PENGEMBANGAN KANDIDAT SENYAWA OBAT TURUNAN NAFTOKUINON SEBAGAI INHIBITOR VIRUS HEPATITIS B

0290: Firdayani dkk.

KO-35

PENGEMBANGAN KANDIDAT SENYAWA OBAT TURUNAN NAFTOKUINON SEBAGAI INHIBITOR VIRUS HEPATITIS B Firdayani1∗ , Rilianawati1 , Susi Kusumaningrum1 , Mutia Hardhiyuna1 , Siska Andrina Kusumastuti1 , Asep Saepudin1 , Pertamawati1 , Hasan1 , Kara Fabiola1 , Harry Noviardi1 , Didin Mujahidin2 , Rukman Hertadi2 , dan Muhammad Ali Zulfikar2 1

Pusat Teknologi Farmasi dan Medika, Dep.Bid TAB - BPPT Gedung II BPPT Lantai 15 Jl. MH. Thamrin 8, Jakarta Pusat 10340 2 Departemen Kimia Institut teknologi Bandung Jl. Ganeca 10 Bandung ∗

e-Mail: [email protected], telp: (021) 3169505

Disajikan 29-30 Nop 2012

ABSTRAK Usaha penemuan dan pengembangan obat baru pada umumnya bersifat coba-coba (trial and error) sehingga dibutuhkan biaya yang besar dan waktu yang lama. Untuk itu perlu terobosan dan inovasi agar pengembangan dan penemuan obat tetap layak secara ekonomi antara lain dengan melakukan penelitian sejumlah kecil senyawa yang terpilih sebagai penuntun dan merancangnya dengan lebih baik. Cara rasional yang dapat dilakukan antara lain melakukan pendekatan pengembangansenyawa yang telah ada, yang sudah diketahui struktur molekul dan aktivitas biologisnya, kemudian dilakukan modifikasi molekul atau mensintesis sejumlah turunannya. Dengan berkembangnya teknologi komputer, rancangan obat rasional mempunyai prospek yang cerah dalam pencarian obat baru. Dalam penelitian ini senyawa yang digunakan sebagai senyawa penuntun adalah turunan naftokuinon yang dari beberapa publikasi diketahui mempunyai aktivitas menghambat virus hepatitis B. Penelitian diawali dengan melakukan simulasi docking dan dinamika molekul senyawa-senyawa turunan naftokuinon menggunakan pemodelan molekuler untuk memprediksi interaksinya dengan reseptor yang bertanggungjawab dalam pertumbuhan dan replikasi VHB. Berdasarkan hasil simulasi, dipilih derivat yang potensial untuk selanjutkan dilakukan semisintesis guna mendapatkan senyawa tersebut. Setelah dilakukan pemurnian dan konfirmasi struktur hasil sintesis, derivat-derivat tersebut diujikan aktivitasnya membunuh atau menghambat replikasi VHB secara in vitro. Data-data yang diperoleh selanjutnya dianalisa hubungan kuantitatif struktur aktivitasnya (HKSA) untuk memperoleh kepastian struktur senyawa terbaik sebagai kandidat senyawa inhibitor virus hepatitis B baru dari derivat naftokuinon. Kata Kunci: Kandidat obat, turunan naftokuinon, virus hepatitis B

I.

PENDAHULUAN

Hepatitis B merupakan masalah kesehatan global, diperkirakan sekitar 2 miliar penduduk dunia pernah terpapar virus hepatitis B (VHB). Angka prevalensi infeksi VHB di Asia Pasifik cukup tinggi yaitu melebihi 8% dan penularannya pada umumnya terjadi secara vertikal (pada periode perinatal) dan horizontal (pada masa anak-anak) oleh karena itu risiko menjadi kronis cukup besar. Diperkirakan lebih dari 350 juta di antaranya menjadi kronis yang berisiko tinggi meninggal dunia akibat penyakit hati kronis. Sekitar 75% pengidap hepatitis B kronis karier berada di Asia Pasifik. Pada saat ini sekitar 1 juta kematian per tahun akibat penyakit hati berhubungan dengan VHB. Sirosis hati, gagal hati, atau kanker hati dapat terjadi pada 15 ∼40% penderita dengan infeksi hepatitisB kronis. Di negara

