PENGEMBANGAN PROTOTIPE KIT DIAGNOSTIK LEPTOSPIROSIS DENGAN MENGGUNAKAN METODE ELISA BERBASIS PADA PROTEIN REKOMBINAN LIPL32

LAPORAN HASIL PENELITJAN RISET PEMBINAAN ILMU PENGETAHUAN DAN TEKNOLOGJ KEDOKTERAN TAHUN ANGGARAN 2012

PENGEMBANGAN PROTOTIPE KIT DIAGNOSTIK LEPTOSPIROSIS DENGAN MENGGUNAKAN METODE ELISA BERBASIS PADA PROTEIN REKOMBINAN LIPL32

Tim Peneliti: _

drh. Hevi Wihad_madyatami, M.Sc.

dr. Rizka Humardewayanti Asdie., SpPD-KPTI Etty Widayanti, S.Si., M.Biotech.

Pembimbing: Dr. drh. Aris Haryanto, M.Si

DILAKSANAKAN ATAS BIAYA: BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN BERDASARKAN PERJANJIAN KERJASAMA ANTARA BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN Rl DAN FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSlTAS GADJAH MADA NOM OR: HK.06.01/1/1693/2012 TANGGAL: 1 MARET 2012

LAPORAN HASIL PENELITIAN RISET PEMBINAAN ILMU PENGETAHUAN DAN TEKNOLOGI KEDOKTERAN TAHUN ANGGARAN 2012

PENGEMBANGAN PROTOTIPE KIT DIAGNOSTIK LEPTOSPIROSIS DENGAN MENGGUNAKAN METODE ELISA BERBASIS PADA PROTEIN REKOMBINAN LIPL32

Tim Peneliti: drh. Hevi Wihadmadyatami, M.Sc. dr. Rizka Humardewayanti Asdie.,

SpPD-KPTI

Etty Widayanti, S.Si., M.Biotech.

Pembimbing: Dr. drh. Aris Haryanto, M.Si

DILAKSANAKAN ATAS BIAYA: BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN BERDASARKAN PERJANJIAN KERJASAMA ANTARA BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN Rl DAN FAKUL TAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS GADJAH MADA NOMOR: HK.06.01/1/1693/2012 TANGGAL: 1 MARET 2012

� .

.

--- - .... -. --�- -·--- _.,

1

b. Lembar ldentitas dan Pengesahan LEMBAR IDENTIT AS DAN PENGESAHAN LAPORAN AKHIR PENELITIAN RISBINIPTEKDOK 2012 1.

Judul Penelitian

:

PENGEMBANqAN

DIAGNOSTIK

KIT

PROTOTIPE

lEPTOSPIR OSI S

DENGAN MENGGUNAKAN METODE ELISA BERBASIS PADA PROTEIN R EKOMBINAN LIPL32

2.

Ketua Peneliti a.

Nama

b.

Jenis Kelamin

c.

3. 4.

Pangkat/Golongan

d.

NIP

e.

Handphone

f.

NPWP

g.

Jabatan Fungsional

h. i.

Alamat Kantor &TelpJFax/E-mail

j.

Alamat Rumah &TelpJFax/E-mail

Fakultas/Pusat Sb.Jdi

Perguruan Tinggi Jangka Waktu (Bulan)

5.

Biayatotalyang disetujui

6.

b. lnstansi lain: Luaran Penelitian

a.

Balitbangkes

.. drh. Hevi Wihadmadyatami, M.Sc. : Perempuan : Penata Muda Tk. 1/ lllb : 198509032010122006 : 08 1329095771 : -

: : Fakultas Kedokteran Hewan : Jalan Fauna No.2 Karangmalang Yogyakarta

: Jalan Yudistira 89 GrogoJ lndah Solo Baru Sektor 7 : Universitas Gadjah Mada : 6 (enam) bulan /180 hari : Rp. 150.000.000,00 : Rp.: 1. Laporan akhir 2. 3.

X-Banner ukuran 60 em x 160 em Manuskrip publikasi

Yogyakarta, 26 Desember 2012

Penetiti

drh. Hevi Wihadmadyatami, M.Sc. NIP. 198503092010122006

2

··.·

SUSUNAN TIM PENELITI 1. Peneliti utama Nama

Gelar

Hevi \Vihadmadyatami Tempat lahir

.

Tanggal lahir

Sukoharjo

. drh; M.Sc

Kelamin

9 Maret 1985

Perempuan

Golongan

Jabatan

CPNS

fib

Bagi an!Divisi

Biokimia dan Biologi Molekuler Institusi asal

Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjab Mada, Yogyakarta Telepon

Faksimile

(0274)560860, 560865

(0274)560861

Alamat Korespondeni Pos

JL Fauna No. 2, Karangmalang, Yogyakarta 55281

Alamat E-mail [email protected] Telepon Rumah

Telepon Genggam

0271-623008

081329095771

(HP)

Kualifikasi Akademik Tahun

2006 Tahun

2007

Tahun

2009

Institusi

Fakultas Kedokteran Dewan, UGM Institusi

Fakultas Kedokteran Hewan, UGM Institusi

Fakultas Kedokteran Dewan, UGM

Gelar

S.K.H. Gelar

drh. Gel ar

M.Sc.

4

2.

Peneliti 1 ·Gelar

Nama Rizka Humardewayanti Asdie Tempat lahir Yogyakarta

dr., SpPD-KPTI

Tanggat lahir 21 Agustus 1971

Jabatan Staf Sub Bagian Penyakit Infeksi

Kelamin Perempuan Golohgan illd

Bagian!Divisi Bagian llmu Penyakit Dalam FK UG:M/RSUP Dr. Sardjito Institusi asal Fakultas Kedokteran UGMIRSUP Dr. Sardjito, Yogyakarta Telepon (0274) 561616

Faksimile (0274) 583745

Alamat Korespondeni Pos Bagian Ilmu Penyakit Dalam RSUP Dr. Sardjito, JI. Kesehatan no. 1, Yogyakarta 55281 ..

Alamat E-mail [email protected] Telepon Rumah

Telepon Genggam (HP) 08121561383

Kuali:fikasi Akademik Tahun 1998

Institusi Gelar S.Ked Fakultas Kedokteran, UGM

Tahun 2000 Tahun 2004

Institusi Gelar Fakultas Kedokteran, UGM dr. Institusi Gelar Fakultas Kedokteran, UGM Sj!_PD.

5

3.Peneliti 2 Nama

Etty Widayanti Tempat lahir

Jakarta Jabatan

Gelar

I

S.Si., M.Biotech. Tanggallahir

1 Juni 1977

Staf Sub Bagian Biologi Molekuler

Kelamin

Perempuan Golongan

.mb

Bagian!Divisi

Bagian BioJogi Fakultas Kedokteran Universitas YARSI Institusi asal

Fakultas Kedokteran Universitas YARSI, Jakar.ta Telepon

(021) 4244574, 4206674-76 Ext. 3106

Faksimile

J02H4243171

Alamat Korespondeni Pos

Jl. Letjen Suprapto, Cempaka Putih, Jakarta Pusat, 10510 Alamat E-mail etthvw04@vahoo. com Telepon Rumah

Telepon Genggam

(HP) 08174903877

021-78884485 Kualifikasi Akademik Tahun

2000 Tahun

2008

Institusi

Fakultas Biologi Universitas Indonesia Institusi PS Bioteknologi, UGM

Gelar

S.Si. Gelar

M.Biotech.

6

KATAPENGANTAR

Alhamdulillah, puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas rahmat dan karunia yang diberikanNya sehingga dapat menyelesaikan laporan hasi1 penelitian yang berjudul

Pengembangan

Prototipe

Kit

Diagnostik

Leptospirosis

dengan

:Menggunakan Metode ELISA Berbasis pada Protein Re kombinan lipl32. . Laporan hasil penelitian

ini disusun sebagai salah satu bentuk pertanggung

jawaban penelitian dari Hibah RISet Pembinaan ilmu Pengetahuan dan Teknologi Kedokteran tahun 2012 yang didanai oleh Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Kementerian Kesehatan. Laporan hasil penelitian ini didasarkan atas basil penelitian yang telah di)akukan di Laboratorium Biokimia, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Gadjah Mada. Penulis menyadari bahwa tanpa bantuan

dari semua pibak yang terkait, laporan basil

ini tidak mungkin terselesaikan dengan baik. Untuk itu penulis mengucapkan terima kasih kepada: 1.

Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Kementerian Kesehatan Republik Indonesia yang telah mendanai hingga dapat terselenggaranya penelitian ini

2.

Dr. drh. Aris Haryanto, M.Si sebagai pembimbing penelitian

3.

Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada yang telah memfasilitasi penelitian ini hingga dapat terlaksana

4.

Dekan

Fakultas

Kedokteran

Hewan

Universitas

Gadjah

Mada

yang

telah

memfasilitasi penelitian ini hingga dapat terlaksana 5.

Ketua Bagian Biokimia beserta staf

6.

Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu atas segala bentuk bantuan baik moral maupun material. Semoga Allah SWT senantiasa melimpahkan karunia-Nya kepada semua pihak yang

telah membantu pelaksanaan penelitian dan penyelesaian laporan ini. Semoga Laporan

7

dapat bennanfaat bagi ilmu pengetahuan dan bagi siapapun yang membutuhkan informasi tentang leptospirosis. Penyusun menyadari sepenuhnya bahwa laporan ini jauh dari kesempurnaan sehingga diharapkan saran dan kritik yang membangun untuk perbaikan dan penyempurn�n laporan ini.

Yogyakarta, Desember 2012

Penyusun

8

RINGKASAN EKSEKUTIF

PENGEMBANGAN PROTOTIPE KIT DIAGNOSTIK LEPTOSPIROSIS DENGAN MENGGUNAKAN METODE ELISA BERBASIS PADA PROTEIN REKOMBINAN LIPL32

Hevi Wihadmadyatami\ Rizka Humardewayanti A2., Etty Widayanti3 1Ba gi�n Anatomi, Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada 2Ba ian llmu Penyakit Dalam, Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada g 3Ba ian Anatomi, Fakultas Kedokteran Universitas YARSI g

A. Latar Belakang Leptospirosis atau yang dikenal juga dengan Weil's diseases merupakan penyakit zoonosis yang disebabkan oleh infeksi bakteri Leptospira sp. memiliki antigen yang beragam, imunopatogenesis

dari genus Leptospira sp. Bakteri

namun

yang berkaitan langsung dengan

dan invasi ke dalam sel adalah antigen yang berasal dari protein

permukaan. Lip L32 adalah lipoprotein permukaan yang dominan dan ditemukan dalam jumlah besar terutama pada Leptospira strain patogenik dan tidak ditemukan pacta non patogenik leptospira (Haake et al, 2000; Guerraro et al., 2001) Leptospirosis terdistribusi di seluruh belahan dunia. Manusia

dapat terinfeksi

leptospira melalui kontak dengan air, tanah atau tanaman yang telah dikotori oleh air seni hewan yang menderita leptospirosis. Bakteri masuk ke dalarn tubuh manusia melalui selaput lendir (mukosa) mata, hidung, kulit yang lecet atau atau makanan yang

terkontaminasi oleh urine hewan terinfeksi leptospira. Leptosp irosi s masih menjadi masalah kesehatan masyarakat, terutama di daerah beriklim tropis dan subtropi s, yang memiliki curah hujan tinggi khususnya di negara berkembang, dimana kesehatan lingkungannya kurang diperhatikan terutama untuk masalah pembuangan sampah

dan

penanganan pasca banjir. Berdasarkan data resmi dari WHO (2010) diketahui bahwa setiap tahun terjadi 500.000 kasus Leptospirosis di seluruh dunia

outbreak

dan apabila terjadi

diperkirakan insidensi leptospirosis mencapai lebih dari 1.00 kasus per 100.000

penduduk. Indonesia berdasarkan data

dari kementerian kesehatan di tahun 20 10 terdapat

delapan propinsi yang melaporkan kasus Leptospirosis yaitu, DIG Jakarta, Jawa Barat, Jawa Tengah, DI Yogyakarta, Jawa Timur, Bengkulu, Kepulauan Riau

dan

Sulawesi

9

Selatan, khusus untuk DI Yogyakarta dilaporkan bahwa di kabupaten Sleman sejak tahun 2007 sampai dengan tahun 2011 terjadi 201 kasus, dengan rincian 1 kasus tahun 2007,35 kasus tahun 2008 (2 meninggal), 85 kasus tahun 2009 (5 meninggal), 67 kasus tahun 2010 (3 meninggal)

dan tahun 2011 sampai dengan bulan maret sudah

ada 23 kasus dari

17 kecamatan, kecarnatan dengan kasus terbanyak adalah Moyudan (4 desa), disusul kecamatan minggir (4 desa),seyegan (2 desa), godean I desa, prambanan 1 desa, kalasan 1 desa, Ngaglik 1 desa, tempel 1 desa, Gamping 1 desa, data tersebut diatas tidaklah mengherankan apabila

dan berbah

1 desa. Berdasarkan

Leptospirosis Society

menyatakan

Indonesia sebagai Negara dengan insiden leptospirosis yang tinggi. Penanganan pada pasien dengan gejala leptospirosis menunjukkan adanya banyak kendala, hal tersebut disebabkan karena gejala klinis infeksi Leptospira sangat sulit dibedakan dengan penyakit yang lain seperti influensa, meningitis, hepatitis, dan demam berdarah dengue sehingga seringkali tidak terdiagnosis. Saat ini ada berbagai macam metode untuk mendiagnosis leptospirosis seperti menggunakan mik:roskop medan gelap,

Polymerase Chain Reaction kelemahan

Microscopic Aglutination Tests (MAT),

dan

(PCR). Teknik yg digunakan tersebut masih memiliki

yaitu pengujian dengan

MAT sangat

membutuhkan fasilitas untuk:

mempertahankan hidup dari leptospirosis, memakan waktu terutama apabila diterapkan pada sarnpel dalam jumlah besar,ada kemungkinan tidak terdeteksi antibodi dikarenakan titer yang rendah, dan MAT tidak dapat di standarisasi, sedangkan untuk

Chain Reaction (PCR),

Polymerase

teknik ini membutuhkan peralatan khusus, teknisi yang terampil,

ada kemungkinan positif palsu diseababkan sarnpel yang terkontaminasi dan nilai umum PCR sebagai teknik diagnosis cepat belum dievalusi karena belum secara

luas

diterapkan

terutama di negara tropis dan sub tropis. Berdasarkan hal tersebut di atas ketersediaan metode deteksi yang spesifik dan sensitif sangat diperlukan terutama bagi leptospirosis yang sangat berpotensi mengancam kesehatan publik, dan untuk pencegahan terjadinya

outbreak

atau kejadian luar biasa.

Dalarn hal ini penelitian tentang protein rekombinan LipL32 sebagai perangkat diagnosis sangat penting dilakukan untuk meningkatkan akurasi, sensitifitas, mudah digunakan, dan dapat digunakan untuk deteksi dini,

10

·

B. Tujuan Tujuan

dari· penelitian ini adalah untuk mengernbangkan alat deteksi dini yang

sederhana, tidak

mahal, cepat dan sensitif dengan berbasis pada rekombinan protein Lip

132 sehingga dapat membantu dalam diagnosis leptospirosis. Tahapan selanjutnya

diharapkan

dapat

digunakan

untuk menentukan prevalensi ieptospirosis

demi

kepentingan rnanajemen pengendalian, pencegahan penyakit baik pada manusia maupun bewan. Deteksi dini juga diharapkan mampu mengurangi kejadian

leptospirosis di

masyarakat.

C. Hasil Utama DNA dari isolat reference Leptospira interogans serovar icterohaernoraghie diisolasi dengan menggunakan genomic DNA mini kit dan basil isolasi digunakan sebagai template untuk proses PCR. Reaksi PCR satu siklus pada suhu 94oc selama 5 menit, diikuti 35 siklus untuk denaturasi 94°C selama 1 menit, elongasi 72°C selama 1

menit

annealing 53°C selama 45 detik,

dan post elongasi 72°C selama 5 menit.Hasil

elektroforesis dari PCR pada penelitian ini menunjukkan pita dengan panjang 819 bp, dapat Agarose gel elek:troferesis

1%.

Hasil PCR · kemudian dipurifi.kasi

dengan

menggunakan purifikasi gel (Biobasic Inc) untuk selanjutnya digunakan dalam proses ligasi

ke

dalam

pET

SUMO.

Proses

selanjutnya

adalah

proses

ligasi,

yaitu

menyarnbungkan gen yang diinginkan ke dalam vektor dengan bantuan enzim ligase. Vektor plasmid yang digunakan dalam penelitian ini adalah pET SUMO, dan dilanjutkan dengan proses transformasi .menggunakan hospes metode

heat shock.

E. coli,

metode yang digunakan adalah

Hasil transformasi pada penelitian ini menunjukkan adanya 3 koloni

pada plat LB padat. Semua koloni yang tumbuh kemudian direkultur ke LB cair untuk selanjutnya diisolasi plasmidnya. Proses selanjutnya setelah transformasi adalah isolasi

11

plasmid dan pengujian gen insert dengan PCR untuk mengetahui apakah gen yang diinginkan ter-insert ke dalam plasmid menggunakan primer forward dan

backward dari

LipL32. Hasil amplifikasi PCR plasmid gen LipL32 pada gel agarose dengan konsentrasi l%.diketahui plasmid menunjukkan basil positif dengan terbentuknya pita DNA dengan panjang 819 bp dan dilanjutkan dengan sekuensin, kemudian gen penyandi LipL32 ditrausfonnasikan kembali pada BL21 (DE3) One Shot' Cells dan diekspresikan proteinnya.

ldentiftkasi protein rekombinan dilakukan dengan Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide

Gel Electrophoresis

dengan konsentrasi 12%. dan imunobloting dan menunjukkan

adanya protein rekombinan LipL32 dengan berat molekul 32 kDa.

