Penggunaan Matriks Membran Amnion untuk Produksi Sel Punca. Limbal (SPL) Hewan Coba

LAPORAN AKHIR PENELIT IAN DIPA 2014

Pe nggunaan Matriks Me mbran Amnion untuk Produksi Se l Punca Limbal (SPL) He wan Coba

Ketua Pelaksana : R a t i h R i n e n d y a p u t ri

P U S A T B I O M ED I S D A N TEK N O L O G I D A S A R K ES EH A TA N B A D A N P EN EL I TI A N D A N P EN G EM B A N G A N K ES EH A TA N K EM EN TR I A N K ES EH A TA N R I 2014

I.

JUDUL PENELITIAN

Penggunaan Matriks Membran Amnion untuk Produksi Sel Punca Limbal (SPL) Hewan Coba. 2. No.

SUSUNAN TIM PENELITI Nama

Keahl ian / Kesarjanaan

Keduduk an dal am Ti m

1.

Rat ih Rinendyaputri, M.Biomed

Ilmu Bio medik

Ket ua Pelaksana

2.

Dr. Lu t fah Rifati. Sp M

Do kt or d alam Ilmu Biomedik

Pen eliti 1

3.

Drh . Uly A lfi Nikmah, M Biomed

Do kt er hewan

Pen eliti 2

4.

A riy ani Noviantari, S. Si

Bio lo gi

Pen eliti 3

5.

d r. Fraiis Dany

Ked okteran

Pen eliti 4

6.

Nike Susanti, S. Si

Bio lo gi

Lit kay asa

7.

Pu rwanti, S.Si

Bio lo gi

Lit kay asa

8.

Dr. A u lia Yusuf, Ph.D

Ku lt ur dan karakterisasi jaringan

Pen eliti UI

9.

Pro f A rief Boediono

Ku lt ur dan rekayasa jaringan

Pen eliti IPB

10.

Ir. Bas ril

Ban k jaringan

Pen eliti Batan

11.

Fajar Lu kitowati, S.Si

Ban k Jaringan

Pen eliti Batan

12.

Drli. W ien Winarno

Do kt er Hewan

Pen eliti 5

13.

S it i Rah ayu

Pemb antu Administrasi

14.

A n ggie

Lit kay asa

3. SURAT KEPUTUSAN PENELITIAN

KEMENTERIAN KESEHATAN RI BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN Jl. Percetakan Negara No. 29 Jakarta 10560, Kolak Pos 1226 Telepon : (021) 4261088 Faksimile.: (021) 4243933 E-mail: [email protected]; Website : http://www.litbang.depkes.go.id

M EM UTUSKAN MENETAPKAN KESATU

KEDUA

KETIGA

KEEMFAT

1)

Membentuk Tim Pelaksana Penelitian Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan Tahun 2014 sebagaimana tercantum dalam lampiran keputusan ini; 2) Kepada Tim Pelaksana Penelitian pada Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan, Badan Litbang Kesehatan Tahun Anggaran 2014, dapat diberikan honorarium sebagaimana tersebut dalam lampiran 2 Keputusan ini; Tim Pelaksana Penelitian Tahun 2014 mempunyai tugas sebagai berikut: 1) Melaksanakan Penelitian pada Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan Tahun 2014, dengan susunan Tim seperti pada Lampiran Surat Keputusan ini; 2) Menyerahkan Laporan Kemajuan Penelitian, Laporan Pelaksanaan Penelitian dan Laporan Akhir Penelitian kepada Kepala Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan. Dalam melaksanakan tugasnya, Tim bertanggungjawab kepada Kepala Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan serta wajib menyampaikan laporan akhir penelitian sebagai pertanggungjiiwaban kegiatan; Biaya pelaksanaan kegiatan serta honor Tim Pelaksana Penelitian Tahun 2014 dibebankan pada anggaran DIPA Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan Tahun 2014; Keputusan ini mulai berlaku sejak bulan Januari sampai dengan

KELIMA

Desember 2014 dengan ketentuan apabila dikemudian hari ternyata terdapat kekeliruan dalam penetapan ini akan diadakan perbaikan dan perubahan sebagaimana mestinya.

Ditetapkan Pada tanggal

di

: Jakarta : 14 Februari 2014

Tembusan Yth: 1. Sekretaris Jenderal Kemenkes RI; 2. Inspektur Jenderal Kemenkes RI 3. Ketua Badan Pemeriksa Keuangan; 4. Kepala Badan Pengawasan Keuangan dan Pembangunan; 5. Kepala Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan; 6. Sekretaris Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan; 7. Kanwil Ditjen Anggaran Kemenkeu RI DKI Jakarta; 8. Para Kepala Pusat di Lingkungan Badan Litbang Kesehatan; 9. Kepala Bagian Tata Usaha Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan; 10. Kepala Bidang Biomedis, Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan; 11. Kepala Bidang Teknologi Dasar Kesehatan, Pusat Biomedis dan Teknologi' Dasar Kesehatan; 12. Bendaharawan Pengeluaran Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan; 13. Masing-masing yang bersangkutan untuk dilaksanakan.

KEMENTER1AN KESEHATAN RI BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN Jl. Percetakan Negara No. 29 Jakarta 10560, Kotak Pos 1226 Telepon : (021) 4261088 Faksimile.: (021) 4243933 E-mail: [email protected]; Website : http://www.litbang.depkes.go.id

Lampiran 1 Keputusan Kepala Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan Nomor : HK.02.03/1.2/974/2014 Tanggal :14 Februari 2014

SUSUNAN TIM PELAKSANA PENELITIAN TAHUN 2014

PENGGUNAAN MATRIKS UNTUK PRODUKSI DAN PROLIFERASI SELL PUNCA LIMBAL SAPI.

1

Ratlh Rlnendyaputri, M.Biomed

: Peneliti Pertama/Ketua Pelaksana

2

drh. Wien Winamo

: Peneliti Madya

3

dr. Lutfah Rlfati, Sp.M

: Peneliti Pertama

4

Artyani Noviantart, SSi

: Peneliti Pertama

5

drh. Ully Alfi Nikmah, M.Biomed

: Pembantu Peneliti

6

dr. Frans Dany

; Pembantu Peneliti

7

Nike Susanti, Ssi

: Pembantu Peneliti

8

Sukanto

: Pembantu Peneliti

9

Fajar Lukitowati. Ssi

: Pembantu Peneliti

10 Anggie

: Pembantu Peneliti

11

dr. H. Ahmad Aulia Yusuf. AHK.PhD

: Peneliti Daerah

12

Prof. Arief Boediono

: Peneliti Daerah

13 lr. Basril

: Peneliti Daerah

14

: Sekretariat Penelitian

Risma slnurat

KEMENTERIAN KESEHATAN RI BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN J1. Percetakan Negara No. 29 Jakarta 10560, Kotak Pos 1226 Telepon : (021) 4261088 Faksimile.: (021) 4243933 E-mail: [email protected]; Website : http://www.litbang.depkes.go.id

Lampiran 2 Keputusan Kepala Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan Nomor: HK.02.03/1.2/974/2014 Tanggal : 14 Februari 2014

Judul Pe ne litian : PENGGUNAAN M ATRIKS UNTUK PRODUKSI DAN PROLIFERASI SELL PUNCA LIM BAL SAPI. Jumlah Honor Tim Pelaksana Penelitian Tahun 2014

1.

Peneliti/Perekayasa Pertama : Jumlah honor yang diterima per- =Rp. 35.000 Jam, perminggu sebesar

2.

Pembantu Peneliti/Perekayasa Jumlah honor yang diterima per- =Rp. 20.000 Jam, perminggu sebesar

KEMENTERIAN KESEHATAN RI BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN Jalan Percct akan Negara No 29 Jakart a 10560 Ko t ak Po s 1226 Tel epon : (0 2 1 )4 2 6 1 0 8 « Fak s i mi l e (0 2 1 ) 4 2 4 3 9 3 3 Su rat Elekt ro n ik ; Ses b an @lit b an g ..d ep kes .g o .id Laman (Website) : h t t p :/ / www.lilb an g .d ep kes .g o .id

PERSETUJUAN ETIK (ETHICAL APPROVAL) Nomor: LB 02.01/5.2/Ke 248 /2014

Yang berlanda tangan di bawah mi, Ketua Komisi Etik Penelitian Kesehatan Badan Litbang Kesehatan, setelah dilaksanakan pembahasan dan penilaian, dengan ini memutuskan protokol penelitian yang berjudul

"Penggunaan Matriks Membran Amnion untuk Produksi Sel Punca Limbal (SPL) Hewan Coba”

yang mengikutsertakan hewan percobaan sebagai subyek penelitian, dengan Ketua Pelaksana I Peneliti Utama

Ratih Rinendyaputri, M.Biomed dapat disetujui pelaksanaannya Persetujuan ini berlaku sejak tanggal ditetapkan sampai dengan batas waktu pelaksanaan penelitian seperti tertera dalam protokol dengan masa berlaku maksimum selama 1 (satu) tahun Selama penelitian berlangsung, laporan kemajuan (setelah 50% penelitian terlaksana) harus diserahkan kepada KEPK-BPPK Pada akhir penelitian, laporan pelaksanaan penelitian harus diserahkan kepada KEPK-BPPK. Jika ada perubahan protokol dan / atau perpanjangan penelitian, harus mengajukan kembali permohonan kajian etik penelitian (amandemen protokol)

Ketua Komisi Etik Penelitian Kesehatan Badan Litbang Kesehatan.

