MORFOLOGI, MORFOMETRI DAN DISTRIBUSI SEL IMUNOREAKTIF INSULIN DAN GLUKAGON PADA PANKREAS TIKUS (Rattus norvegicus) OBESITAS
Tesis
Diajukan oleh: Dela Ria Nesti 12/338414/PKH/00463
Kepada PROGRAM STUDI PASCASARJANA SAIN VETERINER FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA 2015
KATA PENGANTAR Puji syukur penulis sampaikan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya yang telah dicurahkan kepada penulis sehingga tulisan ini dapat diselesaikan. Tulisan ini merupakan hasil penelitian mengenai morfologi, morfometri dan distribusi sel imunoreaktif insulin dan glukagon pada pankreas tikus (Rattus norvegicus) obesitas. Tesis ini disusun sebagai salah satu syarat untuk mendapatkan gelar Magister di Program Studi Sain Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada. Penulis mengucapkan terimakasih kepada: 1. drh. Teguh Budipitojo, M.P., Ph.D. dan drh. Yuda Heru Fibrianto, MP., Ph.D. selaku dosen pembimbing yang telah memberikan waktu, motivasi, nasehat dan kesabarannya dalam mengarahkan hingga penelitian dan penulisan tesis ini selesai. 2. Dr. drh. Tri W. Pangestiningsih, MP, drh. D.L. Kusindarta, MP., Ph.D. dan Prof. Dr. drh. Wayan T.A., sebagai dosen penguji tesis yang telah menguji dan memberikan saran sehingga tesis ini menjadi lebih baik. 3. Pengelola Program Studi Sain Veteriner beserta seluruh staf di Fakultas Kedokteran Hewan UGM yang telah membantu dalam kelancaran penyelesaian studi S2. 4. Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi yang telah memberikan beasiswa unggulan pendidikan pascasarjana sehingga penulis dapat menyelesaikan studi S2. 5. Direktur Sekolah Vokasi dan Kaprodi D3 Kesehatan Hewan beserta seluruh staf pengajar dan pengelola yang telah memberikan izin dan dukungan kepada penulis untuk menyelesaikan studi S2. 6. Seluruh staf pengajar dan karyawan Laboratorium Mikroanatomi FKHUGM atas nasehat, dukungan dan bantuannya
selama penelitian dan
penulisan tesis.
iii
7. Bapak Yuli, selaku laboran Laboratorium Gizi gedung PAU UGM, atas saran dan bantuannya selama penelitian berlangsung. 8. Bapak Mukhtar Yunus, Ibu Pri Emida, Recci Murinanda, Helly Anggi Comita dan Riski Septrino beserta seluruh keluarga besar yang telah memberikan dukungan dan doa sehingga penulis dapat menyelesaikan studi S2.
Yogyakarta, 25 September 2014
Penulis
iv
DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL.........................................................................................
i
HALAMAN PENGESAHAN..........................................................................
ii
KATA PENGANTAR......................................................................................
iii
PERNYATAAN KEASLIAN PENELITIAN................................................
v
DAFTAR ISI.....................................................................................................
vi
DAFTAR TABEL............................................................................................. viii DAFTAR GAMBAR........................................................................................
ix
DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................
x
DAFTAR SINGKATAN..................................................................................
xii
INTISARI.......................................................................................................... xiv ABSTRACT......................................................................................................
xv
PENDAHULUAN............................................................................................ Latar Belakang ....................................................................................... Perumusan Masalah............................................................................... Tujuan Penelitian.................................................................................... Manfaat Penelitian.................................................................................. Keaslian Penelitian.................................................................................
1 3 3 3 3 4
TINJAUAN PUSTAKA.................................................................................. Obesitas.................................................................................................. Pengertian dan prevalensi........................................................... Tipe obesitas.............................................................................. Faktor penyebab obesitas ........................................................... Indeks obesitas........................................................................... Efek obesitas............................................................................... Mekanisme Regulasi Energi................................................................... Sistem regulasi energi................................................................. Metabolisme karbohidrat............................................................ Metabolisme lipid....................................................................... Pankreas................................................................................................. Bagian eksokrin......................................................................... Bagian endokrin.......................................................................... Insulin..................................................................................................... Glukagon................................................................................................ Identifikasi Sel........................................................................................ Pewarnaa Victoria blue............................................................... Pewarnaan imunohistokimia......................................................
6 6 6 7 8 11 12 12 12 15 16 19 20 21 22 23 24 24 24
vi
Landasan Teori...................................................................................... Hipotesis.................................................................................................
26 27
MATERI DAN METODE............................................................................... Waktu dan Tempat................................................................................. Materi..................................................................................................... Sampel ....................................................................................... Bahan.......................................................................................... Alat............................................................................................. Metode.................................................................................................... Perlakuan terhadap hewan coba................................................. Pemeriksaan kadar gula darah dan lipid.................................... Koleksi sampel dan preparasi jaringan pankreas....................... Pewarnaan Hematoksilin Eosin (HE)......................................... Pewarnaan Victoria blue............................................................. Pewarnaan imunohistokimia...................................................... Analisa hasil...............................................................................
28 28 28 28 28 29 29 29 30 32 33 34 36 37
HASIL DAN PEMBAHASAN........................................................................ Profil Berat Badan dan Indeks Obesitas................................................. Profil Lipid dan Glukosa darah ............................................................. Profil lipid .................................................................................. Profil glukosa darah ................................................................... Topografi Pankreas................................................................................. Morfologi dan MorfometriPulau Langerhans...................................... Morfologi, Morfometri dan Distribusi Sel Imunoreaktif Insulin dan Glukagon................................................................................................ Morfologi dan distribusi sel imunoreaktif insulin dan glukagon..................................................................................... Morfometri dan kepadatan sel imunoreaktif insulin dan glukagon.....................................................................................
39 39 40 40 42 43 44
KESIMPULANDAN SARAN........................................................................ Kesimpulan............................................................................................. Saran ......................................................................................................
59 59 60
HALAMAN PENGESAHAN RINGKASAN.................................................
61
RINGKASAN....................................................................................................
62
DAFTAR PUSTAKA.......................................................................................
69
LAMPIRAN......................................................................................................
77
46 46 52
vii
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel 1. Penghitungan indeks obesitas pada hewan coba...............................
10
Tabel 2. Komposisi diet tinggi lemak dan karbohidrat kelompok obesitas serta perbandingannya dengan normal (kontrol)..............................
30
Tabel 3. Hasil pengukuran indeks obesitas.....................................................
39
Tabel 4. Profil lipid dan glukosa plasma kelompok obesitas dan kontrol......
42
Tabel 5. Morfometri Pulau Langerhans pada tikus obesitas dan kontrol.......
45
Tabel 6. Morfometri dan densitas sel imunoreaktif insulin dan glukagon pada tikus obesitas dan kontrol........................................................
54
Tabel 7. Perbandingan proporsi sel IR insulin dan glukagon dengan total sel endokrin dalam Pulau Langerhans.............................................
57
viii
DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Regulasi neuroendokrin terhadap keseimbangan energi pada kondisi lapar.................................................................................
13
Gambar 2. Regulasi neuroendokrin terhadap keseimbangan energi pada kondisi kenyang.........................................................................
14
Gambar 3. Inflamasi pada jaringan adiposa..................................................
18
Gambar 4. Gangguan penyimpanan trigliserida pada jaringan otot akibat obesitas........................................................................................
19
Gambar 5. Sketsa regio lokasi pankreas pada tikus......................................
20
Gambar 6. Ilustrasi metode Labeled Streptavidi-biotin(LSAB)...................
26
Gambar 7. Ukuran tubuh tikus kelompok obesitas dan kontrol....................
40
Gambar 8. Topografi pankreas kelompok obesitas dan kontrol...................
46
Gambar 9. Morfologi Pulau Langerhans kelompok obesitas dan kontrol..... 47 Gambar 10. Bentuk sel, bentuk nukleus dan letak nukleus kelompok obesitas dan kontrol....................................................................
50
Gambar 11. Distribusi sel IR insulin kelompok obesitas dan kontrol............
51
Gambar 12. Distribusi sel IR glukagon kelompok obesitas dan kontrol........
51
Gambar 13. Pola distribusi sel IR insulin dan glukagon pada Pulau Langerhans yang sama................................................................
52
Gambar 14. Distribusi sel IR insulin dan glukagon pada area asinus/eksokrin...........................................................................
53
Gambar 15. Distribusi sel IR insulin dan glukagon pada area duktus pankreatikus...............................................................................
54
ix
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman Lampiran 1.
Komposisi reagen pada pemeriksaan kadar glukosa darah.................. 77
Lampiran 2.
Komposisi reagen pada pemeriksaan kadar trigliserida....................... 77
Lampiran 3.
Komposisi reagen pada pemeriksaan HDL.......................................... 77
Lampiran 4.
Komposisi reagen pada pemeriksaan LDL..........................................
77
Lampiran 5.
Komposisi reagen pada pemeriksaan total kolesterol..........................
77
Lampiran 6.
Data pengukuran panjang tubuh (hidung-anus) dan berat badan kelompok obesitas dan kontrol............................................................. 78
Lampiran 7.
t-Test: two-sample assuming unequal variances “kadar glukosa”....... 78
Lampiran 8.
t-Test:two-sample assuming unequal variances “total kolesterol”...... 78
Lampiran 9.
t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances“Trigliserida”........ 78
Lampiran 10. t-Test: Two-sample assuming unequal variances“HDL”..................... 79 Lampiran 11. t-Test: Two-sample assuming unequal variances “LDL”.................... 79 Lampiran 12. t-Test: Two-sample assuming equal variances “Diameter Langerhans”......................................................................................... 79 Lampiran 13. t-Test: Two-sample assuming equal variances “Keliling Pulau Langerhans”......................................................................................... 79 Lampiran 14. t-Test: Two-sample assuming equal variances “Volume Pulau Langerhans”.......................................................................................... 80 Lampiran 15. t-Test: Two-sample assuming unequal variances “Diameter sel IR insulin”.................................................................................................. 80 Lampiran 16. t-Test: Two-sample assuming equal variances “Diameter nukleus sel IR insulin”.....................................................................................
80
Lampiran 17. t-Test: Two-sample assuming unequal variances “Volume sel IR insulin”................................................................................................
80
Lampiran 18. t-Test: Two-sample assuming equal variances “Volume nukleus sel IR insulin”............................................................................................ 81 Lampiran 19. t-Test: Two-sample assuming unequal variances “Jumlah sel IR insulin/Pulau Langerhans”..................................................................
81
Lampiran 20. t-Test: Two-sample assuming equal variances“Jumlah sel IR Insulin pada area asinus”.....................................................................
81
x
Lampiran 21. t-Test: Two-sample assuming equal variances “Jumlah sel IR insulin pada area duktus”..................................................................
81
Lampiran 22.
t-Test: Two-sample assuming equal variances “diameter sel IR glukagon”...........................................................................................
82
Lampiran 23.
t-Test: Two-sample assuming equal variances “Volume sel IR glukagon”...........................................................................................
82
Lampiran 24.
t-Test: Two-sample assuming equal variances “Diameter nukleus sel IR glukagon”...............................................................................
82
Lampiran 25.
t-Test: Two-sample assuming equal variances “Volume nukleus sel IR glukagon”...............................................................................
82
Lampiran 26.
t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances “Jumlah sel IR glukagon pada area eksokrin”...........................................................
83
Lampiran 27.
t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances “Jumlah sel IR glukagon pada area duktus”...............................................................
83
Lampiran 28.
t-Test: Two-sample assuming unequal variances “Jumlah sel total/Pulau Langerhans”....................................................................
xi
83
DAFTAR SINGKATAN
AgRP
: Agouti-Related Peptide
ARC
: Arcuate nucleus
BB
: Berat Badan
CART
: Cocain-and Regulated Transcript
CCK
: Cholecystokinin
CHOD-PAP : Cholesterol Oxidase Para Aminophenazone CMC
: Carboxyl Methyl Celulose
CRH
: Corticotropin-Releasing Hormone
DAB
: Diaminobenzidine
EDTA
: Ethylene Diamine Tetra Acid
GLP-1
: Glukagon-Like peptide1
GLUT-4
: Glucose Transporter-4
GOD-PAP
: Glucose Oxidase Para Aminophenazone
HDL
: High Density Lipoprotein
HFP
: High Fat Diet Postnatal
HE
: Hematoksilin Eosin
H2O2
: Hidrogen Peroksidase
IKKβ
: IK-β Kinase
IL-1β
: Interleukin-1β
IR
: Imunoreaktif
JNK
: C-Jun N-Terminal Kinase
LHA
: Lateral Hypothalamic Area:
LDL
: Low Density Lipoprotein
LSAB
: Labeled Streptavidin Biotin
MCH
: Melanin-Concentrating Hormone
MCP-1
: Monocyte Chemoatractant Protein-1
MHA
: Mean Hormonal Area
MPA
: Mean Percent of Hormone Stain Cell Area
xii
NPY
: Neuropeptida-Y
NTS
: Nucleusof the Solitary Tract
OX
: Oxytocin
OXY
: Oxytocin
PBS
: Phosphate Buffer Saline
PDX-1
: Pancreatic Homedomain Protein
PFA
: Perifornical Area
PKC
: Protein kinase C
POMC
: Propriomelanocortin
PPARγ
: Peroxisome Proliferator-Actived Receptor γ
PVN
: Paraventricular Nucleus
PYY
: Peptide YY
T3
: 3.5.3 Triodothironine
T4
: Tiroksin
TNF-α
: Tumour Necrosis Factor-α
TRH
: Thyrotropin-Releasing Hormone
TSH
: Tiroid Stimulating Hormone
VLDL
: Very Low Density Lipoprotein
WHO
: World Health Organization
xiii
INTISARI MORFOLOGI, MORFOMETRI DAN DISTRIBUSI SEL IMUNOREAKTIF INSULIN DAN GLUKAGON PADA PANKREAS TIKUS (Rattus norvegicus) OBESITAS
Oleh drh. Dela Ria Nesti Gambaran histologi pankreas akibat pengaruh obesitas menggunakan tikus normal (non genetically obese) yang diinduksi obesitas belum pernah dilaporkan. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi morfologi, morfometri dan distribusi sel imunoreaktif insulin dan glukagon dari pankreas tikus non genetically obese yang diinduksi obesitas dan membandingkannya dengan tikus normal (kontrol). Penelitian menggunakan tikus jantan jenis wistar umur 4 minggu, terdiri dari 5 ekor kelompok kontrol dan 5 ekor kelompok obesitas. Kelompok kontrol diberi pakan dengan komposisi 76% karbohidrat, 16% protein dan 8% lemak sedangkan kelompok obesitas diberi pakan dengan komposisi 47% karbohidrat, 22% protein, dan 31% lemak serta tambahan induksi peroral dari suspensi fruktosa dan kolesterol masing-masing (1%/BB dalam 2 ml Na CMC) setiap hari selama 9 minggu. Eutanasi dengan kloroform dilakukan setelah pengukuran indeks obesitas, penghitungan kadar glukosa darah dan lipid. Sampel organ pankreas difiksasi dengan larutan Bouin, diblok dengan paraffin dan dipotong serial dengan ketebalan 5 µm. Jaringan pankreas divisualisasikan dengan pewarnaan hematoksilin eosin, Victoria blue dan imunohistokimia metode Labeled Streptavidin-biotin (LSAB). Antibodi primer yang digunakan yaitu mouse anti-insulin (1:1500; Abcam, USA) dan rabbit anti-glucagon (1;1500; CosmoBio Co, Japan). TrekUniversal Link Kit (Biocare Medical, USA) digunakan sebagai visual detektor yang hasil pewarnaanya dianalisa secara deskriptif dan kuantitatif. Profil lipid dan glukosa kelompok obesitas menunjukkan nilai total kolesterol (160,62±3,52) mg/dl, kadar trigliserida (98,61±2,66) mg/dl, LDL (67,51±1,81) mg/dl, HDL (44,68±2,25) mg/dl dan kadar glukosa (161,43±7,61) mg/dl. Topografi pangkreas kelompok obesitas tersebar pada 3 lokasi yaitu area gastrium, duodenum, dan lien. Morfologi Pulau Langerhans kelompok obesitas berbentuk bulat, oval dan poligonal serta dikelilingi oleh serabut halus dan kapiler darah. Morfologi sel imunoreaktif insulin dan glukagon kelompok obesitas berbentuk poligonal tidak beraturan dengan inti bulat/oval dan terletak di sentral/perifer. Sel imunoreaktif insulin kelompok obesitas tersebar pada bagian tengah dan beberapa pada bagian tepi Pulau Langerhans sedangkan sel imunoreaktif glukagon dominan tersebar pada bagian tepi dan sedikit pada bagian tengah Pulau Langerhans. Penghitungan morfometri sel menunjukkan diameter Pulau Langerhans kelompok obesitas (154,38±65,56) µm, keliling Pulau Langerhans (373,51±146,69) µm, volume Pulau Langerhans 3.241.105,96 µm3, jumlah sel total/Pulau Langerhans (181,90±96,76), jumlah sel imunoreaktif insulin (113,66±60,90) dan jumlah sel imunoreaktif glukagon (46,98±25,80). Kelompok obesitas menunjukkan perbedaan dengan kontrol berupa peningkatan nilai total kolesterol, kadar trigliserida, LDL, kadar glukosa, diameter Pulau Langerhans, volume Pulau Langerhans, keliling Pulau Langerhans, jumlah sel imunoreaktf insulin/Pulau Langerhans dan jumlah sel imunoreaktif glukagon/Pulau Langerhans (P<0,05). Morfologi, morfometri dan distribusi Pulau Langerhans beserta sel imunoreaktif insulin dan glukagon pada pankreas tikus (non genetically obese) yang diinduksi obesitas menggunakan diet tinggi karbohidrat dan lemak menunjukkan adanya hiperplasia sel imunoreaktif insulin dan glukagon sebagai kompensasi peningkatan volume Pulau Langerhans. Kata kunci: Obesitas, insulin, glukagon, Victoria blue, imunohistokimia. xiv
ABSTRACT MORPHOLOGY, MORPHOMETRY AND DISTRIBUTION OF INSULIN AND GLUCAGON IMMUNOREACTIVE CELLS IN PANCREAS OF OBESE RATS (Rattus norvegicus) By drh. Dela Ria Nesti
Histology changes of the pancreas due to the influence of obesity in normal (non genetically obese) rats with diet-induced obesity has not been reported. This study aims to identify the morphology, morphometry and distribution of insulin and glucagon immunoreactive cells of the pancreas in normal (non genetically obese) rats obesity induced by high carbohydrates and fats diet and compared with normal rats (control). The research used male rats, wistar strain, 4 weeks in age, consist of 5 rats control group and 5 rats obese group. The control group was feed with standard composition. The obese group was feed with a high carbohydrate and fat and an additional induction of oral suspension fructose and cholesterol of each doses (1%/weight homogenized in 2 ml Na CMC) every day for 9 weeks. Euthanasia with chloroform used after the measurement of obesity index, counting blood glucose and lipid levels. Samples of pancreatic organ were fixed with Bouin’s solution, blocks with paraffin and serially cut with a thickness of 5 µm. Pancreatic tissues were visualized by Haematoxilin eosin, Victoria blue, and immunohistochemical with Labeled Streptavidin-biotin (LSAB) staining methods. Primary antibody use mouse anti-insulin (1:1500; Abcam, USA), rabbit anti-glucagon (1:1500; CosmoBioCo., Japan) and TrekUniversal Link Kit (Biocare Medical, USA). The results were analyzed by descriptive and quantitative method. Lipid and glucose profile of obese group show total cholesterol (160.62±3.52) mg/dl, triglyceride levels (98.61±2.66) mg/dl, LDL (67.51±1.81) mg/dl, HDL (44.68±2.25) mg/dl and glucose levels (161.43±7.61) mg/dl. Topography pancreatic obese group spread in three locations (gastrium area, duodenum, and spleen). The morphology of Langerhans Island of obese group are round, oval, polygonal and surroundings of fine fibers and capillary blood. Morphology of insulin and glucagon immunoreactive cells in obese group are irregular polygonal in shape with a core round/oval and located in central/peripheral. Insulin Immunoreactive cells in obese group spread in the middle and some on the edge of the island of Langerhans whereas glucagon immunoreactive cells dominant spread on the edges and a little number in the middle of the island of Langerhans. Morphometry of cells in obese group show Langerhans Island diameter (154.38±65.56) µm, Langerhans Island roving (373.51±146.69) µm, Langerhans Island volume 3,241,105.96 µm3, the total number of cells/Langerhans Island (181.90±96.76), the amount of insulin Immunoreactive cells (113.66±60.90) and the amount of glucagon immunoreactive cells (46.98±25.80). Obese group show differences with the control by increasing the value of total cholesterol, triglyceride levels, LDL, glucose levels, Langerhans Island diameter, Langerhans Island roving, Langerhans Island volume, the amount of insulin imunoreaktf cells/Langerhans Island and the amount of glucagon imunoreaktf cells/Langerhans Island (P<0.05). Morphology, morphometry and distribution of Langerhans island, insulin and glucagon immunoreactive cells of the pancreas in normal (non-genetically obese) rats obesity induced by a high carbohydrates and fats diet show hyperplasia in insulin and glucagon immunoreactive cells as a compensation of the increasing of the islet Langerhans volume. Keywords: Obesity, insulin, glucagon, victoriablue, immunohistochemistry
xv
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Obesitas mulai menjadi masalah kesehatan di seluruh dunia. Perubahan sosial dan transisi gizi pada negara-negara maju dan berkembang termasuk Indonesia telah mendorong epidemi obesitas selama beberapa dekade terakhir. Pertumbuhan ekonomi, modernisasi, urbanisasi dan globalisasi pasar makanan adalah beberapa elemen yang telah memberikan kontribusi terhadap epidemi obesitas (Kanasaki dan Koya 2011). Kondisi ini juga terjadi pada hewan kesayangan seperti anjing jenis Labrador retriever, Terrier cairn dan Beagles yang dilaporkan sering mengalami obesitas (Manens et al., 2012). Gangguan hemostatis energi yang berasal dari predisposisi genetik bisa mempromotori obesitas (Martyn et al., 2008). Penelitian tentang pengaruh obesitas pada hewan genetic obese melalui mutasi gen seperti ob/ob mice, db/dbmouse, Zunker fa/fa rat dan BSB mouse sudah banyak dilakukan (Vicker et al., 2011; Slavin et al., 2010). Obesitas baru-baru ini tidak dianggap sebagai kelainan kongenital spesifik atau kelainan turunan terhadap metabolisme lipid tetapi lebih kepada ketidakmampuan tubuh dalam mengatasi tingginya asupan nutrisi akibat perubahan gaya hidup (Martyn et al., 2008). Kalori yang berlebih diketahui menjadi salah satu promotor terjadinya obesitas. Pemberian diet tinggi lemak (50%) dan karbohidrat (65%) pada hewan non-genetic obese dapat mencerminkan pola asupan nutrisi sosial modern selama dua dekade terakhir yang
1
memberikan kontribusi utama terhadap epidemi obesitas (Dourmashkin et al., 2005; Wang dan Liao, 2012). Diet lemak memberikan kontribusi yang signifikan terhadap berat badan, hiperfagia dan penumpukan lemak di dalam tubuh. Pemberian diet tinggi lemak menyebabkan peningkatan sirkulasi leptin, insulin, trigliserida dan glukosa yang berefek pada aktivitas lipoprotein lipase dalam jaringan lemak yang meningkatkan uptake lemak serta menurunkan pengeluaran energi, aktivitas nervus simpatetik dan oksidasi karbohidrat di otot. Kelebihan asupan karbohidrat juga berkontribusi menyebabkan obesitas dengan stimulasi sekresi insulin (Dourmashkin et al., 2005). Insulin dan glukagon merupakan regulator utama dalam mengatur metabolisme energi. Insulin membantu mengontrol kadar glukosa dengan meningkatkan uptake glukosa di jaringan, stimulasi glikogenesis, serta menghambat glikogenolisis dan glukoneogenesis. Insulin berperan dalam mempromotori lipogenesis, penyimpanan trigliserida, menginduksi sintesis protein di hepar dan otot serta meningkatkan pertumbuhan proliferasi sel pada kondisi obesitas. Glukagon berfungsi sebagai penyeimbang dan menjaga konsentrasi glukosa tetap normal dalam darah (Aronoffet al., 2004). Pengaruh obesitas pada pankreas tikus non-genetic obese yang diberi diet tinggi karbohidrat dan lemak perlu divisualisasikan ditingkat seluler melalui identifikasi morfologi, morfometri dan distribusi Pulau Langerhans, sel imunoreaktif insulin dan sel imunoreaktif glukagon.