D. Kesimpulan Berdasarkan penelitian dapat disimpulkan bahwa basil penelitian menunjukkan

panjang gen penyandi protein LipL32 telah berhasil diamplifikasi dengan panjang

819

bp dan

berat protein LipL32 yang diekspresikan sebesar 32 kDa, protein berhasil diidentifikasi dengan menggunakan SDS-PAGE akan tetapi untuk basil imunoblotting dengan menggunakan antibodi poliklonal Anti-LipL32 belum berhasil diidentifikasi secarajelas.

12

DAFTARISI

Halaman Halaman Judul .. ... . .. . .. . . . .. . . . . .. . . . . ... . .. . . . . . . . .. .. . . . . .. . ... ... ... .. . .. . . .. ..

1

Lembar Identitas dan lembar Pengesahan .. . . . . . . . . . .. . .. . . . . . .. ... . . . . . . ... .. .

2

Susunan Tim Peneliti... ... .. . .. . .. . . .. . .. .. .. ... .. .. .. . .. . .. . ... .. . ... ... .. . . . . .. ...

3

Kata Pengantar . . . . . .

.. . ... . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .. . .. . .. . .. . . . . . . . .. . . .. . .. . . . .. . . . . .

6

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..

8

Daftar lsi . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. . .. . .. . .. . . . . . .. . . . . . . .. . .. . . . . . .. .. . . .. .. . ... .. . . .. ... ..

12

Daftar Gambar

13

.

.

Ringkasan Eksekutif

. . .

.

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . . . .

BAB I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang . . . ...... ............ ......... . . ... .... ........... .........

17

B. Tujuan

18

.

. . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . .

. . .

. . .

. . . . . . . . . . . . . . .

. . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . ..

BAB II. STUDI PUSTAKA A Leptospirosis .

. .

.

.

. . . . . . . . . . . . .

..

.

. . . . . . .

.

. . . .

. . .

..

.

. ..

. .

.. . ..

. . . . . . .

. .. . .

B. Polymerase Chain reaction........................ ... ... .. . ............. C.

Elektroforesis GelAgarose .. .... . .. . .. ... . .. . . .... .. .. . . ...... ... .. .

.

20

.

21

.

21

.

D. Cloning Gen . .. . . . ... ............... ........... ...... ............. ......

20

E. Sekuensing ... ................... ........ ... ... ........ .... ... .... . . . . . . .

.

F. Elektroforesis protein . . . . ........ ............ ...... ..... .......... .... .

.

G. Imunobloting ............ ......... .......... . . ...... ...... ....... ........ BAB III. Materi dan Metode .. . ............. ........ . ........ ...... ..............

.

.

23 24 24 26

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ............ ... . ........... ...........

.

36

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ...... ...... ............ ......... . .....

.

51

DAFTAR PUSTAKA ..... . ... . ..... ...... ... ... ... . . ...... .... ......... . . . . . . ....

.

52

13

DRAFT PUBLIKASI . . . . . . .. . ... . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .. . .. . . . .. . . .. . . . .. . . . . . . . . . . ..

53

LAlvfPffiAN

69

.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .

14

DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Peta vektor plasmid pET SUMO

. . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..

11

Gambar 2. Cloning Site dari produk PCR ke vector plasmid pET SUMO

11

Gambar 3. Hasil arnplifikasi PCR gen LipL32 pada gel agarose dengan konsentrasi 1%. Keterangan: Marker 100 bp (M), basil negatif amplifikasi gen dengan menggunakan DNA tctal Leptospira interogans ser. Bataviae (lajur 1 dan 2, hasil positif amplifikasi gen dengan menggunakan DNA total Leptospira interogans ser. Icterohaemoraghie (lajur 3 dan lajur 4).

37

Gambar 4. Hasil

pertumbuhan bakteri transforman pada media LB padat. Keterangan: Koloni bakteri transforman ditunjukkan dengan penanda Ll, L2 dan L3.

40

Gambar 5. Hasil amplifikasi PCR plasmid gen LipL32 pada gel agarose dengan konsentrasi 1%. Keterangan: Marker 100 bp (M), Plasmid dari koloni Ll menunjukkan basil positif dengan terbentuknya pita DNA (lajur 1), Plasmid dari koloni L2 menunjukkan basil positif dengan terbentuknya pita DNA (lajur 2), Plasmid dari koloni L3 menunjukkan basil negatif tidak terbentuk pita DNA (lajur 3).

42

Gambar 6. Identifikasi protein rekombinan LipL32 pada SDS-PAGE dengan konsentrasi 12%. Keterangan: Marker (M), Protein rekombinan dari koloni Ll dengan induksi IPTG menunjukkan adanya protein rekombinan LipL32 (Lajur 1), Protein rekombinan dari koloni L2 dengan induksi IPTG menunjukkan adanya protein rekombinan LipL32 (Lajur 2), Protein rekombinan dari koloni Ll 1anpa induksi IPTG (Lajur 3), Protein rekombinan dari koloni L2 tanpa induksi IPTG (Lajur 4).

46

Gambar 7. Transfer Blotter dari gel SDS-PAGE menuju membrane nitroselulose. Keterangan: Marker (M), Protein rekombinan dari koloni Ll dengan induksi IPTG menunjukkan adanya protein rekombinan LipL32 (Lajur 1), Protein rekombinan dari koloni L2 dengan induksi IPTG menunjukkan adanya protein rekombinan LipL32 (Lajur 2}, Protein rekombinan dari koloni L 1 tanpa induksi IPTG (Lajur 3) , Protein rekombinan dari koloni L2 tanpa induksi IPTG (Lajur 4).

48

15

8. Hasil imunobloting dengan menggunakan WesternBreeze®Chemiluminescent Western Blot Immunodetection Kit. Keterangan: Marker (M), Protein rekombinan dari koloni L l dengan induksi IPTG menunjukkan adanya protein rekombinan LipL32 (Lajur I), Protein rekombinan dari koloni L2 dengan induksi IPTG menunjukkan adanya protein rekombinan LipL32 (Lajur 2), Protein rekombinan dari koloni L l tanpa induksi IPTG (Lajur 3), Protein rekombinan dari koloni L2 tanpa induksi IPTG (Lajur 4 ).

49

Gambar 9. Hasil imunobloting pada membrane nitocelulose dengan menggunakan antibodi monoklonal anti LipL32. Keterangan: Marker (M), Protein rekombinan dari koloni Ll dengan induksi IPTG menunjukkan adanya protein rekombinan LipL32 (Lajur 1), Protein rekombinan dari koloni L2 dengan induksi IPTG menunjukkan adanya protein rekombinan LipL32 (Lajur 2), Protein rekombinan dari koloni L l tanpa induksi IPTG (Lajur 3), Protein rekombinan dari koloni L2 tanpa induksi IPTG (Lajur 4), Protein rekombinan dari koloni L 1 dengan induksi IPTG menunjukkan adanya protein rekombinan LipL32 (lajur 5)

50

Gambar

16

INTISARI PENGEMBANGAN PROTOTIPE KIT DIAGNOSTIK LEPTOSPIROSIS DENGAN MENGGUNAKAN METODE ELISA BERBASIS PADA PROTEIN REKOMBINAN LIPL32 Hevi Wihadmadyatami1, RieskaHumardewayanti A 2 , Etty Wiaayant i3 ..

1 Bagian Anatomi, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Gadjah Mada 2 Bagian Penyakit Dalam, Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada Jsagian Anatomi, Fakultas Kedokteran, Universitas YARSJ

Leptospirosis atau yang dikenal juga dengan Wei/'s diseases merupakan penyak it zoonosis yang disebabkan oleh infeksi bakteri dari genus Leptospira sp. Leptospirosis terdistribusi di selurul1 belahan dunia dan masih menjadi masalali kesehatan masyarakat, terutama di daerali beriklim tropis dan subtropis, yang memiliki curall hujan tinggi khususnya d i negara berkembang, dimana kesehatan lingkungannya kurang diperhatikan terutama untuk

masalall pembuangan sampall dan penanganan pasca banjir. Berdasarkan data resmi dari WHO (2010) diketallui bahwa setiap tallun terjadi 500.000 kasus Leptospirosis di seluruh dtmia Leptospirosis Society menyatakan Indonesia sebagai Negara dengan

insiden leptospirosis yang tinggi. Penanganan pada pasien dengan g�jala leptospirosis menunjukkan adanya banyak kendala, .hal tersebut disebabkan karena gejala klinis infeksi Leptospira sangat sulit dibedakan dengan penyakit yang lain seperti influensa, meningitis, hepatitis, dan demam berdarall dengue sehingga seringkali tidak terdiagnosis. Saat ini ada berbagai macam metode untuk mendiagnosis leptospirosis seperti menggunakan mikroskop medan gelap, Microscopic Aglutination Tests (MAT), dan Polymerase Chain Reaction (PCR). Teknik yg digunakan tersebut masih memiliki kelemallan. Berdasarkan hal tersebut di atas ketersediaan metode deteksi yang spesifik dan sensitif sangat diperlukan terutama bagi leptospirosis yang sangat berpotensi mengancam kesehatan publik, dan untuk pencegallan tetjadinya outbreak atau kejadian luar biasa. Dalam hal ini penelitian tentang protein rekombinan LipL32 sebagai perangkat diagnosis sangat penting dilakukan untuk meningkatkan akurasi, sensitifitas, mudall digunak an, dan dapat digunakan untuk deteksi dini, Rancangan penelitian dimulai dari isolasi DNA dengan menggunaka n isolate reference Leptospira interogans serovar icterohaemorhagie, PCR dengan menggunakan primer spesifJ.k

LipL32, gen yang teramplifikasi kemudian di puri:fikasi dengan menggunakan EZ- Spin Coloumn DNA Gel Extraction Kit, dan dilanjutkan dengan ligasi ke dalam vector pET SUMO dan transformasi pada sel kompeten Mach-1, plasmid basil transformasi kemudian diisolasi dengan GeneJet™ .Plasmid Miniprep Kit, dan disequencing, dilanjutkan dengan transformasi pada sel competent BL-21, basil transformasi kemudian diinokulasikan pada media LB yang mengandung kanamycin dengan diinduksi IPTG, kemud:ian protein diekstraksi dengan enzymatic digestion, Protein rekombinan diperoleh dengan cara mengambil supernatan dan diidentifikasi dengan SDS­ pAGE dan imunobloting Hasil penelitian menunjukkan bahwa panjang gen penyandi protein LipL32 telah berhasil diamplifikasi dengan panjang 819 bp dan berat protein LipL32 yang diekspresikan sebesar 32 kDa, protein berhasil diidentifikasi dengan menggunakan SDS-P AGE dan imunoblotting dengan menggunakan antibodi monoklonal Anti-LipL32.

Kata kunci: Leptospirosis, Leptospira interogans ser. icterohaeomarghi, protein Lip-L32,

cloning,

ekspresi

17

BAB I PENDAHULUAN A.

Latar Belakang

Leptospirosis atau yang dikenal juga dengan Weil's diseases merupak:an penyakit zoonosis yang disebabkan oleh infeksi bakteri dari genus Leptospira sp. Bakteri Leptospira sp. memiliki antigen yang beragam, namun yang berkaitan langsung dengan imunopatogenesis dan invasi ke dalam sel adalah antigen yang bcrasal dari protein permukaan. Lip L32 adalah lipoprotein permukaan yang dominan dan ditemukan dalam jumlah besar terutama pada Leptospira strain patogenik dan tidak ditemukan pada non patogenik leptospira (Haake

et al, 2000; Guerraro et al.,

2001)

Leptospirosis terdistribusi di seluruh belahan dunia. Manusia

dapat terinfeksi

leptospira melalui kontak dengan air, tanah atau tanaman yang telah dikotori oleh air seni hewan yang menderita leptospirosis. Bakteri masuk ke dalam tubuh manusia melalui selaput lendir (mukosa) mata, hidung, kulit yang lecet atau atau makanan yang terkontaminasi oleh urine hewan terinfeksi leptospira. Leptospirosis masih menjadi masalah kesehatan masyarak:at, terutama di daerah beriklim tropis dan subtropis, yang memiliki curah hujan tinggi khususnya di negara berkembang, dimana kesehatan lingkungannya kurang diperhatikan terutama untuk masalah pembuangan sampah penanganan pasca banjir. Berdasarkan data resmi dari

dan

WHO (2010) diketahui bahwa

setiap tahun terjadi 500.000 kasus Leptospirosis di seluruh dunia dan apabila terjadi

outbreak diperkirak:an

insidensi leptospirosis mencapai lebih dari 100 kasus per 100.000

penduduk. Indonesia berdasarkan data dari kementerian kesehatan di tahun 201 0 terdapat delapan propinsi yang melaporkan kasus Leptospirosis yaitu, DKI Jakarta, Jawa Barat, Jawa Tengah, DI Yogyak:arta, Jawa Timur, Bengkulu, Kepulauan Riau dan Sulawesi Selatan, khusus untuk DI Yogyakarta dilaporkan bahwa di kabupaten Sleman sejak tahun 2007 sampai dengan tahun 20 1 1 teijadi 2 0 1 kasus, dengan rincian 1 kasus tahun 2007, 35 kasus tahun 2008 (2 meninggal), 85 kasus tahun 2009 (5 meninggal), 67 kasus tahun 2010 (3 meninggal) dan tahun 20 1 1 sampai dengan bulan maret sudah ada 23 kasus dari 17 kecamatan, kecamatan dengan kasus terbanyak adalah Moyudan (4 desa), disusul kecamatan minggir (4 des a), seyegan (2 desa), godean 1 desa, prambanan 1 desa, kalasan 1 desa, Ngaglik 1 desa, tempel 1 desa, Gamping 1 desa, dan berbah 1 desa. Berdasarkan 18

data tersebut diatas tidaklah mengherankan apabila

Leptospirosis Society

menyatakan

Indonesia sebagai Negara dengan insiden leptospirosis yang tinggi. Penanganan pada pasien dengan gejala leptospirosis menunjukkan adanya banyak kendala, hal tersebut disebabkan karena gejala ldinis infeksi Leptospira sangat sulit
Polymerase Chain Reaction k.elemahan

Microscopic Aglutination Tests

(MAT), dan

(PCR). Teknik yg digunakan tersebut masih memiliki

yaitu pengujian

dengan

MAT

sangat membutuhkan

fasilitas

untuk

mernpertahankan hidup dari leptospirosis, memakan waktu terutama apabila diterapkan pada sarnpel dalarn jumlah besar, ada kemungkinan tidak terdeteksi antibodi dikarenakan

titer yang rendah, dan MAT tidak dapat di standarisasi, sedangkan untuk

Chain Reaction (PCR), teknik

Polymerase

ini membutuhkan peralatan khusus, teknisi yang terampil,

ada kemungkinan positif palsu diseababkan sampel yang terkontaminasi dan nilai umum PCR sebagai teknik diagnosis cepat belum dievalusi karena belum secara luas diterapkan

rerutama di negara tropis dan sub tropis. Berdasarkan

hal tersebut di atas ketersediaan metode deteksi yang spesifik dan

sensitif sangat diperlukan terutama bagi leptospirosis yang sangat berpotensi mengancam kesehatan publik, dan untuk pencegahan terjadinya Dalam

outbreak

atau kejadian luar biasa.

hal ini penelitian tentang protein rekombinan LipL32 sebagai perangkat diagnosis

sangat penting dilakukan

untuk meningkatkan akurasi, sensitifitas, mudah digunakan, dan

dapat digunakan untuk deteksi dini,

:B.

Tujuan Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan alat deteksi dini yang

sederhana, tidak mahal, cepat dan sensitif dengan berbasis pada rekombinan protein Lip L32 sehingga dapat membantu dalam diagnosis leptospirosis. Tahapan selanjutnya diharapkan

dapat

digunakan

untuk

menentukan

prevalensi

leptospirosis

demi

kepentingan manajemen pengendalian, pencegahan penyakit baik pada manusia maupun

19

hewan. Deteksi dini juga diharapkan mampu mengurangi kejadian

leptospirosis

di

masyarakat.

20

BABll STUDI PUSTAK A A. Leptospirosis

Leptospirosis dicirikan dengan gejala klinis yang bervariasi mulai dari ringan hingga flu like illness hingga kondisi akut. Leptospirosis dapat berefek patogenik ataupun saprofitik. Infeksi endemic terutama teljadi pada daerah tropis dan subtropics, baik. manusia ataupun hewan dapat terifeksi secara langsung melalui kontak langsung dengan jaringan terinfeksi atau urin atau secara tidak langsung dengan tanah dan air yang terkontaminasi. Leptospirosis pada manusia timbul dengan menunjukkan 2 gejala klinis yang spesifik yaitu anicteric atau jinak dan icteric yang lebih dikenal dengan weil disease. Kebanyakan kasus leptospirosis didiagnosis secara serologis. Antibodi dapat terdeteksi di darah kira-kira pada

5-7

hari setelah

menunjukkan gejala klinis , microscopic agglutination test hingga saat ini masih merupakan metode yang paling dipercaya hingga saat ini. Pengobatan leptospirosis tergantung pada gejala klinis yang tampak, spesifik antibiotic treatment yang digunakan adalah doxycycline (100 mg dua kali sehari selarna antibiotik secara intravena seperti penicillin ·

G,

7

umwn

hari). Pernberian

amoxicillin, ampicillin atau

erythromycin dapat diberikan pada beberapa kasus yang serius B. Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) tetdiiji'��H� il ·g�''i8J1g�iih}ut .a�k>t�g�allGJ.ertania : · ehingga al! yang adalah deg��asi·dari·:dSpff,A::. pada· ·9s 6���;.:.· ·-�· ·

terpisah �Ptitri� .dap¥) ;m¥n8!lmplifi�F ;Je�bali pada·.:·slibil�-� yang ·1e�11i�--rend� t ; silh,,li P;i¢n�.sfttiJpai .!Pi.�� qap�� dan ni,�iUill�!:J�r;e��i'-� � � ei®t�i::,.;:y�g ; bii.f��-)R�mMii�t suh�·· �¢ali£.�2' ;/y�g·;t 9�P�t;i"Bervaii�s' :,.:(1¢�����:: •' i�a� ' ·.:pf · fiiief:'da�·�::�6.ii$�1J.tr�i yang t iil!bang��!�a .. saaJ rn·�il1I!il:1�§9,hu, optunal : :avnealin_ g · ·· adal3.Jl suhu digunakan�): Pit Ieleh (Tmfa�.:�J?nm�,.�r.;al!�aii terakhir:a�\r3,glplifikasi P�--PNA _adai��elongasi .. Pro ��s. :i· J;li."41:r���· 4�n��ff,,�·epggoo��-:1��·:f?Jii?\:J)oiitn;¢i���.-' ��d#·s\WW7 · �:·�--� 9;; ·, y(l�tu. !#. ·�· e �¢f.j� '9P#.m subti': H]:!1��¢f).ii . t i '. ·

.