berkembang orang dewasa sangat berisiko tinggi untuk terkena hepatitis B. Terlebih di negara miskin dengan endemis tinggi, hepatitis B cukup banyak ditemukan pada anak-anak. Oleh sebab itu, tingginya morbiditas dan mortalitas akibat hepatitis B, penyakit ini sangat mengancam dunia. Prevalensi infeksi HBV berbeda-beda di seluruh dunia. Kategori daerah endemis terbagi menjadi rendah, sedang, dan tinggi. Indonesia masuk dalam kelompok prevalensi sedang sampai tinggi. Data Organisasi Kesehatan Dunia, WHO, menyatakan virus hepatitis B 50∼100 kali lebih menular daripada virus yang menyerang sistem imunitas, HIV. Penularannya terjadi lewat darah dan cairan tubuh.Kelompok berisiko tinggi adalah anak yang dilahirkan oleh ibu dengan virus HbsAg, virus penanda adanya hepatitis

Prosiding InSINas 2012

KO-36 positif.[1] Tujuan utama pengobatan hepatitis B kronis adalah untuk mengeliminasi atau menekan secara permanen proses replikasi virus yang akan mengurangi patogenitas serta infektivitas dan pada akhirnya dapat menghentikan atau mengurangi keradangan hati sehingga progresivitas menjadi sirosis dan kanker hati dapat dicegah. Obat-obatan yang dipakai untuk hepatitis B kronis ada dua pilihan.Pilihan pertama yaitu obat yang dapat menekan replikasi virus sekaligus untuk memodulasi sistem imun penderita, yang dikenal dengan nama interferon. Yang sekarang dipakai adalah pegylated interferon yang memberikan hasil memuaskan. Keuntungan obat ini dapat menekan replikasi virus dalam jumlah yang besar, lama pemakaian tertentu (6 bulan sampai1 tahun), relatif aman, dan ditoleransi baik oleh pasien yang sudah mengalami sirosis khususnya yang masih terkompensasi. Namun harga obat ini masih cukup mahal. Pilihan kedua adalah dari golongan analog nukleosida yang dapat menekan replikasi virus. Diantaranya adalah lamivudine, adefovir, entecavir dan masih dalam tahap ujicoba adalah telbivudine dan tenofovir. Pemakaian obat-obat ini relatif lebih lama (lebih dari 1 tahun) dan dapat terjadi resistensi virus hepatitis B terhadap obat tersebut, khususnya lamivudine yang mencapai angka 70% setelah pemakaian 5 tahun. Angka keberhasilan terapi hepatitis B kronis dengan menggunakan obat-obatan golongan nukleosida yang kini beredar masih di bawah 20%. Hingga kini belum dipasarkan obat dari golongan nonnukleosida. Dengan demikian, masih diperlukan usaha dan penelitian untuk mencari dan menemukan obat baru untuk mengatasi penyakit akibat virus hepatitis B ini. Usaha penemuan dan pengembangan obat baru pada umumnya bersifat coba-coba (trial and error) sehingga dibutuhkan biaya yang besar dan waktu yang lama. Untuk itu perlu terobosan dan inovasi agar pengembangan dan penemuan obat tetap layak secara ekonomi. Dalam upaya merancang dan mengembangkan obat baru untuk penyakit infeksi VHB ini, langkah awal yang dilakukan antara lain dengan mengembangkan kandidat obat yang telah ada, yang sudah diketahui struktur molekul dan aktivitas biologisnya, untuk dijadikan sebagai senyawa penuntun atas dasar penalaran yang sistematik dan rasional dengan mengurangi faktor coba-coba seminimal mungkin. Teknik-teknik komputasional yang digunakan dalam desain obat berbasis struktur menjadi teknik yang efisien untuk pengembangan dan optimasi senyawa obat agar menghasilkan obat yang lebih poten. Selain itu teknik ini dapat memberikan gambaran dan prediksi yang lebih detail tentang mekanisme aksi suatu obat dalam mengatasi suatu penyakit.

