ISOLASI KONSTRUKSI DAN REKOMBINASI GEN PENGKODE REVERSE TRANSCRIPTASE ASAL Simian Retrovirus-2 (SRV-2)
SELA SEPTIMA MARIYA
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
ABSTRAK SELA SEPTIMA MARIYA. Isolasi Konstruksi dan Rekombinasi Gen Pengkode Reverse Transcriptase asal Simian Retrovirus-2 (SRV-2). Dibimbing oleh A.E ZAINAL HASAN dan DIAH ISKANDRIATI. Ketersediaan enzim reverse transcriptase sebagai komponen reagensia pada teknik Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) masih berasal dari luar negeri. Hal ini mengakibatkan enzim tersebut harganya sangat mahal dan ketersediaannya sangat sulit, untuk itu perlu dikembangkan enzim rekombinan reverse transcriptase yang diproduksi dari Indonesia. Penelitian ini merupakan langkah awal pembuatan enzim rekombinan reverse transcriptase asal SRV-2. Tujuan penelitian ini adalah mengisolasi, mengonstruksi, dan merekombinasi gen pengkode reverse transcriptase asal SRV-2 pada vektor cloning dan vektor destinasi. Isolasi dilakukan dengan teknik PCR menggunakan tiga pasang primer RTI, RTII, dan RTIII. Konstruksi dan rekombinasi gen dilakukan dengan metode Gateway dari Invitrogen. Target gen berhasil diisolasi dari sel A-549 yang diinokulasi dengan SRV-2. Amplifikasi gen pengkode reverse transcriptase dengan teknik PCR menghasilkan pita spesifik untuk RT I sebesar 401 bp, RT II sebesar 639 bp, dan RTIII sebesar 964 bp sesuai dengan primer yang digunakan. Hasil analisis pENTR/SD/TOPO dan pDEST17 menunjukan bahwa gen pengkode reverse transcriptase berhasil tersisipkan pada kedua plasmid. Penelitian ini membuktikan bahwa gen pengkode reverse transcriptase asal SRV-2 berhasil diisolasi, dikonstruksi, dan direkombinasikan pada vektor cloning dan vektor destinasi.
ABSTRACT SELA SEPTIMA MARIYA. Isolation, Construction, Recombination of Reverse Transcriptase Gene from Simian Retrovirus-2 (SRV-2). Under direction by A.E ZAINAL HASAN and DIAH ISKANDRIATI. The availability of reverse transcriptase enzym as a valuable component for Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technique has been providing by foreign companies. Therefore, it needs more cost and time to provide it. This study is an early step to produce in house reverse transcriptase rekombinant enzym from SRV-2. The purpose of this study was isolated, constructed, and rekombined SRV-2 reverse transcriptase gene to entry clone and destination vector. Isolation was done by PCR amplification technique using three pairs of primers, which are RT I (3282-3683), RTII (3261-3900), and RTIII (3169-4133). Construction and recombination in this study used Gateway method from Invitrogen. SRV-2 reverse transcriptase gene was isolated in this study with A-549 cell inoculated SRV-2 as source of virus. This gene amplify by PCR technique and resulted specific band for RTI 401 bp, RTII 639 bp, and RTIII 964 bp. Analysis of pENTR/SD/TOPO and pDEST17 indicated SRV-2 reverse transcriptase gene code has already inserted to this plasmid. This result indicated SRV-2 reverse transcriptase gene have isolated, constructed, and recombined to entry clone and destination vector.
ISOLASI KONSTRUKSI DAN REKOMBINASI GEN PENGKODE REVERSE TRANSCRIPTASE ASAL Simian Retrovirus-2 (SRV-2)
SELA SEPTIMA MARIYA
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
Judul Skripsi : Isolasi Konstruksi dan Rekombinasi Gen Pengkode Reverse Transcriptase asal Simian Retrovirus-2 (SRV-2) Nama : Sela Septima Mariya NIM : G84062723
Disetujui, Komisi Pembimbing
Ir. A.E Zainal Hasan M.Si Ketua
Dr. drh. Diah Iskandriati Anggota
Diketahui,
Dr. Ir. I Made Artika, M.app.Sc Ketua Departemen Biokimia
Tanggal lulus :
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kehadiran Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya sehingga skripsi yang berjudul Isolasi, Konstruksi, dan Rekombinasi Gen Reverse Transcriptase asal Simian Retrovirus2 (SRV-2) dapat diselesaikan. Skripsi ini disusun berdasarkan penelitian yang dilaksanakan mulai tanggal 1 Maret 2009 sampai dengan 31 Juli 2010 bertempat di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi Pusat Studi Satwa Primata, LPPMIPB. Terima kasih penulis sampaikan kepada Ir. Ahmad Endang Zainal Hasan, M.Si sebagai dosen pembimbing, dan Dr. drh. Diah Iskandriati selaku dosen pembimbing dan kepala Laboratorium dan Imunologi PSSP yang telah memberikan kesempatan, dan arahan kepada penulis untuk melaksanakan penelitian ini. Tidak lupa penulis sampaikan terima kasih kepada Uus Saepulloh, S.Si, M.Biomed atas bimbingan dan masukan yang telah diberikan saat penulis melaksanakan penelitian di laboratorium. Terima kasih juga penulis sampaikan pada staf Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi yang telah mendukung dan mengajarkan penulis selama penelitian. Penulis sampaikan terima kasih kepada keluarga tercinta (Mama, Alm.Papap, Teh Silmi, Aborse, Oo, Dadan, Kamila, Wiwit) atas dukungan yang selalu diberikan pada penulis untuk menyelesaikan skripsi ini, Kak Amar beserta keluarga yang turut mendoakan penulis selama menyelesaikan skripsi ini, dan kepada teman satu bimbingan Ifat dan Yanthi atas dukungan yang telah diberikan. Semoga skripsi ini bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, Oktober 2010 Sela Septima Mariya
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 7 Juli 1987 dari pasangan Alm. Yahya Saleh dan Titih Martiana. Penulis merupakan anak ketujuh dari tujuh bersaudara. Tahun 2006 penulis lulus dari SMU Negeri 05 Bogor dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis memilih Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Penulis pernah menjadi asisten praktikum Kimia Dasar pada tahun ajaran 2008/2009. Tahun 2009, penulis mengikuti Praktik Kerja Lapang di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi, Pusat Studi Satwa Primata (PSSP), Bogor. Penulis juga mendapat beasiswa Peningkatan Prestasi Akademik (PPA) pada tahun ajaran 2008/2009, 2009/2010, dan 2010/2011. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah mengikuti Pekan Kreativitas Mahasiswa (PKM) dalam bidang penelitian dengan judul “Identifikasi dan Karakterisasi pada DNA Kerbau Toraja Hasil Persilangan” dan penelitian ini berhasil masuk Pekan Ilmiah Nasional (PIMNAS) ke XXIII di Bali. Penulis pernah menjadi bendahara divisi Pemberdayaan Sumber Daya Manusia (PSDM) Community Research and Education of Biochemist (CREBs) periode 2008/2009 dan Dewan Pengawas CREBs periode 2009/2010.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ vi DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... vii PENDAHULUAN ............................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA Reverse Transcriptase .............................................................................. Konstruksi Gen ........................................................................................ Retrovirus .................................................................................................. Simian Retrovirus-2 (SRV-2)......................................................................
2 2 3 5
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ......................................................................................... Metode ......................................................................................................
6 6
HASIL DAN PEMBAHASAN Amplikon Gen Pengkode Reverse Transcriptase ..................................... 9 Sisipan Gen Pengkode Reverse Transcriptase pada pENTR/SD/TOPO 11 Rekombinan Gen Pengkode Reverse Transcriptase dalam pDEST17 ...... 13 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan .................................................................................................... 14 Saran ......................................................................................................... 15 DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................... 15 LAMPIRAN ...................................................................................................... 17
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Peta Genetik pENTR/SD/ TOPO ................................................................