.

..•

21

C. Elektroforesis Gel Agarose Elektroforesis merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memisahkan dan atau melakukan karakterisasi dari suatu partie} berdasarkan rnigrasi spesifik partikel tersebut dalam

lir;gkm1gan

memisahk:an

listrik

Elektroforesis

gel

agarose

merupakan

metode

tmtuk

dan memvisualisasikan fragmen DNA, dimana terjagi proses migrasi

dari

fiagmen DNA di dalam gel yang direndam dalam larutan buffer TBE. Fragmen DNA dipisahkan berdasarkan muatan dan ukurannya, dengan melewatkan DNA melalui matriks

gel

agarose yang diletakkan dalam medan listrik (Subagiyo, 2006). Fragmen

DNA yang lebih kecil berat molekulnya

akan bergerak lebih cepat daripada molekul

DNA yang besar. Petjalanan molekul DNA di dalam gel mengikuti arus listrik dari kutub negative menuju kutub positif Semakin besar tegangan

arus

listrik,

perjalanan molekul

DNA akan semakin cepat, demikian pula sebaliknya (Sulandari dan Zein, 2003; Devlin, 2006).

D.

Cloning Gen

:.t

Plasmid pET SUMO Vektor plasmid yang digunakan dalam penelitian ini adalah

The Champion™pET

SUMO Protein Expression System, yang dapat digunakan untuk ekspresi, purifikasi, dan generasi dari native protein pada memfasilitasi kloning

E. coli.

Vektor plasmid pET SUMO dirancang untuk

dari produk PCR untuk ekspresi pada E. coli. Komponen vektor

plasmid pET SUMO dan peta plasmidnya dapat dilihat pada Gambar 10 (Invitrogen, 2010). Plasmid

pET

SUMO menyediakan tempat insersi produk PCR yang langsung ke

dalam plasmid. Enzim

Taq polymerase

menghasilkan tambahan

single deoxyadenosine

(A) ke ujung 3' dari produk PCR. Vektor plasmid pET SUMO memiliki residu

deoxythymidine (T) pada

single

ujung 3' sehingga insert PCR dapat diligasi dengan efisien ke

dalam plasmid (Invitrogen. 2010).

22

pET SUMO 5643 bp Cann,...,. brpf.'f

S$�n"dooS-

$\JMO

'rt prcrn I- tirdng!SIIIIlf�St.bZGSZS:I-:!611 ·�IIJII ·� ATG ,b.l - 2!11·21111 lliiG •li'C9'1· b.>oos ��i9 SUMOORJ': bZaS lSOl!� S,,U,f() ioMord ;nn ngs4o: b3:;u 5l9 ..S/1 TJI CIO��: b- «>1 1 (iS� n-- .,m,ingst.. b.l•�·r�·� CC) T1llO<mn::o:xr;b.>too7�m .I(.Jrumjdn�ti...,..��574 locJ OR!': - 43SS. SQ4 tCl (C)';CO�tt.r/ S'nind

Gambar 1. Peta vektor plasmid pET SUMO (Invitrogen, 2010). 3'

Gambar 2. Cloning site dari produk PCR ke vek:tor plasmid pET SUMO (Invitrogen! 201 0). 3.

Escherichia coli BL21 sebagai inang dalam cloning Escherichia coli strain BL21 sering digunakan dalam penelitian sebagai inang

untuk overproduksi protein dari gen klon. Ada dua strategi yang sering digunakan yaitu gen target yang dioverekspresi (langsung atau tidak langsung) dengan induksi suhu oleh promotor phage

I atau induksi dengan IPTG promotor lac dan variannya (Bhandari

andGowrishankar, 1997). Plasmid rekombinan ditransfer ke strain

E. coli yang

mengandung kopi kromosom gen untuk T7 RNA polimerase {T7 gen 1) untuk memproduksi protein. Inang yang biasanya digunakan adalah bacteriophage DE3

23

lysogens, derivate lambda yang memiliki daerah imunitas phage fragmen DNA

yang mengandung gen

lac

I, promotor

21

lacUV5, dan gen

mengkodeT7 RNA polimerase. Fragmen ini disisipkan ke dalam gen mencegah DE3

dan membawa

inti

yang untuk

dari integrasi ke dalam atau keluar dari kromosom tanpa helper phage.

Sekali DE3 lysogen dibentuk, hanya promotor lacUV5 yang dapat mengenali transkripsi langsung gen T7 RNA polimerase, yang diinduksi oleh IPTG. Penambahan IPTG untuk menumbuhkan k:ultur lysogen menginduksi produksi T7 RNA polimerase yang kembali mentranskripsi DNA target pada plasmid. Strain DE3 lysogen dipilih antara lain untuk wjuan

defisiensi

protease,

amino

acid

auxotrophy,

dan peningkatan solubilitas

(kelarutan). 3. Transformasi Transformasi adalah proses memasukkan DNA ke dalam sel bakteri. Sel bakteri yang memiliki kemampuan untuk memasukkan DNA ke dalam dirinya disebut sebagai sel kompeten.

Escherichia

coli

merupakan sel inang yang umumnya digunakan untuk

penelitian DNA rekombinan. Untuk dapat melakukan transformasi secara efisien, bakteri E. coli hams mengalarni perlakuan fisik atau kimiawi tertentu yang akan meningkatkan kemampuannya untuk memasukkan DNA. Masuk nya DNA dengan cara memperlakukan sel menggunakan larutan

CaCI 2dingin diikuti dengan paparan suhu tingi (42°C) yang

dapat menyebabkan perubahan permeabilitas dinding sel bakteri. Plasmid masuk ke dalam sel melalui dinding sel yang telah terbuka. Probabilitas masuknya plasmid ke dalam sel kompeten yang dapat dicapai, yaitu satu sel tertransformasi di antara 1000 sel dengan metode ini

E.

(Brown, 1990; Glick and Pasternak, 1994).

Sekuensing Selcuensing DNA meliputi beberapa metode dan teknologi yang digunakan

untuk menentukan urutan basa nukleotida berupa adenin, guanin, sitosin dan timin pada suatu molelcul DNA Pengetahuan mengenai sek:uen DNA menjadi sangat penting dalam

penelitian biologi dasar biologi forensik

dan

dan beberapa bidang terapan seperti diagnostik, bioteknologi,

biologi sistematik (Petterson et

at.,

2009). Ada dua metode yang

24

dapat digunakan untuk sekuensing DNA yaitu metode degradasi kimia (Metode Maxam­ Gilbert)

et

a/.,

dan metode terminasi rantai 1 977).

Dewasa

(metode Sanger) (Maxam dan Gilbert, 1977� Sanger

ini, hampir semua sekuensing DNA dilakukan dengan

menggunakan metode terminasi rantai dimana metode ini melibatkan terminasi atau penghentian

reaksi

sintesis DNA

in vitro

yang

spesifik untuk

sekuen

tertentu

menggunakan substrat nukleotida yang telah dimodifikasi (Pettersen et al., 2009).

F. Elekroforesis Protein Protein dapat dipisahkan dengan metode elektroforesis. Gel yang dipakai poliakrilamid kemudiandiberi pewamaan comassie blueatau untuk memperoleh basil yang lebih sensitif dapat digunakan pewarnaan silver. Protein dielektroforesis pararel dengan standar protein marker. Hasil elektroforesis protein dibandingkan dengan marker protein sesuaidengan berat molekulnya

(Wong, 2006). Polyacrilamide gel electrophoresis(PAGE) berfungsi untuk menganalisa ekspresi gen. Protein rekombinan yang dipoduksi melalui kloning, diidentifikasi dari pita protein yang terbentuk dibandingkan dengan kontrol (transforman tanpa insert gen). Hasil ekstrak sel pasti banyak mengandung protein-protein lainnya, sehingga ketika gel diwarnai diperoleh pita-pita banyak dan smear. Maka dari itu protein perlu dipuriftkasi hila menginginkan basil protein berupa antigen atau antibodi (Wong, 2006).

G.

Imunobloting atau Western Blotting

Imunobloting atau

Western blotting

merupakan metode ide·ntifikasi menggunakan

antibodi untuk mendeteksi keberadaan antigen pada matrik padat seperti kertas filter (Abbas

et a!. , 2007). Imunobloting

digunakan untuk identifikasi keberadaan antigen atau

antibodi. Protein atau antigen yang spesifik terdeteksi dengan pengujian menggunakan antibodi yang mampu bereaksi dengan protein yang telah dipisahkan berdasarkan berat 25

molekul

dan muatan protein melalui elektroforesis dalam gel seperti poliakrilamid.

Protein setelah dielektroforesis menggunakan Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide

Gel Elektrophoresis, kemudian ditransfer pada membran nitroselulosa (blots) dengan cara transverse electrophoresis, dan dideteksi menggunakan antibodi spesifik yang telah dilabel (Roitt, 1993; Janeway

et a/., 200 1).

26

BAB ID MATERI DAN METODE

A. MATERI

Alat Alat utama yang diperlukan dalam penelitian ini adalah sentrifus, penangas air, mesin thermal cycler (Infinigen), transilluminator ultra violet, elektroforesis horizontal apparatus (Bio-Rad), elektroforesis vertical apparatus (Bio-Rad), mikropipet, Erlenmeyer (Iwaki Pyrex), plate (Iwaki Pyrex), tabung reaksi (Iwaki Pyrex), konikel, inkubator shaker 37°C, inkubator 37°C, dan blotter.

Bahan

Bahan penelitian yang digunakan adalah isolate reference Leptospira interogans serovar icterohaemorhagie yang diperoleh dari dr. Bambang Isbandrio, SpPD. Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro Semarang, kit isolasi DNA (Genomic DNA mini kit Geneaid).

pnmer

spesifik

outer

membrane

protein

LipL32

yaitu:

5'­

CTAAGTICATACCGTGAT TI-3 ' (forward), 5'-ATTACTIAGTCGCGTCAGAA-3'

(reverse), Champion™pET SUMO Protein Expression System, One Shot® Machi ™- T1 Chemically Competent E. coli, GeneJel111 Plasmid Miniprep Kit (Fermentas), Kit komersial PCR Mix K.APA 2G Fast readymix with loading dye (Geneaid), agarose (Invitrogen), marker DNA lOObp (invitrogen), Good view (SBS), Broad way prestained protein marker (Intron), IPTG (Sigma), kanamycin sulfat (Invitrogen), LB agar (Sigma), Tryptone (Sigma), Yeast Extract (Sigma), Tris (Nacalai Tesque), NaCl (Nacalai Tesque), TBE (Invitrogen), Glycin (Nacalai Tesque), Metanol, Aquadest steril, nuclease .free water antibody monoclonal anti LipL32 diperoleh dari Kasertsart University Thailand, NBT. 27

BCIP dan WesternBreeze®Chemiluminescent Western Blot Immunodetection Kit.

B.

Metode

Penelitian ini dibagi menjadi tiga betas tahap yaitu (1) Isolasi DNA dari Isolate Reference Leptospira interogans ser icterohaemoraghi (2) Polymerase Chain Reaction (3)Purifikasi Gen (Biobasic Inc) TJR

(4) Ligasi (5) Tahap transformasi One Shot® Machl™­

Chemically Competent E. coli.dan (6) Tahap isolasi plasmid (7) Tahap pengujian gen

insert dalarn plasmid dengan Polymerase Chain Reaction (8) Tahap Sequensing (9) Tahap Transformasi BL21 (DE3) One ShotR Cells (10) Ekspresi Protein (11)

Identifikasi protein

rekombinan dengan Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (12) produksi antibodi poliklonal (13) Jmunobloting. Alur penelitian secara lengkap dapat diiihat sebagai berikut: Isolasi DNA bakteri Leptospira sp.

t Identifikasi dengan elektroforesis horisontal

t Polymerase Chain Reaction dan Purifikasi gel

�

�

(

Isolasi Plasmid

)-__.� (

Sequencing

+ Identifikasi dng elektroforesis horisontal

Transfonnasi BL21 (DE3)

Ekspresi protein

t Ligasi gen LipL32 ke dalam PET Sumo

+ Transformasi One Shot® Machi™-

Identiflkasi dengan SDSPAGE

�

Imunisasi Mencit (Produksi AB Poliklon�n

+

(.....__�] Imunobloting

28

1.

lsolasi DNA dari Isolate Reference Leptospira interogans ser icterohaemoraghi

Isolasi DNA menggunakan Genomic DNA mini kit (Gene Aid) untuk bakteri gram negatif. Tahap isolasi DNA adalah sebagai berikut kultur isolat reference ditransfer hingga 200 ).ll ke dalam 1,5 ml sentrifuge tube kemudian dilanjutkan sentrifus 1 menit dengan kecepatan 14.000-16.000xg, kemudian supernatant dibuang, tambahkan 200 J..tl GT buffer ke dalam tube kemudian resuspensikan pellet cell dengan shaking secara perlahan atau dengan menggunakan pipet, inkubasikan pada temperature ruang selama 5 menit, tambahkan 250 ).ll GB Buffer ke dalam sampel dan campur secara perlahan selama ° 5 detik, inkubasikan pada 60 C selama 1 0 menit sampai lysate bersih (dibolak-balik tiap ° 3 menit), bersamaan panaskan elution buffer pada 70 C, tambahkan 5)11 RNAse untuk membersihkan lysate dan campur dengan perlahan, inkubasikan pada suhu ruang selama 5 menit, tambahkan 200 J.d etanol absolut dan campur selama 10 detik, tempatkan GD colom ke dalam 2 ml collection tube, kemudian masukkan seluruh campuran ke dalam 2 ml collection tube, sentrifuge 14.000 - 16.000 xg selama 2 menit, dan buang supernatan pada collection tube kemudian tempatkan kernbali collection tube, tambahkan 400 ).ll buffer

ke

W1

dalam GD colom, sentrifuse 14.000 - 16.000 xg selama 30 detik, huang

supematan melalui dinding dan tempatkan GD colom kembali ke dalam 2 ml collection tube, tambahkan wash buffer sebanyak 600 J!l

dan sentrifuse

selama 1 menit, sentrifuse

kembali selama 3 menit dengan kecepatan 14.000 - 16.000 xg untu.k mengeringkan matriks, masuk.kan GD colom kering ke dalam 1.5 ml sentriguge tube bersih, tambahkan 100 J!l preheated elution buffer (TE Buffer) pada permu.kaan tengah dari matriks, diamkan 3 menit,

dan

sentrifuse kembali pada 14.000 - 16.000 xg selama 30 detik dan

hasil elusi berupa DNA. 29

2.

Polymerase Chain Reaction Reaksi PCR disiapkan sebanyak 25 111 sebagai berikut:

mix sebanyak 12,5 111,. primer

template sebanyak 1 111, PCR

forward dan backward masing-masing 1 111, dan

ditambahkan ddH20 sebanyak 9,5 111 agar total reaksi PCR menjadi 25 111. Reaksi PCR dimasukkan dalam

thermal cycler dengan program PCR sebagai berikut: tahap persiapan

(predenaturasi) satu siklus pada suhu 94°C selama 5 menit, diikuti 35 siklus untuk denaturasi 94°C selama 1 menit, menit

annealing 53°C selama 45 detik, elongasi 72°C selama 1

dan post elongasi 72°C selama 5 menit. Gel agarose 1% dibuat dengan cara

mencampurkan 0,25 g agarose dengan 25 ml panaskan dengan mikrowave selama

1

Tris Base EDTA (TBE). Campuran di

menit kemudian didinginkan.

Campuran

ditambahkan Goodview kemudian dibiarkan mengeras dalam sumuran. Elekroforesis dijalankan pada tegangan IOOV selama 30 menit. DNA marker yang digunakan adalah 100 bp. Hasil positif dapat dilihat pada transiluminator ultraviolet yang ditandai dengan terbentuknya pita.

3.

Pu rifikasi Gen (Biobasic Inc) Fragmen gen pada gel elektroforesis di potong kemudian ditimbang dan diletakkan

pada 1.5 ml microcentrifuge tube, tambahkan 400-700 111 binding buffer tiap 100 mg slice gel, tempatkan pada EZ- 10 coloum, diamkan selama 2 menit, sentrifuge 10.000 rpm selama 2 menit, huang melalui dinding tabung kemudian tarnbahkan 500 111 wash solution

dan sentrifuge 10.000 rpm selama

1 menit (tahap ini diulang satu kali ) kemudian

tempatkan coloum pada 1.5 ml microcentrifuge dan tambahkan 30 - 50 111 elution buffer pada permukaan tengah dari coloum, inkubasikan pada suhu ruang selama 2 menit

30

lanjutkan dengan centrifuge 10.000 rpm selama 2 menit DNA yang telah terpurifikasi ° dapat disimpan pada -20 C. 4.

