BSA) 10%, Antibodi primer monoklonal anti-insulin dan glukagon, Antibodi sekunder DEPS (Dako Envision Peroxidase System), larutan DAB (diaminobenzidine),

larutan Hematoksilin

(counterstain). Alat yang digunakan adalah: Spectrophotometer UV/VIS, tissue processor, tissue tek model TEC, Parafin cleaner, inkubator, penangas air, Sentrifugasi mikro, freezer -80 oC, magnetik stirer, homogenizer, timbangan, vortek, mikro-pipet, mikroskop yang dilengkapi dengan kamera, GlukoDr®, tip, tabung reaksi dan rak serta seperangkat glasswares. Metode Penelitian 4.1. Persiapan hewan percobaan Pada penelitian ini digunakan 20 ekor tikus jantan putih strain Spraque dawley umur sekitar 2 bulan dengan bobot badan rata-rata 200 g. Tikus percobaan dibagi menjadi 2 kelompok perlakuan, tiap perlakuan

terdiri dari 10 ekor tikus. Tahap persiapan tikus

percobaan meliputi masa adaptasi selama 2 minggu dengan pemberian ransum komercial dan air minum secara ad libitum. Tikus perlakuan hiperglikemia (HG) diberikan larutan sukrosa 80% (w/v) secara oral (air minum) setiap hari selama 2 bulan. Larutan sukrosa diberikan dua kali sehari hari mulai pukul 08.00dan 18.00 Wita. Kelompok perlakuan yang dicobakan adalah sebagai berikut: a. Kelompok I (tikus kontrol), yaitu tikus normal hanya diberi air minum dan ransum. b. Kelompok II (tikus hiperglikemia=HG), yaitu tikus yang diberi larutan sukrosa 80% dua kali sehari secara oral dan diberi ransum komersial. 13

Perlakuan pada seluruh kelompok diberikan selama 2 bulan. Pada akhir penelitian, semua tikus dikorbankan dengan cara dibius dengan ketamin-HCl. Segera setelah mati, tikus dibedah dan jaringan pankreas diambil untuk analisis kadar malonaldehida (MDA), dan pewarnaan histopatologi. 2. Analisis kadar glukosa darah Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan pada hari ke 0 (data base awal) dan setiap 1 minggu selama 2 bulan. Kadar glukosa darah tikus percobaan ditentukan dengan metode glucose oxidase biosensor, menggunakan alat Blood glucose Test Meter GlucoDr™ model AGM-2100 (diproduksi oleh allmedicus Co Ltd., Korea). Darah diambil dari ujung ekor tikus yang sebelumnya telah dibersihkan dengan alkohol 70%, lalu diurut perlahan-lahan kemudian ujung ekor ditusuk dengan jarum kecil (syring 1 cc) (Kim et al. 2006). Darah yang keluar kemudian disentuhkan pada strip glukometer. Kadar glukosa darah akan terbaca dilayar GlucoDr™ setelah 11 detik dan kadar glukosa darah dinyatakan dalam mg/dl.

3. Analisis kadar malonaldehida (MDA) Preparasi sampel Preparasi dan pengukuran kadar MDA menggunakan metode menurut Capeyron et al. (2002). Homogenat pankreas untuk analisis MDA dibuat dengan cara 0,5 g

pankreas

dicincang halus dalam kondisi dingin kemudian ditambah dengan 2 ml PBS pH 7,4 dan dihomogenkan. Homogenat yang dihasilkan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm 4oC selama 20 menit. Bagian supernatan (lisat) diambil dan segera disimpan pada suhu -4oC untuk dianalisis kemudian. Prosedur pengukuran Sebanyak 0,5 ml sampel (lisat pankreas) atau standar ditambah dengan 2 ml campuran HCl 0,25 N dingin yang mengandung 15% TCA, 0,38% TBA dan 0,5% BHT. Campuran larutan ini dipanaskan 80 0C selama 1 jam. Setelah dingin, campuran larutan dan standar disentrifugasi 3500 rpm selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh diambil dan diukur absorbansinya pada λ 532 nm.

Sebagai larutan standar digunakan TEP (1,1,3,3-

tetraetoksipropana). Caranya adalah membuat larutan kerja 5 µM TEP dengan mengencerkan larutan induk (stok) standar 2,5 mM TEP sebesar 500 kali dengan pelarut air bebas ion. Larutan standar MDA dibuat

dengan mengencerkan larutan kerja (5 µM TEP)

hingga

diperoleh konsentrasi standar sebesar 0; 25; 50, 75; 100; 125; 150; 175; dan 200 pmol/50 µl. 14

Kurva standar dibuat dengan memplotkan nilai absorbansi (sumbu Y) dengan konsentrasi standar (sumbu X). Kadar MDA sampel yang diperoleh dinyatakan dalam satuan picomol/g.

4. Analisis sel beta pankreas secara imunohistokimia. Analisis sel beta pankreas secara imunohistokimia dilakukan menggunakan metode menurut Beesley (1995). Jaringan pankreas difiksasi selama 24 jam dalam larutan formalin 10%, selanjutnya diproses dengan metode standar menggunakan paraffin. Preparat histologis yang telah dibuat, selanjutnya dilakukan pewarnaan imunohistokimia terhadap sel beta menggunakan metode tidak langsung dua tahap (metode antibodi berlabel enzim). Setelah deparafinasi dan rehidrasi, jaringan diinkubasi dengan H2O2 dalam methanol selama 15 menit untuk menghilangkan aktivitas peroksidase endogen. Selanjutnya jaringan diinkubasi dalam bovine serum albumin (BSA) 10% selama 45 menit dalam inkubator suhu 37°C. Setelah dicuci 3 kali dengan PBS, jaringan kemudian diinkubasi dalam antibodi primer monoklonal antiinsulin pada suhu 40C selama 24 jam. Setelah dicuci 3 kali dengan PBS, kemudian jaringan diinkubasi dalam antibodi sekunder Dako Envision Peroksidase (Dako K 1941) pada suhu 37°C selama 60 menit. Setelah dicuci 3 kali dengan PBS, hasil reaksi antigen-antibodi divisualisasikan dengan menggunakan diamino benzidine (DAB) pada suhu kamar selama 25 menit. Setelah dicuci 3 kali dengan PBS, kemudian dikounterstain dengan hematoksilin. Preparat didehidrasi dan clearing kemudian dimounting dengan entelan. Pengamatan secara kualitatif dan kuantitatif dilakukan pada sel beta pankreas, yang jika positif ditunjukkan dengan warna coklat dan inti sel beta dapat dihitung.

5. Pengamatan gambaran histopatologi jaringan pankreas. Pembuatan sediaan histologis dilakukan menurut metode Kiernan (1990). Jaringan pankreas dicuci dengan larutan PBS (phosphate buffered saline pH 7,4) kemudian difiksasi dalam larutan formalin 10% selama 24 jam. Sampel jaringan dipindahkan dan disimpan di dalam alkohol 70% sampai proses selanjutnya. Sampel jaringan dipotong kecil-kecil dan didehidrasi di dalam seri larutan alkohol dengan konsentrasi bertingkat, kemudian dijernihkan dalam silol dan diembedding dalam paraffin. Blok paraffin dipotong serial dengan ketebalan 4 μm menggunakan mikrotom dan sayatan dilekatkan di atas gelas obyek. Setelah dilakukan proses deparafinasi dengan xylol selanjutnya dilakukan rehidratasi dengan alkohol absolut I, II, dan III, lalu alkohol 95 %, 90 %, 80 % dan 70 %, masing-masing selama 3 menit. Sesudah itu, sediaan preparat dibilas dengan air selama 5 menit dan aquades selama 5 menit dan pewarnaan 15

HE. Sediaan yang telah diwarnai lalu diamati di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 200 kali. Pengamatan perubahan histopatologis

dilakukan secara deskriptif

pada satu

potongan sediaan dari setiap jairngan tikus percobaan. Pada setiap sediaan, pengamatan dilakukan pada 5 lapang pandang yang dipilih secara acak. 6. Rancangan percobaan dan analisis data Penelitian ini menggunakan rancangan tidak berpasangan (independent) dengan perlakuan I adalah tikus normal, dan perlakuan II dalah tikus hiperglikemia. Data yang diperoleh dianalisis dengan Uji t tidak berpasangan. Sedangkan gambaran histopatologi pankreas dianalisis secara diskriptif.

