PENGEMBANGAN ENZIM REKOMBINAN REVERSE TRANSCRIPTASE SIMIAN BETARETROVIRUS SEROTIPE-2 ISOLAT INDONESIA ASAL MONYET EKOR PANJANG UUS SAEPULOH

PENGEMBANGAN ENZIM REKOMBINAN REVERSE TRANSCRIPTASE SIMIAN BETARETROVIRUS SEROTIPE-2 ISOLAT INDONESIA ASAL MONYET EKOR PANJANG

UUS SAEPULOH

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul “Pengembangan Enzim Rekombinan Reverse Transcriptase Simian Betaretrovirus Serotipe-2 Isolat Indonesia Asal Monyet Ekor Panjang” adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Agustus 2013

Uus Saepuloh NIM P063100011

RINGKASAN UUS SAEPULOH. Pengembangan Enzim Rekombinan Reverse Transcriptase Simian Betaretrovirus Serotipe-2 Isolat Indonesia Asal Monyet Ekor Panjang. Dibimbing oleh DONDIN SAJUTHI, DIAH ISKANDRIATI, dan DEDY DURYADI SOLIHIN. Reverse transcriptase (RT) retrovirus merupakan suatu enzim multifungsi yang mengkatalisis pembentukan DNA utas ganda dari RNA utas tunggal genom retrovirus. Proses yang kompleks ini disebut dengan transkripsi balik (reverse transcription) yaitu suatu tahapan yang sangat penting dalam siklus hidup retrovirus dan bertanggung jawab terhadap replikasi genomnya. Di bidang bioteknologi, enzim RT retrovirus telah dimanfaatkan sebagai salah satu perangkat yang sangat penting dalam bidang biologi molekuler yaitu untuk menyintesis DNA komplementer (cDNA) dari mRNA. Aplikasi dari enzim RT ini telah memberikan pemahaman yang luas mengenai sejumlah mekanisme regulator seluler. Selain itu, kombinasi antara aktivitas RT dengan amplifikasi PCR telah menjadi suatu gold standard dalam proses pengklonaan daerah penyandi gen (coding region) dari berbagai sasaran gen yang diinginkan. Di bidang biomedis, enzim RT asal virus HIV-1 (human immunodeficiency virus) merupakan enzim yang paling banyak dipelajari sebagai sasaran utama dalam pengembangan senyawa obat antiretrovirus untuk terapi penyakit AIDS (acquired immunodeficiency syndrome). Simian betaretrovirus serotipe-2 (SRV-2) merupakan agen penyebab terjadinya sindroma penurunan kekebalan tubuh dan bertanggung jawab terhadap terjadinya morbiditas dan mortalitas pada satwa primata monyet Asia genus Macaca. Infeksi SRV-2 pada Macaca juga dapat menjadi faktor pengganggu (confounding variable) dalam penelitian biomedis yang menggunakan satwa primata ini sebagai hewan model penelitian. Namun demikian, terdapat potensi menguntungkan yang dapat dieksplorasi dengan mempelajari virus SRV-2 ini. Virus ini dapat dijadikan sebagai model untuk mempelajari retrovirus lainnya terutama terhadap HIV/AIDS melalui pemahaman mekanisme interaksi dengan inangnya dan efek imunosupresi, mekanisme infeksi, struktur virus, serta pengembangan antiretrovirus dan vaksinnya. Sebagaimana karakteristik yang dimiliki oleh semua retrovirus, SRV-2 mempunyai kemampuan untuk mentranskripsi balik genom RNA-nya menjadi DNA utas ganda melalui aksi dari enzim reverse transcriptase. Adanya gen penyandi enzim RT pada SRV-2 sangat potensial untuk dipelajari dan dimanfaatkan sebagai model enzim RT untuk pengembangan kandidat senyawa obat anti-RT terhadap retrovirus. Selain itu, dapat dimanfaatkan juga melalui pengembangan enzim rekombinan RT SRV-2 untuk diaplikasikan dalam bidang biologi molekuler. Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk menghasilkan enzim rekombinan RT SRV-2 isolat Indonesia asal monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) melalui tahapan penelitian: Isolasi, pemodelan struktur 3D dan karakterisasi molekuler, ekspresi gen menggunakan sistem ekspresi Escherichia coli, pemurnian, analisis hasil ekspresi dan uji aktivitas enzim rekombinan RT SRV-2. Isolasi gen penyandi enzim RT SRV-2 dilakukan menggunakan teknik PCR yang dilanjutkan dengan perunutan nukleotida dengan teknik sekuensing.

Pemodelan struktur 3D dilakukan menggunakan program I-TASSER (Iterative Threading ASSEmbly Refinement) yang divisualisasi dengan program PyMol. Ekspresi gen target RT SRV-2 dilakukan dalam sistem ekspresi E.coli dengan metode Gateway technology menggunakan vektor entry pENTR/SD/TOPO dan vektor destinasi pDEST17 yang diekspresikan dalam E.coli BL21AI. Pemurnian enzim rekombinan dilakukan menggunakan kromatografi afinitas Ni2+-NTA yang dilanjutkan dengan analisis ekspresi dengan teknik SDS-PAGE dan Western blot. Aktivitas enzim dianalisis menggunakan RT colorimetric assay dan diaplikasikan pada teknik reverse transcription PCR (RT-PCR). Gen penyandi enzim RT SRV-2 isolat Indonesia asal monyet ekor panjang telah berhasil diisolasi. Runutan nukleotida gen RT SRV-2 berada di daerah pol posisi 3284-4925 menyandikan 547 asam amino yang meliputi domain polimerase dan RNase H. Program komputasi I-TASSER berhasil memprediksi struktur tiga dimensi RT SRV-2 yang terdiri atas domain palm/finger, thumb, connection dan RNase H. Situs aktif polimerase mengandung tiga residu aspartat pada sisi katalitiknya yaitu Asp90, Asp165, Asp166 dan mempunyai motif sangat lestari (conserved region) YMDD yaitu Tyr163, Met164, Asp165, dan Asp166. Model struktur ini memiliki homologi tertinggi dengan RT HIV-1 (2B6A). Domain RNase H juga berhasil ditentukan struktur molekulnya secara parsial yang mempunyai homologi dengan RNase H E.coli (1GOA) dan RNase H HIV-1 (3HYF). Situs katalitik RNase H SRV-2 mengandung tiga asam amino dengan residu karboksilat yaitu Asp436, Glu465 dan Asp486. Gen RT SRV-2 berhasil diekspresikan melalui tahapan pengklonaan pada vektor pENTR/SD/TOPO dan disubklonakan pada vektor pDEST17. Analisis hasil ekspresi menggunakan teknik SDS PAGE dan Western blot menunjukkan adanya pita protein spesifik berukuran 64.9 kDa yang diperkirakan sebagai enzim rekombinan RT SRV-2. Pemurnian terhadap enzim rekombinan RT SRV-2 menghasilkan 312 µg mL-1 protein yang memiliki aktivitas enzim sebesar 7.1 Unit (U) µL-1. Aplikasi enzim rekombinan SRV-2 RT pada teknik RT-PCR terhadap target gen β-globin dan β-aktin menunjukkan bahwa enzim ini mampu mentranskripsi balik mRNA menjadi cDNA. Hal ini ditunjukkan dengan adanya pita DNA berukuran 206 base pairs (bp) dan 350 bp yang spesifik untuk gen βglobin dan β-aktin. Dengan demikian, enzim rekombinan RT SRV-2 memiliki aktivitas yang mirip dengan enzim komersial sejenis, meskipun aktivitasnya masih rendah. Kata kunci:

reverse transcriptase, enzim rekombinan RT SRV-2, I-TASSER, sistem ekspresi Escherichia coli

SUMMARY UUS SAEPULOH. Development of Serotype-2 Simian Betaretrovirus Reverse Transcriptase Recombinant Enzyme Isolated from Indonesian Cynomolgus Monkey. Supervised by DONDIN SAJUTHI, DIAH ISKANDRIATI, and DEDY DURYADI SOLIHIN. Reverse transcriptase (RT) is a multifunctional enzyme that catalyzes the formation of double-stranded DNA from single-stranded RNA viral genomes. Reverse transcription is an essential and critical step in life cycle of all retroviruses replication. RT has become an important enzyme in molecular biology, genetics and medicine for the synthesis of complementary DNA (cDNA) from messenger RNA (mRNA). The application of this enzyme combining with PCR amplification technique (RT-PCR) has expanded our knowledge of numerous cellular regulatory mechanisms and has become a gold standard to facilitate the coding region cloning of any gene of interest. The development of biotechnology has been relying on the availability of this efficient RT. In biomedical fields, RT of human immunodeficiency virus (HIV), the virus causing acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) has been the most studied enzyme due to the prime target for the development of antiretroviral drug therapy of HIV/AIDS. Simian betaretrovirus serotype-2 (SRV-2) is the causative agent of simian acquired immunodeficiency syndrome (SAIDS) in Asian macaques with varying severity. While SRV is an important pathogen in Asian macaque and causes a potential confounding variable in biomedical research, SRV also provides a valuable viral model to compare with other retrovirals for a better understanding of aspects of retroviral–host interactions, infection mechanism, retroviral structure, antiretroviral and vaccine development. As is characteristic of all retroviruses, SRV-2 can transcribe its own RNA genome into a double-stranded DNA by the action of reverse transcriptase enzyme. The presence of gene encoding RT enzyme in SRV-2 genome potentially be studied and utilized further as RT enzyme model for developing the anti RT drug of others retrovirus. On the other hands, the gene encoding SRV-2 RT can be isolated and cloned to produce RT recombinant enzyme and applied in molecular biology techniques. In this study, we isolated the gene encoding RT enzyme of SRV-2 that infected Indonesian cynomolgus monkey and predicted the three dimensional (3D) structure model using I-TASSER (Iterative Threading ASSEmbly Refinement) computational program and visualized with PyMol program. Gene expression was constructed in Escherichia coli expression system with Gateway technology methods using pENTR/SD/TOPO entry vector and pDEST17 destination vector. Purification was performed using Ni2+-NTA affinity chromatography. Expression was analyzed using SDS-PAGE and Western blot techniques; meanwhile enzyme activity was measured using RT colorimetric assay and RT-PCR technique. We isolated the gene encoding RT enzyme of SRV-2 Indonesian isolate at nucleotide position 3284-4925 consisted of 547 amino acids. The I-TASSER program has predicted the three dimensional structure model of RT SRV-2 enzyme that consisted of palm/finger, thumb, connection and RNase H domain.

The polymerase active site located in the finger/palm subdomain characterized by three conserved catalytic aspartates (Asp90, Asp165, Asp166), and has a highly conserved YMDD motif as Tyr163, Met164, Asp165, and Asp166. This SRV-2 RT structure model has the highest homology to HIV-1 RT (2B6A.pdb). Meanwhile, the structure of SRV-2 RNase H closely related to its ortologs such as Escherichia coli RNase H (1GOA) and HIV-1 RNase H (3QIO, 3HYF). The catalytic active site of SRV-2 RNase H contains three amino acid carboxylateresidues as Asp436, Glu465 and Asp486. Analysis of expression using SDS PAGE and Western blot techniques showed a specific band of 64.9 kDa, indicating SRV-2 RT recombinant enzyme. Purification of SRV-2 RT recombinant enzyme produced 312 µg mL-1 protein with 7.1 Unit (U) µL-1 enzyme activities. Application of this recombinant enzyme in reverse transcription-PCR (RT-PCR) of β-globin and β-actin genes produced DNA fragments of 206 base pairs (bp) and 350 bp, indicating amplification of βglobin and β-actin genes, respectively. Therefore, the expressed SRV-2 RT enzyme was proven to be functional, although the activity was low. Keywords: reverse transcriptase, recombinant enzyme, SRV-2 RT, Escherichia coli expression system, I-TASSER

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

PENGEMBANGAN ENZIM REKOMBINAN REVERSE TRANSCRIPTASE SIMIAN BETARETROVIRUS SEROTIPE-2 ISOLAT INDONESIA ASAL MONYET EKOR PANJANG

UUS SAEPULOH

Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Primatologi

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013

Penguji pada Ujian Tertutup: Prof Dr Ir Maggy Thenawidjaja Dr drh Joko Pamungkas, MSc

Penguji pada Ujian Terbuka: Prof Ir Antonius Suwanto, PhD Prof dr Mohamad Sadikin, DSc

Judul Disertasi: Pengembangan Enzim Rekombinan Reverse Transcriptase Simian Betaretrovirus Serotipe-2 Isolat Indonesia Asal Monyet Ekor Panjang Nama : Uus Saepuloh NIM : P063100011 Disetujui oleh Komisi Pembimbing

Prof drh Dondin Sajuthi, MST, PhD Ketua

Dr drh Diah Iskandriati Anggota

Dr Ir Dedy Duryadi Solihin, DEA Anggota Diketahui oleh

Ketua Program Studi Primatologi

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof drh Dondin Sajuthi, MST, PhD

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 26 Agustus 2013

Tanggal Lulus:

PRAKATA Segala puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT, karena atas berkah, rahmat, dan hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan disertasi dengan judul “Pengembangan Enzim Rekombinan Reverse Transcriptase Simian Betaretrovirus Serotipe-2 Isolat Indonesia Asal Monyet Ekor Panjang”. Disertasi ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor dari Program Studi Primatologi Sekolah Pascasarjana IPB. Pada kesempatan ini, penulis mengucapkan terimakasih kepada Prof drh Dondin Sajuthi, MST, PhD selaku ketua komisi pembimbing, Dr drh Diah Iskandriati dan Dr Ir Dedy Duryadi Solihin, DEA selaku anggota komisi pembimbing atas bimbingan, arahan, dan waktu yang diluangkannya kepada penulis sehingga penelitian ini dapat terselesaikan. Ucapan terimakasih juga disampaikan kepada penguji luar komisi ujian tertutup yaitu Prof Dr Ir Maggy Thenawidjaja dan Dr drh Joko Pamungkas, MSc; serta penguji luar komisi ujian terbuka yaitu Prof Ir Antonius Suwanto, PhD dan Prof dr Mohamad Sadikin, DSc; atas berbagai masukan demi perbaikan disertasi ini. Terimakasih kepada ketua Program Studi Primatologi Bapak Prof drh Dondin Sajuthi, MST, PhD beserta seluruh staf pengajar atas kesempatan studi di Sekolah Pascasarjana IPB. Penghargaan dan terimakasih penulis sampaikan kepada Dr drh Joko Pamungkas, MSc selaku Kepala Pusat Studi Satwa Primata Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat Institut Pertanian Bogor (PSSP LPPM IPB), Dr drh Diah Iskandriati selaku Kepala UPT Laboratorium PSSP LPPM IPB, atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk melanjutkan sekolah S3 di Sekolah Pascasarjana IPB dan penggunaan segala fasilitas yang diberikan untuk terlaksananya penelitian ini. Kepada Direktorat Perguruan Tinggi Kementrian Pendidikan dan Kebudayaan Republik Indonesia, penulis mengucapkan terimakasih atas sebagian dana penelitian yang diberikan melalui Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi Tahun 2012 dan kepada SEAMEO BIOTROP melalui program Thesis Research Grants for Indonesian PhD Students tahun 2012. Penulis juga menyampaikan terimakasih dan penghargaan kepada temanteman di Laboratorium Bioteknologi PSSP LPPM IPB yaitu: Sela Septima Mariya, SSi; Elis Dwi Ayuningsih, Amd; dan Mad Ramdan; kepada rekan-rekan di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi PSSP LPPM IPB : Silmi Mariya, SSi, MSi; Maryati Surya, SSi, MS; Rachmitasari Noviana, SKH, MSi; Isti Kartikasari, SSi, MSi; Iin Indriawati, SSi dan Tri Faujiani, SSi serta semua staf dan karyawan PSSP LPPM IPB atas bantuannya selama penelitian. Terimakasih yang tulus disampaikan kepada kedua Orang tua dan Mertua, Kakak-Kakak dan Adik-Adik atas segala doa untuk kesuksesannya. Kepada Isteri tercinta Dewi Ratnaningsih, SPdi; dan putera kami tercinta Azka Razaqy Saepuloh, atas segala doa, kasih sayang dan motivasi yang diberikan kepada penulis. Semoga Allah SWT senantiasa memberikan jalan kemudahan dalam mengungkap dan mempelajari ayat-ayat-Nya. Amiin Bogor, Agustus 2013 Uus Saepuloh

DAFTAR ISI DAFTAR TABEL

xii

DAFTAR GAMBAR

xii

DAFTAR LAMPIRAN

xiv

1 PENDAHULUAN Latar Belakang Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian Tempat dan Waktu Penelitian Ruang Lingkup Penelitian Kebaruan Penelitian

1 1 5 5 5 5 6

2 ISOLASI DAN MODEL STRUKTUR TIGA DIMENSI GEN PENYANDI ENZIM REVERSE TRANSCRIPTASE SIMIAN BETARETROVIRUS SEROTIPE-2 (SRV-2) ASAL MONYET EKOR PANJANG INDONESIA 9 Pendahuluan 9 Bahan dan Metode 11 Hasil dan Pembahasan 13 Simpulan 20 3 ISOLASI DAN MODEL STRUKTUR TIGA DIMENSI ENZIM RNASE H ASAL SIMIAN BETARETROVIRUS SEROTIPE-2 (SRV-2) YANG DIISOLASI DARI MONYET EKOR PANJANG INDONESIA 21 Pendahuluan 21 Bahan dan Metode 23 Hasil dan Pembahasan 24 Simpulan 30 4 PENGKLONAAN DAN EKSPRESI GEN PENYANDI REVERSE TRANSCRIPTASE SIMIAN BETARETROVIRUS SEROTIPE-2 (SRV-2) ASAL MONYET EKOR PANJANG INDONESIA MENGGUNAKAN SISTEM EKSPRESI ESCHERICHIA COLI Pendahuluan Bahan dan Metode Hasil dan Pembahasan Simpulan

31 31 33 35 43

5 PEMBAHASAN UMUM

43

6 SIMPULAN DAN SARAN

49

DAFTAR PUSTAKA

50

LAMPIRAN

56

RIWAYAT HIDUP

59

DAFTAR TABEL 2.1 Perbandingan asam amino yang berperan dalam pembentukan motif dari RT SRV-2 Indo terhadap RT HIV-1 3.1 Perbandingan asam amino yang berperan dalam situs aktif RNase H SRV-2 dan HIV-1 4.1 Pengukuran secara kuantitatif konsentrasi protein dan aktivitas enzim. Konsentrasi protein ditentukan dengan Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific) dan aktivitas enzim diukur dengan Reverse Transcriptase Assay colorimetric Kit (Roche)

17 30

41

DAFTAR GAMBAR 1.1 Skema proses reverse transcriptase pada Retrovirus. Garis hitam (RNA), garis jingga muda (utas negatif DNA), garis jingga tua (utas positif DNA) (Coffin et al. 1997) 1.2 Peta organisasi genom lengkap virus SRV-2 yang disusun oleh gen gag, pol dan env berukuran sekitar 8,000 bp (Coffin et al. 1997) 1.3 Kerangka pemikiran Pengembangan Enzim Rekombinan Reverse Transcriptase Simian Betaretrovirus Serotipe-2 (SRV-2) isolat Indonesia Asal Monyet Ekor Panjang (Macaca fascicularis) 1.4 Bagan alir rencana penelitian pengembangan enzim rekombinan reverse transcriptase simian betaretrovirus serotipe-2 (SRV-2) isolat Indonesia asal monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) 2.1 Hasil amplifikasi PCR terhadap gen RT SRV-2 isolat indonesia, M) 1kb DNA ladder (Invitrogen), 1-2) produk PCR dari RT SRV-2 menghasilkan 1641 bp, 3) kontrol pereaksi 2.2 Pohon filogenetik dari runutan asam amino RT SRV-2 terhadap retrovirus lainnya. RT SRV-2 isolat Indonesia ditandai dengan warna merah 2.3 Penyejajaran runutan asam amino dan prediksi motif struktur sekunder RT SRV-2 Indo dan RT HIV-1. Runutan asam amino RT SV-2 Indo pada posisi 1-547 dan RT HIV-1 pada posisi 18-553. Motif dicirikan oleh heliks-α (H) lembaran-β (S), dan coils (C). Asam amino yang berperan dalam situs aktif ditandai huruf merah dan bayangan merah, huruf hijau untuk runutan yang berikatan dengan DNA, huruf biru untuk berikatan dengan dNTPs, dan huruf ungu/bayangan ungu adalah hibrid RNA-DNA (RNase H) 2.4 Model struktur tiga dimensi dari enzim RT SRV-2 Indo menggunakan program I-TASSER yang divisualisasi dengan program PyMol. Nilai estimasi akurasinya yaitu 0.90±0.06 (TMscore), 4.7±3.1Å (RMSD) dan C-score = 1.33. Subdomain fingers/palm, thumb, connection, dan RNaseH ditandai dengan warna merah tua, ungu, biru tua, dan hijau secara berurutan. Bulatan biru muda menggambarkan residu situs aktif polimerase dan situs

2 4 7 8 13 14

16

pengikatan dNTPs, sedangkan motif YXDD digambarkan oleh bulatan warna kuning 2.5 Model superposisi antara RT SRV-2 Indo dengan RT HIV-1 (2B6A.pdb), nilai estimasi akurasinya yaitu 0.911 (TM-score), 1.85 Å (RMSD), dan 0.953 (coverage). 2.6 Diagram pita dari dari RT SRV-2 Indo yang terikat pada model stick substrat dupleks oligonukleotida RNA/DNA 18-19-basa. Berbagai variasi domain enzim diwarnai seperti pada Gambar 2.4. Situs aktif asam amino dari DNA polimerase dan RNase H digambarkan dalam bulatan warna kuning 2.7 Interaksi antara asam amino yang berperan penting dalam situs aktif polimerase pada RT SRV-2 Indo dengan bagian terminal dari dupleks RNA/DNA. DNA diindikasikan dengan model stick berwarna merah dan biru, sedangkan RNA dicirikan dengan stick warna merah, putih dan biru dan ditandai dengan -1, -2, dan -3 sebagai dupleks, sedangkan RNA yang menggantung ditandai dengan +1. A) situs RT SRV-2 digambarkan dalam permukaan berwarna hijau dengan asam amino lestari berupa Asp165, Gln131, Gly132, dan Arg58 (ditunjukkan dalam stick warna hijau). (B) Interaksi situs aktif asam amino RT SRV-2 yang digambarkan dalam model stick warna hijau 3.1 Hasil amplifikasi PCR terhadap gen RNase H SRV-2, M) 100 bp DNA ladder (Invitrogen), 1) produk PCR RNase H SRV-2 menghasilkan 354 bp 2) Kontrol reagen 3.2 Pohon filogenetik runutan asam amino RNase H dari berbagai retrovirus 3.3 Hasil penyejajaran majemuk (multiple alignment) domain RNase H berbagai retrovirus beserta keterangan prediksi struktur dua dimensi dan daerah lestarinya 3.4 Model struktur tiga dimensi RNase H SRV-2 (Panel A) dibandingkan dengan RNase H HIV-1 (Panel B) dan superposisi diantara keduanya (Panel C). Model bola menggambarkan residu motif DED dari sisi aktif RNase H. Struktur heliks α digambarkan dengan huruf kapital (A- E) dan lembaran β dengan nomor (1-5) 3.5 Sisi aktif katalitik residu asam amino yang berinteraksi dengan kation Mg2+ (ditunjukkan dengan bulat kuning) pada RNase H SRV2 (A) dan RNase H HIV-1 (B) 3.6 Interaksi sisi aktif RNase H SRV-2 (A) dan HIV-1 (B) dengan substrat nukleotida RNA. Residu asam amino yang berinteraksi dengan nukleotida digambarkan dengan model bola dan nukleotida RNA digambarkan dengan model tongkat 4.1 Amplifikasi gen RT SRV-2 menggunakan primer spesifik RT SRV2 RT 3284F dan 4925R. M) 100 bp DNA ladder (Invitrogen), 1-2) Produk PCR RT SRV-2 berukuran 1641bp 4.2 A) Amplifikasi PCR terhadap plasmid pENTR/SD/TOPO RT SRV-2 menggunakan primer M13 F dan M13 R, M) 1kb DNA ladder (Invitrogen); 1-2) Produk PCR berukuran 1991 bp mengandung RT

17 18

19

20 25 25 27

28 29

29 35

SRV-2. B) Ilustrai peta genetik vektor pENTR/SD/TOPO- RT SRV2 4.3 Runutan nukleotida RT SRV-2 isolat Indonesia pada posisi nukleotida 3284-4925 yang disisipkan ke dalam vektor pENTR/SD/TOPO. Situs-situs spesifik dari vektor ditandai dengan huruf tebal dan posisi primer dicirikan dengan huruf warna merah 4.4 A) Amplifikasi PCR terhadap plasmid pDEST17 RT SRV-2 menggunakan primer T7 forward dan SRV-2 RT4925R, M) 1 kb DNA ladder (Invitrogen), 1-2) Produk PCR berukuran 1829 bp. B) ilustrasi peta genetik vektor pDEST17- RT SRV-2 4.5 Runutan nukleotida RT SRV-2 isolat Indonesia pada posisi nukleotida 3284-4925 yang disisipkan ke dalam vektor pDEST17. Situs-situs spesifik dari vektor ditandai dengan huruf tebal dan posisi primer dicirikan dengan huruf warna merah 4.6 Panel A: Hasil elektroforesis SDS PAGE terhadap sampel protein rekombinan RT SRV-2. M) Broad low prestained marker (BioRad) 1) pra-purifikasi, 2) bufer pengikat, 3) bufer pencuci, 4) bufer elusi. Panel B: Analisis hasil ekspresi RT SRV-2 dengan teknik Western blot terhadap antibodi spesifik anti-6xHis. M) Kaleidoskop prestained marker (BioRad), 1) pra-pemurnian, 2) bufer elusi, 3) bufer pencuci, 4) bufer pengikat 4.7 Hasil uji two step RT PCR menggunakan enzim RT SRV-2 dibandingkan dengan enzim RT komersial Superscript III RT (SSTIII, Invitrogen®). M) 100 bp DNA ladder (Invitrogen), 1-4) ulangan sampel, 5) kontrol reagensia 5.1 A). Skema kloning gen dan transfer melalui kloning rekombinasi. Segitiga menunjukkan sisi rekombinasi. Gene yang berupa produk PCR diklonkan ke dalam vektor entry yang mengandung situs attL, KmR dan disubklonakan dengan reaksi LR clonase ke dalam vektor destinasi yang mengandung situs attR, ApR dan ccdB. B). Sekuens dari sisi attB1 dan attB2 yang menempel pada gene dalam klona ekspresi (Hartley et al. 2000)