4
2 Peta Genetik pDEST17 .............................................................................
4
3 Struktur Virion Retrovirus ..........................................................................
5
4 Struktur Genom Retrovirus .........................................................................
5
5 Hasil Amplifikasi Gen Pengkode Reverse Transcriptase .......................... 10 6 Mekanisme Kerja Enzim Topoisomerase I terhadap Produk PCR ............... 11 7 Elektroforegram pENTR/SD/TOPO dengan Primer M13 Sisipan RTI ........ 12 8 Elektroforegram pENTR/SD/TOPO dengan Primer M13 Sisipan RTII....... 12 9 Elektroforegram pENTR/SD/TOPO dengan Primer M13 Sisipan RTIII ..... 12 10 Reaksi Rekombinasi LR clonase .................................................................. 13 11 Elektroforegram pDEST17 dengan Primer T7 promotor forward dan RTI reverse.................................................................................................... 14 12 Elektroforegram pDEST17 dengan Primer T7 promotor forward dan RTII reverse .................................................................................................. 14 13 Elektroforegram pDEST17 dengan Primer T7 promotor forward dan RTII reverse .................................................................................................. 14
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Diagram Alir Penelitian ............................................................................... 18 2 Ekstraksi DNA ............................................................................................ 19 3 Ekstraksi DNA dari Gel Agarosa ................................................................. 20 4 Isolasi Plasmid E.coli .................................................................................. 21 5 Prinsip Kerja Topoisomerase I dalam Pemasukan Gen ke dalam Vektor ... 22 6 Hasil Identifikasi DNA dari Gel Agarosa dengan Teknik PCR .................. 23 7 Besar Amplikon Hasil Analisis pENTR/SD/TOPO dengan Primer M13 Forward dan M13 Reverse........................................................................... 24 8 Hasil Pengurutan DNA untuk RTI .............................................................. 25 9 Hasil Pengurutan DNA untuk RTII ............................................................ 26 10 Hasil Pengurutan DNA untuk RTIII ........................................................... 27 11 Besar Amplikon Hasil Analisis pDEST17 dengan Primer T7 Promotor Forward dan RT Reverse ............................................................................. 28 12 Sekuen Spesifik, Posisi Nukleotida, dan Fungsi pada pENTR/SD/TOPO .. 29 13 Sekuen Spesifik, Posisi Nukleotida, dan Fungsi pada pDEST17 ................ 30
1
PENDAHULUAN Latar Belakang Biologi molekuler merupakan salah satu disiplin ilmu dasar yang sangat berperan dalam menunjang berkembangnya bioteknologi modern. Berbagai teknik dan metode pendukung berkembangnya bidang biologi molekuler seperti: Polymerase Chain Reaction (PCR), Reverse Transcription PCR, Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), teknik DNA microarray, teknologi pengklonan gen, teknik DNA rekombinan, teknik protein engineering, dan lain-lain telah dikembangkan. Adanya teknik-teknik dan metode-metode tersebut mutlak diperlukan dalam mendukung berkembangnya bioteknologi di Indonesia. Teknik atau metode tersebut memerlukan berbagai reagensia yang sebagian besar menggunakan produk-produk komersial dari luar negeri. Kendala utama penggunaan reagensia dari luar negeri adalah secara ekonomi sangat mahal dan diperlukan waktu yang cukup lama untuk pemesanannya. Hal ini tentu saja akan menghambat perkembangan penelitian di Indonesia dalam bidang biologi molekuler khususnya atau bidang bioteknologi pada umumnya. Salah satu reagensia yang sangat penting perannya dalam bidang biologi molekuler adalah enzim reverse transcriptase (RT). Enzim ini dikenal sebagai RNA-dependent DNA polymerase yang akan mentranskripsi utas tunggal RNA menjadi DNA (Mizuno et al. 2009). Enzim reverse transcriptase sangat umum diaplikasikan dalam bidang biologi molekuler terutama dalam teknik Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Teknik ini telah banyak digunakan dalam penelitian biomedis, diagnostik, pengklonan gen, rekayasa genetik, rekayasa protein, protein rekombinan, dan karakterisasi DNA. Secara komersial, enzim tersebut sudah tersedia di pasaran, namun mengingat masih harus didatangkan dari luar negeri, maka harganya sangat mahal dan dibutuhkan waktu yang cukup lama untuk penyediaannya. Enzim reverse transcriptase dihasilkan oleh reverse-transcribing RNA virus seperti virus dari famili retroviridae. Enzim reverse transcriptase yang telah dikembangkan saat ini berupa enzim rekombinan yang berasal dari molony murine leukimia virus (MMLV) dan avian myeblastosis virus (AMV) (Wong
1998). Enzim reverse transcriptase juga dapat dihasilkan dari anggota famili retroviridae yang lain, salah satunya adalah Simian Retrovirus type 2 (SRV-2). Simian Retrovirus type 2 (SRV-2) adalah salah satu agen penyakit yang dapat menyebabkan penurunan kekebalan tubuh pada primata khususnya genus Macaca asal Asia. Gejala klinis yang tampak pada Macaca yang terinfeksi SRV antara lain diare yang berkepanjangan tanpa penyebab yang pasti, penurunan berat badan yang drastis, dehidrasi, dan munculnya beberapa infeksi oportunistik seperti yang terjadi pada penderita Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) (Baker 2003). Virus ini memberikan masalah yang signifikan dalam pengelolaan penangkaran Macaca yang dapat menyebabkan mortalitas dan morbiditas yang tinggi dalam pengandangan berkelompok (Lerche et al. 1995). Virus SRV-2 merupakan virus dari famili retroviridae yang memiliki genom berupa RNA utas tunggal diploid. Virus ini memiliki tiga gen utama, yaitu env yang mengkode protein selubung, gag untuk kelompok antigen spesifik, dan pol untuk polimerase. Gen pol SRV-2 mengekspresikan enzim-enzim seperti protease, reverse transcriptase, RNase H dan integrase (Vanderberg 1996). Reverse transcriptase sebagai enzim spesifik dalam famili retrovirus berfungsi untuk melakukan transkripsi balik yang menghasilkan DNA komplementer (cDNA) dari RNA yang selanjutnya cDNA yang dihasilkan akan masuk ke dalam inti sel dan berintegrasi dengan genom sel inang (Strauss & Strauss 2002) . Adanya gen pengkode reverse transcriptase dalam SRV-2, memungkinkan dilakukannya isolasi, konstruksi, dan rekombinasi gen untuk menghasilkan enzim rekombinan reverse transcriptase asal SRV2. Tersedianya enzim rekombinan tersebut diharapkan dapat mengurangi ketergantungan penggunaan enzim sejenis dari luar negeri. Selain itu, pemanfaatan dan ekplorasi biodiversiti asal Indonesia termasuk mikroorganismenya diharapkan akan meningkatkan nilai jual dan mempunyai nilai ekonomis tinggi. Penelitian ini bertujuan u n t u k melakukan isolasi, konstruksi, dan rekombinasi gen pengkode enzim reverse transcriptase asal SRV-2 menggunakan vektor cloning dan vektor destinasi Escherichia coli. Hipotesis dari penelitian ini
2
adalah gen pengkode reverse transcriptase dapat diisolasi dari SRV-2 yang selanjutnya dikonstruksi pada vektor cloning kemudian direkombinasi pada vektor destinasi E.coli. Penelitian ini diharapkan dapat menjadi langkah awal untuk memproduksi enzim reverse transcriptase rekombinan asal SRV2 menggunakan vektor ekspresi E.coli. Enzim rekombinan ini diharapkan mempunyai aktivitas spesifik sehingga dapat diaplikasikan dalam teknik RT-PCR untuk sintesis cDNA dari RNA.
TINJAUAN PUSTAKA Reverse Transcriptase Reverse transcriptase merupakan enzim yang secara alami digunakan oleh retrovirus untuk sintesis complement DNA (cDNA) dari cetakan RNA. Enzim ini ditemukan oleh Howard Temin dan David Baltimore secara terpisah pada tahun 1970 setelah ditemukannya enzim restriksi. Reverse transcriptase mengonstruksi cDNA dengan menggunakan RNA sebagai cetakan. Hal tersebut mengakibatkan gen atau bagian gen dapat disintesis berdasarkan mRNA. Proses seperti ini dinamakan transkipsi balik (Skalka & Goff 1997). Reverse transcriptase dalam retrovirus merupakan salah satu hasil ekspresi dari gen pol. Selain reverse transcriptase gen pol juga mengekspresikan enzim-enzim seperti protease, RNase H dan integrase. Reverse transcriptase yang terdapat dalam retrovirus memiliki aktivitas RNase H. Fungsi dari RNase H adalah memecah ikatan 3’O-P dari RNA hibrid yang menghasilkan ujung terminal 3’ dan 5’ (Cote & Roth 2008). Ketersediaan enzim reverse transcriptase telah memberikan kemudahan untuk mempelajari gen yang membawa sifat-sifat tertentu. Pekerjaan mencari gen dengan enzim reverse transcriptase tidak harus dimulai dengan isolasi DNA genom total tetapi dapat langsung di isolasi dari messager RNA (mRNA). Enzim reverse transcriptase saat ini diproduksi secara komersial yang merupakan produk rekombinan dari anggota famili retroviridae, yaitu molony murine leukimia virus (MMLV) dan avian myeblastosis virus (AMV) dalam sel E.coli . Sintesis cDNA menggunakan enzim reverse transcriptase dapat digunakan untuk menghitung mRNA untuk analisis ekspresi protein. Perhitungan mRNA dilakukan dengan quantitative real-time reverse