BAB 5. HASIL DAN PEMBAHASAN Analisis kadar glukosa darah Hasil analisis kadar glukosa darah pada tikus percobaan selama 8 minggu diperlihatkan pada Gambar 2 dan Tabel 1. Kadar Glukosa darah (mg/dl)

160 140 120 100 80 60 40 20 0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

Minggu ke: Kontrol Hiperglikemia

Gambar 2. Profil kadar glukosa darah tikus selama 8 minggu percobaan

16

Tabel 1. Kadar glukosa darah (mg/dl) tikus selama 8 minggu percobaan Perlakuan Kontrol normal Hiperglikemia

0 90,7± 2,9 94,7± 5,2

1 94,7± 5,4 95,0± 46

Kadar glukosa darah (mg/dl) minggu ke: 2 3 4 5 6 96,7± 96,2± 95,3± 93,9± 94,9± 3,9 3,3 3,2 3,5 4,5 99,5± 106,2± 119,5± 128,5± 133,4± 6,3 4,4 3,9 4,9 4,7

7 94,7± 3,7 138,8± 3,3

8 97.,8± 4,3 139,5± 5,2

Data pada Tabel 1, terlihat bahwa kadar glukosa darah pada kelompok kontrol relatif sama, yaitu berkisa antara 90,7 - 97,8 mg/dl dan secara statistik kadar glukosa darah kelompok kontrol tidak berbeda nyata (P>0,05). Kadar glukosa darah tikus perlakuan hiperglikemia, menunjukkan kadar awal (minggu ke 0) sebesar 94,7 mg/dl dan setelah minggu ke 8 kadar glukosa darah sebesar 139,9 mg/dl (Tabel 1). Kadar glukosa darah perlakuan hiperglikemia mulai mengalami kenaikan pada minggu ke 4 setelah perlakuan. Selanjutnya kadar glukosa darah tikus percobaan terus mengalami kenaikan sampai pada akhir percobaan. Kadar glukosa darah tikus normal sangat bervariasi, Ramesh dan Pugalendi (2006) melaporkan kadar glukosa darah tikus antara 74,35 – 84,85 mg/dl, sementara Gulfraz et al. (2007) melaporkan kadar glukosa darah normal antara 99-127 mg/dl. Pada penelitian ini diperoleh kadar normal glukosa darah tikus 90,7 - 97,8 mg/dl. Sedangkan kadar glukosa darah tikus setelah minggu ke 4 atau pada minggu ke 5 sampai minggu 8 percobaan diperoleh sebesar 128,5-139,5 mg/dl. Hal ini berarti kadar glukosa darah tikus berada di atas batas nilai normal yang menandakan bahwa tikus dalam keadaan hiperglikemia. Data pada Gambar 1, memperlihatkan bahwa tikus mulai mengalami hiperglikemia setelah minggu ke 4 perlakuan dan selama empat minggu kedepan terus mengalami kenaikan. Hal ini berarti pemberian larutan sukrosa 80% pada tikus selama dua kali sehari telah mampu membuat tikus mengalami kenaikan kadar glukosa darah dan tikus percobaan mengalami hiperglikemia selama 4 minggu.

Analisis kadar malonaldehida (MDA) Malondialdehida merupakan produk akhir dari peroksidasi lipid.

Tingginya kadar

MDA, yang secara tidak langsung juga menunjukkan tingginya jumlah radikal bebas di dalam jaringan. Hasil analisis kadar malonaldehida pada tikus percobaan di tampilkan pada Tabel 2 dan Gambar 3.

17

Tabel 2. Rata-rata kaadar malonalldehida (MD DA) pada pan nkreas tikus percobaan K Kadar MDA A picomol/g Peerlakuan Kontrol K 22,94 ± 3,82a Hipeerglikemia 31,85 ± 5,69b Angka yanng diikuti oleh huruf yang beerbeda pada baaris yang sam ma menunjukkaan hasil uji berrbeda nyata (P<0,05).

G Gambar 3. Kaadar Malonaaldehida (MD DA) pada paankreas tikuus selama perrcobaan. R Rata-rata kaddar malonald dehida (MD DA) pakreas tikus perlakkuan kontrool sebesar 22,94 piccomol/g dann kadar MDA A pankreas ttikus hipergllikemia sebeesar 31,85 piicomol/g. Kadar MDA M perlakuan hiperglikkemia terlihaat lebih besarr bila dibanddingkan denggan kadar pancreas perlakuan control dan berbeda nyyata (P>0,055). Hal ini menunjukkaan bahwa h ia menyebab bkan kerusakkan jaringann pankreas yyang ditandaai dengan kondisi hiperglikemi meningkatnya kadarr MDA. Terj rjadinya keruusakan jarinngan pankeaas disebabkaan karena pada konndisi hiperglikemia terjadi produkssi insulin olleh sel beta yang terus menerus sehinggaa menyebabkkan kelelahaan sel beta. K Kelelahan seel beta diikuuti dengan kerusakan k komponeen sel termaasuk kerusakkan jaringann lemak yanng ditandai dengan kaddar MDA yang meeningkat. Menurut Robeertson (20044), kelebihaan glukosa ddi dalam tuubuh atau hiperglikkemia meruppakan titik awal terjaddinya pemb bentukan raadikal bebass melalui berbagai mekanisme metabolism me biokimiaw wi. G Glukosa dapat mengalam mi reaksi aautooksidasi menghasilkkan radikal hidroksil ▪

(OH ) (W Wolf et al., 1989). Prosses reaksinyya melalui ennolisasi glisserida-3P meembentuk senyawa enediol. Selanjutnya S enediol, beereaksi denggan Fe3+ m menghasilkann radikal 18

enediol. Ion Fe2+ hasil reduksi Fe3+, akan bereaksi dengan

hidrogen peroksida

menghasilkan radikal hidroksil. Sementara, Brownlee (2001) melaporkan keadaan hiperglikemia dapat mengaktifkan empat jalur metabolisme glukosa yang dapat menghasilkan radikal anion superoksida (O2▪) berlebih dalam mitokondria. Radikal bebas yang terbentuk (radikal enediol, radikal hidroksil dan anion superoksida) berpotensi menyebabkan reaksi glikosilasi protein dengan karbohidrat dan berkontribusi menyebabkan kerusakan membran sel. Beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa dalam kondisi diabetes dilaporkan kadar ensim antioksidan intrasel pankreas menurun dan kadar MDA meningkat. Suarsana et al (2011), kadar MDA pada pankreas tikus yang mengalami hiperglikemia lebih tinggi (25,24 pmol/g) dibandingkan dengan tikus perlakuan kontrol (19,57 pmol/g).

Analisis sel beta pankreas secara imunohistokimia Hasil pewarnaan imunohistokimia terhadap sel beta pankreas diperlihatkan pada Gambar 4. Hasil pewarnaan imunohistokimia menunjukkan bahwa insulin terdapat pada inti dan sitoplasma dari sel beta. Secara kualitatif terlihat profil kandungan insulin pada sel beta mengalami penurunan pada kelompok hiperglikemia dibandingkan kelompok kontrol. Warna coklat menunjukkan reaksi positif terhadap insulin pada pewarnaan imunohistokimia. Gambaran sel beta pada tikus kontrol dan tikus perlakuan hiperglikemia tidak banyak mengalami perbedaan. Sel beta terlihat ditengah dengan jumlah yang hampir sama pada kedua perlakuan.

K0

HG 50 μm

50 μm

Gambar 4. Foto mikrograf pewarnaan imunohistokimia terhadap insulin pada sel beta jaringan pankreas. Keterangan: K0=kontrol, HG=hiperglikemia, tanda panah: reaksi positif warna coklat. 19

Pengamatan gambaran histopatologi jaringan pankreas. Secara umum hasil pengamatan mikroskopis terhadap gambaran jaringan pankreas menunjukkan bahwa nampak pulau Langerhans yang sangat jelas dengan warna lebih pucat dubandingkan dengan kelenjar eksokrin disekitarnya (Gambar 5). B B

A

A

K0

50 µm

HG

50 µm

Gambar 5. Foto mikrograf pulau Langerhans pankreas tikus pewarnaan HE. Keterangan: A= pulau Langerhans, B=kelenjar eksrokrin. K0=kontrol, dan HG=hiperglikemia. (tanda panah: inti sel piknotis) Hasil pengamatan secara mikroskopik pada kelompok tikus kontrol (K0) tampak gambaran pulau Langerhans, baik dari segi bentuk, ukuran, dan massa sel jumlah cukup banyak. Pada pankreas kelompok tikus hiperglikemia menunjukkan adanya kerusakan yang mengarah ke degenerasi dengan derajat ringan dengan beberapa inti mengalami piknotis (Gambar 5). Kondisi hiperglikemia dapat menyebabkan terjadinya degenerasi dengan derajat ringan dan inti mengalami piknotis pada kelompok HG. Hal ini dikarenakan pada kondisi hiperglikemia menyebabkan sel-sel pankreas, khususnya sel beta mengalami kelelahan karena fungsinya yang terus menerus harus menghasilkan dan mengekskresikan insulin. Faktor kelelahan dapat menyebabkan sel stress dan lebih cepat mengalami kerusakan. Selain itu, menurut Robertson (2004), kondisi hiperglikemia dapat menyebabkan stress oksidatif. Pada kelebihan glukosa yang cukup lama dapat menyebabkan terbentuknya radikal bebas yang berlebihan. Radikal bebas yang terbentuk ini dapat menyerang sel-sel di sekitarnya, termasuk sel-sel pankreas. Akibat reaksi berantai radikal bebas tersebut menyebabkan sel mengalami kerusakan.

20

BAB 6. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Hiperglikemia menyebabkan kondisi patobiologis pada jaringan pankreas berupa meningkatnya kadar malonaldehid (MDA), masa sel beta berkurang dan sel pankreas mengalami degenerasi ringan.

Saran Kondisi hiperglikemia dibuat lebih lama dan tingkat kenaikan kadar glukosa darah lebih tinggi sehingga efek patobiologisnya pada jaringan pankreas dapat di amati lebih jelas. Selain itu perlu juga diamati sel alpha apakah dipengaruhi oleh kondisi hiperglikemia.