36

37

38

39

40

42

48

DAFTAR LAMPIRAN 1 Hasil pengukuran konsentrasi protein enzim rekombinan RT SRV-2 dengan teknik BCA Assay 2 Hasil pengukuran konsentrasi enzim rekombinan RT SRV-2 dengan teknik RT colorimetric assay

57 58

1

1 PENDAHULUAN Latar Belakang Selama beberapa dekade terakhir, enzim reverse transcriptase (RT) menjadi salah satu perangkat yang sangat penting dalam bidang biologi molekuler yaitu untuk menyintesis DNA komplementer (cDNA) dari mRNA. Aplikasi dari enzim RT ini telah memberikan pemahaman yang luas mengenai sejumlah mekanisme regulator seluler. Selain itu, kombinasi antara aktivitas enzim RT dengan amplifikasi PCR telah menjadi suatu gold standard dalam proses pengklonaan daerah penyandi gen (coding region) dari berbagai sasaran gen yan diinginkan. Enzim RT telah menjadi bagian penting dalam perkembangan biologi molekuler, genetik, dan biomedis. Sampai saat ini, kemajuan bioteknologi sangat tergantung salah satunya terhadap keberadaan enzim RT yang efisien misalnya diaplikasikan dalam teknik microarray untuk mentranskripsi balik mRNA menjadi cDNA dalam menganalisis berbagai ekspresi gen (Hizi dan Herschhorn 2008). Penemuan enzim RT oleh Temin dan Baltimore pada tahun 1970 telah memberikan pengaruh yang besar dalam kemajuan penelitian bidang biologi molekuler. Identifikasi terhadap enzim ini yang pertama kali ditemukan pada virus RNA penyebab tumor merupakan enzim yang bersifat RNA-dependent DNA polymerase. Identifikasi ini telah memberikan tambahan dalam dogma pusat aliran informasi genetik, yaitu dari RNA ke DNA melalui proses transkripsi balik (reverse transcription). Enzim RT memiliki aktivitas antara lain yaitu sebagai RNA-dependent DNA polymerase (RDDP), DNA-dependent DNA polymerase (DDDP), dan ribonuklease H (RNase H) yang akan memecah utas RNA dari heterodupleks RNA-DNA (Herschhorn dan Hizi 2010; Goff 2001; Coffin et al. 1997). Proses reverse transkripsi diinisiasi setelah terjadinya penggabungan antara enzim RT dengan RNA genomik virus dan primer. Primer diperlukan oleh semua RT untuk inisiasi proses sintesis DNA. Transfer RNA (tRNA) asal sel inang bertindak sebagai primer tersebut yang berbeda-beda tergantung virusnya. tRNAlys3 digunakan oleh lentivirus dan betaretrovirus, tRNApro digunakan gamaretrovirus, dan tRNAtrp oleh alfaretrovirus. tRNA mengandung 18 nukleotida pada ujung 3’ yang bersifat komplementer terhadap primer binding site (PBS) yang berlokasi dekat dengan ujung 5’ dari genom RNA virus (pada HIV-1, PBS berlokasi di 180 nukleotida dari ujung) sehingga memungkinkan terjadinya hibridisasi diantara keduanya (Flint et al. 2009; Coffin et al. 1997; Herschhorn dan Hizi 2010). Proses reverse transkripsi diinisiasi dengan menyintesis utas DNA (-) pertama yang bersifat komplementer terhadap utas (+) RNA genom virus. Sintesis ini dimulai dengan memperpanjang terminal 3’-OH dari primer tRNA yang mengopi ujung 5’ dari genom RNA virus yang mengandung sekuens unique 5’ (U5) dan daerah repeat (R). Terbentuknya utas DNA yang baru disintesis dengan utas RNA virus menghasilkan suatu hibrid RNA-DNA dimana utas RNA selanjutnya dihidrolisis oleh aktivitas RNase H yang berasosiasi dengan RT. Aktivitas ini menggunakan model pemecahan langsung pada ujung 3’ DNA untuk menghidrolisis RNA dan meninggalkan utas tunggal DNA bermuatan (-) sebagai utas (-) strong stop DNA (sssDNA). Pembentukan segmen (-) sssDNA mengandung sekuens yang bersifat komplementer terhadap sekuens identik repeat (R) yang berlokasi baik pada ujung 5’ maupun 3’ dari genom virus. Panjang

2 daerah R bervariasi pada berbagai retrovirus retrovirus pada kisaran 12 nukleotida pada MMTV (mouse mammary tumor virus) sampai 235 nukleotida pada BLV (bovine leukemia virus). Akibat dari dulpikasi daerah R, (-) sssDNA dapat mengalami transfer utas (-) (strand transfer(-)) dan berhibridisasi terhadap sekuens R yang berlokasi pada ujung 3’ molekul virus. Setelah utas DNA asal berhibridisasi dengan utas (-) daerah R ujung 3’, sintesis DNA berlanjut sepanjang RNA virus, sedangkan RNase H langsung mendegradasi RNA yang telah dikopi (Herschhorn dan Hizi 2010; Flint et al. 2009; Coffin et al.1997).

Gambar 1.1

Skema proses reverse transcriptase pada Retrovirus. Garis hitam (RNA), garis jingga muda (utas negatif DNA), garis jingga tua (utas positif DNA) (Coffin et al. 1997).

Pemotongan dengan RNase H tidak bersifat sekuens spesifik, tetapi sekuens yang kaya akan purin (polypurine tracks, tracks, PPTs) mempunyai ketahanan terhadap hidrolisis RNase H (Coffin et al. 1997; Goff 2001). 2001). PPT berlokasi dekat dengan ujung 3’ dari RNA virus (3’-PPT) yang sedikit berbeda pada retrovirus yang berbeda. PPT bertindak sebagai primer utama untuk sintesis DNA utas (+) setelah penghilangan sekuens RNA lainnya. Segmen RNA lainnya yang tertinggal setelah degradasi RNA parsial juga dapat bertindak sebagai primer minor untuk sintesis DNA utas (+). Dengan demikian, walaupun semua retrovirus menginisiasi sintesis utas (+) menggunakan PPT ujung 3’

3 sebagai primer, namun beberapa retrovirus seperti HIV-1, equine infectious anemia virus (EIAV), feline immunodeficiency virus (FIV) dan avian sarcoma and leukosis virus (ASLV), memulai sintesis DNA utas (+) dari sisi dimulainya penambahan RNA (Herschhorn dan Hizi 2010). Proses sintesis DNA utas (+) ini akan terhenti pada ujung primer tRNA yang sudah mengalami transkripsi balik menghasilkan utas DNA yang disebut plus-strand strong-stop DNA (+sssDNA). RNase H akan mendegradasi primer tRNA menghasilkan sekuens (+)sssDNA yang berkomplemen dengan sekuens pada ujung 3’ dari DNA utas (-). Adanya komplemen segmen PBS pada (+)sssDNA dengan pada DNA utas (-) memungkinkan terjadinya transfer utas kedua (second strands transfer). Terjadinya sintesis DNA utas (+) dan (-) secara komplit menghasilkan utas ganda DNA yang akan dijadikan cetakan untuk utas berikutnya (Herschhorn dan Hizi 2010; Flint et al. 2009; Coffin et al. 1997 ). Tahapan proses RT retrovirus terdapat pada Gambar 1.1. Gencarnya penelitian mengenai enzim RT dipicu oleh penemuan retrovirus manusia yaitu human immunodeficiency virus (HIV) pada dekade 1980-an yang merupakan agen patogen penyebab terjadinya acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) pada manusia. Telah tersedianya informasi mengenai retrovirus dan enzim RT sangat membantu dalam identifikasi dan penelitian mengenai agen patogen ini. Tingginya morbiditas dan mortalitas pada penderita HIV/AIDS mengharuskan ditemukannya agen antiretrovirus untuk tujuan terapi (Hizi dan Herschhorn 2007). Sehubungan dengan peran sentral enzim RT dalam replikasi virus HIV, maka enzim ini menjadi target utama untuk pengembangan senyawa antivirusnya. Hampir setengah dari obat anti HIV/AIDS yang tersedia saat ini mempunyai target penghambatan pada aktivitas polimerase enzim RT (Sarafianos et al. 2009; Ilina et al. 2012). Obat anti-RT HIV yang direkomendasikan saat ini dibagi ke dalam dua kategori yaitu sebagai nucleoside RT inhibitors (NRTIs) dan non-nucleoside RT inhibitors (NNRTIs). Mekanisme kerja senyawa NRTIs adalah sebagai substrat analog nukleosida alami yang tidak memiliki gugus 3’-OH yang akan berikatan dengan situs aktif DNA polimerase sewaktu proses polimerisasi DNA. Masuknya senyawa NRTIs ke dalam rantai perpanjangan DNA yang berkompetisi dengan nukleosida alami akan menghentikan proses polimerisasi tersebut sehingga proses replikasi virus juga terhenti (Huang et al. 1998; Kohlstaedt et al. 1992). Senyawa NNRTIs akan berikatan dengan NNRTI-binding pocket merupakan daerah hidrofobik yang berbatasan dengan situs aktif polimerase RT (∼10 Å). Senyawa NNRTI merupakan senyawa anti-RT HIV yang bersifat non kompetitif dan tidak berinterferensi dengan pengikatan dNTP atau substrat nukleotida RT (Sarafianos et al. 2009; Roth et al. 1997). Data struktural menunjukkan bahwa pengikatan senyawa NNRTI akan mendistorsi posisi primer grip sehingga mempengaruhi keselarasan dari terminal primer dengan situs aktif polimerase yang dapat mempengaruhi tahapan sintesis DNA virus (Sarafianos et al. 2009; Herschhorn dan Hizi 2010). Kebanyakan regimen tiga jenis obat anti-HIV standar yang biasa diberikan untuk tujuan terapi mengandung kombinasi dua senyawa NRTIs dan satu senyawa NNRTI atau inhibitor protease HIV. Senyawa NRTIs HIV yang telah mendapat ijin dari Food and Drug Administration (FDA) Amerika Serikat adalah: AZT (azidovudine), 3TC-(lamivudine), FTC (emtricitabine), ddI (didanosine), dan ABC (abacavir); sedangkan senyawa NNRTIs adalah nevirapine, delavirdine, efavirenz, dan etravirine (Sarafianos et al. 2009; Ilina et al. 2012) Terapi anti-RT HIV ternyata memunculkan masalah baru yaitu terjadinya resistensi terhadap obat anti-RT akibat adanya mutasi pada situs aktif polimerase RT

4 HIV sehingga dilakukan pencarian target senyawa obat lainnya. Domain RNase H yang berasosiasi dengan enzim RT yang penting dalam proses replikasi virus juga menjadi target pengembangan senyawa anti-HIV baru (Su et al. 2010; Kirby et al. 2012; Ilina et al. 2012). Beberapa senyawa anti-RNase H HIV telah dikembangkan dan sudah melalui uji pra-klinis. Hal ini membuktikan bahwa sampai saat ini enzim RT menjadi salah satu enzim yang paling banyak dipelajari dalam bidang biomedis (Herschhorn dan Hizi 2010). Penelitian enzim RT terus berkembang tidak hanya terhadap virus HIV namun juga dari berbagai jenis virus lainnya dari famili Retroviridae. Tujuan dari penelitian tersebut selain untuk pencarian model virus dalam pengembangan anti RT HIV, juga untuk pemenuhan enzim rekombinan RT yang mempunyai aktivitas enzim tinggi. Berbagai jenis enzim RT yang telah dipelajari karakteristik biokimianya melalui pengembangan enzim rekombinannya antara lain berasal dari Molony murine leukemia virus (MMLV) (Chen et al. 2009), MMTV (Taube et al. 1998), ASLV, FIV, Human T lymphotropic virus (HTLV), dan Simian immunodefieciency virus (SIV) (Flint et al. 2009; Coffin et al. 1997; Herschhorn dan Hizi 2010). Enzim RT MMLV bahkan sudah ditentukan struktur tiga dimensinya melalui teknik kristalografi sinar-X seperti halnya pada RT HIV (Cote et al. 2008).

Gambar 1.2

Peta organisasi genom lengkap virus SRV-2 yang disusun oleh gen gag, pol dan env berukuran sekitar 8,000 bp (Coffin et al. 1997).

Simian betaretrovirus serotipe-2 (SRV-2) tergolong dalam famili Retroviridae dan genus betaretrovirus. Virus ini umumnya secara alami menyerang populasi monyet Asia genus Macaca khususnya asal Indonesia (Iskandriati et al. 2010; Iskandriati et al. 1998; Pamungkas et al. 1991; Marx et al. 1985). SRV-2 merupakan patogen yang berbahaya yang dapat menyebabkan infeksi endemik bagi populasi satwa primata (Philipp-Staheli et al. 2006; Lerche 2010). Virus ini dapat menyebabkan penyakit Simian acquired immunodeficiency syndrome (SAIDS) yang menyerupai AIDS pada manusia (Fujimoto et al. 2010; Gardner et al. 1998; Marx et al. 1984). Penelitian terdahulu tentang SRV-2 telah berhasil mengidentifikasi genom SRV-2 dan diketahui memiliki empat gen utama yaitu gag (group specific antigen), env (envelope), prt (protease), dan pol (polymerase) (Gambar 1.2) (Marraci et al. 1995; Marraci et al. 1999; Thayer et al. 1987 ). Gen pol pada SRV-2 memiliki panjang sekitar 867 asam amino dan menyandikan pol polyprotein, yang terbagi menjadi dua enzim yaitu RT/RNase-H dan integrase. Enzim RT berperan untuk menyintesis utas DNA dari RNA virus, sedangkan integrase berperan untuk menggabungkan DNA yang baru terbentuk dengan kromosom inangnya. Hingga kini belum ada penelitian mengenai RT asal SRV-2 khususnya untuk isolat Indonesia. Adanya gen RT pada SRV-2 memungkinkan untuk dikembangkannya menjadi enzim rekombinan RT asal SRV-2 isolat Indonesia yang dapat diaplikasikan

5 baik dalam bidang biologi molekuler misalnya pada teknik RT-PCR maupun sebagai model enzim RT untuk pencarian senyawa anti RT retrovirus.

Tujuan Penelitian Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk menghasilkan enzim rekombinan RT SRV-2 isolat Indonesia asal monyet ekor panjang (Macaca fascicularis), melalui tahapan penelitian sebagai berikut: - Isolasi, pemodelan struktur tiga dimensi, dan karakterisasi molekuler secara in silico enzim RT dan RNase H SRV-2 isolat Indonesia - Ekspresi gen penyandi RT SRV-2 isolat Indonesia menggunakan sistem ekspresi Escherichia coli - Pemurnian, analisis hasil ekspresi dan uji aktivitas enzim rekombinan RT SRV-2 isolat Indonesia

Manfaat Penelitian Tersedianya enzim rekombinan reverse transcriptase produk lokal asal SRV-2 isolat Indonesia yang mempunyai aktivitas enzim optimal diharapkan akan dapat diaplikasikan dalam bidang biologi molekuler khususnya dalam teknik RT-PCR dan dapat dijadikan model enzim dalam pengembangan senyawa antiretrovirus. Diharapkan, hal ini akan memberikan kontribusi dalam mendukung kemajuan bidang biologi molekuler di Indonesia dan mengurangi ketergantungan terhadap enzim sejenis yang masih didatangkan dari produsen di luar negeri. Teknologi untuk menghasilkan produk enzim reverse transcriptase SRV-2 isolat Indonesia ini merupakan salah satu contoh potensi yang dapat dikembangkan dalam memanfaatkan keanekaragaman biodiversitas Indonesia.

Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi dan Laboratorium Bioteknologi Pusat Studi Satwa Primata, Lembaga Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat, Institut Pertanian Bogor (PSSP LPPM IPB), jalan Lodaya II/5 Bogor 16151. Penelitian dilaksanakan pada bulan Januari 2012 sampai dengan bulan Desember 2012.

Ruang Lingkup Penelitian Penelitian ini difokuskan pada pengembangan enzim rekombinan reverse transcriptase Simian betaretrovirus serotipe-2 isolat Indonesia asal monyet ekor panjang. Untuk mencapai tujuan tersebut, dilakukan melalui dua tahap penelitian. Tahap pertama yang terdapat pada Bab 2 dan Bab 3 menjelaskan tentang isolasi gen penyandi RT dan RNase H pada SRV-2 isolat Indonesia yang dilanjutkan dengan pengurutan nukleotida dengan teknik sekuensing. Translasi asam amino dilakukan

6 menggunakan program komputasi on line EMBOSS Transeq dan ORF finder dan selanjutnya asam amino yang diperoleh dikonstruksi struktur molekulnya dengan program I-TASSER yang divisualisasi dengan program PyMol. Informasi yang diperoleh yaitu model struktur sekunder, struktur tersier (3D), asam amino yang berperan dalam situs aktif, dan situs katalitik enzim. Tahap pertama ini dilakukan karena belum adanya informasi-informasi terkait yang diperoleh dari penelitian sebelumnya terutama penelitian tentang struktur molekul RT SRV-2. Berbekal informasi dari Bab 2 dan Bab 3 tersebut, selanjutnya dilakukan tahap kedua yaitu konstruksi gen untuk proses pengklonaan dalam sistem ekspresi Escherichia coli dalam upaya menghasilkan enzim rekombinan RT SRV-2 yang dijelaskan dalam Bab 4. Digunakan metode Gateway technology (Invitrogen, USA) dalam mengekspresikan gen target RT SRV-2 menggunakan vektor entry pENTR/SD/TOPO yang disubklonakan pada vektor destinasi pDEST17 untuk diekspresikan dalam E. coli BL21AI. Pemurnian protein rekombinan dilakukan menggunakan kromatografi afinitas Ni2+-NTA. Hasil ekspresi dianalisis dengan teknik SDS-PAGE dan Western blot yang menghasilkan protein berukuran sekitar 64.9 kDa dan diuji aktivitasnya dengan RT colorimetric assay serta RT-PCR. Dihasilkannya enzim rekombinan RT SRV-2 isolat Indonesia yang mempunyai aktivitas enzim optimal diharapkan akan dapat diaplikasikan di bidang biologi molekuler khususnya dalam teknik RT-PCR dan dapat dijadikan model enzim dalam pengembangan senyawa antiretrovirus.

Kebaruan Penelitian (Novelty) Selama ini, SRV-2 dianggap sebagai agen patogen penyebab terjadinya SAIDS pada monyet Asia genus Macaca. Infeksi SRV-2 dapat menyebabkan morbiditas dan mortalitas yang menjadi masalah dalam penangkaran satwa primata. Infeksi SRV-2 juga menjadi faktor pengganggu (confounding variable) pada penelitian yang menggunakan satwa primata sebagai hewan model penelitiannya. Penelitian ini mencoba untuk mengeksplorasi virus SRV-2 dengan harapan dapat diperoleh nilai positif yang bermanfaat. Adanya gen penyandi enzim RT pada SRV-2 berpotensi untuk dipelajari dalam upaya pengembangan enzim rekombinan RT mengingat enzim ini sangat potensial dalam bidang biomedis. Sampai saat ini, enzim RT SRV-2 belum banyak diteliti sehingga informasi terkait struktur molekul, sifat-sifat biokimia dan pengembangan enzim rekombinannya belum ada terutama asal isolat Indonesia. Kebaruan dari penelitian ini adalah: - Gen penyandi enzim RT asal SRV-2 isolat Indonesia berhasil diisolasi dan dikarakterisasi. - Pemodelan struktur tiga dimensi menggunakan program komputasi I-TASSER berhasil memprediksi gambaran tiga dimensi enzim RT SRV-2 baik domaindomainnya, interaksi dengan substratnya maupun situs-situs aktifnya pada domain polimerase dan RNase H. - Enzim rekombinan RT SRV-2 berhasil dikembangkan dengan menggunakan sistem ekspresi Escherichia coli berbasis sistem pengklonaan Gateway technology. Enzim rekombinan tersebut berhasil dimurnikan, diuji aktivitasnya dan diaplikasikan secara terbatas pada teknik RT-PCR.

7

Kerangka Pemikiran Simian betaretrovirus Serotipe-2 (SRV-2)

Potensi yang merugikan

Potensi yang menguntungkan

Secara alami menyerang populasi monyet Asia genus Macaca khususnya di Indonesia

SRV isolat Indonesia asal Macaca fascicularis telah berhasil diisolasi dan diidentifikasi

Merupakan patogen yang berbahaya yang dapat menyebabkan infeksi endemik bagi populasi primata

Memiliki empat gen utama yaitu gag (group specific antigen), env (envelope), prt (protease), dan pol (polymerase)

Dapat menyebabkan penyakit Simian acquired immunodeficiency syndrome (SAIDS) pada beberapa satwa primata genus Macaca

Agen patogen utama yang harus dieliminasi dalam penangkaran satwa primata program SPF (Specific Pathogen Free)

Gen pol merupakan gen penyandi enzim reverse transcriptase Memungkinkan untuk dikembangkannya menjadi enzim rekombinan reverse transcriptase asal SRV-2 isolat Indonesia

Isolasi dan karakterisasi model struktur 3D enzim RT dan RNaseH SRV-2

Ekspresi pada sistem ekspresi Eschericia coli dengan Gateway technology

Enzim rekombinan reverse transcriptase SRV-2

Dapat diaplikasikan dalam teknik RTPCR

Model enzim untuk pengembangan senyawa antiretrovirus

Gambar 1.3 Kerangka pemikiran Pengembangan Enzim Rekombinan Reverse Transcriptase Simian Betaretrovirus Serotipe-2 (SRV-2) isolat Indonesia Asal Monyet Ekor Panjang (Macaca fascicularis)

8 SRV-2 Isolat Indonesia

Amplifikasi PCR gen pol SRV-2

Penentuan gen target RT/RNaseH SRV-2 dengan teknik PCR

Sekuensing

Analisis Bioinformatika Bioedit ClustalW Emboss Transeq/ ORF Finder

Konstruksi Pohon Filogenetik dengan MEGA5 Prediksi Struktur Tiga Dimensi • I-TASSER • PyMol

Pengklonaan terhadap pENTR/SD/TOPO

Sub klonaan terhadap pDEST17

Ekspresi di dalam Escherichia coli BL21AI

Perbanyakan dan Pemurnian isolat protein rekombinan RT SRV-2

• Analisis ekspresi protein: SDS PAGE/Western blot • Uji aktivitas enzim RT: RT colorimetric Assay • Aplikasi pada teknik RT PCR

Produk protein rekombinan RT SRV-2

Gambar 1.4 Bagan alir rencana penelitian pengembangan enzim rekombinan reverse transcriptase simian betaretrovirus serotipe-2 (SRV-2) isolat Indonesia asal monyet ekor panjang (Macaca fascicularis).

9

2 ISOLASI DAN MODEL STRUKTUR TIGA DIMENSI GEN PENYANDI ENZIM REVERSE TRANSCRIPTASE SIMIAN BETARETROVIRUS SEROTIPE-2 (SRV-2) ASAL MONYET EKOR PANJANG INDONESIA Isolation and Three-Dimensional Structure Model of Gene Encoding Reverse Transcriptase of Simian Betaretrovirus Serotype-2 (SRV-2) Isolated from Indonesia Cynomolgus Monkey

Abstract In this study, we isolated the gene encoding reverse transcriptase enzyme of SRV-2 that infected Indonesian Cynomolgus monkey (SRV-2 RT Indo) and predicted the three dimensional structure model using I-TASSER computational program. The SRV-2 RT Indo consisted of 547 amino acids at nucleotide position 3284-4925 that has 25.5% similarity compared to HIV-1 RT. The polymerase active site located in the finger/palm subdomain characterized by three conserved catalytic aspartates (Asp90, Asp165, Asp166), and has a highly conserved YMDD motif as Tyr163, Met164, Asp165, and Asp166. We estimated the SRV-2 RT Indo structure that has the accuracy of TM-score 0.90±0.06 and RMSD 4.7±3.1Å, indicating this model can be trusted and the accuracy can be seen from the appearance of protein folding in tertiary structure. The superpositionings between SRV-2 RT Indo and HIV-1 RT were performed to predict the structural in details and to optimize the best fits for illustrations. This SRV-2 RT Indo structure model has the highest homology to HIV-1 RT (2B6A.pdb) with estimated accuracy at TM-score 0.911, RMSD 1.85 Å, and coverage of 0.953. This preliminary study of SRV-2 RT Indo structure modeling is intriguing, given some information to explore the molecular characteristic and biochemical mechanism of this enzyme.