2
PerumusanMasalah
Bagaimana morfologi, morfometri dan distribusi sel imunoreaktif insulin dan sel imunoreaktif glukagon pankreas tikus non genetically obese yang diinduksi obesitas dibandingkan dengan tikus normal.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi morfologi, morfometri dan distribusi Pulau Langerhans, sel imunoreaktif insulin dan sel imunoreaktif glukagon dari pankreas tikus non genetically obese yang diinduksi obesitas serta membandingkannya dengan tikus normal.
Manfaat
Penelitian ini diharapkan dapat menjelaskan dan memberikan data tentang morfologi, morfometri, dan distribusi sel imunoreaktif insulin dan glukagon pankreas tikus non genetically obese yang diinduksi obesitas, sehingga dapat menjadi informasi untuk mencegah terjadinya obesitas.
Keaslian Penelitian
Penelitian tentang obesitas menggunakan tikus genetik obesitas sebagai objek penelitian telah banyak dilakukan (Bathena et al.,1987; Ikemoto et al., 1995). Mencit yang mengalami obesitas menunjukkan hiperplasia Pulau
3
Langerhans, hipertropi Pulau Langerhans serta hiperplasia sel α, β, dan δ (Tomita et al.,1992; Lindstrom, 2007; Slavin et al., 2010; Harishankar et al., 2011). Morfologi, morfometri dan distribusi sel IR insulin dan glukagon pada pankreas tikus normal dan albino ddY sudah dipublikasikan sebelumnya oleh Elayat et al. (1995), Watanabe et al. (1998), serta Lee and Ku (2005). Pemberian diet tinggi lemak pada tikus bunting beserta keturunan jantan dan betinanya sampai postnatal menunjukkan perubahan signifikan di Pulau Langerhans antara lain hiperplasia sel α, sel β dan peningkatan proliferasi sel asinus pada (Cerf et al., 2012). Penelitian terkait pengaruh obesitas terhadap histologi pankreas sebagaimana digambarkan di atas, pada umumnya menggunakan tikus yang secara genetik dibuat mudah menjadi obesitas (genetic obese rat). Penelitian yang menggambarkan pengaruh obesitas akibat diet tinggi lemak dan karbohidrat terhadap aktivitas sel penghasil insulin dan glukagon pada pankreas menggunakan tikus normal (non genetic obese rat) belum dilaporkan.
4
TINJAUAN PUSTAKA
Obesitas
Pengertian dan prevalensi Obesitas dapat diartikan sebagai penimbunan jaringan lemak tubuh secara berlebihan dan memberi efek buruk pada kesehatan (Rahman et al., 2012). Hofbauer (2002) menyatakan bahwa obesitas merupakan suatu peningkatan massa jaringan lemak tubuh yang terjadi akibat ketidakseimbangan antara asupan nutrisi dengan penggunaan energi. Pada hewan kesayangan seperti anjing, obesitas didefinisikan sebagai kondisi berat badan anjing melebihi berat badan optimal yaitu lebih dari 15-20% (Bland dan Hill, 2011). World Health Organization (WHO) menyatakan bahwa lebih dari 1 miliar orang dewasa mengalami kelebihan berat badan dan setidaknya 300 juta orang mengalami obesitas (Kanasaki dan Koya, 2011). Indonesia khususnya di Jakarta, prevalensi obesitas pada anak usia 2-5 tahun sebesar 16,1% (Droomers et al., 1995). Penelitian yang dilakukan Soegih (2004) dan Nugraha (2009) pada 6318 orang pengunjung suatu laboratorium dari berbagai daerah, pekerjaan dan kelompok umur (20-55 tahun) diperoleh hasil 48,97% pria dan 40,65% wanita mengalami
obesitas.
Hasil
survei
yang dilakukan
oleh
Ward
(2012)
mengemukakan bahwa hewan kesayangan seperti anjing dan kucing di Amerika Serikat memiliki jumlah kelebihan berat badan berkisar 36-39% dan obesitas mencapai 16-18%.
5
Tipe obesitas Soetjiningsih (2004) mengungkapkan adanya 3 tipe obesitas berdasarkan kondisi sel dalam tubuh yaitu tipe hiperplastik, hipertropik dan hiperplastikhipertropik. Tipe hiperplastik menunjukkan jumlah sel dalam tubuh lebih banyak dibandingkan dengan kondisi normal, namun ukuran sel masih tetap normal. Tipe hipertropik ditandai dengan jumlah sel yang normal namun ukuran sel lebih besar dibandingkan dengan sel normal. Tipe hiperplastik-hipertropik menunjukkan gambaran jumlah dan ukuran sel yang melebihi batas normal, biasanya bersifat permanen dan sulit diturunkan. Obesitas berdasarkan gejala klinisnya dibagi menjadi obesitas sederhana (Simple obesity) dan obesitas khusus. Obesitas sederhana yaitu obesitas dengan gejala kegemukan saja tanpa disertai kelainan hormonal, mental, fisik dan biasanya terjadi karena faktor nutrisi. Obesitas khusus yaitu obesitas yang biasanya disebabkan oleh kelainan endokrin/hormonal, kelainan somatodismorfik (sindrom Prader Willi, sindrom Summit and Carperter, sindrom Laurence Moon Biedl, dan sindrom Cohen), kelainan hipotalamus (kraniofaringioma), leukimia serebral serta trauma kepala yang akan mempengaruhi nafsu makan sehingga terjadi obesitas (Fukuda et al., 2001). Menurut Klein et al. (1998), berdasarkan patogenesisnya obesitas dibagi menjadi obesitas metabolik dan obesitas regulatorik. Obesitas metabolik yaitu obesitas yang disebabkan adanya gangguan metabolisme lemak dan karbohidrat. Obesitas regulatorik disebabkan karena gangguan pada pusat pengaturan rasa lapar di otak. Nukleus lateral hipotalamus berperan menimbulkan rasa lapar
6
sedangkan nukleus ventromedial hipotalamus memberi tanda kenyang. Kerusakan pada nukleus ventromedial hipotalamus membuat individu tidak pernah merasa kenyang (hiperfagia) sehingga terjadi obesitas.
Faktor penyebab obesitas Nugraha (2009) mengungkapkan bahwa obesitas merupakan penyakit multifaktorial yang diduga sebagian besar disebabkan oleh interaksi antara faktor genetik dan faktor lingkungan, antara lain aktivitas fisik, gaya hidup, sosial ekonomi dan nutrisional. Faktor-faktor yang berkaitan erat dengan kondisi obesitas dijabarkan sebagai berikut: a. Faktor genetik Menurut Mustofa (2010) dan Soetjiningsih (2004), Parental fatness merupakan faktor genetik yang berperanan besar pada manusia.
Anak yang
terlahir dari orang tua yang obesitas memiliki kesempatan lebih dari 70% mengalami obesitas pada saat dewasa. Obesitas dapat diturunkan dari generasi ke generasi berikutnya dalam sebuah keluarga. Kedua orang tua yang mengalami obesitas akan memberikan kemungkinan 80% untuk keturunannya mengalami obesitas. Satu orang tua yang mengalami obesitas akan memberikan kemungkinan 40% untuk keturunannya mengalami obesitas dan bila kedua orang tua tidak mengalami obesitas kemungkinan anak mengalami obesitas 14%. Faktor genetik dapat memodulasi respon tubuh untuk melakukan perubahan pada faktor lingkungan seperti diet dan aktivitas fisik (Balaban dan Silva, 2004).
7
b. Faktor asupan nutrisi Obesitas merupakan dampak dari kelebihan asupan nutrisi dibandingkan kebutuhan normal tubuh sehingga disimpan dalam bentuk lemak. Kandungan makanan yang akan diubah menjadi energi adalah karbohidrat, protein dan lemak. Asupan karbohidrat berlebih akan disimpan sebagai glikogen dalam jumlah terbatas dan sisanya sebagai lemak tubuh. Asupan lemak berlebih akan disimpan dalam jaringan lemak tubuh yang memiliki kemampuan menyimpan lemak tidak terbatas. Faktor-faktor dari asupan makanan yang menyebabkan obesitas adalah kuantitas, porsi makan, kepadatan energi dari makanan yang dimakan serta kebiasaan makan (Nugraha, 2009). Studi eksperimental
menunjukkan bahwa makanan tinggi lemak
menghasilkan respon kenyang yang lebih rendah dibandingkan dengan makanan yang mengandung karbohidrat tinggi. Pola makan yang tidak teratur dan makan dengan cepat juga dapat berkontribusi terhadap kejadian obesitas (Wilding, 2010). c. Faktor hormonal Gangguan
hormonal
dalam
tubuh
akan
berpengaruh
terhadap
keseimbangan energi. Hipotalamus akan menerima sinyal (input) untuk menghambat atau mengaktivasi motor sistem dalam memodulasi sistem saraf dan hormonal untuk mencari atau menjauhi makanan. Hasil (output) dari sinyal yang diterima oleh otak akan mempengaruhi pemilihan jenis makanan, porsi makan, lama makan, absorpsi serta metabolisme zat gizi didalam tubuh (Nugraha, 2009). Hormon tiroid yang berubah secara tidak normal juga bisa menyebabkan obesitas. Tiroid hormone dihasilkan oleh kelenjar tiroid dan berfungsi dalam
8
sintesis 3.5.3 triodothironine (T3) dan hormon tiroksin (T4). Tiroksin dapat merangsang peningkatan metabolisme dengan mempercepat jalur sintetik katabolisme dan anabolisme sehingga pengeluaran energi meningkat. Perubahan pada hormon tiroid (penurunan T3 dan T4 serta peningkatan TSH) akan berpengaruh terhadap energy expenditure dan memicu terjadinya obesitas (Mexitalia et al., 2011). Wilding (2010) menambahkan bahwa hormon leptin juga dapat menginduksi obesitas. Leptin dieksresikan oleh jaringan lemak dan tingkat sirkulasinya merefleksikan massa lemak. Konsentrasi leptin yang menurun akan menyebabkan peningkatan sekresi neuropeptida dan penurunan α-melanocyte stimulating hormone yang berasal dari POMC (Propriomelanocortin) gene. Gangguan leptin, reseptor melanokortin-4 dan POMC gene telah terbukti menyebabkan obesitas pada manusia. d. Faktor obat - obatan Beberapa obat dapat menstimulasi peningkatan asupan nutrisi akibat nafsu makan yang meningkat. Obat-obatan yang sering berkaitan dengan obesitas berhubungan erat dengan hormon steroid dan sensitifitas sel pada masing-masing individu (Nugraha, 2009). e. Faktor psikologi dan sosial Individu yang mengalami obesitas cenderung menggunakan makanan untuk melampiaskan emosi dibandingkan untuk memenuhi rasa lapar. Individu yang tidak mampu mengenali dan mengekspresikan emosi seperti marah, takut,
9
dan cemas menyebabkan gangguan pola makan dan konsumtif secara berlebihan sehingga terjadi obesitas (Williams dan Caliendo, 1984). Zhang et al. (2007) mengungkapkan bahwa anak-anak dengan status sosial ekonomi tinggi mempunyai resiko mengalami obesitas lebih tinggi dibandingkan dengan anak dengan status sosial ekonomi rendah. Obesitas lebih menonjol di daerah kota (urban) daripada daerah pedesaan (Wahab, 2000).
Indeks obesitas Indeks obesitas pada manusia dilakukan dengan pengukuran berat badan (BB) dan hasilnya dibandingkan dengan standar. Hasil penghitungan dikatakan obesitas bila BB>120% BB standar dan overweight bila BB>110-120% berat standar (Hidayatdan Irawan, 2006). Lee et al. (2011) menjelaskan bahwa pada hewan coba seperti tikus penghitungan indeks obesitas menggunakan beberapa cara antara lain Rõhrer index, Lee index, dan TM index. Tabel 1. Penghitungan indeks obesitas pada hewan coba INDEKS Rõhrer index Lee index TM index
RUMUS {Body weight (g)/Naso-anal length (cm)3}×103 {Body weight (g)1/3/Naso-anal length (cm)}×103 Body weight (g)/Naso-anal length (cm)2.823×103
OBESITAS Value > 30 Value > 300 Value> 55
Efek obesitas Kondisi obesitas sering dikaitkan dengan resiko penyakit kronis seperti diabetes
tipe-2,
kanker,
stroke,
kesulitan
bernafas,
gangguan
ginjal,
muskuloskeletal kronis, gangguan metabolisme dan infertilitas (Rahman et al.,
10
2012; Atilgan et al., 2013; Gutterman, 2011). Jumlah lemak diatas 20% dari berat badan ideal akan menimbulkan permasalahan kesehatan sehingga terjadi gangguan fungsi organ tubuh (Misnadierly, 2007). Russel (2011) menambahkan, individu yang mengalami obesitas memiliki resiko yang lebih besar terkena serangan jantung karena penyempitan pembuluh darah yang dipicu oleh tingginya kadar kolesterol dan gula darah.
Mekanisme Regulasi Energi Pada Obesitas
Sistem regulasi energi Nafsu makan bersumber dari sistem regulasi yang kompleks dari syaraf pusat dan perifer untuk memodulasi respon individu dalam proses asupan nutrisi. Arcuate nucleus (ARC) yang berdekatan dengan ventrikel III merupakan area utama pada hipotalamus yang berfungsi untuk mengontrol rasa lapar dan kenyang. Rasa lapar atau nafsu makan di ARC dikontrol oleh Neuropetida-Y (NPY) dan AgRP (Agouti-related Peptide). Aktivasi dari NPY/AgRP akan menyebabkan dihasilkannya orexin/hypocretin dan MCH (Melanin-concentrating hormone) di lateral hipotalamus yang akan mengekspresikan rasa lapar (Gambar 1). Aktivasi dari NPY/Agrp juga tergantung dari molekul perifer yaitu leptin (adiposit), insulin (pankreas), dan ghrelin (lambung). Signal adiposit dan insulin pada konsentrasi rendah serta ghrelin pada konsentrasi tinggi akan mengaktifkan NPY/AgRP sehingga rasa lapar dihasilkan (Stanley dan Hayley, 2006).
11
Gambar 1. Regulasi neuroendokrin dalam mengatur keseimbangan energi pada kondisi lapar. Konsentrasi leptin dan insulin yang rendah serta peningkatan konsentrasi ghrelin menstimulasi NPY/AGRP untuk mengekspresikan rasa lapar (Stanley dan Hayley, 2006). Rasa kenyang yang dihasilkan di ARC dikontrol oleh aktivasi POMC (Propiomelanocortin) dan CART (Cocain-and regulated Transcript). Aktivasi POMC dan CART menyebabkan dirilisnya α –MSH (α-Melanocyte stimulating hormone) dan MCH (Melanin-concentrating hormone) di lateral hipotalamus yang berfungsi sebagai ekspresor rasa kenyang (Gambar 2). Propiomelanocortin juga diaktivasi oleh molekul perifer yang tergolong anorexigenic peptide seperti CCK (Cholecystokinin), GLP-1 (Glukagon-like peptide1) dan PYY (Peptide YY) yang memberikan signal positif melalui nervus vagus dan induksi NTS (Nucleusof the Solitary Tract) (Berridge, 2012; Elmquist dan Scherer, 2012).