transcriptase PCR (RT-qPCR). Penelitian saat ini yang menggunakan teknik RT-qPCR antara lain pencarian profil ekspresi gen pada lalat buah asal Asia (Shen et al. 2010), analisis gen pengekspresi reseptor tirosin kinase (Teutschbein et al. 2010), dan deteksi molekuler pengaruh formalin terhadap Mycobacterium tuberculosis (Mishra et al. 2010) Saat ini banyak dilakukan isolasi enzim reverse transcriptase dari Human Immunodeficiency Virus (HIV) untuk dicari inhibitornya yang dapat diaplikasikan untuk pengobatan penyakit AIDS (Goodsell 2002). Pengobatan terapi HIV dilakukan menggunakan sistem Nukleotida Reverse Transcriptase Inhibitor (NRTI). Contoh NRTI yang banyak digunakan antara lain zidovudin, lamivudin, didanosin, dan stafudin. Toksisitas zidovudin pada anakanak lebih rendah dari NRTI lainnya yang telah disebutkan, untuk itu zidovudin lebih umum dapat digunakan untuk terapi HIV pada anak-anak (Van Dyke et al. 2008) . Konstruksi Gen Teknologi DNA rekombinan atau rekayasa genetika merupakan suatu metode yang dilakukan untuk mengonstruksi DNA suatu mahluk hidup tertentu guna memperoleh sifat-sifat tertentu dari organisme tersebut. Peneliti berusaha menambahkan sifat-sifat unggul ke dalam suatu organisme pada teknik ini, sehingga diharapkan menjadi organisme yang menguntungkan kehidupan manusia (Glick & Pasternack 1994). Beberapa tahap penting yang dapat menentukan keberhasilan konstruksi gen adalah penyiapan fragmen DNA, penyiapan vektor, reaksi restriksi dan ligasi, serta perbanyakan DNA dalam sel inang. Perbanyakan gen dalam sel inang disebut dengan istilah pengklonan gen. Pengklonan gen merupakan inti dari teknologi DNA rekombinan (Pudjiadi 2006). Saat ini salah satu dari metode konstruksi gen yang biasa dipakai adalah metode pengklonan universal dengan memanfaatkan sifat-sifat rekombinasi situs spesifik dari lambda bakteriofage. Metode ini dikenal sebagai metode Gateway yang dikembangkan oleh perusahaan Invitrogen. Metode ini banyak digunakan dalam pengklonan dan sub pengklonan DNA, memfasilitasi analisis gen fungsional, dan ekspresi protein. Metode Gateway ini mengonstruksi gen sisipan yang terlebih
3
dahulu diklon ke dalam vektor Entry (pENTR) dan kemudian ditransfer ke dalam vektor Destinasi (pDEST) dengan rekombinasi situs spesifik. Pengerjaannya menggunakan protein rekombinasi integrase (Int) dan excisionase (Xis) yang mengenali situs attL dan attR di dalam vektor Entry (vektor cloning) dan vektor destinasi yang akan menggabungkannya ke situs attB. Target gen dimasukkan ke dalam vektor Entry menggunakan Site Specific Recombination (SSR) dengan BP clonase atau dengan pengklonan ke dalam multiple cloning site (MCS) tersusun di antara situs attL1 dan attL2 dengan enzim restriksi dan ligase (REaL) kloning (Dubin et al. 2008). Metode Gateway dapat dengan mudah mentransfer satu atau dua sekuen DNA dalam reaksi paralel lebih dari satu vektor tanpa melalui tahapan pemotongan (restriksi) dan penyambungan (ligasi) seperti yang biasa dilakukan dalam pengklonan konvensional (Attanasov 2009). Ekspresi gen menggunakan Gateway Technology dilakukan melalui dua tahap reaksi antara gen yang akan disisipkan (gene of interest) dalam entry clone (vektor cloning) dengan vektor destinasi. Tahap awal untuk menghasilkan klon dilakukan dengan menggunakan pENTR/SD/TOPO sebagai vektor cloning. Vektor cloning pENTR/SD/TOPO merupakan plasmid yang berasal dari E.coli. Vektor ini memiliki panjang basa sebesar 2.6 kbp. Target gen akan tesrsisipkan pada daerah diantara situs attL1 dan attL2 pada pENTR/SD/TOPO (Gambar 1). Prinsip kerja dari penyisipan target gen pada vektor ini adalah kerja enzim topoisomerase I virus vaccinia yang akan mengikat DNA dupleks pada sisi spesifik CCCTT dan memecah ikatan fosfodiester pada salah satu untainya. Energi dari ikatan fosfodiester yang dipecah, disimpan dengan membentuk ikatan kovalen antara 3’-fosfat dari untai yang dipecah dan residu tirosil (Tyr-274) dari topoisomerase I (Shuman 1994). Ikatan fosfotirosil antara DNA dan enzim selanjutnya akan bereaksi dengan 5’-hidroksil dari untai yang dipecah, menyebabkan reaksi balik, dan melepaskan topoisomerase (Shuman 1994). Target gen yang telah tersisipkan dalam selanjutnya akan pENTR/SD/TOPO direkombinasikan pada vektor destinasi (pDEST17). Vektor destinasi (pDEST17) ini memiliki panjang basa sebesar 6354 bp. Target gen dalam vektor cloning akan berekombinasi pada situs ccdB pDEST17
dengan bantuan enzim LR clonase. Pada intinya target gen setelah rekombinasi akan menggantikan posisi situs ccdB dalam pDEST 17. Prinsip kerja pDEST17 ini didasarkan pada aktivitas tinggi dan kekhususan dari bakteriofage T7 RNA polimerase untuk mengatur ekspresi gen heterolog E.coli dari T7 promotor. Ekspresi dari gen yang telah direkombinasikan dalam pDEST17 dikontrol oleh bakteriofage T7 promotor, oleh karena itu dalam pDEST dilengkapi dengan situs T7 promotor dari E.coli (Gambar 2) . Sel inang yang dipakai untuk rekombinasi pDEST adalah sel E.coli DH5α (Invitrogen 2008). Retrovirus Retrovirus merupakan golongan virus yang memiliki dua utas tunggal RNA yang identik. Molekul RNA dari virus ini setelah masuk ke dalam sel target akan disintesis menjadi DNA oleh enzim reverse transcriptase yang dimiliki oleh semua virus keluarga ini. Molekul DNA yang telah disintesis oleh enzim reverse transcriptase akan masuk ke dalam inti sel inang dan berintegrasi ke dalam kromosom sel inang. Molekul DNA ini bersifat stabil dan dapat ditransfer ke dalam organisme inang turunannya (Fridman 2002). Bentuk partikel virion retrovirus menyerupai bola dengan diameter sekitar 100 nm dan dikelilingi oleh selubung virus yang mengandung membran lipid bilayer. Permukaan selubung virus terdapat tonjolantonjolan yang tersusun atas glikoprotein (Gambar 3). Terdapat nukleokapsid internal di bawah membran dengan bentuk bervariasi, hal ini merupakan dasar bagi klasifikasi retrovirus berdasarkan morfologinya dibagi ke dalam tipe A, B, C, dan D. Klasifikasi lain dalam famili retroviridae ditetapkan pada tahun 2002 oleh International Comitte on Taxonomy of Viruses (ICTV). Klasifikasi ini menetapkan famili retroviridae dibagi ke dalam tujuh genus, lima genus berpotensi onkogenik yaitu alfaretrovirus; betaretrovirus; gamaretrovirus; deltarerovirus; dan epsilonretrovirus, dua genus lain adalah lentivirus, dan spumavirus (Carter & Saunders 2007). Genom retrovirus berupa RNA utas tunggal ganda yang bersifat identik. Organisasi genom RNA retrovirus digambarkan dalam bentuk blok sekuens yang penting (Gambar 4). Ujung 5’RNA berupa penutup (capped) dengan struktur m7G5’ppp5’Gmp.
4
Gambar 1 Peta genetik pENTR/SD/TOPO (Invitrogen 2007).
Gambar 2 Peta genetik pDEST (Invitrogen 2008).
5
PPT U3 R
Gambar 3 Struktur virion retrovirus (http://www.epidemic.org) PPT U3
R U5 PBS Leader
gag
pol
env
Cap
A(n) Gambar
4
Organisasi genom RNA (Carter & retrovirus Saunders 2007)
Ujung 3’ mengandung untaian poli (A) sebesar 200 basa. Setelah ujung 5’dan sebelum poli(A) terdapat sekuen R (repeat). Sekuen U5 merupakan sekuen unik 5’ yang di dalamnya mengandung sisi att yang diperlukan untuk integrasi provirus dan yang pertama mengalami transkipsi balik. Setelah daerah u5 terdapat sekuens primer binding site (PBS), sekuens ini merupakan tempat tRNA inang terhibridisasi dengan genom. Daerah setelah PBS mengandung sinyal utama untuk enkapsidasi RNA virus ke dalam partikel virion yang dikenal dengan elemen Psi (Coffin et al. 1997). Retrovirus memiliki tiga gen utama yaitu gag untuk group-specific antigen, pol untuk polimerase, dan env untuk envelope. Polypurine tract (ppt) berada setelah gen utama mengandung paling sedikit sembilan residu A atau G, berperan dalam inisiasi selama proses transkipsi balik. Daerah U3 mengandung sejumlah cis-acting element untuk ekspresi gen virus dan satu sisi att untuk integrasi DNA (Coffin 1997).
Simian Retrovirus-2 Simian retrovirus merupakan betaretrovirus yang secara etiologi berhubungan dengan terjadinya sindroma penurunan kekebalan tubuh pada satwa primata (simian acquired immunedeficiency syndrome, SAIDS) dengan berbagai tingkat keparahan pada spesies Macaca asal Asia (Fridman 2002). Infeksi akibat SRV ditemukan pada Macaca hasil penangkapan dari alam liar dan menjadi endemik pada populasi penangkaran di beberapa pusat penelitian primata Amerika Serikat. Sampai saat ini, telah berhasil ditemukan dan diidentifikasikan lima anggota serotipe SRV asal Macaca, yaitu SRV 1-5, serotipe SRV-6 asal Hanuman langur (Semnopithecus entellus) dan serotipe SRV-7 asal monyet resus (M.mulatta) dan S.entellus. Virus ini telah berhasil diisolasi dan ditentukan urutan nukleotidanya dari SRV asal M.nemestrina (SRVMn) isolat Indonesia yang mempunyai kemiripan dengan SRV PO-1-Lu (Iskandriati 2004). Serotipe SRV-2 telah berhasil diidentifikasikan pada awal tahun 1980 pada kasus infeksi endemik yang terjadi pada beruk, monyet ekor panjang (Macaca fascicularis), dan monyet Jepang di pusat penelitian primata Washington, dan pada monyet rhesus serta monyet hitam Sulawesi di pusat penelitian primata nasional Oregon (Staheli 2006).
6
BAHAN DAN METODE
Metode
Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan adalah sel A-549 yang sudah diinokulasi dengan SRV2, SDS (Sodium Dodesilsulfat), EDTA (Etilendiamin Tetraasetat), tris-HCL, NaCl (Natrium Klorida), Posfat Buffer Saline (PBS) 1x, proteinase K 20 mg/mL, etanol 95%, QIAmp DNA Mini Kit and DNA Blood mini kit yang terdiri atas bufer AW1, bufer AW2, dan bufer AE. Bahan yang digunakan untuk teknik PCR dan elektroforesis gel agarosa adalah primer RT I 3282 fordward, RT I 3683 reverse, primer RT II 3261 fordward, primer RT II 3900 reverse, primer pol I fordward, primer pol I reverse, primer M13 fordward, primer M13 reverse, primer T7, MgCl2 25 mM, dNTPs 10 mM, 10x PCR bufer, Taq polymerase 50/µL, nuclease free water, agarosa 1.8%, agarosa 1%, loading dye 6x, bufer Triacetic Acid EDTA (TAE), Etidium Bromida (EtBr), marker 1 kb, marker 100 bp dan dH20. Bahan yang digunakan untuk isolasi DNA dari gel agarosa berdasarkan Qiagen MinElute terdiri atas bufer QG, isopropanol, bufer PE, dan bufer elusi. Adapun bahan yang digunakan untuk pengklonan gen berdasarkan pENTR Directional TOPO Cloning Kits dari Invitrogen ialah Luria Bertani (LB) broth, LB agar, kanamisin, salt solution, pENTR/SD/TOPO, dan media SOC (Super Optimum Broth with Glucose). Bahan yang digunakan pada isolasi plasmid berdasarkan QIAprep dari Qiagen adalah bufer P1, bufer P2, bufer N3, bufer PE, dan bufer elusi. Adapun bahan uang digunakan untuk rekombinasi gen sisipan berdasarkan E. Coli Expression System with Gateway Technology dari Invitrogen adalah pDEST17, LR Clonase, bufer TE (TrisEDTA) pH 8.0, media SOC, dan es. Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini antara lain pipet mikro, vial, barriers tip, pipet Mohr, timbangan, pipet serologis, pipet aid, spin kolom, tabung PCR, mesin PCR Perkin Elmer 9700, elektroforesis chamber, cetakan agar, voltmeter, kabel penghubung, gunting, pisau, mikrosentrifus, pinset, cawan petri, bunsen, jarum okulasi, kolom, tabung PCR, tabung reaksi, tabung Erlenmeyer, sentrifus Beckman GS56R untuk pemisahan darah, microwave, gelas ukur, waterbath dan vorteks. Selain itu digunakan juga Geldoc Biorad untuk penampakan hasil elektroforesis gel agarosa.