UCAPAN TERIMAKASIH Pada kesempatan ini, ucapan terimakasih disampaikan kepada Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan Nasional dan Rektor Univesitas Udayana yang telah memberikan biaya penelitian dari Dana RM Universitas Udayana dengan surat Perjanjian Penugasan Penelitian No:175.59/UN14.2/ PNL.01.03.00/2013, Tanggal 16 Mei 2013

21

DAFTAR PUSTAKA

Asikin N. 2001. Antioksidan endogen dan penilaian status antioksidan. Di dalam: Prosiding Kursus Penyegar radikal bebas dan antioksidan dalam kesehatan: dasar aplikasi dan pemanfaatan bahan alam. Jakarta 16 April 2001. Bagian Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia Auroma OI, Neergheen VS, Bahorun T, Jen LS. 2006. Free radicals, Antioxidants and Diabetes: Embryopathy, Retinopathy, Neuropathy, Nephropathy and Cardiovascular Complications. Neuroembryol Aging 4:117-137. Beesley, JE. 1995. Immuno-cytochemistry: A Practical Approach. IRL. Press Oxford University Press, New York. P.15-41 Brownlee M. 2001. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature 414:813-820 Capeyron MFM, Julie C, Eric B, Jean P, Jean MR,, Piere B, Claude LL, Benard D. 2002. A diet cholesterol and deficient in vitamin E induces lipid peroxidation but does not enhace antioxidant enzyme expression in rat liver. J Nutr Biochem 13:296-301 Conti, M., P.C. Moramd, P.Levillain, and A.Lemonnier. 1991. Improve Flurometric Determination of Malonaldehyde. J. Clin. Chem. 37(7):1273-1275. Dominiczak MH. 2005. Glucose homeostasis, fuel metabolism and insulin. Di dalam Baynes JW dan Dominiczak MH Editor. Medical Biochemistry. Second Edition. Elsivier Mosby. Hlm 273-197 Draper HH, Polensek L, Hadley TM, Mcgirr LG. 1984. Urinary Malondialdehyde as an Indicator of Lipid Peroxidation in the Diet and in the Tissues. Lipids 19 (11):836-843. Freisleben H.J. 2001. Free radical and ROS in biological system. Di dalam: Prosiding Kursus Penyegar radikal bebas dan antioksidan dalam kesehatan: dasar aplikasi dan pemanfaatan bahan alam. Jakarta 16 April 2001. Bagian Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Gulfraz M, Qadir G, Noshhen F, Parveen Z. 2007. Antihyperglycemic effects of Berberis lyceum royle in alloxan induced diabetic rats. Diabetologia Croatica 36 (3):49-54 Kiernan JA. 1990. Histopatological and Histochemical Methods: theory and Practice. Pergamon Press. Kim JS, Ju JB, Choi CW, Kim SC. 2006. Hypoglycemic and antihyperlipidemic Effect of Four Korean Medicinal Plants in Alloxan Induced Diabetic Rats. Am J Biochem and Biotech 2: 154-160 Luczaj W, Skrzydlewska E. 2003. DNA damage caused by lipid peroxidation products. Cellular & molecular biology letters 8:391-413 Newsholme P,Haber EP, Hirabara SM, Rebelato ELO, Procopio J, Morgan D, Oliveira-Emilio HC, Carpinelli AR, Curi R. 2007. Diabetes associated cell stress and dysfunction: role of mitochondrial and non-mitochondrial ROS production and activity. J Physiol 583. 9–24. Ramesh B, Pugalendi KV. 2006. Antihyperglycemic Effect of Umbelliferone in Streptozotocin-Diabetic Rats. Journal of Medicinal Food. J Med Food 9 (4), 562–566 22

Rasal VP, Shetty BBP, Sinnathambi A, Yeshmaina S, Ashok P. 2008. Antihyperglycaemic and Antioxidant Activity of Brassica Oleracea In Streptozotocin Diabetic Rats. The Internet Journal of Pharmacology. ISSN: 1531-2976. 10 halaman. http://www.ispub.com/ostia/ index.php?xmlFilePath= journals/ ijpharm/vol4n2/antioxidant.xml (1 of 10) Robertson RP, Harmon J, Tran PO, Poitout V. 2004. β-Cell Glucose Toxicity, Lipotoxicity, and Chronic Oxidative Stress in Type 2 Diabetes. Diabetes. 53, :S119-S124 Robertson. 2004. Minireview: Chronic Oxidative Stress as a Central Mechanism for Glucose Toxicity In Pancreatic Islet Beta Cells In Diabetes. J. of Biological Chemistry Vol. 279(41): 42351–42354 Soewoto H. 2001. Antioksidan eksogen sebagai lini pertahanan kedua dalam menanggulangi peran radikal bebas. Di dalam: Prosiding Kursus Penyegar radikal bebas dan antioksidan dalam kesehatan: dasar aplikasi dan pemanfaatan bahan alam. Jakarta 16 April 2001. Bagian Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Suarsana N, Iwan H Utama, Suartini AA. 2011. Pengaruh hiperglikemia dan vitamin E pada kadar malonaldehida dan enzim antioksidan intrasel jaringan pankreas tikus. Majalah Kedokteran Bandung (MKB). 43 (2):72-76 Szkudelski T. 2001. The mechanism of alloxan and sreptozotocin action in cells of the rat pancreas. Physiol Res 50:536-546. Thomas, JA. 1999. Oxidative Stress: including glutathione, a peptide for cellular defense against oxidative stress. Departement of Biochemistry and Biophysics Iowa State University Ames, IA. 5001 Tug T, Karatas F, Terzi SM, Ozdemir N. 2005. Comparison of serum malondialdehyde levels determined by two different methods in patients with COPD: HPLC or TBARS Methods. Science 36:41-44. Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin MTD, Mazur M, Telser J. 2007. Review: Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Inter J Biochem & Cell Biol 39:44-84. Virtanen SM, Knip M. 2003. Nutritional risk predictors of cell autoimmunity and type 1 diabetes at a young age. Am J Clin Nutr. 78:1053– 1067 Wolff SP, Bascal Z, Hunt JV. 1989. Autoxidative glycosylation: free radicals and glycation theory. In: Kunio Yagi, ed. The Maillard Reaction in Ageing, Diabetes and Nutrition. Alan R. Liss, Inc. 247-275.

23

LAMPIRAN Lampiran 1. Biodata Personalia Tenaga peneliti.

CURICULUM VITAE 1 Ketua Peneliti A IDENTITAS DIRI 1.1

Nama Lengkap (dengan gelar)

1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8

Jabatan Fungsional NIP/NIK/No. identitas lainnya Tempat dan Tanggal Lahir Alamat Rumah Nomor Telepon/Faks Nomor HP Alamat Kantor

1.9 1.10 1.11

Nomor Telepon/Faks Alamat e-mail Lulusan yg telah dihasilkan

1.12 Mata Kuliah yg diampu

: Prof. Dr. drh. Iwan Harjono Utama , MS (L) : guru besar : 196106041989 03 1002 : Bogor 6 Apil 1961 : Jl. Tibung sari Gg, Badung, Bali. :: 081 337755860 : Laboratorium Biokimia Veteriner, FKH Unud, Kampus Sudirman, Bali : 0361-223791 / 0361-223791 : [email protected] S-1= 70 orang ; S-2= 1 orang; S-3= orang 1. Pengantar Kimiabiofisika 2. Biokimia Veteriner I 3. Biokimia Veteriner II 4. pengantar biokimia komparatif (S2 – S3) 5. Biokimia Lanjut (S2 – S3)

B. RIWAYAT PENDIDIKAN 2.1 Program: 2.2 Nama PT

2.3 Bidang Ilmu

S-1 Institut Pertanian Bogor Dokter Hewan

S-2 Institut Pertanian Bogor Sains Veteriner: Biokimia klinik

S-3 Institut Pertanian Bogor Sains Veteriner: Biokimia Vet. 1993

2.4 Tahun Masuk

1980

1986

2.5. Tahun Lulus

1985

1989

1998

Prof. Dr. Aisjah Girindra Prof. Dr. Soenarjo S. Drh. R. ipin. R. manggung MS. Stat

Prof. Dr. Aisjah Girindra Prof. Dr. Fachrijan H. Pasaribu Prof. Dr.

2.6 Judul Skripsi/ Tesis/Disertasi 2.7. Nama Pembimbing/ Promotor

Dr. A. Muchlis, MSc (alm) Drh. A. Syahir

24

Wayan T. Wibawan Prof. Dr. Gatut Ashadi (alm) Dr. Endhie D. Setiawan, MS.

C. PENGALAMAN PENELITIAN (bukan skripsi, tesis, maupun disertasi) Urutkan judul penelitian yang pernah dilakukan(sebagai ketua) selama 5 tahun terakhir dimulai dari penelitian yang paling diunggulkan menurut Saudara sampai penelitian yang tidak diunggulkan. Pendanaan Sumber* Jml (Juta Rp) Hibah 37.200.000 1 2009 Profil DNA Plasmid Serotipe Escherichia coli O157:H7 yang fundamental Diisolasi dari Feses Ayam yang Menunjukkan Reaksi Positif Hemolisis dan Bersifat Resistensi Berganda (Multy Drug Resistance) terhadap Berbagai Jenis Antibiotika. Penelitian Hibah Fundamental (Tahap I ) Hibah 37.200.000 2010 Profil DNA Plasmid Serotipe Escherichia coli O157:H7 yang fundamental Diisolasi dari Feses Ayam yang Menunjukkan Reaksi Positif Hemolisis dan Bersifat Resistensi Berganda (Multy Drug Resistance) terhadap Berbagai Jenis Antibiotika. Penelitian Hibah Fundamental (Tahap II) Tuliskan sumber pendanaan: PDM, SKW, Fundamental Riset, Hibah Bersaing, Hibah Pekerti, Hibah Pascasarjana, RAPID, atau sumber lainnya. No.