Prof Dr M Sudomo

4. KATA PENG ANTAR Alhamdulillah, Segala puji hanya bagi Allah, Tuhan semesta alam yang telah melampahkan rahmat, nikmat, karunia dan ridhoNya sehingga penelitian ini dapat terlaksana dan terselesaikan. Saya menyadari penelitian ini dapat terselesaikan atas kerjasama tim yang telah bekerja cepat dan cerdas dalam pengambilan data eksperimental di laboratorium. Kesabaran masing-masing anggota tim untuk menumbuhkan serta merawat sel dalam sebuah cawan demi mendapatkan data yang tepat dan akurat merupakan pengorbanan yang tidak dapat tergantikan kecuali rasa syukur kami yang telah dapat memberikan kontribusi terhadap ilmu pengetahuan berupa hasil penelitian ilmiah. Saya ucapakan terimakasih kepada semua tim yang telah memberikan masukanmasukan dan pertimbangan yang bermanfaat untuk kelancaran pembuatan protokol sampai pada pelaksanaan penelitian. Saran reviewer dan anggota komisi etik sangat membantu dalam pelaksanaan serta penyempurnaan pembuatan proposal. Selain itu kekompakan tim anggota peneliti, litkayasa serta tim administrasi juga sangat membantu kelancaran proses pelaksanaan penelitian serta dalam pengambilan data penelitian baik di lapangan maupun di laboratorium. Saya sangat bersyukur mendapat kepercayaaan untuk menjadi salah satu ketua pelaksana dalam penelitian Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan (PBTDK), Balitbanges Kementerian Kesehatan dengan anggaran DIP A tahun 2014 ini. karena kesempatan ini tidak dapat diperoleh oleh semua peneliti di PBTDK. Penelitian ini dilakukan dengan melakukan kerjasama dengan institusi lain dengan tema penelitian yang belum pernah dilakukan sebelumnya. Semua proses awal hingga akhir penelitian ini memberikan banyak ilmu yang bermanfaat bagi saya khususnya, dan tim sehingga dapat menjadi bekal kami baik dalam menjadi ketua pelaksana maupun bekal sebagai peneliti untuk melaksanakan penelitian yang masih menunggu, untuk mengoptimalkan hasil penelitian sehingga manfaatnya dapat digunakan oleh masyarakat luas. Kami berharap hasil penelitian ini dapat bermanfaat untuk kemajuan ilmu pengetahuan khususnya transplantasi stem cell untuk terapi regenerasi pada mata.

3

Akhirnya kepada semua pihak yang telah membantu penyelesaian penelitian ini dengan setulus hati saya sampaikan terimakasih dan penghargaan vang tinggi. Semoga Allah SWT membalas semua kebaikan dan ketulusan Bapak dan Ibu dengan pahala yang berlipat ganda. Amin

Jakarta, Desember 2014

Ratih Rinendyaputri

4

2. RING KASAN EKSEKUTIF

RAT1H RINENDYAPUTRI. Penggunaan Matriks Membran Amnion untuk Produksi Sel Punca Limbal (SPL) Hewan Coba.

Pemanfaatan stem cell untuk terapi penyakit degeneratif dalam ophthalmologi telah dilakukan, seperti pada pasien dengan defisiensi sel punca limbal (stem cell limbal deftciencyISCLD). Namun ketersediaan sel punca limbal (SPL) sangat terbatas karena jumlah donor SPL yang sangat kurang dibandingkan dengan kebutuhan. Untuk mengatasi hal tersebut maka dilakukan produksi SPL secara in vitro sehingga kebutuhan dapat terpenuhi. Keberhasilan produksi SPL secara in vitro sangat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan seperti komposisi medium, lingkungan, pH dan penggunaan matriks ekstraseluler. Penggunaan matriks ekstraseluler dalam kultur SPL selain dapat meningkatkan proliferasi juga dapat mempermudah dalam proses aplikasi transplantasi. Oleh sebab itu perlu dilakukan penelitian dalam penggunaan matriks untuk produksi SPL secara in vitro. Tujuan penelitian ini adalah mendapatkan matriks ekstraseluler yang optimal untuk memproduksi SPL secara in vitro. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental berbasis laboratorium menggunakan SPL tikus yang dikultur secara eksplan menggunakan matriks membran amnion dan fibronectin (FN). Setelah dikultur SPL dikarakterisasi menggunakan metode PCR. Membran amnion yang digunakan dalam penelitian ini merupakan produksi bank jaringan di BATAN. Sel punca limba (SPL) diisolasi dan dikultur di Laboratorium Stem Cell. Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan, Badan Litbangkes. Untuk karakterisasi dilakukan di Dept. Histologi FKUI pada bulan Maret November 2014. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa SPL dapat dikembangkan secara in vitro baik pada cawan petri dengan membran amnion dan fibronectin sebagai matriks ekstraseluler. Keberhasilan kultur pada membran amnion sebagai matrik ekstraseluler diharapkan dapat mempermudah penggunaan terapi transplantasi menggunakan SPL pada kerusakan kornea.

5

6. ABSTRAK Ketersediaan sel punca limbal (SPL) sangat terbatas mengingat jumlah donor SPL yang sangat kurang dibandingkan dengan kebutuhan, untuk mengatasi hal tersebut maka perlu dilakukan produksi SPL secara in vitro. Keberhasilan kultur in vitro pada SPL sangat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan, salah satunya adalah penggunaan matriks ekstraseluler. Pemilihan jenis matriks yang tepat dalam kultur SPL, selain dapat meningkatkan proliferasi juga dapat mempermudah dalam aplikasi transplantasi. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan matriks ekstraseluler yang optimal untuk memproduksi SPL secara in vitro. Penelitian dilakukan di Laboratorium stem cell Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan Badan Litbangkes. Penelitian ini dilakukan dengan melakukan kultur SPL tikus menggunakan metode eksplan. Selanjutnya dilakukan kultur SPL secara in vitro pada cawan petri dengan membran amnion dan fibronectin (FN). Tingkat proliferasi SPL pada kedua cawan dianalisis dengan menghitung population doubling (PD) dan population doubling time (PDT). Karakterisasi SPL dilakukan dengan melihat ekspresi gen CD90, p63, ABCG2 dan Krtl2 sebagai marker SPL. Hasil penelitian menunjukkan bahwa PD dan PDT pada SPL yang mengunakan dan tanpa FN secara berturut-turut adalah 2.15,2.23 dan 59.26 dan 56.89. Sedangkan ekspresi gen CD90, p63, ABCG2 dan Krtl2 SPL pada penggunaan dan tanpa FN masing-masing adalah 17.70, 19.75, 17.08, 18.42 dan 15.23, 19.09, 17.42, 18.85. Pada penelitian ini membran amnion dan fibronectin dapat digunakan sebagai matriks ekstraseluler pada kultur in vitro SPL. Kata kunci : sel punca limbal, membran amnion, fibronektin ABSTRAC Availability of stem cells limbus (SCL) is very limited considering the number of donors SCL very less as compared to the needs, so it is necessary SCL production in vitro. The success of in vitro culture of SCL is strongly influenced by environmental conditions, one of which is the use of the extracellular matrix. Selection of the appropriate type of matrix in the SCL culture, can increase proliferation and facilitate the application of transplantation. This study aimed to obtain the optimal extracellular matrix to produce SCL. Research conducted at the Center for Biomedical and Basic Technology of Health. This research was conducted with cultured SCL rat using explants. Furthermore, the SPL in vitro culture in a petri dish with amniotic membrane and fibronectin (FN). SCL proliferation rate in were analyzed by calculating population doublings (PD) and the population doubling time (PDT). Characterization of SCL done by looking at the expression of CD90, p63 ,ABCG2 and Krt 12 as a marker gene. The results showed that the PD and PDT in SCL use and without FN respectively are 2.15 , 2.23 and 59.26 and 56.89. While the expression gene of CD90 , p63 , ABCG2 and Krt 12 SPL on the use and without FN respectively 17.70 , 19.75 , 17.08 , 18.42 and 15..3 , 19.09 , 17.42 , 18.85. In this study, amniotic membrane and fibronectin can be used as an extracellular matrix to produce SCL. Key word : stem cell limbus, amnion membrane, fibronectin

6

7. DAFTAR ISI

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. a. b. c. d.

e. f. g. h. i.