Isolasi DNA Total (Qiagen 2003). Sumber virus yang digunakan dalam penelitian ini adalah sel A-549 yang diinokulasi dengan SRV-2. Sel A-549 yang diinokulasi dengan SRV-2 disentrifugasi dengan kecepatan 424 g selama 5 menit. Supernatan hasil sentrifus dibuang, kemudian pelet ditambahkan PBS 1 mL. Pelet tersebut disentrifugasi kembali dan supernatan hasil sentrifugasi dibuang. Sebanyak 20 µL proteinase K, 200 µL lisis bufer, dan 200 µL PBS ditambahkan pada pellet, kemudian dicampurkan selama 15 detik. Pemurnian dan pemekatan DNA dilakukan dengan metode QIAmp DNA Mini KIT and DNA Blood Mini Kit dari Qiagen. Pemurnian DNA diawali dengan sel yang telah dilisis diinkubasi pada suhu 56oC selama 10 menit. Pemekatan dilakukan dengan penambahan etanol 95% sebanyak 200 µL pada sel, kemudian dicampurkan. Campuran etanol dan sel darah tersebut dipindahkan ke spin kolom. Kolom yang digunakan dilengkapi dengan tabung 1 µL untuk tempat supernatan, kemudian kolom disentrifugasi pada 6780 g selama 1 menit. Sebanyak 500 µL bufer AW1 akan ditambahkan dan disentrifugasi pada kecepatan 6780 g selama 1 menit. Supernatan dibuang dari kolom, kemudian bufer AW2 ditambahkan 500 µL pada kolom lalu disentrifugasi kembali dengan kecepatan 10600 g selama 5 menit. Supernatan dibuang dan tabung koleksi diganti dengan tabung Eppendorf. Bufer AE 100 µL ditambahkan dan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Tabung tersebut kemudian disentrifugasi 6780 g selama 1 menit. Amplifikasi Fragmen DNA Pengkode Reverse Trancriptase SRV-2 (Sambrook 1989). Gen penyandi daerah reverse transcriptase SRV-2 diperbanyak dengan PCR. Molekul DNA akan diamplifikasi dengan mesin PCR. Sebanyak tiga jenis pasangan primer digunakan untuk amplifikasi fragmen DNA SRV-2. Tiga jenis pasangan primer yang digunakan antara lain RT I 3282 fordward dan RT I 3683 reverse, RT II 3261 fordward dan RT II 3900 reverse, serta RTIII fordward dan RTIII reverse. Tabel 1 menunjukkan urutan nukleotida primer yang digunakan dalam penelitian ini. Sebanyak 10 µL DNA
7
ditambahkan pada formula untuk PCR yang berisi campuran yang mengandung 1 µL primer forward 10 pmol/ µL, 1 µL primer reverse, 4 µL MgCl2 25 mM, 5 µL dNTPs 10 mM, 5 µL 10x bufer Pfu, 1 µL Pfu turbo 2.5 U/µL, kemudian ditambahkan 23 µL nuclease free water agar volumenya menjadi 50 µL. Campuran tersebut kemudian dimasukkan ke dalam mesin PCR pada kondisi denaturasi awal dengan suhu 95oC selama 2 menit, selanjutnya dilakukan amplifikasi sebanyak 35 siklus masingmasing untuk denaturasi pada suhu 94oC selama 30 detik, proses penempelan primer (annealing) pada suhu 50oC selama 30 detik dan proses perpanjangan (extention) pada suhu 72oC selama 1.5 menit. Proses PCR akan diakhiri pada suhu 72oC selama 5 menit sebagai tambahan waktu perpanjangan dan reaksi dihentikan pada suhu 4oC. Visualisasi Hasil PCR dengan Teknik Elektroforesis Gel Agarosa (Sambrook 1989). Elektroforesis gel agarosa diawali dengan dibuatnya serbuk agarosa sebanyak 1.8 gram kemudian dicampurkan ke dalam larutan bufer TAE 1x. Campuran tersebut kemudian dididihkan dalam microwave, kemudian sebanyak 10 µL senyawa EtBr ditambahkan pada gel agarosa, lalu gel dicetak ke dalam alat cetakan agar sampai memadat. Agar yang sudah memadat dimasukkan ke dalam elektroforesis chamber. Sebanyak 2.5 µL larutan loading dye dicampurkan dengan 1.5 µL marker 1
kb bp (Invitrogen) dan ditambahkan bufer TAE 1x sampai volumenya menjadi 15 µL. Campuran tersebut dimasukkan ke dalam sumur elektroforesis. Sumur antara marker dan sampel diberi jarak satu sumur. Sebanyak 12.5 µL DNA sampel dicampurkan dengan 2.5 µL larutan loading dye lalu dimasukkan ke dalam sumur. Power supply dinyalakan sebesar 100 volt selama 45 menit. Hasil elektroforesis gel agarosa diamati dibawah sinar UV GelDoc dengan program Quantity One (Biorad). Isolasi DNA Pengkode Reverse Transcriptase dari Gel Agarosa (Qiagen 2006). Isolasi DNA dari gel agarosa dilakukan berdasarkan metode MinElute dari Qiagen. Hasil positif elektroforesis gel agarosa 1% diambil dari gel keseluruhan. Gel tersebut dimasukkan ke dalam tabung bertutup ulir yang telah ditimbang bobotnya. Gel dan tabung ditimbang, bobot gel merupakan selisih berat tersebut dengan tabung bertutup ulir yang kosong. Bufer QG ditambahkan pada gel sebanyak 3x dari bobot gel dikali 10 µL. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 50oC selama 10 menit dan setiap dua menit larutan dikocok. Isopropanol ditambahkan sebanyak bobot gel dikali 10 µL. Semua larutan dipindahkan ke kolom kemudian disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 17900 g. Supernatan dibuang kemudian 500 µL bufer QC ditambahkan. Kolom disentrifugasi kembali dengan kecepatan dan waktu yang sama.
Tabel 1 Daftar primer yang digunakan dalam penelitian ini Primer
Sekuen
RT I fordward
5'- CACCATGAGCCTGTTTGGGTTGAT-3'
RT I reverse
5'- CATGCCTTGAGGCAACACTTTCCA-3'
RT II fordward
5'- CACCATGCCCATTACATGGAAGTCA-3'
RT II reverse
5'- ATGGATCTTGTAGCTGTACCTTTTC-3'
RTIII fordward
5'- CACCATGCCATCCCAAATTC-3'
RTIII reverse
5'- AGACGTAAGGGCTGCTTCAG-3'
M13 fordward
5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’
M13 reverse
5’-CAGGAAACAGCTAT GAC-3’
T7 promotor
5´- TAATACGACTCACTATAGGG- 3´
8
Sebanyak 750 µL bufer PE ditambahkan kemudian diinkubasi 2 sampai 3 menit lalu disentrifugasi kembali. Supernatan dibuang kemudian kolom kosong disentrifugasi. Kolom dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifus. Sebanyak 10 µL bufer elusi ditambahkan kemudian diinkubasi selama 5 menit dan disentrifugasi. Molekul DNA hasil ekstraksi gel dihasilkan dalam tabung mikrosentrifus. Pembuatan Medium Luria Bertani (LB). Pembuatan medium padat diawali dengan ditambahkannya 6.4 gram agar Luria Bertani (LB) pada 200 mL dH20. Campuran tersebut dikocok dan dididihkan sampai mendidih. Larutan agar yang telah dididihkan dimasukkan ke dalam autoklaf dengan tekanan 15 Psi. Kanamisin dengan konsentrasi 200 µg/mL akan ditambahkan ke dalam larutan yang telah steril tersebut. Sebanyak 3 mL larutan agar tersebut ditempatkan ke dalam cawan. Medium cair dibuat dengan prosedur yang sama dan diawali dengan penambahan medium LB broth sebanyak 2 gram dalam 100 ml dH20 dan disimpan dalam botol. Penyisipan Gen Pengkode Reverse Transcriptase dengan PENTR/SD/TOPO (Invitrogen 2007). Penyisipan gen pada vektor cloning dilakukan berdasarkan metode pENTR Directional TOPO Cloning Kits dari Invitrogen. Amplikon gen pengkode reverse transcriptase asal SRV-2 hasil isolasi dari gel agarosa disisipkan pada pENTR/SD/TOPO. Tahap awal pengklonan gen dilakukan dengan dibuatnya formula yang mengandung 3 µL DNA PCR product, 1 µL salt solution, 1 µL steril water, dan 1 µL TOPO vektor. Sebanyak 2 µL formula tersebut ditambahkan pada bakteri E.coli dan dikocok. Campuran tersebut diinkubasi selama 5 menit kemudian diberi perlakuan heatshock pada 42oC selama 30 detik. Campuran tersebut setelah diberi perlakuan heatshock didinginkan dalam es. Sebanyak 250 µL medium SOC ditambahkan pada campuran lalu diinkubasi selama 1 jam dan dihomogenkan. Campuran digoreskan pada medium padat dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Hasil pengklonan diamati setelah 24 jam, klon yang positif ditandai dengan bakteri berwarna putih yang tumbuh dalam cawan. Bakteri tersebut dipindahkan pada media LB kaldu yang diberi amfisilin, selanjutnya diinkubasi selama 24 jam.
Isolasi Plasmid pENTR/SD/TOPO. (Qiagen 2006). Isolasi plasmid dilakukan dengan metode QIAprep Miniprep dari Qiagen. Hasil positif pengklonan dipindahkan dari medium padat ke medium cair. Koloni putih pada medium padat diambil dengan kawat ose dipindahkan ke medium cair. Medium cair diinkubasi pada suhu 37oC. Hasil positif diperoleh apabila pada medium cair terjadi kekeruhan. Hasil yang positif dipindahkan ke dalam tabung bertutup ulir lalu disentrifugasi selama 3 menit pada kecepatan 17900 g. Sebanyak 250 µL bufer P1, 250 µL P2, dan 350 bufer N3 ditambahkan secara berurutan pada pelet yang dihasilkan. Pengocokan dilakukan setelah penambahan bufer P2 dan N3 dengan tidak menggunakan sentrifus. Campuran disentrifugasi pada kecepatan 17900 g selama 10 menit. Campuran kemudian dipindahkan dari tabung ke kolom. Kolom disentrifugasi 1 menit pada 17900 g. Supernatan hasil sentrifus dibuang. Sebanyak 750 µL bufer PE ditambahkan lalu disentrifugasi selama 1 menit, langkah ini dilakukan sebanyak dua kali. Supernatan hasil sentrifus dibuang. Kolom disentrifugasi kembali dalam keadaan kosong kemudian alas kolom akan dipindahkan pada tabung Eppendorf. Bufer EB ditambahkan sebanyak 50 µL pada kolom lalu disentrifugasi selama 1 menit. Plasmid DNA telah didapat. Analisis pENTR/SD/TOPO dengan Teknik PCR dan Teknik Penentuan Urutan DNA. Plasmid yang didapat selanjutnya dianalisis untuk melihat ada atau tidak adanya gen sisipan reverse transcriptase dalam pENTR/SD/TOPO. Analisis dilakukan menggunakan teknik PCR dan teknik penentuan urutan DNA. Teknik PCR dilakukan untuk mengamplifikasi plasmid pada daerah vektor pada posisi M13 dan reverse transcriptase. Primer yang digunakan adalah: M13 fordward, M13 reverse, dan primer spesifik untuk reverse transcriptase. Untuk melihat arah dan urutan nukleotida dari sampel plasmid tersebut dilakukan teknik penentuan urutan DNA di Macrogen Inc. Seoul-Korea. Primer yang digunakan adalah M13 fordward dan M13 reverse. Analisis terhadap hasil penentuan urutan DNA dilakukan menggunakan program Basic Local Aligment Search Tool (BLAST) dari National Center Bioinformatic Information (NCBI).