Keywords: reverse transcriptase, SRV-2 Indo, I-TASSER, 3D structure model

Pendahuluan Reverse transcriptase (RT) retrovirus merupakan suatu enzim multifungsi yang mengkatalisis pembentukan DNA utas ganda dari RNA utas tunggal genom retrovirus. Proses yang kompleks ini disebut dengan transkripsi balik (reverse transcription) yaitu suatu tahapan yang sangat penting dalam siklus hidup retrovirus dan bertanggung jawab terhadap replikasi genomnya. DNA yang baru disintesis selanjutnya akan berintegrasi ke dalam genom inangnya dengan bantuan enzim integrase retrovirus (Telesnitsky dan Goff 1997; Goff 2001; Coffin et al. 1997). Enzim retrovirus RT memiliki beberapa fungsi yaitu sebagai RNA-dependent DNA polymerase, DNA dependent DNA polymerase, pemecahan hibrid DNA-RNA (DNA-directed RNA cleavage), strand transfer, dan strand displacement synthesis (Herschhorn dan Hizi 2010; Coffin et al. 1997). Enzim RT memiliki dua aktivitas enzimatik yaitu sebagai polimerase DNA dan RNase H yang masing-masing berlokasi pada dua domain yang terpisah. Polimerase DNA mempunyai kemampuan untuk menggunakan DNA maupun RNA sebagai cetakannya sedangkan RNase H berfungsi untuk menghidrolisis utas RNA dari hibrid

10 RNA-DNA. Aktivitas polimerase dan RNase H keduanya berperan sangat penting dalam proses replikasi virus (Coté dan Roth 2008; Telesnitsky dan Goff 1997). Genom retrovirus mengandung gen penyandi domain gag, pol dan env, dimana gen pol mengkodekan prekursor protein Pol yang mengandung enzim RT/RNase H dan integrase (Telesnitsky dan Goff 1997; Goff 2001; Coffin et al. 1997). Enzim RT dari berbagai kelompok retrovirus yang berbeda memiliki kesamaan aktivitas fungsi katalitik. Namun demikian, terdapat beberapa perbedaan dalam hal struktur dan komposisi subunit, berat molekul, sifat-sifat katalitik, karakteristik biofisika dan biokimia serta sensitivitas terhadap inhibitor (Herschhorn dan Hizi 2010). Enzim RT asal virus HIV-1 (human immunodeficiency virus) merupakan enzim yang paling banyak dipelajari dalam bidang biomedis pada beberapa dekade ini (Herschhorn dan Hizi 2010). Enzim RT HIV-1 menjadi sasaran utama dalam pengembangan senyawa obat antiretrovirus untuk terapi akibat infeksi HIV-1 yang dapat menyebabkan terjadinya sindroma penurunan kekebalan tubuh (acquired immunodeficiency syndrome, AIDS). Lebih dari setengah obat anti HIV-1 yang disetujui FDA (food and drug administration) mempunyai target kerja untuk menghambat aktivitas enzim RT virus HIV tersebut (Ilina et al. 2012; Sarafianos et al. 2009). Enzim RT HIV-1 menjadi obyek penelitian yang dilakukan secara intensif melalui penentuan struktur kristal tiga dimensi dan uji-uji biokimia (Sarafianos et al. 2009). Penelitian yang telah dilakukan terkait karakteristik struktur enzim RT HIV-1 adalah antara lain penentuan kompleks struktur enzim RT dengan DNA utas ganda (Ding et al. 1998); interaksi dengan nukleotida (Huang et al. 1998) dan interaksi dengan hibrid RNA-DNA (Sarafianos et al. 2001). Simian betaretrovirus serotipe-2 (SRV-2) merupakan agen penyebab terjadinya sindroma penurunan kekebalan tubuh dan bertanggung jawab terhadap terjadinya morbiditas dan mortalitas pada satwa primata monyet Asia genus Macaca baik di fasilitas penelitian maupun di penangkaran (Marx et al. 1984; Gardner et al. 1988; Lerche 2010). Infeksi SRV-2 pada Macaca dapat menjadi faktor pengganggu (confounding) dalam penelitian biomedis yang menggunakan satwa-satwa ini sebagai subyek penelitian (Lerche dan Osborn 2003). Mengingat potensi infeksi aktif atau laten dan abnormalitas kekebalan yang terkait pada infeksi ini, maka SRV-2 merupakan salah satu target agen patogen yang harus dieliminasi dalam program penangkaran satwa primata genus Macaca bebas patogen tertentu (specific pathogen free, SPF) (Morton et al. 2008). Namun demikian, terdapat potensi menguntungkan yang dapat dieksplorasi dengan mempelajari retrovirus lainnya terutama terhadap HIV/AIDS melalui pemahaman mekanisme interaksi dengan inangnya dan efek imunosupresi, mekanisme infeksi, struktur virus, serta pengembangan antiretrovirus dan vaksinnya (Montiel et al. 2010; Lerche dan Osborn 2003). Genom SRV-2 mengandung empat gen utama yang tersusun dengan urutan 5’gag-prt-pol-env-3’ dan mempunyai ukuran provirus sebesar 8105-bp (Marracci et al. 1995; Marracci et al. 1999, Thayer et al. 1987). Sebagaimana karakteristik yang dimiliki oleh semua retrovirus, SRV-2 mempunyai kemampuan untuk mentranskripsi balik genom RNA-nya menjadi DNA utas ganda melalui aksi dari enzim RT. DNA utas ganda yang dihasilkan disisipkan ke dalam genom kromosom inangnya secara random yang selanjutnya akan diekspresikan sebagai informasi genetik dari retrovirus (Marracci et al. 1999). Adanya gen penyandi enzim RT pada SRV-2 sangat potensial untuk dipelajari dan dimanfaatkan lebih lanjut sebagai model enzim RT untuk pengembangan kandidat senyawa obat anti-RT terhadap retrovirus terutama HIV/AIDS.

11 Pada penelitian ini, dilakukan isolasi gen penyandi enzim RT asal SRV-2 yang menginfeksi monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) Indonesia dan dilakukan prediksi model struktur tiga dimensinya (3D) menggunakan program komputer ITASSER (Iterative Threading ASSEmbly Refinement). I-TASSER merupakan metode komputasi yang telah berhasil secara akurat dalam melakukan pemodelan struktur protein (Zhang 2008; Roy et al. 2010). I-TASSER menggunakan pendekatan kombinasi dalam melakukan pemodelan struktur melalui tiga metode konvensional yaitu: comparative modeling, threading, dan ab initio modeling (Roy et al. 2010). Sampai saat ini belum tersedia informasi mengenai struktur 3D enzim RT SRV-2, sehingga prediksi model struktur ini akan memberikan informasi awal yang berguna untuk memahami struktur dan karakteristik fungsional dari enzim ini. Tersedianya struktur protein akan memberikan informasi molekuler secara detail yang akan memudahkan penelitian mengenai karakteristk dan fungsi suatu protein atau enzim. Perkembangan dan validasi metode komputasi dapat memprediksi struktur protein dengan tingkat akurasi yang relatif tinggi sehingga memungkinkan untuk mempelajari fungsi anotasi, analisis biokimia, dan karakteristik biologis. Dalam penelitian ini, model yang kami kembangkan menjadi suatu inisiator untuk memahami struktur enzim RT SRV-2 baik dari segi fungsi domain, situs aktif, maupun interaksi hibrid RNA-DNA dengan enzim.

Bahan dan Metode Amplifikasi PCR Gen RT SRV-2 dan Perunutan Nukleotida Sel darah tepi berinti tinggal (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) yang diisolasi dari monyet ekor panjang yang positif terinfeksi SRV-2 diekstraksi menggunakan QiaAmp DNA blood minikit (Qiagen, Hilden, Jerman). Amplifikasi PCR terhadap 5 µl DNA dilakukan menggunakan enzim DNA polimerase Pfx 2U (Invitrogen, CA, USA) di dalam total reaksi 25 µl yang mengandung 2 mM MgCl2 (Applied Biosystems, CA, USA), 1x PCR buffer (Applied Biosystems), dan 1 mM dNTPs (Applied Biosystems). Primer yang digunakan didesain menggunakan program Primer3 (http://primer3.wi.mit.edu/) yaitu SRV-2 RT 3284F (5’-CCTGTTTGGGTTGA TC-3’) dan SRV-2 RT 4925R (5’-GTGATTACCTTGAGATAAAGGTCC-3’). Amplifikasi PCR dijalankan selama 35 siklus melalui tahapan: denaturasi suhu 94oC selama 30 detik, annealing pada suhu 55oC selama 30 detik, dan ekstensi pada suhu 68oC selama 2 menit. Sebanyak 12.5 µl amplikon dijalankan dalam elektroforesis agarosa 1.0% dengan TAE bufer dan divisualisasi menggunakan mesin GelDoc (BioRad, USA). Produk PCR dipurifikasi menggunakan kit Qiaquick gel extraction (Qiagen) dan selanjutnya ditentukan runutan nukleotida dengan teknik sekuensing di Macrogen Inc (Seoul, Korea). Primer yang digunakan untuk sekuensing sama dengan yang dipakai untuk amplifikasi PCR dan beberapa primer spesifik internal yaitu: SRV-2 RT 3751R (5’-GCCCAAGATTTTCTGATTGG-3’), SRV-2 RT 3799F (5'-GATT GGCGAACAAGTTTTGC-3'), SRV-2 RT 4247F (5’-TACTGGCCTCTTCTGG-3’), dan SRV-2 RT 4604F (5'-GGCATAGCCGCATACACTTT-3'). Primer-primer tersebut didisain dengan program Primer3 mengacu pada referensi genom komplit SRV-2 di Genbank (Genbank database accession number AF126467.1).

12

Analisis Pohon Filogenetik Sekuen nukleotida yang diperoleh selanjutnya dianalisis dengan program Bioedit (Ibis Biosciences) dan disejajarkan dengan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) dari NCBI (National Center for Biotechnology Information). Translasi nukleotida penyandi asam amino dilakukan menggunakan program EMBOSS Transeq (http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/ transeq/index. html). Sekuens asam amino disejajarkan menggunakan programa ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/clustalW) yang selanjutnya dikonstruksi pohon filogenetiknya menggunakan program MEGA 5 dengan metode Neighbor-Joining. Jarak genetik diestimasi menggunakan metode Kimura’s two parameter dan análisis bootstrap dilakukan 1000 kali ulangan (Tamura et al. 2011). Sekuen asam amino RT dari retrovirus lainnya digunakan sebagai referensi yaitu sebagai berikut: Avian myeloblastosis virus (AMV, AAB31929.1), Baboon endogenous virus (BaEV, BAA89659.1), Feline leukemia virus (FeLV, BAL04139.1), Feline immunodeficiency virus (FIV, ABO69501.1), Human immunodeficiency virus-1 (HIV-1, ADN28092.1), Human immunodeficiency virus-2 (HIV-2, AAB01352.1), Moloney murine leukemia virus (MoMLV, NP_955591.1), Mason-Pfizer monkey virus (MPMV, AAA47711.1), Simian foamy virus (SPF, YP_001961122.1), Simian endogenous retrovirus (SERV, AAC97565.1), Simian immunodeficiency virus (SIV, AAA74707.1), Simian retrovirus-1 (SRV-1, AAA47732.1), Simian retrovirus-2 (SRV2, AAD43256.1), Simian retrovirus-2 (SRV-2, AAA47562.1), Simian retrovirus-4 (SRV-4, YP_003864102.1), Human T-lymphotropic virus-2 (HTLV-2, AAB59885.1), Simian T-lymphotropic virus-1 (STLV-1NP_049560.1) and Mouse mammary tumor virus (MMTV, BAA03767). Model Struktur Tiga Dimensi RT SRV-2 Prediksi struktur dua dimensi berdasarkan sekuens asam amino dan motif struktur dibuat menggunakan program I-TASSER (http://zhang. bioinformatics.ku.edu/ I-TASSER). Sekuen lestari (conserve sequences) dan posisi situs aktif asam amino ditentukan secara manual berdasarkan pada hasil prediksi struktur dua dimensi dan pensejajaran sekuen ganda dengan mengacu pada sekuens HIV-1 1HYS (Sarafianos et al. 2001) dan SRV-2 pol AAD43256 (Marracci et al. 1999). Program I-TASSER digunakan untuk menentukan struktur 3D dan fungsi suatu protein query yang diperoleh dengan mencocokkannya terhadap struktur dan fungsi dari protein-protein yang ada di Protein Data Bank (PDB). Fungsi analog dari hasil pencarian global diurutkan berdasarkan pola struktur yang lestari (conserved structure patern) yang ada dalam model dan diukur menggunakan skema skor dengan mengkombinasikan template modeling (TM-score), root-mean-squared deviation (RMSD), sequence identity, dan coverage of the structure alignment. TM-skor didefinisikan untuk menilai kesamaan topologi dari pasangan struktur protein dengan nilai dalam kisaran (0,1), dimana skor yang lebih tinggi menunjukkan kecocokkan struktural yang lebih baik. Hasil dari pencarian global dan lokal digabungkan untuk menyajikan daftar lengkap analog fungsional (Zhang 2008; Roy et al. 2010). Struktur yang cocok dianalisis menggunakan program PyMOL (http://www. pymol.org) yang memungkinkan kita untuk mengevaluasi lebih lanjut mengenai struktural dan fungsi domain dari protein RT SRV2.

13 Hasil dan Pembahasan Isolasi Karakterisasi Gen RT SRV-2 Asal Isolat Indonesia Baru-baru ini telah berhasil diisolasi dan dikarakterisasi virus SRV-2 asal monyet ekor panjang Indonesia. Hasil analisis urutan nukleotida daerah gen envelope menunjukan 96% kesamaan dengan SRV-2 (Iskandriati et al. 2010). Dalam penelitian ini, dilakukan isolasi dan analisis gen penyandi RT SRV-2 isolat Indonesia (RT SRV-2 Indo), karena sampai saat ini belum ada penelitian yang mengeksplorasi RT SRV-2. Oleh karena itu, sebagai langkah awal, penelitian ini diharapkan akan membantu dalam mendukung pemahaman yang lebih baik mengenai struktur dan mekanisme retrovirus RT SRV-2. Hasil amplifikasi DNA terhadap RT SRV-2 Indo ini menghasilkan 1641 bp amplikon (Gambar 2.1) yang menyandikan 547 asam amino sebagai enzimatik RT. Berdasarkan kesamaan runutan asam aminonya, isolat ini memiliki kesamaan identitas 99% terhadap RT SRV-2 isolat D2/RHE/OR dengan kode akses di Genbank yaitu AAD43256.1. Terdapat enam perbedaan asam amino yaitu pada posisi 307 (Leu terhadap Phe), 329 (Ile terhadap Val), 478 (Gln terhadap His), 521 (Tyr terhadap Cys), 540, 541 (Gly, Pro terhadap Arg, Thr).

2000 bp 1650 bp

1641 bp

500 bp

M

1

2 3

Gambar 2.1 Hasil amplifikasi PCR terhadap gen RT SRV-2 isolat Indonesia, M) 1kb DNA ladder (Invitrogen), 1-2) produk PCR dari RT SRV-2 menghasilkan 1641 bp, 3) kontrol pereaksi. Runutan asam amino selanjutnya disejajarkan secara majemuk (multiplealigned) terhadap enzim RT asal retrovirus lainnya yang ada di data Genbank dan dikonstruksi pohon filogenetiknya untuk menentukan hubungan kekerabatan antara enzim RT retrovirus lainnya (Gambar 2.2). Hasil filogenetik menunjukkan bahwa sekuens target (RT SRV-2 Indo) mempunyai hubungan kekerabatan terdekat dengan SRV-2 isolat D2/RHE/OR asal Oregon Amerika Serikat (AAD43256.1). RT SRV-2 Indo juga mempunyai hubungan kekerabatan yang berada dalam satu kelompok (cluster) subfamili betaretrovirus adalah dengan SRV endogen (SERV), SRV-1, MPMV (SRV-3), SRV-4 dan MMTV. Subfamili betaretrovirus mempunyai kedekatan dengan subfamili deltavirus (HTLV-1), dimana kedua subfamili ini merupakan hasil percabangan dari subfamili alfaretrovirus (AMV). Ketiga subfamili ini merupakan hasil percabangan dari subfamili lentivirus dimana RT HIV-1 sebagai anggota virusnya merupakan virus yang paling banyak dipelajari dalam bidang biomedis. Subfamilisubfamili tersebut merupakan hasil percabangan dari spumavirus dan gamaretrovirus

14 yang terdapat MMLV sebagai anggota retrovirusnya yaitu enzim RT yang paling banyak diaplikasikan dalam teknik RT-PCR.

Betaretrovirus

Deltaretrovirus Alpharetrovirus

Lentivirus Spumavirus Gammaretrovirus

Gambar 2.2 Pohon filogenetik dari runutan asam amino RT SRV-2 terhadap retrovirus lainnya. RT SRV-2 isolat Indonesia ditandai dengan warna merah Tingginya tingkat kelestarian (conserved region) dari gen pol ini menyebabkan daerah gen ini biasa digunakan dalam studi filogenetik baik berdasarkan runutan asam nukleat maupun asam aminonya (Li et al. 1995). Berdasarkan hasil runutan asam amino RT SRV-2 Indo yang meliputi daerah RT dan RNase H menunjukkan bahwa isolat ini masuk ke dalam kelompok SRV-2. Kemungkinan isolat ini merupakan nenek moyang dari isolat SRV-2 yang pertama kali ditemukan asal monyet resus (Marracci et al. 1999). Hasil filogenetik ini mempunyai kesamaan korelasi dengan yang pernah dilaporkan oleh Li et al. (1995) dalam penelitian mengenai filogenetik daerah pol retrovirus dari 55 retroelements dimana SRV-1 mempunya kedekatan dengan MPMV (SRV-3) dan berevolusi setelah SRV-2. Prediksi Struktur Sekunder RT SRV-2 Isolat Indonesia Pada penelitian ini, kami mencoba melakukan perkiraan perbandingan struktur fungsional dari RT SRV-2 dengan RT HIV-1. Perbandingan ini didasarkan atas datadata yang telah tersedia di dalam genbank yaitu data struktur kristal RT HIV-1 p66 pada basis data protein (PDB) dengan kode akses 2B6A dan 1HYS serta data pembanding pol SRV-2 dalam genbank dengan kode akses AAD43256.1. Runutan asam amino RT SRV-2 pada posisi 1-547 dan RT HIV-1 pada posisi 1-553 disejajarkan menggunakan program ClustalW dan I-TASSER (Gambar 2.3). Hasil perbandingan antara RT SRV2 Indo dengan RT HIV-1 menunjukkan adanya kesamaan subdomain finger/palm sebesar 32% dari 237 residu, subdomain thumb mempunyai kesamaan 25.6% dari 82 residu, subdomain connection mempunyai kesamaan 12% dari 133 residu, dan

15 subdomain RNase H mempunyai kesamaan 27% dari 118 residu. Secara keseluruhan, perbandingan runutan penuh (full length) antara RT SV-2 Indo dengan RT HIV-1 RT mempunyai kesamaan sebesar 25.5% dari 553 residu, namun jika perbandingan melibatkan asam amino yang sangat lestari (misalnya Ala vs. Val, Leu vs. Ile, dan lainlain) maka perbandingan ini menghasilkan kesamaan sebesar 43%. Situs aktif polimerase yang berlokasi di subdomain finger/palm dicirikan oleh adanya tiga aspartat katalitik lestari yaitu Asp90, Asp165, Asp166 untuk RT SRV-2 Indo, dan Asp110, Asp185, Asp186 untuk RT HIV-1 (Tabel 2.1). Ketiga aspartat ini (dua aspartat terakhir berada dalam motif YXDD) berperan penting sebagai katalitik enzimatik dari RT HIV-1 melalui pengikatan terhadap kofaktor enzim yaitu kation divalen Mg2+ (Sharma et al. 2005). Hal ini mengantarkan pada suatu asumsi bahwa situs aktif katalitik RT SRV-2 Indo juga berkoordinasi dengan kation divalent Mg2+. Motif YXDD, dimana X berupa asam amino variabel merupakan motif yang sangat lestari dan berperan penting dalam berbagai enzim retrovirus RNA dependent DNA polymerases. RT SRV-2 Indo dan RT HIV-1 mempunyai motif YMDD untuk asam amino Tyr, Met, Asp, Asp masing-masing pada posisi 163-166 untuk RT SRV-2 Indo dan 183-186 untuk RT HIV-1. Motif asam amino YMDD juga dimiliki oleh SIV, dan FIV, namun berbeda dengan MMLV dan FeLV yang memiliki motif YVDD (Sharma et al. 2005). Belakangan ini, banyak penelitian enzim RT yang difokuskan dalam mempelajari motif YXDD karena berhubungan dengan resistensi NRTI (nucleoside reverse transcriptase inhibitor), RT fidelity, proses polimerase dan replikasi virus (Sharma et al. 2005). Situs pengikatan dNTPs yang juga berlokasi dalam situs aktif polimerase mempunyai residu lestari yaitu Lys64, Arg72, Asp110, Asp113, Gln151, dan Asp186 untuk RT HIV-1, sedangkan RT SRV-2 Indo memiliki asam amino Lys45, Arg52, Asp90, Asp93, Gln131, dan Asp166. Sementara itu, situs aktif RNase H yang berinteraksi dengan hibrid DNA/RNA mengandung motif lestari DED yang berupa asam amino Asp, Glu, dan Asp pada posisi 443, 478, dan 498 untuk RNase H HIV-1 dan 436, 465, 486 untuk RNase H SRV-2 RT Indo. Pemodelan Struktur Tersier (Tiga Dimensi) RT SRV-2 Isolat Indonesia Hasil prediksi struktur tiga dimensi RT SRV-2 Indo secara utuh terdapat pada Gambar 2.4. Model dibuat menggunakan program dari metode I-TASSER dan divisualisasi dengan program PyMol. Diperoleh lima model hasil perhitungan komputasi untuk RT SRV-2 Indo dan model I merupakan model struktur dengan nilai C-score tertinggi yaitu 1.33. C-score merupakan nilai kepercayaan (confidence score) yang nilainya berkisar antara -5 sampai dengan 2, dimana nilai tertinggi merepresentasikan model dengan nilai kepercayaan tertinggi. Nilai C-score berkorelasi dengan kualitas dari model yang dihasilkan oleh model I-TASSER (Roy et al. 2010). Secara umum, model struktur dengan C-score >-1.5 diharapkan akan mempunyai pelipatan yang tepat. Nilai RMSD dan TM-score digunakan untuk mengukur kesamaan topologi antara model yang dicari dengan struktur asal (native structure). Nilai TMscore berada dalam kisaran [0,1] dimana nilai yang lebih tinggi mengindikasikan kecocokkan struktur yang lebih baik (Roy et al. 2010). Struktur model I dari RT SRV-2 mempunyai estimasi dengan nilai akurasi yaitu TM-score 0.90±0.06 dengan nilai RMSD 4.7±3.1Å. Dengan demikian, struktur model I RT SRV-2 Indo mempunyai nilai C-score terbaik sehingga dapat dipercaya dan akurasinya dapat dilihat dari penampakannya dalam lipatan struktur tersier (Gambar 2.4).

16

HIV-1 RT SRV-2 RT Indo Prediksi

Finger/Palm PISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPV 60 -----------------PVWVDQWPLTQEKLAAAQQLVQEQLQAG--HIIESNSPWNTPI 41 CCCCCCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHCC--CCCCCCCCCCCCS


Finger/Palm FAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPL 120 FVIKKK-SGKWRLLQDLRAVNATMVLMGALQPGLPSPVAIPQGYFKIVIDLKDCFFTIPL 100 SSSSCC-CCCCHHHHHHHHHHHHCCCCCCCCCCCCCHCHCCCCCCSSSSSCCCSSSSCCC


Finger/Palm DEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFKKQNPDIVI 180 QPVDQKRFAFSLPSTNFKQPIKRYQWKVLPQGMANSPTLCQKYVAAAIEPIRKSWAQMYI 160 CCCCCCCCSSCCCCCCCCCCCCCSSSSSCCCCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCSS


Finger/Palm YQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDKWT 240 IHYMDDILIAGKIG-EQVLQCFAQLKQALTTTGLQIAPEKVQLQDPYTYLGFQLNGPKIT 219 SSSCCCSSSSCCCH-HHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCCHHHCCCCCCSSSSSSSSCCSSS


Tumb VQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYPGIK--VRQLSKLLRGTKALTEVIPLTEE 298 NHKAVIRRDKLQTLNDFQKLLGDINWLRPYLHLTTGDLKPLFDILKGDSNPNSPRFLSEA 279 SCCSSSCCCCCCCHHHHHHHHCHHHHHCCCCCCCHHHHHHHHHHHCCCCCCCCCCCCCHH


Connection AELELAENR-EILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTG----- 352 ALTSLKKVETAIAEQFVTQIDYTQPLTFLIFNTTLTPTGLFWQNNPVMWVHLPASPKKVL 339 HHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCCHHHHHHCCCCCCSSSSSSCCCSSSSCCCCCCCCCC


Connection --KYARMRGAHTNDVKQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQ--A 408 FPYYDAIADLIILGRDNSKKYFGLEPSTIIQPYSKSQIHWLMQNTETWPIACASYAGNID 399 CCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCSSSSCCCHHHHHHHHHHCHHHHHHHCCCCCCSS


RNaseH TWIPEWEFVNTPPLVKLWYQ--LEKEPIVGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTNKGRQKV 466 NHYPPNKLIQFCKLHAVVFPRIISKTPLDNALLVFTDGSS-----TGIAAYTFEKTTVKF 454 SCCCCHHHHHHHHHCCCCCCCCCCCCCCCCCCSSSSCCCC-----CCCSSSSSCCCSSSS


RNaseH VPLTNTTNQKTELQAIYLALQDS-GLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDKSESELVNQIIEQL 525 K-TSHTSAQLVELQALIAVLSAFPHRALNIYTDSAYLAHSIPLLETVSQIKHISDTAKLF 513 S-SCCCCHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCSSSSSCHHHHHHHHHHHHHCCCCCCCCCHHHHH


RNaseH IKKEK--------VYLAWVPAHKGIGGNEQVDKLVS 553 LQCQQLICNRSIPFYLGHIRAHSGLPRTLSQGNH-- 547 HHHHHHHHHCCCCSSSSSSCCCCCCCCHHHCCCC

Gambar 2.3

Penyejajaran runutan asam amino dan prediksi motif struktur sekunder RT SRV-2 Indo dan RT HIV-1. Runutan asam amino RT SV-2 Indo pada posisi 1-547 dan RT HIV-1 pada posisi 18-553. Motif dicirikan oleh heliks-α (H) lembaran-β (S), dan coils (C). Asam amino yang berperan dalam situs aktif ditandai huruf merah dan bayangan merah, huruf hijau untuk runutan yang berikatan dengan DNA, huruf biru untuk berikatan dengan dNTPs, dan huruf ungu/bayangan ungu adalah hibrid RNA-DNA (RNase H).