Ligasi

Reaksi ligasi dipersiapkan sebanyak 10 Jll dengan komposisi sebagai berikut: Produk PCR fresh sebanyak 5 J.Ll, 1 OX Ligation

Buffer

sebanyak 1 Jll, 2 Jll vektor plasmid pET

SUMO (25 ng/Jll) dan T4 DNA Ligase sebanyak 1 J.d. Reaksi ligasi kemudian diinkubasi pada suhu 4 ° C selama 24 jam.

5.

Tahap transformasi One Shot® l�achJTM..TJR Chemically Competent E. coli. Proses transfonnasi dilakukan dengan mencampurkan 2 J.Ll produk ligasi dan

dimasukkan dalam vial

One Shot® Machl™-TJR Chemically Competent E. coli.

Campuran tersebut dicampur dengan perlahan dan

tidak boleh dipipetting naik turun,

karena kondisi sel kompeten yang masih rapuh sehingga proses pipetting dapat merusak sel kompeten tersebut. Campuran kemudian diinkubasi pada es selama 20 rnl!nit. Campuran

di-heatshock selama

30 detik pada

waterbath

42°C tanpa

shaking,

kemudian

vial langsung dipindahkan ke es selama kurang lebih 2 menit. Vial kemudian ditambahkan

Super Optimal Broth

(SOC) medium dengan suhu ruangan sebanyak 400

J.LL Vial ditutup dengan rapat kemudian digoyang secara horizontal (200 rpm) pada

inkubator

shaker dengan suhu 37°C selama

1 jam. Hasil transformasi sebanya.k masing­

masing 200 J.Ll kemudian dituang pada 2 plat LB yang mengandung kanamycin. Plat selanjutnya diinkubasi pada inkubator dengan suhu 37°C selama 24 jam.

31

6.

Tahap isolasi plasmid Hasil transformasi positif dihmju.kkan dengan adanya pertumbuhan koloni pada

plat LB. Sebelum isolasi plasmid, koloni

dari LB padat direkultur terlebih dahulu ke LB

cair. Proses rekultur koloni bakteri yang tumbuh dari

LB plat ke LB cair yaitu dengan

cara koloni bakteri masing-masing diambil dan dikultur pada

5

mengandung kanamycin. Tiap koloni bakteri dikultur ke tabung

ml media

LB cair yang

LB cair secara terpisah.

Tabung kemudian diinkubasi pada inkubator shaker 37°C selama semalam dengan posisi tabung miring. Proses isolasi plasmid dimulai dengan melakukan sentrifus media LB cair selama

1 0 menit dengan kecepatan 6000 g.

dan pelet diresuspensi dengan

111 Lysis Bzif.fer dan

balikan tube sebanyak

dan

TM

4-6

x,

350

Supernatan kemudian dibuang

f.d Resuspension solution, kemudian ditambahkan 250

dicampur dengan pelan selama

dan tampak cerah, tambahkan

Gene Jet

250

5 ml kultur E. coli dari

Jll

4-6

menit hingga larutan bercampur

neutralization solution, campur dengan membolak­

sentrifuse selama

5

menit masukkan supernatan ke dalam

spin colown (hindari pipetting white precipitate), sentrifuse selama 1 menit

huang supernatant, tambahkan

500 111 wash solution

sentrifuse selama 1 menit

(ulangi sebanyak 1 kali), dilanjutkan dengan sentrifuse 1 menit, letakkan spin coloum ke dalam

microcentrifuge tube,

pada suhu ruang selama

tambahkan

50 111 elution buffer

kemudian diinkubasikan

2 menit, sentifuse selama 2 menit, hasil yang didapat berupa

Purified plasmid DNA.

32

7.

Tabap pengujian gen insert dalam plasmid denganPolymerilse Chain Reaction

Reaksi PCR disiapkan sebanyak 25 fll sebagai berikut: template sebanyak 1 )ll, PCR mix sebanyak 12,5 fll, primer forward dan backward masing-masing

1

Ill, dan

ditambahkan ddH20 sebanyak 9,5 fll agar total reaksi PCR menjadi 25 Jll. Reaksi PCR dimasukkan dalam thennal cycler dengan program PCR sebagai berikut: tahap persiapan (predenaturasi) satu siklus pada suhu 94°C selama 5 menit, diikuti 40 siklus

untuk

denaturasi 94°C selama 1 menit, annealing 55°C selama 45 detik, elongasi 72°C selama 1 menit dan postelongasi 72°C selama 1 menit Gel agarose 1 % dibuat dengan cara mencampurkan 0,25 g agarose dengan 25 ml Tris Base EDTA (TBE). Campuran

di

panaskan dengan mikrowave. selama 1 menit kemudian didinginkan. Campuran ditambahkan Goodview kemudian dibiarkan mengeras dalam sumuran. Elekroforesis dijalankan pada tegangan

IOOV

selama 30 menit DNA marker yang digunakan adalah

100 bp. Hasil positif dapat dilihat pada transiluminator ultraviolet yang ditandai dengan terbentuknya pita.

8.

Tahap sekuensing

Sekuensing DNA dilakukan di PT. 1st BASE Sequencing dengan menggunakan metode Sanger (metode terminasi rantai). Sekuensing DNA dilakukan dengan dua kali reaksi menggunakan primer Lip L32 forward dan reverse masing-masing dengan konsentrasi 1 0 pmol. Basil PCR digunakan sebagai cetakan untuk reaksi selruensing. Komposisi reaksi sekuensing DNA terdiri dari produk PCR, enzyme Taq Polymerase, primer, dNTP dan. ddNTP. Kondisi reaksi sekuensing DNA yaitu tahap persiapan (predenaturasi) satu siklus pada suhu 94°C selama 5 menit, diikuti 40 siklus untu.k 33

denaturasi 94°C selama 1 menit, annealng55°C i selama 45 detik, elongasi 72°C selama 1 menit dan postelongasi 72°C selama 1 menit 9.

R Tahap Transformasi BL21 (DE3) One Shot Cells

Masukkan

l-5J.1l plasmid DNA ke dalam tiap vial BL2 l(DE3) One ShorR Cells dan campur

secara perlahan dengan menggunakan tip micropipet tetapi jangan di pipet naik dan turun. Inkubasikan dalam es selama 30 �enit kemudian pindahkan sel dalam incubator 42 °C tanpa shaking, kemudian transfer tube ke dalam es, tambahkan 250 J.ll SOB mediwn , tutup rapat tube kemudian diinkubasikan selama 37°C selama I jam dengan kecepatan shaker 200 rpm, tumbuhkan selama 24 jam pada suhu 37 ° C dengan shaking (pada ta.hap ini digunakan 4 vial

BL21 (D£3) One Shot Cells). 10.

Ekspresi Protein Ino.kulasikan 1000 J.ll overnight kultur basil transformasi dalam 20 ml LB cair media

yang mengandung kanamycin kemudian tumbuhkan selama 24 jam pada inkubator shaker 37°C, kemudian kultur dibagi menjadi 2 masing-masing sebanyak 10 m1 dan tambahkan pada salab satu tabung

IPTG sampai mencapai konsentrasi 1 mM. kemudian dilakukan pengukuran optical

density (OD) protein hingga mencapai nilai 0.600, kemudian sentrifuse untuk m.endapatkan pellet yang digunakan sebagai sampel Pada pellet kemudian ditambahkan 200

J.ll

PBS kemudian

tambabkan 20 J.ll lysosime dan diinkubasikan pada waterbatb selama 30 menit pada suhu 37°C dilanjutkan freeze ke dalam N2 cair selama 30 menit ta.hapan ini diulang sebanyak 3 kali. Sentrfifuse dilakukan pada kecepatan 10.000 rpm dan diambil supernatant sebagai sampel protein Protein diidentifikasi dengan menggunakan elektroforesis protein.

34

11.

ldentifikasi

protein

rekombinan

dengan

Sodium

Dodecyl

Sulphate­

Polyacrylamide Gel Electrophoresis Protein rekombinan dipisahkan dengan 12% SDS-P AGE menurut metode Laemmli (1 970) dengan alat elektroforesis. Gel poliakrilamid 12% dituang pada plat dan diratakan pennukaana ny dengan butanol, setelah gel berpolimerisasi, butanol dibuang dan gel dicuci dengan

aquadest. Stacking gel (3%) dituang di

untuk membuat sumuran, setelah

aparatus elektroforesis.

stacking gel

berpolimerisasi, plat dirangkai dengan

Bufer elektroda dituang ke dalam tangki dan sisir diangk:at

Sampel ditambah sampel buffer

(4

:

1 ) direbus

dalam air mendidih selama 2 menit.

Sampel masing-masing sebanyak 20J.Ll dan protein dimasukkan ke dalam sumuran stacking gel. Aparatus

power supply front,

atas gel, selanjutnya sisir dipasang

marker

(intron) sebanyak: 10 J.U

elektroforesis d.ihubungkan dengan

(100 volt selama 2 jam) untuk dielektroforesis. Setelah sampel mencapai

gel diambil

dan

diwarnai dengan

commasie brilliant blue

R.250 0,2 % selama

semalam. Gel yang telah diwamai dibersihkan denga.n larutan

destaining

hingga

transparan dan disimpan dalam asam asetat 10%. 12.

Imunisasi.

Crude

protein LipL32 sebanyak 5 Jlg/Jll dilarutkan dalam akuabides steril dan

diemulsikan dengan

Freund's complete adjuvant

(perbandingan 1 : 1) untuk penyuntikan

pertama, sedangkan untuk penyuntikan kedua dan seterusnya digunakan

adjuvant.

incomplete

Emulsi disuntikk:an pada rongga peritoneum dari menct i Balb/C betina umur

8-10 minggu denganjarum 25

gauge. Penyuntikan

diulang 5 kali dengan interval waktu

14 hari.

35

13.

Imu1wbloting

Holzel blotter dibasahi dengan buffer blotting dan dilapisi dengan kertas whatman sebanyak

4

lembar yang telah dibasahi dengan

yang telah dibasahi dengan

buffer blotting

buffer blotting.

Membran nitroselulose

diletakkan pada tumpukan kertas whatman.

Gel poliakrilamid diletakkan di atas membran dan diberi penanda denganj arum 20 gauge sebagai orientasi letak sampel. Gel kemudian ditutup dengan kertas whatman telah dibasahi dengan

buffer blotting. Blotter

blotter.

ditutup dengan penutup

protein dilakukan pada red current menunjukkan angka

500,

5

2 kali, ink.ubasikan dengan antibody

kali, inkubasikan dengan 10 ml secondary antibody selama

kemudian cuci membrane selama

transparan

ml blocking

24 jam dilanjutkan dengan pencucian dengan antibody wash selama 5

menit sebanyak

sebanyak

10

30 menit dengan menggunakan rotary shaker, cuci

membran dengan 20 ml air selama 5 menit sebanyak primer selama

Transfer

selama 1-2 jam, kemudian

dilanjutkan dengan meletakkan membran pada disc yang telah berisi solution, inkubasikan selama

4 lapis yang

30 menit

5 menit dengan 20 ml antibody wash selama 2 menit

3 kali kemudian membrane yang telah dicuci diletakkapan pada plastic kemudian

chemilluminescent

dengan

substrat

menggunakan

hilangkan

ekses

mikropipet

tambahkan

chemiluminescent

substrat

2�5

ml

dengan

menggunakan paper pada kit, kemudian tutup permukaan membrane dengan transparan plastic,

dan membrane siap untuk proses luminography

36

BAB IV BASIL DAN PEMBABASAN 1.

Isolasi DNA dan Polymerase Chain Reaction DNA dari isolatreference diisolasi dengan menggunakan genomic DNA mini kit dan

hasil isolasi digunakan sebagai template untuk proses PCR. Reaksi PCR disiapkan sebanyak 25 Jll sebagai berikut: template sebanyak 1 Jll, PCR

mix

sebanyak 12,5 �1,

primer forward dan backward masing-masing 1 Jll, dan ditambahk:an dd.H20 sebanyak 9,5 Jll agar total reaksi PCR menjadi 25 Jll. Reaksi PCR dimasukkan dalam thermal

cycler dengan program PCR sebagai berikut: tahap persiapan (predenaturasi) satu siklus pada suhu 94°C selama 5 menit, diikuti 35 siklus untuk denaturasi 94°C selama 1 menit,

annealing 53°C selama 45 detik, elongasi 72°C selama

1

menit dan post elongasi 72°C

selama 5 menit. Gel agarose 1% dibuat dengan cara mencampurkan 0,25 g agarose dengan 25 ml Tris Base EDTA (TBE). Campuran di panaskan dengan mikrowave selama 1

menit kemudian didinginkan. Campuran ditambahk:an Goodview kemudian dibiarkan

mengeras dalam sumuran. Elekroforesis dijalankan pada tegangan

lOOV

selama 30 menit.

DNA marker yang digunakan adalah 100 bp. Hasil positif dapat dilihat pada transilurninator ultraviolet yang ditandai dengan terbentuknya pita. Hasil

elektroforesis

dari PCR pada penelitian ini menunjukkan pita dengan panjang 819 bp, dapat dilihat pada Gambar 3.

37

600

100

Gambar 3. Hasil amplifikasi PCR gen LipL32 pada gel agarose dengan konsentrasi 1%. Keterangan: Marker 1 00 bp (M), hasil negatif ampliftkasi gen dengan menggunakan DNA total Leptospira interogans ser. Bataviae (lajur 1 dan 2, hasil positif ampliftkasi gen dengan menggunakan DNA total interogans ser. Icterohaemoraghie (lajur 3 dan lajur 4).

Leptospira

Hasil PCR kemudian dipuriftkasi dengan menggunakan purifikasi gel (Biobasic Inc)

untuk selanjutnya digunakan dalam proses ligasi ke dalam pET SUMO. 2.

Ligasi

Proses selanjutnya ada1ah proses ligasi, yaitu menyambungkan gen yang diinginkan ke dalam vektor dengan bantuan enzim ligase. Vektor yang digunakan dalam kloning ada beberapa macam antara lain vektor plasmid,

Chromosomes

(BAC), dan

bacteriophage,

Yeast Artificial Chromosomes

kosmid,

Bacterial Artificial

(YAC). Pemilihan vektor

didasarkan pada ukuran gen yang akan di.klon (Russell dan Sambrook, 2001). Pada penelitian ini vektor yang digunakan adalah vektor plasmid.. Vektor plasmid yang digunakan dalam penelitian

ini adalah pET SUMO. Salah satu aspek yang penting dalam

melakukan proses ligasi adalah mengatur temperatur yang optimal. Kebanyakan proses 38

ligasi menggunakan T4 DNA Ligase (diisolasi dari

bacteriophage T4),

yang

aktif pada

temperatur 25°C. Namun demikian, temperatur optimal yang efisien untuk ligasi dengan vektor plasmid yang memiliki

cohesive-ended fragment (sticky end)

membutuhkan

keseimbangan antara suhu optimal enzim dan Tm yang juga suhu armealing dari

sticky

end yang diligasi.

Jika suhu yang dipakai melebihi Tllb pasangan homolog dari sticky

tidak akan stabil

karena suhu yang tinggi mengganggu ikatan hidrogen. Reaksi ligasi

paling efisien jika

sticky end telah menempel

ujung yang menempel

overhang,

end

dengan stabil dan adanya gangguan pada

akan menyebabkan efisiensi ligasi yang rendah. Semakin pendek

semakin rendah Tm yang digunakan. Umumnya 4-basa

overhang memiliki

Tm

antara 12-l6°C (Tabor, 2001 ). Reaksi ligasi pada penelitian ini diinkubasi pada temperatur 4oc selama semalam (24 jam) pada refrigerator Produk ligasi ini selanjutnya ditransfonnasi pada plat E.

3.

coli yang kompeten.

Tahap transformasi One Shot® Maclzl™-Tl R Chemically Competent E. coli.

Umumnya penelitian mengenai kloning menggunakan vektor plasmid dan E.coli sebagai sel hospesnya. Plasmid vektor dan

E. coli

banyak digunakan oleh karena mudah

diadaptasikan, mudah didapat, dan organisme rekombinan ini dapat tumbuh secara cepat dengan peralatan minimal .

Origin of replication

membantu plasmid DNA bereplikasi

secara independen tanpa dipengaruhi oleh replikasi kromosom sel bakteri itu sendiri (Hanahan, 1983). Pada penelitian ini sel kompeten yang digunakan adalah

Chemically Competent

E.

coli.

Mach

1

Transformasi memiliki pengertian dimana material

genetik eksogenous dimasukkan ke dalam sel bakteri. Ada beberapa metode dalam proses transfonnasi, antara lain dengan senyawa kalsium klorida, elektrotransformasi (Russel

dan

heat shock,

maupun dengan

Sambrook, 2001 ). Pada penelitian ini metode yang

39

digunakan adalah metode

heat shock karena

vektor plasmid yang digunakan yaitu pET

SUMO merupakan plasmid sirkuler. Transformasi biasanya menghasilkan campuran sel bakteri yang telah mengalami transfonnasi

dan

mengandung plasmid rekombinan serta

sekumpulan sel yang tidak mengalami transformasi. Sebuah rnetode diperlukan untuk menyeleksi sel bakteri yang mengandung plasmid rekombinan. Plasmid membawa marker yang spesifik dimana sel yang tidak mengandung plasmid rekombinan dapat mati atau pertumbuhannya terhambat. Resistensi terhadap antibiotik tertentu merupakan indikator

yang paling

sering

digunakan

untuk

bakteri yang membawa plasmid

rekombinan, karcna plasmid memiliki gen yang resisten terhadap antibiotik tertentu. Selsel bakteri lain yang tidak mengalami transformasi dan tidak membawa plasmid rekombinan akan bersifat sensitif terhadap antibiotik sehingga hanya bakteri yang telah mengalami transfonnasi yang dapat turnbuh pacta media yang mengandung antibiotik tertentu (Russell dan Sambrook, 2001 ). Antibiotik yang digunakan pacta penelitian ini adalah kanamycin dengan dosis 50

Jlg/ml pada media LB. Proses transformasi

menggunakan media LB padat dalam plat untuk menumbuhkan E. merupakan media yang kaya akan nutrisi, dan

coli.

digunakan secara

Media

umum

LB

untuk

menumbuhkan bakteri. Media LB sudah diformulasikan secara standar untuk kultivasi

coli

E.

sejak tahun 1950an. Media ini sudah digunakan secara luas dalam aplikasi

mikrobiologi molekuler sebagai media preparasi plasmid DNA dan protein rekombinan. Media

LB menjadi media yang paling banyak digunakan di laboratorium untuk

pertumbuhan strain

E. coli

rekombinan (Anonim, 2009). Hasil positif dari proses

transformasi adalah adanya koloni bak:t:eri yang tumbuh pada plat positif dapat dilihat pacta Gambar

4. Hasil transformasi

LB. Hasil transfonnasi

pacta penelitian ini menunjukkan

40

adanya 3 koloni pada plat. Semua koloni yang tumbuh kemudian direkultur ke

LB cair

untuk: selanjutnya diisolasi plasmidnya.