12
Gambar 2. Regulasi neuroendokrin terhadap keseimbangan energi pada kondisi Gambar 2. Regulasi terhadap pada kondisi kenyang.neuroendokrin Konsentrasi leptin dankeseimbangan insulin yangenergi meningkat serta kenyang. Tingginya konsentrasi leptin dan insulin serta rendahnya konsentrasi ghrelin yang rendah menstimulasi POMC/ACRT untuk konsentrasi ghrelin menstimulasi POMC/ACRT untuk mengekspresikan rasa kenyang (Stanley dan Hayley, 2006). mengekspresikan rasa kenyang (Stanley dan Hayley, 2006). Pada obesitas terjadi perbesaran ukuran sel adiposit (hipertropi adiposit) dan MCP-1 dalam jumlah berlebih. Monocyte Chemoattractant Protein-1 merupakan suatu peptida yang disekresikan oleh adiposit dan berfungsi untuk mengatur metabolisme trigliserida dan asam lemak di dalam adiposit. Sekresi MCP-1 dalam jumlah berlebih disebut kondisi proinflamasi. Proinflamasi dapat memicu infiltrasi makrofag ke dalam adiposit sehingga terjadi lipolisis. Kondisi lipolisis akan menggangu sekresi leptin untuk mengirimkan signal adiposit sehingga aktivasi anabolik memimpin rilisnya orexigenic peptide dan rasa lapar menjadi tidak terkontrol (Misnadierly, 2007; Soliman et al., 2012).
13
Metabolisme karbohidrat Sukrosa, fruktosa dan glukosa merupakan sumber kalori yang berasa manis. Fruktosa dan glukosa adalah monosakarida yang terdapat pada buah dan madu, sedangkan sukrosa paling banyak dijumpai pada gula tebu. Sukrosa terdiri dari satu molekul glukosa yang berikatan dengan satu molekul fruktosa. Fruktosa dan glukosa memiliki jalur metabolik yang berbeda. Inisiasi awal dari metabolisme fruktosa tidak melibatkan insulin. Komponen glukosa yang terserap akan di ekstraksi oleh hepar melalui transpor GLUT2. Glukosa diubah menjadi glucose-6-phosphate oleh enzim glucokinase (dibawah kontrol insulin) setelah masuk kedalam sel. Glucose-6-phosphate kemudian diubah menjadi piruvat dengan jalur glikogenesis. Fruktosa yang dikonsumsi akan melewati tahapan yang sama dengan glukosa yaitu melalui transpor GLUT2 di hepar namun setelah berada di dalam sel, fruktosa dikonversikan kedalam bentuk fructose-1phosphate kemudian
diubah
lagi
menjadi
glyceraldehyde-phosphate
dan
dihydroxy-acetone-phosphate oleh enzim spesifik fructokinase dan aldolase B. Inisiasi awal degadasi fruktosa tidak terjadi karena status energi sel sehingga semua fruktosa yang masuk ke dalam hepar dimetabolisme menjadi triose phosphatase yang secara sekunder diubah menjadi glukosa, glikogen, laktat dan lemak. Sintesis triose phosphatase oleh hepar dalam jumlah berlebih dapat menjadi prekusor lipogenik (Tappy dan Anne, 2010). Penelitian pada manusia dan hewan telah membuktikan bahwa hiperenergenik diet tinggi sukrosa menghasikan efek metabolik yang merugikan dengan peningkatan signifikan pada trigliserida dalam plasma. Efek hiperlipemik
14
ini dapat meningkatkan berat badan dan resistensi insulin. Konsumsi hiperenergenik fruktosa juga menghasilkan peningkatan yang signifikan pada glukosa plasma saat puasa, produksi glukosa oleh hepar dan hepatik insulin resisten. Pada rodensia, diet sukrosa dan fruktosa yang tinggi memiliki hubungan erat dengan obesitas, diabetes mellitus, dislipidemia, dan tekanan darah tinggi dan resistensi insulin (Le et al., 2006; Le et al., 2009).
Metabolisme lipid Lipid merupakan senyawa organik yang berkaitan erat dengan asam lemak dan mempunyai sifat tidak larut dalam air tetapi larut dalam pelarut non polar seperti eter, kloroform, dan benzena. Fungsi utama lipid adalah sebagai sumber energi dan isolator panas dalam jaringan subkutan. Lipid diperlukan untuk proses metabolisme dalam bentuk trigliserida (trigliserol), fosfolipid, steroid, dan hasil metabolisnya berupa asam lemak bebas, gliserol, dan benda keton (Martin et al, 1987). Trigliserida, fosfolipid dan steroid merupakan lipid yang penting dalam metabolisme mamalia. Lambung dan mulut mamalia belum dapat mencerna lipid dengan baik. Enzim lipase akan menghidrolisis lipid (trigliserida) untuk membentuk monogliserida dan asam lemak setelah melewati usus. Asam lemak bebas, monogliserida, kolesterol, dan vitamin membentuk senyawa kompleks yang kemudian bergerak menuju ke arah mukosa usus halus dan diabsorbsi secara pasif melewati membran sel mukosa usus dengan bantuan misel-misel asam empedu. Misel-misel asam empedu akan melepaskan diri dan meninggalkan permukaan sel mukosa menuju lumen usus. Asam lemak yang mengandung atom
15
karbon kurang dari 12 akan langsung ditranspor sebagai asam lemak bebas dalam darah dan sisanya akan diesterifikasi menjadi trigliserida dan ester kolesterol. Trigliserida dan ester kolesterol akan diselubungi oleh apoprotein, kolesterol dan fosfolipid untuk membentuk kilomikron kemudian masuk ke saluran limfatik. Kilomikron akan dibawa ke hepar dan jaringan lain yang memerlukan melalui sistem peredaran darah untuk dimetabolisme lebih lanjut (Ganong, 1995). Trigliserida merupakan 95-98% dari seluruh lemak terkonsumsi pada semua macam makanan. Trigliserida yang terdapat dalam tubuh hewan berupa rantai panjang dengan ikatan jenuh yang lebih sedikit, seperti lemak babi. Sifat hidrofobik dari lemak membuat lemak tidak larut dalam air dan disimpan dalam sel khusus yang disebut adiposit dan hampir seluruhnya terdiri dari trigliserida (Linder, 1992; Lehninger, 1993). Komposisi asam lemak yang dikonsumsi mempengaruhi komposisi asam lemak yang terakumulasi (disimpan sebagai trigliserida) dalam jaringan lemak. Diet yang mengandung banyak asam lemak tidak jenuh cenderung akan menyebabkan deposit trigliserida (Linder, 1992). Kolesterol merupakan suatu senyawa sterol yang mempunyai ikatan rangkap. Kolesterol tidak dapat larut dalam air tetapi larut dalam eter, etanol, khloroform, dan benzena (Montgomery et al, 1993). Laju sintesis kolesterol berhubungan dengan jumlah kolesterol yang berasal dari makanan, jika jumlah kolesterol yang dikonsumsi meningkat maka sintesis kolesterol dalam hati dan usus akan menurun. Jumlah kolesterol dari makanan yang sedikitakan membuat sintesis kolesterol di dalam hati dan usus meningkat. Kolesterol dapat diangkut dalam sirkulasi darah bila berikatan dengan protein khusus yang larut air. Ikatan
16
lipid (kolesterol, trigliserida, dan fosfolipid) dengan protein (apo-protein) disebut dengan lipoprotein (Harper et al, 1988). Menurut Guyton (1994), lipoprotein dibagi menjadi lima kelompok sesuai dengan berat jenisnya antara lain kilomikron, LDL (Low Density Lipoprotein), VLDL (Very Low Density Lipoprotein), IDL (Intermediate Density Lipoprotein), HDL (High Density Lipoprotein). LDL mengandung trigliserida dalam jumlah relatif sedikit, tetapi persentase kolesterolnya sangat tinggi (70-80%) dan sedikit apoprotein-B. Low Density Lipoprotein merupakan lipoprotein pengangkut kolesterol tersebar di seluruh endotel jaringan perifer dan pembuluh nadi. Kadar LDL dalam darah tergantung dari konsumsi makanan yang tinggi kolesterol dan lemak jenuh, tingginya VLDL, serta kecepatan produksi dan eliminasi LDL. High Density Lipoprotein mengandung 50% liporotein, 30% fosfolipid, 20% kolesterol dan 10% trigliserida. High Density Lipoprotein merupakan lipoprotein yang mengandung apoprotein-a dan mempunyai efek antiaterogenik kuat sehingga disebut juga kolesterol baik. Fungsi utama HDL yaitu mengangkut kolesterol bebas yang terdapat dalam endotel jaringan perifer, termasuk pembuluh darah, ke reseptor HDL di hati untuk dikatabolisme menjadi apoprotein, fosfolipid, kolesterol, dan trigliserida, kemudian diekskresikan lewat empedu. Kadar HDL diharapkan tinggi dalam darah namun kadarnya rendah pada kondisi obesitas, perokok,dan penderita diabetes mellitus. Tikus putih (Rattus norvegicus) galur wistar pada kondisi normal memiliki kadar kolesterol 44-86 mg/dl, HDL 20-80 mg/dl dan kadar trigliserida 39-128 mg/dl (Caroll, 1983).
17
Dalimartha (2000) menyebutkan bahwa kadar kolesterol meningkat bila mengkonsumsi makanan yang mengandung kolesterol atau lemak jenuh, baik dari sumber nabati ataupun hewani. Kolesterol yang meningkat juga terjadi akibat menurunnya ekskresi kolesterol ke usus melalui asam empedu. Produksi kolesterol di hepar meningkat pada kondisi obesitas, kurang aktivitas, stres dan perokok berat. Heslet (2002) menambahkan bahwa pada kondisi obesitas cenderung mempunyai kadar kolesterol dan lemak yang lebih tinggi dalam darah serta mempunyai HDL yang rendah. Hal ini disebabkan penderita obesitas mempunyai sel lemak yang jauh lebih besar dan lebih banyak dari pada kondisi normal.
Gambar 3. Inflamasi pada jaringan adiposa. Kondisi normal (a), obesitas Gambar 3. Inflamasi pada jaringan adiposa. Kondisi normal (a), obesitas menyebabkan perbesaran adiposit (b), obesitas memicu peningkatan menyebabkan perbesaran adiposit (b), obesitas memicu peningkatan sekresi MCP-1 oleh adiposit yang merangsang infiltrasi makrofag sekresi MCP-1 oleh adiposit yang merangsang infiltrasi makrofag ke adiposit (c), makrofag mensekresikan TNF-α sebagai respon ke adiposit (c), makrofag mensekresikan TNF-α sebagai respon inflamasi (d) (Guilherme et al, 2008). inflamasi (d) (Guilherme et al, 2008). 18
Obesitas dapat menyebabkan perbesaran dan peningkatan jumlah sel lemak yang dibarengi dengan sekresi MCP-1 dalam jumlah berlebih. Monocyte Chemoattractant Protein-1 merupakan suatu peptida yang disekresikan oleh adiposit dan berfungsi untuk mengatur metabolisme trigliserida dan asam lemak di dalam adiposit. Sekresi MCP-1 dalam jumlah berlebih disebut dengan kondisi proinflamasi dan memicu infiltrasi makrofag ke dalam adiposit (Gambar 6). Makrofag akan mensekresikan TNF-α dan IL1β sebagai respon dari inflamasi. Inflamasi akan mengakibatkan disfungsi adiposit yang berlanjut pada peningkatan lipolisis dan menurunnya penyimpanan trigliserida pada jaringan otot. Peningkatan lipolisis dan penurunan penyimpanan trigliserida menyebabkan peningkatan kadar asam lemak bebas dan trigliserida dalam darah pada kondisi (Guilherme et al., 2008).
Gambar4. Gangguan penyimpanan trigliserida pada jaringan otot akibat obesitas. Gambar 4. TNF-α Gangguan penyimpanan trigliserida pada jaringan akibat obesitas. menyebabkan penurunan regulasi PPAR γ,otot penurunan sintesis TNF-α menyebabkan penurunan regulasi PPAR γ, penurunan trigliserida dan penigkatan lipolisis, peningkatan asam lemaksintesis bebas trigliserida dan penigkatan lipolisis, peningkatan asam lemak bebas dalam darah, peningkatan penyerapan asam lemak di otot, penurunan dalam darah, peningkatan penyerapan asam lemak diGLUT-4 otot, penurunan penyimpanan trigliserida, serta gangguan translokasi melalui penyimpanan trigliserida, sertadan JNK (lhermet al., 2008). aktivasi PKC, IKKβ dan JNK (Guilherme et al., 2008). 19
Pankreas
Miyaki et al.(1994) menyatakan bahwa pankreas tikus terletak di mesoduodenum dan terdiri dari bagian tubuh dengan lobus kanan dan kiri. Tubuh pankreas terletak di sepanjang bagian kranial dari duodenum. Lobus kanan diperluas sampai ke ligamentum duodenum, sedangkan lobus kiri memanjang kearah limpa. Elayat et al. (1995) mengungkapkan bahwa pankreas tikus dibagi menjadi beberapa regio yaitu duodenal dengan lobus dorsal dan ventral, regio gastric dan regio splenic (lien).
Gambar5.5. Sketsa Gambar Sketsaregio regiolokasi lokasipankreas pankreaspada pada tikus. tikus. Lower Lower duodenal duodenal (LD), upper duodenal duodenal(UD), (UD),gastric gastric(G) (G)dan dansplenic splenic(SP) (SP)(Elayat (Elayatetetal., al.,1995). 1995). Pankreas merupakan campuran dari kelenjar eksokrin dan endokrin. Bagian eksokrin berfungsi untuk mensekresikan ion-ion, enzim dan proenzim seperti
tripsinogen,
kimotripsinogen,
karboksipeptidase,
ribonuklease,
deoksiribonuklease, lipase dan amilase. Bagian endokrin menghasilkan homon insulin, glukagon dan pankreas polipeptida yang erat kaitannya dalam pengaturan regulasi energi dalam tubuh (Junqueira dan Carneiro, 1992). Kadar glukosa yang berlebih di dalam darah menyebabkan pankreas mensekresikan insulin untuk 20
menghambat kerja glukagon dalam menghasilkan glukosa, mendistribusikan glukosa ke jaringan otot, menginduksi proses lipogenesis dan uptake glukosa pada jaringan lemak, menghambat pembentukan glukosa oleh hepar serta mengirimkan rangsangan ke hipotalamus untuk menghambat anorexigenic system (Berridge, 2012; Elmquist dan Scherer, 2012).
Bagian eksokrin Sel asini merupakan komponen utama dari bagian eksokrin. Inti sel asini berbentuk bulat dan mengandung banyak kromatin. Sitoplasma bagian basal bersifat basofilik dan memiliki banyak mitokondria yang berbentuk memanjang. Sitoplasma bagian apikal mengandung granula atau sekret asidofilik (zimogen). Asinus atau alveolus berbentuk tubular seperti buah apokat, dikelilingi lamina basal dan terdiri atas lima sampai delapan sel asini berbentuk piramid yang tersusun mengelilingi lumen sempit. Jaringan ikat halus, pembuluh darah, pembuluh limfe, saraf dan duktus sekretori yang terdapat diantara sel acini memberikan celah pada asinus dengan tambahan sel sentroasinar pada lumen. Hasil sekresi dari sel asinus disekresikan ke duodenum melalui duktus dengan urutan dimulai dari lumen sentroasinar atau sentroduktular, duktus interkalatus, duktus intralobularis, duktus interlobularis dan duktus asesoris (Leeson et al., 1996; Junqueira dan Carneiro, 1992).
Bagian endokrin Endokrin pankreas (Pulau Langerhans) tersebar di seluruh pankreas. Pulau Langerhans tampak sebagai kelompok sel berbentuk bulat, pucat,
21
dikelilingi serabut halus, tidak memiliki saluran, dengan banyak pembuluh darah untuk penyaluran hormon kelenjar pankreas (Johnson, 1993; Subowo, 1992; Tambajong, 1995). Pulau-pulau kecil sel endokrin ditemukan berselang-seling diantara sel eksokrin pankreas (Ganong ,1995; Subowo, 1992). Serabut retikuler halus mengelilingi setiap Pulau Langerhans dan memisahkannya dari eksokrin pankreas yang berdekatan. Sel-sel parenkim dan pembuluh darah di inervasi oleh serat saraf autonom (Junqueira dan Carneiro , 1992). Pulau
Langerhans
kebanyakan
berdiameter
100-200
µm.
Pulau
Langerhans merupakan kumpulan sel berbentuk ovoid, berukuran 76 x 0,2 µm yang tersebar di seluruh pankreas (Ganong, 1995). Semua sel dalam Pulau berbentuk poligonal tidak beraturan dengan inti bundar di tengah, mitokondria kecil berbentuk batang dan aparatus golgi kecil (Leesonet al., 1996). Menurut Paulsen (2000), sel-sel dalam Pulau Langerhans dapat dibagi berdasarkan sifat pewarnaanya. Metode pewarnaan imunohistokimia bisa menunjukkan 4 jenis sel yang berbeda pada Pulau Langerhans, yaitu sel A, B, D dan F yang juga dinamai sel α, β, δ, dan PP (Polipeptida Pankreas). Sel α mensekresikan glukagon, sel β mensekresikan insulin, sel δ mensekresikan somatostatin dan sel PP menghasilkan polipeptida pankreas (Ganong, 1995; Paulsen, 2000). Insulin
Insulin
dibentuk
sebagai
rantai
polipeptida
tunggal,
proinsulin,
mengandung 81-86 residu tergantung pada spesiesnya. Insulin bersifat anabolik (Ganong, 1995). Perubahan proinsulin menjadi insulin terjadi dengan pembelahan
22
proteolitik, menghasilkan satu molekul insulin dan satu peptida-C yang berlangsung saat transpor proinsulin ke aparatus golgi dan dibungkus dalam bentuk ganula (Leesonet al., 1996). Ganong (1995) mengungkapkan bahwa insulin merupakan hormon yang berperan pada metabolisme karbohidrat, lemak dan protein. Insulin meningkatkan transpor glukosa dari darah ke dalam sel target di jaringan perifer (otot, otak, jaringan lemak, hati, dan lain-lain) melalui transporter glukosa yaitu GLUT-4. Insulin juga berperan dalam penghambatan lipolisis pada jaringan lemak dan mengurangi kadar asam lemak bebas dalam plasma. Elayat et al. (1995) telah melaporkan bahwa pada tikus normal, distribusi sel imunoreaktif insulin tersebar pada daerah sentral Pulau Langerhans dengan persentase tertinggi terdapat pada pankreas regio splenic. .
Glukagon
Glukagon memiliki rantai polipeptida tunggal, bersifat anabolik, berfungsi merangsang pemecahan glikogen dan sintesa glukosa di hati, menimbulkan efek hiperglikemia
dengan
menghambat
sintesis
glikogen,
mempromotori
glikogenolisis dan menstimulasi glukoneogenesis serta meningkatkan produksi keton oleh hepar (ketogenesis) (Johnson,1993; Ganong, 1995). Pada jaringan lemak,
glukagon mempromotori pemecahan lemak dan menghambat sintesis
trigliserida. Kadar glukagon yang berlebih akan menyebabkan hiperglikemia dan hipoglikemia akan merangsang pelepasan glukagon (Tambajong, 1995; Paulsen, 2000).
23
Elayat et al. (1995) telah melaporkan bahwa pada tikus normal, distribusi sel imunoreaktif glukagon tersebar pada daerah mantel (perifer) Pulau Langerhans dengan persentase tertinggi terdapat pada pankreas regio splenic.
