PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS BUFFER SERTA KECEPATAN SENTRIFUGASI TERHADAP KUALITAS PRODUK DNA PADA SAPI FRIESIAN HOLSTEIN (FH)
SKRIPSI KOKOM KOMALASARI
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2009
RINGKASAN KOKOM KOMALASARI. D14051702. 2009. Pengaruh Perbandingan Volume Darah dan Lisis Buffer serta Kecepatan Sentrifugasi Terhadap Kualitas Produk DNA pada Sapi Friesian Holstein (FH). Skripsi. Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Pembimbing Utama : Prof. Dr. Ir. Ronny Rachman Noor, MRur.Sc Pembimbing Anggota : Dr. Ir. Endang Tri Margawati, M. Agr.Sc Deoxyribonucleic Acid (DNA) adalah molekul terkecil dari suatu sel berbentuk untai panjang yang membawa informasi genetik dan mengontrol semua fungsi seluler pada semua bentuk kehidupan. DNA diperoleh dengan cara ekstraksi dari jaringan atau darah segar hewan. Terdapat berbagai metode ekstraksi DNA, salah satunya adalah phenol-choroform-isoamyl alcohol (PCI) yang digunakan dalam penelitian ini. Tujuan penelitian ini yaitu mencari perbandingan yang optimal antara volume darah segar dan lisis buffer dengan kecepatan sentrifugasi untuk memperoleh produk DNA yang berkualitas tinggi. Materi penelitian berupa darah segar Friesian Holstein (FH) yang diperoleh dengan cara penyedotan dengan jarum suntik (G18) dari pembuluh darah ekor sapi yang dialirkan ke dalam tabung vacum berisi 15% EDTA, sebanyak ±5 ml per ekor. Darah diperoleh dari 4 ekor sapi sesuai dengan jumlah ulangan (4). Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume darah dan lisis buffer (µl darah : µl lisis buffer), terdapat 3 kombinasi, yaitu 100 : 800, 200 : 700, dan 300 : 600. Faktor kedua yaitu kecepatan sentrifugasi (10.000 rpm dan 12.000 rpm). Dengan demikian terdapat 6 kombinasi perlakuan. Masing-masing perlakuan diulang 4 kali. Data yang dikoleksi berupa konsentrasi DNA dan kemurnian DNA pada rasio OD 260/280 yang diukur dengan GeneQuant DNA calculator. Sementara kualitas DNA dicek melalui gel agarose (1%) yang dialiri listrik 100 voltage selama 1 jam. Data dianalisis dengan sidik ragam (ANOVA). Perbedaan antara perlakuan diuji dengan Tukey pada taraf perbedaan 5% (p<0,05). Hasil penelitian menunjukkan bahwa kombinasi volume darah dan lisis buffer dengan dua kecepatan sentrifugasi yang berbeda tidak berpengaruh terhadap konsentrasi DNA. Konsentrasi DNA relatif lebih tinggi diperoleh pada perlakuan perbandingan volume darah : lisis buffer (300µl : 600µl), konsentrasi DNA relatif meningkat dengan meningkatnya volume darah. Tingkat kemurnian DNA yang diperoleh rata-rata 1,3 (260/280), artinya DNA yang diperoleh masih terbawa bahan kimia lain. Tingkat kemurnian yang optimal yaitu 1,8. Kualitas DNA pada hasil elektroforesis menunjukan hasil berbanding lurus dengan konsentrasi DNA, dan menunjukkan pita tunggal. Kata-kata kunci : darah, ekstraksi DNA, phenol-choroform-isoamyl alcohol (PCI), lisis buffer, kecepatan sentrifugasi
ABSTRACT THE EFFECT OF BLOOD AND BUFFER LYSIS COMPOSITION AND SPINNING SPEED ON DNA YIELDS OF Friesian Holstein (FH) Komalasari, K., R. R. Noor and E. T. Margawati Deoxyribonucleic Acid (DNA) is smallest part (molecule) of a cell in the form of a long chain that carries genetic information and controlling all cellular functional in all life form. The DNA can be obtained by extracting tissue or fresh whole blood of animal. There are several methods of DNA extraction, one of which is phenolchoroform-isoamyl alcohol (PCI) that used in this research. The aim of this research was to determine the best combination of fresh blood and buffer lysis with two differences of spinning speed on DNA quantity and quality. The fresh whole blood of Friesian Holstein (FH) dairy cattle was collected using a vacuum tube (vacutainer) containing 15% EDTA with a 18G needle to suck the blood of tail vena with the amount of ±5 ml per head. A 3x2 factorial completely random design was used. First factor was three combinations of fresh whole blood and buffer lysis