Gambar 4. Hasil pertumbuhan bakteri transforman pada media LB padat. Keterangan: Koloni bakteri transforman ditunjukkan dengan penanda Ll, 12 dan L3.

4.

Tahap isolasi plasmid

Proses selanjutnya setelah transformasi adalah isolasi plasmid. Plasmid yang terdapat dalam sel bakteri diisolasi

untuk selanjutnya diuji apakah gen yang diinginkan ter-insert

ke dalam plasmid. Isolasi plasmid pada penelitian

Miniprep Kit

ini menggunakan

GeneJe1111 Plasmid

(Fennentas), dan diawali dengan rekultur terlebih dahulu. Plasmid yang

mengalami transformasi tidak semuanya mengandung gen

yang diinginkan. Beberapa

plasmid mungkin berhasil dalam proses ligasinya dan gen dapat masuk: ke dalam plasmid, namun beberapa plasmid mungkin juga tidak berhasil dalam ligasi sehingga tidak ada gen yang masuk dalam plasmid. Plasmid-plasmid basil isolasi

ini kemudian diuji dengan

teknik PCR untuk mengetahui apakah gen yang diinginkan ter-insert ke dalam plasmid menggunakan primerforward dan

backwcird dari LipL32.

41

5.

Pengujia n gen insert LipL32 dengan Polymerase Chain Reaction Terdapat beberapa cara pengujian

untuk mengetahui apakah target gen yang

diinginkan terdapat dalam plasmid rekombinan antara lain menggunakan teknik PCR, maupun dengan cara pemotongan plasmid rekombinan menggunakan enzim restriksi. Selanjutnya basil pemotongan ini dielektroforesis untuk melihat panjang gennya. Metode lain untuk: menyeleksi

insert

gen pada plasmid adalah dengan metode

blue-white

screening

menggunakan media yang mengandung X-gal. Plasmid yang mengandung

insert gen

yang diingink:an akan menghasilkan koloni yang berwarna putih, sedangkan

plasmid yang tidak mengandung

insert

berwarna biru karena adanya produksi

gen akan ditunjukkan dengan koloni yang

P-galactosidase

yang fungsiona] (Russell dan

Sambrook, 2001). Pengujian gen insert dalam plasmid pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan teknik PCR. Primer yang digunakan adalah

LipL32

dan

template

forward

dan

reverse gen

yang digunakan adalah plasmid yang sudah diisolasi yaitu Ll-L3.

Hasil PCR selanjutnya dielektroforesis untuk melihat panjang pita yang dihasilkan. Hasil positif dapat dilihat pada transiluminator ultraviolet yang ditandai dengan terbentuknya pita. Hasil PCR dari plasmid dapat dilihat pada Gambar 5

42

Gambar 5. Hasil amplifikasi PCR plasmid gen LipL32 pada. gel agarose dengan konsentrasi 1%. Keterangan: Marker 100 bp (M), Plasmid dari koloni L1 menunjukkan hasil positif dengan terbentuknya pita DNA (lajur 1), Plasmid , dari koloni L2 menunjukkan hasil positif dengan terbentuknya pita DNA (lajur 2), Plasmid dari koloni L3 menunjukkan hasil negatif tidak terbentuk pita DNA (lajur 3).

6.

Tahap sekuensing Sekuensing DNA dilakukan di PT. 1st BASE Sequencing dengan menggunakan

metode Sanger (metode terminasi rantai). Sekuensing DNA dilakukan dengan dua kali reaksi menggunakan primer canine IFN-r forward dan backward masing-masing dengan konsentrasi 10 pmol Hasil PCR digunakan sebagai cetakan untuk reaksi sekuensing. Komposisi reaksi sekuensing DNA terdiri dari produk PCR; enzyme Taq Polymerase, primer, dNTP dan ddNfP. Kondisi reak:si sekuensing DNA yaitu predenaturasi satu. siklus pada suhu 94°C selama 5 menit, diikuti 40 siklus untuk denaturasi 94°C selama 1 43

-

menit,

annealing 55°C selama 45

detik, elongasi 72°C selama 1 menit dan postelongasi

72°C selama 1 menit 7.

Transformasi BL21

(DE3) One Shof Cells dan Ekspresi Protein

Masukkan 1·5� plasmid DNA ke dalam tiap vial BL21(DE3)

One

secara perlahan dengan menggunakan tip micropipet tetapi jangan Inkubasikan

dalam

Shof Cells dan campur

eli

pipet naik dan

turun.

es selama 30 menit kemudian pindabkan sel dalam incubator 42 °C tanpa

shaking, kemudian transfer tube ke dalam es, tambahkan 250 f..l.l SOB medium , tutup rapat tube kemudian diinkubasikan selama 37°C se]ama 1 jam dengan kecepatan shaker 200 rpm, °

tumbuhkan selama 24 jam pada suhu 3 7

C dengan shaking (pada tahap ini digunakan 4 vial

BL21 (DE3) One Shot Cells). Kemudian dilanjutkan dengan ekspresi protein, langkah pertama yang

dilak:ukan

menumbuhkan

untuk

mengisolasi

bakteri E. coli

protein

rekombinan

LipL

32

dengan

cara

BL21 yang telah disisipi gen LipL32 pada plasmid pET

SUMO ke dalam media LB yang mengandung kanamycin, klon protein rekombinan tersebut ditumbuhkan pada suhu 3'flC, kemudian dilak:ukan induksi dengan

IPTG

kemudian dilak:ukan pengkuran optical density hingga 0,600. Optical Density 0,600 dimak:sudkan karena pada OD tersebut

(logarhytmik phase

atau

bakteri telah mencapai fase pembelahan

exponential phase).

Bakteri berkembang biak: dengan berlipat

dua kalinya pada fase ini, jumlah bak:teri meningkat secara eksponensiaL Fase eksponensial berlangsung selama 1 8-24 jam, pada pertengahan fase ini pertumbuhan bak:teri sangat ideal, pembelahan teijadi secara teratur, semua bahan dalam sel berada dalam keadaan seimbang penyandi

LipL32

(balanced growth)

menggunakan

(Syahrurachman

plasmid

pET-SUMO

et a/.,

1994). Kloning gen

sebagai

vektor

untuk

mengekspresikan gen penyandi LipL32. Vektor pETSUMO merupakan derivat pBR322 yang memiliki sifat

low copy number, dan

overekspresi protein .. Pemilihan E. coli mengandung gen

Nucleic Acid

E.coli

vektor ini lebih menitikberatkan pada

sebagai inang unfuk ekspresi disebabkan karena

chromosomal copy untuk T7 Ribo Nucleid Acid polimerase. Ribo

polimerase

bacteriophage

T7

dapat

mentranskripsi plasmid sirkuler

beberapa kali (Sambrook and Russel, 2001; Wong, 2006), sehingga gen LipL32 pada

multiple

cloning site

dapat

diekspresikan

secara

menggunakan promotor T7, gen LipL32 yang terletak

maksimal.

downstream

Sistem

ekspresi

di bawah kendali

44

promotor tidak akan diekspresikan sampai tersedia IPTG. Pemberian IPTG pada media pertumbuhan akan memacu produksi dari T7 RNA polimerase yang berada di bawah kendali promotor lac. Transforman akan mengekspresikan gen yang dimilikinya, jika IPTG ditambahkan untuk: menginduksi T7 RNA polimerase, kemudian berjalan mengenali promotor T7 pada vektor ekspresi untuk memulai transkripsi (Wong, 2006).

i marker yaitu menyeleksi sel bakteri Pemberian ampisilin bertujuan sebagai selectve basil transfonnasi. Selective marker memanfaatkan

keberadaan gen resistensi terhadap

antibiotik yang dimiliki oleh vektor seperti bla coding sequence untuk P-lactamase. Gen resistensi ampisilin mengekspresikan enzim �laktamase. Enzim ini mengkatalisis reaksi hidrolisis pada cincin �laktam sehingga bakteri transforman menjadi resisten terbadap ampisilin (Sambrook and Russel, 2001). Set yang tidak tertransformasi tidak akan mampu hidup pada media yang mengandung antibiotik (Wong, 2006). Proses sonikasi diperlukan untuk memecah dinding sel bakteri transfomian sehingga gen penyandi LipL32 yang terekspresi dapat diperoleh, akan tetapi pada penelitian ini menggunakan enzymatic digestion untuk memecah dinding sel bakteri, dan dilanjutkan dengan sentrifugasi untuk mendapatkan gen LipL32 yang terlarut pada supernatan Protein rekombinan LipL32 kemudian diidentifikasi dengan Sodium Dodecyl Sulphate­

Polyacrylamide Gel Electrophoresis. 8.

ldentifikasi

protein

rekombinan

dengan

Sodium

Dodecyl

Sulphate­

Polyacrylamide Gel Electrophoresi s

Ekspresi protein rekombinan dapat diidentifikasi dengan 12% SDS-PAGE menurut metode Laemmli dengan alat elektroforesis. Identifikasi protein dengan menggunakan SDS-PAGE didasarkan pada mobilitas elektroforesis molekul. Polyac1ylamide Gel

Electrophoresis yang akan memisahkan molekul protein berdasarkan berat molekul dan muatan molekul tersebut. Ukuran pori dari PAGE ditentukan oleh total konsentrasi monomer acrylamide-bisacrylamide (% T) dan konsentrasi cross-linker (% C). PAGE terdiri atas resolving gel dan stacking gel. Resolving gel merupakan polyacrylamide gel

45

dengan ukuran pori yang kecil (3% monomer aery/amide). Makromolekul pada resolving

gel

akan terpisah berdasarkan ukurannya.

Stacking gel

dengan ukuran pori yang besar (4% monomer diinisiasi dengan pemberian

(TEMED).

merupakan

aery/amide).

polyacrylamide gel

Proses polimerisasi gel

ammonium persulfate (APS) dan tetramethylethylenediamine

Konsentrasi APS dan TEMED yang umum digunakan adalah antara 1-10

rnM. Peningkatan konsentrasi APS dan 1EMED akan menurunkan elastisitas gel.

Dodecyl Sulfate adalah senyawa yang digunakan untuk mendenaturasi protein, protein akan menjadi

polypeptida

menggunakan

coomasie brilliant blue.

paralel dengan marker protein. Marker protein dengan ukuran molekul

sehingga

yang tunggal. Sampel protein akan bermigrasi dari

kutub negatif ke kutub positif. Sampel protein yang tel.ah terpisah dengan

Sodium

yang telah

divisualisasikan

Sampel protein bermigrasi secara terdiri dari sejumlah protein standar

diketahui,

sehingga dapat digunakan untuk

menentukan berat molekul protein target. Penentuan ukuran molekul dilakukan dengan menganalisis pita-pita protein yang telah terpisah dengan membandingkan jarak migrasi dengan

fragmen yang telah diketahui pada marker. Hasil

elektroforesis

rekombinan LipL32 pada gel poliakrilamid 12 % disajikan pada Gambar

protein

6.

46

45kDa

34kDa

26.SkDa

Gambar 6. Identifikasi protein rekombinan LipL32 pada SDS-P AGE dengan konsentrasi 12%. Keterangan: Marker (M), Protein rekombinan dari koloni L l dengan induksi IPTG menunjukkan adanya protein rekombinan LipL32 (Lajur

1 ),

Protein rekombinan dari koloni L2 dengan induksi IPTG menunjukkan adanya

dari koloni L l dari koloni L2 tanpa

protein rekombinan LipL32 (Lajur 2), Protein rekombinan tanpa induksi IPTG

(Lajur 3), Protein rekombinan

induksi IPTG (Lajur 4) Profil protein pada lajur

.

1, lajur 2, dan lajur 3 menunjukkan pola pita yang sama

dibandingkan lajur 3. Perbedaan tersebut disebabkan adanya gen pET-SUMO yang mengekspresikan protein rekombinan LipL32

insert

pada plasmid

sebesar 32

k.Da,

sehingga mempengaruhi transkripsi dan translasi plasmid yang dibawa sel inang. Transkripsi menyampaikan informasi genetika dari DNA ke dalam molekul RNA, sedangkan translasi mengkode informasi yang ada di RNA menjadi protein (Yuwono, 2005).

9.

Imunobloting

lmWlobloting atau

western

blotting adalah suatu teknik identifikasi dimana antibodi

digunak:an untuk mendeteksi keberadaan antigen pada matriks padat seperti membran

47

nitroselulose (Abbas

et a/.,

2007). Antibodi mempunyai kemampuan untuk berikatan

dengan berbagai macam antigen termasuk makromolekul dan substansi kimia yang sangat kecil (Abbas and Lichtman, 2009). Antibodi poliklonal adalah antibodi yang mengenal beberapa antigen (Janeway

et al.,

2001). Bagian dari antigen yang dapat

dikenali oleh antibodi dikenal sebagai epitop a tau determinan. Determinan antigen yang _

berbeda-beda dapat dikenali berdasarkan

sequence

(epitop linier) atau bentuk epitop

(konformasi epitop). Epitop biasanya terdiri dari 4-5 asam amino dan beberapa dari epitop tersembunyi di dalam molekul antigen perubahan

physicochemical.

dan dapat terekspose apabila terjadi

Kemampuan interaksi untuk terjadinya pengikatan antara

antibodi dengan satu epitop antigen disebut dengan afmitas (Abbas and Lichtman, 2009). Teknik protein

western blotting yang

terpisah

nitroselulosa Gel protein

atau imunobloting diawali dengan proses mentransfer pita pada

Polyacrilamyde Gel Electrophoresis

dan membran disisipkan

ke

membran

di antara kertas filter, direndam dalam

bufer, dan dialiri listrik, setelah pita protein bermigrasi ke membran, pita tersebut digunakan untuk deteksi imunologi (Wong, 2006). Penggunaan teknik

western blotting

sangat berguna untuk mengetahui keberadan antigen, sehingga dapat diketahui protein yang dihasilkan dikenali oleh antibodi poliklonal anti-LipL32. Antibodi polikonal anti ESA diharapkan dapat mengenali protein rekombinan LipL32

saat imunobloting.

Kompleks reaksi antigen-antibodi yang terbentuk kemudian dibandingkan dengan protein standar (marker) yang telah diketabui berat molekulnya. Antibodi yang spesifik terhadap antigen,

berikatan

hanya

pada

divisualisasikan sebagai pita tunggal

protein

rekombinan

yang

diekspresikan

dan

(Wong, 2006). Hasil transfer membran dari gel

SDS-PAGE ke membran nitroselulose dapat dilihat pada Gambar 7, sedangkan basil

dari

48

visualisasi

® WesternBreeze Chemiluminescent

Western

Blot

Immunodetection

dengan menggunakan antibodi poliklonal anti LipL32 dapat dilihat pada Gambar

Kit

8.

Gambar 7. Transfer Blotter dari gel SDS-PAGE menuju membrane nitroselulose. Keterangan: Marker (M), Protein rekombinan dari koloni Ll dengan induksi IPTG menunjukkan adanya protein rekombinan LipL32 (Lajur I), Protein rekombinan dari koloni L2 dengan induksi IPTG menunjukkan adanya protein rekombinan LipL32 (Lajur 2), Protein rekombinan dari koloni Ll tanpa induksi IPTG

(Lajur 3), Protein rekombinan dari koloni L2 tanpa induksi

IPTG (Lajur 4).

49

® Gambar 8. Hasil imunobloting dengan menggunakan WesternBreeze Chemiluminescent Western Blot Immunodetection Kit. Keterangan: Marker (M),

Protein

rekombinan dari koloni L l dengan induksi IPTG menunjukkan adanya protein rekombinan LipL32 (Lajur 1), Protein rekombinan dari koloni L2 dengan induksi IPTG menunjukkan adanya protein rekombinan LipL32 (Lajur 2), Protein rekombinan dari koloni L1 tanpa induksi IPTG (Lajur 3), Protein rekombinan dari koloni L2 tanpa induksi IPTG (Lajur 4) . . Protein

rekombinan yang dihasilkan

setelah direaksikan dengan antibodi

poliklonal anti LipL32 tidak menunjukkan adanya pita yang bereaksi positif dengan antibodi poliklonal yang digunakan, hal ini kemungkinan besar disebabkan karena pengenceran antibodi poliklonal yang terlalu tinggi yaitu 1 : 1000, ataupun juga karena terlalu

lama

terekspose

dalam

chemiluminecance

substrat,

kemudian

dilakukan

pengulangan kembali proses imunobloting dengan menggunakan antibodi monoklonal anti-LipL32 dengan pengenceran 1 : 10 dan dapat dilihat pada gambar 9, sebehnn proses imunobloting diawali dengan identifikasi menggunakan SDS-PAGE 12 %.