Tahun

Judul Penelitian

D PENGALAMAN PENGABDIAN KEPADA MASYARAKAT Urutkan judul pengabdian kepada masyarakat yang pernah dilakukan(sebagai ketua) selama 5 tahun terakhir dimulai dari yang paling diunggulkan menurut Saudara sampai pengabdian kepada masyarakat yang tidak diunggulkan. No.

Tahun

Judul Pengabdian Kepada Masyarakat

2011

Penyuluhan penyakit rabies di desa Buana Giri kecamatan bebandem kabupaten karang Asem, 19/ 8/ 2011 Pelayanan kesehatan dan pemberian obat cacing pada kambing di desa Tangkas kabupaten Klungkung Bali, 29/ 10/ 2010.

2010

Pendanaan Sumber* Jml (Juta Rp) Local universitas Local universitas

25

2007

Pelayanan kesehatan dan vaksinasi SE Local pada sapi Bali tanggal 4 /10/ 2007. universitas Tuliskan sumber pendanaan: Penerapan Ipteks, Vucer, Vucer Multitahun, UJI, Sibermas, atau sumber lainnya.

E PENGALAMAN PENULISAN ARTIKEL ILMIAH DALAM JURNAL (tidak termasuk makalah seminar/proceedings, artikel di surat kabar) Urutkan judul artikel ilmiah yang pernah diterbitkan selama 5 tahun terakhir dimulai dari artikel yang paling diunggulkan menurut Saudara sampai penelitian yang tidak diunggulkan. No.

Tahun

Judul Artikel Ilmiah

1

2011

2

2010

Utama, I. H., E. M. Hutagalung, Wy. P. A. Laksmi, I G. M. K. Erawan, S. K. Widyastuti, L. E. Setiasih dan K. Berata. 2011. Urinalisis menggunakan dua jenis dipstick (batang celup) pada sapi bali. J. Vet. 12: 107 - 112 Utama, I. H., Y. Y. Rumlaklak, D. A. D. Karmi, A. A. S. Kendran, S. K. Widyastuti, Kt. Berata, dan L. E. Setiasih. 2010. Keterkaitan antara turbiditas serum dan laju endap darah dengan jenis kerusakan organ hati pada sapi Bali. J. Vet. 11: 185 -189.

3

2008

4

2007

Utama, I. H., Sugiyarto, A. A. S. Kendran, I. A. P. Apsari, I Nym. Suarsana, I. G. M. K. Erawan, A. A. A. Mirah Adi, I. B. O. Winaya, dan Y. Hayashi. 2008. Blood smear evaluation of Bali ducks sampled from traditional farming systems in Bali. J. Vet. 9: 188 – 191. Utama, I. H., A. Girindra, F. H. Pasaribu, I W. T. Wibawan, E. D. Setiawan, dan A. L. T. Rompis, 2007. Deteksi asam hyaluronat kapsul Streptococcus equi subsp. zooepidemicus sebagai faktor perlekatan pada epitel mukosa buccalis babi. J. Vet. 8 (3) : 132-138

Volume/ Nomor

Nama Jurnal

12 : 107 112

Jurnal veteriner

11 ; 185 189

Jurnal veteriner

9 : 188 191

Jurnal veteriner

8 : 132 138

Jurnal veteriner

F. PENGALAMAN PENULISAN BUKU Urutkan judul buku yang pernah diterbitkan selama 5 tahun terakhir dimulai dari buku yang paling diunggulkan menurut Saudara sampai buku yang tidak diunggulkan. 26

No.

Tahun

1

2001

2

2002

3

2005

Judul Buku Pengantar Kimiabiofisika ISBN: 979-8286-26-x (Iwan HU) Laboratorium Klinik Veteriner: prinsip dan interpretasi hasil pemeriksaan ISBN: 979-8286-64-2 (Iwan HU) Biokimia Veteriner II ISBN: 979-25-5190-5 (Iwan HU, dan Suarsana N)

Jumlah Halaman

Penerbit

287

Universitas Udayana Universitas Udayana

223

Pelawa sari

G. PENGALAMAN PEROLEHAN HKI Urutkan judul HKI yang pernah diterbitkan 5-10 tahun terakhir. No.

Tahun

Judul/Tema HKI

Jenis

Nomor P/ID

-

-

-

-

-

H. PENGALAMAN MERUMUSKAN KEBIJAKAN PUBLIK/REKAYASA SOSIAL LAINNYA Urutkan judul rumusan kebijakan/rekayasa sosial lainnya yang pernah dbuat/ditemukan selama 5 tahun terakhir. No.

Tahun

-

-

Judul/Tema/Jenis Rekayasa Sosial Lainnya yang Telah Diterapkan -

Tempat Penerapan

Respons Masyarakat

-

-

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan, saya sanggup menerima risikonya. Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu persyaratan dalam pengajuan hibah Fundamental Denpasar, 25 Oktober 2013 Pengusul, Prof. Dr. Iwan Harjono Utama, MS. NIP. 19610604198903 1002

27

2. Anggota Peneliti 1 A IDENTITAS DIRI 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5

Nama Lengkap (dengan gelar) Jabatan Fungsional NIP/NIK/No. identitas lainnya Tempat dan Tanggal Lahir Alamat Rumah

1.6 1.7 1.8

Nomor Telepon/Faks Nomor HP Alamat Kantor

1.9 1.10 1.11

Nomor Telepon/Faks Alamat e-mail Lulusan yg telah dihasilkan

1.12 Mata Kuliah yg diampu

: drh. I Made Kardena, MVS (L) : Lektor : 19790310 200312 1 001 : Benoa, 10 Maret 1979 : Jl. Pratama No. 35 B Nusa Dua, Kuta Selatan, Badung, Bali. : 0361 772330 : 081 353 353 399 : Laboratorium Patologi Veteriner, FKH Unud, Kampus UNUD Denpasar, Bali : 0361-223791 / 0361-223791 : [email protected] S-1= 6 orang ; S-2= - orang; S-3= orang 1. Epidemiologi dan Ekonomi Veteriner 2. Patologi Umum Veteriner 3. Patologi Sistemik Veteriner 4. Nekropsi Veteriner

B. RIWAYAT PENDIDIKAN 2.1 Program: 2.2 Nama PT

2.3 Bidang Ilmu

S-1 Universitas Udayana

Dokter Hewan

S-2 Murdoch University Master Veterinary Surveillance

of

2.4 Tahun Masuk

1997

2007

2.5. Tahun Lulus

2002

2009

Pengaruh Berbagai Konsentrasi Ekstrak Hipofisa Ayam Kampung (Gallus domestikus) Terhadap Kualatas Semen Ayam Kampung. Drh. I Wayan Bebas, MKes

Syndromic Surveillance: A Potential Method to Improve Animal Health Surveillance System in Bali Prof. Ian Robertson, BVSc, PhD, MACVSc.

2.6 Judul Skripsi/ Tesis/Disertasi

2.7. Nama Pembimbing/ Promotor

28

C. PENGALAMAN PENELITIAN (bukan skripsi, tesis, maupun disertasi) Urutkan judul penelitian yang pernah dilakukan(sebagai ketua) selama 5 tahun terakhir dimulai dari penelitian yang paling diunggulkan menurut Saudara sampai penelitian yang tidak diunggulkan. Pendanaan No. Tahun Judul Penelitian Sumber* Jml (Juta Rp) 1 2007 Deteksi Antibodi Terhadap Antibodi DIPA 5 Japanese Enchephalitis Pada Sapi Bali DIPA 7.5 2 2011 Mengukur tingkat validitas uji Seller’s dan FAT dalam mendiagnosa penyakit rabies pada anjing di Bali Tuliskan sumber pendanaan: PDM, SKW, Fundamental Riset, Hibah Bersaing, Hibah Pekerti, Hibah Pascasarjana, RAPID, atau sumber lainnya. D PENGALAMAN PENGABDIAN KEPADA MASYARAKAT Urutkan judul pengabdian kepada masyarakat yang pernah dilakukan(sebagai ketua) selama 5 tahun terakhir dimulai dari yang paling diunggulkan menurut Saudara sampai pengabdian kepada masyarakat yang tidak diunggulkan. Pendanaan No. Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Sumber* Jml (Juta Rp) DIPA 3 Pemeriksaan Kesehatan dan Pemberian Vitamin Pada Babi Di Desa Taro, Kabupaten Gianyar 2 2011 Vaksinansi SE Pada Sapi di Desa DIPA 3 Demulih, Kabupaten Bangli Tuliskan sumber pendanaan: Penerapan Ipteks, Vucer, Vucer Multitahun, UJI, Sibermas, atau sumber lainnya. 1

2010

E PENGALAMAN PENULISAN ARTIKEL ILMIAH DALAM JURNAL (tidak termasuk makalah seminar/proceedings, artikel di surat kabar) Urutkan judul artikel ilmiah yang pernah diterbitkan selama 5 tahun terakhir dimulai dari artikel yang paling diunggulkan menurut Saudara sampai penelitian yang tidak diunggulkan. No.