JUDUL PENELITIAN ............................................................................... SUSUNAN TIM PENELITI ....................................................................... SURAT KEPUTUSAN PENELITIAN Nomor HK.02.03/I.2/974/2014 PERSETUJUAN ETIK Nomor : LB.2.0I/5.2/KE248/2014 KATA PENGANTAR ................................................................................ RINGKASAN EKSEKUTIF ....................................................................... ABSTRAK ................................................................................................ DAFTAR ISI ............................................................................................. DAFTAR TABEL/GAMBAR ..................................................................... ISI LAPORAN PENELITIAN Pendahuluan ............................................ ................................................ Rumusan Masalah .......... ....................................................... ................. Tujuan ..................................................................................................... Manfaat .................................................................................................... Metode ..................................................................................................... Kerangka Konsep ..................................................................................... Alur Kerja ............................................................................................... Tempat dan Waktu Penelitian................................................................... Desain dan Jenis Penelitian ..................................................................... Populasi dan Sampel ................................................................................ Cara Pengamblan Sampel ........................................................................ Kriteria inklusi dan eksklusi .................................................................... Variabel ................................................................................................... Definisi Operasional ............................................................................... Cara Pengumpulan Data ................... ....................................................... Bahan dan Cara Kerja .............................................................................. Hasil ........................................................................................................ Pembahasan .............................................................................................. KesimpulandanSaran ............ .................................................. ................. Ucapan Terimakasih ............................................................... ................ Daftar Kepustakaan...................................................................................

2

3 5 6

7 8

9 11 11 11 12 12 13 13 13 13 13 14 14 14 14 15 18 25 27 27 28

7

8.

DAFTAR TABEL/G AMBAR Tabel I. PD dan PDT sel punca limbal ................................................... 20 Tabel 2. Ekspresi relatif SPL dibandingkan dengan

kelompokkontrol 24

Tabel 3. Ekspresi gen berdasarkan A CT ................................................ 24 Gambar 1. Kerangka Konsep.................................................................. 12 Gambar 2. Alur Kerja ............................................................................ 13 Gambar 3. Metode eksplan kultur SPL................................................... 18 Gambar 4. Kultur SPL pada membran amnion ........................................ 19 Gambar 5. Kultur SPL pada fibronectin ................................................. 19 Gambar 6. Produk bank jaringan BATAN ............................................... 20 Gambar 7. CFU dari SPL menggunakan kristal violet............................. 21 Gambar 8. Diferensiasi dan karakterisasi SPL ....................................... 22 Gambar 9. Karakterisasi menggunakan Alizarin ..................................... 23 Gambar 10. Induksi osteosit dan kondrosit pada sel punca limbal

23

(SPL) tikus pasca simpan beku (vitrifikasi) .... ......................................

8

A. Pe ndahuluan Pemanfaatan stem cell (sel punca) untuk terapi penyakit regeneratif telah diaplikasikan untuk beberapa kondisi klinis yang tidak dapat diterapi menggunakan pengobatan konvensional. Kemampuan sel punca untuk berdiferensiasi menjadi berbagai tipe sel [plasticity) dan berploriferasi dalam jangka waktu yang lama (selfrenewal) sangat berpotensi untuk melakukan regenerasi pada kerusakan jaringan maupun organ. 1 Setiap organ mempunyai sel punca dewasa yang bersifat unipoten dan dapat meregenerasi jaringan dan organ tersebut. Sel punca dewasa dapat berdiferensiasi sesuai dengan kondisi lingkungan sekitarnya. Seperti pada organ mata yang permukaannya dikelilingi oleh sel epitelial konjungtiva dan kornea. Jika terjadi kerusakan pada jaringan komea maka sel punca limbal (SPL) akan berdiferensiasi menjadi sel epitel komea sehingga jaringan komea kembali normal. 2 . 3 Kerusakan pada jaringan yang masih memiliki sel punca dewasa masih sangat memungkinkan terjadi regenerasi secara alami. Namun pada kerusakan kronis dapat mengakibatkan sel punca dewasa pada jaringan mengalami kerusakan sehingga mengganggu proses regenerasi jaringan Pada kerusakan SPL dapat menyebabkan regenerasi komea terganggu. Hal inilah yang mengakibatkan kebutaan mengingat fungsi komea yang sangat penting yaitu sebagai penerima cahaya. Kerusakan komea dapat terjadi akibat beberapa penyakit seperti pada Stevens-Johnson Syndrome (SJS), diferensisi SPL parsial/total, trauma kimiawi(basa/asam nukleat) atau trauma kronis akibat penggunaan lensa kontak . 2 . 3 Transplantasi SPL merupakan terapi sel punca untuk kerusakan SPL, namun ketersediaan donor SPL masih sangat terbatas. Oleh sebab itu produksi SPL secara in vitro terus dilakukan untuk menjamin ketersediaan SPL . 1 Untuk melakukan produksi SPL ada beberapa faktor yang harus diperhatikan mengingat SPL mempunyai rentang hidup yang lama dan siklus sel yang lama . 5 Sehingga dalam melakukan produksi SPL secara in vitro dibutuhkan lingkungan yang mendukung proliferasi SPL. Menurut Shimazaki et al. (2002) komponen matriks ekstraseluler, asosiasi molekul-molekul membran sel serta sitokini untuk komunikasi antar sel sangat berpengaruh untuk proliferasi sel secara in vitro.

9

Matriks ekstraseluler merupakan scalfold yang berfungsi sebagai tempat melekatnya sel sehingga sel mampu membelah. Penggunaan matriks tidak hanya penting untuk pertumbuhan sel dalam kultur SPL namun juga untuk keamanan dalam penggunaan terapi klinis seperti transplantasi. Untuk memproduksi SPL ada beberapa scalfold yang dapat digunakan seperti gel. gelatin, serta membran amnion 4 - 6 Membran amnion merupakan matriks yang sering digunakan karena merupakan biomartnks ekstraseluler yang dapat menghambat inflamasi, memiliki kemiripan struktur dengan matriks pada basal konjungtiva dan dapat diabsorbsi secara bertahap sehingga aman untuk transplantasi. 7 Menurut Shimazuki et al. (2002) penggunaan amnion membran pada allograf tidak menimbulkan penolakan imun resipien Metode isolasi SPL sebelum dilakukan kultur, merupakan faktor yang penting menurut Sudha et al. (2006) melaporkan bahwa metode enzimatik maupun eksplan dapat digunakan dalam produksi SPL. 4 Keduanya memiliki kekurangan dan kelebihan namun viabilitas dan jumlah sel yang dihasilkan tidak berbeda, namun pada tingkat proliferasi pada metode enzimatik lebih tinggi sehingga tingkat konfluensi lebih cepat. Hal ini disebabkan karena pada enzimatik sel yang ditanam merupakan suspensi sel sehingga pertumbuhan dapat menyebar keseluruh permukaan cawan. Penelitian mengenai penggunaan matriks ekstraseluler untuk produksi SPL secara in vitro terus dilakukan untuk mendapatkan metode dalam memproduksi SPL yang efektif. Mengingat pentingnya ketersediaan jaringan SPL untuk berbagai kasus degeneratif pada mata khususnya, kerusakan SPL dan setiap jenis sel membutuhkan matriks ekstraseluler yang berbeda-beda. Oleh sebab itu perlu dilakukan penelitian untuk proliferasi SPL pada matriks ekstraseluler. Penelitian ini bertujuan untuk memproduksi SPL secara in vitro menggunakan membran amnion sebagai matriks ekstraseluler serta fibronectin (FN) sebagai attachment factor.

10

1.2 Rumus an M as alah

Ketersediaan donor SPL yang menjadi kendala dalam terapi SPL sehingga perlu dilakukan kultur secara in vitro untuk produksi SPL. Matriks ekstraseluler diharapkan dapat meningkatkan proliferasi serta mempermudah transplantasi SPL. Untuk itu perlu dilakukan penelitian dalam memproduksi SPL secara in vitro menggunakan amnion membran dan fibronectin (FN) sebagai matriks ekstraseluler. B.