9
Rekombinasi Gen Pengkode Reverse Transcriptase dalam pENTR/SD/TOPO terhadap pDEST17 (Invitrogen 2008). Plasmid dengan sisipan gen yang tepat dan urutan nukleotida yang sesuai selanjutnya direkombinasikan dengan pDEST17. Tahap awal rekombinasi gen dari pENTR/SD/TOPO pada pDEST17 dilakukan dengan dibuatnya formula untuk masing-masing sampel yang mengandung 3 µL plasmid hasil klon pertama , 1 µL pDEST17, 4 µL bufer TE pH 8.0 . Sebanyak 2 µL LR clonase ditambahkan pada formula tersebut dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 25oC. Proteinase K ditambahkan setelah inkubasi sebanyak 1 µL, inkubasi dilakukan kembali namun pada suhu 37 oC selama 10 menit. Sebanyak 1 µL formula yang mengandung LR clonase ditambahkan pada 50 µL bakteri E.coli DH5α dan dikocok. Campuran tersebut diinkubasi dalam es selama 30 menit kemudian diberi perlakuan heatshock pada 42oC selama 30 detik. Campuran tersebut setelah diberi perlakuan heatshock didinginkan dalam es. Sebanyak 450 µL medium SOC ditambahkan pada campuran lalu diinkubasi selama 1 jam dan dihomogenkan. Sebanyak 20 µL campuran digoreskan pada medium padat dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Hasil pengklonan diamati setelah 24 jam, klon yang positif ditandai dengan koloni berwarna putih yang tumbuh dalam cawan. Isolasi plasmid dilakukan dengan metode yang sama dalam mengisolasi plasmid pENTR/SD /TOPO. Analisis pDEST17 dengan Teknik PCR dan Teknik Penentuan urutan DNA. Analisis rekombinasi antara sisipan gen target dari pENTR/SD/TOPO ke pDEST17 dilakukan dengan teknik PCR. Primer yang digunakan adalah T7 promotor dan primer spesifik reverse transcriptase.
HASIL DAN PEMBAHASAN Amplikon Gen Pengkode Reverse Transcriptase Sumber virus SRV-2 yang digunakan dalam penelitian ini adalah sel A-549 yang telah diinokulasi dengan virus SRV-2. Isolasi DNA dilakukan dengan metode QIAamp DNA Mini Kit and DNA Blood Mini Kit dari Qiagen. Metode tersebut berprinsip menghilangkan komponen yang
mendegradasi DNA dan inhibitor enzim secara efisien menggunakan bufer yang mengubah kondisi pH dan garam sehingga DNA bebas dari kontaminan (Qiagen 2003). Molekul DNA total yang dihasilkan sebanyak 50 µL. Molekul DNA hasil isolasi selanjutnya diamplifikasi dengan teknik PCR menggunakan tiga pasang primer spesifik pengkode reverse transcriptase asal SRV-2. Primer-primer tersebut adalah primer RTI yang mengamplifikasi gen pada posisi 3282-3683, primer RTII pada posisi 3261-3900 dan primer RTIII pada posisi 3169-4133. Sel A-549 merupakan sel carcinoma paru-paru yang sangat mudah diinfeksi oleh SRV-2 (Iskandriati 2004). Isolasi DNA dari sel A-549 yang telah diinokulasi SRV-2 dilakukan melalui proses penghancuran sel, pemurnian DNA, serta pemekatan DNA. Sel A-549 yang diinokulasi virus yang telah tersimpan dalam suhu -196oC dipindahkan ke dalam suhu ruang dan dihangatkan. Sel dihancurkan dengan bufer lisis yang mengandung SDS, EDTA, tris-HCL, NaCl, dan dH2O. Senyawa SDS merupakan detergen yang dapat merusak membran sel. Larutan detergen berfungsi menurunkan tegangan permukaan cairan dan melarutkan lipid sehingga membran sel mengalami degradasi dan organel-organel sel di dalamnya keluar dari sel. Senyawa EDTA merupakan senyawa yang biasa digunakan sebagai pengkhelat logam. Senyawa EDTA dalam penghancuran sel dapat berfungsi sebagai pengikat ion magnesium sebagai prekusor enzim sehingga enzim tidak aktif. Tris- HCl memberikan pH yang optimum agar sel menjadi hancur tanpa menghancurkan asam nukleat di dalam inti. Larutan NaCl berfungsi sebagai larutan isotonik sel yang menjaga tekanan osmotik agar DNA tidak rusak. Pemusnahan protein dilakukan dengan digunakannya enzim proteinase K. Protease K merupakan salah satu Qiagen kit untuk isolasi DNA yang tidak mengandung RNase dan DNase (Qiagen 2003). Aktivitas proteinase tidak bergantung pada logam, dan pH optimum enzim ini 6.5-9.5. Sel yang telah hancur diinkubasi, namun sebelum ditambahkan proteinase K. Hal ini dilakukan agar sel hancur secara merata atau keseluruhan. Proteinase K berfungsi untuk menghidrolisis protein yang ada dalam sel sehingga protein terdenaturasi. Kerja enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, salah satu diantaranya adalah suhu (Pudjiadi 2006).
10
Suhu optimum proteinase K bereaksi dengan substrat adalah 56oC, pada suhu ini proteinase K bekerja dalam laju maksimum sehingga produk yang dihasilkan tepat sasaran (Qiagen 2003). Pemurnian DNA dilakukan dengan teknik presipitasi etanol. Etanol absolut dan etanol 70% digunakan dalam teknik ini untuk membersihkan kontaminan selain DNA. Pemekatan DNA dilakukan dengan metode QIAamp DNA Mini Kit and DNA Blood Mini Kit (Qiagen 2003). Pemekatan DNA dengan metode tersebut menggunakan kolom yang dapat mengikat DNA dan membuang komponen lain yang ada dalam virus selain DNA. Kolom tersebut memiliki komponen berupa silika gel yang dapat mengikat DNA pada kondisi pH rendah. Penambahan larutan garam dengan pH rendah (AW1, AW2) menyebabkan ikatan fosfat pada DNA berikatan kuat dengan kation larutan garam yang memiliki pH rendah tersebut. Ikatan fosfat DNA dengan kation garam lepas ketika kondisi pH berubah menjadi tinggi (Alberts 2008). Penambahan bufer AE yang berisi sodium hidroklorida menyebabkan DNA lepas dari kolom dan ditempatkan pada tabung Eppendorf. Target gen yang diisolasi dalam penelitian ini adalah bagian gen pol yang mengkode enzim reverse transcriptase SRV-2. Urutan nukleotida gen pol pengkode reverse transcriptase asal SRV-2 berada pada posisi 3195-5798 yang akan menyandi sekitar 2603 bp (Gene Bank No. akses AF126467). Isolasi gen pengkode reverse transcriptase dari SRV-2 dilakukan dengan mengamplifikasi urutan nukleotida tersebut melalui teknik PCR menggunakan tiga pasang primer spesifik pengkode enzim reverse transcriptase. Primer-primer tersebut adalah primer RTI yang mengamplifikasi gen pada posisi 3282-3683, primer RTII pada posisi 3261-3900 dan primer RTIII pada posisi 3169-4133. Pemilihan tiga posisi gen pada daerah gen pol SRV-2 dengan ketiga pasang primer tersebut dimaksudkan untuk kemungkinan daerah yang mempunyai aktivitas enzim paling baik jika kemudian gen-gen yang diisolasi tersebut digunakan untuk tujuan pembuatan protein rekombinan. Pasangan primer RTI mengamplifikasi daerah sisi aktif (active site) dari enzim RT I (401 bp), pasangan primer RTII mengamplifikasi daerah yang lebih besar dari sisi aktif enzim (639 bp), sedangkan pasangan primer RTIII
akan mengamplifikasi daerah pengkode keseluruhan gen pengkode reverse transcriptase (964 bp). Amplifikasi terhadap gen target reverse transcriptase dilakukan menggunakan enzim DNA polimerase Pfu. Enzim Pfu ini merupakan DNA polimerase yang berasal dari bakteri Pyrococcus furiosis dengan berat molekul 92 kD. Enzim ini diketahui mempunyai laju kesalahan yang paling kecil dalam sintesis untai asam nukleat dibandingkan dengan enzim DNA polimerase lainnya (Yuwono 2006). Hasil amplifikasi PCR dengan enzim ini menghasilkan amplikon yang berujung tumpul (blunt end) sehingga akan memudahkan konstruksi gen ke dalam vektor cloning yaitu pENTR/SD/TOPO dengan metode Gateway dari Invitrogen. Hasil amplifikasi PCR dengan ketiga pasang primer tersebut menghasilkan pita spesifik masing-masing 401 bp, 639 bp, dan 964 bp (Gambar 5). Besar bp yang dihasilkan sesuai dengan panjang bp hasil amplifikasi seharusnya oleh primer yang dirancang. Hasil tersebut menunjukkan bahwa primer yang dirancang dan kondisi PCR yang dilakukan sudah benar . Amplikon gen pengkode reverse transcriptase kemudian diisolasi dari gel agarosa dengan metode Qiagen MinElute. Dasar dari metode tersebut sama dengan isolasi DNA yang dilakukan dengan metode QIAamp DNA Mini Kit and DNA Blood Mini
1500 bp
900 bp
964 bp
600 bp
639 bp 401 bp
100 bp
Marker
RTI RTII RTIII
Gambar 5 Hasil amplifikasi gen reverse transcriptase menggunakan tiga pasang primer spesifik reverse trancriptase RTI 401 bp, RTII 639 bp, dan RTIII 964 bp.