Identifikasi Sel Pewarnaan Victoria blue Pewarnaan Victoria blue menggunakan derivat diphenylnaphthylmethane (C34H34N3Cl) yang berfungsi untuk mendeteksi kandungan cooper dalam plasma sel, granula sel β pankreas, material neuroendokrin invertebrata dan vertebrata serta granula juxtaglomerular ginjal. Sel β pada pankreas akan terwarnai biru tua menggunakan pewarnaan Victoria blue. Faktor penting yang menentukan visualisasi sel β pankreas menggunakan pewarnaan Victoria blue yaitu metode fiksasi dan oksidasi jaringan. Sel β hanya akan terwarnai jika jaringan difiksasi menggunakan larutan Bouin dan dioksidasi dengan permanganate sebelum diwarnai Victoria blue yang terlarut dalam acid alcoholic 0,05%. Jaringan yang tidak difiksasi menggunakan larutan Bouin akan menghasilan warna yang sangat gelap setelah oksidasi dan tidak terwarnai bila dilakukan tanpa oksidasi (Wohlrab et al., 1985).
Pewarnaan imunohistokimia Imunohistokimia merupakan suatu teknik penentuan lokasi antigen dalam jaringan
atau
sel
menggunakan
reaksi
antigen-antibodi.
Pewarnaan
imunohistokimia menimbulkan ikatan antibodi dengan antigen di permukaan atau di dalam sel yang selanjutnya dapat dideteksi dengan cara dilabel dengan enzim,
24
isotop dan fluoropore atau gel koloidal. Morfologi sel dapat dipelajari dengan proses fiksasi, pewarnaan dan divisualisasikan dengan mikroskop electron atau mikroskop cahaya (Rantam, 2003). Teknik imunohistokimia dapat digunakan untuk mempelajari distribusi enzim yang spesifik pada struktur sel normal, mendeteksi komponen sel, biomakromolekul seperti protein dan karbohidrat (Lehr et al., 1999). Interaksi antara antigen-antibodi adalah reaksi yang tidak kasat mata, oleh karena itu diperlukan visualisasi adanya ikatan tersebut dengan melabel antibodi yang digunakan dengan enzim atau fluorokrom. Enzim yang dipakai untuk melabel selanjutnya direaksikan dengan substrat yang dicampur dengan kromogen sehingga menghasilkan produk akhir berwarna dan tidak larut serta dapat diamati menggunakan
mikroskop.
Metode
imunohistokimia
yang
menggunakan
fluorokrom dalam melabel antibodi dapat langsung diamati tanpa direaksikan lagi dengan kemikalia yang menghasilkan warna di bawah mikroskop fluorescence (Rantam, 2003). Penelitian ini menggunakan metode Labeled Streptavidi-biotin (LSAB). Streptavidin merupakan protein yang berasal dari Streptomyces avidinii dan memiliki mekanisme yang sama dengan avidin (berasal dari telur ayam) dalam mengikat biotin. Streptavidin digunakan untuk mendeteksi antigen yang sudah terikat oleh antibodi sekunder terbiotinilisasi. Antigen yang ada pada jaringan akan diikat oleh antibodi primer kemudian antibodi primer diikat oleh antibodi sekunder yang sudah terlabel biotin. Kombinasi Streptavidin dengan enzim
25
Horseradish Peroksidase akan menandai ikatan komplek antigen-antibodi yang selanjutnya akan terwarnai oleh kombinasi substrat dan kromogen (Key, 2009).
Gambar 6. Ilustrasi Ilustrasimetode metodeLabeled LabeledStreptavidi-biotin Streptavidi-biotin(LSAB). (LSAB). Jaringan yang mengandung antigen akan berikatan dengan antibodi primer. primer, Antibodi primer akan diikat oleh antibodi sekunder yang antibodi primer diikat oleh antibodi sekunder yang terbiotinilisasi, terbiotinilisasi dan Strepavidin Enzyme Complex menandai ikatan Strepavidin Enzyme Complex ntibodi sekunder, (Key,2009). kompleks antigen-antibodi primer-antibodi sekunder (Key,2009).
Landasan Teori
Pankreas merupakan organ penghasil insulin dan glukagon yang secara langsung berpengaruh dalam pengaturan keseimbangan sistem regulasi energi (Junqueira dan Carneiro, 1992). Histologi Pulau Langerhans pankreas berbentuk bulat, berwarna pucat (pewarnaan HE), berdiameter 100-200 µm dan dikelilingi oleh serabut retikuler. Pulau Langerhans yang berukuran kecil tersebar di antara area eksokrin (Ganong, 1995). Sel-sel dalam Pulau Langerhans berbentuk poligonal tidak teratur dengan inti sel berbentuk bundar dan berada di tengah (Leeson et al., 1996). Distribusi sel imunoreaktif insulin tersebar pada area sentral
26
dari Pulau Langerhans sedangkan sel imunoreaktif glukagon tersebar pada area mantel (perifer) (Elayat et al., 1995). Pada kondisi obesitas mencit yang genetik obesitas menunjukan peningkatan ukuran Pulau Langerhans serta jumlah sel β, α dan δ dibandingkan dengan tikus normal (Lindstrom, 2007; Slavin, 2010; Harishankar et al, 2011).
Hipotesis
Terdapat
perbedaan
morfologi,
morfometri
dan
distribusi
Pulau
Langerhans, sel imunoreaktif insulin dan glukagon meliputi perbedaan bentuk, peningkatan ukuran dan jumlah Pulau Langerhans, sel IR insulin dan glukagon beserta nukleusnya pada pankreas tikus normal (non genetic obese) yang diinduksi obesitas dibandingkan dengan tikus kontrol.
27
MATERI DAN METODE Waktu dan tempat
Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret 2014 sampai Mei 2014 di Laboratorium Nutrisi Sekolah Pascasarjana Universitas Gadjah Mada dan berakhir pada bulan Juli 2014 di Laboratorium Mikroanatomi Fakultas Kedokteran Hewan dan Laboratorium Histologi dan Biologi Sel Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Materi
Sampel Hewan coba yaitu tikus putih (Rattus norvegicus) non genetic obese, jantan, jenis wistar, umur 4 minggu dipisah dalam 2 kelompok yaitu kelompok kontrol dan obesitas dengan masing-masing kelompok berjumlah 5 ekor. Sampel plasma diambil dari darah segar (infraorbitalis) yang diberi EDTA dan disentrifus. Sampel organ berupa pankreas (regio splenic) diambil dari masing-masing hewan coba.
Bahan Larutan fiksatif yang digunakan yaitu larutan Bouin yang terdiri dari campuran formaldehid 37%, asam pikrat dan asam asetat glasial dengan perbandingan komposisi 25:75:5. Pewarnaan jaringan dengan Hematoksilin eosin menggunakan bahan meliputi larutan xilol, alkohol bertingkat (70%, 80% dan 90% dan alkohol absolut), Haris hematoksilin dan eosin.
28
Pewarnaan Victoria blue menggunakan bahan antara lain asam pikrat, Cromic potassium sulfate, Potassium permanganat, Sulfuric acid, Victoria blue B, alkohol 95%, gliserin 87%, Glacial acetic acid, Sodium bisulfit, formaldehid 37% dan Phloxin. Bahan yang digunakan dalam metode imunohistokimia adalah PBS (Posfat Buffer Saline), sitrat buffer, akuades, alkohol bertingkat (70%, 80% dan 90% dan alkohol absolut), xilol, hematoksilin, antibodi primer mouse anti-insulin (1:1500; Abcam, USA), anti bodi primer rabbit anti-glucagon (1;1500; Cosmo Bio Co, Japan), backgound sniper (Biocare Medical, USA), antibodi sekunder TrekkieUniversal Link (Biocare Medical, USA), TrekAvidin-HRP (Biocare Medical, USA), DAB dan substrat (Biocare Medical, USA).
Alat Peralatan yang digunakan untuk masing – masing pewarnaan meliputi tissue cassete, gelas objek, mikropipet, tip, inkubator, refrigerator, waterbath, slide warmer, timbangan analitik, gelas ukur, erlenmeyer, magnetic stirrer, kertas saring, dan mikroskop cahaya yang dilengkapi dengan optilab. Metode
Perlakuan terhadap hewan coba Tikus pada kelompok obesitas dan kontrol terlebih dahulu ditimbang dan dihitung indeks obesitasnya sebagai acuan data awal sebelum perlakuan. Kelompok obesitas diberi pakan secara ad libitum setiap hari selama 9 minggu dengan komposisi karbohidrat 47%, protein 22% dan lemak 31% serta tambahan
29
suspensi fruktosa dan kolesterol masing-masing 1% per berat badan yang dihomogenisasi dalam 2 ml Na CMC (Carboxyl Methyl Celulose). Suspensi fruktosa dan kolesterol diberikan sebagai aplikasi tambahan dari diet tinggi lemak dan karbohidrat.
Tabel 2. Komposisi diet tinggi lemak dan karbohidrat kelompok obesitas serta perbandingannya dengan normal (kontrol). Komposisi Jagung Sukrosa Kasein L-cystin Soybean oil Lard Fiber Mineral Vitamin Cholin Karbohidrat Protein lemak
Normal (g/Kg) 583.5 106 140 3 70 50 35 10 2.5
Obesitas (g/Kg) 257.2 172,8 200 3 25 245 50 35 10 2
76% 16% 8%
47% 22% 31%
Sumber : American International Nutrition 93G Diet Induction Obesity (Research Diet, 2010)
Pemeriksaan kadar gula darah dan lipid Tikus kelompok obesitas dan kontrol dipuasakan selama 8 jam kemudian masing-masing diambil darahnya melalui sinus infraorbitalis. Sampel darah kemudian disimpan dalam tabung berisi EDTA 10%, disentrifus selama 10menit dengan kecepatan 4000 rpm dan diambil plasmanya untuk melihat profil gula darah dan lipid . Pemeriksaan kadar glukosa darah dilakukan dengan metode Enzymatic Colorimetric Test GOD-PAP (Glucose Oxidase Para Aminophenazone). Metode Colorimetric Test GOD-PAP dilakukan dengan mencampurkan sampel plasma
30
sebanyak 10µl dengan 1000 µl reagen (lampiran1), diinkubasi selama 20 menit pada suhu ruang (20-25oC) dan hasilnya dibaca menggunakan spektrofotometri dengan panjang gelombang 500nm. Kadar trigliserida dihitung dengan metode Enzymatic Colorimetric Test. Metode Enzymatic Colorimetric Test dilakukan dengan mencampurkan sampel plasma sebanyak 10 µl dengan 1000 µl reagen (Lampiran 2) kemudian diinkubasi selama 20 menit pada suhu ruang dan hasilnya dibaca menggunakan spektrofotometri dengan panjang gelombang 546 nm. High Density Lipoprotein (HDL) dihitung menggunakan metode presipitasi. Sampel plasma sebanyak 200 µl dicampur dengan 500µl HDL diluted selama 10 menit kemudian disentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 4000rpm pada suhu ruang. Supernatan sebanyak 100 µl dicampur dengan reagen (Lampiran 3) dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Hasil penghitungan dibaca menggunakan spektofotometri dengan panjang gelombang 546 nm. Low
Density
Lipoprotein
(LDL)
dihitung
menggunakan
metode
presipitasi. Sampel plasma sebanyak 100µl dicampur dengan 1000 µl precipitating reagent, diinkubasi selama 10 menit,dan disentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Supernatan diambil sebanyak 100 µl, dicampur dengan reagen (Lampiran 4), diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang dan hasilnya dibaca menggunakan spektrofotometri dengan panjang gelombang 546 nm.
31
Total kolesterol dihitung dengan metode Enzymatic Colorimetric Test CHOD-PAP (Cholesterol Oxidase Para Aminophenazone). Metode Enzymatic Colorimetric Test CHOD-PAP dilakukan dengan mencampur sampel plasma sebanyak 10 µl dengan 1000 µl reagen (Lampiran 5) kemudian diinkubasi selama 20 menit pada suhu ruang dan hasilnya dibaca menggunakan spektrofotometri (panjang gelombang 546 nm). Hasil akhir dari pergukuran masing-masing sampel dihitung menggunakan rumus :
Nilai pembacaan fotometrik sampel X Konsentrasi standar (mg/dl) Nilai pembacaan fotometrik kontrol Sumber : DiaSys, Jerman. Koleksi sampel dan preparasi jaringan pankreas Tikus kontrol dan obesitas dieutanasi menggunakan cloroform. Tikus di nekropsi, diambil pankreasnya, difiksasi pada larutan Bouin selama 24 jam kemudian diganti dengan larutan alkohol 70% untuk disimpan sampai pemrosesan jaringan dilakukan. Sampel jaringan pankreas selanjutnya dipotong dengan ukuran 3x3 mm dan dimasukkan ke dalam tissue cassete (masing – masing diberi label). Tahap awal pemrosesan jaringan berupa dehidrasi yang dimulai dengan mencuci jaringan (dalam tissue cassete) di air mengalir selama 60 menit dan selanjutnya jaringan di rendam pada alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 90%, alkohol absolut I, absolut II, absolut III, secara bertahap masing-masing selama
32
60 menit. Clearing dilakukan dengan merendam jaringan pada larutan xilol I, xilol II dan xilol III secara bertahap masing-masing selama 20 menit. Tahap infiltrasi parafin dan pengeblokan bertujuan untuk memasukkan parafin ke dalam ruang sel sehingga membuat jaringan memiliki konsistensi kuat yang diperlukan untuk pemotongan. Proses infiltrasi parafin diawali dengan mencairkan parafin pada empat gelas ukur di dalam inkubator (58o-60o) selama 24 jam. Jaringan dimasukkan ke dalam parafin cair I, II, III, yang ada dalam inkubator masing-masing selama 1 jam. Proses pengeblokan dilakukan di atas tungku penghangat agar parafin tetap cair selama parafin dari gelas ke IV dimasukkan ke dalam cetakan. Jaringan diambil dari parafin cair gelas ke III dan dimasukkan kedalam cetakan dengan letak yang sesuai, setelah itu blok didinginkan dan disimpan di refrigerator. Blok parafin yang berisi potongan jaringan selanjutnya dilepas dari cetakan dan diberi pegangan. Mikrotom disiapkan dan blok parafin dipotong dengan ketebalan 5-6 µm secara serial (1-7 potongan jaringan). Hasil potongan blok dimasukkan pada waterbath berisi air dan gelatin masing-masing direkatkan pada obyek glass (coated slide) yang berbeda. Potongan I-IV berturut-turut diwarmai dengan Hematoksilin Eosin, Victoria blue, imunohistokimia dengan antibodi primer mouse anti-insulin, dan imunohistokimia dengan antibodi primer rabbit anti-glukagon.
Pewarnaan Hematoksilin Eosin (HE) Pewarnaan HE diawali dengan tahap deparafinisasi dengan merendam preparat jaringan pada xilol bertingkat (xilol I, xilol II dan xilol III) masingmasing selama 5 menit. Slide yang berisi preparat jaringan direndam pada alkohol
33
bertingkat (Alkohol absolut I, Alkohol absolut II, Alkohol absolut III, Alkohol 90%, Alkohol 80% dan Alkohol 70% masing-masing selama 5 menit. Preparat jaringan kemudian direndam pada larutan Haris hematoksilin selama 5 menit, dicuci dengan air mengalir 10 menit kemudian direndam pada larutan eosin selama 25 menit. Preparat jaringan didehidrasi pada alkohol bertingkat (alkohol 70%, 80%, 90%, alkohol absolut I, alkohol absolut II dan alkohol absolut III) masing-masing selama 30 detik dan di clearing dengan xilol I, xilol II, xilol III masing-masing selama 10 menit. Tahap akhir yaitu mounting dengan cover sliped dan entelan.
Pewarnaan Victoria blue Tahap pertama dari pewarnaan Victoria blue adalah pembuatan larutan Mordant. Asam pikrat ditimbang sebanyak 1,4g lalu dimasukkan kedalam tabung Erlernmeyer 250 ml yang sudah berisi 100 ml akuades dan dilarutkan sampai homogen. Larutan yang tercampur diambil sebanyak 75 ml selanjutnya ditambahkan dengan larutan formaldehid 37% sebanyak 25 ml dan asam asetat glasial 5 ml dan disaring menggunakan kertas teknis. Larutan yang sudah disaring ditambahkan dengan 3,5 g chromic potassium sulfat, dilarutkan lagi sampai homogen dan disaring menggunakan kertas saring. Tahapan kedua yaitu pembuatan campuran untuk oksidasi. Potassium permanganat ditimbang sebanyak 0,3 g, dimasukkan dalam tabung Erlenmeyer 250 ml, ditambahkan akuades sebanyak 100 ml, dilarutkan sampai homogen, disaring menggunakan kertas saring dan simpan dalam botol 100 ml pada suhu ruang (Larutan I). Asam sulfat pekat diencerkan sebanyak 0,3 ml ke dalam 100 ml
34
akuades, lalu dicampurkan sampai homogen dan disimpan dalam botol 100 ml pada suhu ruang (Larutan II). Tahap ketiga adalah pembuatan larutan warna (10 hari sebelum pewarnaan). Victoria blue ditimbang sebanyak 0,15 g kemudian dimasukkkan dalam tabung erlenmeyer 25 ml, ditambahkan 15 ml larutan alkohol 95% dan dicampurkan menggunakan stirer. Larutan yang sudah tercampur dimasukkan kedalam tabung Erlenmeyer 500 ml yang berisi 60 ml alkohol 95%, lalu ditambahkan gliserin 180 ml dan dicampur sampai homogen (Larutan III). Asam asetat pekat sebanyak 150 µl diambil menggunakan mikropipet dan dimasukkan dalam tabung Erlenmeyer 25 ml ditambah dengan 25 ml akuades, dicampur sampai homogen, dimasukan dalam Larutan III dan dicampur menggunakan stirer. Larutan disimpan dalam pada suhu ruang dan hanya bisa digunakan 10 hari setelah pembuatan (maksimal penggunaan 30 hari setelah dibuat). Tahap keempat yaitu pembuatan larutan sodium bisulfat dari campuran 3,5 g sodium bisulfit dengan 100 ml akuades yang disaring menggunakan kertas saring dan disimpan pada suhu ruang. Tahap kelima yaitu pembuatan larutan Phloxin 0,5 %. Phloxin ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian dimasukkan dalam tabung Erlenmeyer 100 ml, ditambahkan akuades sebanyak 100 ml, dicampur sampai homogen, disaring dengan kertas saring dan disimpan menggunakan pada suhu ruang. Tahap keenam adalah proses pewarnaan. Gelas obyek yang berisi jaringan (preparat jaringan) ditata pada staining jar. Proses deparafinisasi dilakukan sama seperti pada pewarnaan HE. Larutan Mordant dimasukkan ke dalam staining jar
35
hingga preparat jaringan terendam dan disimpan pada inkubator dengan suhu 370C selama semalam. Preparat jaringan kemudian dicuci dengan air mengalir sampai tidak berwarna dan bilas dengan akuades. Preparat jaringan dikeluarkan dari staining jar, sisa cairan disekeliling jaringan dikeringkan dan ditata pada bidang datar. Larutan I dan larutan II dicampur dengan perbandingan 1:1 kemudian diteteskan pada gelas obyek, dibiarkan selama 4 menit, cairan dibuang, preparat jaringan ditata kembali pada staining jar, dibilas dengan akuades 3 kali, ditambahkan larutan 3,5% sodium bisulfit hingga jaringan terendam dan dicuci dengan akuades sebanyak 3 kali. Larutan kemudian dimasukkan dalam alkohol 70% selama 1 menit, diganti dengan larutan warna (Tahap ketiga) dan dibiarkan selama 24 jam pada suhu ruang. Preparat jaringan selanjutnya dicuci dengan akuades sebanyak 3 kali, direndam dengan larutan Phloxin 0,5% selama 1 menit, dicuci dengan akuades 3 kali dan dilanjutkan dengan tahap dehidrasi dan mounting.