Tujuan Penel i ti an

Tujuan Umum : Mendapatkan matriks ekstraseluler yang optimal untuk memproduksi SPL secara in vitro. Tujuan Khusus: 1. Melakukan kultur sel punca limbal (SPL) dengan metode eksplan menggunakan dan tanpa fibronectin (FN) 2. Mendapatkan population doubling (PD) dan population doubling time (PDT) yang telah dikultur menggunakan dan tanpa fibronectin (FN). 3. Mendapatkan karakterisasi SPL yang telah di kultur menggunakan dan tanpa fibronectin (FN). 4. Melakukan seeding SPL pada membran amnion dengan dan tanpa fibronectin (FN). C.

Manfaat Penel i ti an Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi dalam memproduksi

jaringan sel punca limbal secara in vitro untuk teknologi tissue engineering pada terapi transplantasi mata.

11

D. M e tode Pe ne litian

Gamb ar I Potensi sel p unca d apat digunakan untuk t erapi regenerasi b eberapa t ipr sel salah satunya adalah t erapi p ada kerusakan epitel komea. Sel punca limba (SPL) merupakan sel punca yang memp u nyai sifat unipoten menjadi sel epitel komea, sehingga SPL mempunyai potensi untuk t erapi p ada kerusakan ko mea dengan melakukan transplantasi SPL. Sel Punca limbah SPL y ang d igunakan d apat diperoleh dari donor atau kultur SPL secara in vitro. Yan g p erlu d ip erhatikan p ada produksi SPL secara in vitro ad alah kondisi lingkunganseperti metode is o lasi, komposisi medium d an p enggunaan matriks ekstraseluler.

12

Al ur Kerja

Gambar 2 . Mel akukan isolasi dan kultur SPL secara in vitro s erta melakukan karakterisasi SPL yang tel ali di kultur pada membran amnion menggunakan metode imunohistokimia.

Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Stem Cell, Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan, Badan Litbangkes, Kementerian Kesehatan Republik Indonesia dan Dept. Histologi FK U1 pada bulan Maret-November 2014, Desai n dan Jenis penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental berbasis laboratorium. Popul asi dan Sampel Populasi : Mata dan tikus Swiss Webster. Sampel : SPL yang berhasil dikultur. Besar sampel, cara pemilihan atau pengambilan sampel a. besar sampel: t = perlakuan (metode kultur SPL +/- FN) = 2 n = jumlah pengulangan

13

t(n-l)>15 ---------- ► n = 8,5 (10) b. Cara pengambilan Sesuai kriteria inklusi dan eksklusi Kri teria i nklusi dan eksklusi Kriteria inklusi: 1. Mata tikus yang masih segar. 2. Sel punca limba yang berhasil dikultur. Kriteria eksklusi: 1. Mata tikus yang sudah keruh pada bagian komea. 2. Sel punca limbal yang telah dikultur namun mengalami kontaminasi. Vari abel Variabel dalam penelitian ini adalah fibronectin, membran amnion dan SPL. Defi nisi Operasional Sel punca limbal : sel punca yang akan berdiferensiasi menjadi sel epitel komea. Karakterisasi sel punca limbal (SPL) : identifikasi menggunakan marker positif sel punca limbus yaitu ABCG2, p63 dan K3/K12. Fibronectin (FN): merupakan attachment factor pada kultur SPL secara in vitro Kelompok kontrol : kultur SPL tanpa FN Kelompok perlakuan : kultur SPL dengan FN (+FN) Population doubling (PD): kemampuan sel untuk menggandakan jumlah sel Population doubling time (PDT) : waktu yang dibutuhkan untuk menggandakan jumlah sel Ekspresi relatif: ekspresi suatu gen target pada suatu sampel atau SPL A CT (cycle tresholcl): waktu yang dibutuhkan untuk untuk amplifikasi Cara Pengumpul an Data Pengumpulan data dilakukan dengan melakukan pengamatan mikroskopis selama kultur dan karakterisasi ekspresi gen ABCG2, p63 dan K3/K12 menggunakan rtPCR.

14

Bahan dan Cara Kerja Bahan dan Al at 1. Medium yang digunakan : -

Medium kultur MEM low glucose (Sigma, M0894)

-

HAM 12 (Gibco,21700-075)

-

PBS (Gibco, 12800-017)

-

FBS (Biowest)

-

Penstrep (Sigma)

-

ITS (Sigma, 13146)

-

EGF (Sigma)

-

Hidrocortison (Sigma)

-

Kit ekstraksi RNA (Qiagen)

-

Enzim/ kil untuk cDNA (ProtoScript, First Strand E6300L)

-

Kit rtPCR (Kapa Biosystem 2 step)

-

Kit rtPCR 1 step (AB, CA94404)

2. Alat yang diperlukan : -

Gunting

-

Pinset

-

Scalpel

-

Petridish atau 4,6 dan 24-well plate

-

Fintip 10-1000 mikroliter

-

Pipet volume

-

TC Flask 25

Cara Kerja Isol asi Sel Punca l imbal Sel punca limba (SPL) yang digunakan dalam penelitian ini merupakan SPL tikus strain Wistar jantan atau betina dengan umur 3-4 bulan. Tikus dipelihara dalam kandang akawat dengan pemberian pakan dan minum secara adlibitum. Tikus yang diambil organ mata diterminasi dengan melakukan anasthesi dengan menggunakan xylasine dosis 0,05mg/kg B B dan ketamin dengan dosis 11 mg/kg BB kemudian dilakukan disloca/io cervicalis. Organ mata dibawa ke laboratorium menggunakan medium transport (posphat buffer saline/PBS yang

15

mengandung I % penstrep). Isolasi SPL dilakukan di laboratorium dalam Biosafety Cabinet /BSC II. Organ mata dimasukkan kedalam iodine 1% selama 2 menit kemudian dilakukan isolasi SPL dengan menginisiasi bagian konjungtiva melingkar kornea terlebih dahulu. Setelah itu dilakukan isolasi SPL yang terdapat diperbatasan antara konjungtiva dan kornea.

4

Tikus yang sudah diambil organ matanya dimasukkan ke

dalam insenerator. Penanganan hewan coba dilakukan oleh dokter hewan yang terlibat dalam penelitian di laboratorium hewan coba Pusat Biomedi dan Teknologi dasar Kesehatan (PBTDK), Balitbangkes. Sel punca limbal yang diperoleh dicacah menggunakan gunting kemudian dicuci dalam PBS 1% penstrep sebelum dikultur. Sel punca limbal yang telah dipotong kecil dikultur dengan dieksplan pada plate dengan 4 well menggunakan medium kultur. Kul tur Sel Punca Li mbal Kultur sel punca limbal dilakukan dengan metode yang dikerjakan oleh Burman dan Sangwan (2000) : dan Krishnan et a/. (2010) 1 1 dengan sedikit modifikasi. Medium kultur yang digunakan medium a-MEM/F!2 dengan 10% FBS, dan suplementasi pensterp 1% ITS (insulin 0,1 mg, transferin 55)ig/ml, selenium 5 ng/l), EGF/epidermal growth factor (0,01 mg/l), hidrocortisone 0,1 mg/ml) pada suhu 37 ll C, 5% C02. Penggantian medium kultur dilakukan setiap 2-3 hari kultur, setelah 13-15 hari kultur dilakukan passase. Pada saat apssase dilakukan perhitungan sel dan penanaman kembali pada cawan yang baru. Karakteri sasi Sel Punca Li mbal Tahap ini diawali dengan tahapan isolasi material genetik berupa RNA (Ribonucleid Acicf), hal ini bertujuan untuk melihat ekspresi gen CD90, p63, Krt/12 dan ABCG2 pada sampel. Sampel yang dilakukan isolasi RNA adalah Sel punca limbal yang telah dikultur selama 7 hari dengan menggunakan dan tanpa Fibronectin. Proses isolasi RNA dilakukan dengan menggunakan manual kit (Qiagen, #52906). Hasil isolasi RNA dilanjutkan dengan uji kualitas menggunakan spektrofotometri yaitu menggunakan Nanodrop 1 M , hal ini bertujuan untuk evaluasi hasil isolasi baik konsentrasi maupun kemurniannya. Pengujian kemurnian RNA total dilakukan dengan membandingkan nilai A260 dan A280. Rasio A260/A280 yang baik adalah 1.88-2.00 artinya RNA hasil isolasi bebas dari