11
Kit (Qiagen 2003) yaitu pelekatan DNA pada silika gel yang merupakan komponen dari spin kolom. Amplikon yang berhasil diisolasi dari gel agarosa pada penelitian ini volumenya sebesar 60 µL. Identifikasi amplikon dari gel agarosa dilakukan dengan teknik PCR menggunakan primer spesifik RT untuk membuktikan bahwa amplikon benar-benar terisolasi. Hasil identifikasi dapat dilihat pada Lampiran 6. Hasil ini menunjukkan bahwa amplikon benar-benar terisolasi. Sisipan Gen Pengkode Reverse Transcriptase pada pENTR/SD/TOPO Amplikon hasil isolasi dari gel agarosa selanjutnya disisipkan pada pENTR/SD/TOPO sebagai vektor cloning. Sisipan amplikon atau gen pengkode reverse transcriptase asal SRV-2 selanjutnya dianalisis untuk mengetahui bahwa target gen telah tersisipkan. Analisis dilakukan dengan teknik PCR menggunakan primer M13 forward dan M13 reverse. Penentuan urutan DNA pun dilakukan untuk memastikan tidak ada perubahan urutan DNA dalam sisipan target gen pada pENTR/SD/TOPO. PENTR/SD/TOPO merupakan vektor cloning yaitu vektor yang akan memperantarai masuknya target gen RT ke dalam vektor ekspresi E.coli melalui pDEST sebagai vektor destinasi (Invitrogen 2007). PENTR/SD/TOPO berukuran 2601 bp yang mengandung gen Ribosome Binding Site (RBS) yang memungkinkan terjadinya ekspresi target gen di dalam vektor ekspresi E.coli. Vektor ini mengandung gen yang resisten terhadap kanamisin sehingga dapat digunakan untuk seleksi koloni E.coli yang mengandung target gen. Prinsip kerja dari pengklonan gen pada pENTR/SD/TOPO berdasarkan kerja enzim topoisomerase I virus vaccinia yang akan mengikat DNA dupleks pada sisi spesifik CCCTT dan memecah ikatan fosfodiester pada salah satu untainya (Shuman 1991). Energi dari ikatan fosfodiester yang dipecah, disimpan dengan membentuk ikatan kovalen antara 3’-fosfat dari untai yang dipecah dan residu tirosil (Tyr-274) dari topoisomerase I (Shuman 1994). Ikatan fosfotirosil antara DNA dan enzim akan bereaksi dengan 5’hidroksil dari untai yang dipecah, menyebabkan reaksi balik, dan melepaskan topoisomerase (Shuman 1994).
Penggabungan DNA untai ganda menggunakan oligonukleotida bermuatan – TOPO terjadi melalui penambahan ujung runcing (overhang) 3’ GTGG terhadap DNA yang masuk. Untai tunggal overhang ini identik dengan ujung 5’ DNA untai ganda yang bermuatan TOPO (Shuman 1994). Hal ini mengakibatkan primer spesifik reverse transcriptase dirancang dengan menambahkan sekuen CACCATG pada ujung 5’nya (Saepulloh 2007). Untai overhang ini menginvasi ujung 5’ dari amplkon, menempel pada basa yang ditambahkan, dan menstabilkan amplkon pada orientasi yang benar (Gambar 6) (Invitrogen 2007). Target gen akhirnya tergabung ke dalam pENTR/SD/TOPO, selanjutnya pENTR/SD /TOPO ditransformasi pada E.coli TOP 10. Metode kejut panas pada suhu 42oC dilakukan sebagai metode untuk mentransformasikan vektor pENTR/SD /TOPO ke dalam E.coli TOP 10. Kumpulan sel E.coli yang diharapkan mengandung pENTR/SD/ TOPO yang tersisipi gen target ditumbuhkan pada media Luria Bertani (LB) agar dan LB kaldu untuk peremajaan dan isolasi plasmid. Pertumbuhan E.coli juga diinduksi oleh SOC, yaitu SOB (Super Optimum Broth) dengan penambahan glukosa untuk menginduksi pertumbuhkan bakteri yang mengalami rekayasa genetik.
Gambar 6 Mekanisme kerja enzim I terhadap topoisomerase amplikon (Invitrogen 2007).
12
Bakteri yang telah tersisipkan target gen pengkode reverse transcriptase tumbuh pada media LB agar yang diberi kanamisin karena plasmid yang tersisipkan gen pengkode reverse transcriptase resisten terhadap kanamisin. Bakteri yang tersisipkan target gen pengkode reverse transcriptase tumbuh sebagai bakteri berwarna putih. Kumpulan bakteri tersebut sebelum diisolasi plasmidnya dipindahkan pada media LB kaldu yang ditambahkan kanamisin. Hal ini bertujuan untuk memperbanyak koloni mempermudah isolasi plasmid. Isolasi plasmid dilakukan dengan metode QIAprep dari Qiagen. Prinsip dari isolasi plasmid ini adalah perpaduan antara lisis alkali dan metode spin kolom (Qiagen 2006). Pelet bakteri E.coli ditambahkan bufer lisis (bufer P1) untuk menghancurkan komponen bakteri termasuk RNA kecuali DNA. Komponen bakteri yang hancur tersebut ditambahkan larutan basa pH tinggi (bufer P2) untuk memisahkan antara DNA kromosom non-supercoil dengan DNA plasmid supercoil. Larutan basa pH tinggi akan mengudarkan DNA dengan konfigurasi non-supercoil (Greene & Rao 1998). Penambahan larutan asam (bufer N3) yang mengandung Three Chloro Acetic Acid (TCA) membuat protein dan DNA nonsupercoil menjadi seperti benang kusut dan mengendap dengan teknik sentrifugasi (Greene & Rao 1998). Plasmid hasil isolasi dianalisis dengan teknik PCR menggunakan primer M13 fordward dan M13 reverse. Primer ini mengamplifikasi situs M13 forward dan M13 reverse pada pENTR/SD/TOPO. Gen target akan tersisipkan diantara posisi M13 forward dan M13 reverse pada pENTR /SD/TOPO. Hasil analisis pENTR/SD /TOPO dengan teknik PCR menghasilkan penambahan pasang basa pada amplkon sebesar 342 bp. Adanya penambahan basa sebesar 342 bp menunjukkan bahwa adanya kombinasi pasang basa antar target gen dan pENTR/SD/TOPO sesuai dengan primer yang digunakan (Lampiran 7). Amplikon dengan primer RTI mengalami penambahan 342 bp sehingga besarnya menjadi 743 bp, begitu pula pada amplikon dengan primer RTII dan RTIII sehingga besar bp yang dihasilkan pada analisis sisipan target gen dalam pENTR/SD/TOPO menjadi 981 bp dan 1306 bp (Gambar 7-9). Hal ini membuktikan bahwa gen pengkode reverse transcriptase asal SRV-2 berhasil tersisipkan pada pENTR/SD/TOPO.
12000 bp 5000 bp 2000 bp 1000 bp 743 bp
100 bp 1
2
3 4
5
Gambar 7 Elektroforegram pENTR/SD /TOPO dengan primer M13 sisipan amplikon RT I :1) 1 kbp Marker, 2-5) pENTR /SD/TOPO.
12000 bp 5000 bp 2000 bp 1000 bp 981 bp
100 bp 1
2
3 4
5
Gambar 8 Elektroforegram pENTR/SD /TOPO dengan primer M13 sisipan amplikon RT II :1) 1kbp Marker, 2-5) pENTR /SD/TOPO
12000 bp 5000 bp 2000 bp 1000 bp
1306 bp
100 bp 1 Gambar 9
2
3 4
5
Elektroforegram pENTR/SD /TOPO dengan primer M13 sisipan amplikon RT III :1) 500 bp Marker, 2-5) pENTR /SD/TOPO.
13
Plasmid yang diperoleh, setelah dianalisis dengan teknik PCR selanjutnya dianalisis urutan nukleotidanya dengan teknik penentuan urutan DNA (DNA sequencing) untuk benar-benar meyakinkan bahwa telah terjadi penyisipan target gen pengkode reverse transcriptase pada pENTR/SD/TOPO. Penentuan urutan DNA dilakukan oleh Macrogen Inc, Seoul-Korea Selatan. Hasil penentuan urutan DNA dianalisis dengan teknik BLAST dari NCBI. Teknik BLAST dari NCBI merupakan teknik bioinformatika untuk menganalisis urutan DNA yang homolog dari satu organisme dengan organisme lainnya (Anonim 2010). Teknik ini merupakan teknik yang umum digunakan untuk menganalisis hasil penentuan urutan DNA. Hasil penentuan urutan DNA dari Macrogen yang berupa urutan DNA sisipan gen pengkode reverse transcriptase daerah amplifikasi primer RTI dalam pENTR/SD /TOPO dimasukan dalam kolom urutan DNA contoh dalam situs BLAST dari NCBI. Pencarian urutan DNA yang memiliki kemiripan dilakukan dengan memilih program BLASTn. Program tersebut bekerja dengan mencari perbandingan kemiripan urutan DNA pada satu organisme dengan organisme lain. Hasil BLASTn menunjukkan bahwa 99% urutan DNA contoh sama dengan DNA pengkode reverse transcriptase asal SRV-2 pada posisi 32823683 (posisi primer RTI). Begitu pula hasil yang ditunjukkan oleh gen pengkode reverse transcriptase posisi RTII dan RTIII. Hasil analisis menunjukan adanya sisipan target gen pengkode reverse transcriptase SRV-2 di dalam pENTR /SD/TOPO dengan arah dan urutan yang benar tanpa ada pergeseran pada bingkai baca (frame shifting). Hasil analisis penentuan urutan DNA juga menunjukkan adanya urutan DNA bagian dari situs attL1 dan attL2 yang mengapit gen pengkode reverse transcriptase asal SRV-2. Urutan DNA situs
attL1 dan attL2 diketahui dengan membandingkan urutan DNA hasil penentuan DNA dari Macrogen dengan urutan DNA attL1 dan attL2 sebenarnya berdasarkan Invitogen 2007 (Lampiran 810). Rekombinan Gen Pengkode Reverse Transcriptase dalam pDEST17 Plasmid pENTR/SD/TOPO yang telah dianalisis dan tersisipi gen pengkode reverse transcriptase asal SRV-2 selanjutnya direkombinasikan dengan vektor destinasi yaitu pDEST17 dari Invitrogen. Isolasi plasmid rekombinan dilakukan dengan metode yang sama seperti yang digunakan pada isolasi plasmid vektor cloning (pENTR/SD/TOPO). Isolasi plasmid dilakukan setelah rekombinasi kemudian plasmid dianalisis dengan teknik PCR. Vektor cloning (pENTR/SD/TOPO) direkombinasi dengan vektor destinasi (pDEST17) dengan bantuan enzim LR clonase. PDEST17 dilengkapi dengan sisi attR dengan sisi ccdb yang melekat di attR. Rekombinasi terjadi dengan bantuan enzim LR clonase didorong dengan adanya integrase dan Integrase Hose Factor (IHF). Enzim LR clonase memotong gen target dari sisi attL di pENTR/SD/TOPO dan sisi ccdb dari attR di pDEST17. Enzim integrase dan IHF mengintegrasi gen pengkode reverse transcriptase pada sisi attR di pDEST17 dan sisi ccdb pada attL di pENTR/SD/TOPO setelah 60 menit pemotongan (Gambar 10). PDEST17 memiliki gen resisten amfisilin sehingga dapat dijadikan seleksi apabila pDEST17 ini ditransformasikan pada sel E.coli DH5α, sel E.coli yang mengandung pDEST17 dapat tumbuh dalam media yang diberi amfisilin. Analisis pDEST17 dilakukan dengan teknik PCR menggunakan primer T7 promotor dan primer RT reverse. Primer T7 promotor merupakan primer universal untuk
Gambar 10 Reaksi rekombinasi LR clonase (Invitrogen 2008).