Tahun

1

2010

2

2011

3

2011

4

2011

5

2011

Judul Artikel Ilmiah

Volume/ Nomor

Nama Jurnal

Vol.2 No.1 Buletin Syndromic Surveillance: A Potential Veteriner Method for Alternative Animal Health Surveillance System. Vol.12 Jurnal Veteriner The Efficacy of Turmeric Juice on No.1 Pathological Changes of the Mice Liver Induced by Carbon Tetrachloride. Pathological Changes on Balinese Vol.3 No.1 Buletin Veteriner Local Dog’ Lung Infected with Canine Distemper Disease The Advantages and Disadvantages of Vol.3 No.2 Buletin Syndromic Surveillance Methods Veteriner Cloning, Sequencing and Phylogenetic Vol.12 Jurnal Veteriner 29

6

2011

7

2012

No.3 Analysis of Nucleocapsid Protein Gene of New Castle Disease Virus Bali-1/07 Formaldehyde Exposure Inhibits the Vol.12 Jurnal Veteriner Spermatogenesis Process in Mice No.1 Case Study of Morbidity, Mortality Vol.4 No.1 Buletin Veteriner and Case Fatality Rate of Swine Colibasillosis

F. PENGALAMAN PENULISAN BUKU Urutkan judul buku yang pernah diterbitkan selama 5 tahun terakhir dimulai dari buku yang paling diunggulkan menurut Saudara sampai buku yang tidak diunggulkan. No.

Tahun

Judul Buku

Jumlah Halaman

Penerbit

-

-

-

-

-

G. PENGALAMAN PEROLEHAN HKI Urutkan judul HKI yang pernah diterbitkan 5-10 tahun terakhir. No.

Tahun

Judul/Tema HKI

Jenis

Nomor P/ID

-

-

-

-

-

H. PENGALAMAN MERUMUSKAN KEBIJAKAN PUBLIK/REKAYASA SOSIAL LAINNYA Urutkan judul rumusan kebijakan/rekayasa sosial lainnya yang pernah dbuat/ditemukan selama 5 tahun terakhir. No.

Tahun

-

-

Judul/Tema/Jenis Rekayasa Sosial Lainnya yang Telah Diterapkan -

Tempat Penerapan

Respons Masyarakat

-

-

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan, saya sanggup menerima risikonya. Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu persyaratan dalam pengajuan hibah Penelitian Fundamental Denpasar, 25 Oktober 2013 Anggota Pengusul, drh. I Made Kardena, MVS

30

31

EFEK HIPERGLIKEMIA KRONIS TERHADAP JARINGAN PANKREAS TIKUS (Effect of Chronic Hyperglycemia on Rat Pancreatic Tissue) 1

1

Iwan H. Utama, 2I Made Kardena, 1I Nyoman Suarsana Laboratorium Biokimia, 2Laboratorium Patologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana, Bali. Jl. PB. Sudirman Denpasar

ABSTRAK Paparan kronis hiperglikemia dapat menyebabkan disfungsi seluler yang menetap atau dapat menjadi ireversibel, proses ini yang disebut toksisitas glukosa. Toksisitas glukosa merupakan awal mekanisme kerusakan sel melalui pembentukan radikal bebas. Radikal bebas yang berlebihan dapat merusak komponen membran sel diantaranya lipid, protein sel, dan DNA. Tujuanya penelitian adalah untuk mengetahui pengaruh jaringan pankreas tikus akibat hiperglikemia. Sebanyak 20 ekor tikus jantan putih strain Spraque dawley umur sekitar 2 bulan dengan bobot badan rata-rata 200 g digunakan dalam penelitian ini. Tikus percobaan dibagi menjadi 2 kelompok perlakuan, tiap perlakuan terdiri dari 10 ekor tikus. Tikus perlakuan kontrol (K0) dan Tikus perlakuan hiperglikemia (HG) diberikan larutan sukrosa 80% (w/v) secara oral dua kali sehari selama 2 bulan. Pengamatan dilakukan terhadap (1) analisis kadar glukosa darah dengan metode glucose oxidase biosensor menggunakan alat Blood glucose Test Meter GlucoDr™, (2) analisis kadar malonaldehida menggunakan metode spektrofotometri, (3) analisis sel beta pankreas secara imunohistokimia, dan (4) gambaran histopalogi pankreas tikus menggunakan pewarnaan Hematoksilin Eosin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tikus percobaan mulai hiperglikemia setelah satu bulan perlakuan selanjutnya mengalami hiperglikemia selama 1 bulan dengan kadar glukosa akhir sebesar 139,5±5,2 mg/dl sedangkan kadar glukosa kelompok perlakuan kontrol rata-rata sebesar 97,8±4,3 mg/dl. Hiperglikemia menyebabkan terjadinya perubahan patobiologis pada jaringan pankreas, yaitu meningkatnya kadar malonaldehida (MDA) rata-rata 31,85 ± 5,69 picomol/g dan kelompok kontrol rata-rata 22,94 ± 3,82 picomol/g. Pada jaringan pankreas tikus yang mengalami hiperglikemia juga ditemukan degenerasi ringan, dan secara kualitatif terdapat penurunan massa sel beta. Kata-kata kunci: pankreas, hiperglikemia, malonaldehida, sel beta, glukosa darah

ABSTRACT Chronic exposure to hyperglycemia can cause to cellular dysfunction that persists or may become irreversible, this process is called glucose toxicity. Mechanisms of glucose toxicity initial is cell damage through the formation of free radicals. Free radicals can damage cell membrane components such as lipids, protein, and DNA cells. The aim of research was determined the effect of rat pancreatic tissue caused by hyperglycemia. A total of 20 male white rats Spraque Dawley strain about 2 months of age with an average body weight of 200 g used in this study. Rats were divided into 2 treatment groups, each treatment consisted of 10 rats. Rat control treatments (K0) and rats treatments hyperglycemia (HG) was given 80% sucrose solution (w / v) orally twice a day for 2 months. Parameters were observed among others, (1) the analysis of blood glucose levels with a glucose oxidase method using a biosensor Blood Glucose Test Meter GlucoDr, (2) analysis of malonaldehida levels using spectrophotometric method, (3) analysis of the pancreatic beta cells by immunohistochemistry stainning, and (4) overview hystopalogi of rat pancreatic tissue using Hematoxylin Eosin 32

staining. The results showed that the rats was started to hyperglycemia after one month of treatment subsequently had hyperglycemia for 1 month with a final glucose levels of 139.5 ± 5.2 mg/dl whereas glucose levels control treatment group an average of 97.8 ± 4.3 mg/dl. Hyperglycemia leads to changes phatobiologys in pancreatic tissue, namely increased levels of malonaldehida (MDA) average of 31.85 + 5.69 picomol/g and the control group average of 22.94+3.82 picomol/g. Hyperglycemia condition on rat pancreatic tissue was also found mild degeneration and qualitative decrease of beta cell mass Key words: pancreatic tissue, Hyperglycemia, malonaldehida, beta cells, blood glucose

PENDAHULUAN Manusia dan juga hewan tidak luput dari keadaan stres oksidatif dengan tingkat keparahan dan penyebab berbeda dan dapat menghasilkan jumlah radikal bebas dalam tubuh melebihi jumlah antioksidan endogen. Pada kondisi stres oksidatif dapat terjadi kerusakan sel akibat radikal bebas bila kemampuan mekanisme pertahanan tubuh seperti enzim antioksidan seluler menurun. Oleh karena itu perlu dilakukan usaha-usaha dalam mencegah terjadinya stres oksidatif atau mencegah pencetus terbentuknya radikal bebas di dalam tubuh yang berlebihan, misalnya mencegah supaya tidak terjadi kondisi hiperglikemia kronis. Kebanyakan populasi di belahan dunia, termasuk di Indonesia mengkonsumsi karbohidrat dalam jumlah tinggi. Disadari atau tidak bahwa sedari kecil kita telah terpapar dengan karbohidrat melalui menu makan yang dihidangkan sehari-hari, bahkan terasa belum komplit apabila menu kita tidak mengandung glukosa (gula). Kelebihan karbohidrat (glukosa) di dalam tubuh yang sering disebut dengan hiperglikemia merupakan titik awal terjadinya pembentukan radikal bebas melalui berbagai mekanisme metabolisme biokimiawi (Robertson, 2004). Stres oksidatif adalah suatu kondisi yang berhubungan dengan peningkatan kecepatan kerusakan sel akibat radikal bebas. Hal ini disebabkan oleh ketidak seimbangan antara pembentukan radial bebas dan aktivitas pertahanan antioksidan. Kondisi yang berhubungan dengan peningkatan produksi radikal bebas meliputi berbagai proses kimia kompleks dalam tubuh yang melibatkan aktivitas organel mitokondria terutama dalam menghasilkan ATP (Newsholme et al., 2007). Pada keadaan glukotoksisiti (Robertson et al., 2004), proses pagositosis dalam sistim imun, infeksi, dan inflamasi (Freisleben, 2001), serta terpapar dengan bahan kimia dan zat diabetogenik (Szkuldelski 2001) menyebabkan terbentuknya radikal bebas yang tinggi di dalam tubuh .