16

kontaminasi protein. Hasil spektrofotometri yang positif dilanjutkan dengan proses amplifikasi. Amplifikasi material genetik RNA dilakukan 2 tahap yaitu 1) pengubahan RNA menjadi cDNA atau RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) menggunakan kit (Invitrogen, 12574-026) dan 2) amplifikasi cDNA menggunakan realtime PCR dengan SYBR Green PCR Master Mix (AB, #4385610). Tahap pertama dilakukan denaturasi RNA pada suhu 70°C selama 5 menit, kemudian tahap kedua adalah sintesis komplementari DNA (cDNA) dengan inkubasi pada suhu 25"C selama 5 menit, 42°C selama 60 menit dan 80°C selama 5 menit. Tahap terakhir tambahkan 50nl NFW. Amplifikasi cDNA menggunakan mesin Applied Biosystem 7500 fast Realtime PCR system (AB 7500 realtime PCR) dengan tahapan aktifasi enzim 95“C selama 3 menit, denaturasi 95°C selama 1-3 detik dan aneling/ektensi 60”C selama 20 detik (40 cycle). PCR dilakukan dengan primer spesifik gen CD90, p63, Krt/12 dan ABCG2. Primer yang digunakan primer spesfik yang di desing dan telah dibuktikan dengan pengecekan BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) pada gene bank (www.ncbi.nlm.nih.gov) sehingga diharapkan hasil amplifikasi mumi gen-gen tersebut. Metode threshold cycle digunakan untuk menganalisa ekspresi gen, selain itu sistem mesin telah dilengkapi dengan kalibrator dye ROX sebagai internal quality kontrol pada setiap reaksi serta 18SS sebagai housekeeping gene. Pengol ahan dan Anal i si s Data Data dan penelitian ini akan dianalisis secara deskriptif dan data kuantitatif dianalisis menggunakan SPSS.

17

E. H a s i l Pada pengamatan mikroskopis, sel punca limbal dapat tumbuh di sekitar eksplan dari jaringan yang dikultur secara in vitro setelah hari ke 2 kultur (Gambar 3). Morfologi sel yang tumbuh masih beragam dengan bentuk heksagonal dan fibroblastik. Hasil eksplan limbus pada penggunaan dan tanpa fibronectin sebagai matriks ekstraseluler menunjukkan adanya proliferasi sel punca limbal. Hal ini secara mikroskopis dapat diamati dengan adanya migrasi sel punca limbus disekitar eksplan pada kedua perlakuan.

Gamb ar 3. Metode ekpian pada kultur sel punca limbal (SPL) t ikus. Kultur menggunakan (A) dan t anpa fibronectin (FN) (B).

Kultur dan pasase SPL secara in vitro dapat dilakukan 4 sampai dengan 5 kali untuk memperoleh jumlah sel yang cukup untuk siap dilakukan transpalantasi. Untuk mempermudah transplantsi maka SPL dapat ditanam pada matriks ekstraseluler seperti membran amnion. Pada penelitian ini membran amnion diperoleh dari Bank Jaringan BATAN (Gambar 4). SPL mampu tumbuh pada membran amnion yang telah dicoating maupun tidak dengan fibronektin Hal ini ditunjukan dengan adanya perubahan morfologi sel punca limbal di atas permukaan membran amnion.

18

Gamb ar 4. Kultur sel p unca limb al (SPL) t ikus menggunakan membran amnion dengan (C dan D) dan t anpa (Ad an B) FN. Ku lt u r hari ke 3 (A d an C) d an hari ke 7 (B d an D).

Kultur dan ekspansi SPL pada cawan dengan dan tanpa ftbronectin menunjukkan pertumbuhan sel yang sama secara morfologi (Gambar 5).

Gamb ar 5. Kultur sel p unca limb al (SPL) hari ke 5 p aska p asase dengan (+/-) fibronectin (FN sebagai attachment factor.

Membran amnion dan perikardium merupakan salah satu jaringan yang dapat digunakan untuk membuat scalfold atau sebagai matriks ekstrseluler. Pemilihan matriks harus disesuaikan dengan kebutuhan dan sifat matriks itu sendiri. Membran amnion merupakan membran tipis yang lebih fleksibel untuk digunakan untuk ditransplankan pada organ mata. Jaringan tersebut dapat diperoleh dari BATAN (Gambar 6). 19

Gamb ar 6, Produk Bank jaringan berupa membran amnion (A) dan p erikardium (B).

Tabel 1. PD dan PDT limbal tikus pasase 2 yang dikultur secara

in vitro

PD

PDI (jam)

PD/hari

Kontrol

2,23

Perlakuan (+FN)

2,15

56,89 59,26

0,45 0,43

Tingkat proliferasi sel punca limbal tikus secara in vitro pasase ke 2 pada penggunaan fibronectin (FN) memiliki population doubling (PD) dan population doubling time (PDT) yang sama (Tabel 1).

Kemampuan sel punca limbal untuk berproliferasi dapat diamati dengan menghitung pembentukan koloni sel dengan jumlah sel > 50 setelah dilakukan

20

kultur selama 14 hari. Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop inverted setelah sel diwarnai menggunakan kristal violet (Gambar 7).

Gamb ar 7. Gamb aran s ecara makro p emb en t u kan ko lo n i p ad a s el p u n ca limb al {colony’formingunil/CFU) pada seeding 100 s el/ well d an 1000 s el/ wll mas in g -mas in g ad alah 7,66% d an 7.46%.

Pada kultur SPL secara in vitro, populasi sel yang tumbuh sangat beragam. Sel punca mesenkim merupakan salah satu sel punca yang mampu berproliferasi dan tumbuh dalam kultur SPL. Multipotensi sel punca mesenkim pada kultur tersebut dapat ditunjukkan dengan kemampuan sel untuk berdiferensiasi menjadi sel osteosit, kondrosit dan lipid setelah mengalami kultur dan pasase berulang (Gambar 8 ).

Gamb ar 8. Karakterisasi sel punca limb al seielah diinduksi memperlihatkan sifat mullipotensi d engan menunjukkan d iferensiasi ke arah osteosit pada (A) sebelum p ewarnaan alizarin dan sesudah p ewarnaan (D}. Pada kontrol sel tidak menunjukkan adanya deposit min eralisasi (B d an C). Sel punca limb al ju ga dapat b erdiferensiasi menjadi sel kondrosit dengan p ewarnaan A loan Blue (E) d an menjadi s el lema! dengan menunjukkan adanya deposit t emak dengan p ewarnaan Oil Red O (F).

Sel punca limbal memiliki populasi sel yang bersifat multipoten, sehingga ketika dikultur pada medium tertentu maka sel akan mengarah menjadi sel yang sesuai dengan lingkungannya. Pada kultur dengan medium induksi osteosit maka sel punca limbal akan berdiferensiasi menjadi osteosit dan menunjukkan wama merah pada deposit-deposit mineral setelah dilakukan pewarnaan Alizarin (Gambar 9).

22

Kontrol

Gamb ar 9. Sel p unca limbal setelah mengalami induksi akan berdiferensiasi menjadi osteosit, p ewarnaan Alizarin d ilakukan selelah 14 h ari dikultur dengan medium induksi.

Sel punca limba! setelah disimpan beku dengan metode vitrifikasi masih mampu berproliferasi dan berdiferensiasi menjadi sel osteosit dan kondrosit. Diferensiasi osteosit ditunjukkan dengan adanya deposit mineral seperti kalsium pada sel, sedangkan pada sel kondrosit terbentuk nodul-nodul setelah mengalami kultur lebih dari 7 hari (Gambar 10).

Gamb ar 10. Induksi osteosit d an kondrosit pada sel punca limb al (SPL) tikus pasca simpan beku (vitrifikasi). Setelah s imp an beku sel masih mampu berproliferasi dan berdiferensiasi menjadi sel osteosit dengan p ewarnaan A lizarin (A) d an berdiferensiasi menjadi kondrosit ( B ) .

23

Tabel 2. Ekspresi Relatif Sel Punca Limbal (SPL) dibandingkan kelompok kontrol G en Krt 12

G en ABCG 2

Pasase I

0,414

0,448

Pasase 2

4,412

3,572

Pada pasase ke 2 kultur SPL yang dikultur menggunkan fibronectin menunjukkan ekspresi relatif gen Krt 12 dan ABCG2 empat dan tiga kali lebih besar dibandingkan dengan kontrol namun pada p63 dan CD90 menunjukkan ekspresi relatif yang sama (Tabel2).