14
mengamplifikasi daerah T7 promotor. T7 promotor adalah daerah promotor dari T7 RNA polimerase. Enzim ini diekspresikan oleh bakteriofage T7. Enzim ini mengatalisis sintesis RNA utas tunggal dan biasa digunakan untuk transkripsi in vitro, preparasi pelabelan RNA, dan sintesis RNA untuk translasi in vitro (Reece 2004). Adanya T7 promotor dalam pDEST yang tersisipi gen pengkode reverse transcriptase diharapkan akan terjadi sintesis RNA secara in vitro dalam sel ekspresi E.coli, selanjutnya terjadi translasi in vitro sehingga gen pengkode reverse transcriptase dapat diekspresikan menjadi enzim reverse transcriptase. Enzim reverse transcriptase ini diharapkan memiliki aktivitas spesifik sehingga dapat diaplikasikan dalam teknik RT-PCR. Hasil amplifikasi menunjukkan pita DNA berukuran 769 bp untuk RT I, 1007 bp untuk RT II, dan 1332 bp untuk RTIII (Gambar 11-13). Adanya penambahan pasang basa sebesar 368 bp dari amplikon gen pengkode reverse transcriptase asal SRV-2 menunjukkan adanya kombinasi pasang basa dari gen target dengan pDEST17 dari posisi T7 promotor sampai dengan posisi akhir gen pengkode enzim reverse transcriptase asal SRV-2. Sebagai contoh untuk pita pDEST17 yang tersisipi RT I menghasilkan 769 bp yang berasal dari 401 bp amplikon RTI dan 368 bp merupakan pasang basa bagian dari pDEST17 (Lampiran 11). Hal ini membuktikan bahwa target gen pengkode reverse transcriptase telah tersisipkan dalam pDEST17.
1500 bp 1007 bp
900 bp 600 bp
100 bp 1 Gambar 12
2 3 4
5
Elektroforegram pDEST17 primer T7 dengan promotor forward dan RT II reverse rekombinan amplikon RT II :1) 100 bp Marker, 2-5) pDEST17.
12000 bp 5000 bp 2000 bp 1332 bp
1000 bp
100 bp 1 Gambar 13
2 3 4
5
Elektroforegram pDEST17 primer T7 dengan promotor forward dan RT III reverse rekombinan amplikon RT III :1) 1 kbp Marker, 2-5) pDEST17.
SIMPULAN DAN SARAN 1500 bp 900 bp 769 bp
600 bp
100 bp 1 Gambar 11
2
3
4
5
Elektroforegram pDEST17 primer T7 dengan promotor forward dan RT I reverse rekombinan amplikon RT I :1) 100 bp Marker, 2-5) pDEST17.
Simpulan Gen pengkode reverse transcriptase berhasil diisolasi dari sel A-549 yang diinokulasi dengan SRV-2. Amplifikasi gen pengkode reverse transcriptase dengan teknik PCR menghasilkan pita spesifik untuk RT I sebesar 401 bp, RT II sebesar 639 bp, dan RTIII sebesar 964 bp. Hasil analisis pENTR /SD/TOPO dan pDEST17 menunjukan bahwa gen target reverse transcriptase berhasil tersisipkan pada masing-masing plasmid. Penelitian ini membuktikan bahwa gen pengkode reverse transcriptase asal SRV-2 telah berhasil diisolasi, dikonstruksi pada vektor cloning, dan direkombinasikan pada vektor destinasi E.coli.
15
Saran Saran untuk penelitian ini adalah setelah gen pengkode reverse transcriptase berhasil direkombinasikan dalam pDEST17, perlu dianalisis dengan teknik penentuan urutan DNA untuk meyakinkan bahwa hasil yang didapat tidak mengalami perubahan urutan nukleotidanya. Ekspresi gen pengkode reverse transcriptase pada sel E.coli harus dilakukan untuk menghasilkan enzim reverse transcriptase rekombinan. Enzim rekombinan tersebut diharapkan dapat memiliki aktivitas spesifik sehingga dapat diaplikasikan dalam teknik RT-PCR.
DAFTAR PUSTAKA Atanassov et al.. 2009. A simple, flexible and efficient PCR- fusion/ Gateway cloning procedure for gene fusion, site-directed mutagenesis, short sequence insertion and domain deletions and swaps. Plants Methods 5:14. Alberts B. 2008. Molecular Biology of The Cells. London : Garland Science. Carter J, Saunder V. 2007. Virology Principles and Aplication. West Sussex: John Willey and Sons Ltd. Baker DG. 2003. Natural Pathogen of Laboratory Animal, Their Effect on Research. Washington DC: ASM Pr. Coffin JM, Hughes SH, Varmus HE. 1997. Retriviruses. New York: Cold Spring Harbor Lab Pr. Cote ML, Roth MJ. 2008. Murine Leukimia Reverse Transcriptase: Struktural Caomparison with HIV-1 Reverse Transcriptase. Virus Res 134: 186202. Dubin MJ, Bowler C, Benvenuto G. 2008. A modified Gateway cloning strategy for overexpressing tagged proteins in plants. Plant methods 4:1-11. Glick B, JJ Pasternack. 1994. Molecular Biotechnology: principle and Applications of Recombinant DNA. Washington DC: American Society for Microbiology. Fridman EP. 2002. Medical Primatology. London: Taylor and Francis.
Goodsell DS. 2002. Reverse Transcriptase. www.rscb.com/ pdb.html [19 Januari 2010] Greene JJ, Rao VB. 1998. Recombinant DNA Principles and Methodologies. California : CRC Pr. Invitrogen. 2007. pENTR Directional TOPO Cloning Kits. Carslosd: Invitrogen Invitrogen. 2008. E.coli Expression System with Gateway Technology. Carslosd: Invitrogen. Iskandriati D. 2004. Identification and characterization of type D Simian Retrovirus from Macaca fascicularis, M.nemestrina, and Presbytis sp in Indonesia [disertasi]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Lerche NW, Heneine W, Kaplan JE, Spira T, Yee JL, Khabbaz RF. 1995. An expanded search for human infection with simian type D retrovirus. AIDS Res Hum Retroviruses 11: 527-529. Mishra et al. 2010. Molecular detection of Mycobacterium tuberculosis in formalin fixed, paraffin embedded tissues and biopsies gastrointestinal specimens using real time polymerase chain reaction system. Turk J Gastroenterol 2: 129-134. Mizuno M, Yasukawa K, Inouye K. 2009. Insigh into the mechanism of the stabilization of Molony Murine Leukimia Virus reverse transcriptase by eliminating RNase H activity. J. Biosci. Biotechnol. Biochem 74 : 440442. Poedjiadi A. 2006. Dasar-Dasar Biokimia Ed Revisi. Jakarta: UI Press. Qiagen. 2003. QIAamp DNA Mini Kit and DNA Blood Mini Kit Handbook. USA: Qiagen. Qiagen. 2006. MinElute Handbook. USA: Qiagen. Qiagen. 2006. QIAprep Miniprep Handbook. USA:Qiagen. Reece RJ. 2004. Analysys of Genes and Genomes. West Susssex: John Willey and Sons Pb.
16
Saepulloh U. 2007. Ekspresi protein rekombinan envelop Simian Retrovirus Tipe-D Serotipe-2 (SRV2) dalam biakan sel serangga menggunakan sistem ekspresi vektor Baculovirus [tesis]. Jakarta: Program Magister Ilmu Biomedik, Universitas Indonesia. Sambrook et al.. 1989. Molecular Cloning a Laboratory Manual. Ed ke-2. New York: Cold Spring Harbor Lab Pr. Shuman S. 1991. Recombination mediated virus DNA by vaccinia topoisomerase I in Escherichia coli in sequence specific. Proc Natl Acad Sci 88 : 10104-10108. Shen
GM et al. 2010. Evaluation of endogenous references for gene expression profiling in different tisues of the oriental fruits fly Bactosera dorsalis. BMC Mol Biol 1:76.
Shuman S. 1994. Novel approach to molecular cloning and polynucleotide synthesis using vaccinia DNA Topoisomerase. J Biol Chem 269 : 32678-32684. Skalka
MA, Goff PS. 1997. Reverse transcriptase. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Staheli et al.. 2006. Genetic variability of envelope gene of type Simian Retrovirus 2 (SRV-2) subtypes associated with SAIDS related retroperitoneal fibromatotis in different macaques species. J Virol 3:11. Strauss JH, Strauss EG. 2002. Viruses and Human Diseases. San Diego: Academic Pr. Teutschbein J et al. 2010. Gene expression analysis after receptor tyrosine kinase activation reveals new potential melanoma proteins. BMC Cancer 10:386. Van Dyke et al. 2008. Toxicities associated with dual nucleoside reverse transcriptase inhibitor regimens in HIV infected children. J Infect Dis 11: 1599-1608. Vandenberg JL. 1996. Genetic of Nonhuman Primatas. Bennet BT, Abee CR,
Henricson R,editor. Academy Pr.
San
Diego:
Wong L, Pearson H, Fletcher A, Marquis CP, Mahler S. 1998. Comparison of the efficiency of Moloney Murine Leukaemia Virus (M-MuLV) reverse Transcriptase, Rnase H -M-MuLV reverse transcriptase and Avian Myeloblastoma Leukaemia Virus (AMV) reverse transcriptase for the amplification of human immunoglobulin genes. Biotech nology technique 12: 485-489. Yuwono T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Yogyakarta : ANDI OFFSET.