17 Tabel 2.1 Perbandingan asam amino yang berperan dalam pembentukan motif dari RT SRV-2 Indo terhadap RT HIV-1. Motif Domain/ Subdomain Finger/Palm Thumb Connection RNase H

Asam Amino RT SRV Indo a

Asam Amino RT HIV-1b

1-216 217-297 298-430 431-547

1-237 238-316 317-437 438-553

Situs aktif Polimerase

Trp7, Pro8, Phe42, Lys46, Arg52, Leu54, Gln55, Asp56, Arg58, Asn61, Ala69, Gln71, Pro72, Leu74, Asp90, Leu91, Lys92, Asp93, Cys94, Phe95, Gln131, Gly132, Ala134, Pro137, Tyr163, Asp165, Asp166, Leu209, Gly210

Hibrid RNA/DNA

Ser438, Ser439, Thr440, Ala461, Ala488, His531, Arg533, Ala534 Asp436, Glu465, Asp486 Lys45, Arg52, Asp90, Leu91, Lys92, Asp93, Cys94, Phe95, Gln131, Asp166

Trp24, Pro25, Phe61, Lys65, Arg72, Leu74, Val75, Asp76, Arg78, Asn81, Glu89, Gln91, Leu92, Ile94, Asp110, Val111, Gly112, Asp113, Ala114, Tyr115, Gln151, Gly152, Lys154, Pro157, Tyr183, Asp185, Asp186, Met230, Gly231 Ala446, Arg448, Glu449, Thr473, Asn474, Gln475, Gln500, Hi539 Asp443, Glu478, Asp498, Lys64, Arg72, Asp110, Val111, Gly112, Asp113, Ala114, Tyr115, Gln151, Asp186 Tyr183, Met184, Asp185, Asp186

Situs aktif RNase Situs pengikatan dNTPs

Motif YXDD

Tyr163, Met164, Asp165, Asp166

RT SRV-2 Indo disejajarkan berdasarkan hasil I-TASSER dan mengacu pada SRV-2 pol (genbank AAD43256.1) b HIV-1 RT berdasarkan pada PDB 2B6A,1HYS dan mengacu pada pol HIV-1 (genbank ADN28092.1) a

Gambar 2.4 Model struktur tiga dimensi dari enzim RT SRV-2 Indo menggunakan program I-TASSER yang divisualisasi dengan program PyMol. Nilai estimasi akurasinya yaitu 0.90±0.06 (TM-score), 4.7±3.1Å (RMSD) dan C-score = 1.33. Subdomain fingers/palm, thumb, connection, dan RNaseH ditandai dengan warna merah tua, ungu, biru tua, dan hijau secara berurutan. Bulatan biru muda menggambarkan residu situs aktif polimerase dan situs pengikatan dNTPs, sedangkan motif YXDD digambarkan oleh bulatan warna kuning

18 Superposisi antara RT SRV-2 Indo dengan RT HIV-1 dilakukan untuk memprediksi motif struktur secara lebih detail dan untuk mengoptimasi kecocokan ilustrasi yang terbaik. Tabel 2.1, Gambar 2.3 dan Gambar 2.5 memperlihatkan motif struktur yang digunakan dalam perbandingan superposisi antara RT SRV-2 Indo terhadap RT HIV-1. Struktur RT HIV-1 mempunyai struktur yang paling konsisten dan memberikan motif yang paling cocok dalam penelitian ini yaitu 1HYS (Sarafianos et al. 2001), 2HMI (Ding et al. 1998) dan 2B6A (Roth et al. 1997). Model struktur RT SRV-2 Indo mempunyai nilai homologi tertinggi terhadap RT HIV-1 (2B6A) dengan nilai estimasi akurasi pada TM-score 0.911, RMSD 1.85 Ao, dan coverage 0.953 yang diukur dengan menggunakan program TM-align dari Zhang Lab (Zhang dan Skolnick 2005). Model RT SRV-2 Indo yang membentuk kompleks dengan substrat nukleotida mer-18/19 DNA-RNA dari posisi situs aktif polimerase sampai situs aktif RNase H terdapat pada Gambar 2.6. RT SRV-2 bersuperposisi dengan RT HIV-1 (1N6Q) (Sarafianos et al. 2002) berdasarkan hasil dari I-TASSER yang menunjukkan adanya kesamaan situs pengikatan. Pemeriksaan terhadap model ini dilakukan menggunakan server TM-align (http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/ TM-align) dengan nilai TMscore 0.838, kesamaan identitas 0.258, dan BS-score 1.48. BS-score menggambarkan hasil pengukuran berdasarkan kesamaan sekuens maupun struktur lokal (local similarity) antara situs pengikatan cetakan (template binding site) dengan situs pengikatan struktur sampel yang akan diprediksi. Berdasarkan hasil analisis pembandingan ini, diperoleh nilai BS-score >1.1 merefleksikan keselarasan lokal yang sangat baik antara sampel struktur yang diprediksi dengan situs pengikatan (Roy et al. 2010).

Gambar 2.5 Model superposisi antara RT SRV-2 Indo dengan RT HIV-1 (2B6A.pdb), nilai estimasi akurasinya yaitu 0.911 (TM-score), 1.85 Å (RMSD), dan 0.953 (coverage).

19

Gambar 2.6

Diagram pita dari dari RT SRV-2 Indo yang terikat pada model stick substrat dupleks oligonukleotida RNA/DNA 18-19-basa. Berbagai variasi domain enzim diwarnai seperti pada Gambar 2.4. Situs aktif asam amino dari DNA polimerase dan RNase H digambarkan dalam bulatan warna kuning.

Model interaksi antara situs aktif RT SRV-2 Indo dengan asam nukleat dikembangkan berdasarkan struktur kristal RT HIV-1 yang telah tersedia di PDB (Huang et al. 1998) (Gambar 2.7). Asam amino yang terlibat dalam interaksi antara RT HIV-1 dengan dNTP yang masuk adalah Lys65, Arg72, Asp113, Ala114, Tyr115 dan Gln151 (Huang et al. 1998), memiliki kesamaan asam amino dengan RT SRV-2 Indo yaitu Lys45, Arg52, Asp93, dan Gln131. Ala114 dan Tyr115 pada RT HIV-1 digantikan dengan Cys94 dan Phe95 pada RT SRV-2 Indo. Penggantian Tyr115 dengan Phe tidak menyebabkan efek yang signifikan dalam aktivitas katalitik enzim ketika berinteraksi langsung dengan deoksiribosa dari trifosfat yang masuk (Boyer et al. 2000). Kami memprediksi nukleotida pertama yang tidak berpasangan (overhang) dari cetakan yang akan berpasangan dengan dNTP yang baru masuk dan berinteraksi dengan rantai samping Leu54 dan terhadap tulang punggung Gly132. Cetakan overhang kedua dan ketiga akan berinteraksi dengan residu Trp7, Pro8, dan Phe42. Interaksi secara langsung dari basa dalam minor groove terjadi pada asam amino Pro137, Met164, Leu74, dan Tyr163. dNTP yang baru masuk akan berpasangan berpasangan dengan basa template dimana residu trifosfat akan berinteraksi dengan Lys45, Arg52, Asp93, dan Cys94. Sementara itu, 3'-OH dari dNTP akan sejajar dengan sisi rantai Asp93, Phe95, Gln131, dan tulang punggung peptida antara residu 93 dan 95.

20

A

B

Gambar 2.7 Interaksi antara asam amino yang berperan penting dalam situs aktif polimerase pada RT SRV-2 Indo dengan bagian terminal dari dupleks RNA/DNA. DNA diindikasikan dengan model stick berwarna merah dan biru, sedangkan RNA dicirikan dengan stick warna merah, putih dan biru dan ditandai dengan -1, -2, dan -3 sebagai dupleks, sedangkan RNA yang menggantung ditandai dengan +1. A) situs RT SRV-2 digambarkan dalam permukaan berwarna hijau dengan asam amino lestari berupa Asp165, Gln131, Gly132, dan Arg58 (ditunjukkan dalam stick warna hijau). (B) Interaksi situs aktif asam amino RT SRV-2 yang digambarkan dalam model stick warna hijau.

Simpulan Studi awal mengenai pemodelan struktur tiga dimensi dari monomer RT SRV-2 Indo dibandingkan dengan heterodimer RT HIV-1 sangat menarik, yang memberikan beberapa informasi mengenai persamaan dan perbedaan sekuens asam amino diantara keduanya sehingga dapat diprediksi fungsi masing-masing subdomainnya. Menggunakan model struktural untuk mengeksplorasi karakteristik molekuler dan mekanisme biokimia dari RT SRV-2 Indo dan memahami mekanisme katalitik enzimatik telah memberikan informasi yang berharga. Baru-baru ini, sudah banyak struktur RT yang dieksplorasi dan dilaporkan dalam Bank Data PDB, sehingga struktur RT yang tersedia telah memberikan kontribusi dan menginspirasi kita untuk mengeksplorasi struktur RT SRV-2 Indo berdasarkan model struktur tiga dimensinya. Hal ini akan memperluas pengetahuan kita mengenai RT SRV-2 Indo sebagai model virus HIV dan pengembangan agen terapinya di masa yang akan datang.

21

3 ISOLASI DAN MODEL STRUKTUR TIGA DIMENSI ENZIM RNase H ASAL SIMIAN BETARETROVIRUS SEROTIPE-2 (SRV-2) YANG DIISOLASI DARI MONYET EKOR PANJANG INDONESIA Isolation and Three Dimensional Structure Model of Simian Betaretrovirus Serotype-2 (SRV-2) RNase H Isolated from Indonesian Cynomolgus Monkey

Abstract The RNase H domain that associated with reverse transcriptase (RT) enzyme is essential for retroviral replication. RNase H activity has been an alternative target for anti-HIV therapeutics development, due to the HIV strains resistant to currently available antiretroviral therapies. SRV-2 RT, like others retrovirus comprises of two different functional enzymes as RNA/DNA polymerase and RNase H activities. In this study, we isolated, analyzed and predicted the three dimensional structural model of RNase H enzyme of SRV-2 Indonesian isolate using I-TASSER computational program. The structure of SRV-2 RNase H closely related to its ortologs such as Escherichia coli RNase H (1GOA) and HIV-1 RNase H (3QIO, 3HYF). The catalytic active site of SRV-2 RNase H contains three amino acid carboxylate-residues as Asp436, Glu465 and Asp486, that stabilized with Thr541 to interact with coordinating two divalent magnesium cations. Amino acid residues that interact with RNA-DNA strand were Ser438, Ser439, Thr440, Ala461, Ala488, His531, Arg533, and Ala534. This structure modeling is the preliminary study to explore the molecular characteristic and biochemical mechanism of SRV-2 RNase H.

Keywords: SRV-2, RNase H, reverse transcriptase, 3D structure model

Pendahuluan Enzim reverse transcriptase (RT) retrovirus mempunyai aktivitas multifungsi yaitu sebagai RNA-dependent DNA polymerase, DNA-dependent DNA polymerase, strand displacement synthesis, strand transfers, dan mendegradasi utas RNA dalam hibrid RNA-DNA (Schultz dan Champoux 2008; Herschhorn dan Hizi 2010; Coffin et al. 1997). Aktivitas multifungsi ini dijalankan oleh dua domain enzim yaitu DNA polimerase dan ribonuklease H (RNase H) yang berlokasi dalam dua domain protein yang berbeda. Domain polimerase berada pada posisi ujung-N berukuran sekitar dua pertiga dari keseluruhan enzim RT. Domain ini mempunyai fungsi sebagai DNA polimerase yang dapat menggunakan DNA atau RNA sebagai cetakannya. Domain RNase H berlokasi pada posisi ujung-C yang berukuran sekitar satu pertiga dari enzim RT dan mempunyai aktivitas untuk menghidrolisis utas RNA pada hibrid RNA-DNA. Aktivitas polimerase dan RNase H ini sangat penting dalam replikasi retrovirus (Champoux dan Schultz 2009; Schultz dan Champoux 2008). Aktivitas RNase H retrovirus berfungsi sebagai endonuklease yang bekerja secara bertahap dalam menghidrolisis RNA dari heterodupleks RNA-DNA. Sifat ini sangat penting dalam proses reverse transkripsi dimana oligo-ribonukleotida yang

22 dibentuk akan menginisiasi sintesis DNA utas (-) yang berkomplemen dengan utas positif cetakan RNA. Aktivitas pemotongan RNase H retrovirus bersifat non specific sequences yang mempunyai tiga jenis tipe pemotongan yaitu: DNA 3’-end directed, RNA 5’-end directed, dan pemotongan internal (Herschhorn dan Hizi 2010; Coffin et al. 1997; Champoux dan Schultz 2009). Proses pemotongan ini diperlukan selama terjadinya reverse transkripsi terutama untuk menghilangkan primer tRNA yang berperan pada tahap awal pembentukan utas negatif DNA dan primer polypurine tract (PPT) pada pembentukan utas positif DNA. Pada tipe pemotongan internal, RNase H berperan seperti halnya endonuklease yang memotong RNA sepanjang hibrid RNADNA. Pada tipe pemotongan -end directed, interaksi enzim dengan substrat melibatkan pengenalan RNA ujung -5’ atau DNA ujung -3’ (Champoux dan Schultz 2009). Domain RNase H pada enzim RT dipisahkan dari domain polimerase oleh domain connection. Beberapa RNase-H dari berbagai mikroorganisme telah berhasil ditentukan struktur molekulnya seperti Escherichia coli (Katayanagi et al. 1993), human immunodeficiency virus tipe 1 (HIV-1) (Huang et al. 1998; Sarafianos et al. 2001), Thermus thermophilus HB8, Bacillus halodurans dan molony murine leukemia virus (MMLV) (Lim et al. 2006). Struktur dari enzim-enzim tersebut memiliki kemiripan satu dengan lainnya. Selain itu, struktur kristal dari berbagai enzim lain yang memiliki aktifitas nuklease juga menunjukkan pelipatan struktur tersier yang serupa dengan RNase-H. RNase-H retrovirus dari genus yang berbeda memiliki aktifitas yang serupa, tetapi terdapat perbedaan penting antara lain dalam hal struktur pengenalan substrat dan perbedaan substrat (Lim et al. 2006). Domain RNase H RT asal MMLV dan HIV-1secara struktural mempunyai kemiripan dengan RNase H asal E. coli, B. halodurans, dan RNase H1 manusia. Perbedaan yang cukup jelas diantara enzim tersebut terletak ada tidaknya heliks-α C dimana RNase H MMLV, manusia dan E. coli memiliki heliks tersebut sedangkan RNase H HIV dan B. halodurans tidak memilikinya (Nowotny et al. 2005). Heliks-α C diperkirakan berperan dalam pengenalan substrat dan aktivitas katalitik enzim. RNase H memiliki empat residu asam amino yang bersifat lestari (conserve) yang berperan dalam mengkoordinasikan pengikatan terhadap kation divalen yaitu ion magnesium yang berikatan dengan situs aktifnya (Nowotny et al. 2005). Aktivitas DNA polimerase dan RNase H dari enzim RT HIV merupakan target yang potensial dalam pengembangan senyawa antiretrovirus. Pengembangan inhibitor DNA polimerase RT sebagai anti replikasi HIV-1 telah terbukti efektif dalam menghambat replikasi HIV-1 yang digunakan untuk terapi penderita HIV/AIDS (Sarafianos et al. 2009). Munculnya resistensi terhadap inhibitor polimerase akibat mutasi virus menjadikan RNase H sebagai salah satu alternatif dalam pencarian senyawa anti HIV yang baru. Penelitian terkait struktur 3D dan sifat-sifat biokimia RNase H dari berbagai retrovirus dalam upaya pencarian senyawa inhibitornya dilakukan cukup intensif walaupun belum memasuki tahap uji klinis (Su et al. 2010; Ilina et al. 2012; Kirby et al. 2012; Klumpp dan Mirzadegan 2006). Simian betaretrovirus serotipe-2 (SRV-2) merupakan agen patogen penyebab terjadinya sindroma penurunan kekebalan tubuh pada satwa primata monyet Asia genus Macaca (Gardner et al. 1988; Marracci et al. 1999). Namun demikian, SRV-2 juga dapat menjadi model retrovirus yang dapat digunakan untuk memahami interaksi retroviral dengan inangnya dan mempelajari mekanisme imunosupresi pada retrovirus (Lerche 2010; Lerche dan Osborn 2003; Montiel 2010; Marracci et al. 1999). Seperti halnya retrovirus lainnya, genom SRV-2 diketahui memiliki empat gen utama yaitu gag

23 (group specific antigen), env (envelope), prt (protease), dan pol (polymerase) (Marraci et al. 1995; Marraci et al. 1999; Thayer et al. 1987). Gen pol menyandikan dua enzim penting yang berperan dalam proses replikasi retrovirus dalam inangnya yaitu RT/RNase-H dan integrase. Enzim RT SRV-2 mempunyai dua bagian fungsional yaitu sebagai DNA polimerase dan RNase H yang memiliki potensi untuk dipelajari dan dimanfaatkan lebih lanjut terutama sebagai model untuk mempelajari retrovirus lainnya khususnya terhadap HIV/AIDS. Pada penelitian ini, dilakukan isolasi, analisis dan pemodelan struktur tiga dimensi enzim RNase H yang berasosiasi dengan domain enzim RT asal SRV-2 isolat Indonesia yang menginfeksi Macaca fascicularis. Pemodelan dilakukan menggunakan program komputasi I-TASSER (Iterative Threading ASSEmbly Refinement) (Zhang 2008; Roy et al. 2010) yang diharapkan akan memberikan pemahaman mengenai fungsi domain, situs aktif enzim, dan interaksi antar asam amino dalam enzim RNase H dengan hibrid DNA-RNA.

Bahan dan Metode Amplifikasi PCR dan Perunutan Nukleotida Gen Penyandi RNase H SRV-2 Isolasi DNA dilakukan menggunakan QiaAmp DNA blood minikit (Qiagen, Hilden, Jerman) terhadap sel darah tepi berinti tunggal (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) asal monyet ekor panjang yang positif terinfeksi SRV-2 (koleksi PSSP LPPM IPB). Amplifikasi PCR terhadap 5 µl DNA dilakukan di dalam total reaksi 25 µl yang mengandung enzim Taq gold DNA polymerase 1.25 U µL-1 (Applied Biosystems, CA, Amerika Serikat), 2 mM MgCl2 (Applied Biosystems), 1x PCR buffer (Applied Biosystems), 1 mM dNTPs (Applied Biosystems) dan pasangan primer SRV-2 RNase H 4571F (5’-GCCTTACTGGTATTCACTGATGG-3’) dan SRV-RNase H 4925R (5’GTGATTACCTTGAGATAAAGGTCC-3’). Primer yang digunakan didesain menggunakan program Primer3 (http://primer3.wi.mit.edu/). Tahapan amplifikasi PCR selama 40 siklus adalah sebagai berikut: denaturasi suhu 94oC selama 30 detik, annealing pada suhu 55oC selama 30 detik, dan ekstensi pada suhu 72oC selama 30 detik. Sebanyak 12.5 µl amplikon dijalankan dalam elektroforesis agarosa 1.8% dengan TAE bufer dan divisualisasi menggunakan mesin GelDoc (BioRad). Produk PCR dipurifikasi menggunakan kit Qiaquick gel extraction (Qiagen) dan selanjutnya ditentukan runutan nukleotidanya dengan teknik sekuensing di Macrogen Inc (Seoul, Korea). Primer yang digunakan untuk sekuensing sama dengan yang dipakai untuk amplifikasi PCR. Konstruksi Pohon Filogenetik RNase H SRV-2 terhadap Retrovirus Lainnya Runutan nukleotida yang diperoleh selanjutnya dianalisis dengan program Bioedit (Ibis Biosciences) dan disejajarkan dengan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) dari NCBI (National Center for Biotechnology Information). Translasi nukleotida penyandi asam amino dilakukan menggunakan program EMBOSS Transeq (http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/ transeq/index.html). Sekuens asam amino disejajarkan menggunakan programa ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/clustalW) yang selanjutnya dikonstruksi pohon filogenetiknya menggunakan program MEGA 5 dengan metode Neighbor-Joining. Jarak genetik diestimasi menggunakan metode Kimura’s two parameter dan análisis bootstrap dilakukan 1000 kali ulangan (Tamura et

24 al. 2011). Sekuen asam amino RT dari retrovirus lainnya digunakan sebagai referensi yaitu sebagai berikut: Avian myeloblastosis virus (AMV, AAB31929.1), Baboon endogenous virus (BaEV, BAA89659.1), Feline leukemia virus (FeLV, BAL04139.1), Feline immunodeficiency virus (FIV, ABO69501.1), Human immunodeficiency virus-1 (HIV-1, ADN28092.1), Human immunodeficiency virus-2 (HIV-2, AAB01352.1), Moloney murine leukemia virus (MoMLV, NP_955591.1), Mason-Pfizer monkey virus (MPMV, AAA47711.1), Simian foamy virus (SPF, YP_001961122.1), Simian endogenous retrovirus (SERV, AAC97565.1), Simian immunodeficiency virus (SIV, AAA74707.1), Simian retrovirus-1 (SRV-1, AAA47732.1), Simian retrovirus-2 (SRV2, AAD43256.1), Simian retrovirus-2 (SRV-2, AAA47562.1), Simian retrovirus-4 (SRV-4, YP_003864102.1), Human T-lymphotropic virus-2 (HTLV-2, AAB59885.1), Simian T-lymphotropic virus-1 (STLV-1NP_049560.1) and Mouse mammary tumor virus (MMTV, BAA03767).

Model Struktur Tiga Dimensi RNase H SRV-2 Prediksi struktur tiga dimensi berdasarkan sekuens asam amino dan motif struktur dibuat menggunakan program I-TASSER (http://zhang.bioinformatics. ku.edu/I-TASSER). Sekuen lestari (conserve sequences) dan posisi situs aktif asam amino ditentukan secara manual berdasarkan pada hasil prediksi struktur dua dimensi dan pensejajaran sekuen ganda dengan mengacu pada sekuens HIV-1 1HYS (Sarafianos et al. 2001) dan SRV-2 pol AAD43256 (Marracci et al. 1999). Program I-TASSER digunakan untuk menentukan struktur 3D dan fungsi suatu protein query yang diperoleh dengan menyocokkannya terhadap struktur dan fungsi dari protein-protein yang ada di Protein Data Bank (PDB). Fungsi analog dari hasil pencarian global diurutkan berdasarkan pola struktur yang lestari (conserved structure patern) yang ada dalam model dan diukur menggunakan skema skor dengan mengkombinasikan template modeling (TM-score), root-mean-squared deviation (RMSD), sequence identity, dan coverage of the structure alignment. TM-skor didefinisikan untuk menilai kesamaan topologi dari pasangan struktur protein dengan nilai dalam kisaran (0,1), dimana skor yang lebih tinggi menunjukkan kecocokan struktural yang lebih baik. Hasil dari pencarian global dan lokal digabungkan untuk menyajikan daftar lengkap analog fungsional (Zhang 2008; Roy et al. 2010). Struktur yang cocok dianalisis menggunakan program PyMOL (http://www. pymol.org) yang memungkinkan kita untuk mengevaluasi lebih lanjut mengenai struktural dan fungsi domain dari protein RNase H SRV-2.

Hasil dan Pembahasan Isolasi dan Konstruksi Pohon Filogenetik RNase H SRV-2 Isolat Indonesia Amplifikasi PCR terhadap gen penyandi RNase H SRV-2 isolat Indonesia asal M. fascicularis menghasilkan amplikon berukuran sekitar 354 bp (Gambar 3.1). Produk PCR ini meliputi daerah RNase H SRV-2 pada posisi 4571-4925 bp berdasarkan genom SRV-2 utuh yang ada di data genbank (AF126467.1). Translasi asam amino menggunakan program EMBOSS-Transeq dan ORF finder (NCBI) menghasilkan 118 asam amino yang mempunyai kesamaan 97% dengan RNase H SRV-2 (AAD43256.1) setelah diverifikasi dengan program BLASTp (NCBI). Terdapat empat perbedaan asam amino diantara keduanya yaitu pada posisi 478 (His terhadap Glu), 521 (Cis terhadap

25 Tyr), 540 (Arg terhadap Gly), dan 541 (Thr terhadap Pro). Runutan asam amino RNase H SRV-2 berada pada posisi 429-547 yaitu sekitar 21% dari keseluruhan enzim RT SRV-2 (118 dari 547 asam amino). RNase H SRV-2 mempunyai kemiripan tertinggi dengan SRV-2 D2/RHE/OR yaitu sebesar 97%. 1500 bp 600 bp 354 bp 100 bp

M

Gambar 3.1

1

2

Hasil amplifikasi PCR terhadap gen RNase H SRV-2, M) 100 bp DNA ladder (Invitrogen), 1) produk PCR RNase H SRV-2 menghasilkan 354 bp 2) Kontrol reagen

Betaretrovirus

Deltaretrovirus Alpharetrovirus Gammaretrovirus Spumavirus Lentivirus

Gambar 3.2 Pohon filogenetik runutan asam amino RNase H dari berbagai retrovirus Konstruksi pohon filogenetik dibangun berdasarkan hasil penyejajaran majemuk (multiple-aligned) runutan asam amino RNase H RT SRV-2 yang dibandingkan dengan data yang ada di basis data dari berbagai genus retrovirus (Gambar 3.2). Hasil filogenetik menunjukkan bahwa dendogram RNase H membentuk dua kelompok (cluster) besar yaitu kelompok pertama yang terdiri atas betaretrovirus, deltaretrovirus dan alfaretrovirus; sedangkan kelompok kedua terdiri atas gamaretrovirus, spumavirus dan lentivirus. Perbedaan dua kelompok ini terutama disebabkan adanya perbedaan

26 panjang runutan asam amino antara utas β2 dan utas β3 serta pada heliks α C (Gambar 3.3). RNase H SRV-2 isolat Idonesia memiliki kekerabatan terdekat dengan SRV-2 isolat Oregon (AAD43256, AAA47562) yang berada dalam kelompok betaretrovirus bersama-sama dengan SRV-1, SRV-3 (MPMV), SRV-4 dan SERV (Endogen).

Pemodelan Struktur Sekunder RNase H SRV-2 Isolat Indonesia Berdasarkan hasil prediksi model struktur dua dimensi domain RNase H SRV-2 menggunakan program I-TASSER menunjukkan molekul RNase H SRV-2 disusun oleh campuran struktur berupa lembaran β (β-sheets) yang terdiri atas empat utas pararel (utas 1, 3, 4, dan 5) dan satu berupa utas anti-paralel (utas 2), dan diapit oleh lima struktur heliks α (α-helices) yang terdiri atas heliks α A sampai dengan E (Gambar 3.4). Struktur heliks α-C merupakan heliks yang cukup berbeda antar anggota retrovirus. Hasil penyejajaran majemuk RNase H antar retrovirus dengan program ClustalW pada Gambar 3.3 menunjukkan bahwa MMLV, FeLV, BaEV dan SFV merupakan kelompok retrovirus yang memiliki struktur heliks α-C, sedangkan AMV, HIV, SIV, dan FIV tidak memiliki struktur heliks ini. Kelompok betaretrovirus termasuk SRV-2 memiliki struktur heliks α-C namun dengan ukuran yang lebih pendek dibanding MMLV. Heliks ini diprediksi berperan penting dalam proses interaksi dengan substrat hibrid RNADNA dan berkontribusi terhadap pengikatan dengan nukleotida (Lim et al. 2006). Hasil analisis struktur tiga dimensi kristalografi sinar-X membuktikan bahwa MMLV mempunyai struktur heliks α-C sedangkan HIV-1 dan AMV tidak memiliki struktur ini (Lim et al. 2006). Situs aktif superfamili RNase H mengandung beberapa asam amino yang bersifat lestari. Situs aktif katalitik RNase H mengandung tiga asam amino dengan motif DED yang mengandung residu karboksilat yaitu Asp, Glu dan Asp. Motif DED ini berada pada blok yang sangat lestari masing-masing pada posisi struktur lembaran β1, heliks α-A, dan diantara lembaran β-4 dan heliks α-B. Motif katalitik DED berkoordinasi dengan dua kation Mg2+ yang berperan penting dalam fungsi enzim. Pemodelan Struktur Tiga Dimensi RNase H SRV-2 Pada penelitian ini, juga dilakukan prediksi model struktur tiga dimensi domain RNase H SRV-2 yang dibandingkan dengan struktur kristal RNase H HIV-1 sesuai dengan basis data di PDB (3HYF). Gambaran prediksi tiga dimensi tersebut terdapat pada Gambar 3.4. Model didesain menggunakan program I-TASSER dan divisualisasi dengan program Pymol. Hasil pemodelan secara komputasi diperoleh lima model yang mungkin dan model I merupakan struktur yang memiliki nilai C-score tertinggi yaitu 0.37 dengan perkiraan nilai akurasi TM-score 0.76±0.10 dan nilai RMSD 3.6±2.5Å (Gambar 3.4A). Nilai C (confidence)-score berkorelasi dengan kualitas model yang dihasilkan dimana semakin tinggi nilainya semakin tinggi tingkat kepercayaan model tersebut. Secara umum, model yang memiliki nilai C-score > -1.5 diperkirakan masih mempunyai pelipatan protein yang tepat. Nilai TM-score (template modeling) dan RMSD (root mean squared deviation) keduanya menggambarkan kesamaan topologi antara model dengan struktur cetakan (template). Kisaran nilai TM-score adalah antara [0, 1] dimana semakin tinggi nilainya maka semakin baik kesesuaian struktur model dengan cetakan. Secara keseluruhan, struktur RNase H SRV-2 mempunyai kemiripan dengan ortolognya seperti RNase H Escherichia coli (PDB 1GOA) dan RNase H HIV-1 (PDB 3QIO, 3HYF) (Gambar 3.4B).