Pewarnaan imunohistokimia Pada pewarnaan imunohistokimia proses pertama yang dilakukan adalah deparafinisasi dan rehidrasi sama seperti pada pewarnaan HE. Preparat jaringan selanjutnya direndam pada aquades selama 10 menit dan dilanjutkan dengan pencucian menggunakan PBS 0,01 M (pH 7,4) sebanyak 3x/5menit. Aktivitas peroksidase endogen pada jaringan dihambat menggunakan 3% H2O2 dalam akuades selama 30 menit. Preparat jaringan kemudian dicuci menggunakan PBS 0,01 M (pH 7,4) sebanyak 3x/5menit. Antigen retrievel dilakukan dengan merendam preparat jaringan pada sitrat buffer mendidih 1 menit dan dibiarkan
36
sampai dingin pada suhu ruang selama 60 menit. Preparat jaringan kemudian dicuci menggunakan PBS 0,01 M (pH 7,4) sebanyak 3x/5menit. Preparat jaringan diinkubasi dengan backgound sniper selama 15 menit pada suhu ruang untuk mencegah terjadinya pewarnaan yang tidak spesifik. Inkubasi antibodi primer (Mouse anti-insulin dan Rabbit anti-glucagon) dilakukan dengan cara ditetesi pada jaringan dan dibiarkan semalaman (over night) pada suhu 4oC. Preparat jaringan kemudian dicuci menggunakan PBS 0,01 M (pH 7,4) sebanyak 3x/5menit. Antibodi sekunder diinkubasi menggunakan Trekkie Universal Link pada suhu ruang selama 30 menit yang dilanjutkan dengan pencucian menggunakan PBS 0,01 M (pH 7,4) sebanyak 3x/5menit. Preparat jaringan selanjutnya ditetesi menggunakan TrekAvidin-HRP pada suhu ruang selama 10 menit sebagai indikator ikatan antigen, antibodi primer dan sekunder serta pencucian menggunakan PBS 0,01 M (pH 7,4) sebanyak 3x/5menit. Ikatan antigen dan antibodi dapat diwarnai dengan campuran larutan DAB dan substrat (4 µl DAB + 96 µl substrat) dibiarkan selama 1 menit pada suhu ruang. Preparat jaringan kemudian dicuci dengan aquades 10 celup, direndam pada larutan hematoksilin selama 30 detik, dicuci dengan air mengalir selama 5 menit dan dilanjutkan dengan tahap dehidrasi dan penjernihan sama seperti pada pewarnaan HE. Tahap akhir preparat jaringan yang sudah terwarnai di mounting menggunakan entelan dan titutup dengan cover sliped. Hasil pewarnaan diamati menggunakan mikroskop cahaya yang dilengkapi dengan optilab.
37
Analisis hasil Hasil topografi anatomi dan histologi pankreas dianalisa menggunakan metode deskriptif dan kuantitatif. Metode deskriptif digunakan untuk menjelaskan topografi pankreas, morfologi Pulau Langerhans, morfologi sel IR insulin dan glukagon serta lokasi inti masing-masing sel. Metode kuantitatif dilakukan untuk mengetahui morfometri meliputi diameter,
keliling dan volume Pulau
Langerhans, diameter sel IR insulin dan glukagon beserta nukleusnya yang nilai rata – rata diambil dari 10 lokasi Pulau langerhans secara acak pada masing – masing sampel (n=5) sehingga didapatkan 50 lokasi Pulau Langerhans dengan sel IR insulin untuk kelompok kontrol, 50 lokasi Pulau Langerhans dengan sel IR glukagon untuk kelompok kontrol, 50 lokasi Pulau Langerhans dengan sel imunoreaktif insulin untuk kelompok obesitas dan 50 lokasi Pulau Langerhans dengan sel IR glukagon untuk kelompok obesitas. Distribusi dan kepadatan sel juga dihitung pada masing-masing kelompok kontrol dan obesitas, melalui jumlah sel total/Pulau Langerhans, jumlah sel IR insulin dan glukagon/Pulau Langerhans, jumlah sel IR insulin dan glukagon pada area asinus, jumlah sel IR insulin dan glukagon pada area duktus, proporsi sel IR insulin dan glukagon/Pulau Langerhans. Data pemeriksaan kadar glukosa, profil lipid, morfometri, distribusi dan kepadatan sel IR insulin dan glukagon pada tikus obesitas dan kontrol dianalisa dengan parameter statistik t-Test independent. Pengukuran diameter sel, keliling Pulau Langerhans dan jumlah sel menggunakan program software Optilab®Image RasterV2.1 dengan kalibrasi yang
38
sudah disesuaikan. Volume Pulau Langerhans, sel dan nukleus dihitung menggunakan rumus: Volume = 4/3π x (D/2)3 Keterangan : π=22/7, D (diameter).
39
HASIL DAN PEMBAHASAN
Profil Berat Badan dan Indeks Obesitas
Kelompok obesitas dan kontrol menunjukkan perbedaan ukuran tubuh dan indeks obesitas setelah perlakuan selama 9 minggu. Kelompok obesitas memiliki ukuran tubuh yang lebih lebar dengan panjang tubuh relatif sama dibandingkan kelompok kontrol (Lampiran 6).
Gambar 7.
Gambar tikus kelompok obesitas dan kontrol. Tikus kelompok obesitas (A) lebih lebar dan gemuk dibandingkan tikus kelompok kontrol (B) dengan panjang tubuh yang relatif sama.
Tabel. 3 Hasil pengukuran indeks obesitas kelompok kontrol dan obesitas Karakteristik Kelompok Kontrol Kelompok Obesitas Jumlah subjek 5 ekor 5 ekor BB rata-rata (g) 153 ± 7.52 183,2 ± 5,96 PB rata-rata (cm) 17,6 ± 0,29 17,5 ± 0,32 Rohrer index 28 ± 1,00 34 ± 3,00 TM index 46 ± 2,03 56,6 ± 4,27 Keterangan: BB (Berat badan), PB (panjang badan dari nasal sampai anus). Nilai merupakan mean ± standar deviasi. 40
Pengukuran indeks obesitas menggunakan rumus Rohrer index (34±3,00) dan TM index (56,6±4,27) menunjukkan bahwa kelompok obesitas telah memenuhi nilai indeks obesitas sesuai dengan standar masing-masing indeks. Rohrer index merupakan salah satu indikator yang digunakan dalam menghitung indeks obesitas. Penghitungan nilai Rohrer index mengacu pada berat badan dan panjang tubuh mulai dari nasal (hidung) sampai anus. Nilai penghitungan yang >30 menginterpretasikan individu obesitas. Selain Rohrer index estimasi lemak tubuh sebagai indikator obesitas juga bisa dihitung menggunakan TM index. Hasil penghitungan TM indeks >55 menyatakan individu obesitas (Lee et al., 2011).
Profil Lipid dan Glukosa Darah
Profil lipid Profil lipid kelompok obesitas dan kontrol diukur dari plasma masingmasing kelompok yang sudah dipuasakan selama 8 jam. Kelompok obesitas menunjukkan nilai rata-rata total kolesterol (160,62±3,52) mg/dl lebih tinggi dibandingkan kontrol (108,84±4,08) mg/dl (P<0,001). Kadar trigliserida kelompok obesitas (98,61±2,66) mg/dl juga lebih tinggi dibandingkan kontrol (70,03±3,02) mg/dl (P<0,05) (Tabel 4). Obesitas pada penelitian ini diinduksi dari pemberian pakan diet tinggi lemak berupa soybean oil dan lemak babi (Tabel 2) yang disertai dengan penambahan kolesterol 1%/BB dan diberikan secara peroral menggunakan sonde setiap harinya. Guilherme et al. (2008) mengungkapkan bahwa kadar kolesterol
41
dan trigliserida di dalam darah bersumber dari makanan, biosintesis di hepar, usus, korteks adrenal, lemak dan jaringan reproduktif. Obesitas dapat menyebabkan terjadi perbesaran dan peningkatan jumlah sel lemak akibat tingginya mobilisasi lipid dan penyimpanan trigliserida di dalam sel. Hipertropi adiposit akan disertai dengan sekresi MCP-1 dalam jumlah berlebih yang dapat memicu infiltrasi makrofag ke dalam adiposit. Makrofag akan mensekresikan TNF-α dan IL1β yang menyebabkan disfungsi adiposit sehingga terjadi lipolisis dan penurunan penyimpanan trigliserida. Peningkatan lipolisis dan penurunan penyimpanan trigliserida menyebabkan peningkatan kadar asam lemak bebas dan trigliserida dalam darah. Kelompok obesitas menunjukkan nilai LDL lebih tinggi (67,51±1,81) mg/dl dibandingkan kontrol (51,77±2,44) mg/dl (P<0,01) (Tabel 4). Low Density Lipoprotein merupakan lipoprotein pengangkut kolesterol terbesar untuk disebarkan ke seluruh endotel jaringan perifer dan pembuluh darah. LDL merupakan metabolit dari VLDL yang mudah menempel pada endotel dan dapat menyebabkan penumpukan lemak dan penyempitan pembuluh darah (Guyton, 1994). Tingginya kadar kolesterol pada kondisi obesitas akan diikuti dengan peningkatan LDL dalam aliran darah. Kadar HDL pada kelompok obesaitas lebih rendah (44,68±2,25) mg/dl dibandingkan dengan kontrol (44,92±2,42) mg/dl (P>0,05) (Tabel 4). High Density Lipoprotein memiliki 50% lipoprotein yang berfungsi untuk mengangkut kolesterol bebas pada jaringan perifer ke reseptor HDL di hepar untuk dikatabolisme menjadi apoprotein, fosfolipid, kolesterol, dan trigliserida yang
42
dieksresikan melalui empedu sehingga penimbunan kolesterol pada jaringan perifer akan berkurang. Kadar kolesterol yang tinggi pada kondisi obesitas menyebabkan berkurangnya jumlah HDL dalam aliran darah (Heslet, 2002). Kelompok obesitas pada penelitian ini tidak menunjukkan penurunan LDL yang signifikan dibandingkan kontrol. Peningkatan kadar kolesterol pada kelompok obesitas masih bisa ditoleransi oleh fungsi HDL sebagai transporter sehingga kadar HDL belum terlalu rendah.
Profil glukosa darah Hasil pengukuran rata-rata kadar glukosa darah kelompok obesitas (161,43±7,61) lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol (88,59±1,77) (P<0,01) (Tabel 4). Longmire dan Maclaren (2007) mengemukakan bahwa pada kondisi obesitas akan terjadi gangguan toleransi glukosa. Peningkatan asam lemak bebas dan gliserol melalui vena porta akibat lipolisis, akan berakibat pada peningkatan oksidasi asam lemak bebas di otot dan hepar yang akhirnya menurunkan intake glukosa di otot sehingga asam lemak bebas digunakan sebagai sumber energi alternatif. Glukosa yang tidak digunakan akan tetap berada pada pembuluh darah sehingga kadarnya tinggi dalam sirkulasi.
Tabel 4. Profil lipid dan glukosa plasma kelompok tikus obesitas dan kontrol (n=5) Karakteristik Total kolesterol (mg/dl)a Trigliserida (mg/dl)a HDL (mg/dl)c LDL (mg/dl)a Glukosa (mg/dl)a Keterangan:
Kelompok Obesitas 160,62 ± 3,52 98,61 ± 2,66 44,68 ± 2,25 67,51± 1,81 88,59 ± 1,77
Kelompok Kontrol 108,84 ± 4,08 70,03 ± 3,02 44,92 ± 2, 42 51,77 ± 2,44 161, 43 ± 7,61
s
HDL (High Density Lipoprotein), LDL (Low Density Lipoprotein ). Nilai merupakan mean ± standar deviasi. a Nilai sangat signifikan (P<0,01) c Nilai tidak signifikan (P>0,05) 43
Topografi Pankreas Pankreas tikus kelompok obesitas dan kontrol masing-masing melekat pada 3 lokasi yaitu pankreas yang menempel pada gastrium, duodenum dan lien. Pankreas memiliki bentuk menyerupai jaringan lemak dan menyebar diantara gastrium, duodemun, dan lien sehingga sulit untuk diukur. Pemeriksaan histologi jaringan menggunakan pankreas area splenic (Gambar 8). Data yang menyebutkan adanya perbedaan topografi anatomi pankreas tikus obesitas dibandingkan tikus normal belum dipublikasikan, Miyaki et al. (1994) dan Elayat et al. (1995) menyebutkan lokasi pankreas tikus normal terletak di mesoduodenum dengan lobus kanan dan kiri yang memanjang ke arah limpa dan gastrium. Lokasi limpa merupakan lokasi yang paling banyak terdapat Pulau Langerhans yang diikuti dengan sel IR insulin dan glukagonnya.
Gambar 8.
Topografi pankreas kelompok obesitas dan kontrol. Pankreas kelompok obesitas dan kontrol tidak menunjukkan perbedaan bentuk dan lokasi yang bermakna karena menyerupai jaringan lemak sehingga sulit untuk diukur. Lokasi yang menempel dengan gastrium (warna hijau), lokasi yang menempel pada duodenum (warna biru), lokasi yang menempel dengan lien (warna kuning).
44
Morfologi dan Morfometri Pulau Langerhans Pulau Langerhans merupakan bagian endokrin dari pankreas. Pulau Langerhans kelompok obesitas dan kontrol masing-masing memperlihatkan bentuk Pulau Langerhans yang bervariasi yaitu bulat, oval dan poligonal. Setiap Pulau Langerhans dikelilingi oleh serabut halus yang membatasi area endokrin dan eksokrin (sel asinus) serta kapiler darah yang akan menyalurkan hormon (Gambar 9).
Gambar 9.
Morfologi Pulau Langerhans kelompok obesitas dan kontrol. Bentuk Pulau Langerhans kelompok obesitas dengan kontrol tidak menunjukkan perbedaan yang bermakna yaitu sama-sama memilki bentuk bulat, oval dan poligonal. Pulau Langerhans kelompok obesitas berbentuk bulat (O1), poligonal (O2) dan oval (O3), Pulau Langerhans kelompok kontrol berbentuk bulat (K1), poligonal (K2) dan oval (K3).
Johnson (1993), Subowo (1992), dan Tambajong (1995) mengungkapkan bahwa Pulau Langerhans terlihat sebagai kelompok sel berbentuk bulat, pucat, dikelilingi serabut halus, tidak memiliki saluran dengan banyak pembuluh darah untuk penyaluran hormon kelenjar pankreas. Junquera (1992) menambahkan,
45
serabut retikuler halus mengelilingi setiap Pulau Langerhans dan memisahkannya dari eksokrin pankreas yang berdekatan. Morfometri Pulau Langerhans menunjukkan diameter rata-rata
Pulau
Langerhans kelompok obesitas (154,38±65,56) µm lebih besar dibandingkan dengan kontrol (116,52±52,35) µm (P<0,01), volume rata-rata Pulau Langerhans kelompok obesitas (3241105,96 µm3) lebih besar dibandingkan kontrol (1395370,99µm3) (P<0,05), keliling Pulau Langerhans kelompok obesitas (373,51±146,69) µm lebih besar dibandingkan kontrol (286,79±116,67) µm (P<0,01) (Tabel 5).
Tabel 5. Morfometri Pulau langerhans pada tikus obesitas dan kontrol (n =5). Aspek
Obesitas
Kontrol
Diameter Pulau Langerhansa 154,38 ± 65,56 a Keliling Pulau Langerhans 373,51 ± 146,69 Volume Pulau Langerhansb 3241105,96 ± 684976,03 Keterangan : Nilai ± standar deviasi a Nilai sangat signifikan (P<0,01) b Nilai signifikan (P<0,05)
116,52 ± 52,35 286,79 ± 116,67 1395370,99 ± 198726,13
Lindstrom (2007) mengungkapkan bahwa pada kondisi obesitas, mencit ob/ob yang genetik obesitas dengan karakter hiperfagia, hiperglikemia, dan hiperinsulinemia menunjukkan peningkatan ukuran Pulau Langerhans pankreas. Korelasi positif antara level hiperglikemia dengan replikasi sel di Pulau Langerhansobese-hyperglicemic
mice
dan
reagregasi
morfologi
Pulau
Langerhans ob/ob mice tergantung pada konsentrasi glukosa. Dor et al. (2004) menyebutkan bahwa Pulau langerhans dapat terbentuk melalui proliferasi sel endokrin yang berdiferensiasi, stem sel yang tidak terdiferensiasi (Bonner dan
46
Sharma, 2002) atau neogenesis dari duktus pankreatikus (Bonner et al., 2004). Neogenesis merupakan proliferasi dan diferensiasi sel progenitor yang menentukan jumlah sel β saat kelahiran. Sebagian kecil siklus sel β masih dapat terus berkembang bila dibutuhkan sebagai mekanisme kompensasi tehadap peningkatan kebutuhan insulin. Stimulasi faktor eksternal seperti pancreatectomy, diet treatment, gejala awal terjadinya diabetes mellitus dapat berkontribusi meningkatkan regenerasi postnatal neogenesis Pulau Langerhans (Tse et al., 1997).
Morfologi, Morfometri dan Distribusi Sel Imunoreaktif Insulin dan Glukagon
Morfologi dan distribusi sel imunoreaktif insulin dan glukagon Deteksi sel imunoreaktif insulin pada penelitian ini menggunakan pewarnaan histokimia Victoria blue dan imunohistokimia. Pewarnaan Victoria blue menunjukkan sel imunoreaktif insulin berwarna biru dengan inti sel merah pucat sedangkan pada pewarnaan imunohistokimia sel terlihat berwarna coklat dengan inti sel ungu muda. Hasil pewarnaan Victoria blue hanya digunakan untuk melihat morfologi dan distribusi sel IR insulin (data pendukung) karena tidak menunjukkan batas antar sel yang jelas. Hasil pewarnaan imunohistokimia digunakan sebagai acuan untuk menghitung morfometri sel IR insulin dan glukagon kelompok obesitas dan kontrol. Sel IR insulin dan glukagon kelompok obesitas memiliki bentuk sel yang sama dengan kelompok kontrol yaitu berbentuk poligonal tidak beraturan dengan inti bulat/oval dan terletak di sentral/perifer (Gambar 10).
47
Gambar 10. Bentuk sel, bentuk nukleus dan letak nukleus sel IR insulin kelompok obesitas dan kontrol. Kelompok obesitas (A) dan kontrol (B) sama-sama menunjukkan bentuk sel poligonal dengan nukleus bulat (panah biru) atau oval (panah merah) dan terletak di tengah atau perifer.
Gambar 11. Distribusi sel IR insulin kelompok obesitas dan kontrol. Kelompok obesitas (A) dan kontrol (B) sama-sama menunjukkan distribusi sel IR insulin dominan pada area sentral dan beberapa pada area perifer. Area Pulau Langerhans (garis merah).
Distribusi sel IR insulin kelompok obesitas dan kontrol sama-sama dominan tersebar pada bagian tengah (sentral) dan beberapa pada area tepi Pulau Langerhans (Gambar 11). Sel IR glukagon kelompok obesitas dan kontrol samasama dominan tersebar pada bagian tepi (perifer) dan beberapa pada bagian sentral Pulau Langerhans(Gambar 12).
48
Gambar 12.
Distribusi sel IR glukagon kelompok obesitas dan kontrol. Kelompok obesitas (A) dan kontrol (B) sama-sama menunjukkan distribusi sel IR glukagon dominan pada area perifer dan sedikit pada area sentral. Area Pulau Langerhans (garis merah).
Gambar 13. Pola distribusi sel IR insulin dan glukagon pada Pulau Langerhans yang sama. Sel IR glukagon kelompok obesitas (O1) dominan terdistribusi pada area perifer dan sel IR insulin (O2) dominan pada area sentral. Sel IR glukagon kelompok kontrol (K1) dominan terdistribusi pada area perifer dan sel IR insulin (K2) dominan pada area sentral. Area Pulau Langerhans (garis merah).