33

Karbohidrat tidak saja penting dalam makanan manusia sebagai sumber energi, tetapi karena bahan pangan berkarbohidrat tinggi berlimpah dan murah bila dibandingkan dengan protein dan lemak. Oleh karena itu, karbohidrat menjadi bagian utama makanan di hampir semua bagian di dunia.

Studi epidemiologi menunjukkan ada kaitan erat antara status

kesehatan dan usia harapan hidup manusia dengan pola konsumsinya. Masyarakat di daerah yang banyak mengkonsumsi gula, lemak dan garam misalnya, ternyata lebih banyak ditemukan sebagai penderita penyakit degeneratif. Pemberian jumlah karbohidrat yang berlebih dalam jangka waktu lama dapat menimbulkan apa yang disebut dengan hiperglikemia. Hiperglikemia kronis cenderung menimbulkan efek yang tidak baik bagi kesehatan tubuh. Hiperglikemia kronis cenderung mendorong terbentuknya radikal bebas yang dapat merusak komponen sel (lipid, karbohidrat, protein, dan DNA) (Robertson, 2004). Kerusakan oksidatif tersebut merupakan cikal bakal munculnya penyakit degeneratif, misalnya diabetes. Penyakit

diabetes

merupakan

sindroma

multifaktor

yang

secara

metabolik

dikarakterisasi dengan kondisi hiperglikemia kronis yang timbul akibat ketidakmampuan pankreas memproduksi insulin yang cukup atau ketidakmampuan tubuh menggunakan insulin secara efektif (Auroma et al. 2006). Faktor penyebab penyakit diabetes meliputi faktor genetik, obesitas, radikal bebas, sistem kekebalan (Virtanen dan Knip 2003). Pada kondisi hiperglikemia, sel beta pankreas akan merespon dengan cara mengeluarkan insulin. Insulin berfungsi untuk menurunkan kadar glukosa darah melalui mekanisme memasukan glukosa ke dalam sel untuk selanjutnya mengalami metabolisme (Dominiczak, 2005). Jika kejadian hiperglikemia berlangsung lama (kronis), maka sel beta secara terus menerus menghasilkan insulin. Kondisi ini dapat menyebabkan sel beta mengalami kelelahan bahkan kerusakan sehingga produksi insulin bisa jadi berkurang. Dilain pihak, pada keadaan hiperglikemia, glukosa akan cenderung mengalami metabolisme kearah pembentukan radikal bebas (Robertson., 2004). Radikal bebas yang terbentuk akan bereaksi dengan komponen membran sel. Reaksi berantai

radikal bebas tersebut menyebabkan

kerusakan pada membran sel. Kondisi hiperglikemia tersebut akan menyebabkan perubahan patobiologis pada pankreas sehingga perlu dilakukan pengamatan terhadap kadar peroksidasi lipid pankreas, gambaran sel beta pankreas, dan gambaran histopatologi pankreas. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui patobiologis hiperglikemia terhadap jaringan pankreas tikus.

34

MATERI DAN METODE Bahan dan Alat penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: Tikus strain spraque dawley umur 2 bulan, kandang tikus dan perlengkapannya, pakan tikus, syring 2,5 cc, canul, dan sukrosa. Bahan pemeriksaan kadar MDA (sigma): TEP (1,1,3,3-tetraethoxypropane) (T-9889), BHT (butylated hydroxytoluene), TCA (thricloroacetic) (ACS Reagent) (T-9159), TBA (thio barbituric acid) dan 0.25 N HCl, dan strip test glukosa. Larutan H2O2, Serum normal (BSA) 10%, Antibodi primer monoklonal anti-insulin dan glukagon, Antibodi sekunder DEPS (Dako Envision Peroxidase System), larutan DAB (diaminobenzidine),

larutan Hematoksilin

(counterstain). Alat yang digunakan adalah: Spectrophotometer UV/VIS, tissue processor, tissue tek model TEC, Parafin cleaner, inkubator, penangas air, Sentrifugasi mikro, freezer -80 oC, magnetik stirer, homogenizer, timbangan, vortek, mikro-pipet, mikroskop yang dilengkapi dengan kamera, GlukoDr®, tip, tabung reaksi dan rak serta seperangkat glasswares. Metode Penelitian Persiapan hewan percobaan Pada penelitian ini digunakan 20 ekor tikus jantan putih strain Spraque dawley umur sekitar 2 bulan dengan bobot badan rata-rata 200 g. Tikus percobaan dibagi menjadi 2 kelompok perlakuan, tiap perlakuan

terdiri dari 10 ekor tikus. Tahap persiapan tikus

percobaan meliputi masa adaptasi selama 2 minggu dengan pemberian ransum komercial dan air minum secara ad libitum. Tikus perlakuan hiperglikemia (HG) diberikan larutan sukrosa 80% (w/v) secara oral (air minum) setiap hari selama 2 bulan. Larutan sukrosa diberikan dua kali sehari hari mulai pukul 08.00dan 18.00 Wita. Kelompok perlakuan yang dicobakan adalah sebagai berikut: c. Kelompok I (tikus kontrol), yaitu tikus normal hanya diberi air minum dan ransum. d. Kelompok II (tikus hiperglikemia=HG), yaitu tikus yang diberi larutan sukrosa 80% dua kali sehari secara oral dan diberi ransum komersial. Perlakuan pada seluruh kelompok diberikan selama 2 bulan. Pada akhir penelitian, semua tikus dikorbankan dengan cara dibius dengan ketamin-HCl. Segera setelah mati, tikus dibedah dan jaringan pankreas diambil untuk analisis kadar malonaldehida (MDA), dan pewarnaan histopatologi.

35

Analisis kadar glukosa darah Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan pada hari ke 0 (data base awal) dan setiap 1 minggu selama 2 bulan. Kadar glukosa darah tikus percobaan ditentukan dengan metode glucose oxidase biosensor, menggunakan alat Blood glucose Test Meter GlucoDr™ model AGM-2100 (diproduksi oleh allmedicus Co Ltd., Korea). Darah diambil dari ujung ekor tikus yang sebelumnya telah dibersihkan dengan alkohol 70%, lalu diurut perlahan-lahan kemudian ujung ekor ditusuk dengan jarum kecil (syring 1 cc) (Kim et al. 2006). Darah yang keluar kemudian disentuhkan pada strip glukometer. Kadar glukosa darah akan terbaca dilayar GlucoDr™ setelah 11 detik dan kadar glukosa darah dinyatakan dalam mg/dl.

Analisis kadar malonaldehida (MDA) Analisis kadar MDA menggunakan metode menurut Capeyron et al. (2002). Sebanyak 0,5 ml sampel (lisat pankreas) atau standar ditambah dengan 2 ml campuran HCl 0,25 N dingin yang mengandung 15% TCA, 0,38% TBA dan 0,5% BHT. Campuran larutan ini dipanaskan 80 0C selama 1 jam. Setelah dingin, campuran larutan dan standar disentrifugasi 3500 rpm selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh diambil dan diukur absorbansinya pada λ 532 nm.

Sebagai larutan standar digunakan TEP (1,1,3,3-tetraetoksipropana). Caranya

adalah membuat larutan kerja 5 µM TEP dengan mengencerkan larutan induk (stok) standar 2,5 mM TEP sebesar 500 kali dengan pelarut air bebas ion. Larutan standar MDA dibuat dengan mengencerkan larutan kerja (5 µM TEP) hingga diperoleh konsentrasi standar sebesar 0; 25; 50, 75; 100; 125; 150; 175; dan 200 pmol/50 µl. Kurva standar dibuat dengan memplotkan nilai absorbansi (sumbu Y) dengan konsentrasi standar (sumbu X). Kadar MDA sampel yang diperoleh dinyatakan dalam satuan picomol/g.

Analisis sel beta pankreas secara imunohistokimia. Analisis sel beta pankreas secara imunohistokimia dilakukan menggunakan metode menurut Beesley (1995). Jaringan pankreas difiksasi selama 24 jam dalam larutan formalin 10%, selanjutnya diproses dengan metode standar menggunakan paraffin. Preparat histologis yang telah dibuat, selanjutnya dilakukan pewarnaan imunohistokimia terhadap sel beta menggunakan metode tidak langsung dua tahap (metode antibodi berlabel enzim). Setelah deparafinasi dan rehidrasi, jaringan diinkubasi dengan H2O2 dalam methanol selama 15 menit untuk menghilangkan aktivitas peroksidase endogen. Selanjutnya jaringan diinkubasi dalam bovine serum albumin (BSA) 10% selama 45 menit dalam inkubator suhu 37°C. Setelah dicuci 3 kali dengan PBS, jaringan kemudian diinkubasi dalam antibodi primer monoklonal anti36

insulin pada suhu 40C selama 24 jam. Setelah dicuci 3 kali dengan PBS, kemudian jaringan diinkubasi dalam antibodi sekunder Dako Envision Peroksidase (Dako K 1941) pada suhu 37°C selama 60 menit. Setelah dicuci 3 kali dengan PBS, hasil reaksi antigen-antibodi divisualisasikan dengan menggunakan diamino benzidine (DAB) pada suhu kamar selama 25 menit. Setelah dicuci 3 kali dengan PBS, kemudian dikounterstain dengan hematoksilin. Preparat didehidrasi dan clearing kemudian dimounting dengan entelan. Pengamatan secara kualitatif dan kuantitatif dilakukan pada sel beta pankreas, yang jika positif ditunjukkan dengan warna coklat dan inti sel beta dapat dihitung.