Tabel 3. Ekspresi gen berdasarkan A CT pada kelompok kontrol dan perlakukan Krt 12

ABCG 2

p63

CD90

Kontrol

18,85

17,42*

19,09

15,23*

Perlakuan {+ FN)

18,42

17,08

19,75

17,70

* p < 0,05

Ekspresi masing-masing gen pada SPL yang dikultur menggunakan fibronectin (FN) sebagai attachment factor tidak menunjukkan perbedaan dengan kultur tanpa FN (kontrol). Namun ekspresi gen ABCG2 dan CD90 pada kontrol menunjukkan ekspresi yang lebih rendah dibandingkan ekspresi gen Krt 12 (p<0,05) (Tabel 3).

24

F. Pembahasan Kul tur sel punca l i mbal (SPL) ti kus Produksi sel punca limbal dapat dilakukan dengan melakukan kultur pada bagian limbus menggunakan metode eksplan maupun enzimatik . 4 Kultur limbus pada penelitian ini dilakukan dengan metode eksplan dan menunjukkan pertumbuhan serta proliferasi sel pada pengamatan hari ke 3 kultur baik pada cawan yang menggunakan matriks maupun yang tidak menggunakan fibronectin sebagai matriks ekstraseluler (Gambar 3.4 dan 5), Proliferasi dan diferensiasi sel punca limbal atau sel progenitor sangat tergantung kondisi kultur, beberapa hal yang mempengaruhi tingkat proliferasi dan diferensiasi dari sel punca adalah jenis serta komposisi medium kultur. Penggunaan serum serta faktor pertumbuhan yang tepat dan dengan konsentrasi yang optimal mampu meningkatkan proliferasi sel yang dikultur secara in vitro 6 Pada penelitian ini membran amnion diperoleh dari BATAN yang memproduksi membran amnion dan perikardium menjadi produk bank jaringan yang dapat dimanfaatkan sebagai matriks ekstraseluler (Gambar 6 ). Membran amnion telah digunakan pada transplantasi penyakit degeneratif mata seperti pada kasus defisiensi komea serta pengobatan luka membran amnion merupakan biomaterial yang mneujang perbaikaan penyembuhan luka pada kulit pada saat digunakan terapi menggunakan sel punca mesenkim dari tali pusat . 8 ' 9 ' 10 Menurut Meyer-Blazejweska et al. (2010) penambahan fibrin sebagai matriks ekstraseluler, penggunaan medium DMEM/FI2 dan 10% serum, faktor pertumbuhan EGF dengan konsentrasi 5 ng/ml atau kombinasi faktor pertumbuhan (3-NGF dan EGF pada ekspansi sel punca limbal secara in vitro!' Pada penelitian ini kultur sel punca limbal menggunakan fibronectin sebagai matriks ekstraseluler, medium kultur 10% FBS dalam medium MEM/F12 serta penambahan protein sebagai faktor pertumbuhan seperti insulin, EGF dan hidrocortison. Penambahan protein diharapkan dapat meningkat afinitas resptor TrkA sehingga proses proliferasi, diferensiasi serta migrasi pada sel punca limbal meningkat. 1 " Selain itu penambahan mineral seperti transferin dan selenium juga dapat meningkatkan proliferasi serta diferensiasi sel punca limbal.

25

Penambahan fibronectin dalam kultur SPL dapat

digunakan sebelum

transplantasi SPL menggunakan membran amnion. Fibronectin selain dapat berfungsi sebagai attachment factor juga dapat meningkatkan migrasi sel serta berpotensi memicu pertumbuhan sel . 13 , 14 Hal ini akan sangat membantu dalam penyembuhan pada penyakit degeneratif mata. Tingkat proliferasi dapat ditunjukkan dengan pembentukan koloni (CFU) serta PD dan PDT sel (Tabel 1 dan Gambar 7). Pada penelitian ini CFU sel punca limbal menunjukka angka yang lebih rendah dibandingkan MSC dari sumsum tulang tikus yang dilaporkan oleh Tawonsawatruk et al. (2012).

13

Perbedaan ini dapat

disebabkan oleh perbedaan sumber, perbedaan jumlah sel awal pada saat kultur, medium serta lingkungan kultur yang digunakan. Kemampuan di ferensiasi sel punca l i mbal ti kus Ekspresi p63 pada sel punca limbal (SPL) menunjukkan kemampuan multipotensi SPL seperti multipotensi mecenchymal stem cell (MSC). Gen p63 dapat menyebabkan epithelial-mesenchymal transition (EMT) sehingga memiliki kemampuan yang sama dengan MSC. b Secara molekuler karakter MSC harus mengekspresikan CD 105, CD90, CD73 positif serta mampu berdiferensiasi menjadi sel osteosit, kondrosit serta sel lemak. 16 ' 7 Pada penelitian ini SPL yang dapat terisolasi menggunakan metode eksplan mampu mengalami diferensiasi seperti MSC (Gambar 8 dan 9) serta mengekspresikan gen p63 dan CD90 yang tinggi (Tabel 3). Hal ini senada dengan penelitian yang dilakukan oleh Bray et al 2012., MSC dapat diperoleh dari kultur limbus manusia yang dikultur dengan penambahkan growth factor tertentu seperti 10% FBS, standard serum-free medium yang ditambahkan suplemen seperti B-27, epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor 2 (FGF)."' Karakterisasi MSC yang diperoleh dari kultur limbal juga menunjukkan hasil positif pada pemeriksaan menggunakan flow cytometry (pada CD73, CD90, CD105, CD141 dan CD271) selain itu positif juga terhadap differentiation assays (osteogenesis, adipogenesis and chrondrogenesis). Penggunaan medium dengan FBS menunjukkan 70-80% sedangkan menggunakan MesenCult-XF mencapai > 95% CD34(-) CD45(-) CD90 (+) CD73 (+) CD105 (+). MSC yang diperoleh dari limbus (L-MSC) mensuport pertumbuhan sel-sel epithelial limbus hal ini ditunjukkan dengan

26

tingginya ekspresi p63 yang merupakan marker progenitor sel dan marker cytokeratin 3 sebagai penanda diferensiasi kornea . 17 ' 19 Pada produksi SPL secara in vitro proses kultur dan pasase dapat memicu diferensiasi spontan. Untuk mengurangi potensi diferensiasi tersebut dapat dilakukan simpan beku pada SPL yang telah mencapai pasase 4 atau 5. Produksi sel punca limbal tikus dapat dilakukan sampai pada pasase 4 dan selanjutnya dapat dilakukan simpan beku untuk menghindari kultur yang lama. Kultur yang lama akan mengurangi sifat multipoten dan dapat terjadi diferensiasi spontan. Pada penelitian membuktikan bahwa setelah simpan beku sel punca limbal masih memiliki multipotensi dan memiliki karakter yang tidak berubah (Gambar 10). G . Kesi mpulan dan Saran Kesi mpulan Penggunaan matriks ekstraseluler seperti membran amnion dan fibronectin dapat meningkatkan kondisi kultur in vitro SPL. Saran Perlu dilakukan tranplantasi sel punca limbal yang telah diproduksi in vitro untuk terapi secara in vivo. H. Ucapan Teri makasi h Terima kasih Kepala Badan Litbangkes dan Kepala Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan (PBTDK) atas pemberian dana penelitian, masukan dan nasehat selama melakukan penelitian dengan dana DIPA 2014. Teman-teman tim di laboratorium stem cell PBTDK Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan, Badan Litbankes, Kementerian Kesehatan serta BATAN yang telah membantu dalam proses penelitian, menyediakan bahan untuk penelitian serta berdiskusi selama menjalankan penelitian, saya ucapkan terimakasih.