50

Gambar 9. Hasil imunobloting pada membrane nitocelulose dengan menggunakan antibodi

monoklonal

rekombinan

anti

LipL32.

Keterangan:

Marker

(M),

Protein

dari koloni L l dengan induksi IPTG menunjukkan adanya protein

rekombinan LipL32 (Lajur 1), Protein rekombinan dari koloni L2 dengan induksi IPTG menunjukkan . adanya protein rekombinan LipL32 (Lajur 2), Protein rekombinan dari koloni L1 tanpa induksi IPTG (Lajur 3), Protein rekombinan dari koloni L2 tanpa induksi lPTG (Lajur 4), Protein rekombinan dari koloni Ll dengan induksi IPTG menunj ukkan adanya protein rekombinan LipL32 (lajur 5) ·

51

-:­

� � -= �

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A.Kesimpulan Berdasarkan penelitian dapat disimpulkan bahwa

hasil penelitian menunjukkan

panjang gen penyandi protein LipL32 telah berhasil diampliflkasi deng'"an panjang 819 bp dan

berat

protein LipL32

yang diekspresikan sebesar 32 kDa, protein berhasil diidenti:fikasi dengan

menggunakan SDS-PAGE dan imunoblotting dengan menggunakan antibodi monoklonal anti LipL32

B.Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang berbagai protein yang terkait dalam proses patogenesitas dari Leptospira sp., sehingga kedepannya dapat dikembangkan sebagai kandidat kit diagnostik ataupun kandidat vaksin.

52

-

BAB VI DAFTAR PUSTAKA Abbas, A. K., Lichtman, A. H., and Pober, J. S. 2007. Cellular and Molecular Immunology. 4th ed. W.B. Saunders Company, Philadelphia. Anonim0• 2009. Commonly used bacterial E.coli growth media. Expression Technologies · Inc. http://www.exptec.com/Reagents/Common%20Media. htm. Diakses tanggal 1 5 Agustus 2011. Chalayon, P., Chanket, P., Boonchawalit, T., Chattanadee, S., Srimanote, P., Kalambaheti, T. 2011. Leptospirosis Serodiagnosis by ELISA based on Recombinant Outer Membrane Protein. Transactions of The Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. p 289-197. Faine, S., Adler, B., Bolin, C., Perolat, P. 1999. Leptospira and Leptospirosis. Medischi:Melboume Australia. Guerreiro, H., Croda, J., Flannery, B., Mazel, M., Matsunaga, J., Reis, M.G., Levett, P.N., Ko., A.I., and Haake, D.A. 2001. Leptospiral Proteins Recognized during thr humoral Immune Response to Leptospirosis in Humans. Infection and Immunity, 69(8). 4958-4968. Haake, D.A., Chao, G., Zuerner, R.I., Barnett, J.K., Barnett, D., Mazel, M., Matsunaga, J., Levett, P.N., Bolin, C.A 2000. The Leptospiral Major Outer Membrane Protein LipL32 Is a Lipoprotein Expressed during Mammalian Infection. Infection and Immunity. p 2276-2285 Hoke, D.E., Egan, S., Cullen, P.A., Adler, B. 2008. LipL32 Is an Extracelluer Matrix­ Interacting Protein of Leptospira spp. And Pseudoalteromonas tunicate. Infection and Immunity. p 2063-2069. Invitrogen. 2010. User Manual, Champion™ pET SUMO Protein Expression System. Manual Part No. 25-0709. Lin,

X.,

Sun, A., Ruan, P., Zhang, Z., Yan J. 201 1 . Characterization of Conserved Combined T and B cell Epitopes in Leptospira interrogans Major Outer Membrane Protein OmpLl and LipL4 1. BMC Microbiology.

t Sambrook, J. and Russel, D.W. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual. 3 h edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Syarurachman, Agus., Staf pengajar Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran. Bina Rupa Aksara. Jakarta.

53

Tabor, S.. DNA ligases. Chapter in:

Current Protocols in Molecular Biology,

Book 1.

2001: Wiley Interscience WHO. 2003 .

Human Leptospirosis:

Guidance for Diagnosis, Surveillance and Control.

ILS. WHO. 2010. Report of The First Meeting of The Leptospirosis Burden Epidemiology

Reference Group. Geneva.

·

54

55

69

,_,__, . ,..,.-. N�

C C't

T

, _ ,

T

10

·· -

·---_: ·--- 1""·-·

f f. ••Gl .; T T C

110

30 20 G Cf.G C G r.1 t. G C l i C. 1

13<J

•\ •· C G :l :; .,G �- TC C T T T C '-C T TC

2JO

240

� GO ,.. T T ;: G GQ :•, 'TC

C T

T T G GCG 350

1 TG

-:_ - - · · · - ·

250

360

iT

� ocv. ·r 1 C

50 60 T T c:. G G .�.i T TO .1 G T G G

140 1� ISO C C i G G T T T -- T , G G f ,;. G "( G � · , Q :..·. t.

; T T C T :.a

.-, T i T G G 7 c:.GQC

iT

.. T .-•

-r:

:·.G ,'1-G

2su .",Q T TG 1' ·, C

210

T TG T T G TO 'T C

f T C i G T -•

'f C

28o r l'C

TC

370 380 390 ·�- T CG C. C G . c .'. l r C T T TC T .. c : C GG .

.-

: T C C.

:. Q

•

70 80 tC�-G CG G G C TC.!.C..:. C C TG G

T T T ·:

400 T .•, T

180

't •

C :.

290

·-G

l

,. · C C .

TC G

iC

300 :,CC •, 1 C

410 ': l G T G G C

'I , / .!

90 TG G

100 lG G G .-. "'1. � G C .\ G A C C.::

19Q 200 210 2; t· G T T l T T TI· G T G T C G ."'. TG T T T T T C ·· G '�- TC G f C :, I· '· t

' G ·-CC T C T l C T .·,:

170

.:..,.:. ·u- C C

---··-

·'

:, T C

1 Q :. r 420

T

:·

TT T

31o T C., 1 C G

1G

T

T C C: J,

_., T T 1 T 1 G ·� 32o

330 :,c T G G t T

TC

4JO 440 T G O G G 1 AGC G G C T T r G

\

T T G(

;. J;,A GC 0 TC 450

:' l \ :.1 1

.. I . ' ' ' !

<70

.ao

G r c '!'CC G TC GCC T G G C T C

•oo

&>a

CC G .'- T T TC G C C i G i T G G G G

. . . !.

510

520

.

. · f =·

-

T .._

C

-·

�

-CCG � TCC GGCGC

·- ,..

-.

100 G � GC 1

ll

T

110 r -- GGC

� GO .-,.-. ::. -"' TC,)C GGT;. 1120

-

1 T G T CC 1' GGC T 1

no

�

830 T GG -'"· '-C T T :...G;:.,,

=

1 ··C G T- ICC G r ·· •·. T -- G T

T TGGC;.G •\CC .,c C G

7311

.: - -O.C .. c c -· C

�50

. l" ,tCG :• -C T C C C ·• T T 1' C -� GC ();. T T -� C G G C ��GG ..-. ., T C C 1 .-. :,c •• T ··· O �0 :\T : G T ··. T G C T T T T T

iC .

•

TG •

100

: .; · .- : .

,

m

T C -· C .' :.G

"'GCGGT -··

�r

.

•

\

·:·

l_

530

s.o

550

e10 fGTT 1

:>�'

TC C G T

�

- G G G :\ '· G T

750 GC T T G C -

� - •

·

760 0 • G T GC

=

-�C G T T

:. -!

� � T T l :.: cQGT T TC G T T T CH C G C 1 G G G •'

no C 00:.0:. T --GC C :,

·

7W

790

fG

T TG

TC C

TC G

800

:•. :.. T r;.G .:.. .S. #' G i i T T T T C .�. 1 ·• G �C T C TC

Jle: 1071297_A_LeptoF

File: E:\ New folder (2)\ 1 st_BASE_1071.? U � _A_Leptot-.ao1

BLAST ®

Basic Local Alignment Search Tool

NCBII ID.A§II blastn suite! Formatting Results - C6CDPYJV016 Formattin go p tions Download

View these resultsin the new enhanced re oo rt Learn -about the enhanced rep ort

Nucleotide Sequence (834 letters) Query ID Description

Molecule type

Query Length

Database Name

1dl17457

Description

None

nudeic acid 834

Program

nr Nudeotide collection (nt)

BLASTN 2.2.27+

Graph ic Summary Distribution of 100 Blast Hits on the Query Sequence Color key for alignment scores

<40

40:00 I 150

:•

� d'i ' � l: -

300

•

450

..

I 600

••

I 750

==--=-=-=====-- ·-----

II

. .

'

.,

II 1

• �1

··.· -

Descrigtions

Legend for links to other resources: [!] UniGene 13 GEO [!3 Gene El Structure IZJ Map Viewer fl PubChem BioAssay Max Total Query Max Links � score score coverage value ident

Accession

Description

gi!3534562 77ICP001221.1

Leptospira lnterrcgans serovar L.ai str. IPAV chromosome 1548 1, complete sequence

1548

97%

0.0

99%

gii2933853961AE010300.2

Leptospira interrogans serovar L.ai str. 56601 chromosome I, complele 10e<�uence

�

1548

97%

0.0

99%

gii2351762IU89708.1

Leptospira interrcgansserovar lai hemolysis-associated protein-1 (hap-1) and hemolytic protein (sphH) genes, complete cds

1548

1548

97%

0.0

99%

gii2890657491GU592525.1

Leptospira lnterrogans serovar Hardjo hemolysisassociated protein I (hapl) gene, complete cds

1546

1546

97%

0.0

99%

1546

1546

97%

0.0

99%

�

1544

97%

0.0

99%

1542

1542

97%

0.0

99%

Leptospira interrcgans serovar Coperhageni str. Fiocruz 1542 L1-130, c:Vomosome I, complete sequence

1542

97%

0.0

99%

JMQ

1540

97%

0.0

99%

1540

1540

97%

0.0

99%

Leptospira interrcgans serovar hardjo outer membrane lipoprotein (lipl..32) gene, complete ods

gii37813208IAY442332.1 ·

Leptospira interrogans serovar lcterohaemorrhagiae gi12703135�1GU183106.1 strain RGAhemolysis associated protein I (hap!) gene, complete cds gii164171431AF366366.1 gi!45602555IAE016823.1 qi11947400271EU871720.1 gi!1947400251EU871719.1

##

Leptospira interrogans strain UPM-R37 major outer membrane protein (lipl..32) gtlne, complete cds Leptospira interrcgans strain UPM-P5 major outer membrane protein (lipl.32) gene, complete cds

g!!485263191AY609332.1

Leptospira interrogans serovar Wolffi major outer membrane protein (lipl32) gene, complete cds

1540

1540

97%

0.0

99%

gi148526309IAY609327.1

Leptospira interrcgans serovar Grippotyphosa iTiajor outer 1540 membrane protein (lipl32) gene, complete cds

1540

97%

0.0

99%

gii48526305IAY609325:1

Leptospira interrogans serovar Austr:alls major outer membrane protein (lipl32) gene, complete cds

1540

1540

97%

0.0

99%

gii485263031AY609324.1

Leptospira n i terrogans serovar Attlrnnalis major outer membrane protein (lipl32) gene, complete cds

1540

1540

97%

0.0

99%

gi!48526297IAY609321.1

Leptospira lnte.rrcgans serovar canlcola major outer membrane protein (lipl32) gene, complete cds

1540

1540

97%

0.0

99%

g i175282VIAF245281. 1

Leptospira interrcgans putatiVe flpoprotein Upl32 (hap1) gene, complete cds

�

1540

97%

0.0

99%

aii485263131AY609329.1

Leptospira lnterrcgans serovar Paid]an major outer membrane protein (Upl32) gene, complete cds

1534

1534

97%

0.0

99%

�

1534

97%

0.0

99%

gi1485263111AY609328.1

1

Leptospira interrogans serovar autumnalis hemolysinassociated protein 1 (hap1) gene, complete cds

Leptospira lnterrcgans serovar Hebdomadis major outer membrane protein (lipl32) gene, complete cds

gi!456451711AY568679.1

Leptospira interrcgans strain L.ai major outer membrane protein (lipL32) gene, complete cds

1534

1534

97%

0.0

99%

gll289065747 iGU592524.1

Leptospira fnterrcgans serovar Grippotyphosa hemolysis1m associated protein l (hapI) gene, complete cds

1529

97%

0.0

99%

qii1 947400191EU871716.1

Leptospira interrcgans serovar Pomona major outer membrane protein (ftpl32) gene, complete cds

1529

1529

97%

0.0

99%

gi148526307IAY609326.1

Leptospira noguchii serovar Pomona major outer membrane protein (lipl32) gene, complete cds

1529

1529

97%

0.0

99%

qi13583572571JN831363.1

Leptospira lnterrogans serovar canicola strain RTCC 2805.outer membrane proieln Qipl32) gene, complete cds 1 523

1523

97%

0.0

99%

gii485263211AY609333.1

Leptospira borgpeterserll serovar Mirl major outer membrane protein (lipl32) gene, complete cds

1523

1523

97%

0.0

99%

qii335891931AJ580493.1

Leptospira lnterrogans serovar canicola lipl32 gene for . 1523 outer membrane protein

1523

97%

0.0

99%

ali2890657451GU59�

Leptospira lnterrcgans serovar Hebdomadis hemolysisassociated protein I (hapI) gene, complete cds

1517

1517

97%

0.0

99%

qii28906574�IGU592522.1

Leptospira lnterrogans serovar Mini hemolysis-associated 1517 protein I (hapl) gene, complete cd s

1517

97%

0.0

99%

1 .

II

. ·· · .

..

,. 'I

J

lr\1

1 " / n l,.. n 1 "

gi!426281541AY461908.1

Leprospira interrogans strain 56601 Upl32 (llpl32) gene, 1515 partial c:ds

1515

95%

0.0

99%

gii42628148! AY 4 61905.1

leptospira interrogans strain HardjoprajKno Upl32 (lipl32) gene, partial c:ds

1515

1515

95%

0.0

99%

ill.1

1511

97%

0.0

99%

�

1509

95%

0.0

99%

95%

0.0

99%

95%

0.0

99%

1506

97%

0.0

99%

gi!485263011AY609323.1 g i! 4262815 6!AY 461909.1

Leptospira interrogans strain RGA Upl32 (llpl.32) gene, partial c:ds

qi!42628.1521AY461907 1

partial c:ds

�

1509

qi!426281421AY461902.1

Leprospira interrogans strain Akiyami Upl32 Olpl32) gene, par'Jal cds

�

1 508

qlj295641 0561HM026175.1

Leprospira interrogans strain L1-130 Lipl32 (lipl32) gene,

Leptospira interrogans serovar Csnicola lmmunodominant outer membrane protein Upl32 (lipl32) gene, complete j§Q§ c:ds

•

gii289065751(GU592526.1

Leptospira interrogans serovar Autumnalis hemolysisassociated protein I (hapl) gene, complete c:ds

1®.2

1506

97%

0.0

99%

g j l1 �47 �00�31j;U871 723.1

leptospira interrogans serovar Grippotyphosa strain Moskva V major outer membrane protein (llpL32) gene, complete c:ds >gii378942580igbiJN886738.1 1 Leptospira interrogans serovar Grippotyphosa strain RTCC2808 Upl32 (lip132) gene, complete c:ds

1§Q§

1506

97%

0.0

99%

q!j378942582 1JN886739.1

Leprospira interrogans serovar Hardjo strain RTCC2821 Upl32 (lipl32) gene, partial eels

l.§!M

1504

96%

0.0

99%

1504

1504

95%

0.0

99%

gi:428281501AY461906.1

Leptospira interrogans strain Kremastos Upl32 (lipl32) gene, partial c:ds

qil7330696jAF121192.1

Leptospira kirschneri major outer membrane protein (lipl32) gene, complete c:ds; and unknown gene

w.z

1502

97%

0.0

99%

glj42628158!AY461910.1

Leptospira lnterrogans strain Pomona RZ11 Upl32 (lipl32} gene, partial c:ds

1498

1498

95%

0.0

99%

Leprospira interrogans strain Hond Utrecht Lipl32 (lipL32) 1498 gene, partial cds

1498

95%

0.0

99%

�

gij42628146I AY461904.1

Leptospira lnterrogans sirain RZ11 Upl32 gene, partial c:ds

�498

95%

0.0

99%

aH3B67784711Jao1351a.1

Leptospira interrogans isolate F7 major outer membrane .J.j@§ lipoprotein Upl32 (lipL3:2) gene, partial cds

1496

94%

0.0

99%

g!I426281401AY461901.1

Leptospira interrogans strair. Jez-Bratislava Lipl32 (lipl32) gene, partial cds

.lli.1

1494

94%

0.0

99%

gl138677847SjJQ013520.1

Leptospira interrogans serovar Balico major outer membrane lipoprotein Upl32 (lipl32) gene, partial cda

.1m

1492

94%

0.0

99%

qii7313074 1 AF181553.1

Leptospira kirscmeri strain 5621 UpL32 (lipl32) gene, partial c:ds

lla§

1486

95%

0.0

99%

gU38677847J!JQ013519.1

Leptospira lnterrogans serovar Manilae major outer membrane Upoprotein LipL32 Oipl32) gene, partial c:ds

�

1485

94%

0.0

99%

gii283105175IGU220823. 1

Leptospira interrogans serovar Hebdomadis Upl32 (llpl32) gene, partial cds

�

1485

95%

0.0

99%

�

1485

97%

0.0

99%

�

1483

97%

0.0

99%

gji426281721AY46191 7.1

qll194740023jEU871 718.1 g!j289065755j GU592528.1

Leptospira lnterrogans strain UPM-ND major outer membrane protein (fipl32) gene, complete cds

Leprospira interrogans serovar Jalna strain SSK1 hemolysi�ssociated protein I (hap!) gene, complete c:ds

qlj289065753jGU592527.1

Leprospira interrogans servvar Jalna strain MP1 hemolysis-associated protein I (hapl} gene, complete c:ds 1483

1483

97%

0.0

99%

61913.1 i! i4 l 26281 64 1 A Y4

Leptospira kirsclvleri strain HS26 Upl32 (lipL32} gene, partial c:ds

�

1481

95%

0.0

99%

qi1426281621AY461912.1

Leprospira kirschneri strain ErinaceusAuritus 670 Upl32 (lipL32} gene, partial c:ds liD

1481

95%

0.0

99%

Leptospira interrogans strain Van Tienen Upl32 (lipl32) 1481 gene, partial c:ds

1 481

93%

0.0

99%

.1ill

1479

95%

0.0

99%

1ill

1477

97%

0.0

98%

.1ill

1475

93%

0.0

99%

qi1426281441 AY461903.1 gH42628160j AY461911.1

11 "

Ulprospira interrogans serovar Pyrogenes major outer membrane protein {lipl32) gene, complete cds

Leptospira kirschneri strain Musa Upl32 (lipL32) gene, partial cds

qi1300250762IHM449749.1

Leptospira interrogans serovar Pyrogenes strain MVC hemolysis-associated protein (hap!) gene, complete cds

.alj170280306iEU526391.1

Leptospira lnterrogans sef'ovar Autumnafis strain N2 outermembrane lipoprotein UpL32 gene, partial cds

II

1 •

BLAST ®

Basic Local Alignment Search Tool

NCBII BLAST/ blastr1 s yitel Formatting Results - C6CNTJ9Z01R tions p go Formattin Download

View these results in the new enhanced report Le arn about the enhanced re port

Nucleotide Sequence (837 letters) Query ID

O"tiilbaH Name nr •

lcll5149

None Molecule type nudeic acid Query Length 837 DeScription

Description Program

Nudeotide collection (nt)

E3l.ASTN 2.2.27+

G raphic Summary Distribution of 100 Blast Hits on the Query Sequence

Qu ..ry

-- " <40 . 1

150

=

Color key for alignment scores

40-60

I 300

_: ,.