volume (µl), i.e., 100 : 800, 200 : 700, and 300 : 600. Second factor was spinning speeds, i.e., 10.000 rpm and 12.000 rpm. There were 6 combination treatments used in this research which replicated 4 times of each treatment. Data of DNA concentration was collected by a GeneQuant DNA calculator at the 260 nm and 280 nm wave length of optical density (OD). The quality of DNA was obtained by running the DNA through electrophoresis with 1% gel agarose and electricity flow of 100 voltage for an hour. The DNA purity was examined at OD 260/280 ratios. DNA concentration and purity were analyzed by using ANOVA, the differences between theatments were tested by tukey test at the level of 5% (p<0.05). The result showed that there was no significant effect of combination of fresh blood and buffer lysis at both spinning speeds (p>0.05). The highest DNA concentration was obtained from the treatment of ratio of 300 µl blood and 600 µl buffer lysis. The DNA concentration tended to increase with the increase of blood volume. The DNA purity was obtained at the ratio of 1.3 (260/280) meaning that the DNA was a slighty contaminated by the chemical used. A ratio of 1.8 is the optimal purity of DNA. The DNA quality linearly correlated to DNA concentration and showed a single band. Keywords: blood, DNA extraction, phenol-choroform-isoamyl alcohol (PCI), buffer lysis, spinning speed
PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS BUFFER SERTA KECEPATAN SENTRIFUGASI TERHADAP KUALITAS PRODUK DNA PADA SAPI FRIESIAN HOLSTEIN (FH)
KOKOM KOMALASARI D14051702
Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Peternakan pada Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2009
PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS BUFFER SERTA KECEPATAN SENTRIFUGASI TERHADAP KUALITAS PRODUK DNA PADA SAPI FRIESIAN HOLSTEIN (FH)
Oleh KOKOM KOMALASARI D14051702
Skripsi ini telah disetujui dan disidangkan di hadapan Komisi Ujian Lisan pada tanggal 18 Juni 2009
Pembimbing Utama
Pembimbing Anggota
Prof. Dr. Ir. Ronny R. Noor, MRur.Sc.
Dr. Ir. Endang T. Margawati, M.Agr.Sc.
Dekan Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor
Ketua Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Luki Abdullah, M.Sc.Agr.
Dr. Ir. Cece Sumantri, M.Agr.Sc.
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan pada tanggal 8 Desember 1986 di Pangkalan Boros, Sumedang. Penulis anak kedua dari dua bersaudara dari pasangan Bapak Wiharya dan Ibu Uka. Pendidikan dasar diselesaikan pada tahun 1999 di SD Negeri Boros, Sumedang. Pendidikan lanjutan menengah pertama diselesaikan pada tahun 2002 di SLTP Negeri II Buahdua, Sumedang dan pendidikan menengah atas diselesaikan pada tahun 2005 di SMU Negeri I Cimalaka, Sumedang. Penulis diterima sebagai mahasiswa Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada tahun 2005. Penulis aktif di berbagai organisasi meliputi Staf ahli divisi Unggas, Himpunan Mahasiswa Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan (HIMAPROTER), Fakultas Peternakan (2006-2007), sekertaris umum Famm Al An’Am, Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor (2007-2008), dan aktif pada berbagai kegiatan kampus (2005-2008) serta pernah menjadi asisten mata kuliah Tingkah Laku dan Kesejahteraan Ternak (2009). Penulis aktif menulis beberapa karya ilmiah diantaranya Chicken Jelly Drink sebagai Inovasi Minuman Instant Sumber Protein (2005), Pemanfaatan Telur Busuk sebagai Bahan Peningkat Mutu Pupuk Organik Cair Berbahan Baku Effluent Biogas (2006), Persilangan Puyuh dan Ayam (Puyam) (2007) dan Pengaruh Perbandingan Volume Darah dan Lisis Buffer serta Kecepatan Sentrifugasi terhadap Kualitas Produk DNA pada Sapi Friesian Holstein (FH). Penulis juga merupakan salah satu penerima beasiswa BP POM tahun 2005-2007 dan beasiswa Gudang Garam 20072009 serta memperoleh hibah dana dari Dikti dalam rangka mengikuti Program Kreativitas Mahasiswa-Penelitian (PKM-P) tahun 2006 dan Program Kreativitas Mahasiswa-Ilmiah (PKM-I) tahun 2008.