Pengamatan gambaran histopatologi jaringan pankreas. Pembuatan sediaan histologis dilakukan menurut metode Kiernan (1990). Jaringan pankreas dicuci dengan larutan PBS (phosphate buffered saline pH 7,4) kemudian difiksasi dalam larutan formalin 10% selama 24 jam. Sampel jaringan dipindahkan dan disimpan di dalam alkohol 70% sampai proses selanjutnya. Sampel jaringan dipotong kecil-kecil dan didehidrasi di dalam seri larutan alkohol dengan konsentrasi bertingkat, kemudian dijernihkan dalam silol dan diembedding dalam paraffin. Blok paraffin dipotong serial dengan ketebalan 4 μm menggunakan mikrotom dan sayatan dilekatkan di atas gelas obyek. Setelah dilakukan proses deparafinasi dengan xylol selanjutnya dilakukan rehidratasi dengan alkohol absolut I, II, dan III, lalu alkohol 95 %, 90 %, 80 % dan 70 %, masing-masing selama 3 menit. Sesudah itu, sediaan preparat dibilas dengan air selama 5 menit dan aquades selama 5 menit dan pewarnaan HE. Sediaan yang telah diwarnai lalu diamati di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 200 kali. Pengamatan perubahan histopatologis

dilakukan secara deskriptif

pada satu

potongan sediaan dari setiap jairngan tikus percobaan. Pada setiap sediaan, pengamatan dilakukan pada 5 lapang pandang yang dipilih secara acak. Rancangan percobaan dan analisis data Penelitian ini menggunakan rancangan tidak berpasangan (independent) dengan perlakuan I adalah tikus normal, dan perlakuan II adalah tikus hiperglikemia. Data yang diperoleh dianalisis dengan Uji t tidak berpasangan. Sedangkan gambaran histopatologi pankreas dianalisis secara diskriptif.

37

HASIL DAN PEMBAHASAN Analisis kadar glukosa darah Hasil analisis kadar glukosa darah pada tikus percobaan selama 8 minggu diperlihatkan pada Gambar 2 dan Tabel 1. Kadar Glukosa darah (mg/dl)

160 140 120 100 80 60 40 20 0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

Minggu ke: Kontrol Hiperglikemia

Gambar 2. Profil kadar glukosa darah tikus selama 8 minggu percobaan Tabel 1. Kadar glukosa darah (mg/dl) tikus selama 8 minggu percobaan Perlakuan Kontrol normal Hiperglikemia

0 90,7± 2,9 94,7± 5,2

1 94,7± 5,4 95,0± 46

Kadar glukosa darah (mg/dl) minggu ke: 2 3 4 5 6 96,7± 96,2± 95,3± 93,9± 94,9± 3,9 3,3 3,2 3,5 4,5 99,5± 106,2± 119,5± 128,5± 133,4± 6,3 4,4 3,9 4,9 4,7

7 94,7± 3,7 138,8± 3,3

8 97.,8± 4,3 139,5± 5,2

Data pada Tabel 1, terlihat bahwa kadar glukosa darah pada kelompok kontrol relatif sama, yaitu berkisa antara 90,7 - 97,8 mg/dl dan secara statistik kadar glukosa darah kelompok kontrol tidak berbeda nyata (P>0,05). Kadar glukosa darah tikus perlakuan hiperglikemia, menunjukkan kadar awal (minggu ke 0) sebesar 94,7 mg/dl dan setelah minggu ke 8 kadar glukosa darah sebesar 139,9 mg/dl (Tabel 1). Kadar glukosa darah perlakuan hiperglikemia mulai mengalami kenaikan pada minggu ke 4 setelah perlakuan. Selanjutnya kadar glukosa darah tikus percobaan terus mengalami kenaikan sampai pada akhir percobaan. Kadar glukosa darah tikus normal sangat bervariasi, Ramesh dan Pugalendi (2006) melaporkan kadar glukosa darah tikus antara 74,35 – 84,85 mg/dl, sementara Gulfraz et al. (2007) melaporkan kadar glukosa darah normal antara 99-127 mg/dl. Pada penelitian ini diperoleh kadar normal glukosa darah tikus 90,7 - 97,8 mg/dl. Sedangkan kadar glukosa darah 38

tikus setelah minggu ke 4 atau pada minggu ke 5 sampai minggu 8 percobaan diperoleh sebesar 128,5-139,5 mg/dl. Hal ini berarti kadar glukosa darah tikus berada di atas batas nilai normal yang menandakan bahwa tikus dalam keadaan hiperglikemia. Data pada Gambar 1, memperlihatkan bahwa tikus mulai mengalami hiperglikemia setelah minggu ke 4 perlakuan dan selama empat minggu kedepan terus mengalami kenaikan. Hal ini berarti pemberian larutan sukrosa 80% pada tikus selama dua kali sehari telah mampu membuat tikus mengalami kenaikan kadar glukosa darah dan tikus percobaan mengalami hiperglikemia selama 4 minggu.

Analisis kadar malonaldehida (MDA) Malondialdehida merupakan produk akhir dari peroksidasi lipid.

Tingginya kadar

MDA, yang secara tidak langsung juga menunjukkan tingginya jumlah radikal bebas di dalam jaringan. Hasil analisis kadar malonaldehida pada tikus percobaan di tampilkan pada Tabel 2 dan Gambar 3. Tabel 2. Rata-rata kadar malonaldehida (MDA) pada pankreas tikus percobaan Kadar MDA picomol/g Perlakuan Kontrol 22,94 ± 3,82a Hiperglikemia 31,85 ± 5,69b Angka yang diikuti oleh huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan hasil uji berbeda nyata (P<0,05).

Rata-rata kadar malonaldehida (MDA) pakreas tikus perlakuan kontrol sebesar 22,94 picomol/g dan kadar MDA pankreas tikus hiperglikemia sebesar 31,85 picomol/g. Kadar MDA perlakuan hiperglikemia terlihat lebih besar bila dibandingkan dengan kadar pancreas perlakuan control dan berbeda nyata (P>0,05). Hal ini menunjukkan bahwa kondisi hiperglikemia menyebabkan kerusakan jaringan pankreas yang ditandai dengan meningkatnya kadar MDA. Terjadinya kerusakan jaringan pankeas disebabkan karena pada kondisi hiperglikemia terjadi produksi insulin oleh sel beta yang terus menerus sehingga menyebabkan kelelahan sel beta. Kelelahan sel beta diikuti dengan kerusakan komponen sel termasuk kerusakan jaringan lemak yang ditandai dengan kadar MDA yang meningkat. Menurut Robertson (2004), kelebihan glukosa di dalam tubuh atau hiperglikemia merupakan titik awal terjadinya pembentukan radikal bebas melalui berbagai mekanisme metabolisme biokimiawi.

39

G Gambar 3. Kaadar Malonaaldehida (MD DA) pada paankreas tikuus selama perrcobaan. G Glukosa dapat mengalam mi reaksi aautooksidasi menghasilkkan radikal hidroksil ▪

(OH ) (W Wolf et al., 1989). Prosses reaksinyya melalui ennolisasi glisserida-3P meembentuk senyawa enediol. Selanjutnya S enediol, beereaksi denggan Fe3+ m menghasilkann radikal enediol. Ion Fe2+ hasil h reduksi Fe3+, akkan bereaksi dengan

hidrogen peroksida p

melaporkan keadaan menghasilkan radikal hidroksill. Sementarra, Brownleee (2001) m g yanng dapat hiperglikkemia dapatt mengaktiffkan empatt jalur mettabolisme glukosa menghasilkan radikaal anion supeeroksida (O2▪) berlebih dalam d mitokoondria. Radikal bebas b yang terbbentuk (raddikal enedioll, radikal hhidroksil dann anion supperoksida) berpotensi menyebaabkan reakssi glikosilaasi protein dengan karbohidrat k dan berkkontribusi menyebaabkan kerusaakan membraan sel. B Beberapa hassil penelitiann menunjukkkan bahwa dalam d kondissi diabetes dilaporkan kadar enssim antioksidan intrasel pankreas meenurun dan kadar k MDA meningkat. Suarsana et al (20111), kadar MDA M pada paankreas tikuus yang menggalami hiperrglikemia lebbih tinggi (25,24 pm mol/g) dibanndingkan denngan tikus peerlakuan kon ntrol (19,57 pmol/g).

Analisis sel beta pa ankreas secaara imunoh histokimia H Hasil pewarnnaan imuno ohistokimia terhadap sel beta pannkreas diperlihatkan paada Gambar 4. Hasil pew warnaan imuunohistokim mia menunjuukkan bahwaa insulin terddapat pada inti dan sitopplasma dari sel beta. Seecara kualitaatif terlihat profil p kanduungan insulinn pada sel bbeta mengalam mi penurunaan pada kelo ompok hiperrglikemia diibandingkan kelompok kontrol. k Waarna coklat menunjukkan m n reaksi po ositif terhadap insulin n pada pew warnaan im munohistokim mia. Gambaraan sel beta pada tikuss kontrol dan d tikus peerlakuan hipperglikemia tidak banyyak 40

mengalami perbedaan. Sel beta terlihat ditengah dengan jumlah yang hampir sama pada kedua perlakuan.