= ·

I 450

• •

I 600

• •

750

==

----------------···-----= = - = == =-== -= -== ---= = ---= -= - ··--= = --= = -- = ·= ------= -= ----= -== ------- ·------- - ---------··- ==

1 ��

.

�·. .

II

1 •

1

'1

, 1

' fr\ 1

Descri�tions

Legend for links to other resources:

Max Links Total Query Max 5 score score coverage value ident

Accession

Description

gl!353456277!CP001 221.1

Leptospira interrogans serovar L.ai str. IPAV chromosome 1554 1, complete sequence

1554

96%

0.0

100%

gi12933853961AE010 300.2

Leptospira interrogans serovar L.al str. 56601 chromosome I, complete sequence

1554

1554

96%

0.0

100%

gl!2351762JU89708.1

Leptospira interrogans serovar tai hemolysis-associated protein-1 (hap-1) and hemolytic protein {sphH) genes, complete cds

1554

1554

96%

0.0

100%

gl!456025551AE016823.1

Leptospira interrogans serovar Copenhageni str. Fiocruz 1548 L1-130, chromosome I, complete sequence

1548

96%

0.0

99%

gi!73307411AF181553.1

Leptospira interrogans strain RZ11 UpL32 gene, partial cds

.121.1

1511

94%

0.0

99%

gi!7330696JAF121192.1

Leptospira kirschneri major outer membrane protein (lipL32) gene, complete cds; and unknown gene

1508

1508

96%

0.0

99%

gi11 64171431 Af366366.1

Leptospira interrogans serovar autumnalis hemolysinassociated proteln 1 (hap1) gene, complete cds

1498

1498

93%

0.0

99%

gi!289065749 JGU592525.1

Leptospira interrogans serovar Hardjo hemolysisassociated protein I (hap!) gene, complete cds

1492

1492

92%

0.0

100%

.9i!l[03135341GU183106.1

Leptospira interrogans serovar lcterohaemorrhagiae strain RGA hemolysis associated protein I (hap!) gene, complete cds

1492

1492

92%

0.0

100%

qi!4262B11i41 AY461908.1

Leptospira interrogans strain 56601 UpL32 (lipL32) gene, . 1492 partial cds

1492

92%

0.0

100%

gii37&1 3?081 AY442332.1

Leptospira interrogans serovar hardjo outer membrane lipoprotein (lipL32) gene, complete cds

1492

1492

92%

0.0

100%

1488

1488

92%

0.0

100%

gi!42628148J AY461905.1

Leptospira interrogans strain Hardjoprajitno Up!-32 (lipL32) gene, partial cds

qli194740027!EU871720.1

Leptospira interrogans strain UPM-R37 major outer membrane protein (lipL32) gene, complete cds

1486

1486

92%

0.0

99""'

gii1947400251EU871719.1

Leplt>spira interrogans strain UPM-P5 major outer membrane protein (lipL32) gene, complete cds

1486

1486

92%

0.0

99%

qii485263191AY609332.1

Leptospira interrogans serovar Wolffi major outer membrane protein (lipl32) g�ne. complete cds

1486

1486

92%

0.0

99%

gjl48526309iAY609327.1

Leptospira interrogans serovar Grippotyphosa major outer 1486 membrane protein (llp132) gene, complete cds

1486

92%

0.0

99%

g !4 i 8526305J AY609325.1

Leptospira interrogans serovar Austrafis major outer membrane protein (lipl32) QBne, complete cds

1486

1486

92%

0.0

99%

gll48526303lAY609324.1

Leptospira interrogans serovarAlltumnalis major outer membrane protein (lipl32) gene, complete cds

1486

1486

92%

0.0

99%

gi14&526297A 1 Y609321.1

Leptospira interrogans serovar Canicola major outer membrane protein (lipl32) gene, complete cds

1486

1486

92%

0.0

99%

gii42628156IAY461909.1

Leptospira interrogans strain RGA LipL32 (lipL32) gene, partial cds

1486

1486

92%

0.0

99%

gi!426281521AY461907.1

Leptospira interrogans strain L1-130 UpL32 (lipL32) gene, 1486 partial cds

1486

92%

0.0

99%

qii45645171IAY568679.1

Leptospira interrogans strain Lai major outer membrane protein (lipL32) gene, complete cds

1486

92%

0.0

99%

1486

92%

0.0

99%

gi175282UIAF245281.1

1 4�

[!] UniGene 13 GEO m Gene E1 Structure Ill) Map Viewer fj PubChem BioAssay

1486

Leptospira interrogans putative lipoprotein UpL32 (hap1) 1§.§ gene, complete cds

gti426281441AY461903.1

Leptospira interrogans strain Van Tlenen UpL32 (lipL32) gene, partial cds

1483

1483

92%

0.0

99%

gll42628142lAY461902.1

Leptospira interrogans strain Akiyami LipL32 OipL32) gene, partial cds

1483

1483

92%

0.0

99%

gi!485263131AY609329.1

Leptospira lnterrogans serovar Paidjan major outer membrane protein (lipl32) gene, complete cds

1481

1481

92%

0.0

99%

gi!485263111AY609328.1

Leptospira interrogans serovar Hebdomadis major outer membrane protein (fipl32) gene, complete cds

1481

1481

92%

0.0

99%

II

' .

.,

It 1

1 1"\ /fl / l"'t l'\ 1 "'

4 �1

··.·

Leptospira noguchij serovar Pomona major outer membrane protein (Upl32) gene, complete cds

1481

1481

92%

0.0

99%

Leptospira lnterrogans strain Kremastos Lipl32 (lipL32) gene, partial cds

1477

1477

92%

0.0

99%

gi!42628140!AY4§1901.1

Leptospira interrogans strain Jez-Bratislava Lipt.32 (lipL32) gene, partial cds

1ill

1477

92%

0.0

99%

gii2890657471GU592524.1

Leptospira interroga� serovar Grippotyphosa hemolysis1475 associated protein I (hap!) gene, complete cds

1475

92%

0.0

99%

gii194740019!EU871716.1

Leptospira interrogans serovar Pomona major outer membrane protein (upL32) gene, complete cds

1475

1475

92%

0.0

99%

gi!485263211AY609333.1

Leptospira borgpetersen!i serovar Mini major outer membrane protein (lipl32} gene, complete cds

1475

1475

92%

0.0

99%

Leptospira lnterrogans serovar AI:JtumnaHs strain N2 outermembrane lipoprotein UpL32 gene, partial cds

1473

1473

91%

0.0

99%

Leptospira interrogans :;train Pomona RZ11 LipL32 (lipL32) gene, partial cds

.1.£.1

1471

92%

0.0

99%

1471

92%

0.0

99%

gi!48526307!AY609326.1 gi!42628150!AY461906.1

gi!170280306 !EU526391.1 gil42628158JAY461910.1 qi142628146JAY461904.1

Leptospira interrogans strain Hand Utrecht UpL32 (lipt.32) 1471 gene, partial cds

.

qil378942582IJN886739.1

Leptospira interrogens serovar Hardjo strain RTCC2821 Lip!32 (fip!32) gene, partial cds

1469

1469

92%

0.0

99%

gil358357257!JN831363.1

Leptospira interrogans serovar Canicola strain RTCC 2805 outer membrane protein (lipl32) gene, complete cds 1469

qli289065743!GU592522.1

1469

92%

0.0

99%

Leptospira lnterrogans serovar Mlni hemolysis-assooiated 1469 protein I (hap!) gene, complete cds

1469

92%

0.0

99%

gil33589193IAJ580493.1

Leptospira interrogans serovar canlcola lipL32 gene for outer membrane protein

.1§!1

1469

92%

0.0

99%

qi!386 7784751JQ013520.1

Leptospira interrogans serovar Balico major outer membranE! lipoprotein UpL32 (lipl32) gene, partial cds

1465

1465

91%

0.0

99%

gi!386778471!J0.013518.1

Leptospira interrogans isolate F7 major outer membrane 1.§§ lipoprotein Llpl32 (lipL32) gene, partial cds

1465

91%

0.0

99%

g 1 i 289065745IGU592523.1

Leptospira interrogans serovar Hebdomadis hemolysisassooiated protein I (hapI) gene, complete cds

1463

1463

92%

0.0

99%

g 1 i 283105175 1GU220823.1

Leptospira interrogans serovar Hebdomadis Upt.32 (lipl32) gene, partial cds

1463

1463

92%

0.0

99%

gii426281721AY461917.1

Leptospira kirschneri strain 5621 LipL32 (lipt.32) gene, partial cds

1460

1460

92%

0.0

99%

AY609323.1 g 14 i 8526301J

Leptospira interroga� serovar P)'l'ogenes major outer membrane protein (lip132) gene, complete cds

1458

1458

92%

0.0

99%

gi13867784731JQ013519.1

Leptospira interrogans serovar Manilae major outer membrane Upoprotein LipL32 (lipl32) gene, partial cds

.1.§.1

1454

91%

0.0

99%

g 1i42 628166JAY461914.1

partial cds

Leptospira kirschneri strain LT1014 UpL32 (lipL32) gene,

1454

1454

92%

0.0

99%

ai!42628164 ! AY461913,1

partial cds

1454

1454

92%

0.0

99%

1454

92%

0.0

99%

1454

1454

92%

0.0

99%

1§.6

1452

92%

0.0

99"A.

1452

92%

0.0

99%

qi!426281621 AY461912.1

Leptospira kirschneri strain HS26 UpL32 (lipL32} gene,

Leptospira ldrschneri strain Erinaceus Auritus 670 UpL32 1454 QipL32) gene, partial cds

qi!426281601 AY461911.1

Leptospira kirschneri strain Musa Upl32 (lipL32) gene, partial cds

g i i 295641056 1 H M026 1 Z5.1

Leptospira interrogans serovar Canioola immunodominant outer membrane protein Upl32 (lipl32) gene, complete

cds

Leptospira interrogans serovar Grippotyphosa strain Moskva V major outer membrane protein (lipL32) gene,

gil1947400331EU871723.1

complete cds >gll378942580jgbiJN886738.11 Leptospira .lill interrogans serovar Grippotyphosa strain RTCC2808 Lip!32 (lipl32) gene, complete cds

qii42628168IAY461915.1

Leptospira kirschneri strain RM52 Upt.32 Qipt.32) gene, p
1448

1448

92%

0.0

99%

gli73307471AF181556.1

Leptospira noguchH strain Fort Bragg UpL32 gene, partial 1448 cds

1448

94%

0.0

98%

gi!2890657511GU592526.1

Leptospira lnterrogans serovar Autumnalis hemolysisassociated protein I (hapl) gene, complete cds

1446

1446

92%

0.0

99%

qii3546835561JN210551.1

Leptospira interroga� serovar Aulumnalis strain N2 m
1444

1444

90%

0.0

99%

t '

•t

n 1

4 �1

MINISTRY OF NATIONAL EDUCATION FACULTY OF MEDICINE GADJAH MADA UNIVERSITY ICAL AND HEALTH RESEARCH ETHICS COMMITTEE (MHREC)

ETHICS COMMITTEE APPROVAL Ref: KE/FK/ Title of the Research Protocol

��

Pengembangan dengan

/EC

Prototipe

Menggunakan

Kit

Diagnostik

Metode

ELISA

Leptospirosis

Berbasis

pada

Protein Rekombinan LipL·32 Documents Approved

1. Study Protocol

2.

Information for Subjects

I

3. Informed consent form

..·J I

4. Case report forms (CRF) Principle Investigator

i

Hevi Wihadmadyatami

Name of medically Responsible Physician(s)

0 3 AUG 201Z

Date -of Approval

(Valid for one year beginning from the date of approval)

·=.�....·'

Irfstitution(s)/place(s) of

Laboratorium Biokimia FK Hewan UGM

research

·....

PAU Bioteknologi UGM RSUP Dr Sardjito Yogyaka
The Medical and Health Research Ethics Committee (MHREC) states that the above protocol meets the ethical principle outlined in the Declaration of Helsinki

2008

and therefore can be

carried out. -

The Medical and Health Research Ethics Committee (MHREC) has the right to monitor the research activities at any time. The investigator(s) is/are obliged to submit final report upon the

completion of the study or a progress report in case a �:;:ontinuing review is needed.

d�-

Prof.dr.Mohammad Hakimi, Sp.OG (K),Ph.D

Dr. dr. Eti Nurwening Sholikhah, M.Kes·

Chairman

Secretary

·

··.·

PERJANJIAN KERJASAMA ANTARA BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN KEMENTERIAN KESEHATAN RI DAN FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS GADJAH MADA TENTANG RISET PEMBINAAN ILMU PENGETAHUAN & TEKNOLOGI KEDOKTERAN (RISBIN IPTEKDOK)

;�� ·· ·· �

Nomor : HK.06 . 0 1 / 1 / 1693/20 12

Pada hari ini Kamis tanggal satu bulan Maret tahun dua ribu dua belas, kami yang bertandatangan di bawah ini : 1 . dr. Trisa Wahyuni Putri, MKes : · Pejabat Pembuat Komitmen Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Kementerian Kesehatan RI berkedudukan dan berkantor di Jalan Percetakan Negara Nomor 29 Jakarta 10560, dalam hal ini bertindak dalam jabatannya untuk dan atas nama B�dan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, selanjutnya disebut PIHAK KESATU; 2. dr. Rr: Titi Savitri Prihatiningsih, MA, MMed.Ed, PhD : Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada berdasarkan surat pendelegasian dari Rektor Universitas Gadjah Mada nomor : 1235/P/FK/20 1 2 tanggal 22 Februari 2012 dalam hal ini bertindak untuk dan atas nama Universitas Gadjah Mada, berkedudukan di Sekip Yogyakarta, selanjutnya disebut PIHAK l<EDUA. PIHAK KESATU dan PIHAK KEDUA selanjutnya bersama-sama disebut PARA PIHAK, telah sepakat untuk mengadakan Peijanjian Keijasama antara Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan dan Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada dengan ketentuan dan syarat-syarat sebagai berikut: PASAL 1 DASAR DAN TUJUAN ( 1 ) Perjanjian ini dibuat berdasarkan referensi yang merupakan bagian yang terpisahkan dari perjanjian 1m, yaitu tidak

1

a. Undang-Undang Nomor 18 Tahun 2002· tentang Sistem Nasional Penelitian, Pengembangan dan Penerapan Ilmu Pengetahuan dan Teknologi (Lembaran Negara Republik Indonesia tahun 2002 Nomor 84, Tambahan Lembaran Negara Republik Indonesia Nomor 4219); b. Undang-Undang Nomor 20 Tahun 2003 tentang Sistem Pendidikan Nasional; c. Undang undang Nomor 36 Tahun 2009 tentang Kesehatan (Lembaran Negara Tahun 2009 Nomor 144, Tambahan .Lembaran Negara Nomor 5063; d. Peraturan Pemerintah Nomor 39 Tahun 1995 tentang Penelitian dan Pengembangan Kesehatan (Lembaran Negara Republik Indonesia tahun 1995 Nomor 67, Tambahan Lembaran Negara Republik Indonesia Nomor 3609; e. Peraturan Pemerintah Nomor 6 1 Tahun 1999 tentang Penetapan Perguruan Tinggi Sebagai Badan Hukum. f. Peraturan Presiden RI Nomor 54 Tahun 2010 tentang Pengadaan Barang/ Jasa Pemerintah; g. Keputusan Menteri Kesehatan Nomor 791/Menkes/SK/VII/1999 tentang Koordinasi Penyelenggaraan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan; h. Peraturan Menteri Kesehatan Nomor 1 144/MenkesfPerfVIII/2010 tentang Organisasi dan Tata Keija Kementerian Kesehatan RI; 1. Keputusan Kepala Badan Penelitian dan Perigembangan Kesehatan Nomor : HK.03.05j l / 1273/2012 tentang Penetapan Tim Pelaksana Risbin Iptekdok Tahun 2012; membina (2) Perjanjian ini bertujuan untuk memperbaiki dan pembangunan iptekdok Indonesia dengan menggerakkan, mendayagunakan, dan meningkatkan kemampuan ilmiah yang ada untuk ikut serta memanfaatkan, mengembangkan, dan menguasai ilmu pengetahuan dan teknologi yang diprioritaskan dalam bidang riset dan teknologi serta pencapaian sasaran pembangunan bidang kesehatan. PASAL 2 RUANG LINGKUP

Ruang lingkup perjanjian meliputi pelaksanaan kegiatan penelitian , pembiayaan, jangka waktu pelaksanaan, tata cara pembayaran, hak dan kewajiban, pengadaan barangjjasa, laporan, hak atas kekayaan intelektual, sanksi, keadaan memaksa, dan penyelesaian perse lisihan .