49
Distribusi sel IR insulin dan glukagon di Pulau Langerhans yang sama pada kelompok obesitas dan Pulau Langerhans yang sama pada kelompok kontrol dapat menggambarkan pola distribusi masing- masing sel IR insulin dan glukagon (Gambar 13). Sel IR insulin dan glukagon kelompok obesitas dan kontrol yang tersebar pada area asinus/eksokrin (Gambar 14) dan area duktus pankreatikus (Gambar 15) memiliki pola distribusi yang sama yaitu membentuk koloni (3-5 sel) ataupun soliter. Leeson et al. (1996) telah melaporkan bahwa semua sel dalam Pulau Langerhans berbentuk poligonal tak teratur, dengan inti bundar di tengah, mitokondria kecil berbentuk batang dan aparatus golgi kecil. Lee dan Ku (2005) mengemukakan bahwa distribusi sel – sel IR insulin pada tikus normal tersebar pada regio sentral Pulau Langerhans dan menjadi sel yang paling dominan dengan reaktivitas yang lebih rendah dibandingkan regio perifer. Sel IR glukagon dominan berlokasi di regio perifer Pulau Langerhans dan sedikit tersebar pada regio sentral bersama sel IR insulin. Sel IR insulin dan glukagon tersebar secara random pada area eksokrin dan duktus pankreas. Referensi tentang adanya perbedaan bentuk dan distribusi sel IR insulin dan glukagon pada kelompok obesitas dibandingkan kontrol belum pernah dilaporkan.
50
Gambar 14. Distribusi sel IR insulin dan glukagon pada area asinus/eksokrin. Sel kelompok obesitas dan kontrol sama-sama terdistribusi secara koloni dan soliter. Sel IR insulin obesitas dengan Victoria Blue (O1) dan kontrol (K1), sel IR insulin obesitas dengan imunohistokimia (O2) dan kontrol (K2), sel IR glukagon obesitas dengan imunohistokimia (O3) dan kontrol (K3). Sel berbentuk soliter (panah merah), sel berbentuk koloni (panah biru).
51
Gambar 15. Distribusi sel IR insulin dan glukagon pada area duktus pankreatikus. Sel kelompok obesitas dan kontrol sama-sama terdistribusi secara koloni dan soliter. Sel IR insulin obesitas dengan Victoria Blue (O1) dan kontrol (K1), sel IR insulin obesitas dengan imunohistokimia (O2) dan kontrol (K2), sel IR glukagon obesitas dengan imunohistokimia (O3) dan kontrol (K3). Sel berbentuk soliter (panah merah), sel berbentuk koloni (panah biru), sel yang berdekatan dengan duktus (panah hijau).
52
Morfometri dan kepadatan sel imunoreaktif insulin dan glukagon Diameter rata-rata sel IR insulin kelompok obesitas (12,86±0,67) µm lebih besar dibandingkan kontrol (12,75±0,8) µm sehingga volume rata-rata sel IR insulin kelompok obesitas (1121,88±172,59) µm3 juga lebih besar dibandingkan kontrol (1097,49±208,37) µm3 (P>0,05) (Tabel 6). Slavin et al. (2010) sebelumnya telah melaporkan pada BSB mice yang genetik obesitas bahwa Mean Hormonal Area (MHA) insulin kelompok obesitas (12,663±3,21) µm2 lebih besar dibandingkan kelompok kontrol (30,19±8,72) µm2 (P<0,05). Milburn et al. (1995) mengungkapkan hipersekresi insulin pada isolat Pulau Langerhans Zucker rat obese menyebabkan hiperplasia sel β. Pick et al. (1998) menambahkan kondisi obesitas dapat menginduksi hiperinsulinemia dan peningkatan ukuran sel β. Peningkatan diameter dan volume sel IR insulin kelompok obesitas dibandingkan kelompok kontrol pada penelitian ini tidak signifikan sehingga belum bisa menjadi perbaharuan data. Diameter rata-rata sel IR glukagon kelompok obesitas (12,80±0,36) µm lebih besar dibandingkan kontrol (12,67±0,59) µm sehingga volume sel IR glukagon kelompok obesitas (1102,10±92,08) µm3 juga lebih besar dibandingkan kontrol (1072,58±150,99) µm3 (P>0,05) (Tabel 6). Slavin et al. (2010) melaporkan bahwa MHA glukagon kelompok obesitas (955±203) µm2 lebih kecil dibandingkan kelompok kontrol (1210±200) µm2 dengan perbedaan yang signifikan. Baetens et al. (1978) mengemukakan hal yang sama dengan Slavin et al. (2010) namun menggunakan objek yang berbeda yati ob/ob dan db/db mice. Area sel IR glukagon yang mengecil pada kondisi
53
obestas belum diketahui dengan jelas penyebabnya, diduga meningkatnya sekresi insulin yang menekan sekresi glukagon akan berakibat pada penurunan volume sel. Slavin et al. (2010) mengemukakan bahwa diameter dan volume sel IR glukagon kelompok obesitas lebih besar dibandingkan dengan kelompok kontrol namun perbedaanya belum signifikan. Findlay et al. (1973) dan Tomita et al. (1984) pernah melaporkan bahwa ukuran sel IR glukagon di Pulau Langerhans meningkat pada ob/ob mice jantan dibandingkan kontrol dengan analisa hasil menggunakan biokimia dan metodologi histokimia. Ukuran sel yang meningkat merupakan kompensasi dari peningkatan ukuran dan aktivitas sel IR insulin. Insulin dan glukagon merupakan hormon yang bekerja berlawanan dan berfungsi untuk menjaga keseimbangan energi dan kadar gula dalam darah (Johnson, 1993), meningkatnya aktivitas sel IR insulin akan berpengaruh terhadap aktivitas sel IR glukagon. Diameter rata-rata nukleus sel IR insulin kelompok obesitas (6,27±0,31) µm lebih besar dibandingkan kelompok kontrol (6,20±0,27) µm. Volume nukleus sel IR insulin kelompok obesitas (130,66±18,93) µm3 juga lebih besar dibandingkan kelompok kontrol (125,57±16,42) µm3 (P>0,05). Diameter rata-rata nukleus sel IR glukagon justru menunjukkan hasil yang berbeda, kelompok kontrol (6,30±0,28) µm memiliki rata-yang lebih besar dibandingkan kelompok obesitas (6,26±0,18) µm sehingga volume nukleus sel IR glukagon kelompok kontrol (131,87±17,45) µm3 juga lebih besar kelompok obesitas (128,96±11,19) µm3 (P>0,05) (Tabel 6).
54
Tabel 6. Morfometri dan densitas sel imunoreaktif insulin dan glukagon pada tikus obesitas dan kontrol (n=5). Aspek Diameter sel IR insulin/ Pulau L.c Volume sel IR insulin/Pulau L.c Diameter nukleus sel IR insulin/ Pulau L.c Volume nukleus sel IR insulin/Pulau L.c Jumlah sel IR insulin / Pulau L.a Jumlah sel IR insulin pada area asinus /1000 sel c Jumlah sel IR insulin pada area duktus/100 sel c
Kontrol
Obesitas
12,75 ± 0,8 1097,49 ± 208,37 6,20 ± 0,27 125,57 ± 16,42 52,82 ± 34,23 4,60 ± 2,88 1,90 ± 1,20
12,86 ± 0,67 1121,88 ± 172,59 6,27 ± 0,31 130,66 ± 18,93 113,66 ± 60,90 4,70 ± 3,19 2,1± 1,72
Diameter sel IR glukagon/ Pulau L.c 12,67 ± 0,59 Volume sel IR glukagon/Pulau L.c 1072,58 ± 150,99 Diameter nukleus sel IR glukagon/ Pulau L.c 6,30 ± 0,28 Volume sel IR glukagon/Pulau Lc 131,87 ± 17, 45 Jumlah sel IR glukagon / Pulau L.a 21,90 ± 14,01 Jumlah sel IR glukagon pada area asinus/1000 sel c 1,70 ± 1,77 Jumlah sel IR glukagon pada area duktus/100 sel c 0,60 ± 1,35 a Keterangan : Nilai merupakan mean ± standar deviasi. a Nilai sangat signifikan (P<0,01) c Nilai tidak signifikan (P>0,05)
12,80 ± 0,36 1102,10 ± 92,08 6,26 ± 0,18 128,96 ± 11,19 46,98 ± 25,80 1,90 ± 2,02 1,10 ± 1, 45
Referensi tentang perubahan diameter dan ukuran nukleus sel IR insulin dan glukagon pada kondisi obesitas belum pernah dilaporkan. Hasil yang tidak signifikan dari peningkatan diameter dan volume nukleus sel IR insulin serta penurunan diameter dan volume sel IR glukagon tidak bisa menjadi acuan dalam pembaharuan data. Jumlah rata-rata sel IR insulin/Pulau Langerhans kelompok obesitas (113,66±60,90) µm lebih tinggi dibandingkan kontrol (52,82±34,23) µm. Jumlah rata-rata sel IR glukagon/Pulau Langerhans kelompok obesitas (46,98±25,80) µm lebih tinggi dibandingkan kontrol (21,90±14,01) µm (P<0,01) (Tabel 6). Slavin et al. (2010) melaporkan bahwa area rata-rata Pulau Langerhans dan densitasnya untuk hormon insulin BSB mice obesity meningkat signifikan dibandingkan tikus kontrol. Penelitian pada tikus mutan WNIN/G-Ob dengan
55
karakter obesitas dan euglikemia menunjukkan peningkatan yang signifikan pada densitas dan area Pulau langerhans, serta jumlah sel β/Pulau langerhans dibandingkan dengan tikus normal (Harishankar et al., 2011). Jumlah sel IR insulin yang meningkat dapat disebabkan oleh paningkatan konsentrasi insulin dan insulin-like growth factor yang menstimulasi replikasi sel β secara in vitro (Rabinovitch et al., 1982) dan in vivo (Brown et al., 1981). Hiperplasia sel β pada hewan obesitas dan resisten insulin dapat disebabkan oleh pancreatic homedomain protein PDX-1 (Kulkarni et al., 2004), neogenesis Pulau Langerhans yang berintegrasi dengan protein tertentu (Del et al., 2004) dan mitogenic growth factor (Flier et al., 2001). Peningkatan
jumlah
sel
IR
glukagon
pada
kelompok
obesitas
dibandingkan kelompok kontrol, terlebih dahulu sudah dilaporkan oleh Cerf et al. (2012). Jumlah sel α yang meningkat pada tikus HFP (High-fat diet Posnatal) merupakan kompensasi dari peningkatan jumlah sel dalam Pulau Langerhans sebagai upaya untuk merekondisi normoglikemia. Hiperplasia sel α sering bersamaan dengan peningkatan proliferasi sel asinus sehingga menjadi tanda bahwa sel asinus adalah sumber terbentuknya sel di Pulau Langerhans. Kombinasi dari faktor transkripsi, MafA, Pdx1 dan Ngn3 telah dilaporkan menjadi promotor pemprograman ulang sel asinus menjadi sel endokrin di Pulau Langerhans pada pankreas adolencent immune-compromised mice. Data yang memastikan bahwa peningkatan jumlah sel IR glukagon pada kondisi obesitas berasal dari proliferasi sel asinus dengan kombinasi berbagai faktor tersebut belum diketahui kejelasannya.
56
Jumlah rata-rata sel IR insulin pada area asinus kelompok obesitas (4,70±3,19) µm lebih banyak dibandingkan kontrol (4,60±2,88) µm (P>0,05). Jumlah rata-rata sel IR glukagon pada area asinus kelompok obesitas (1,90±2,02) µm lebih banyak dibandingkan kontrol (1,70±1,77) µm (P>0,05). Jumlah rata-rata sel IR insulin pada area duktus kelompok obesitas (2,1±1,72) µm lebih banyak dibandingkan kontrol (1,90±1,20) µm, begitu juga dengan jumlah sel rata-rata IR glukagon kelompok obesitas (1,10±1,45) µm dan kontrol (0,60±1,35) µm (P>0,05) (Tabel 6). Lee et al., (2011) pernah melaporkan pada tikus strain ddN bahwa frekuensi sel IR insulin/1000 sel pada area eksokrin dan frekuensi sel IR insulin/100 sel pada area duktus berkisar 8,20±3,46 dan 3,60±3,53, sel IR glukagon/1000 sel pada area eksokrin 1,56±0,97 dan tidak ditemukan sel IR glukagon/1000 sel pada area duktus. Jumlah rata-rata sel IR insulin dan glukagon pada area asinus dan duktus kelompok obesitas tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan. Penelitian terkait sel IR insulin dan glukagon pada kondisi obesitas masih terfokus pada Pulau Langerhans sehingga belum dapat dipastikan ada tidaknya perbedaan distribusi sel IR insulin dan glukagon di area eksokrin dan duktus pada strain tikus genetik obesitas yang dapat menjadi fakta pendukung untuk penelitian ini. Nilai rata-rata total sel IR insulin/Pulau Langerhans kelompok obesitas (181,90±96,76) lebih tinggi dibandingkan kontrol (86,40±48,72) (P>0,05). Perbandingan persentase sel IR insulin dan glukagon terhadap sel total pada pulau Langerhans kelompok obesitas adalah 62,48% dan 25,82% sedangkan persentase
57
sel IR insulin dan glukagon terhadap sel total pada Pulau Langerhans kontrol adalah 61,13% dan 25,34%. Proporsi sel IR insulin terhadap sel total/Pulau Langerhans kelompok obesitas lebih tinggi 1,35% dibandingkan kontrol. Proporsi sel IR glukagon kelompok obesitas juga lebih tinggi 0,4% dibandingkan kontrol (Tabel 7). Tabel 7. Perbandingan proporsi sel IR insulin dan glukagon dengan total sel endokrin dalam Pulau Langerhans yang sama. Aspek
Kontrol
Total sel/Pulau Langerhansa 86,40 ± 48,72 Jumlah sel IR insulin / Pulau L.a 52,82 ± 34,23 Jumlah sel IR glukagon / Pulau L.a 21,90 ± 14,01 Persentase sel IR insulin/total sel 61, 13% Persentase sel IR glukagon/total sel 25,34% Keterangan : aNilai merupakan mean ± standar deviasi. a Nilai sangat signifikan (P<0,01)
Obesitas 181,90 ± 96,76 113,66 ± 60,90 46,98 ± 25,80 62,48% 25,82%
Slavin et al. (2010) sebelumnya telah melaporkan pada BSB mice yang genetik obesitas, Mean percent of hormone-stained cell area (MPA) insulin kelompok obesitas 52,1% dan kelompok kontrol 55,2%, sedangkan persentase sel IR glukagon kelompok obesitas 2% dan kelompok kontrol 5%. Persentase sel IR glukagon yang rendah pada kelompok obesitas dibandingkan kontrol disebabkan karena hiperplasia dari sel β akibat hipersekresi insulin. Lindstrom (2007) mengungkapkan pada kondisi obesitas mencit ob/ob yang genetik obesitas memiliki porsi sel β yang lebih banyak. Peningkatan proporsi sel IR insulin/Pulau Langerhans kelompok obesitas pada penelitian ini juga diikuti oleh meningkatnya proporsi sel IR glukagon/Pulau Langerhans dengan nilai yang tidak signifikan sehingga proporsi yang maningkat merupakan kompensasi dari peningkatan ukuran Pulau Langerhans.
58
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan Berdasarkan hasil yang diperoleh dalam penelitian ini dapat disimpulkan: 1. Profil lipida dan glukosa kelompok obesitas menunjukkan adanya peningkatan total kolesterol, trigliserida, LDL dan glukosa dibandingkan kontrol (P<0,05). 2. Distribusi sel IR insulin dan glukagon pada area eksokrin dan duktus pankreatikus dari kelompok obesitas dan kontrol tidak menunjukkan perbedaan yakni terdistribusi secara soliter dan koloni (3-5 sel) (P>0,05). 3. Diameter sel, volume sel, diameter nukleus dan volume nukleus dari sel IR insulin dan glukagon kelompok obesitas tidak menunjukkan perbedaan dengan kontrol (P>0,05). 4. Jumlah rata-rata sel IR insulin dan glukagon/Pulau Langerhans kelompok obesitas meningkat dibandingkan kontrol (P<0,05). 5. Jumlah rata-rata sel IR insulin dan glukagon pada area asinus dan duktus kelompok obesitas tidak berbeda dengan kontrol (P>0,05). 6. Nilai rata-rata total sel/Pulau Langerhans kelompok obesitas meningkat dibandingkan kontrol (P<0,01). 7. Proporsi sel IR insulin terhadap sel total/Pulau Langerhans kelompok obesitas lebih tinggi 1,35% dibandingkan kontrol. 8. Proporsi sel IR glukagon terhadap sel total/Pulau Langerhans kelompok obesitas lebih tinggi 0,4% dibandingkan kontrol.
59
9. Kelompok obesitas tidak menunjukkan perbedaan topografi
pankreas,
bentuk Pulau Langerhans, bentuk dan distribusi sel IR insulin dan glukagon, bentuk dan lokasi nukleus sel IR insulin dan glukagon dibandingkan kontrol. 10. Morfologi, morfometri dan distribusi sel IR insulin dan glukagon pada pankreas tikus (non genetically obese) yang diinduksi obesitas menggunakan diet tinggi karbohidrat dan lemak menunjukkan hiperplasia sel IR insulin dan glukagon sebagai kompensasi peningkatan volume Pulau Langerhans. Saran Pemberian diet tinggi karbohidrat dan lemak yang diberikan pada tikus non genetically obese selama 9 minggu dapat menginduksi obesitas yang berdampak pada perbesaran volume Pulau Langerhans dan jumlah sel IR insulin dan glukagon. Oleh sebab itu individu yang tidak memiliki genetik obesitas juga perlu memperhatikan komposisi asupan nutrisi yang seimbang dengan kebutuhan energi sehingga dapat menghindari terjadinya obesitas.