27

1. Daftar Kepustakaan 1. Burman S and Sangwan V. Cultivated limbal stem cell transplantation for ocular surface recontniction. Clinical Opthalmology. 2008;2(3):489- 502. 2. Albert R, Vereb Z, Csomos K, Moe MC, Johnsen EO, Oldstad OK, et al. Cultivation and Characterization of corneal Limbal Ephitelial Stem Cell on Lens Capsule in Animal material-Free medium. PLOS ONE. 2012;7( 10): 1 11. 3. Lekhanont K, Choubtum L, Chuck RS, Sa-ngiampornpanit T, Chuckpaiwong V and Vongthongsri A. A Serum-and feeder-free technique of culturing human comeal epitheliual stem cells on amniotic membrane. Molecular Vision. 2009; 15:1294-302. 4. Sudha B. Madhavan HN, Sitalakshmi G, Malathi S, Krishnakumar S, Mori Y, Yoshika H and Abraham S. Cultivation of human comeal limbal stem cell in Mebiol gel-A thermo reversible gelation polymer. Indian J Med Res. 2006; 124:655-64. 5. Dua HS, Joseph A, Shanmuganathan VA and Jones RE. Stem cell diferentiation and effects of dificiency. Eye. 2003;17:877-85. 6. Shimazaki J, Aiba M, Goto E, Kato N, Shimmamura S. Tsuboto K. Transplantation of human limbal epthelium cultivated on amniotic membrane for the treatment of severe ocular surface disorders. Am J Ophiamol. 2002;109:1285-90. 7. Ahmad S, Stewart R, Yung S, Armstrong L, Stojkovic M, Figueiredo F and Lako M. Diferentiation of Human Embrionic stem cell into comeal ephiteliallike cel! by In vitro replication of the comeal ephitelial stem cell niche. Stem Cell. 2007;25:1145-55. 8. Guell JL, Morral M, Gris O, Elies D, Manero F, Saenz N. Barcelona cicinnati technique for limbal transplatation. J Emmetropia. 2012;3(3): 1 5. 9. Javadi MA, Einollahi B, Rafie AB, Baharvand H, Ebrahimi M, Rafati N, Kanavi MR. Early Results of Autologous Cultivated Limbal Stem cell

28

Transplantation in Total Limbal Stem cell Deficiency. Iranian J Opthalmic Res. 2006; 1(2):71-9. 10. Sabapathy V,Sundaram B, Sreelakshmi VM, Mankuzhy P, Kumar S. Human Wharton’s Jelly Mesenchymal Stem Cells Plasticity Augments Scar-Free Skin Wound

Healing

with

Hair

Growth.

.

2014;

DOI:

10.1371/journal.pone.0093726. http://joumals.plos.org/plosone/article?id= 10.1371/journal.pone.0093726 11. Meyer-Blazejewska E.A, Kruse F.E, Bitterer K, Meyer C, Hofmann- Rummelt (', Peter H. Preservation of the Limbal Stem Cell Phenotype by Appropriate Culture Techniques. IOVS. 201 0;51 (2):765-74. 12. Krishnan S, Iyer GK and Krishnakumar S. Culture and characterisation of limbal epithelial cells and oral mucosal cells. Indian J Med Res. 2010;131:4228. 13. Fibronectin may modulate the directional migration of corneal epithelial cells. Kimura K, Kawano S, Mori T, Inoue J, Hadachi H, Saito T, and Nishida T. Invest Ophthalmol Vis Sci.2010;51:4492-4499. DOI: 10.1167/iovs.09-4380 14. Veevers-Lowe J., Ball SG., Shuttleworth A. and Kielty CM. Journal of Cell Science. 2011;124:1288-1300. doi: 10.1242/jcs.076935 15. Tawonsawatruk T., Spadaccino T, Murray R, Pault B, Hamish, Simpson BM. Growth Kinetics of Rat Mesenchymal Stem Cells From 3 Potential Sources: Bone Marrow, Periosteum and Adipose Tissue. J Med Assoc Thai Vol. 95 Suppl. 10 2012 16. Shortt AJ, Seeker GA, Munro PM, Khaw PT, Tuft SJ, and Daniels JT. Characterization of the limbal epithelial stem cell niche : Novel imaging techniques permit in vivo observation and targeted biopsy of limbal epithelial stem cell. Stem ('ells. 2007;25:1402-9. 17. Oh J, Kim R.H, Shin K, Park N and Kang M.K. ANp63a Triggers Epithelial-Mesenchymal Transition and Conffers Stem Cell Properties in Normal Human Keratinocyts. http://www.jbc.Org/cgi/doi/10.1074/jbc.M 111.244939

29

18. Bray U, Heazlewood CF, Atkinson K, Hutmacher DW, Harkin DG. Evaluation of

methods

for

cultivating

limbal

mesenchymal

stromal

cells.

Cytotherapy.2012; 14(8);936-47. doi: 10.3109/14653249.2012.684379. 19. Heidari B, Shirazi A, Akhondi M M, Hossein Hassanpour H, Behzadi B, Naderi M.M, Sarvari A and Borjian S Comparison of Proliferative and Multilineage Differentiation Potential of Sheep Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow, Liver, and Adipose Tissue. Avicenna J Med Biotech. 2013;5(2):104-17.

J. Persetujuan Atasan yang Berw enang

Jakarta, Desember 2014

Menyetujui. Kabid. Teknologi Dasar Kesehatan

Drh. Rita Marletadewi. M Kes NIP. 19591211 1985032001

Ketua Pelaksana

Ratih Rinendvapulri. M. Biomed NIP. 19790924 200912 2 001

Mengetahui,

Ketua Panitia Pembina Ilmiah

Dr. dru. Maizdanna D. Autini. MSc NIP. 19501206 198402 2 001

31

ANALISIS GEN TANPA FN Descriptive Statistics N

Krt12

Minimum

Mean

Std Deviation

Statistic Delta_CT Valid N

Maximum

6 (listwtse)

Statistic

Statistic

17.83026791

20.07797

Statistic

Std. Error

18.85295947

0.311129

Statistic 0.762107

6

Descriptive Statistics

ABCG2

N Statistic

DeltaCT Valid N

Minimum

6 (listwise)

Maximum

Statistic

Statistic

16,49202442

18.03467

Mean

Std

Statistic

Std Error

17.42187309

0,210966

Deviation Statistic 0,51676

6

Descriptive Statistics N

CD90

Minimum

Mean

Std Deviation


Maximum

6 (listwise)

Statistic

Statistic

12.71934509

182343

Statistic

Std Error

15 23368231

1 081916

Statistic 2,650142

6


p63

Minimum

Mean

Std Deviation


Maximum

6 (listwise)

4 gen

Statistic

Statistic

16,90195465

24,65738

Statistic

Std Error

19 09243457

1 237181

3.030462

6

Kolmog

Shapiro-Wiik

Statistic df Delta_CT

Sig

0.2149

24

0,005549

Statistic

df

0.864214661

a Lilliefors Significance

Mann-Whitney Test Ranks

Krt12 vs ABCG2 ID2 Delta_CT

Statistic

N

Mean

Sum of Ranks

1

6

9,333333

56

2

6

3.656667

22

Total

12

Sig 24

0.004061

Test Statistics(b) Delta_CT

Mann-Whitney U

1.000

Wilcoxon W

22.000

Z

-2.722

Asymp. Sig. (2-tailed) .006 Exact Sig. [2*(1-tailed SI ,004a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: ID2

Ranks

Krt12

VS

CD90

ID2

Delta_CT

N

Mean

Sum of

Ranks

1

6

9,333333

56

3

6

3,666667

22

Mean

Sum of Ranks

7

5

Total

12

Test Statistics(b) Delta_C T Mann-Whitney U

1,000

Wilcoxon W

22.000

2

-2.722

Asymp. Sig. (2-tailed) .006 Exact Sig. [2* (1 –tailed Si 004a

a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: ID2

Ranks

Krt12 VS p63 Delta_CT

N 1

6

45 4

6

5 533

Total

12

Test Statistics(b)

Delta_CT Mann-Whitney

U

12.000

Wilcoxon W

33.000

Z Asymp Sig

-.961 (2-tailed)

Exact Sig[2*(1 -tailed

.337 S ,394a

a. Not corrected for lies b. Grouping Variable ID2

Ranks

ABCG2 VS Delta_CT

CD90 ID2 2 7,833333

N

Mean

Sum of Ranks 6 47

3

6

Total

5,166667

31

12

Test Statistics(b) Delta_C T Mann-Whitney U

10.000

Wilcoxon W

31.000

Z

-1.281

Asymp. Sig. (2-tailed) .200 Exact Sig. [2*( 1-tailed S .240a a. Not corrected for ties b. Grouping Variable: ID2

Ranks

ABCG2 VS p63 Delta_CT

102

Mean

N

2

6

4

6

Total

Sum of Ranks

5,5

33

7,5

45

Mean

Sum of Ranks

12

Test Statistics(b)

Delta_CT Mann-Whitney U

12.000

Wilcoxon W

33.000

Z

-.961

Asymp Sig.

(2-tailed)

.337

Exact Sig [2*( 1 -tailed S.394a a. Not corrected for ties b. Grouping Variable ID2

Ranks

CD90 VS p63

!D2

Delta_CT

3

6

4,833333

29

4

6

8,166667

49

N

Total Test Statistics(b) Delta_CT Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp Sig.