HG

K0

50 μm

50 μm

Gambar 4. Foto mikrograf pewarnaan imunohistokimia terhadap insulin pada sel beta jaringan pankreas. Keterangan: K0=kontrol, HG=hiperglikemia, tanda panah: reaksi positif warna coklat. Pengamatan gambaran histopatologi jaringan pankreas. Secara umum hasil pengamatan mikroskopis terhadap gambaran jaringan pankreas menunjukkan bahwa nampak pulau Langerhans yang sangat jelas dengan warna lebih pucat dubandingkan dengan kelenjar eksokrin disekitarnya (Gambar 5). B B

A

A

K0

50 µm

HG

50 µm

Gambar 5. Foto mikrograf pulau Langerhans pankreas tikus pewarnaan HE. Keterangan: A= pulau Langerhans, B=kelenjar eksrokrin. K0=kontrol, dan HG=hiperglikemia. (tana panah: inti sel piknotis) Hasil pengamatan secara mikroskopik pada kelompok tikus kontrol (K0) tampak gambaran pulau Langerhans, baik dari segi bentuk, ukuran, dan massa sel jumlah cukup banyak. Pada pankreas kelompok tikus hiperglikemia menunjukkan adanya kerusakan yang mengarah ke degenerasi dengan derajat ringan dengan beberapa inti mengalami piknotis 41

(Gambar 5). Kondisi hiperglikemia dapat menyebabkan terjadinya degenerasi dengan derajat ringan dan inti mengalami piknotis pada kelompok HG. Hal ini dikarenakan pada kondisi hiperglikemia menyebabkan sel-sel pankreas, khususnya sel beta mengalami kelelahan karena fungsinya yang terus menerus harus menghasilkan dan mengekskresikan insulin. Faktor kelelahan dapat menyebabkan sel stress dan lebih cepat mengalami kerusakan. Selain itu, menurut Robertson (2004), kondisi hiperglikemia dapat menyebabkan stress oksidatif. Pada kelebihan glukosa yang cukup lama dapat menyebabkan terbentuknya radikal bebas yang berlebihan. Radikal bebas yang terbentuk ini dapat menyerang sel-sel di sekitarnya, termasuk sel-sel pankreas. Akibat reaksi berantai radikal bebas tersebut menyebabkan sel mengalami kerusakan.

KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Hiperglikemia menyebabkan kondisi patobiologis pada jaringan pankreas berupa meningkatnya kadar malonaldehid (MDA), masa sel beta berkurang dan sel pankreas mengakami degenerasi ringan.

Saran Kondisi hiperglikemia dibuat lebih lama dan tingkat kenaikan kadar glukosa darah lebih tinggi sehingga efek patobiologisnya pada jaringan pankreas dapat di amati lebih jelas. Selain itu perlu juga diamati sel alpha apakah dipengaruhi oleh kondisi hiperglikemia.

UCAPAN TERIMAKASIH Pada kesempatan ini, ucapan terimakasih disampaikan kepada Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan Nasional dan Rektor Univesitas Udayana yang telah memberikan biaya penelitian dari Dana RM Universitas Udayana dengan surat Perjanjian Penugasan Penelitian No:175.59/UN14.2/ PNL.01.03.00/2013, Tanggal 16 Mei 2013

42

DAFTAR PUSTAKA Asikin N. 2001. Antioksidan endogen dan penilaian status antioksidan. Di dalam: Prosiding Kursus Penyegar radikal bebas dan antioksidan dalam kesehatan: dasar aplikasi dan pemanfaatan bahan alam. Jakarta 16 April 2001. Bagian Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia Auroma OI, Neergheen VS, Bahorun T, Jen LS. 2006. Free radicals, Antioxidants and Diabetes: Embryopathy, Retinopathy, Neuropathy, Nephropathy and Cardiovascular Complications. Neuroembryol Aging 4:117-137. Beesley, JE. 1995. Immuno-cytochemistry: A Practical Approach. IRL. Press Oxford University Press, New York. P.15-41 Brownlee M. 2001. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature 414:813-820 Capeyron MFM, Julie C, Eric B, Jean P, Jean MR,, Piere B, Claude LL, Benard D. 2002. A diet cholesterol and deficient in vitamin E induces lipid peroxidation but does not enhace antioxidant enzyme expression in rat liver. J Nutr Biochem 13:296-301 Conti, M., P.C. Moramd, P.Levillain, and A.Lemonnier. 1991. Improve Flurometric Determination of Malonaldehyde. J. Clin. Chem. 37(7):1273-1275. Dominiczak MH. 2005. Glucose homeostasis, fuel metabolism and insulin. Di dalam Baynes JW dan Dominiczak MH Editor. Medical Biochemistry. Second Edition. Elsivier Mosby. Hlm 273-197 Draper HH, Polensek L, Hadley TM, Mcgirr LG. 1984. Urinary Malondialdehyde as an Indicator of Lipid Peroxidation in the Diet and in the Tissues. Lipids 19 (11):836-843. Freisleben H.J. 2001. Free radical and ROS in biological system. Di dalam: Prosiding Kursus Penyegar radikal bebas dan antioksidan dalam kesehatan: dasar aplikasi dan pemanfaatan bahan alam. Jakarta 16 April 2001. Bagian Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Gulfraz M, Qadir G, Noshhen F, Parveen Z. 2007. Antihyperglycemic effects of Berberis lyceum royle in alloxan induced diabetic rats. Diabetologia Croatica 36 (3):49-54 Kiernan JA. 1990. Histopatological and Histochemical Methods: theory and Practice. Pergamon Press. Kim JS, Ju JB, Choi CW, Kim SC. 2006. Hypoglycemic and antihyperlipidemic Effect of Four Korean Medicinal Plants in Alloxan Induced Diabetic Rats. Am J Biochem and Biotech 2: 154-160 Luczaj W, Skrzydlewska E. 2003. DNA damage caused by lipid peroxidation products. Cellular & molecular biology letters 8:391-413 Newsholme P,Haber EP, Hirabara SM, Rebelato ELO, Procopio J, Morgan D, Oliveira-Emilio HC, Carpinelli AR, Curi R. 2007. Diabetes associated cell stress and dysfunction: role of mitochondrial and non-mitochondrial ROS production and activity. J Physiol 583. 9–24. Ramesh B, Pugalendi KV. 2006. Antihyperglycemic Effect of Umbelliferone in Streptozotocin-Diabetic Rats. Journal of Medicinal Food. J Med Food 9 (4), 562–566.

43

Rasal VP, Shetty BBP, Sinnathambi A, Yeshmaina S, Ashok P. 2008. Antihyperglycaemic and Antioxidant Activity of Brassica Oleracea In Streptozotocin Diabetic Rats. The Internet Journal of Pharmacology. ISSN: 1531-2976. 10 halaman. http://www.ispub.com/ostia/ index.php?xmlFilePath= journals/ ijpharm/vol4n2/antioxidant.xml (1 of 10) Robertson RP, Harmon J, Tran PO, Poitout V. 2004. β-Cell Glucose Toxicity, Lipotoxicity, and Chronic Oxidative Stress in Type 2 Diabetes. Diabetes. 53, :S119-S124 Robertson. 2004. Minireview: Chronic Oxidative Stress as a Central Mechanism for Glucose Toxicity In Pancreatic Islet Beta Cells In Diabetes. J. of Biological Chemistry Vol. 279(41): 42351–42354 Soewoto H. 2001. Antioksidan eksogen sebagai lini pertahanan kedua dalam menanggulangi peran radikal bebas. Di dalam: Prosiding Kursus Penyegar radikal bebas dan antioksidan dalam kesehatan: dasar aplikasi dan pemanfaatan bahan alam. Jakarta 16 April 2001. Bagian Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Suarsana N., Utama IH, Suartini, IGA. Pengaruh hiperglikemia dan Vitamin E pada kadar manolaldehida dan enzim antioksidan intrasel jaringan pankreas tikus. Majalah Kedokteran Bandung (MKB). 43 (2):72-76. Szkudelski T. 2001. The mechanism of alloxan and sreptozotocin action in cells of the rat pancreas. Physiol Res 50:536-546. Thomas, JA. 1999. Oxidative Stress: including glutathione, a peptide for cellular defense against oxidative stress. Departement of Biochemistry and Biophysics Iowa State University Ames, IA. 5001 Tug T, Karatas F, Terzi SM, Ozdemir N. 2005. Comparison of serum malondialdehyde levels determined by two different methods in patients with COPD: HPLC or TBARS Methods. Science 36:41-44. Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin MTD, Mazur M, Telser J. 2007. Review: Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Inter J Biochem & Cell Biol 39:44-84. Virtanen SM, Knip M. 2003. Nutritional risk predictors of cell autoimmunity and type 1 diabetes at a young age. Am J Clin Nutr. 78:1053– 1067 Wolff SP, Bascal Z, Hunt JV. 1989. Autoxidative glycosylation: free radicals and glycation theory. In: Kunio Yagi, ed. The Maillard Reaction in Ageing, Diabetes and Nutrition. Alan R. Liss, Inc. 247-275.

44