0290: Firdayani dkk. Telah diketahui bahwa senyawa yang terkandung dalam produk alami mempunyai potensi untuk dikembangkan sebagai obat. Dengan berkembangnya teknologi komputer, rancangan obat rasional mempunyai prospek yang cerah dalam pencarian obat baru. Dengan bantuan program pemodelan dan dinamika molekul, dan telah diketahui sruktur molekul tiga dimensi enzim sebagai reseptor target, akan dapat diketahui cara kerja obat pada tingkat molekul dan peran berbagai kekuatan sifat fisika dan kimia pada proses interaksi obatreseptor.[7] Dalam riset terapan ini dipilih senyawa 1,4nafokuinon sebagai senyawa penuntun untuk dikembangkan sebagai kandidat senyawa obat untuk infeksi VHB. Berdasarkan literatur diketahui beberapa turunan senyawa ini mempunyai aktivitas yang luas antara lain sebagai antikanker, antifungal, antibakteri dan antiviral. Crosby et al.(2011) menemukan bahwa derivat naftokuinon yang berbentuk trimer mempunyai aktivitas antivirus hepatitis B dengan EC50 sebesar 0,009 µM dan senyawa kecil monomernya juga menghambat bahkan terhadap virus yang resistant terhadap analog nukleosida golongan cytidine (3TC).[8] Berbagai macam kemungkinan turunan naftokuinon hasil modifikasi digambar dan diprediksi kemungkinannya sebagai inhibitor VHB secara in silico. Senyawa naftokuinon dan turunannya ini kemudian disintesis dan diuji aktivitas penghambatannya secara in vitro terhadap enzim glikohidrolase dan reverse-transkriptase serta terhadap kultur sel hati yang telah terinfeksi virus hepatitis B. Hasil pengujian selanjutnya dianalisa hubungan kuantitatif struktur dengan aktivitas untuk melihat sifat kimia fisika yang berperan, substituen atau gugus yang memberikan aktivitas dan memprediksi senyawa dengan struktur ”terbaik” sebagai kandidat senyawa antivirus hepatitis B turunan naftokuinon. Dengan demikian kegiatan riset ini merupakan inovasi dalam penemuan obat dimana dilakukan kombinasi antara kegiatan komputasi dengan laboratorium. Dalam riset ini dikurangi faktor coba-coba untuk mendapatkan obat baru sebagai antivirus hepatitis B sehingga menghemat biaya dan waktu yang biasa diperlukan untuk pengembangan obat. TABEL 1: Afinitas ikatan ligan-reseptor hasil simulasi docking

Prosiding InSINas 2012

0290: Firdayani dkk.

II.

KO-37

METODOLOGI

• Simulasi dengan pemodelan molekular senyawasenyawa derivat naftokuinon dalam berinteraksi dengan reseptor target secara komputasi dilakukan menggunakan program Autodock vina dan Amber. • Senyawa terpilih disintesis dalam beberapa tahap, senyawa hasil sintesis dimurnikan dengan khromatografi atau rekristalisasi dan dianalisa sifat fisikokimianya. Konfirmasi dan identifikasi struktur senyawa hasil sintesis dengan metoda khromatografi dan spektrofotometri antara lain dengan GS-MS, LC-MS, FTIR dan NMR. • Pengujian aktivitas menghambat enzim glikohidrolase dan reverse transcriptase dari naftokuinon dan derivatnya menggunakan metode spektrometri.

G AMBAR 1: Pola interaksi 2HNDIG dengan protein HBx

• Analisis hubungan kuantitatif struktur - aktivitas untuk mengetahui sifat fisikokimia yang berperan dan mekanisme aksi dalam aktivitas menghambat replikasi virus hepatitis B serta menentukan struktur ideal turunan naftokuinon sebagai kandidat antivirus.