27

SRV-2Ind SRV-2AAD43256.1 MPMV SRV-1 SRV-4 SERV MMTV FeLV MMLV BaEV HIV-2 SIV HIV-1 FIV HTLV-1 AMV SFV

Utas β1 Utas β 2 Utas β3 heliks α-A CCSSSSCCCCCC-SSSSSSCCS-----------------SSSSCCCCCCCHHHHHHHHHH ALLVFTDGSSTG-IAAYTFEKT-----------------TVKFKTSHTSAQLVELQALIA ALLVFTDGSSTG-IAAYTFEKT-----------------TVKFKTSHTSAQLVELQALIA ALLVFTDGSSTG-MAAYTLTDT-----------------TIKFQTNLNSAQLVELQALIA ALLVFTDGSSTG-MAAYTLADT-----------------TIKFQTNLNSAQLVELQALIA ALLVFTDGSSTG-IAAYTFADS-----------------IIKFQTKFSSAQLVELQAFIA ALLIFTDGSSTG-LAAYTYNDV-----------------IVKFQTTYTSAQLVKLQAIIA GIVIFTDGSANGRSVTYIQGRE-----------------PIIKENTQNTAQQAEIVAVIT DLTWYTDGSSFIRNGERKAGAAVT---------TESEVIWAASLPPGTSAQRAELIALTQ DHTWYTDGSSLLQEGQRKAGAAVT---------TETEVIWAKALPAGTSAQRAELIALTQ DHTWYTDGSSYLDSGTRRAGAAVV---------DGHNTIWAQSLPPGTSAQKAELIALTK AETFYTDGSCNKQSREGKAGYITD---------RGR---DKVRLLEQTTNQQAELEAFAM AVTFYVDGAANRDSKTGNAGYVAS---------DGT---QRVQYLEQTTNQQAELEGLLM AETYYVDGAANRETKLGKAGYVTD---------KGK---QKIITLTETTNQKAELQAIQI AETWYIDGGR-KKGKKARAGRWKN---------SKE---WQIMEIEGS-NQVAEAQALNM APCLFSDGSPQKAAYVLWDQTILQ---------QD---ITPLPSHETHSAQKGELLALIC --TVFTDASSSTHKGVVVWREGPR-------------WEIKEIADLGASVQQLEARAVAM AMVFYTDGSAIKHPDVNKSHSAGMGIAQVQFIPEYKIVHQWSIPLGDHTAQLAEIAAVEF


heliks α-D Utas β 4 heliks α-B heliks α-C HHHHCC—-CCCSSSSSCHHHHHHHHCHHHHHCC--------CCCCCCCHHHHHHHHHHHH VLSAFP--HRALNIYTDSAYLAHSIPLLETVSQ--------IKHISDTAKLFLQCQQLIC VLSAFP--QRALNIYTDSAYLAHSIPLLETVSQ--------IKHISDTAKLFLQCQQLIY VLSAFP--NQPLNIYTDSAYLAHSIPLLETVAQ--------IKHISETAKLFLQCQQLIY VLSAFP--NQPLNIYTDSAYLAHSIPLLETVAQ--------IKHISETAKLFLQCQQLIY VLSAFP--NQPLNIYTDSAYLAHSIPLLETVAQ--------IKHISDTAQLFLQCQQLIH ALSAFP--CQPLNIYTDSAYLAHSIPLLETVPQ--------IKHISDTANLFLQCQQLIQ AFEEVS---QPFNLYTDSKYVTGLFPEIETAT---------LSPRTKIYTELKHLQRLIH ALKMAK--GKKLTVYTDSRYAFATAHVHGEIYRRRGLLTSEGKEIKNKNEILALLEALFL ALKMAE--GKKLNVYTDSRYAFATAHIHGEIYRRRGLLTSEGKEIKNKDEILALLKALFL ALELSK--GKKANIYTDSRYAFATAHTHGSIYERRGLLTSEGKEIKNKAEIIALLKALFL AVTDS---GPKANIIVDSQYVMGIVAGQ--------------PTESESKIVNQIIEEMIK ALQDS---KDKVNIVVDSQYSYGILMTC--------------PTNTEHPIVEQIIQEAIK ALQDS---GSEVNIVTDSQYALGIIQAQ--------------PDSSESELVNQIIEQLIK ALKAG---PEKMNIITDSQYVYNMIRAR--------------PEPS-SPLWKEIIEELQK GLRAAKP-WPSLNIFLDSKYLIKYLHSLAIGAF---------LGTSAHQTLQAALPPLLQ ALLLWP--TTPTNVVTDSAFVAKMLLKMG-------------QEGVPSTAAAFILEDALS ACKKALKISGPVLIVTDSFYVAESANKELPYWKSNGFLNNKKKPLRHVSKWKSIAECLQL


Utas β5 heliks α-E CCCCCSSSSSSCCCCCCCCHH-HCCCC NRSIPFYLGHIRAHSGLPRTL-SQGNH----------------------------NRSIPFYLGHIRAHSGLPGPL-SQGNH----------------------------NRSIPFYIGHVRAHSGLPGPI-AQGNQRADLATKIVA------------------NRSIPFYIGHVRAHSGLPGPI-AHGNQKADLATKTVA------------------NRSTPIYIGHVRAHSGLPGPI-AQGNQLADLATKTIA------------------KRTTPFFLGHIRAHSR---------------------------------------KRQEKFYIGHIRGHTGLPGPL-AQGN-----------------------------PKR--LSIIHCPGHQKGDSPQ-AKGNRLADDTAKKAA--------TETQSSLTILPKR--LSIIHCPGHQKGHSAE-ARGNRMADQAARKAAI-------TETPDTSTLLI PQE--VAIIHCPGHQKGQDPV-AVGNRQADRVARQAAMAEVLTLATEPDNTSHITKEA--IYVAWVPAHKG------IGGNQEVDHLVSQ--------------------KEA--IYVTWVPAHKG------IGGNEAVDKLVSKG-------------------KEK--VYLSWVPAHKG------IGGNEQVDKL-----------------------KEK--IFLDWVPGHKG------IPGNKEIDELV----------------------GKT--IYLHHVRSHTNLPDPI-STFNEYTDSL-----------------------QRSAMAAVLHVRSHSEVPGFF-TEGNDVADSQATFQAY-----------------KPD--IIIMHEKGHQQPMTTLHTEGNNLADKLATQG--------------------

Gambar 3.3

42 42 42 42 42 43 51 51 51 48 48 48 46 48 45 60

92 92 92 92 92 92 91 109 109 109 91 91 91 88 98 90 120

118 118 128 128 128 108 116 153 155 161 118 119 115 113 127 127 154

Hasil penyejajaran majemuk (multiple alignment) domain RNase H berbagai retrovirus beserta keterangan prediksi struktur dua dimensi dan daerah lestarinya.

28 Superposisi antara RNase H SRV-2 terhadap RNase H HIV-1 digambarkan untuk melihat kecocokan struktur (best fit) antara keduanya (Gambar 3.4C). Struktur RNase H HIV-1 yang memiliki motif paling konsisten terhadap RNase H SRV-2 adalah 3LP3.pdb. Model ini memiliki homologi tertinggi dengan nilai TM-score = 0.813, RMSD = 1.64, identity = 0.239 dan coverage 0.924 yang diukur berdasarkan TM-align dari Zhang Lab (Zhang dan Skolnick 2005). Sampai saat ini, struktur kristal RNase H retrovirus yang secara intensif dipelajari adalah RNase H HIV-1 dan MMLV (Lim et al. 2006; Nowotny et al. 2005; Zhou et al. 2012). Dengan demikian, pemodelan struktur molekuler RNase H SRV-2 diprediksi berdasarkan keberadaan struktur kristal yang tersedia di basis data PDB khususnya terhadap RNase H HIV-1. Perbedaan utama antara struktur RNase H SRV-2 dengan HIV-1 adalah tidak adanya heliks-α C pada RNase H HIV-1, sementara itu, heliks-α E dan lembaran-β 5 pada RNase H HIV-1 berukuran lebih panjang dibanding pada SRV-2. Terdapat perbedaan minor pada daerah loop antara lembaran β-5 dan heliks α-E sebagai His-loop yang berdekatan dengan situs aktif sehingga menyebabkan terjadinya sedikit perbedaan konfigurasi pada pusat katalitik (Zhou et al. 2012).

A

Gambar 3.4

B

C

Model struktur tiga dimensi RNase H SRV-2 (Panel A) dibandingkan dengan RNase H HIV-1 (Panel B) dan superposisi diantara keduanya (Panel C). Model bola menggambarkan residu motif DED dari situs aktif RNase H. Struktur heliks α digambarkan dengan huruf kapital (AE) dan lembaran β dengan nomor (1-5).

Situs aktif superfamili RNase H mengandung beberapa asam amino yang bersifat lestari. Situs aktif katalitik RNase H SRV-2 mengandung tiga asam amino dengan motif DED mengandung residu karboksilat yaitu Asp436, Glu465 dan Asp486, yang distabilkan oleh Thr541 untuk berinteraksi dengan ion Mg2+ (Gambar 3.5A). Asam amino pada situs aktif katalitik RNase H HIV-1 yang berkoordinasi dengan ion Mg2+ adalah Asp443, Glu478, Asp498, dan Asp549 (Gambar 3.5B).

29

A

Gambar 3.5

B Situs aktif katalitik residu asam amino yang berinteraksi dengan kation Mg2+ (ditunjukkan dengan bulat kuning) pada RNase H SRV-2 (A) dan RNase H HIV-1 (B).

Pada penelitian ini, juga diprediksi kemungkinan model residu asam amino yang berinteraksi dengan hibrid RNA-DNA sebagai substratnya. Residu asam amino RNase H SRV-2 yang berinteraksi dengan utas RNA-DNA adalah Ser438, Ser439, Thr440, Ala461, Ala488, His531, Arg533, dan Ala534 (Gambar 3.6A). Residu asam amino dari RNase H HIV-1 yang berinteraksi dengan utas RNA/DNA adalah Ala446, Arg448, Glu449, Thr473, Asn474, Gln475, Gln500, dan His539 (Gambar 3.6B). A

B

Gambar 3.6 Interaksi situs aktif RNase H SRV-2 (A) dan HIV-1 (B) dengan substrat nukleotida RNA. Residu asam amino yang berinteraksi dengan nukleotida digambarkan dengan model bola dan nukleotida RNA digambarkan dengan model tongkat. Terdapat dua sub-region dari domain RNase H retrovirus yaitu RNase H primer grip dan C-helix and loop yang mempunyai karakter struktur yang berbeda dan berpengaruh terhadap kontribusi aktivitas RNase H (Schultz dan Champoux 2008). RNase H primer grip adalah daerah dekat dengan situs aktif RNase H yang kontak dengan nukleotida pada utas DNA dalam hibrid yang membentuk pasangan dengan nukleotida RNA (Schultz dan Champoux 2008). Primer grip residu Tyr489 pada RNase

30 H SRV-2 (Tyr501 pada HIV-1) merupakan bagian residu yang penting untuk kontak dengan substrat dimana perubahan pada sisi ini akan berpengaruh terhadap aktivitas RNase H maupun terhadap pengenalan yang sangat penting dengan substrat. Gln462 pada RNase H SRV-2 (Gln475 pada HIV-1) juga merupakan residu dalam primer grip yang sangat penting (Champoux dan Schultz 2009). Model interaksi antara substrat RNA-DNA dengan RNase H SRV-2 berdasarkan hasil pemodelan program I-TASSER menunjukkan adanya delapan residu asam amino yang terlibat yaitu: Ser438, Ser439, Thr440, Ala461, Ala488, His531, Arg533, Ala534 (Gambar 3.6A, Tabel 3.1). Berdasarkan struktur kristal PDB 1HYS dan 3HYF mengindikasikan residu RNase H HIV-1 yang berinteraksi dengan substrat DNA-RNA adalah Ala446, Arg448, Glu449, Thr473, Asn474, Gln475, Gln500, dan His539 (Gambar 3.6B). Variasi residu pada situs pengikatan ini kemungkinan disebabkan perbedaan struktur dimana RT SRV-2 berupa monomer sedangkan RT HIV-1 adalah berupa dimer. Tabel 3.1

Perbandingan asam amino yang berperan dalam situs aktif RNase H SRV-2 dan HIV-1 Posisi asam amino Posisi asam amino Situs RNase H RNase H HIV-1b RNase H Indoa Panjang asam amino 1-547 1-553 RT-RNase H utuh Panjang asam amino 431-547 438-553 RNase H Hibrid RNA-DNA Ser438, Ser439, Thr440, Ala446, Arg448, Glu449, Ala461, Ala488, His531, Thr473, Asn474, Gln475, Arg533, Ala534 Gln500, Hi539 Situs aktif RNase H Asp436, Glu465, Asp486 Asp443, Glu478, Asp498, Asp549 Berdasarkan hasil prediksi struktur molekul dengan program I-TASSER Mengacu pada Kirby et al. 2012

a b

Pemodelan struktur tiga dimensi RNase H SRV-2 merupakan penelitian awal untuk mengeksplorasi karakteristik molekuler dan mekanisme biokimia dari RNase H SRV-2. Hal ini telah memberikan gambaran informasi untuk memahami mekanisme katalitik dan asam amino yang berperan di situs aktif enzim ini. Melalui pemahaman karakteristik molekuler dan struktur molekul RNase H SRV-2 diharapkan akan memberikan konsep-konsep baru untuk mencari inhibitor RNase H yang rasional dan untuk membuktikan bahwa SRV-2 dapat menjadi model virus pada penelitianpenelitian terkait virus HIV.

Simpulan Gen penyandi RNase H asal SRV-2 yang diisolasi dari M.fascicularis Indonesia (RNase H SRV-2 Indo) berhasil diisolasi dikarakterisasi runutan asam aminonya. Hasil pemodelan struktur tiga dimensi menunjukkan RNase H SRV-2 Indo memiliki kemiripan struktur dengan RNase H yang ada di basis data PDB terutama terhadap

31 RNase H E. coli dan HIV-1. Asam amino yang berperan dalam situs aktif yang berinteraksi dengan substratnya juga berhasil diprediksi.

4 PENGKLONAAN DAN EKSPRESI GEN PENYANDI REVERSE TRANSCRIPTASE SIMIAN BETARETROVIRUS SEROTIPE-2 (SRV-2) ASAL MONYET EKOR PANJANG INDONESIA MENGGUNAKAN SISTEM EKSPRESI ESCHERICHIA COLI Cloning and Expression of Serotype-2 Simian Betaretrovirus Reverse Transcriptase Gene Isolated From Indonesian Cynomolgus Monkey in Escherichia coli

Abstract In this study, we were developing the reverse transcriptase (RT) recombinant isolated from serotype-2 Simian betaretrovirus (SRV-2) infected Indonesian cynomolgus monkey (Macaca fascicularis) using Escherichia coli expression system. We have isolated the SRV-2 RT gene located at position 3284-4925 nucleotide of polyprotein (Pol) region encoding 547 amino acids. Analysis of expression using SDS PAGE and Western blot techniques showed a specific band sized of 64.9 kDa assumed as SRV-2 RT recombinant enzyme. Purification of SRV-2 RT recombinant enzyme produced 312 µg mL-1 protein that has 7.1 Unit (U) µL-1 enzyme activities. Application of this recombinant enzyme in reverse transcription-PCR (RT-PCR) technique of β-globin and β-actin gene target showed that this SRV-2 RT enzyme was able to reverse transcribe mRNA into cDNA. This was indicated by the presence of DNA bands sized 206 base pairs (bp) and 350 bp specific for β-globin and β-actin genes. Therefore, this SRV-2 RT enzyme has the activity similar to that of commercial enzyme, although the activity is still low.

Keywords: reverse transcriptase, recombinant enzyme, SRV-2, Escherichia coli expression system

Pendahuluan Reverse transkripsi merupakan tahapan proses yang sangat penting dalam siklus hidup dan replikasi dari semua retrovirus (Telesnitsky dan Goff 1997; Sarafianos et al. 2009). Reverse transcriptase (RT) adalah enzim multifungsi yang mengkatalisis pembentukan asam deoksiribonukleat untai ganda (DNA) dari asam ribonukleat beruntai tunggal (RNA) asal genom virus (Telesnitsky dan Goff 1997; Goff 2001; Coffin et al. 1997). Enzim ini bertanggung jawab terhadap replikasi genom virus yang memiliki aktivitas RNA polimerase dan DNA polimerase serta aktivitas RNase H (Hizi dan Herschhorn 2008). Enzim RT sangat berperan penting dalam bidang biologi

32 molekuler, genetika dan biomedis yang digunakan untuk menyintesis DNA komplementer (cDNA) dari messenger RNA (mRNA) (Telesnitsky dan Goff 1997; Herschhorn dan Hizi 2010). Aplikasi enzim ini yang digabungkan dengan teknik amplifikasi PCR (RT-PCR) telah memperluas pengetahuan kita tentang berbagai mekanisme regulasi seluler dan telah menjadi standar emas (gold standard) untuk memfasilitasi pengklonaan daerah penyandi setiap gen yang diinginkan. Ketersediaan enzim RT telah menjadi bagian penting dalam berkembangnya kemajuan bioteknologi sekarang ini (Herschhorn dan Hizi 2010). Gencarnya penelitian mengenai enzim RT dipicu oleh adanya penemuan human immunodeficiency virus (HIV) pada tahun 1980-an yang merupakan agen patogen penyebab terjadinya acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) pada manusia. Tingginya morbiditas dan mortalitas pada penderita HIV/AIDS menyebabkan banyaknya penelitian yang dilakukan untuk menemukan agen antivirus HIV dan enzim RT ini menjadi target utama untuk dihambat melalui penemuan senyawa anti RT (Hizi dan Herschhorn 2007; Kohlstaedt et al. 1992). Penelitian enzim RT terus berkembang tidak hanya terhadap virus HIV namun juga dari berbagai jenis virus lainnya dari famili Retroviridae antara lain berasal dari molony murine leukemia virus (MMLV), mouse mammary tumour virus (MMTV), avian myeoloblastosis virus (AMV), feline immunodeficiency virus (FIV), dan human T lymphotropic virus (HTLV) (Herschhorn dan Hizi 2010). Sampai saat ini, enzim RT asal HIV-1 dan MMLV merupakan enzim RT yang paling banyak dikarakterisasi. RT asal virus HIV-1 menjadi target utama untuk pengembangan terapi obat antiretroviral terhadap HIV-1/AIDS dan enzim RT HIV-1 merupakan enzim yang paling banyak dipelajari dalam penelitian biomedis (Kohlstaedt et al.1992). Sementara itu, RT MMLV adalah enzim yang paling banyak digunakan dalam bidang biologi molekuler untuk sintesis cDNA dan amplifikasi RNA karena mempunyai aktivitas katalitik yang kuat (Kotewitcz et al.1988; Taube et al. 1998; Chen et al. 2009). Simian betaretrovirus serotipe-2 (SRV-2) adalah salah satu agen penyakit yang dapat menyebabkan sindroma penurunan kekebalan tubuh (simian acquired immunodeficiency syndrome, SAIDS) pada satwa primata monyet Asia genus Macaca (Iskandriati et al. 2010; Iskandriati et al. 1998; Pamungkas et al. 1991; Marx et al. 1985). Infeksi SRV-2 pada Macaca dapat menjadi faktor pengganggu (confounding) dalam penelitian biomedis yang menggunakan satwa ini sebagai subyek penelitian (Lerche dan Osborn 2003; Lerche 2003). SRV-2 isolat Indonesia asal M.fascicularis telah berhasil diisolasi dan diidentifikasi yang memiliki kemiripan urutan nukleotida daerah envelop sebesar 94-96% terhadap SRV-2 isolat Washington (Iskandriati et al. 2010). SRV-2 tergolong dalam famili Retroviridae dan genus betaretrovirus yang memiliki empat gen utama yaitu gag (group specific antigen), env (envelope), prt (protease), dan pol (polymerase) (Marraci et al. 1995; Marraci et al. 1999, Thayer et al. 1987). Gen pol diketahui menyandikan dua enzim penting yang berperan dalam proses replikasi retrovirus dalam inangnya yaitu RT/RNase-H dan integrase. Hingga kini belum ada penelitian mengenai RT asal SRV-2 khususnya yang diisolasi dari Macaca asal Indonesia. Adanya gen RT pada SRV-2 memungkinkan untuk dikembangkannya menjadi enzim rekombinan RT asal SRV-2 isolat Indonesia tersebut. Kegiatan penelitian ini bertujuan untuk melakukan ekspresi gen penyandi enzim RT yang diisolasi dari SRV-2 asal monyet ekor panjang Indonesia, melakukan pemurnian dan menguji aktivitas enzim rekombinan RT yang dihasilkan. Diharapkan akan diperoleh enzim rekombinan RT SRV-2 yang memiliki aktivitas enzim serupa

33 dengan enzim komersial sehingga dapat mengurangi ketergantungan enzim sejenis produk luar negeri.

Bahan dan Metode Isolasi Gen RT SRV-2 Menggunakan Teknik PCR Ekstraksi DNA dilakukan terhadap sel darah tepi berinti tunggal (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) dari sampel asal M. fascicularis yang terinfeksi SRV-2 (sampel arsip PSSP LPPM IPB) menggunakan QIAmp Blood DNA Minikit (Qiagen, Hilden, Jerman). Gen RT SRV-2 diamplifikasi menggunakan primer spesifik yaitu SRV-2RT3284U (5’CACCCCTGTTTGGGTTGATC-3’) dan SRV-2 RT4925R (5’-CTAGTGATTACCTTGAGATAA AGGTCC-3’). Teknik PCR dilakukan dengan menggunakan enzim Pfx DNA Polymerase (5 U µL-1) dan dijalankan pada mesin PCR Gene Amp PCR System 9700. Komponen reaksi yang digunakan adalah 5 µl DNA hasil ekstraksi, masing-masing 1 µL primer dengan konsentrasi 10 pmol µL-1, 2 µl MgCl2 konsentrasi 25 mM, 2.5 µl 10x TaqGold buffer, 2.5 µl dNTP 10 mM, 0,5 µl Pfx DNA polymerase 5 U µL-1, dan dH2O hingga volume reaksi 25 µl. Tahapan PCR dilakukan sebagai berikut: pre-denaturasi pada suhu 94°C selama 10 menit, selanjutnya tahap denaturasi pada suhu 94°C selama 30 detik, tahap annealing pada suhu 55°C selama 30 detik, dan tahap ekstensi pada suhu 68°C selama 2 menit. Ulangan dalam reaksi PCR dilakukan sebanyak 40 siklus. Hasil PCR dikonfirmasi dengan metode elektroforesis menggunakan 1.0% gel agarosa yang mengandung 10 µg mL-1 etidium bromida, dijalankan dengan arus listrik 100 Volt selama 60 menit. Visualisasi dilakukan menggunakan GelDoc (Biorad, AS). Purifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Jerman) sesuai prosedur yang diberikan. Tambahan primer yang digunakan untuk proses sekuensing adalah M13F (TGTAAAACGACGGCCAGT), M13R (GGTCATAGCTGTTTCCTG), SRV-2 RT 3751R (5’-GCCCAAGATTTTCTGATTGG-3’), SRV-2 RT 3799F (5'-GATTGGCG AACAAGTTTTGC-3'), SRV-2 RT 4247F (5’-TACTGGCCTCTTCTGG-3’), dan SRV2 RT 4604F (5'-GGCATAGCCGCATACACTTT-3'). Primer-primer ini didesain menggunakan program Primer3 (http://primer3.wi.mit.edu/) berdasarkan cetakan genom komplit SRV-2 (Genbank AF126467.1) sebagai referensi. Pengklonaan dan Ekspresi Gen RT SRV-2 Gen target RT SRV-2 diinsersikan ke dalam vektor pENTR/SD/TOPO (Invitrogen, California, Amerika Serikat) dengan mengacu pada prosedur dari Invitrogen yang ditransformasikan ke dalam E. coli TOP10 dan ditumbuhkan dalam cawan petri LB agar yang mengandung 50 µg mL-1 antibiotik kanamisin. Klona selanjutnya dikultur dalam LB broth dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 jam. Isolasi DNA plasmid dilakukan menggunakan kit ekstraksi QIAprep spin miniprep kit (Qiagen, Hilden, Jerman) yang selanjutnya dilakukan analisis dengan teknik PCR dan perunutan nukleotida (sequencing) menggunakan primer universal M13 untuk meyakinkan bahwa gen sasaran sudah masuk ke dalam vektor dengan benar. Gen RT SRV-2 dalam pENTR/SD/TOPO selanjutnya di subklonakan ke dalam vektor destinasi pDEST17 (Invitrogen, California, Amerika Serikat) pada posisi nukleotida 147 dan 1830 arah hilir (downstream) dari gen 6x His-tag dan ditransformasikan ke dalam E. coli DH5α. Analisis terhadap rekombinan dilakukan menggunakan teknik PCR dan

34 perunutan nukleotida dengan primer forward T7 promoter terhadap primer SRV-2 RT4925R. pDEST17 yang mengandung gen target ditransformasi ke dalam E. coli BL21AI sebagai sel ekspresi menggunakan metode kejut panas (heat shock). Tranforman ditumbuhkan dalam 5 mL media LB broth yang mengandung 100 µg mL-1 ampisilin sampai mencapai absorbansi OD600 0.6-1.0. Kultur ini selanjutnya diinokulasikan ke dalam media segar LB yang mengandung ampisilin 100 µg mL-1 sampai mencapai fase mid-log (OD600 ~0.4) dan diinduksi dengan 20% L-Arabinosa.