60
RINGKASAN
Gangguan hemostatis energi yang berasal dari predisposisi genetik dapat mempromotori terjadinya obesitas (Martyn et al., 2008). Penelitian tentang pengaruh obesitas pada hewan genetic obese melalui mutasi gen seperti ob/ob mice, db/dbmouse, Zunker fa/fa rat dan BSB mouse sudah banyak dilakukan (Vicker et al., 2011; Slavin et al., 2010), akan tetapi peningkatan obesitas barubaru ini tidak dianggap sebagai kelainan kongenital spesifik atau kelainan turunan terhadap metabolisme lipid tetapi lebih kepada ketidakmampuan tubuh dalam mengatasi tingginya asupan energi dari makanan akibat perubahan gaya hidup (Martyn et al., 2008). Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi morfologi, morfometri dan distribusi sel imunoreaktif insulin dan glukagon
pankreas tikus non
genetically obese yang diinduksi obesitas dan membandingkannya dengan tikus normal. Obesitas dapat diartikan sebagai penimbunan jaringan lemak tubuh secara berlebihan dan memberi efek buruk pada kesehatan (Rahman et al., 2012). Prevalensi obesitas pada anak usia 2-5 tahun di Jakarta sebesar 16,1% (Droomers et al., 1995). Obesitas dapat dikelompokkan berdasarkan kondisi sel dalam tubuh yaitu tipe hiperplastik, hipertropik dan hiperplastik-hipertropik, berdasarkan gejala klinisnya yaitu obesitas sederhana dan
khusus (kelainan hormonal,
somatodismorfik dan hipotalamus), berdasarkan patogenesisnya yaitu obesitas
62
metabolik dan regulatorik. Faktor penyebab obesitas antara lain faktor genetik, asupan energi (diet), hormonal, obat-obatan, psikologi dan sosial. Lee et al. (2011) menjelaskan bahwa pada hewan coba seperti tikus penghitungan indeks obesitas menggunakan beberapa cara antrara lain Rõhrer index({Body weight (g)/Naso-anal length (cm)3}×103), Lee index ({Body weight (g)1/3/Naso-anal length (cm)}×103) dan TM index (Body weight (g)/Naso-anal length (cm)2.823×103). Indeks memenuhi kategori obesitas apabila nilai hitung >30 (Rõhrer index), >300 (Lee index), >55 (TM index). Kondisi obesitas sering dikaitkan dengan resiko penyakit kronis seperti diabetes
tipe-2,
kanker,
stroke,
kesulitan
bernafas,
gangguan
ginjal,
muskuloskeletal kronis, gangguan metabolisme dan infertilitas (Rahman et al., 2012; Atilgan et al., 2013; Gutterman, 2011). Kondisi obesitas menyebabkan perbesaran ukuran sel adiposit (hipertropi adiposit) dan MCP-1 dalam jumlah berlebih (proinflamasi). Proinflamasi dapat memicu infiltrasi makrofag ke dalam adiposit sehingga terjadi lipolisis. Kondisi lipolisis akan menggangu sekresi leptin untuk mengirimkan signal adiposit. Pada kondisi obesitas terjadi penurunan jumlah signal leptin sehingga aktivasi anabolik memimpin rilisnya orexigenic peptide dan rasa lapar menjadi tidak terkontrol (Misnadierly, 2007; Soliman et al, 2012). Diet tinggi lemak dan karbohidrat sebagai induksi obesitas akan mempengaruhi keseimbangan regulasi energi. Komposis sukrosa dan fruktosa yang tinggi pada diet rodensia memiliki hubungan erat dengan obesitas, diabetes mellitus, dislipidemia, dan tekanan darah tinggi dan resistensi insulin (Le et al.,
63
2006; Le et al., 2009). Heslet (2002) menambahkan bahwa pada kondisi obesitas cenderung mempunyai kadar kolesterol dan lemak yang lebih tinggi dalam darah serta mempunyai HDL yang rendah. Penderita obesitas mempunyai sel lemak yang jauh lebih besar dan lebih banyak dari pada kondisi normal sehingga memiliki kecendrungan lebih tinggi di aliran darah. Pankreas merupakan campuran dari kelenjar eksokrin dan endokrin. Bagian eksokrin terdiri dari sel-sel asinus, sedangkan bagian endokrin berisi Pulau Langerhansyang mensekresikan insulin, glukagon, somatostatin dan pankreas polipeptida (Ganong, 2005). Insulin dan glukagon yang dihasilkan oleh pankreas merupakan hormon yang secara langsung berpengaruh dalam pengaturan keseimbangan sistem regulasi energi (Junqueira, 1992). Pada kondisi normal histologi Pulau Langerhans pankreas berbentuk bulat, pucat (pewarnaan HE), berdiameter 100200 µm dan dikelilingi oleh serabut retikuler. Pulau Langerhans yang berukuran kecil tersebar di antara area eksokrin (Ganong, 1995). Sel-sel dalam Pulau Langerhans berbentuk poligonal tidak teratur dengan inti sel berbentuk bundar di tengah (Leeson et al., 1996). Distribusi sel imunoreaktif insulin tersebar pada area sentral dari Pulau Langerhans sedangkan sel imunoreaktif glukagon tersebar pada area mantel (perifer) (Elayat et al., 1995). Mencit yang genetik obesitas akan menunjukan peningkatan ukuran Pulau Langerhans serta jumlah sel β, α dan δ dibandingkan dengan tikus normal (Lindstrom, 2007; Slavin, 2010; Harishankar et al, 2011).
64
Penelitian menggunakan tikus jantan, jenis wistar, umur 4 minggu, terdiri dari 5 ekor kelompok kontrol dengan pakan normal dan 5 ekor kelompok obesitas dengan pakan tinggi karbohidrat dan lemak ditambah induksi fruktosa 1%/BB dan kolesterol 1%/BB secara per oral. Indeks obesitas diukur sebelum pemeriksaan glukosa darah dan lipid. Tikus di eutanasi menggunakan kloroform dan sampel pankreas difiksasi dengan larutan Bouin. Proses embedding menggunakan paraffin dengan ketebalan potongan 5 µm (serial) dan divisualisasikan dengan tiga pewarnaan yaitu Hematoksilin Eosin, Victoria blue dan imunohistokimia metode Labeled Streptavidin-biotin (LSAB). Antibodi primer yang digunakan yaitu mouse anti-insulin (1:1500; Abcam, USA) dan rabbit anti-glucagon (1;1500; CosmoBio Co, Japan). TrekUniversal Link Kit (Biocare Medical, USA) digunakan sebagai visual detektor yang hasil pewarnaanya dianalisa secara deskriptif dan kuantitatif. Profil lipida dan glukosa kelompok obesitas menunjukkan adanya peningkatan total kolesterol, trigliserida, LDL dan glukosa dibandingkan kontrol (P<0,01). Pankreas tikus kelompok obesitas dan kontrol masing-masing melekat pada 3 lokasi yaitu pankreas yang menempel pada gastrium, duodenum dan lien. Pulau Langerhans kelompok obesitas dan kontrol memperlihatkan bentuk Pulau Langerhans yang bervariasi yaitu bulat, oval dan poligonal. Setiap Pulau Langerhans dikelilingi oleh serabut halus yang membatasi area endokrin dan eksokrin (sel asinus) serta kapiler darah yang akan menyalurkan hormon. Sel IR insulin dan glukagon kelompok obesitas memiliki bentuk sel yang sama dengan kelompok kontrol yaitu berbentuk poligonal tidak beraturan dengan inti bulat/oval
65
dan terletak di sentral/perifer. Diameter Pulau Langerhans kelompok obesitas (154,38±65,56) µm meningkat dibandingkan kontrol (116,52±52,35) µm, keliling Pulau
Langerhans
kelompok
obesitas
meningkat
(373,51±146,69)
µm
dibandingkan kontrol (286,79±116,67) µm dan volume Pulau Langerhans kelompok
obesitas
(3241105,96
µm3)
meningkat
dibandingkan
kontrol
(1395370,99 µm3) (P<0,05). Jumlah sel total/Pulau Langerhans kelompok obesitas (181,90±96,76) meningkat dibandingkan kontrol (86,40±48,72), jumlah sel IR insulin kelompok obesitas (113,66±60,90) µm meningkat dibandingkan kontrol (52,82±34,23) µm dan jumlah sel IR glukagon kelompok obesitas (46,98±25,80) meningkat dibandingkan kontrol (21,90±14,01) (P<0,01). Kondisi obesitas menyebabkan terjadinya perbesaran dan peningkatan jumlah sel lemak akibat tingginya mobilisasi lipid dan penyimpanan trigliserida di dalam sel. Hipertropi adiposit pada kondisi obesitas akan dibarengi dengan sekresi MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1) dalam jumlah berlebih, memicu infiltrasi makrofag ke dalam adiposit, peningkatan lipolisis dan menurunnya penyimpanan trigliserida sehingga konsentrasinya tinggi dalam darah. Kadar kolesterol yang tinggi pada kondisi obesitas akan diikuti dengan peningkatan LDL dalam aliran darah. High Density Lipoprotein memiliki 50% lipoprotein yang berfungsi untuk mengangkut kolesterol bebas pada jaringan perifer termasuk pembuluh darah ke reseptor HDL di hepar untuk dikatabolisme. Kadar kolesterol yang tinggi pada kondisi obesitas menyebabkan berkurangnya jumlah HDL dalam aliran darah (Heslet, 2002). Longmire dan Maclaren (2007) mengemukakan pada kondisi obesitas akan terjadi gangguan toleransi glukosa karena peningkatan asam
66
lemak bebas dan gliserol yang langsung melalui vena porta akibat lipolisis dan berakibat pada peningkatan oksidasi asam lemak bebas di otot dan hepar yang akhirnya menurunkan intake glukosa di otot. Peningkatan diameter, keliling dan volume Pulau Langerhans kelompok obesitas dibandingkan kontrol merupakan kompensasi peningkatan ukuran tubuh. Pulau langerhans dapat terbentuk melalui proliferasi sel endokrin yang berdiferensiasi (Dor et al., 2004), stem sel yang tidak terdiferensiasi (Bonner dan Sharma, 2002) atau neogenesis dari duktus pankreatikus (Bonner et al., 2004). Stimulasi faktor eksternal seperti pancreatectomy, diet treatment, gejala awal terjadinya diabetes mellitus, dapat berkontribusi meningkatkan regenerasi postnatal neogenesis Pulau Langerhans (Tse et al., 1997). Peningkatan jumlah sel IR insulin kelompok obesitas dibandingkan kontrol dapat disebabkan oleh meningkatnya konsentrasi insulin dan insulin-like growth factor yang menstimulasi replikasi sel β secara in vitro (Rabinovitch et al., 1982) dan in vivo (Brown et al., 1981). Fakta bahwa hiperplasia sel β pada hewan obesitas dan resisten insulin dapat disebabkan oleh pancreatic homedomain protein PDX-1 (Kulkarni et al., 2004), neogenesis Pulau Langerhans yang berintegrasi dengan protein tertentu (Del et al., 2004) dan mitogenic growth factor (Flier et al., 2001) mulai diketahui. Peningkatan jumlah sel IR glukagon kelompok obesitas dibandingkan kontrol sebelumnya sudah dilaporkan oleh Cerf et al. (2012), yang mengungkapkan adanya peningkatan jumlah sel α pada HFP (High-fat diet Posnatal). Peningkatan sel α merupakan kompensasi dari peningkatan jumlah sel
67
dalam Pulau Langerhans sebagai upaya untuk merekondisi normoglikemia. Hiperplasia sel α sering bersamaan dengan peningkatan proliferasi sel asinus sehingga menjadi tanda bahwa sel asinus adalah sumber terbentuknya sel di Pulau Langerhans. Kombinasi dari faktor transkripsi, MafA, Pdx1 dan Ngn3 telah dilaporkan menjadi promotor pemprograman ulang sel asinus menjadi sel endokrin di Pulau Langerhans pada pankreas adolencent immune-compromised mice. Penelitian yang memastikan bahwa peningkatan jumlah sel IR glukagon pada kondisi obesitas berasal dari proliferasi sel asinus dengan kombinasi berbagai faktor tersebut belum pernah dilaporkan. Morfologi, morfometri dan distribusi sel IR insulin dan glukagon pada pankreas tikus (non genetically obese) yang diinduksi obesitas menggunakan diet tinggi karbohidrat dan lemak menunjukkan hiperplasia sel IR insulin dan glukagon sebagai kompensasi peningkatan volume Pulau Langerhans.
.
.
68
DAFTAR PUSTAKA Aronoff, S.L., Berkowiz, K., Shreiner, B., and Want, L. 2004. Glucose Metabolism and Regulation: Beyond Insulin and Glucagon. Pharmaceuticals, Inc., 9360 Towne Centre Drive, San Diego, CA 92121. Diabetes Spectrum; 17, 183-190. Atilgan, D., Parlaktas, B.S., Uluocak, N., Erdemir, F., Kilic, S., Erkorkmaz, U., Ozyurt, H., and Markoc, F. 2013. Weight Loss And Melatonin Reduce Obesity-Induced Oxidative Damage In Rat Testis. Advances in urology; 1-6. Balaban, G. and Silva, G.A.P. 2004. Protective Effect of Breast feeding Against Childhood Obesity. Journal de Pediatria; 7-16. Baetens, D., Stefan, Y., Ravazzola, M., Malaisse, L.F., Coleman, D.L., and Orci, L.1998. Alteration of Islet Cell Population in Spontaneously Diabetic Mice. Diabetes; 27, 1-7. Berridge, M.J. 2012. Cell Signalling Biology Module 7. Portland Press Limited. Di download dari www.cellsignallingbiology.org pada 26 Februari 2014. Bhathena, S.J., Aparicio, P., Revett, K., Voyles, N., and Recant, L. 1987. Effect Of Dietary Carbohydrates on Glucagon and Insulin Reseptor in Genetically Obese Female Zucker. American Institute of Nutrition; 117, 1291-1297. Bland, I.M. and Hill, J. 2011. Tackling dog obesity by tackling owner attitudes. Perspective in Agiculture, Veterinary Science Nutrition and Natural Resources; 1–7. Bonner, W.S., and Sharma, A. 2002. Pancreatic Stem Cell. Journal Pathology; 197, 519-526. Bonner, W.S., Toschi,E., Inada, A., Reitz, P., Fonseca, S.Y., Aye, T., and Sharma, A. 2004. The Pancreatic Ductal Epithelium as a Potential Pool of Progenitor Cell. Pediatric Diabetic; 5, 16-22. Brown, J., Heininger, D., Kuret, J., and Mullen, Y. 1981. Islet Cell Grow after Transplantation of Fetal Pancreas and Control of Diabetes. Diabetes; 30, 9-13. Caroll. 1983. Animal Laboratory. W.B. Saunders Company. Philadelphia.
69
Cerf, E.M., Chapman, C.S., and Louw, J. 2012. High-fat progamming of hyperglycemia, hyperinsulinemia, insulin resisten, hyperleptinemia, and altered islet architechture in 3-month-old Wistar Rat. ISRN Endocrinology; 1-8. Dalimartha, S., 2000. 36 Resep Tumbuhan untuk Menurunkan Kolesterol. Cetakan kedelapan. Jakarta: Penerbit Sawadya; 33-34. Del, Z., Borelli, M.I., Flores, L., Garcia, M.E., Gomez, D.C.L., Chicco, A., Lombardo, Y.B., and Gangliardino, J.J. 2004. Islet Neogenesi: an Apparent Key Component of Long-term Pancreas Adaptation to Increase Insulin Demand. Journal Endocrinology; 183, 321-330. DiaSys Diagnostic System GmBh, Holzheim Germany. 2008. Dor , Y., Brown, J., and Martinez, O.I. 2004. Adult Pancreatic Beta-cell are Formed by Self-duplication rather than Stem-cell Diferentiation. Nature; 429, 41-46. Dourmashkin, J.T., Chang, G.Q., Gayles, E.C., Hill, J.O., Julien, C., and Leibowitz, S.F.2005. Different Forms of Obesity as a Function of Diet Composition. International Journal of Obesity; 1-11. Droomers, M., Gross, R., and Schultin, K.W. 1995. High Socio- Economic Class Preschool Children From Jakarta, Indonesia Are Taler And Heavier Than NCHS Reference Population. European Journal of Clinical Nutrition; 49, 740–744. Elayat, A.A., Nanggar, M.M., and Tahir, M. 1995. An Immunocytochemical and Morphometric Study of Rat Pancreatic Islet. Journal of Analytical Chemistry; 186, 629-637. Elmquist, J.K., and Scherer, P.E. 2012. Neuroendocrine and Endocrine Pathway of Obesity. The Journal of the American Medical Association; 308, 1070-1071. Findlay, J.A., Rookledge, K.A., Beloff, C.A., and Lever, J.D. 1973. A Combined Biochemical and Histological Study on the Islet of Langerhans in the Genetically Obese Hyperglycemic Mouse and in The Lean Mouse, Including Observation on the Effect of Streptozotocin Treatment. Journal Endocrinology; 56, 571-583. Fukuda, S., Takeshita, T., and Morimoto, K., 2001. Obesity and Lifestyle. Obesity Research; hal 5-60.
70
Ganong, W.F. 1995. Fisiologi Kedokteran. 14thed. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC; 313-314. Guiherme, A., Virbasius, J.V., Puri, V., and Czech, M.P., 2008. Adipocyte Dysfunction Linking Obesity to Insulin Resisten and Type 2 Diabetes. Molecular Cell Biology; 368-370. Gutterman, S. 2011. Obesity : Status and Effect. Sosiety of Actuartes Orlando; 1-18. Guyton, A.C., 1994. Fisiologi Manusia dan Mekanisme Penyakit. Cetakan VII. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran ECG; 705-707. Harishankar, N., Kumar, P.U., Sesikeran, B., and Giridharan, N. 2011. Obesity Associated Pathothysiological and Histological Changes in WNIN Obese Mutant Rats. The Indian Journal of Medical Research; 134, 330-340. Harper, H., Rodwell V.W., and Mayes, P.A. 1988. Review of Physiological Chemistry. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC; 380-400. Heslet, L., 2002. Kolesterol. Penerjemah: Anton Adiwiyoto. Cetakan VII. Jakarta: Penerbit Megapoint; hal 63-68. Hidayat, N.S., andIrawan, R. 2006. Obesitas Pada Anak. Di download dari http://www.pediatrik.com pada 25 Maret 2014. Hofbauer, K.G. 2002. Molecular Pathways to Obesity. International Journal of Obesity; 26, 518-527. Ikemoto, S., Tomson, P.S., Takahasi, M., Itakura, H., Lane, M.D., and Ezaki, O. 1995. High Fat Diet-Unduce Hyperglycemia: Prevention Buy Low Level Expression Of A Glucose Transporter (GLUT 4) Mini Gene In Trangenic Mice. Science USA; 92, 3096-3099. Johnson, K.E. 1993. Histology and Cell Biology. Cetakan I. Jakarta: Penerbit Binarupa aksara; hal 311-315. Junqueira, L.C. and Carneiro, J. 1992. Histologi Dasar. Cetakan III. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC; 430-435. Kanasaki, K., and Koya, D. 2011. Biology Of Obesity : Lesson From Animal Models of Obesity. Journal Biomed Biotechnology; 1-11. Key, M. 2009. Immunohistochemical Staining Methods Fifth Edition. California: Dako; 57-60.
71
Klein, K.O., Larmore, K.A., Brown, J.M., Considine, R.V., and Hassink, S.G., 1998. Effect of Obesity on Estradiol Level, and Its relationship to Leptin, Bone Maturation, and Bone Mineral Density in Children. Journal Clinical Endocrinology Metabolic; 83, 10-15. Kulkarni, R.N., Jhala, U.S., Winnay, J.N., Krajewski S., Montminy, M., and Kahn, R. 2004. PDX-1 Haploinsufficiency limit the Compensatory Islet Hyperplasia that Occurs in Response to Insulin Resistence. Journal of Clinical Investigation; 114, 828-836. Le, K.A., Faeh, D., and Stettler, R. 2006. A Four Week High-Fructose Diet Alters Lipid Metabolism Without Affecting Insulin Sensitivity or Ectopic Lipids in Healthy Humans. The American Journal Clinical Nutrition; 84, 1374-1379. Le, K.A., Ith, M., Kreis, R., Faeh, D., Bortolotti, M., Tran, C., Boesch C., and Tappy L. 2009. Fructose Overconsumption Causes Dyslipidemia and Ectopic Lipid Deposition In Healthy Subjects With and Without A Family History of Type 2 Diabetes. The American Journal Clinical Nutrition; 89, 1760-1765. Lee, H.S. and Ku, K.K.S. 2005. Distribution And Frekuensi Of Endokrin Sel In Thepancreas of The ddy Mouse: An Inmunohistochemical Study. European Journal Of Histochemistry; 49, 19-24. Lee, S-II., Kim, J.W., Lee, Y.K., Yang, S.H., Lee, I., Suh, J.W., and Kim, S.D. 2011. Anti-obesity Effect of Monascus pilosus Mycelial Extract in High Fat Diet-induced Obese Rat. Journal Applied Biomolecular Chemistery; 54, 197-205. Lehninger, A.L., 1993. Principles of Biochemistry. Cetakan II. Penerbit Worth publisher; 679. Lehr, A.H., Cris, M., Loss, V.D., Teeling, P., and Gown, M. 1999. Complete Cromogen Separation and Analysis in Double Immunohistochemical Staining Using Photoshop-based Image Analisys. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry; 47, 119-125. Lesson, C.R., Leeson,T.S., and Paparo, A.A. 1996. Histologi. Cetakan V. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC; 380-383. Linder, M.C., 1992. Biokimia Nutrisi dan Metabolisme, dengan Pemakaian Secara Klinis. Penerjemah: Parakkasi Aminudin. Cetakan I. Jakarta: Penerbit UI Press; 59-77, 164-169.