III.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Telah dilakukan simulasi docking dengan ligan naftokuinon dan turunan-turunannya ke dalam reseptor-reseptor target protein atau enzim yang berperan dalam proses replikasi virus hepatitis B yaitu: HBx, glikohidrolase dan reverse transcriptase. Hasil simulasi docking ke dalam reseptor target antivirus hepatitis B tertera pada TABEL 1. Adapun pola interaksi antara senyawa 2HNDIG dengan reseptor-reseptor tersebut dapat dilihat pada G AMBAR 1, G AMBAR 2 dan G AMBAR 3. Simulasi dinamika ligan 2HNDIG dalam enzim reverse transcriptase menunjukkan terjadinya pelemahan ikatan yang diakibatkan respon reseptor. Dari gambar di atas dapat terlihat bahwa interaksi ligan-reseptor terdiri dari tiga ikatan hidrogen (dengan Lys350 dan Tyr336) dan interaksi hidrofobik dengan 3 residu asam amino (His96, Trp266, dan Lys353). Sedangkan pola interaksi setelah simulasi dinamika molekul ditunjukkan pada G AMBAR 5. Hasil simulasi dinamika menunjukkan pengurangan ikatan hidrogen dan penambahan jumlah residu-residu yang berinteraksi hidrofobik. Pengurangan jumlah ikatan hidrogen ini berperan dalam pelemahan interaksi ligan-reseptor. Senyawa terpilih selanjutnya disintesis dan dikonfirmasi strukturnya pada tiap-tiap tahap. Pada tahun pertama ini sintesis yang telah dilakukan belum sampai pada senyawa diharapkan, melainkan baru diperoleh senyawa antara/ intermedietnya antara

G AMBAR 2: Pola interaksi 2HNDIG dengan enzim glukohidrolase

lain 2-hidroksi-3-bromo-1,4-naftokuinon yang dihasilkan dari reaksi brominasi 2-hidroksi-1,4-naftokuinon. Untuk mengetahui hubungan kuantitatif strukturaktivitas, dilakukan uji aktivitas penghambatan beberapa senyawa turunan naftokuinon terhadap enzim yang berperan dalam replikasi virus menggunakan metode spektrofotometri UV/visual. Pada penelitian ini, dilakukan uji penghambatan virus hepatitis B terhadap enzim α dan β-glukosidase menggunakan senyawa turunan naftokuinon dengan metode in vitro enzimatis. Uji ini didasarkan pada reaksi substrat enzim yang akan menghasilkan produk pnitrophenyl. Produk ini akan menghasilkan warna kekuningan yang kemudian diukur dengan spektrofotometri dengan panjang gelombang 400nm. Semakin bening suatu larutan maka semakin aktif sampel tersebut menghambat enzim α-glukosidase dan βglukosidase. Prosiding InSINas 2012

KO-38

0290: Firdayani dkk.

G AMBAR 3: Pola interaksi 2HNDIG dengan enzim reverse transcriptase

G AMBAR 5: Pola interaksi senyawa 2HNDIG dengan reverse transcriptase setelah simulasi dinamik

TABEL 2: Nilai IC50 senyawa turunan naftokuinon terhadap enzim α- dan β-glukosidase

G AMBAR 4: Pola interaksi senyawa 2HNDIG dengan reverse transkriptase sebelum simulasi dinamika

Berdasarkan data di atas, diketahui bahwa turunan naftokuinon mempunyai potensi sebagai penghambat enzim yang terlibat dalam replikasi virus antara lain α-glukosidase dan β-glukosidase. Enzim-enzim ini merupakan penyusun enzim glikohidrolase, yaitu en-

zim yang berperan dalam pembentukan amplop virusdan bertanggung jawab terhadap glikohidrolasi protein. Virus Hepatitis B merupakan salah satu virus beramplop yang terdiri dari membran lipid yang dibentuk dari sel inang yang terinfeksi. Penghambatan enzim glikohidrolase dapat menghambat pembentukan amplop virus hepatitis B sehingga replikasi virus menjadi tidak sempurna dan pada akhirnya virus akan mati. Dari data penghambatan enzim -glukosidase derivat naftokuinon dilakukan analisis HKSA yang melibatkan parameter-parameter fisika kimia yang diperoleh dari perhitungan teoritis. Data-data tersebut diolah dengan regresi linear dan non linear menggunakan program Prosiding InSINas 2012

0290: Firdayani dkk.