Purifikasi dan Analisis Hasil Ekspresi Enzim Rekombinan RT SRV-2. E. coli BL21AI yang mengekspresikan protein rekombinan RT SRV-2 dikultur semalam dalam 1 L media LB broth dan disentrifugasi pada kecepatan 10 000 x g selama 10 menit. Pelet sel dilisis menggunakan native binding buffer (50 mM kalium fosfat pH 7.8, 400 mM NaCl, 100 mM KCl, 10% gliserol, 0.5% Triton X 100, 10 mM imidazol) dan ditambahkan 8 mg lisozim. Kromatografi afinitas dengan agen pengkelat Ni2+-NTA (Qiagen, Hilden, Jerman) digunakan untuk tahap pemurnian protein rekombinan. Konsentrasi protein rekombinan ditentukan menggunakan uji bicinchoninic acid assay (BCA) (Thermo Scientific, Illinois, Amerika Serikat). Hasil ekspresi enzim rekombinan RT SRV-2 dianalisis menggunakan teknik SDS PAGE berdasarkan adanya pita protein spesifik. Uji Western blot dilakukan untuk menganalisis reaksi serologis dengan antibodi anti-polipeptida 6x Histidine-tagged (Invitrogen, California, Amerika Serikat) terhadap 6x His-RT SRV-2. Analisis Aktivitas Enzim Rekombinan RT SRV-2. Aktivitas enzim RT SRV-2 ditentukan secara kuantitatif menggunakan RT colorimetric assay (Roche, Penzberg, Jerman) berdasarkan kemampuan enzim RT untuk menyintesis utas DNA baru yang dimulai dari hibrid cetakan/primer poly (A) x oligo (dT)15. Uji dijalankan dalam suatu campuran reaksi yang mengandung 46 mM Tris-HCl, 266 mM kalium fosfat, 27.5 mM magnesium klorida, 9.2 mM DDT, 10 mM dUTP/dTTP, dan hibrid cetakan/primer, pada kondisi pH 7.8; inkubasi dijalankan selama 1 jam pada suhu 37oC. Jumlah dari DNA yang baru disintesis dikuantitasi sebagai parameter untuk mengukur aktivitas RT enzim yang diikuti dengan tahapan prosedur sandwich ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Nukleotida terlabel digoksigenin dan biotin dalam perbandingan yang tepat bergabung ke dalam molekul DNA yang baru disintesis oleh enzim RT. DNA yang terlabel biotin selanjutnya terikat ke dalam permukaaan pelat mikro (microplate) yang sebelumnya telah dilapisi dengan streptavidin. Selanjutnya ditambahkan konjugat yaitu antibodi terhadap digoksigenin yang dilabel horseradish peroksidase (anti-DIG-POD) yang akan terikat pada DNA terlabel digoksigenin. Suatu substrat peroksidase yaitu luminol/4-iodophenol ditambahkan yang akan dioksidasi oleh peroksidase dalam hidrogen peroksida (H2O2) yang menghasilkan produk reaksi dan dikuantifikasi dengan alat baca ELISA (ELISA reader) pada panjang gelombang 490 nm. Hasil baca absorbansi berkorelasi dengan kandungan aktivitas enzim RT dari sampel yang dianalisis. Aktivitas enzim RT SRV-2 juga dianalisis secara kualitatif dengan mengaplikasikannya pada teknik reverse transcription-PCR (RT-PCR) untuk melihat kemampuan enzim tersebut dalam mentranskripsi balik mRNA menjadi cDNA. Metodenya mengacu pada Superscript III reverse transcriptase (Invitrogen, California, Amerika Serikat) dan cDNA yang dihasilkan selanjutnya diamplifikasi terhadap target house-keeping genes β-globin dan β-aktin.

35

Hasil dan Pembahasan Isolasi Gen RT SRV-2 dan Pengklonaan Pada penelitian ini, gen target diisolasi dari gen pol SRV-2 yang menyandikan enzim reverse transcriptase pada posisi nukleotida 3284-4925 dan menghasilkan pita DNA spesifik 1641 bp (Gambar 4.1).

1641 bp

1500 bp 600 bp

100 bp

M Gambar 4.1

1

2

Amplifikasi gen RT SRV-2 menggunakan primer spesifik RT SRV-2 RT 3284F dan 4925R. M) 100 bp DNA ladder (Invitrogen), 1-2) Produk PCR RT SRV-2 berukuran 1641bp

Primer forward didesain dengan penambahan nukleotida CACC yang akan memfasilitasi proses pengklonaan gen sasaran ke dalam vektor entry pENTR/SD/TOPO. Pada primer reverse dilakukan penambahan nukleotida CTA sebagai reverse complement terhadap kodon stop UAG karena ekspresi dilakukan pada vektor ekspresi pDEST17 terminal ujung-N. Amplifikasi PCR dilakukan menggunakan DNA polimerase Pfx asal Thermococcus sp yang mempunyai akurasi amplifikasi tinggi dan mempunyai kemampuan aktivitas proof reading dalam menyintesis utas nukleotida. Gen RT SRV-2 dikonstruksi di dalam vektor entry pENTR/SD/TOPO yang akan memfasilitasi masuknya gen tersebut ke dalam vektor destinasi pDEST17 sebagai sistem ekspresi E. coli. Sistem pengklonaan ini menggunakan metode universal dengan memanfaatkan sifat-sifat rekombinasi situs spesifik (site specific recombination) dari lambda bakteriofage (Landy 1989; Hartley et al.2000). Prinsip kerja dari metode ini didasarkan atas kerja enzim topoisomerase I virus vaccinia yang akan mengikat DNA dupleks pada sisi spesifik CCCTT dan memecah ikatan fosfodiester pada salah satu untainya (Shuman 1994). Energi dari ikatan fosfodiester yang dipecah selanjutnya disimpan dengan membentuk ikatan kovalen antara 3’-fosfat dari untai yang dipecah dan residu tirosil (Tyr-274) dari topoisomerase I. Ikatan fosfotirosil antara DNA dan enzim selanjutnya akan bereaksi dengan 5’-hidroksil dari untai yang dipecah, menyebabkan reaksi balik dan melepaskan topoisomerase (Shuman 1994). Arah penggabungan dari DNA untai ganda menggunakan oligonukleotida bermuatan-TOPO terjadi melalui penambahan ujung runcing (overhang) 3’- yang mengandung sekuens GTGG terhadap DNA yang masuk. Untai tunggal overhang ini adalah identik dengan ujung 5’ dari fragmen DNA bermuatan-TOPO. Oleh sebab itu, primer SRV-2 RT3284U didesain

36 dengan menambahkan sekuens CACC pada ujung 5’-nya. Untai overhang akan menginvasi ujung 5’ dari produk PCR, menempel pada basa yang ditambahkan dan menstabilkan produk PCR pada orientasi yang benar. Analisis hasil PCR menggunakan primer forward dan reverse M13 dilakukan untuk memeriksa keberadaan gen sisipan RT SRV-2 dalam plasmid pENTR/SD/TOPO yang menghasilkan DNA spesifik berukuran 1991 bp (Gambar 4.2A).

A

B

5000 bp 1650 bp

1991 bp

1000 bp 500 bp

M

Gambar 4.2

1

2

A) Amplifikasi PCR terhadap plasmid pENTR/SD/TOPO RT SRV-2 menggunakan primer M13 F dan M13 R, M) 1kb DNA ladder (Invitrogen); 1-2) Produk PCR berukuran 1991 bp mengandung RT SRV-2. B) Ilustrai peta genetik vektor pENTR/SD/TOPO- RT SRV-2

Analisis runutan nukleotida terhadap plasmid pENTR/SD/TOPO yang dikonfirmasi dengan program BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) mengindikasikan adanya gen target yang memiliki kesamaan 99% (1631 dari 1641 nukleotida) terhadap RT SRV-2 isolat D2/RHE/OR (Genbank AF126467.1). Gen target telah tersisip ke dalam vektor pada arah yang tepat tanpa adanya pergeseran nukleotida pada bingkai baca (reading frame) dan berlokasi pada arah hilir dari posisi situs pengikatan ribosom (ribosome binding site, RBS) dan diapit oleh situs attL1 dan attL2 (Gambar 4.2B dan Gambar 4.3).

37

M13 Forward primer TGTAAAACGACGGCCAGTCTTAAGCTCGGGCCCCAAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCA attL1 ACAAATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCGCGGCCGCCTTGTTTAACT RBS SRV-2 RT3284F Gen RT SRV-2 TTAAGAAGGAGCCCTTCACCCCTGTTTGGGTTGATCAATGGCCCCTAACTCAAGAAAAACTTGCTGCTGCCCAACAGT TAGTGCAAGAACAATTACAGGCAGGGCATATTATAGAAAGTAATTCTCCCTGGAATACACCTATATTTGTCATAAAAA AGAAGTCTGGTAAATGGAGGCTTTTGCAAGATTTAAGGGCGGTAAATGCCACCATGGTATTAATGGGAGCTCTCCAAC CTGGGCTGCCCTCACCAGTGGCTATTCCTCAGGGATATTTTAAAATAGTCATTGATCTTAAAGATTGTTTTTTTACTA TCCCCCTTCAGCCCGTTGATCAAAAGCGATTTGCTTTTAGTCTCCCGTCTACCAACTTTAAACAACCAATAAAACGTT ATCAATGGAAAGTGTTGCCTCAAGGCATGGCCAATAGTCCTACCTTGTGTCAAAAATATGTAGCTGCTGCTATAGAGC CAATCAGAAAATCTTGGGCACAAATGTACATTATACACTATATGGATGACATTCTAATAGCAGGAAAGATTGGCGAAC AAGTTTTGCAGTGTTTTGCTCAACTTAAACAAGCATTGACAACTACTGGGTTACAAATAGCTCCAGAAAAGGTACAGC TACAAGATCCATATACCTACCTTGGGTTTCAACTTAATGGTCCCAAAATTACCAATCATAAGGCAGTTATTCGTAGAG ATAAGTTACAAACCCTTAATGATTTTCAAAAACTTTTGGGAGATATCAATTGGCTTAGACCCTATTTACACCTCACTA CAGGAGATCTAAAACCTCTTTTTGATATCCTAAAAGGGGATTCTAATCCTAACTCACCCAGATTTTTATCTGAAGCAG CCCTTACGTCTCTTAAAAAGGTAGAAACAGCTATTGCTGAACAATTTGTTACACAAATAGATTATACACAGCCATTGA CCTTTTTAATTTTTAATACTACACTGACACCTACTGGCCTCTTCTGGCAAAATAATCCTGTCATGTGGGTTCACTTGC CTGCATCGCCAAAAAAGGTATTGTTCCCCTATTATGATGCTATAGCAGATCTTATTATCCTTGGAAGGGACAACAGTA AAAAATATTTTGGACTTGAACCATCTACTATTATACAACCCTATTCTAAATCTCAAATCCATTGGTTAATGCAAAACA CAGAAACATGGCCAATTGCCTGCGCTTCCTATGCAGGCAACATTGATAATCATTATCCACCCAATAAACTTATTCAAT TTTGCAAACTCCATGCAGTTGTTTTTCCCCGAATCATTAGTAAAACTCCTCTAGACAATGCCTTACTGGTATTCACTG ATGGATCCTCTACCGGCATAGCCGCATACACTTTTGAAAAGACCACTGTCAAATTTAAAACCTCCCATACGTCAGCCC AATTAGTAGAATTACAAGCCCTAATTGCAGTGTTATCGGCCTTTCCTCATCGGGCCCTCAATATTTATACAGATAGTG CATACTTAGCTCATTCTATACCTCTACTTGAGACAGTATCGCAAATCAAACATATCTCAGACACAGCAAAATTATTTT TACAGTGCCAACAACTAATATGCAACAGGTCTATACCCTTTTATTTAGGACATATCAGGGCCCATTCAGGATTACCAG GACCTTTATCTCAAGGTAATCACTAGAAGGGTGGGCGCGCCGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTATAAGAA SRV-2 RT4925R AGCATTGCTTATCAATTTGTTGCAACGAACAGGTCACTATCAGTCAAAATAAAATCATTATTTGCCATCCAGCTGATA attL2 TCCCCTATAGTGAGTCGTATTACATGGTCATAGCTGTTTCCTG M13 reverse primer

Gambar 4.3

Runutan nukleotida RT SRV-2 isolat Indonesia pada posisi nukleotida 3284-4925 yang disisipkan ke dalam vektor pENTR/SD/TOPO. Situssitus spesifik dari vektor ditandai dengan huruf tebal dan posisi primer dicirikan dengan huruf warna merah.

Rekombinasi RT SRV-2 Terhadap Vektor Ekspresi Escherichia coli pDEST17 Klona RT SRV-2 dalam pENTR/SD/TOPO direkombinasikan ke dalam vektor destinasi pDEST17 menggunakan reaksi rekombinasi LR. Reaksi rekombinasi ini dilakukan menggunakan campuran enzim LR clonase II yaitu suatu campuran integrase (Int) bakteriofage λ, protein excisionase (Xis), dan protein E. coli integration host factor (IHF) (Shuman 1994; Landy 1989; Hunt 2005). Vektor ini didesain untuk memfasilitasi ekspresi yang dapat menghasilkan protein rekombinan dengan rendemen tinggi dan mudah diinduksi dalam E. coli yang menggunakan sistem pET. Sistem ini menguntungkan karena mempunyai aktivitas yang tinggi dan spesifisitas dari T7 RNA polimerase bakteriofage memudahkan terjadinya regulasi ekspresi dari gen heterolog dalam E. coli dengan memanfaatkan promoter T7 (Rosenberg et al. 1987). T7 promoter adalah daerah promoter dari T7 RNA polimerase. Enzim T7 RNA polimerase merupakan DNA-dependent RNA polimerase yang diekspresikan oleh bakteriofage T7. Adanya T7 promoter dalam pDEST yang tersisipi gen RT SRV-2 diharapkan akan

38 terjadi sintesis RNA dalam sel ekspresi E. coli, selanjutnya terjadi translasi sehingga gen RT dapat diekspresikan menjadi enzim RT. Vektor pDEST17 berukuran 6354 bp yang memiliki promotor T7, situs 6x His, situs AttB1 dan AttB2, gen penyandi resistensi terhadap antibiotik ampisilin, dan gen ccdb yang diapit oleh situs AttB1 dan AttB2. Situs AttB1 dan AttB2 merupakan situs spesifik rekombinasi yang membantu perpindahan gen target dari vektor entri ke vektor destinasi (Hartley et al. 2000). Gen penyandi resistensi terhadap ampisilin berguna untuk proses seleksi transforman. Gen ccdb merupakan gen yang menghambat pertumbuhan sel (Bahassi et al. 1995). Apabila proses rekombinasi gagal, sehingga plasmid destinasi tetap memiliki gen ini, maka bakteri yang membawa plasmid ini tidak akan dapat tumbuh. Adanya gen ini memastikan keberhasilan proses kloning dengan gen target yang benar. Promotor T7 berguna untuk mengekspresikan protein rekombinan dari gen target yang direkombinasikan ke dalam plasmid. Situs 6x His berguna untuk proses purifikasi protein rekombinan menggunakan kromatografi afinitas berkelat ion logam Ni2+.

A

B

5000 bp 1829 bp

1650 bp 1000 bp 500 bp

M

1

2

Gambar 4.4 A) Amplifikasi PCR terhadap plasmid pDEST17 RT SRV-2 menggunakan primer T7 forward dan SRV-2 RT4925R, M) 1 kb DNA ladder (Invitrogen), 1-2) Produk PCR berukuran 1829 bp. B) ilustrasi peta genetik vektor pDEST17- RT SRV-2 Analisis rekombinasi dalam vektor pDEST17 dengan amplifikasi PCR menggunakan primer T7 promoter terhadap RT SRV-2 4925R menghasilkan pita DNA spesifik berukuran 1829 bp (Gambar 4.4). Hasil analisis runutan nukleotida mengindikasikan adanya rekombinasi gen sisipan RT SRV-2 dalam bingkai baca yang tepat dalam vektor (Gambar 4.5). Hal ini membuktikan bahwa gen target telah tersisip secara tepat dalam vektor ekspresi pDEST17.

39 Primer T7 Promotor F

Shine-Dalgarno

TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA Met

6x His

TATACATATGTCGTACTACCATCACCATCACCATCACCTCGAATCAACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCC SRV-2 RT3284F

Gen RT SRV-2

GCGGCCGCCTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGCCCTTCACCCCTGTTTGGGTTGATCAATGGCCCCTAACTCAAG AAAAACTTGCTGCTGCCCAACAGTTAGTGCAAGAACAATTACAGGCAGGGCATATTATAGAAAGTAATTCTCC CTGGAATACACCTATATTTGTCATAAAAAAGAAGTCTGGTAAATGGAGGCTTTTGCAAGATTTAAGGGCGGTA AATGCCACCATGGTATTAATGGGAGCTCTCCAACCTGGGCTGCCCTCACCAGTGGCTATTCCTCAGGGATATT TTAAAATAGTCATTGATCTTAAAGATTGTTTTTTTACTATCCCCCTTCAGCCCGTTGATCAAAAGCGATTTGC TTTTAGTCTCCCGTCTACCAACTTTAAACAACCAATAAAACGTTATCAATGGAAAGTGTTGCCTCAAGGCATG GCCAATAGTCCTACCTTGTGTCAAAAATATGTAGCTGCTGCTATAGAGCCAATCAGAAAATCTTGGGCACAAA TGTACATTATACACTATATGGATGACATTCTAATAGCAGGAAAGATTGGCGAACAAGTTTTGCAGTGTTTTGC TCAACTTAAACAAGCATTGACAACTACTGGGTTACAAATAGCTCCAGAAAAGGTACAGCTACAAGATCCATAT ACCTACCTTGGGTTTCAACTTAATGGTCCCAAAATTACCAATCATAAGGCAGTTATTCGTAGAGATAAGTTAC AAACCCTTAATGATTTTCAAAAACTTTTGGGAGATATCAATTGGCTTAGACCCTATTTACACCTCACTACAGG AGATCTAAAACCTCTTTTTGATATCCTAAAAGGGGATTCTAATCCTAACTCACCCAGATTTTTATCTGAAGCA GCCCTTACGTCTCTTAAAAAGGTAGAAACAGCTATTGCTGAACAATTTGTTACACAAATAGATTATACACAGC CATTGACCTTTTTAATTTTTAATACTACACTGACACCTACTGGCCTCTTCTGGCAAAATAATCCTGTCATGTG GGTTCACTTGCCTGCATCGCCAAAAAAGGTATTGTTCCCCTATTATGATGCTATAGCAGATCTTATTATCCTT GGAAGGGACAACAGTAAAAAATATTTTGGACTTGAACCATCTACTATTATACAACCCTATTCTAAATCTCAAA TCCATTGGTTAATGCAAAACACAGAAACATGGCCAATTGCCTGCGCTTCCTATGCAGGCAACATTGATAATCA TTATCCACCCAATAAACTTATTCAATTTTGCAAACTCCATGCAGTTGTTTTTCCCCGAATCATTAGTAAAACT CCTCTAGACAATGCCTTACTGGTATTCACTGATGGATCCTCTACCGGCATAGCCGCATACACTTTTGAAAAGA CCACTGTCAAATTTAAAACCTCCCATACGTCAGCCCAATTAGTAGAATTACAAGCCCTAATTGCAGTGTTATC GGCCTTTCCTCATCGGGCCCTCAATATTTATACAGATAGTGCATACTTAGCTCATTCTATACCTCTACTTGAG ACAGTATCGCAAATCAAACATATCTCAGACACAGCAAAATTATTTTTACAGTGCCAACAACTAATATGCAACA GGTCTATACCCTTTTATTTAGGACATATCAGGGCCCATTCAGGATTACCAGGACCTTTATCTCAAGGTAATCA CTAG SRV-2 RT4925R

Gambar 4.5

Runutan nukleotida RT SRV-2 isolat Indonesia pada posisi nukleotida 3284-4925 yang disisipkan ke dalam vektor pDEST17. Situs-situs spesifik dari vektor ditandai dengan huruf tebal dan posisi primer dicirikan dengan huruf warna merah.

Analisis Ekspresi Enzim RT SRV-2 Ekspresi protein target gen RT SRV-2 dilakukan di dalam sel E. coli strain BL21AI. Strain ini didesain untuk mengekspresikan protein asing melalui perantaraan vektor ekspresi berbasis T7. E. coli strain BL21-AI berasal dari strain BL21 yang mengandung insersi kromosom dari gen penyandi T7 RNA polimerase (T7 RNAP) ke dalam lokus araB dari operon araBAD. Dengan demikian, ekspresi T7 RNA polimerase dapat diregulasi oleh gula L-arabinosa dan glukosa. Penambahan L-arabinosa akan mengaktivasi proses transkripsi dari RNA polimerase T7 yang terdapat pada bakteri E. coli BL21AI. Induksi oleh L-arabinosa menyebabkan situs O2 pada araC dimer terlepas. Hal ini menyebabkan situs C dapat menempel pada situs I2, sehingga proses penghambatan transkipsi di-non-aktifkan (Ellis et al. 1980). Dengan bantuan cAMP Activator Protein, proses transkripsi dapat berjalan. RNA polimerase T7 yang dihasilkan akan mengaktivasi T7 late promoter yang terdapat di dalam vektor destinasi, sehingga terbentuk protein rekombinan dengan level yang relatif tinggi (Eckert dan Mechlinshky 1999). Hasil analisis SDS-PAGE terhadap protein rekombinan RT SRV-2 ditunjukkan oleh adanya pita protein spesifik yang diperkirakan mempunyai berat molekul berukuran sekitar 64.9 kDa (Gambar 4.6). Ukuran berat molekul ini dikonfirmasi dengan hasil perhitungan terhadap 547 asam amino RT SRV-2 dan enam asam amino histidin menggunakan perangkat lunak dalam website www.expasy.org/compute_pi

40 /Mw. Protein rekombinan RT SRV-2 telah berhasil dimurnikan menggunakan kromatografi afinitas Ni2+-NTA spin column. Protein rekombinan yang telah dimurnikan keluar dari kolom ketika dielusi dengan imidazol yang mengikat ion nikel lebih kuat dibanding terhadap polipeptida 6x His. Pada penelitian ini, metode purifikasi dilakukan menggunakan kondisi native dimana enzim RT SRV-2 terikat 6x His berada dalam kondisi terlarut. Namun demikian, pada kondisi ini, protein pengotor biasanya lebih banyak yang berinteraksi dengan resin Ni2+-NTA dibanding dengan kondisi denaturasi. Hal ini dibuktikan dengan banyaknya protein non spesifik pada fase binding buffer (Gambar 4.6A) dan secara kuantitatif hasil pengukuran dengan uji BCA menunjukkan hasil 2280 µg mL-1. Adanya pengikatan non-spesifik ini dapat dikurangi dengan penambahan imidazol konsentrasi rendah pada bufer pencuci. Protein rekombinan RT SRV-2 yang dihasilkan dari bufer elusi dalam kondisi pH asam dengan kondisi imidazol konsentrasi tinggi (250 mM) menghasilkan protein 306 µg mL-1 (Tabel 4.1). Untuk menganalisis hasil ekspresi protein lebih lanjut dilakukan uji Western blot menggunakan antibodi anti-6x His terhadap enzim rekombinan 6x His tagged RT SRV2 ditunjukkan oleh adanya pita protein spesifik berukuran 64.9 kDa (Gambar 4.6B). Hal ini membuktikan bahwa gen RT SRV-2 telah berhasil diekspresikan dalam sistem ekspresi E. coli.

A

B

kD 216 132

kD 210

78 64.9 45.7

125 101 64.9 56.2

6x His RT SRV-2

32,5 35.8 29 21

18,4 7,6

6.9

M

Gambar 4.6

1

2

3

4

M

1

2

3

4

Panel A: Hasil elektroforesis SDS PAGE terhadap sampel protein rekombinan RT SRV-2. M) Broad low prestained marker (BioRad) 1) pra-purifikasi, 2) bufer pengikat, 3) bufer pencuci, 4) bufer elusi. Panel B: Analisis hasil ekspresi RT SRV-2 dengan teknik Western blot terhadap antibodi spesifik anti-6xHis. M) Kaleidoskop prestained marker (BioRad), 1) pra-pemurnian, 2) bufer elusi, 3) bufer pencuci, 4) bufer pengikat.

Berdasarkan analisis SDS-PAGE dan Western blot terhadap hasil ekspresi protein rekombinan RT SRV-2 menunjukkan adanya pita protein dengan berat molekul sekitar 64.9 kDa. Tag polipeptida 6x His yang berukuran cukup kecil tidak akan menggangu ekspresi protein dan struktur molekul dari target protein yang diinginkan. Adanya tag ini memungkinkan untuk dilakukannya pemurnian baik dalam kondisi denaturasi

41 ataupun dalam kondisi native yang memungkinkan juga untuk dilakukan refolding pada protein yang tidak larut. Tag 6x His pada posisi N-terminal tidak hanya berperan dalam pemurnian protein rekombinan namun juga berperan dalam menstabilkan struktur mRNA dalam daerah inisiasi translasi (Svensson et al. 2006). Perbandingan ekspresi protein baik dilakukan pada sistem prokariotik maupun eukariotik dengan posisi tag 6x His pada posisi N terhadap C-terminal dan dianalisis tingkat ekspresinya menunjukkan bahwa tag N-terminal mampu meningkatkan ekspresi protein (Busso et al. 2003; Svensson et al. 2006). Pada penelitian ini, enzim RT SRV-2 hanya diisolasi dari bagian yang terlarut karena isolasi dari protein yang tidak larut tidak berhasil diperoleh rendemen protein target. Penggunaan vektor ekspresi pDEST17 dengan N-terminal ini terjadi penambahan asam amino yang berasal dari 6x His tag yang diikuti dengan 21 asam amino dari sistem transkripsi Gateway dan situs topoisomerase. Tambahan tag asam amino tersebut diharapkan tidak akan mengganggu karakteristik enzim RT SRV-2 yang dihasilkan. Hal ini dibuktikan dengan uji Western blot yang menghasilkan pita protein spesifik berukuran 64.9 kDa yang mengindikasikan adanya reaksi spesifik dengan antibodi anti-6x His.