KATA PENGANTAR Bismillahirrahmaniirahim, Alhamdulillah setelah disiapkan dalam waktu yang cukup singkat akhirnya skripsi ini telah diselesaikan. Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat, karunia, rizki, dan nikmat iman dan islam yang telah diberikan sehingga penulis memperoleh kemudahan dalam menyusun dan menyelesaikan skripsi ini yang berjudul “Pengaruh Perbandingan Volume Darah dan Lisis Buffer serta Kecepatan Sentrifugasi terhadap Kualitas Produk DNA pada Sapi Friensian Holstein (FH)”. Shalawat dan salam semoga tetap tercurahkan ke junjungan kita Nabi Muhammad SAW. Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Peternakan di Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Di samping itu penulisan skripsi ini bertujuan untuk memberikan satu sumbangan untuk kemajuan di dunia peternakan, khususnya bioteknologi molekuler hewan. Penelitian dilaksanakan di Laboraturium Biologi Molekuler Hewan, Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI Cibinong pada bulan Februari-April 2009. Sampel darah diambil dari sapi FH dengan jarum G-18 pada pembuluh halus di ekor kemudian diekstraksi dengan metode phenol-choroform-isoamyl alcohol (PCI) dengan modifikasi volume darah dan lisis buffer dengan kecepatan sentrifugasi yang berbeda. Penelitian ini diharapkan dapat memperoleh dan mengetahui kombinasi optimal antara volume darah dan lisis buffer dengan kecepatan sentrifugasi dalam mengoptimalkan produk DNA yang dihasilkan. Akhirnya tiada gading yang tak retak, penulis menyadari bahwa karya kecil ini masih belum sempurna. Penulis mengharapkan semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi pembaca dan menjadi salah satu sumber ilmu pengetahuan.
Bogor,
Juli 2009
Penulis
DAFTAR ISI Halaman RINGKASAN ..................................................................................................
i
ABSTRACT.....................................................................................................
ii
RIWAYAT HIDUP .........................................................................................
iii
KATA PENGANTAR .....................................................................................
iv
DAFTAR ISI....................................................................................................
v
DAFTAR TABEL............................................................................................
vii
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................
viii
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................
ix
PENDAHULUAN ...........................................................................................
1
Latar Belakang ..................................................................................... Tujuan ..................................................................................................
1 1
TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................................
3
Sapi Fresian Holstein........................................................................... Darah .................................................................................................... Sejarah dan Perkembangan Teknologi DNA ....................................... Perkembangan Penelitian DNA pada Hewan ...................................... DNA (Deoxyribonucleic Acid)............................................................. Ekstraksi DNA ..................................................................................... Phenol-Choroform-Isoamyl alkohol (PCl)........................................... Penentuan Kuantitas DNA ................................................................... Penentuan Kualitas DNA .....................................................................
3 3 5 6 7 9 10 10 11
METODE .........................................................................................................
12
Lokasi dan Waktu ................................................................................ Materi ................................................................................................... Sampel dan Bahan .................................................................... Peralatan ................................................................................... Rancangan Statistik .............................................................................. Analisis Data ............................................................................ Prosedur ............................................................................................... Koleksi Darah Segar................................................................. Koleksi Darah Putih ................................................................. Pemisahan Protein ................................................................... Presipitasi dan Koleksi DNA ................................................... Kuantifikasi DNA .................................................................... Kualifikasi DNA ......................................................................
12 12 12 12 13 13 14 14 14 14 14 15 15
HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................................
16
Kuantitas DNA ..................................................................................... Konsentrasi DNA .....................................................................
16 16
Rasio ......................................................................................... Kualitas DNA .......................................................................................
17 19
KESIMPULAN DAN SARAN .......................................................................
21
Kesimpulan .......................................................................................... Saran.....................................................................................................
21 21
UCAPAN TERIMA KASIH ...........................................................................
22
DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................
23
LAMPIRAN .....................................................................................................
26
DAFTAR TABEL Nomor 1. 2.
Halaman Pengaruh Perbandingan Volume Darah dan Lisis Buffer dengan Kecepatan Sentrifugasi terhadap Konsentrasi DNA (Rataan ± SE) ..
16
Pengaruh Perbandingan Volume Darah dan Lisis Buffer dengan Kecepatan Sentrifugasi terhadap Rasio OD 260/280 (Rataan ± SE) .
18