KO-39

SPSS sehingga didapat persamaan HKSA yang akan mengetahui parameter yang mempunyai hubungan dengan aktivitas. Beberapa persamaan diperoleh melibatkan sifat hidrofobik dan sterik dalam aktivitas antikanker turunan naftokuinon adalah sebagai berikut:  Log

1 IC50

 = 0, 03M R − 2, 61

R2 = 0, 497 F = 4, 946 s = 0, 546   1 Log = 0, 02M R − 1, 85 IC50

(1)

(2)

R2 = 0, 545 F = 5, 995 s = 0, 519  1 = −0, 58ClogP + 0, 01CM R − IC50 2, 91

(3)

R2 = 0, 797 F = 7, 830 s = 0, 389   1 Log = 0, 045logP 2 − 0.048logP − IC50 1, 084

(4)

 Log

R2 = 0, 436 F = 1, 548

 Log

1 LC50



DAFTAR PUSTAKA

s = 0, 650

= −0, 079logP 2 − 0, 048logP − 1, 084

(5)

F = 1, 548 s = 0, 650 −   1 Log = −0, 08ClogP 2 LC50 0, 373ClogP − 2, 365

(6)

R = 0, 677 F = 4, 189 s = 0, 490  1 = 0, 031logP 2 + 0, 222logP + LC50 0, 032M R − 3, 155

(7)

2

R = 0, 436

2

 Log

2

R = 0, 982

F = 55, 415 s = 0, 132

Berdasarkan hasil analisa hubungan kuantitatif struktur-aktivitas tersebut terlihat bahwa parameter hidrofobik logP dan sterik M R mempunyai peranan dalam aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase pada turunan naftokuinon. Persamaan tersebut, terutama P ERS . (7) yang memiliki parameter statistik optimal, dapat digunakan untuk merancang struktur turunan naftokuinon yang berpotensi antivirus dengan aktivitas maksimal.

IV.

senyawa ini masih dalam tahap pengerjaan dan telah dihasilkan beberapa senyawa intermediet Sementara itu, untuk mengetahui hubungan struktur naftokuinon dengan aktivitas antivirus telah dilakukan uji penghambatan terhadap enzim alfa dan beta glukosidase dengan metode spektrofotometri. Pada tahun berikutnya disarankan untuk melanjutkan sintesis hingga diperoleh senyawa yang diinginkan dan dilakukan optimasi kondisi-kondisi prosesnya. Senyawa yang dihasilkan selanjutnya diuji aktivitas inhibisi virus secara in vitro menggunakan sel yang telah ditransfeksi plasmid DNA virus hepatitis B.

[1] World Health Organization, Hepatitis B. World Health Organization Fact Sheet no. 2004. available at http://who.int/mediacentre/factsheets/fs204/en [2] Lafanchy D., Hepatitis B Virus epidemiology, disease burden, treatment,and current and emerging prevention and control measures, J. Viral Hepat. 2004;11:97-107. [3] Lok A.S., Chronic Hepatitis B. N. Engl. J. Med. 2002;346:1682-3.Hou J, Liu Z, Gu F. Epidemiology and Prevention of Hepatitis B Virus Infection, Int. J. Med. Sci. 2005:2;50-57. [4] PPHI, Konsensus Penatalaksanaan Hepatitis B Kronik, 2003. [5] Hernomo K., Perkembangan baru pengobatan hepatitis virus B, Simposium Perkembangan Mutakhir di Bidang Gastro-hepatologi, Surabaya, 23 Oktober 1999. [6] Hernomo K, Perkembangan baru dalam penatalaksanaan hepatitis virus B dan C, Pekan ilmiah dalam Acara Peringatan 12 Tahun RS Pupuk Kaltim, Bontang, Kaltim, 10 Agustus 2002. Dalam website:http://www.pgh.or.id [7] Siswandono, B. Soekardjo, Kimia Medisinal 1, Airlangga University Press, Surabaya [8] Crosby, et al., Antiviral agents 3. Discovery of a novel small molecule non-nucleoside inhibitor oh Hepatitis B Virus (HBV), Bioorganic & Medicinal Chemistry 21, 2011: 1644-1648

KESIMPULAN

Desain struktur senyawa hasil simulasi docking dan dinamika dalam reseptor target memberi menunjukkan bahwa senyawa 2HNDIG memiliki potensi menjadi kandidat obat turunan naftokuinon sebagai inhibitor virus hepatitis B. Hingga saat ini proses sintesis Prosiding InSINas 2012