Analisis Aktivitas Enzim Rekombinan RT SRV-2 Enzim rekombinan RT SRV-2 mempunyai aktivitas enzim 1420 Unit dalam 200 µL bufer elusi, sehingga konsentrasi enzim yang dihasilkan adalah 7.1 U µL-1 dan aktivitas enzim spesifiknya adalah 22.76 U mg-1 total protein (Tabel 4.1). Tabel 4.1

Pengukuran secara kuantitatif konsentrasi protein dan aktivitas enzim. Konsentrasi protein ditentukan dengan Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific) dan aktivitas enzim diukur dengan reverse transcriptase assay colorimetric Kit (Roche)

Fraksi Tahap Purifikasi

Konsentrasi Protein (µg mL-1)

Total Protein (mg)

Konsentrasi Enzim (Unit µL-1)

Total Aktivitas Enzim (Unit)

Prapurifikasi Bufer Pengikat Bufer Pencuci Bufer Elusi

2760

1656

0.10

60

Aktivitas Spesifik Enzim (Unit mg-1 protein) 0.04

2280

1368

0.15

90

0.07

578

346.8

0.24

144

0.42

312

62.4

7.1

1420

22.76

Aktivitas spesifik dari DNA polimerase diukur dalam satuan Unit (U) yang merupakan sejumlah enzim yang diperlukan untuk terjadinya penggabungan 1 nmol dNTP terlabel selama 10 menit pada suhu 37oC terhadap poly (A) x oligo(dT)15 sebagai hibrid cetakan/primer. Protein rekombinan RT SRV-2 yang aktif secara enzimatik ditentukan aktivitasnya dari bagian terlarut bakteri yang telah dimurnikan dan hasil pengukurannya terdapat pada Tabel 4.1. Berdasarkan studi prediksi model struktur tiga dimensinya (Saepuloh et al. 2013, menuskript terkirim untuk publikasi), RT SRV-2 sebagaimana halnya enzim RT yang lain memiliki enzim yang multifungsi yaitu sebagai

42

RNA-dependent DNA polymerase (RDDP), DNA-dependent DNA polymerase (DDDP) dan RNase H. Pada penelitian ini dilakukan analisis secara kuantitatif terhadap aktivitas katalitik RDDP berdasarkan perpanjangan primer oligo(dT)15 pada cetakan poly(rA)n. Sebagaimana halnya terjadi pada kebanyakan RT retrovirus, penggunaan poly (rA)n (oligo(dT)12-18 sangat efesien untuk menganalisis sintetis cetakan-primer untuk mempelajari aktivitas RDDP (Taube et al. 1998). Kation divalen diperlukan untuk aktivitas katalitik pada hampir semua DNA polimerase termasuk RT SRV-2 yang menggunakan Mg2+ sebagai kofaktor enzim. Hal ini mengacu juga pada RT asal MMTV (mouse mammary tumour virus) anggota dari betaretrovirus dimana penggunaan Mg2+ menyebabkan aktivitas katalitiknya 20 kali lebih besar dibanding penggunaan Mn2+ sebagai kofaktornya (Taube et al. 1998). Aktivitas RT SRV-2 juga dianalisis secara kualitatif dengan mengaplikasikannya pada teknik two step RT-PCR. Kemampuan enzim ini dalam mentranskripsi balik cetakan mRNA menjadi cDNA yang dilanjutkan dengan amplifikasi PCR menggunakan primer spesifik yang didesain mengamplifikasi daerah penyandi gen (coding region) mengindikasikan bahwa enzim RT SRV-2 mempunyai aktivitas RDDP dan DDDP. 1500 bp

500 bp 206 bp

350 bp β-Aktin

β-Globin M

1

2

3

4 5

RT SSTIII

Gambar 4.7

1

2

3 4 5

RT SRV-2

1 2

3

4 5 1

RT SSTIII

2

3

4 5

RT SRV-2

Hasil uji two step RT PCR menggunakan enzim RT SRV-2 dibandingkan dengan enzim RT komersial Superscript III RT (SSTIII, Invitrogen®). M) 100 bp DNA ladder (Invitrogen), 1-4) ulangan sampel, 5) kontrol reagensia

Enzim rekombinan RT SRV-2 yang dimurnikan mempunyai konsentrasi 7.1 U µL-1. Konsentrasi ini lebih rendah dibanding dengan enzim komersial yaitu RT MMLV Superscript III (Invitrogen) yang mempunyai aktivitas 200 U µL-1 dan RT asal avian myoblastosis virus (AMV) (Promega, Wisconsin, USA) dengan aktivitas 20-25 U µL-1. Rendahnya aktivitas enzim ini kemungkinan disebabkan oleh proses pemurnian yang menggunakan kromatografi satu tahap Ni2+-NTA yang tidak mampu menghilangkan kontaminan sepenuhnya misalnya residu bakteri yang biasanya menurunkan aktivitas enzim. Selain itu, perbedaan aktivitas ini juga mungkin disebabkan oleh perbedaan subfamili virus dimana MMLV adalah gamaretrovirus, AMV adalah alfaretrovirus, dan SRV-2 adalah betaretrovirus. Enzim RT asal grup retrovirus yang berbeda mempunyai fungsi aktivitas katalitik yang sama tetapi mempunyai perbedaan dalam hal struktur dan komposisi subunit, berat molekul, sifat-sifat katalitik, karakteristik biokimia dan biofisika, dan sensitivitas terhadap inhibitor (Herschhorn dan Hizi 2010). Aplikasi enzim rekombinan RT SRV-2 (3 µL yang sama dengan 21 U) digunakan untuk menyintesis cDNA dibandingkan terhadap 1 µL sebanding dengan 200 U dari enzim RT komersial asal MMLV-RT (Invitrogen). Hasil amplifikasi terhadap cDNA yang diperoleh terhadap gen target β-globin dan β-aktin menghasikan pita DNA

43 spesifik berukuran 206 bp dan 350 bp (Gambar 4.7). Hal ini menunjukkan bahwa enzim RT SRV-2 berhasil mentranskripsi balik mRNA menjadi cDNA.

Simpulan Gen RT SRV-2 telah berhasil diisolasi, diklonakan, diekspresikan, dimurnikan dan diuji aktivitas enzimnya. Enzim rekombinan RT SRV-2 ini menunjukkan aktivitas enzim yang serupa dengan enzim sejenis yang sudah komersial, meskipun aktivitasnya masih rendah. Enzim rekombinan RT SRV-2 harus diperbanyak dan dipekatkan untuk menghasilkan aktivitas enzim yang lebih tinggi. Selain itu, karakteristik biokimia dan pengukuran kinetika enzim diperlukan untuk menjaga konsistensi dan kualitas enzim ini untuk studi lebih lanjut.

5 PEMBAHASAN UMUM

Simian Betaretovirus Serotipe-2 Isolat Indonesia Simian betaretrovirus merupakan betaretrovirus yang secara etiologi berhubungan dengan terjadinya sindroma penurunan kekebalan tubuh pada satwa primata (simian acquired immunedeficiency syndrome, SAIDS) dengan berbagai tingkat keparahan pada monyet Asia genus Macaca. Infeksi akibat SRV ditemukan pada Macaca hasil penangkapan dari alam liar dan menjadi endemik pada populasi penangkaran di beberapa pusat penelitian primata Amerika Serikat. Sampai saat ini, telah berhasil ditemukan dan diidentifikasikan lima anggota serotipe SRV asal Macaca, yaitu SRV 1-5 (Chopra dan Mason 1970; Maul et al. 1986; Li et al. 2000; Zao et al. 2010), serotipe SRV-6 asal Hanuman langur (Semnopithecus entellus) dan serotipe SRV-7 asal monyet resus (M.mulatta) dan S.entellus (Hara et al. 2005; Nandi et al. 2003; Nandi et al. 2006). Serotipe SRV-2 telah berhasil diidentifikasikan pada awal tahun 1980 pada kasus infeksi endemik yang terjadi pada beruk, monyet ekor panjang (Macaca fascicularis), dan monyet Jepang (M.fuscata) di pusat penelitian primata Washington, dan pada monyet rhesus (M.mulatta) serta monyet hitam Sulawesi (M.nigra) di pusat penelitian primata nasional Oregon (Todaro et al. 1978; Marracci et al. 1995; Marracci et al. 1999; Thayer et al. 1987). Perbedaan patogenitas dilaporkan terjadi pada serotipe SRV yang berbeda isolatnya. Perbedaan ini kemungkinan tergantung dari subtipe dari virus dan jenis Macaca yang diinfeksinya (Rosenblum et al. 1999). Sebagai contoh adalah isolat SRV-2 yang menyebabkan penurunan kekebalan tubuh yang parah pada M. nigra tetapi tidak menimbulkan gejala ketika ditransmisikan pada M. mulatta. Isolat SRV-2 lainnya ada yang menyebabkan penurunan kekebalan tubuh ringan pada monyet rhesus dan menimbulkan gejala yang fatal terhadap monyet Jepang (Philipp-Staheli et al. 2006). SRV memberikan masalah yang signifikan dalam pengelolaan penangkaran Macaca. Virus ini dapat menyebabkan mortalitas dan morbiditas yang tinggi khususnya dalam kondisi pengandangan kelompok (Voevodin dan Marx 2009; Lerche, 1992). Di samping itu, infeksi SRV pada Macaca dapat menjadi faktor pengganggu

44 (confounding) dalam penelitian biomedis yang menggunakan satwa-satwa ini sebagai subyek penelitian (Lerche dan Osborn 2003). Selain untuk pengelola penangkaran, juga penting bagi pengelola kebun binatang dan pusat rehabilitasi satwa primata untuk lebih banyak memberikan perhatian kepada retrovirus ini. Penularan penyakit dapat terjadi antara Macaca dengan satwa primata lainnya, karena mereka berbagi habitat yang sama atau berada dalam fasilitas pengandangan yang berdekatan (Lerche et al. 2001). Kemungkinan infeksi SRV alamiah pada satwa primata tidak dapat diabaikan dan sangat sedikit informasi komparatif yang tersedia saat ini (Morton et al. 2008). Secara serologis, M. fascicularis dan M. nemestrina di Indonesia memiliki antibodi terhadap SRV-2, yang dapat diasumsikan bahwa hewan tersebut pernah terpapar dengan SRV-2 atau agen sejenisnya (Iskandriati et al. 2010; Iskandriati et al. 1998; Pamungkas et al. 1991; Marx et al. 1985). Tingginya angka prevalensi antibodi SRV pada M. fascicularis dan M. nemestrina asal Indonesia dirasakan cukup menghambat proses pemilihan bibit induk pada penangkaran satwa primata bebas SRV. Mengingat potensi infeksi aktif atau laten dan abnormalitas kekebalan yang terkait pada infeksi ini, maka SRV-2 merupakan salah satu target agen patogen yang harus dieliminasi dalam program penangkaran satwa primata genus Macaca bebas patogen tertentu (Morton et al. 2008). SRV-2 isolat Indonesia telah berhasil diisolasi dari monyet ekor panjang dan runutan nukleotida bagian envelopnya telah berhasil ditentukan yang menunjukkan homologi dengan SRV-2 isolat Washington dengan tingkat kesamaan sekitar 96% (Iskandriati et al. 2010). Diperolehnya isolat SRV-2 asal Indonesia dapat digunakan sebagai virus model dalam memahami infeksi retrovirus karena dapat menimbulkan gejala berupa penurunan kekebalan tubuh pada Macaca yang mirip dengan AIDS pada manusia. Melalui pemahaman akan struktur virus, infeksi dan patogenitas SRV pada Macaca, diharapkan akan diperoleh informasi yang dapat digunakan dalam strategi pengembangan vaksin atau obat anti retroviral untuk tujuan preventif maupun terapeutik terutama sebagai model untuk mempelajari HIV/AIDS. Selain itu, pemahaman dan eksplorasi molekuler terhadap SRV-2 isolat Indonesia akan sangat bermanfaat dalam pengembangan protein-protein rekombinan asal SRV-2. Protein rekombinan tersebut dapat dimanfaatkan sebagai sumber antigen dalam pengembangan kit diagnostik atau sebagai sumber enzim spesifik. Salah satu enzim yang cukup potensial untuk dikembangkan adalah reverse transcriptase yang dikodekan oleh gen pol SRV-2.

Enzim Reverse Transcriptase SRV-2 Isolat Indonesia Penelitian enzim RT asal retrovirus terus berkembang terutama terhadap virus HIV-1 sebagai penyebab terjadinya AIDS pada manusia sehingga sampai saat ini, enzim RT HIV-1 merupakan enzim yang paling banyak diteliti dalam bidang biomedis. Penelitian terutama ditujukan untuk memahami lebih dalam mengenai mekanisme dan multi fungsi selama proses RT sehingga informasi secara detail mengenai struktur molekul RT tersebut sangat diperlukan untuk tujuan pencarian senyawa anti retroviral RT HIV-1. Serupa dengan struktur DNA polimerase secara umum, domain DNA polimerase molekul RT membentuk struktur yang berupa konformasi tangan kanan yang dihubungkan dengan domain RNase H pada terminal C dengan masing-masing domain katalitiknya yang terpisah. Domain polimerase RT dibagi ke dalam subdomain berupa finger, palm, thumb, dan connection (domain connection menghubungkan

45 dengan RNase H), yang masing-masing memiliki fungsi unik dalam penggabungan nukleotida selama sintesis DNA. Kebanyakan, pengetahuan mengenai sifat-sifat struktur dari RT didasarkan pada penentuan dengan teknik kristalografi sinar-X dari RT HIV-1 baik berupa wild type maupun mutan akibat resistensi obat. Banyak juga dari penentuan struktur ini berupa struktur kristal RT HIV-1 yang membentuk kompleks dengan substrat DNA-RNA atau dengan inibitor RT. Selain itu, informasi tambahan juga diperoleh dari struktur kristal HIV-2 RT dan MMLV RT sehingga memungkinkan perbandingan struktur dari RT yang berbeda dan dipelajari elemen struktur secara umum dari semua RT (Flint et al. 2009; Coffin et al. 1997; Coté & Roth 2008; Herschhorn & Hizi 2010). Pemahaman terhadap karakteristik biokimia dan sifat-sifat enzim RT asal retrovirus juga terus dilakukan dengan mengembangkan enzim rekombinannya. Tidak hanya terhadap virus HIV namun juga dari berbagai jenis virus lainnya dari famili Retroviridae telah berhasil diteliti. Tujuan dari penelitian tersebut selain untuk pencarian model virus dalam pengembangan anti RT HIV-1, juga untuk pemenuhan enzim rekombinan RT yang mempunyai aktivitas enzim tinggi. Berbagai jenis enzim RT yang telah dipelajari antara lain berasal dari Molony murine leukemia virus (MMLV), Mouse mammary tumour virus (MMTV), Avian sarcoma and leukosis virus (ASLV), Mason-Pfizer monkey virus (MPMV), Baboon endogenous virus (BaEV), Feline immunodeficiency virus (FIV), Human T lymphotropic virus (HTLV), dan Simian immunodefieciency virus (SIV) (Flint et al. 2009; Coffin et al. 1997; Herschhorn & Hizi 2010). Sampai saat ini, penelitian yang dilakukan terhadap enzim RT SRV-2 terkait penentuan struktur tiga dimensi molekul maupun enzim rekombinannya belum dilakukan sehingga informasinya masih sangat terbatas. Hal inilah yang menjadi kebaruan (novelty) dalam penelitian ini yaitu pemodelan struktur tiga dimensi (3D) enzim RT SRV-2 isolat Indonesia dan pengembangan enzim rekombinannya. Untuk mencapai tujuan tersebut dilakukan melalui serangkaian penelitian yaitu tahapan penentuan prediksi struktur 3D secara in silico yang dilanjutkan dengan upaya pengklonaan, ekspresi dalam sistem E. coli, perbanyakan (scale up), pemurnian, uji aktivitas dan aplikasi pada teknik RT-PCR. Informasi pemodelan struktur 3D yang akurat dan terpercaya dapat dijadikan acuan untuk mengkonstruksi protein rekombinan didukung dengan informasi dari protein sejenis yang ada di basis data protein.

Pemodelan Struktur Molekul RT SRV-2 Isolat Indonesia Penentuan struktur tiga dimensi suatu protein sangat penting untuk memahami fungsi protein di tingkat molekuler. Pemahaman tersebut dapat digunakan untuk pembuatan rancangan eksperimen yang efektif, seperti site-directed mutagenesis, studi relasi penyakit yang berhubungan dengan mutasi, pengembangan desain senyawa obat yang rasional terutama senyawa antivirus, dan pengembangan protein rekombinan maupun vaksin. Pada beberapa tahun terakhir ini, telah terjadi kemajuan luar biasa dalam teknik eksperimental untuk penentuan struktur protein menggunakan teknik kristalografi sinar-X dan teknik spektroskopi NMR (nuclear magnetic resonance). Upaya penentuan struktur protein ini telah memberikan kontribusi yang signifikan untuk menjelaskan struktur protein yang baru dan pengembangan teknologi yang bisa meningkatkan kecepatan dan tingkat keberhasilan dalam menentukan struktur molekul

46 dengan biaya eksperimen yang tidak terlalu mahal. Meskipun banyak kemajuan yang telah didapat, namun kedua teknik tersebut memakan waktu yang lama, peralatan yang spesifik dan proses pengkristalan tidak selalu berhasil. Sementara itu, jumlah data sekuens protein yang berhasil ditentukan jauh lebih tinggi dibandingkan jumlah struktur protein yang berhasil dikarakterisasi. Data terbaru yang dirilis oleh beberapa database protein (non-redundant GenBank CDS translations, PDB, SwissProt, PIR (protein information resources) dan PRF (protein research foundation)) menunjukkan ada lebih dari 23 juta sekuens protein yang berhasil diteliti, sedangkan data struktur protein di PDB (protein data bank) hanya sekitar 83,000 yang berarti sekitar 0.36% dibanding jumlah sekuens protein. Untuk itu, diperlukan adanya suatu pendekatan komputasi yang stabil dan bisa diandalkan untuk pemodelan struktur molekul protein yang diperlukan untuk memperoleh informasi struktural dari berbagai protein yang bisa ditentukan dengan metode in silico dalam memprediksi struktur suatu protein (Mihasan 2010). Metode komputasi yang digunakan untuk memprediksi struktur 3D suatu protein dibagi menjadi tiga kategori berdasarkan ketersediaan struktur cetakan (template) yang ada di perpustakaan PDB (Roy et al. 2010). Pemodelan komparatif (CM) didasarkan atas identifikasi cetakan terkait adanya homologi secara evolusi melalui perbandingan sekuens atau profil sekuen. Model resolusi tinggi dapat dihasilkan hanya dengan menyalin kerangka struktur cetakan yang memenuhi batas ruang dan dikumpulkan dari struktur cetakan yang ada di basis data. Metode threading dirancang untuk protein dari asal evolusi yang berbeda yang kemungkinan memiliki struktur yang sama. Hal ini dilakukan dengan menyelaraskan sekuens query langsung ke struktur 3D protein lainnya yang dapat mengenali lipatan (folding) yang mirip dengan query meskipun tidak ada hubungan evolusi dengan protein cetakan. Metode ab initio dirancang untuk protein query yang tidak memiliki keterkaitan dengan protein struktural yang ada di perpustakaan PDB sehingga model struktur harus dibangun dari awal. Metode ini merupakan metode yang paling sulit dan keberhasilannya terbatas pada protein kecil dengan sekuen kurang dari120 asam amino. I-TASSER (iterative threading assembly refinement) merupakan program komputasi yang menggabungkan metode-metode tersebut sehingga memberikan akurasi yang lebih baik dalam memprediksi struktur 3D protein. Hasil penilaian CASP7 (critical assessment of protein structure prediction) ke7, 8 dan 10, I-TASSER merupakan metode kumputasi otomatis terbaik dalam memprediksi struktur 3D protein (Roy et al. 2010; Mihasan 2010). Melalui metode ini, telah berhasil dibuat model struktur 3D enzim RT SRV-2 isolat Indonesia baik pada domain polimerase (Bab 2) maupun domain RNase H-nya (Bab 3). Selain itu, situs aktif enzim, interaksi enzim dengan substrat dan kofaktor enzim, serta asam-asam amino yang berperan dalam situs aktif enzim berhasil juga dipelajari. Dengan diketahuinya gugus fungsional dan model struktur 3D dari enzim RT SRV-2, dapat dilakukan pembelajaran secara in silico untuk mengkonstruksi gen dalam upaya pengembangan enzim rekombinan RT SRV-2 tersebut. Selain itu, dapat juga dilakukan site directed mutagenesis secara in silico untuk menghasilkan enzim dengan aktifitas yang lebih baik dan untuk mencari molekul yang dapat menghambat kerja dari enzim tersebut sebagai bakal obat antiviral.

47

Ekspresi Enzim RT SRV-2 dalam Sistem Ekspresi Escherichia coli Di antara mikroorganisme yang dapat digunakan untuk memproduksi protein heterologus, E. coli menjadi salah satu pilihan yang paling menarik. Berbagai keunggulan yang dimiliki E. coli antara lain adalah kemampuannya untuk tumbuh dengan cepat, densitas sel yang tinggi, substrat pertumbuhan yang murah, karakteristik genetik yang jelas, serta ketersediaan berbagai pasangan vektor kloning dan strain mutan. Meskipun tidak selalu ada jaminan bahwa protein heterologus akan dihasilkan oleh E. coli dalam jumlah yang tinggi dan aktif secara biologis, berbagai cara telah dilakukan untuk meningkatkan performa dari mikroorganisme ini. Pada penelitian ini, ekspresi gen RT SRV-2 dilakukan menggunakan sistem ekspresi E. coli dengan metode in vitro site specific recombination. Sistem ini akan memperantarai proses pengklonaan gen target secara langsung dari produk PCR ke dalam suatu vektor entry dan selanjutnya disubklonakan ke dalam vektor destinasi secara efisien. Gen target dalam vektor destinasi akan tetap dipertahankan dengan orientasi dan bingkai baca yang tepat. Reaksi site specific recombination diperantarai oleh rekombinase dari famili integrase fage λ yang bersifat konservatif (tidak ada penambahan atau pengurangan nukleotida) dan sangat spesifik yang akan terikat pada situs spesifik att (attachment) dan secara kovalen akan merekombinasi DNA target sesuai dengan aslinya (Landy 1989; Hunt 2005). Sistem ini disebut dengan Gateway technology dimana reaksi rekombinasi yang dikenal dengan reaksi LR akan memfasilitasi rekombinasi spesifik pada sinyal sekuen attL dan attR yang akan menghasilkan attB yang mengandung klona ekspresi. Reaksi ini dikatalisis oleh enzim LR clonase. Pendekatan dua tahap pengklonaan ini memungkinkan terjadi insersi gen target ke dalam vektor entry yang akan dilanjutkan transfer secara pararel ke dalam vektor ekspresi melalui situs rekombinasi att yang tepat. Situs rekombinasi att ini sudah mengalami modifikasi dari att lambda tipe asalnya untuk meningkatkan proses pengklonaan sehingga memungkinkan terjadinya transfer DNA target secara spesifik antara dua plasmid. Dengan demikian, entry clone akan menempel diantara situs attL1 dan attL2 yang akan berekombinasi hanya dengan situs attR1 dan attR2. Hal ini memungkinkan terjadi transfer yang cepat dari suatu gen target dalam suatu plasmid dan akan mempertahankan orientasi bingkai baca dari gen target tersebut (Hartley et al. 2000; Hunt 2005). Reaksi rekombinasi in vitro ini mengandung dua jenis DNA awal (starting DNA) yaitu: suatu entry clone (attL1-gene-attL2) yang membawa segmen DNA untuk ditrasfer, dan sebuah vektor destinasi (destination vector, attR1-ccdB-attR2) yaitu vektor dimana DNA akan disubklonkan (Gambar 5.1). Inkubasi DNA ini dengan protein rekombinasi (Int + Xis + IHF) menghasilkan suatu Int-mediated recombination yang merupakan molekul ko-integrasi yang akan mentransfer segmen klona DNA terhadap vektor destinasi. Untuk memperoleh klon ekspresi gen target setelah diintroduksikan ke dalam E. coli melalui proses transformasi, selanjutnya digunakan dua skema seleksi. Pertama adalah entry clone yang mengandung gen resisten kanamisin (KmR) dan vektor destinasi yang mengandung gen resisten ampisilin (ApR). Seleksi kedua pada vektor destinasi mengandung marker seleksi yaitu F-plasmid yang mengkode gen ccdB yang bisa menghambat pertumbuhan E. coli (Bahassi et al. 1995). Transforman yang diseleksi untuk resistensi ampisilin (ApR) akan mengandung hanya klon ekspresi (dalam vektor destinasi dimana gen ccdB digantikan oleh segmen DNA target yang menempel melalui sisi kecil attB) (Hartley et al. 2000; Hunt 2005).

48

A

B

Gambar 5.1. A). Skema kloning gen dan transfer melalui kloning rekombinasi. Segitiga menunjukkan sisi rekombinasi. Gene yang berupa produk PCR diklonkan ke dalam vektor entry yang mengandung situs attL, KmR dan disubklonakan dengan reaksi LR clonase ke dalam vektor destinasi yang mengandung situs attR, ApR dan ccdB. B). Sekuens dari sisi attB1 dan attB2 yang menempel pada gen dalam klona ekspresi (Hartley et al. 2000). Kelebihan utama sistem Gateway ini adalah tingginya efisiensi rekombinasi (efficiency), pemusatan reaksi (directionality) serta otomatisasi reaksi mengingat reaksi rekombinasi bisa dilakukan dalam satu tabung reaksi (one tube reaction) (Hunt 2005). Adanya sekuens att dalam sistem ini yang mengkodekan asam amino TSLYKKAG (Gambar 5.1B) ditambah dengan adanya asam amino fusion tags yang biasanya disisipkan setelah situs att untuk tujuan purifikasi dikhawatirkan akan mengurangi fungsi dan sistem pelipatan protein. Namun demikian, hal ini bisa diatasi dengan melakukan pemotongan asam amino sisipan tersebut dari protein rekombinan yang diinginkan menggunakan enzim protease setelah proses pemurnian. Penggunaan strategi ekspresi yang bersifat paralel pada sistem Gateway ini mengharuskan adanya penerapan sistem pemurnian yang cepat, sederhana, dan murah. Beberapa fusion tag asam amino tertentu telah dikembangkan untuk memfasilitasi langkah permurnian tersebut yang sengaja disisipkan sebelum atau sesuai protein target. Salah satu fusion tag yang biasa digunakan adalah tag polihistidin karena ukurannya yang sangat kecil sehingga diharapka tidak akan mengganggu proses pelipatan protein target (Svensson et al. 2006). Tag ini juga memiliki ikatan yang sangat kuat dengan resin yang mengandung ion logam (misalnya ion nikel) yang bersifat reversibel yang memungkinkan untuk dilakukannya proses pemurnian satu tahap yang cepat. Tag ini biasanya terdiri atas enam residu histidin yang dapat ditempatkan baik pada terminal-N atau terminal-C dari protein rekombinan. Melalui pemahaman terhadap keunggulan metode ekspresi protein tersebut yang didukung dengan informasi bioinformatika, kami hasilkan enzim RT SRV-2 isolat Indonesia yang merupakan langkah awal dalam pemahaman dan eksplorasi molekuler terhadap pengembangan protein atau enzim asal SRV-2 isolat Indonesia. Protein tersebut dapat dimanfaatkan sebagai sumber antigen dalam pengembangan kit

49 diagnostik atau sebagai sumber enzim spesifik. Dihasilkannya enzim rekombinan RT SRV-2 isolat Indonesia diharapkan akan dapat diaplikasikan dalam penelitian-penelitian bidang biologi molekuler pada teknik RT-PCR sebagai alternatif terhadap enzim sejenis yang diproduksi dari luar negeri. Enzim rekombinan tersebut juga dapat diaplikasikan sebagai model enzim RT asal retrovirus dalam proses pencarian kandidat senyawa obat anti retrovirus dengan target enzim RT baik dari senyawa sintetik maupun senyawa bahan alam. Rangkaian penelitian ini merupakan suatu langkah kecil dalam mengeksplorasi nilai positif (benefit value) dari virus SRV-2 yang selama ini merupakan agen patogen yang merugikan dalam penangkaran satwa primata dan bidang biomedis.