2

f

PASAL 3 KEGIATAN PENELITIAN ( 1 ) Penelitian Riset Pembinaan llmu Pengetahuan dan Teknologi Kedokteran diarahkan untuk peningkatan kesehatan ibu, bayi dan balita, perbaikan status gizi masyarakat, pengendalian penyakit menular serta penyakit tidak menular, diikuti penyehatan lingkungan. (2) Protokol penelitian yang dibiayai oleh PIHAK KESATU merupakan protokol yang telah lulus dalam seleksi panel. (3) Protokol penelitian sebagaimana dimaksud pada ayat (2) tercantum dalam lampiran perjanjian ini dan merupakan bagian yang tidak terpisahkan. (4) Tim peneliti sebagaimana tercantum dalam lampiran peijanjian ini tidak diperkenankan untuk diganti/ diubah tanpa persetujuan PIHAK KESATU, dan merupakan bagian yang tidak terpisahkan dari perjanjian ini. (5) Penggantian dan atau perubahan tim peneliti sebagaimana dimaksud pada ayat (4) harus diajukan secara tertulis dengan melampirkan persetujuan tertulis dari ketua panel pakar dan amandemen etik. PASAL 4 PEMBIAYAAN ( 1 ) Bantuan dana diberikan dalam bentuk swakelola. (2) Biaya pelaksanaan kegiatan yang diberikan oleh PIHAK KESATU kepada PIHAK KEDUA dengan rincian sebagaimana tercantum dalarn lampiran perjanjian ini dan merupakan bagian yang tidak terpisahkan. (3) Biaya pelaksanaan kegiatan penelitian sebagaimana dimaksud pada ayat ( 1 ) sebesar Rp. 499.180.000,- (empat ratus sembilan puluh sembilan juta seratus delapan puluh ribu rupiah) sudah termasuk PPh dan PPN, yang dibebankan pada DIPA Sekretariat Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Tahun 2012.

(4) Biaya sebagaimana dimaksud pada ayat (3) meliputi segala pengeluaran dalam pelaksanaan kegiatan penelitian termasuk pajak-pajak, materai dan biaya-biaya lainnya harus dibayar oleh PIHAK KEDUA sesuai dengan ketentuan yang berlaku. 3

f.

(5) Peneliti sebagaimana tercantum dalam lampiran pe:rjanjian ini tidak diperkenankan untuk mengajukan pembiayaan kepada pihak lain dalam rangka penelitian yang sama.

(6) PIHAK KEDUA tidak diperkenankan untuk mengalihkan dan atau memindahtangankan

sebagian maupun seluruh

kegiatan

penelitian

sebagaimana te rcantum dalam lampiran peijanjian ini kepada pihak lain tanpa persetujuan PIHAK KESATU. PASAL 5 JANGKA WAKTU

( 1) Pelaksanaan kegiatan penelitian sebagaimana terse but dalam pe:rjanjian ini dilakukan selama 10 (sepuluh) bulan kalender terhitung sejak penandatanganan perjanjian ini .

. (2) Apabila pelaksanaan kegiatan penelitian ini tidak selesai dalam waktu yang telah ditetapkan sebagaimana disebut pada ayat ( 1 } , maka sisa dana dikembalikan ke Kas Negara. PASAL

6 TATA CARA PEMBAYARAN

(1) Penyaluran dana oleh PIHAK KESATU kepada PIHAK KEDUA dilakukan melalui transfer ke rekening resmi institusi PARA PIHAK yaitu: Nama Rekening Nomor Rekening Bank Cabang

: UGM FKU Penunjang : 179

40 2424

: BNI '46 : Bulaksumur, UGM

(2) Tata cara pencairan dana -penelitian sesuai dengan ketentuan yang berlaku dan Pedoman Administrasi Keuangan Risbin Iptekdok 2012. (3) Penyaluran dana sebagaimana dimaksud pada ayat (1) tidak berlaku ·untuk belanja sewa dan belanja bahan habis pakai yang mekanisme Pengadaan pelaksanaannya melalni Panitia dan/atau Pejabat Barang/ Jasa. (4) Penyaluran dana sebagaimana dimaksud melalui rekening penyedia barangjjasa.

pada

ayat (3)

4

lI l l

dilakukan

I

{5) Penggunaan

dana

penelitian harus disetujuifdiketahui oleh

PIHAK

KEDUA. PASAL 7 HAK DAN KEWAJIBAN

( 1) PIHAK KESATU a. Hak : 1) Memperoleh penelitian

laporan

dari

akhir,

PIHAK

abstrak

KEDUA

dan

dalam

hasil

bentuk

pelaksanaan

hardcopy

dan

softcopy; 2)

Memperoleh raw data (data mentah) basil penelitian dari PIHAK KEDUA;

3) Memperoleh

semua

dokumen

pertanggungjawaban

keuangan

asli

yang

dari PIHAK

berkaitan KEDUA

dengan

selambat­

lambatnya awal bulan Desember 2012. b. Kewaj iban: Melakukan

pembayaran

pelaksanaan

kegiatan

penelitian

kepada

PIHAK KEDUA melafui rekening resmi institusi sesuai dengan usulan yang telah diterima oleh PIHAK KESATU. {2) PIHAK KEDUA a.. Hak : Menerima pembayaran atas pelaksanaan kegiatan penelitian dari PIHAK KESATU sesuai dengan usulan yang telah diserahkan oleh PIHAK KEDUA. b. Kewajiban:

1) Melakukan pemantauan dan evaluasi intemal atas pelaksanaan penelitian di institusinya dan bertanggung jawab penuh atas hasil penelitian; 2) Menyampaikan

laporan

akhir

penelitian

dan

abstrak

kepada

PIHAK KESATU sesuai denganjangka waktu yang disepakati; 3) Menyerahkan raw data (data mentah) hasil penelitian kepada PIHAK KESATU;

4) Menyimpan salinan/copy semua dokumen yang berhubungan dengan pelaksanaan penelitian;

5) Menyelesaikanjmenyerahkan semua bentuk pertanggungjawaban keuangan kepada PIHAK KESATU sesuai ketentuan yang berlaku .

5

f

PASAL 8 PENGADAAN BARANG/JASA (1) Proses

pengadaan

barangjjasa dilaksanakan oleh

Panitia danfatau

Pejabat Pengadaan Barang/Jasa yang ditunjuk oleh PIHAK KEDUA. (2) Panitia

danfatau

Pejabat

Pengadaan

BarangjJasa

sebagaimana

dirnaksud pada ayat (1) harus memiliki sertiflkat keahlian pengadaan barangjjasa sesuai ketentuan yang berlaku . PASAL 9 LAPORAN ( 1 ) PIHAK KEDUA wajib membuat dan menyampaikan laporan kemajuan penelitian kepada PIHAK KESATU (minggu kedua bulan September 2012) sebanyak 3 (tiga) rangkap. (2) PIHAK

KEDUA

wajib

membuat

dart

menyerahkan

laporan

akhir

penelitian kepada PIHAK KESATU selambat-lambatnya minggu ketiga bulan Desember 2012 s.ebanyak

3 (tiga) rangkap.

(3) Penulisan Laporan Akhir harus mengikuti ketentuan dalam Buku Panduan Penyusunan Laporan Akhir Penelitian Badan Litbangke s yang diterbitkan oleh Komisi Ilmiah Penelitian Kesehatan Badan Litbangkes. PASAL

10

KEPEMILIKAN HASIL PENELITIAN Kepemilikan hasil penelitian yang dimaksud adalah: (1)

H ak Kelayakan Intelektual, teknologi tepat guna, temuan lainnya yang diperolah sebagai hasil pelaksanaan kegiatan penelitian ini dan menjadi milik bersama para pihak

(2) Dalam hal terjadi tuntutan dari pihak lain atas penggunaan suatu alat atau

teknologi tertentu

akibat penelitian ini,

PIHAK KEDUA dalam

rangka pekerjaan berdasarkan perjanjian ini akan membebaskan PIHAK KESATU dari segala tuntutan hukum pihak lain tersebut. PASAL 1 1 PERTUKARAN INFORMASI

( 1) PARA PIHAK

sepakat

untuk

saling

bertukar

data

dan

inforrtlasi

mengenai hal-hal yang berhubungan dengan pelaksanaan Perjanjian ini 6

··.' · · -"i ..a l� w..

:

y

dan semata-mata hanya digunakan untuk kepentingan yang sesuai dengan maksud dan tujuan Peijanjian Keijasama Penelitian ini. (2) PARA PIHAK sepakat untuk menjaga kerahasiaan seluruh data dan informasi

sebagaimana

dimaksud

pada

ayat

(1)

dan

tidak

akan

memberikan kepada pihak ketiga tanpa persetujuan tertulis dari PARA PIHAK. PASAL 12 SANKSI (1) Bilamana PIHAK KEDUA dalam pelaksanaan kegiatan dan penggunaan dana tidak sesuai dengan syarat dan ketentuan yang tercantum dalam pezjanjian ini dan/ atau melanggar ketentuan Peraturan Perundangan yang berlaku, PIHAK KESATU memberikan sanksi berupa peringatan tertulis mulai peringatan pertama sampai dengan peringatan ketiga. (2) Pemberian

sanksi sebagaimana dimaksud pada

ayat ( 1 )

dilakukan

apabila PIHAK KEDUA berdasarkan hasil evaluasi dan verifikasi terbukti melakukan kekeliruan; baik dalam melaksanakan kegiatan maupun pengelolaan keuangan yang dapat menimbulkan kerugian Negara.

(3) Apabila PIHAK KEDUA tidak mengindah,kan peringatan tertulis dari PIHAK KESATU sebanyak 3 (tiga) kali sebagaimana dimaksud pada ayat ( 1 ) , maka PIHAK KESATU dapat memberlakukan sanksi kepada PIHAK KEDUA berupa: a. Menarik kembali danj atau menghentikan bantuan dana danjatau meminta kembali bantuan dana yang telah disalurkan sesuai dengan perjanjian ini; b. Memasukkan PIHAK KEDUA ke dalam daftar sebagai lembaga yang tidak

memenuhi syarat

sebagai penerima

bantuan

dana

Risbin

Iptekdok. c. Melaporkan PIHAK KEDUA kepada lembagaj instansi yang berwenang untuk proses tindak lanjut. PASAL 13 KEADAAN MEMAKSA (FORCE MAJEURE) Keterlambatan pelaksanaanj penyelesaian pekerjaan yang diakibatkan oleh keadaan memaksa (force majeure) dapat membebaskan PIHAK KEDUA dari sanksijdenda sebagaimana tersebut dalam pasal 12 Perjanjian Keijasama ini.

( 1 ) Yang dimaksud keadaan memaksa (force majeure) adalah: 7

L

f

a. Bencana alam (gempa bumi, tanah longsor, banjir) dan keadaan cuaca yang tidak memungkinkan pekeijaan dilaksanakan; b. Adanya perang, huru-hara, pemberontakan, kekacauan, kebakaran dan epidemi; c. Kejadian lain diluar kekuasaanjkemampuan manusia dan kejadian tersebut dapat dipahamijdisetujui oleh PIHAK KESATU. (2) Apabila teijadi keadaan memaksa, maka PIHAK KEDUA harus memberitahukan secara tertulis kepada PIH1\K KESATU selambat­ lambatnya dalam waktu 14 (empat belas) hari sejak teijadinya keadaan niemaksa disertai bukti yang sah, demikian pula ketika keadaan memaksa berakhir. (3) Atas pemberitahuan PIHAK KEDUA, maka PIHAK KESATU dapat menyetujui atau menolak secara tertulis keadaan memaksa itu dalam waktu 3 X 24 jam sejak terjadinya pemberitahuan keadaan memaksa tersebut dari PIHAK KEDUA . . (4) Jika dalam waktu 3 x 24 jam sejak diterimanya pemberitahuan PIHAK KEDUA kepada PIHAK KESATU tentang keadaan memaksa tersebut tidak ada jawaban dari 'PIHAK KESATU, maka PIHAK KESATU dianggap meny�tujui akibat terj adinya keadaan memaksa tersebut. PASAL 14 PERSELISIHAN

PENYELESAIAN

(1) Apabila terjadi perselisihan antara PARA PIHAK, maka pada dasarnya akan diselesaikan secara musyawarah.

( 1) tidak dapat diselesaikan dengan cara musyawarah, maka perselisihan tersebut akan diselesaikan melalui Badan Arbitrase Nasional Indonesia atau akan dibentuk Panitia Penyelesaian Perselisihan yang terdiri dari 3 (tiga) orang, yaitu: a. seorang wakil dari PIHAK KESATU;

(2) Apabila perselisihan sebagaimana dimaksud pada ayat

(3)

b.

seorang wakil dari PIHAK KED UA;

c.

dan seorang wakil yang ditunjuk dan disetujui oleh PARA

PIHAK.

dimaksud (2) tidak diterima oleh PARA PIHAK, maka p enyelesaian masalah tersebut akan diselesaikan secara hukum dengan domisili

Apabila hasil keputusan terhadap perselisihan sebagaimana pada ayat

hukum di Pengadilan Negeri Jakarta Pusat.

8

f

PASAL 1 5 PENUTUP akan dilakukan (1) Apabila terdapat perubahan dalam perjanjian uu perubahan (addendum) atas kesepakatan PARA PIHAK.

(2) Ketentuan lain yang belum tercantum dalam pe.Ijanjian ini akan ditetapkan kemudian, dan merupa.kan bagian yang tidak terpisahkan dari perjanjian ini. \

(3) Perjanjian ini ditandatangani oleh PARA PIHAK, dibuat dalam rangkap 3 (tiga) dan bermaterai cukup serta mempunyai kekuatan hukum yang sam a.

PIHAK KEDUA, Fakultas Kedokteran

PIHAK KESATU, Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan

dr. Rr. Titi Savitri P, MA, MMed.Ed, PhD NIP. 196607051997022001 Mengetahui,

9

------.--

------···

------�----···--

Lampiran· Perjanjian Keija Sama Nomor : HK.06.01/l/1693/2012 Tanggal

No

1.

: 1

Maret 2012

Judul Penelitian

Peneliti Hevi

Pengembangan prototipt kit diagnosis

Wihadmadyatami,

Leptospirosis dengan menggunakan

drh, MSc

metode ELISA berbasis pada protein

Anggaran (Rp.)

1 50.000,000

rekombinan LipL32

2.

Narendra Yoga

Pengembangan multiplex dipstik untuk

Hendarta, ST,

deteksi dini HIV- 1 dan HBV berbasis

M.Biotech

kombinasi Multiplex Reverse Transcript

1 50.000,000

Loop Mediated Isothermal Amplification (mRT-LAMP} dan Lateral Flow Distick (LFD) 3.'

4.

Retno

Pengembangan senyawa derivat kalkon

Arianingrum, Dra,

sebagai agen ko-kemoterapi bertarget

M.Si

molekuler spesifik pada kanker payudara

Shanti Listyawati,

Potensi Ekstrak Etanol Temu Kunci

S.Si, M.Si

(Boesenbergia pandurata) sebagai Agen Kemoprovensi Kanker Kulit Terinduksi UV-8

10

75.000.000

124. 180.000

UNIVERSITAS GADJAH MADA Bulaksumur, Yogyakarta 55281, Telp. (0274) 588688, Fax. (0274) 565223 . Website : www.uqm.ac.ld. E-mail : setre!!ugm.ac.ld

SURAT KUASA Nomor : /�fP/FK/20 12 .

Saya yang bertanda tangan dibawah ini : : Prof. lr. Sudjarwad i, M.Eng., Ph.D.

Nama NIP

Pangkat I Golongan

: 1 94703 1 3 197603 I 001

: Pembina Utama Madya, Gol. IVId.

Jabatan

: Rektor Universitas Gadjah Mada

Memberikan kuasa kepad� : : dr. Rr. Titi Savitri Prihatiningsih, MA, M.Med.Ed., Ph.D.

Nama NIP

: 19660705 199702 2 00 I

Jabatan

: Dekan Fakultas Kedokteran UGM.

Pangkat I GoIongan

: Penata Tk. I., Go!. IIUd.

Untuk : I.

Bertindak dalam jabatannya untuk dan atas nama Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, menandatangani Kontrak I Surat Perjanj ian Pelaksanaan Penelitian (SP3) Risbin Iptekdok 2012 dengan Badan Litbang Kesehatan.

2.. Bertanggungjawab atas pelaksanaan penel itian Risbin lptekdok 20 1 2 sesuai dengan SP3. Demikian Surat Kuasa ini dibuat untukdigu nakan sebagaimana mestinya.

Yogyakarta, Penerima Kuasa

Pemberi Kuasa

..

��

dr. Rr. Titi Savitri Prihatiningsih, MA, M. NIP 1 9660705 1 99702 2 00 I

-Ed., Ph.D.

��

i, M.Eng., Ph.D. 13 1 97603

I 001

/1tL,. �