8.000 29.000 -1.601

(2-tailed)

Exact Sig [2*(1-tailed a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: ID2

.109 S .132a

12

ANALISIS ANTAR GEN DENGAN FN


Krt12

Minimum

Maximum

Mean

Std. Deviation

Statistic Delta_CT

Statistic

Statistic

6 16,2697086

Valid N (listwise)

Statistic

20.97345448

18.41746

Std. Error

Statistic

0.764834959

1.87345539

6


ABCG2

Minimum

Maximum

Mean

Std Deviation

Delta_CT Valid N (listwise)

Statistic

Statistic 6 15,3388166 6

Statistic 18,62785721

Statistic 17,081984

Std Error 0,638844519

Statistic 1,5648431

Descriptive Statistics

CD90

N

Minimum

Maximum

Statistic

Statistic

Statistic

Mean

Std Deviation

Defta_CT

6 14 4585066

20.68341732

Valid N (listwise)

Statistic

Std Error

Statistic

17.700767

1,18341001

2,89875068

6


Minimum

Maximum

Mean

Std

P63

Deviation Statistic

Delta_CT

Statistic 6

Statistic

Statistic

17,3231859 23.47856712

Valid N (listwise)

19,751784

Shapiro-

rov-

Wilk

Statistic Delta_CT

df

Sig.

0,11373 24

Statistic 0,2

0,9736526

a Lilliefors Sigmfic. *. This is a lower bound of the true significance

Test of Homogeneity of Variances

4 qen

Delta_CT Levene Statistic 2.179

df 1

df2 Sig. 3

AN OVA Delta_CT


6

Kolmogo

4 gen

Std Error 0.864383717

20 .122

df

Sig. 24

0,75688708

ANALISIS GEN SAMA ANTARA KONTROL DAN PELAKUAN

KRT12

Tests of Normality Kolmogorov-Smirnova

t

De!ta_CT

Shapiro-Wilk

Statistic

df

Sig.

Statistic

0,11278306

12

0.2

0,98075794

df 12

Sig. 0,986483051

a. Lilliefors Sig *. This is a lower bound of the true significance.

KRT12 dengan Penambahan FN Descriptive Statistics N

De!ta_CT

Minimum

Maximum

Statistic

Statistic

6

16,26970863

Valid N (listwis

Statistic 20.97345448

Mean Statistic 18.41745965

Std. Deviation Std. Error 0,764835


6

KRT12 tanpa Penambahan FN Descriptive Statistics N

Minimum

Statistic Delta_CT

Maximum

Statistic 6

Statistic

17.83026791

Valid N (listwis

20,07796669

Mean

Std. Deviation

Statistic

Std. Error

18,85295947

0,31 1129


6

Krt12 antar Perlakuan FN Independent Levene's Test

t-test for

for Equality of

Equality of

Variances

Stg.

Means t

df

Sig. (2-tailed)

Mean Difference

Std. Error Difference

95% Confidence Interval of the Difference Lower

Upper

Delta_CT

Equal variance 5,558385426

0,040115619 -0,527433732

10

0,609394262

-0.527433732

6,610691

0,615121933

Equal variances not assumed

ABCG2 Tests of Normality KolmogorovSmirnova Statistic Delta_CT

Shapiro-Wilk df

0,180572395

Sig 12

Statistic 0,2

0,916012043

df

Sig 12

0,254578481

a. Lilliefors Sig *. This is a lower bound of the true significance

ABCG2 dengan Penambahan FN Descriptive Statistics N

Minimum

Statistic

Statistic

Delta_CT

6

Maximum Statistic

15,33881664

Valid N (listwis

18,62785721

Mean

Std. Deviation

Statistic

Std Error

Statistic

17,08198357

0,638845

1,564843095

6

ABCG2 tanpa Penambahan FN Descriptive Statistics

Delta_CT Valid N (listwis

N

Minimum

Statistic

Statistic 6

Maximum Statistic

16,49202442

18,03466988

Mean

Std Deviation

Statistic

Std Error

Statistic

17,42187309

0.210966

0,516759959

6

ABCG2 antar Perlakuan FN

0,4355

0,82569582

-0,4355

0,82569582

-

2,27526476

1,404265106

-2.411512748

1,540513093

-

Independent Samples Test Levene's Test

t-test for

for Equality of

Equality of

Variances

Means Sig.

t

df

Sig (2-tailed)

Mean

Std Error

95% Confidence

Difference

Difference

Interval of the Difference Lower

Delta_CT


9.681E-05


-0,505203712

10

0,624363202

-0,33989

0,67277718

-1,83893049

1,159151437

-0,505203712

6.07771

0,631209223

-0,33989

0,67277718

-1,98102716

1,301248107

CD90 Tests of Normality Kolmogorov-Smirnova Statistic Delta_CT

0,1649585

df

Shapiro-Wilk Sig

12

Statistic 0.2

df

0,912642162

Sig 12

0,230621541

a, Lilliefors Sig * This is a lower bound of the true significance

CD90 dengan Penambahan FN Descriptive Statistics N Statistic Delta_CT Valid N (listwis

Minimum Statistic 614.45850658

Maximum Statistic 20,68341732

Upper

Mean Statistic 17,70076664

6

CD90 tanpa Penambahan FN

Std. Deviation Std

Error

1,18341



Minimum

Statistic Delta_CT Valid

6

Maximum

Mean

Std. Deviation

Statistic

Statistic

Statistic

Std Error

Statistic

12,71934509

18,23429966

15,23368231

1.081916

2,650142424

N (listwis

6

CD90 antar Perlakuan FN Independent Samples Test Levene'sTest

|

t-testfor

for Equality of

Equality of

Variances

Means Sig

t

df

Sig-(2-tailed) Mean

Std. Error

Difference Difference


Delta_CT

Equal variance

0 156787299

0,700448392


1,53862509

10

1,53862509

9.920663

1,60343435

-1,105590055

6,039758711

0,15515787

1,60343435

-1,109466641

6,043635297

p63 Tests of Normality Kolmogorov-Smirnova Statistic

df

Delta_CT 0,197354345

Shapiro-Wilk Sig.

12

Statistic 0,2

df

0,866163921

Sig. 12

0,05843896

a Lilliefors Sig *. This is a lower bound of the true significance

p63 dengan Penambahan FN Descriptive Statistics NMinimum Maximum Deviation

Upper

0,154915235 2,467084

Mean Std.

2.467084

Independent Samples Test Levene'sTest

|

t-test for

for Equality of

Equality

Variances

df Means

Sig.

t

df

Sig. (2-tailed)

Mean

Std. Error

Difference Difference


Delta_CT


9.681E-05


-0,505203712

10

0,624363202

-0,33989

0,67277718

-1,83893049

1,159151437

-0,505203712

6,07771

0,631209223

-0,33989

0,67277718

-1,98102716

1,301248107

CD90 Tests of Normality Kolmogorov-Smirnova Statistic Delta_CT

df

Shapiro-Wilk Sig

0,1649585

12

Statistic 0,2

0,912642162

df

Sig 12

0.230621541

a Lilliefors Sig *. This is a lower bound of the true significance

CD90 dengan Penambahan FN Descriptive Statistics N Statistic Delta_CT Valid N (listwis

Minimum

Maximum

Statistic

Statistic

614,45850658

20.68341732

Upper

Mean Statistic 17,70076664

6

CD90 tanpa Penambahan FN

Std. Deviation Std Error 1,18341

Statistic 2.898750682


Minimum

Maximum

Mean

Statistic

Statistic

Statistic

Statistic

18,23429966

15,23368231

Delta_CT

6

12,71934509

Valid N (listwis

Std. Deviation Std Error 1,081916


6

CD90 antar Perlakuan FN |

Independent Samples Test Levene'sTest

t-test for

for Equality of

Equality of

Variances

Means Sigt

df

Sig. (2-tailed) Mean Difference

Std. Error

95% Confid'

Difference Interval of Differenc Lower

Delta_CT Equal variance 0.156787299 0.700448392

1,53862509


1,53862509

10 9,920663

0,154915235

2,467084

1,60343435

-1,10559

0,15515787

2,467084

1,60343435

-1,10946

p63 Tests of Normality KolmogorovSmirnova Statistic

Shapiro-Wilk df

Delta_CT 0,197354345

Sig 12

Statistic 0,2

0 866163921

df

Sig 12

0,05843896

a. Lilliefors Sig V This is a lower bound of the true significance

p63 dengan Penambahan FN Descriptive Statistics N Minimum Mean

Std. Deviation

Maximum

Penggunaan Matriks Membran Amnion untuk Produksi Sel Punca. Limbal (SPL) Hewan Coba

Recommend Documents