6 SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan Gen penyandi enzim reverse transcriptase (RT) asal SRV-2 isolat Indonesia telah berhasil diisolasi dari monyet ekor panjang (M. fascicularis). Runutan nukleotida gen RT SRV-2 berada pada daerah pol posisi 3284-4925 yang menyandikan 547 asam amino, meliputi domain polimerase dan RNase H. Program komputasi I-TASSER berhasil memprediksi struktur tiga dimensi RT SRV-2 yang terdiri atas domain palm/finger, thumb, connection dan RNase H. Situs aktif polimerase mengandung tiga residu aspartat pada sisi katalitik yaitu Asp90, Asp165, Asp166 dan mempunyai motif sangat lestari YMDD yaitu Tyr163, Met164, Asp165, dan Asp166. Model struktur ini memiliki homologi tertinggi dengan RT HIV-1 (2B6A.pdb). Domain RNase H juga berhasil ditentukan struktur molekulnya secara parsial yang mempunyai homologi dengan RNase H E. coli (1GOA) dan RNase H HIV-1 (3HYF). Situs katalitik RNase H SRV-2 mengandung tiga asam amino dengan residu karboksilat Asp436, Glu465 dan Asp486. Gen penyandi enzim RT SRV-2 isolat Indonesia asal monyet ekor panjang berhasil diisolasi dan diekspresikan pada sistem ekspresi E. coli. Hasil ekspresi berupa enzim rekombinan RT SRV-2 berhasil dipurifikasi, diuji aktivitasnya, dan diaplikasikan pada teknik RT PCR. Enzim rekombinan RT SRV-2 tersebut terbukti memiliki aktivitas yang serupa dengan enzim RT komersial walaupun masih memiliki aktivitas yang lebih rendah. Aplikasi enzim rekombinan RT SRV-2 pada teknik RT-PCR telah berhasil mentranskripsi balik mRNA menjadi cDNA terhadap house keeping gene β-globin dan β-aktin.

Saran Perlu dilakukan perbanyakan dan pemekatan enzim rekombinan RT SRV-2 untuk menghasilkan produk dengan aktivitas enzim yang lebih tinggi. Tahapan purifikasi juga perlu dioptimalkan untuk menghasilkan produk enzim yang lebih murni. Pengujian sifat fisiko kimia dan biokimia serta aplikasi pada teknik RT PCR dengan target gen yang lain juga perlu dilakukan untuk menjaga konsistensi aktivitas enzim

50 sehingga kualitas produk bisa ditingkatkan. Penentuan struktur tiga dimensi dengan metode eksperimental menggunakan kristalografi sinar-X diperlukan untuk mengkaji struktur molekul RT SRV-2 secara riil dan akurat mengingat informasi tersebut belum ada.

UCAPAN TERIMAKASIH Terimakasih kami sampaikan kepada Dr drh Joko Pamungkas, MSc selaku pimpinan Pusat Studi Satwa Primata Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat Institut Pertanian Bogor (PSSP LPPM IPB) dan Dr drh Diah Iskandriati selaku kepala UPT Laboratorium PSSP LPPM IPB atas kemudahan penggunaan fasilitas laboratorium penelitian. Terimakasih juga kami sampaikan kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Republik Indonesia atas dana penelitian melalui Penelitian Strategis Unggulan IPB 2012 (55/13.24.4/SPK-PUS/IPB/2012 untuk Prof drh Dondin Sajuthi, MST, PhD) dan kepada SEAMEO BIOTROP melalui dana hibah Thesis Support for Indonesian PhD Student (047.57/PSRP/PNLT/ III/2012 untuk Uus Saepuloh).

DAFTAR PUSTAKA Bahassi EM, Salmon MA, Van Melderen L, Bernard P, Couturier M. 1995. F Plasmid CcdB killer protein: ccdB gene mutants coding for noncytotoxic proteins which retain their regulatory functions. Mol Microbiol. 15:1031-1037. Boyer PL, Sarafianos SG, Arnold E, Hughes SH. 2000. Analysis of mutations at position 115 and 116 in the dNTPs binding site of HIV-1 reverse transcriptase. Proc Natl Acad Sci USA. 97(7):3056-3061. Busso D, Delagotte-Busso B, Moras D. 2005. Construction of a set gateway-based destination vectors for high-throughput cloning and expression screening in Escherichia coli. J Anal Biochem. 343(2):313-321.doi:10.1016/j.ab. 2005. 05.015. Champoux JJ, Schultz SJ. 2009. Ribonuclease H: properties, substrate specificity, and roles in retroviral reverse transcription. FEBS J. 276: 1506–1516. doi: 10.1111/j.1742-4658.2009.06909.x. Chopra HC, Mason MM. 1970. A new virus in a spontaneous mammary tumor of a rhesus monkey. Cancer Res 30(8): 2081-2086. Chen Y, Xu W, Sun Q. 2009. A novel and simple method for high-level production of reverse transcriptase from Moloney murine leukemia virus (MMLV-RT) in Escherichia coli. Biotechnol Lett. 31: 1051-57. doi: 10.1007/s10529-009-9977-5. Epub 2009 Mar 29. Coffin JM, Hughes SH, Varmus HE. 1997. Retroviruses. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press.

51 Coté ML, Roth MJ. 2008. Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase: Structural Comparison with HIV-1 Reverse Transcriptase. Virus Res. 134: 186–202. doi: 10.1016/j.virusres.2008.01.001. Epub 2008 Feb 21. Ding J, Das K, Hsiou Y, Sarafianos SG, Clark AD Jr, Jacobo-Molina A, Tantillo C, Hughes SH, Arnold E. 1998. Structure and functional implications of the polymerase active site region in a complex of HIV-1 RT with a double-stranded DNA template-primer and an antibody Fab fragment at 2.8 A resolution. J Mol Biol. 284(4):1095–111. Ellis L, Carolyn S, Bankaitis V, Montefiori D, Craig K. 1980. Metabolite gene regulation of the L-arabinose operon in Escherichia coli with indoleacetic acid and other indole derivative. J Biochem. 77:1768-1772. Eckert D, Mechlinskhy M. 1999. Vaccinia virus-bacteriphage T7 expression vector for complementation analysis of late gene processes. J General Vir. 80:1463-1469. Flint SJ, Enquist LW, Racaniello VR, Skalka AM. 2009. Principle of Virology : Molecular Biology, Pathogenesis, and Control. Washington DC : ASM Pr. Fujimoto K, Takano J, Narita T, Hanari K, Shimozawa N, Sankai T, Yosida T, Terao K, Kurata T, Yasutomi Y. 2010. Simian betaretrovirus infection in a colony of cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis). Comp Med. 60(1): 51–53. Gardner MB, Luciw P, Lerche N, Marx P. 1988. Nonhuman primate retrovirus isolates and AIDS. Adv Vet Sci and Comp Med. 32:171-190. Goff SP. 2001. Retroviridae: the retrovirus and their replication. In: Knipe DM and Howley PM (Eds). Fields Virology. Vol 2. 4th Ed. Philadelphia: Lippincott Williams dan Wilkins. p 1871-1923. Hara M, Sata T, Kikuchi T, Nakajima N, Uda A, Fujimoto K, Baba T, Mukai R. 2005. Isolation and characterization of a new simian retrovirus type D subtype from monkeys at the Tsukuba Primate Center, Japan. Microbes Infect. 7(1):126–131. Hartley JL, Temple GF, Brasch MA. 2000. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10(11):1788-1795. Herschhorn A, Hizi A. 2010. Retroviral reverse transcriptase. Cell Mol Life Sci. 67(16): 2717-47.doi: 10.1007/s00018-010-0346-2. Hizi A, Herschhorn A. 2008. Retroviral reverse transcriptases (other than those of HIV1 and murine leukemia virus): A comparison of their molecular and biochemical properties. VirusRes. 134(1-2):203–220.doi:10.1016/j. virusres. 2007.12.008. Huang H, Chopra R, Verdine GL, Harrison SC. 1998. Structure of a covalently trapped catalytic complex of HIV-1 reverse transcriptase: Implications for drug resistance. Science. 282(5394):1669–1675. Hunt I. 2005. From gene to protein: A review of new and enabling technologies for multi parallel protein expression. Protein Expr Purif. 40(1):1-22. doi:10.1016/j.pep.2004.10.018. Ilina T, LaBarge K, Sarafianos SG, Ishima R, Parniak MA. 2012. Inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase-associated Ribonuclease H activity. Biology. 1: 521-541. Iskandriati D, Pamungkas J, Surya M, Mariya S, Budiarsa IN, Sajuthi D. 1998. Prevalence of simian retrovirus type D serotype 2 (SRV-2) antibodies on Macaca fascicularis and Macaca nemestrina in Indonesia. J Primatol Indones. 2:5-8. Iskandriati D, Saepuloh U, Mariya S, Grant RF, Solihin DD, Sajuthi D, Pamungkas J. 2010. Isolation and characterization of simian retrovirus type D from Macaca fascicularis and M. nemestrina in Indonesia. Microbiol Indones. 4(3):132-136. doi: 10.5454/mi.4.3.6.

52 Katayanagi K, Okumura M, Morikawa K. 1993. Crystal structure of Escherichia coli RNase HI in complex with Mg2+ at 2.8Å resolution : proof for a single (Mg2+)binding site. Proteins. 17(4):337-346. Kirby KA, Marchand B, Ong YT, Ndongwe TP, Hachiya A, Michailidis E, Leslie MD, Sietsema DV, Fetterly TL, Dorst CA, Singh K, Wang Z, Parniak MA, Sarafianos SG. 2012. Structural and inhibition studies of the RNase H function of xenotropic murine leukemia virus-related virus reverse transcriptase. Antimicrob Agents Chemother. 56(4):2048–2061.doi: 10.1128/AAC.06000-11. Epub 2012 Jan 17. Klumpp K, Mirzadegan T. 2006. Recent progress in the design of small molecule inhibitors of HIV RNase H. Curr Pharm. 12(15):1909–1922. Kohlstaedt LA, Wang J, Friedman JM, Rice PA, Steitz TA. 1992. Crystal structure at 3.5 A resolution of HIV-1 reverse transcriptase complexed with an inhibitor. Science. 256(5065):1783–1790. Kotewitcz M, Sampson CM, D’Alessio M, Gerard GF. 1988. Isolation of cloned moloney murine leukemia virus reverse transcriptase lacking ribonuclease H activity. Nucleic Acid Res. 16(1):265-277. Landy, A. 1989. Dynamic, structural, and regulatory aspect of λ site-specific recombination. Annu Rev Biochem. 58:913-949. Lerche NW, Switzer WM, Yee JL, Shanmugam V, Rosenthal AN, Chapman LE, Folks TM, Heneine W. 2001. Evidence of infection with simian type D retrovirus in persons occupationally exposed to nonhuman primates. J Virol 75(4):1783–1789. Lerche NW, Osborn KG. 2003. Simian retrovirus infections: potential confounding variables in primate toxicology studies. Toxicol Pathol. 31(Suppl):103–111. Lerche NW. 2010. Simian retroviruses: Infection and disease-implications for immunotoxicology research in primates. J Immunotoxicol. 7(2): 93–101. doi: 10.3109/15476911003657406. Li B, Axthelm MK, Machida CA. 2000. Simian retrovirus serogroup 5: partial gag-prt sequence and viral RNA distribution in an infected rhesus macaque. Virus Genes. 21(3):241–248. Li MD, Bronson DL, Lemke TD, Faras AJ. 1995. Phylogenetic analysis of 55 retroelements on the basis of the nucleotide and product amino acid sequences of pol gene. Mol Biol Evol. 12(4):657-670. Lim D, Gregorio GG, Bingman C, Martinez-Hackert E, Hendrickson WA, Goff SP. 2006. Crystal structure of the Moloney Murine Leukimia Virus RNase H domain. J Virol. 80(17):8379-8389. doi: 10.1128/JVI.00750-06 Marracci GH, Kelley RD, Pilcher KY, Crabtree L, Shiigi SM, Avery N, Leo G, Webb MC, Hallick LM, Axthelm MK. 1995. Simian AIDS type D serogroup 2 retrovirus: isolation of an infectious molecular clone and sequence analyses of its envelope glycoprotein gene and 3' long terminal repeat. J Virol. 69(4): 2621-2628. Marracci GH, Avery Na, Shiigi SM, Couch G, Palmer H, Pilcher KY, Nichols H, Hallick LM, Axthelm MK, Machida CA. 1999. Molecular cloning and cellspecific growth characterization of polymorphic variants of type D serogroup 2 simian retroviruses. Virol. 261(1): 43-58. Marx PA, Maul DH, Osborne KG. 1984. Simian AIDS: isolation of type D retrovirus and disease transmission. Science. 223(4640):1083-1086. Marx PA, Bryant ML, Osborn KG, Maul DH, Lerche NW, Lowenstine LJ, Kluge JD, Zaiss CP, Henrickson RV, Shiigi SM. 1985. Isolation of a new serotype of simian acquired immune deficiency syndrome type D retrovirus from Celebes black

53 macaques (Macaca nigra) with immune deficiency and retroperitoneal fibromastosis. J Virol. 56(2): 571-578. Maul DH, Lerche NW, Osborn KG, Marx PA, Zaiss C, Spinner A, Kluge JD, MacKenzie MR, Lowenstine LJ, Bryant ML, et al. 1986. Pathogenesis of simian AIDS in rhesus macaques inoculated with the SRV-1 strain of type D retrovirus. Am J Vet Res. 47:863–868. Mihasan M. 2010. Basic protein structure prediction for the biologist: a review. Arch Biol Sci. 62 (4): 857-887. doi:10.2298/ABS1004857M). Montiel NA. 2010. An updated review of simian betaretrovirus (SRV) in macaque hosts. J Med Primatol. 39(5): 303–314. doi: 10.1111/j.1600-0684.2010.00412.x. Morton WR, Agy MB, Capuano SV, Grant RF. 2008. Specific pathogen-free macaques: definition, history, and current production. ILAR J. 49(2):137–144. Nandi JS, Tikute SA, Chhangani AK, Potdar VA, Tiwari-Mishra M, Ashtekar RA, Kumari J, Walimbe A, Mohnot SM. 2003. Natural infection by simian retrovirus6 (SRV-6) in Hanuman langurs (Semnopithecus entellus) from two different geographical regions of India. Virology. 311(1):192–201. Nandi JS, Van Dooren S, Chhangani AK, Mohnot SM. 2006. New simian ß retroviruses from rhesus monkeys (Macaca mulatta) and langurs (Semnopithecus entellus) from Rajasthan, India. Virus Genes. 33(1): 107-116. Nowotny M., Gaidamakov SA, Crouch RJ, Yang W. 2005. Crystal structures of RNase H bound to an RNA/DNA hybrid: substrate specificity and metal-dependent catalysis. Cell. 121(7):1005–1016. Pamungkas J, Joeniman B, Watanabe RA, Kuller L, Schmidt A, Thouless ME, Morton WR. 1991. Simian AIDS retrovirus (SRV) antibodies on cynomolgus macaques (Macaca fascicularis) from Indonesia. J Ilmu Pert Indones 1:52-56. Philipp-Staheli J, Marquardt T, Thouless ME, Bruce AG, Grant RF, Tsai CC, RoseTM. 2006. Genetic variability of the envelope gene of Type D simian retrovirus-2 (SRV-2) subtypes associated with SAIDS-related retroperitoneal fibromatosis in different macaque species. Virol J. 3:11-25. doi:10.1186/1743-422X-3-11. Rosenberg AH, Lade BN, Chui DS, Lin SW, Dunn JJ, Studier FW. 1987. Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 56(1): 125135. Rosenblum LL, Weiss RA, McClure MO. 1999. Virus load and sequence variation in simian retrovirus type 2 infection. J virology 74(8):3449-3454. Roth T, Morningstar ML, Boyer PL, Hughes SH, Buckheit RW, Michejda CJ. 1997. Synthesis and biological activity of novel non nucleoside inhibitors of HIV-1 reverse transriptase 2-Aryl-substituted benzimidazoles. J Med Chem. 40(26): 4199-4207. Roy A, Kucukural A, Zhang Y. 2010. I-TASSER: a unified platform for automated protein structure and function prediction. Nat Prot. 5:725-738. doi:10.1038/nprot.2010.5. Sarafianos SG, Das K, Tantillo C, Arthur D, Clark J, Jianping Ding, Whitcomb JM, Boyer PL, Hughes SH, Arnold E. 2001. Crystal structure of HIV-1 reverse transcriptase in complex with a polypurine tract RNA:DNA. EMBO J. 20(6):1449–1461. Sarafianos SG, Clark AD Jr, Das K, Tuske S, Birktoft JJ, Ilankumaran P, Ramesha AR, Sayer JM, Jerina DM, Boyer PL, Hughes SH, Arnold E. 2002. Structures of

54 HIV-1 reverse transcriptase with pre- and post-translocation AZTMP-terminated DNA. EMBO J. 21(23):6614-6624. Sarafianos SG, Marchand B, Das K, Himmel D, Parniak MA, Hughes SH, Arnold E. 2009. Structure and function of HIV-1 reverse transcriptase: molecular mechanisms of polymerization and inhibition. J Mol Biol. 385(3): 693-713. doi:10.1016/j.jmb.2008.10.071 Schultz SJ, Champoux JJ. 2008. RNaseH activity : structure, specificity, and function in Virus Res. 134(1-2): 86-103. doi: reverse transcription. 10.1016/j.virusres.2007.12.007. Epub 2008 Feb 7 Schultz SJ, Champoux JJ. 2009. RNaseH activity : structure, specificity, and function in reverse transcription. FEBS J. 276(6): 1506-1516. Sharma PL, Nurpeisov V, Schinazi RF. 2005. Retrovirus reverse transcriptase containing a modified YXDD motif. Antivir Chem Chemother. 16(3):169-182. Shuman S. 1994. Novel approach to molecular cloning and polynucleotide synthesis using vaccinia DNA Topoisomerase. J Biol Chem. 269(51): 32678-32684. Su HP, Yan Y, Prasad GS, Smith RF, Daniels CL, Abeywickrema PD, Reid JC, Loughran HM, Kornienko M, Sharma S, Grobler JA, Xu B, Sardana V, Allison TJ, Williams PD, Darke PL, Hazuda DJ, Munshi S. 2010. Structural basis for the inhibition of RNase H activity of HIV-1 reverse transcriptase by RNase H active site-directed inhibitors. J Virol. 84(15): 7625–7633. doi: 10.1128/JVI.00353-10. Epub 2010 May 19. Svensson J, Andersson C, Reseland JE, Lyngstadaas P, Bulow L. 2006. Histidine tag fusions increases expression levels of active recombinant amelogenin in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 48(1):134–141. doi: 10.1016/j.pep. 2006.01.005. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. 2011. Mega5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol. 28(10):2731-2739. doi:10.1093/molbev/msr121. Taube R, Loya S, Avidan O, Perach M, Hizi A. 1998. Reverse transcriptase of mouse mammary tumour virus: expression in bacteria, purification and biochemical characterization. Biochem J. 329(3): 579-587. Telesnitsky A, Goff SP. 1997. Reverse transcriptase and the generation of retroviral DNA. In Retroviruses (Coffin SH, Hughes HE, Varmus, eds), pp. 121-160. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Thayer RM, Power MD, Bryant ML, Gardner MB, Barr PJ, Luciw PA. 1987. Sequence relationships of type D retroviruses which cause simian acquired immunodeficiency syndrome. Virol 157(2): 317-329. Todaro GJ, Benveniste RE, Sherr CJ, Schlom J, Schidlovsky G, Stephenson JR. 1978. Isolation and characterization of a new type D retrovirus from the asian primate, Presbytis obscurus (spectacled langur). Virology 84:189–194. Voevodin AF, Marx PA. 2009. Simian Virology. San Fransisco: Wiley-Blackwell. Zao CL, Armstrong K, Tomanek L, Cooke A, Berger R, Estep JS, Marx PA, Trask JS, Smith DG, Yee JL , Lerche NW. 2010. The Complete Genome and Genetic Characteristics of SRV-4 Isolated from Cynomolgus Monkeys (Macaca fascicularis). Virology. 405(2): 390–396. doi: 10.1016/j.virol. 2010.06.028. Epub 2010 Jul 7.

55 Zhang Y, Skolnick J. 2005. TM-alignment: a protein structure alignment algorithm based on the TM-score. Nucleic Acid Res. 33(7):2302-2309. doi: 10.1093/nar/gki524. Zhang Y. 2008. I-TASSER server for protein 3D structure prediction. BMC Bioinformatics. 9(40) doi:10.1186/1471-2105-9-40. Zhou D, Chung S, Miller M, Le Grice SFJ, Wlodawer A. 2012. Crystal structures of the reverse transcriptase-associated ribonuclease H domain of xenotropic murine leukemia-virus related virus. J Struc Biol. 177(3): 638–645. doi: 10.1016/j.jsb.2012.02.006. Epub 2012 Feb 16.

56

LAMPIRAN

57 Lampiran 1 Hasil pengukuran konsentrasi protein enzim rekombinan RT SRV-2 dengan teknik BCA Assay

Konsentrasi Standar (µg mL-1)

OD1 pada λ560 nm

OD2 pada λ560 nm

Rata-Rata Nilai OD

50 125 250 500 750 1000 1500

0.111 0.160 0.177 0.220 0.306 0.375 0.478

0.109 0.150 0.175 0.230 0.304 0.375 0.473

0.110 0.155 0.176 0.225 0.305 0.375 0.475

0.600 y = 0.0002x + 0.1117 R² = 0.992

OD pada λ560 nm

0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 0

500

1000

1500

2000

Konsetransi Standar (ug/mL)

Tahap Pemurnian Pra-pemurnian Pengikatan Pencucian Elusi

OD1 pada λ560 nm

OD2 pada λ560 nm

Rata-Rata Nilai OD

Konsentrasi Protein (µg mL-1)

0.660 0.570 0.230 0.172

0.666 0.564 0.224 0.176

0.663 0.567 0.227 0.174

2760 2280 578 312

58 Lampiran 2 Hasil pengukuran konsentrasi enzim rekombinan RT SRV-2 dengan teknik RT colorimetric assay

OD1 pada λ490 nm

OD2 pada λ490 nm

Rata-Rata Nilai OD

Rata-Rata Nilai OD - blanko

Konsentrasi Enzim (U uL-1)

0.025 0.614 0.501 0.397 0.267 0.214 0.160 0.071

0.034 0.613 0.490 0.382 0.272 0.205 0.155 0.065

0.030 0.614 0.496 0.390 0.270 0.210 0.158 0.068

0.584 0.466 0.360 0.240 0.180 0.128 0.039

10.000 5.000 2.500 1.250 0.615 0.313 0.156

Standar 0 Standar 1 Standar 2 Standar 3 Standar 4 Standar 5 Standar 6 Standar 7

Konsentrasi Enzim (U/uL)

14.000 12.000

y = 0.1409e7.6454x R² = 0.9809

10.000 8.000 6.000 4.000 2.000 0.000 -

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

OD pada λ490 nm

Tahap Pemurnian Pra-pemurnian Bufer Pengikat Bufer Pencuci Bufer Elusi

OD1 pada λ490 nm

OD2 pada λ490 nm

Rata-Rata Nilai OD

Konsentrasi Enzim (U uL-1)

Volume Isolat (mL)

0.003 0.009 0.070 0.539

0.005 0.007 0.076 0.536

0.004 0.008 0.073 0.537

0.10 0.15 0.24 7.10

0.60 0.60 0.60 0.20

59

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Sukabumi pada tanggal 16 Maret 1975 sebagai anak ketiga dari pasangan M. Endang Munawar dan Siti Aminah. Pendidikan sarjana ditempuh di Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor, lulus pada tahun 1998. Penulis melanjutkan jenjang pendidikan S2 pada tahun 2005 di Program Magister Ilmu Biomedik, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia dan lulus pada tahun 2007. Kesempatan untuk melanjutkan pendidikan ke program Doktor di Program Studi Primatologi Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor diperoleh pada tahun 2010. Penulis bekerja sebagai peneliti di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi, Pusat Studi Satwa Primata, Lembaga Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat, Institut Pertanian Bogor (PSSP LPPM IPB) sampai tahun 2012. Pada tahun 2012 sampai sekarang, penulis menjadi staf peneliti dan koordinator Laboratorium Bioteknologi PSSP LPPM IPB. Beberapa karya ilmiah akan dipublikasikan yang berhubungan dengan judul disertasi ini yaitu: - Cloning and Expression of Serotype-2 Simian Betaretrovirus Reverse Transcriptase Gene Isolated from Indonesian Cynomolgus Monkey in Escherichia coli. Microbiology Indonesia. Volume 7. No. 20. Tahun 2013. p59-67. (Jurnal terakreditas DIKTI A) - Isolation and Three Dimensional Structure Model of Simian Betaretrovirus Serotype-2 (SRV-2) RNase H Isolated from Indonesian Cynomolgus Monkey. Sudah dikirimkan untuk dipublikasi di Annales Journal (Jurnal terakreditasi LIPI A) - Isolation and Three-Dimensional Structure Model of Gene Encoding Reverse Transcriptase of Simian Betaretrovirus Serotype-2 (SRV-2) Isolated from Indonesia Cynomolgus Monkey. Sudah dikirimkan untuk publikasi di Biotropia, the Southeast Asian Journal of Tropical Biology (Jurnal terindeks Scopus) Beberapa karya ilmiah lainnya adalah: - Screening and confirmatory testing of MHC class I alleles in pigtail macaques. Immunogenetics. 63:511-521. 2011. - Dissemination in pigtailed macaques after primary infection of dengue-3 virus. Microbiol Indones. 5: 94-98. 2011. - Characterization of simian retrovirus type D from Macaca fascicularis and M. nemestrina in Indonesia. Microbiol Indones. 4(3): 132-136. 2010. - Expression of simian retrovirus typeD serotype 2 envelope in insect cell using baculovirus expression vector system. Microbiol Indones. 3(2): 91-95. 2009.

PENGEMBANGAN ENZIM REKOMBINAN REVERSE TRANSCRIPTASE SIMIAN BETARETROVIRUS SEROTIPE-2 ISOLAT INDONESIA ASAL MONYET EKOR PANJANG UUS SAEPULOH

Recommend Documents