72
Lindstrom, P. 2007. The Phisiology of Obese-Hyperglycemic Mice (ob/ob Mice).The Scientific World Journal; 7, 666-685. Longmire B.E., and Maclaren N.K., 2007. Assesment of Child and Adolescent Overweight and Obesity. Pediatric; 120, 193-228. Manens, J., Bolognin, M., Bernaerts, F., and Diez, M.N.K.2012. Effects of obesity on lung function and airway reactivity in healthy dogs. The Veterinary Journal; 193, 217-221. Martin, D.W., Rodwell, V.W., and Granner, D.K., 1987. Biokimia (Harper’s Review of Biochemistry). Penerjemah: Darmawan. Jakarta: Penerbit EGC; 217-286. Martyn, J.J.A., Kaneki, M.,and Yasuhara, S. 2008. Obesity-Induced Insulin Resisten and Hyperglycemia: Etiological Factor and Molecular Mechanisms. Anesthesiology; 109, 137-148. Mexitalia, M., Fahmi, I., Susanto, R.,and Yamauchi, T. 2011. Hubungan Fungsi Tiroid dengan Energy Expenditure pada Remaja. Sari Pediatri; 325327. Milburn, J.L., Hirose, H., Lee, Y.H., Nagasawa, Y., Ogawa, A., Ohneda, M., Beltrandelrio, H., Newgard, C.B., Johnson, J.H., and Unger, R.H. 1995. Pancreatic β-cells in Obesity: Evidence for Induction of functional, Morphology and Metabolic Abnormalities by Increased Long-chain fatty Acid. Journal Biology Chemistery: 270, 1295-1299. Misnadierly. 2007. Obesitas Sebagai Faktor resiko berbagai penyakit. Jakarta: Penerbit Pustaka Obor Populer; 25-27. Miyaki, T., Nakama, K., Akimoto, T., Kitoh, J.,and Ito, H. 1994. Goss Morfology of the Pancreas and Distribution of Pancreas Duct in Rat. Jikken Dobutsu; 43, 257-260. Montgomery, R., Dryer, R.L., Conway, T.A., and Specter, A. 1993. Biokimia, Suatu Pendekatan Biosintesis. Yogyakarta: Penerbit Gadjah Mada University Press; 927-928. Mustofa, A. 2010. Solusi Ampuh Mengatasi Obesitas. Yogyakarta: Hanggar Kreator; 7-10.
73
Nugraha, G. I. 2009. Etiologi dan Patofisiologi Obesitas. Dalam: Soegih, R. R., dan Wiramihardja, K. K. (Editor). Obesitas Permasalahan dan Terapi Praktis. Jakarta: Penerbit Sagung Seto; 9-18. Paulsen, D.F. 2000. Histologi and Cell Biology Examination and Board Reveiw. Cetakan I. Singapore: McGaw-Hill Publisher ; 270-271. Pick, A., Clark, J., Kubstrup, C., Levisette, M., Pugh, W., Bonner, W.S., and Polonsky, K.S. 1998. Role of Apoptosis in Failure of β-cell Mass Compensation for Insulin Resistence α β cell Defect in the Male Zucker diabetic Fatty Acid. Diabetes; 47, 358-364. Rabinovitch, A., Quigly, C., Russell, T., Patel, Y., and Mintz, D.H. 1982. Insulin and Multiplication Stimulating Activity (an insulin-like growth factor) Stimulate Islet β-cell Replication in Neonatal Rat Pancreatic Monolayer Culture. Diabetes; 31,160-164. Rahman, Basuki, U., Handoyo, and Rohadi, P. 2012. Hubungan Obesitas dengan Resiko Obstructive Sleep Apnea (OSA) pada Remaja. Jurnal Ilmiah Kesehatan Keperawatan; 8, 44-55. Rantam, F.A. 2003. Metode Immunologi. Surabaya: Airlangga University Press; 145-155. Russel, M.D. 2011. Bebas dari 6 Penyakit Paling Mematikan. Jakarta: Penerbit Media Presindo; 35-38. Slavin, B.G., Zarow, C., Warden, C.H., and Fisler, J.S. 2010. Histological, Immunocytochemical and Morphometrical Analyses of Pancreatic Islet in BSB Mouse Model Of Obesity. The Anatomical Record; 293, 108-116. Soegih, R. 2004. BMI And WC Cut Offs for The Risk Of Comorbidities of Obesity in A Population in Indonesia. BMI and WC Cutoff; 13, 241-245. Soetjiningsih. 2004. Tumbuh Kembang Remaja dan Permasalahannya. Jakarta: Sagung Seto. Soliman, A.T., Yasin, M., and Kassem, A. 2012. Leptin in Pediatrics: A Hormon from Adipocyte that Wheels Several Functions in Children. Indian Journal of Endocrinology and Metabolism; 16, 577-5874. Stanley, J.U., and Hayley, L. 2006. Obesity in Biocultural Perspective. Annual Review of Antropology; 35, 337-360.
74
Subowo. 1992. Histologi Umum. Cetakan II. Jakarta: Penerbit Bumi Aksara; 38-39. Tambajong, J. 1995. Sinopsis Histologi. Cetakan I. EGC. Jakarta:138-141. Tomita, T., Doull, V., Kimmel, J.R., and Pollock, H.G. 1984. Pancreatic Polipeptide and Other Hormone in Pancreatic of Obese (ob/ob) mice. Diabetologia; 27, 454-459. Tomita, T., Doull, V., Pollock, H.G., and Krizsan, D. 1992. Pankreas Islet of Obese Hyperglycemic Mice Ob/Ob. Publication medical; 367-375. Tappy, L. and Anne, K. 2010. Metabolic Effects of Sweetened Beverages Pathophysiology and Mechanistic Insights. Clinical Microbiology Review Journal; 3, 13-18. Tse, O.E., Gregoire, F.M., Reusens, B., Remacle, C., Hoet, J.J., Jhonson, P.R., and Stern, J.S. 1997. Changes of Islet Size and Islet Size distribution Resulting from Protein-Malnutrition in Lean (Fa/Fa) and Obese (fa/fa) Zucker Rats. Obesity Research; 5, 563-671. Vicker, P.S., Jackson, H.C., and Cheetham, S.C. 2011. Review The Utility of Animal Model to Evaluate Novel Anti-Obesity Agents. British Journal of Pharmacology; 164, 1248-1262. Wahab, S. 2000. Ilmu Kesehatan Anak. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. Wang, C.Y. and Liao, J.K. 2012. A Mouse Model Of Diet-Induced Obesity and Insulin Resistance. Methods Molecular Biology; 821, 421-433. Ward, E. 2012. Pets obesity rates rise, cats heavier than ever. Association for Pets obesity prevention. Di download dari www.petobesityprevention.org pada 25 maret 2014. Watanabe, M., Hayasaki, H., Tamayama, T., and Shimada, M. 1998. Histologic Distribution of Insulin and Glucagon Receptors. Brazilian Journal of Medical and Biological Research; 31, 243-256. WHO. 2003. Obesity and Overweight. Di download dari http://www.who.int/dietphysicalactivity/media/en/gsfs_obesity.pdf. pada 20 Maret 2014. Wilding. J.P.H. 2010. Pathophysiology and Aetiology of obesity. Medicine; 1-10. Williams, E.R. and Caliendo, M.A. 1984. Nutrition Principles, Issues and Application. USA: McGraw Hill Book Company; 259-270.
75
Wohlrab, F., Dorsche, H.N., and Krautschick, Schmidt, S. 1985. On the Specificity of Insulin Staining by Victoria Blue 4R. Histochemical Journal; 17, 515-518. Zhang, L.X., Zuo, L., Wang, F., Wang, M., Wang, S.Y., Liu, L.S., and Wang, H.Y. 2007. Metabolic Syndrome and Chronic Kidney Disease in a Chinese Population Aged 40 years and Older. Mayo Clinical Process; 82, 822-827.
76
LAMPIRAN
Lampiran 1. Komposisi reagen pada pemeriksaan kadar glukosa darah Glukose FS (DiaSys, Jerman) Metode = Enzymatic Colorimetric Test “ GOD – PAP “ Komponen Reagen = Phosphate Buffer pH 7.5 250 mmol/l Phenol 5 mmol/l 4-Aminoantipyrine 0.5 mmol/l Glucose Oxsidase ≥15 KU/l Peroxidase ≥1 KU/l Standar = 100mg/dl (5.55mmol/l)
Lampiran 2. Komposisi reagen pada pemeriksaan kadar trigliserida Triglycerida (DiaSys, Jerman) Metode = Colorimetric Enzymatic Test " GPO " Komponen Reagen = Goods Buffer pH 7.2 50 mmol/l 4-Chlorophenol 4 mmol/l ATP 2 mmol/l 15 mmol/l Mg²⁺ Glycerokinase ≥0.4 KU/l Peroxidase ≥2 KU/l Lipoprotein Lipase ≥2 KU/l 4-Aminoantipyrine 0.5 mmol /l Gliserol-3-Phosphate-Oxidase ≥0.5 KU/l Standar = 200mg/dl (5.2mmol/l)
Lampiran 3. Komposisi reagen pada pemeriksaan HDL HDL precipitant (DiaSys, Jerman) Metode = Precipitation Of LDL,VLDL and Chylomicrons Komponen Reagen = Magnesium Chloride 50 mmol/l Phosphotungstic Acid 4 mmol/l Standar = 200mg/dl (5.2mmol/l)
Lampiran 4. Komposisi reagen pada pemeriksaan LDL HDL precipitant (DiaSys, Jerman) Metode = Precipitation Of LDL,VLDL and Chylomicrons Komponen Reagen = Magnesium Chloride 50 mmol/l Phosphotungstic Acid 4 mmol/l Standar = 200mg/dl (5.2mmol/l)
Lampiran 5. Komposisi reagen pada pemeriksaan total kolesterol Colesterol FS(DiaSys, Jerman) Metode = Enzymatic Colorimetric Test " CHOD - PAP " Komponen Reagen = Goods Buffer pH 6.7 50 mmol/l Phenol 5 mmol/l 4-Aminoantipyrine 0.3 mmol/l Cholesterol Esterase ≥200 u/l Cholesterol Oxsidase ≥50 u/l Standar = 200mg/dl (5.2mmol/l)
77
Lampiran 6. Data pengukuran panjang tubuh (hidung-anus) dan berat badan kelompok obesitas dan kontrol Kelompok Kontrol 1 Kontrol 2 Kontrol 3 Kontrol 4 Kontrol 5 Perlakuan 1 Perlakuan 2 Perlakuan 3 Perlakuan 4 Perlakuan 5
Sebelum perlakuan BB (gram) Panjang (cm) 100 16,92 103 16,99 107 17,32 102 16,72 111 17,23 106 109 103 102 106
17,52 17,18 16,83 17,00 17,55
Setelah 9 minggu perlakuan BB (gram) Panjang (cm) 145 17,36 152 17,94 165 17,77 149 17,40 154 17,95 182 188 183 174 189
17,89 17,62 17,44 17,64 17,03
Lampiran 7.t-Test:: two-sample assuming unequal variances “kadar glukosa” Obesitas Mean 5,08 Variance 0,00 Observations 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 5 t Stat 26,09 P(T<=t) one-tail 0,00 t Critical one-tail 2,01 P<0.005: ada perbedaan dan signifikan
Kontrol 4,483 0,00 5
Lampiran 8. t-Test:: two-sample assuming unequal variances “total kolesterol” Obesitas Mean 5,07 Variance 0,00 Observations 5,00 Hypothesized Mean Difference 0,00 df 6,00 t Stat 20,19 P(T<=t) one-tail 0,00 t Critical one-tail 1,94 P< 0,005: ada peredaan dan signifikan
Kontrol 4,68 0,00 5,00
Lampiran 9. t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances “Trigliserida” Obesitas Mean 4,59 Variance 0,00 Observations 5,00 Hypothesized Mean Difference 0,00 df 7,00 t Stat 15,05 P(T<=t) one-tail 0,00 t Critical one-tail 1,89 P< 0,005: ada peredaan dan signifikan
Kontrol 4,24 0,00 5,00
78
Lampiran 10. t-Test: Two-sample assuming unequal variances“HDL” Kontrol Mean 3,80 Variance 0,00 Observations 5,00 Hypothesized Mean Difference 0,00 df 8,00 t Stat 0,15 P(T<=t) one-tail 0,43 t Critical one-tail 1,85 P>0.005 : ada perbedaan tetapi tidak signifikan
Obesitas 3,79 0,00 5,00
Lampiran 11. t-Test: Two-sample assuming unequal variances “LDL” Obesitas Mean 4,21 Variance 0,00 Observations 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 6 t Stat 10,99 P(T<=t) one-tail 0,00 t Critical one-tail 1,94 P< 0,005: ada peredaan dan signifikan
Kontrol 3,94 0,00 5
Lampiran 12. t-Test: Two-sample assuming equal variances “Diameter Pulau Langerhans” Obesitas Mean 154,38 Variance 4298,56 Observations 50 Pooled Variance 3519,79 Hypothesized Mean Difference 0 df 98 t Stat 3,19 P(T<=t) one-tail 0,00 t Critical one-tail 1,66 P< 0,005: ada peredaan dan signifikan
Kontrol 116,52 2741,01 50
Lampiran 13. t-Test: Two-sample assuming equal variances “Keliling Pulau Langerhans” Obesitas Mean 373,51 Variance 21519,29 Observations 50 Pooled Variance 17565,62 Hypothesized Mean Difference 0 df 98 t Stat 3,27 P(T<=t) one-tail 0,00 t Critical one-tail 1,66 P< 0,005: ada peredaan dan signifikan
Kontrol 286,79 13611,95 50
79
Lampiran 14. t-Test: Two-sample assuming equal variances “Volume Pulau Langerhans” Obesitas Mean 3241105,957 Variance 46919212528766,8 Observations 50 Pooled Variance 25434225566031,8 Hypothesized Mean Difference 0 df 98 t Stat 1,82 P(T<=t) one-tail 0,03 t Critical one-tail 1,66 P< 0,005: ada peredaan dan signifikan
Kontrol 1395370,99 3949238603296,83 50
Lampiran 15. t-Test: Two-sample assuming unequal variances “Diameter sel IR insulin” Obesitas Mean 12,85 Variance 0,44 Observations 50 Hypothesized Mean Difference 0 df 95 t Stat 0,74 P(T<=t) one-tail 0,22 t Critical one-tail 1,66 P>0,005: ada peredaan tetapi tidak signifikan
Kontrol 12,74 0,64 50
Lampiran 16. t-Test: Two-sample assuming equal variances “Diameter nukleus sel IR insulin” Obesitas Mean 6,27 Variance 0,09 Observations 50 Pooled Variance 0,08 Hypothesized Mean Difference 0 df 98 t Stat 1,35 P(T<=t) one-tail 0,08 t Critical one-tail 1,66 P>0,005: ada peredaan tetapi tidak signifikan
Kontrol 6,20 0,07 50
Lampiran 17. t-Test: Two-sample assuming unequal variances “Volume sel IR insulin” Obesitas Mean 1121,88 Variance 29788,65 Observations 50 Hypothesized Mean Difference 0 df 95 t Stat 0,63 P(T<=t) one-tail 0,26 t Critical one-tail 1,66 P>0,005: ada peredaan tetapi tidak signifikan
Kontrol 1097,49 43418,89 50
80
Lampiran 18. t-Test: Two-sample assuming equal variances “Volume nukleus sel IR insulin’ Obesitas Mean 130,66 Variance 358,51 Observations 50 Pooled Variance 314,11 Hypothesized Mean Difference 0 df 98 t Stat 1,43 P(T<=t) one-tail 0,07 t Critical one-tail 1,66 P>0,005: ada peredaan tetapi tidak signifikan
Kontrol 125,56 269,71 50
Lampiran 19. t-Test: Two-sample assuming unequal variances “Jumlah sel IR insulin/Pulau Langerhans” Obesitas Mean 113,66 Variance 3709,12 Observations 50 Hypothesized Mean Difference 0 df 77 t Stat 6,16 P(T<=t) one-tail 0,00 t Critical one-tail 1,66 P< 0,005: ada peredaan dan signifikan
Kontrol 52,82 1171,98 50
Lampiran 20. t-Test: Two-sample assuming equal variances “Jumlah sel IR Insulin pada area asinus” Obesitas Mean 4,7 Variance 10,23 Observations 10 Pooled Variance 9,25 Hypothesized Mean Difference 0 df 18 t Stat 0,07 P(T<=t) one-tail 0,47 t Critical one-tail 1,73 P>0,005: ada peredaan tetapi tidak signifikan
Kontrol 4,6 8,26 10
Lampiran 21. t-Test: Two-sample assuming equal variances “Jumlah sel IR insulin pada area duktus” Mean Variance Observations Pooled Variance Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T<=t) one-tail t Critical one-tail
Obesitas 2,1 2,98 10 2,21 0 18 0,30 0,38 1,73
Kontrol 1,9 1,4333 10
81
P>0,005: ada peredaan tetapi tidak signifikan
Lampiran 22. t-Test: Two-sample assuming equal variances “diameter sel IR glukagon” Obesitas Mean 12,80 Variance 0,13 Observations 50 Pooled Variance 0,24 Hypothesized Mean Difference 0 df 98 t Stat 1,34 P(T<=t) one-tail 0,09 t Critical one-tail 1,66 P>0,005: ada peredaan tetapi tidak signifikan
Kontrol 12,67 0,35 50
Lampiran 23. t-Test: Two-sample assuming equal variances “Volume sel IR glukagon” Obesitas Mean 1102,10 Variance 8477,91 Observations 50 Pooled Variance 15638,33 Hypothesized Mean Difference 0 df 98 t Stat 1,18 P(T<=t) one-tail 0,12 t Critical one-tail 1,66 P>0,005: ada peredaan tetapi tidak signifikan
Kontrol 1072,58 22798,76 50
Lampiran 24. t-Test: Two-sample assuming equal variances “Diameter nukleus sel IR glukagon” Kontrol Mean 6,30 Variance 0,07 Observations 50 Pooled Variance 0,05 Hypothesized Mean Difference 0 df 98 t Stat 0,84 P(T<=t) one-tail 0,19 t Critical one-tail 1,66 P>0,005: ada peredaan tetapi tidak signifikan
Obesitas 6,26 0,03 50
Lampiran 25. t-Test: Two-sample assuming equal variances“Volume nukleus sel IR glukagon” Mean Variance Observations Pooled Variance Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T<=t) one-tail t Critical one-tail
kontrol 131,86 304,34 50 214,77 0 98 0,99 0,16 1,66
obesitas 128,96 125,19 50
82
P>0,005: ada peredaan tetapi tidak signifikan
Lampiran 26. t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances “Jumlah sel IR glukagon pada area asinus” Obesitas Mean 1,9 Variance 4,1 Observations 10 Pooled Variance 3,61 df 18 t Stat 0,23 P(T<=t) one-tail 0,40 t Critical one-tail 1,73 P>0,005: ada peredaan tetapi tidak signifikan
Kontrol 1,7 3,12 10
Lampiran 27. t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances “Jumlah sel IR glukagon pada area duktus” Obesitas Mean 1,1 Variance 2,1 Observations 10 Pooled Variance 1,96 Hypothesized Mean Difference 0 df 18 t Stat 0,79 P(T<=t) one-tail 0,21 t Critical one-tail 1,73 P>0,005: ada peredaan tetapi tidak signifikan
Kontrol 0,6 1,82 10
Lampiran 28. t-Test: Two-sample assuming unequal variances “Jumlah sel total/Pulau Langerhans” Obesitas Mean 150,96 Variance 8115,549 Observations 50 Hypothesized Mean Difference 0 df 80 t Stat 4,956755 P(T<=t) one-tail 0,00 t Critical one-tail 1,664125 P<0,005: ada peredaan dan signifikan
Kontrol 77,34 2914,229 50
83