17
LAMPIRAN
18
Lampiran 1 Diagram Alir Penelitian
Isolasi DNA sel A549/SRV-2
Amplifikasi Gen Pengkode Reverse Transcriptase dengan Teknik PCR: • Primer RT I • Primer RT II • Primer RTIII
Konstruksi Gen Pengkode Reverse Transcriptase pada Vektor Cloning (pENTR /SD /TOPO) dan Isolasi Plasmid
Rekombinasi Gen Pengkode Reverse Transcriptase pada Vektor Ekspresi ( pDEST) dan Isolasi Plasmid
Elektroforesis Gel Agarosa Isolasi DNA dari Gel Agarosa
Analisis plasmid dengan: • Teknik PCR dan • Penentuan urutan DNA
Analisis plasmid dengan Teknik PCR
19
Lampiran 2 Ekstraksi DNA (Qiagen 2003)
Sampel
Penghancuran Sel dengan Bufer Lisis (NaCl, EDTA, SDS) dan Proteinase K
SEL LISIS + Etanol 95%
Kolom Sentrifus 10000 rpm Cuci (Bufer AW 1 dan AW 2) Sentrifus 8000 rpm Elusi (Bufer Elusi (BE)) Sentrifus 8000 rpm DNA murni
20
Lampiran 3 Ekstraksi DNA dari gel agarosa (Qiagen 2003)
Bufer QG
Bufer BE
Sentrifus 10.000 rpm, 1 menit Gel agarosa Inkubasi 5 menit DNA murni Bufer PE
Isopropanol 170 µL Sentrifus 10.000 rpm, 1 menit
Bufer QC Sentrifus 10.000 rpm, 1 menit
21
Lampiran 4 Isolasi plasmid E.coli (Qiagen 2003)
22
Lampiran 5 Prinsip kerja topoisomerase I dalam pemasukan gen ke dalam vektor (Invitrogen 2004)
23
Lampiran 6 Hasil identifikasi DNA dari gel agarosa dengan teknik PCR 1500 bp 900 bp 600 bp
100 bp
Marker
RTI RTII RTIII
24
Lampiran 7 Besar amplikon hasil analisis pENTR/SD/TOPO dengan primer M13 forward dan M13 reverse
•
Hasil besar bp yang teramplifikasi primer M13 forward dan M13 reverse M13 forward-M13 reverse = 342 bp Amplikon RT I = 401 bp Jumlah bp teramplifikasi = 743 bp
•
Hasil besar bp yang teramplifikasi primer M13 forward dan M13 reverse M13 forward-M13 reverse = 342 bp Amplikon RT II = 639 bp Jumlah bp teramplifikasi = 981 bp
•
Hasil besar bp yang teramplifikasi primer M13 forward dan M13 reverse M13 forward-M13 reverse = 342 bp Amplikon RT III = 964 bp Jumlah bp teramplifikasi = 1306 bp
25
Lampiran 8 Hasil penentuan urutan DNA RTI
attL1
RTI
attL2
CCAAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCNA CAAATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAA AAGCAGGCTCCGCGGCCGCCTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGCCCTTC ACCATGAGCCTGTTTGGGTTGATCAATGGCCCCTAACTCAAGAAAAAC TTACTGCTGCCCACAGTTAGTGCAAGAACAATTACAGGCAGGGCATA TTATAGAAAGTAATTCCCTGGAATACACCTATATTTGTCATAAAAAAG AAGTCTGGTAAATGGAGGCTTTTGCAAGATTTAAGGGCGGTAAATGC CACCATGGTATTGATGGGAGCTCTCCAACCTGGGCTGCCCTCACCAGT GGCTATTCCTCAGGGATATTTTAAAATAGTCATTGATCTTAAAGATTG TTTTTTTACTATCCCCCTTCAGCCCGTTGATCAAAAGCGCTTTGCTTTT AGTCTCCCGTCTACCAACTTTAAACAACCAATGAAACGTTATCAATGG AAAGTGTTGCCTCAAGGCATGAAGGGTGGGCGCGCCGACCCAGCTTT CTTGTACAAAGTTGGCATTATAAGAAAGCATTGCTTATCAATTTGT TGCAACGAACAGGTCACTATCAGTCAAAATAAAATCATTATTTGC
26
Lampiran 9 Hasil penentuan urutan DNA RTII
attL1
RTII
attL2
CCAAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCA ACAAATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAA AAAAGCAGGCTCCGCGGCCGCCTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGCCC TTCACCATGCCCATTACATGGAAGTCAGATGAGCCTGTTTGGGTTGA TCAATGGCCCCTAACTCAAGAAAAACTTGCTGCTGCCCAACAGTTAG TGCAAGAACAATTACAGGCAGGGCATATTATAGAAAGTAATTCTCCC TGGAATACACCTATATTTGTCATAAAAAAGAAGTCTGGTAAATGGAG GCTTTTGCAAGATTTAAGGGCGGTAAATGCCACCATGGTATTGATGG GAGCTCTCCAACCTGGGCTGCCCTCACCAGTGGCTATTCCTCAGGGA TATTTTAAAATAGTCATTGATCTTAAAGATTGTTTTTTTACTATCCCCC TTCAGCCCGTTGATCAAAAGCGCTTTGCTTTTAGTCTCCCGTCTACCA ACTTTAAACAACCAATGAAACGTTATCAATGGAAAGTGTTGCCTCAA GGCATGGCCAATAGTCCTACCTTGTGTCAAAAATATGTAGCTGCTGC TATAGAGCCAATCAGAAAATCTTGGGCACAAATGTATATTATACACT ATATAGATGACATTCTAATAGCAGGGAAGATTGGCGAACAAGTTTTG CAGTGTTTGCTCAACTTAAACAAGCATTGATAACTACTGGGTTACAA ATAGCTCCAGAAAAGTACAGCTACAAGATCCATAAGGGTGGGCGCG CCGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTATAAGAAAGCATT GCTTATCAATTTGTTGCAACGAACAGGTCACTATCAGTCAAAATA AAATCATTATTTG
27
Lampiran 10 Hasil penentuan urutan DNA RTIII
attL1
RTIII
attL2
CCAAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCA ACAAATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAA AAAAGCAGGCTCCGCGGCCGCCTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGCCC TTCACCATGCCATCCCAAATTCAGGACAACTTAACAGAAAAGGATTT GGAAATTTTTAGCTGCGGCCGTTGACATACTTGCACCCCAGAGGTAT GCTGACCCCATTACATGGAAGTCAGATGAGCCTGTTTGGGTTGATCA ATGGCCCCTAACTCAAGAAAAACTTGCTGCTGCCCAACAGTTAGTGC AAGAACAATTACAGGCAGGGCATATTATAGAAAGTAATTCTCCCTG GAATACACCTATATTTGTCATAAAAAAGAAGTCTGGTAAATGGAGG CTTTTGCAAGATTTAAGGGCGGTAAATGCCACCATGGTATTGATGGG AGCTCTCCAACCTGGGCTGCCCTCACCAGTGGCTATTCCTCAGGGAT ATTTTAAAATAGTCATTGATCTTAAAGATTGTTTTTTTACTATCCCCC TTCAGCCCGTTGATCAAAAGCGCTTTGCTTTTAGTCTCCCGTCTACCA ACTTTAAACAACCAATGAAACGTTATCAATGGAAAGTGTTGCCTCAA GGCATGGCCAATAGTCCTACCTTGTGTCAAAAATATGTAGCTGCTGC TATAGAGCCAATCAGAAAATCTTGGGCACAAATGTATATTATACACT ATATGGATGACATTCTAATAGCAGGGAAGATTGGCGAACAAGTTTT GCAGTGTTTTGCTCAACTTAAACAAGCATTGATAACTACTGGGTTAC AAATAGCTCCAGAAAAGGTACAGCTACAAGATCCATATACCTACCTT GGGTTTCAACTTAATGGTCCCAAAATTACCAATCATAAGGCAGTTAT TCGTAGAGATAAGTTGCAAACCCTTAATGATTTTCAAAAACTCTTAG GAGATATCAATTGGCTTAGACCCTATTTGCACCTCACTACAGGAGAT CTAAAACCCCTGTTTGATATCCTAAAAGGGGATTCTAATCCTAACTC ACCCAGATTTTTATCTGAAGCAGCCCTTACGTCTAAGGGTGGGCGCG CCGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTATAAGAAAGCATT GCTTTCAATTTGTTGCAACGAACAGGTCACTATCAGTCAAAATAA AATCATTATTG
28
Lampiran
11
Besar amplikon hasil analisis pDEST17 dengan primer T7 promotor forward dan RT reverse
Blok gen pDEST17 sebelum tersisipi gen
Blok gen pDEST17 setelah tersisipi gen GENE
•
Hasil besar bp yang teramplifikasi primer T7 promotor forward dan RTI reverse T7 Promotor = 20 bp Ribosom Binding Site (RBS) = 7 bp ATG = 3 bp 368 bp 6xHis = 28 bp = 125 bp attR1 Amplikon RT I = 401 bp Jumlah bp teramplifikasi = 769 bp
•
Hasil besar bp yang teramplifikasi primer T7 promotor forward dan RTII reverse T7 promotor-attR1 = 368 bp Amplikon RT II = 639 bp Jumlah bp teramplifikasi = 1007 bp
•
Hasil besar bp yang teramplifikasi primer T7 promotor forward dan RTIII reverse T7 promotor-attR1 = 368 bp Amplikon RT III = 964 bp Jumlah bp teramplifikasi =1332 bp
29
Lampiran 12 Sekuen spesifik, posisi nukleotida, dan fungsinya pada genom pENTR/SD/TOPO Posisi Fungsi nukleotida T1 dan T2 sekuen 268-295 Mencegah terjadinya ekspresi dari terminasi transkripsi 427-470 amplkon yang disisipkan yang kemungkinan berpotensi menyebabkan toksik pada E.coli. Sekuens spesifik
M13 forward (-20) M13 reverse
537-552 845-861
mempermudah analisis sisipan DNA yang diklon dengan teknik sekuensing
attL1 dan attL2
569-668 705-804
sekuens untuk sisi spesifik rekombinasi yang berasal dari lambda-bakteriofage yang memungkinkan terjadinya rekombinasi kloning dari gen yang akan disisipkan ke dalam vektor yang dituju.
TOPO recognition site 1 TOPO recognition site 2
680-684 689-693
sekuen spesifik yang akan dikenali dan berikatan dengan topoisomerase I.
pUC origin of replication 1904-2577 (ori)
berperan dalam memelihara proses replikasi DNA E.coli.
30
Lampiran 13
Sekuen spesifik, posisi nukleotida, dan fungsinya pada genom pDEST17
Sekuen Spesifik
Posisi Nukleotida
T7 Promotor
21-40
Ribosome Binding Site (RBS)
86-92
N-terminal 6x His
113-130
attR1 dan attR2
140-264 1720-1844
Kloramfenikol resisten (CmR)
373-1032
Gen ccdB
1374-1679
T7 terminator transkripsi
1855-1983
bla promotor
2471-2569
Gen Resisten Amfisilin
2570-3430
pBR322 ori
3575-4248
ROP ORF
4619-4810
Fungsi Memungkinkan ekspresi tingkat tinggi pada rekombinan yang diinduksi oleh IPTG Mengoptimalkan jarak pada saat inisiasi dari ATG di Nterminal untuk efisiensi translasi pada amplkon Untuk pemurnian protein rekombinan menggunakan logam pengkhelat seperti ProbondTM atau Ni-NTA Sekuen dari λ bakteriofage yang memungkinkan terjadinya rekombinasi dengan entry clone Marka seleksi pada plasmid Marka seleksi negatif pada plasmid Sekuen dari T7 bakteriofage yang mengefisiensikan terminasi pada proses transkripsi Memungkinkan ekspresi dari gen resisten amfisilin Untuk seleksi plasmid dalam E.coli Titik awal transkripsi yang terjadi pada E.coli Berinteraksi dengan pBR322 ori untuk menghasilkan sedikit copy DNA dalam proses replikasi di E.coli
