J. Sains MIPA, Desember 2011, Vol. 17, No. 3, Hal.: 92 - 98 ISSN 1978-1873
PENGARUH MODIFIKASI KIMIA TERHADAP TITIK ISOELEKTRIK (pI) ENZIM HASIL MODIFIKASI Yandri A.S. Jurusan Kimia FMIPA, Universitas Lampung Jl. Sumatri Brojonegoro 1 Bandar Lampung 35145 E-mail:
[email protected]
ABSTRACT The objective of the research is to study the effect of chemical modification toward isoelectric point on the modified enzymes by the use of cyanuric chloride polyethylene glycol (CC-PEG) and pnitrophenolcarbonate-polyethylene glycol (NPC-PEG). The results showed that the modified enzyme with CCPEG with modification degrees of 23, 63, and 67% had isoelectric point 6.5 ; 6.0 ; and 6.0 respectively. The modified enzyme with NPC-PEG with modification degrees of 56, 76, and 89% had the same isoelectric point at pH 6.0. The purified enzyme had isoelectric point at pH 7.0. All modified enzymes with CC-PEG and NPCPEG have decreased their isoelectric point than those of unmodified enzyme. Key words: isoelectric point, chemical modification, Bacillus subtilis ITBCCB148
ABSTRAK Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari pengaruh modifikasi kimia terhadap titik isoelektrik enzim hasil modifikasi menggunakan sianurat klorida polietilenglikol (CC-PEG) dan nitrofenol karbonat polietilenglikol (NPC-PEG). Hasil penelitian menunjukkan, enzim hasil modifikasi dengan CC-PEG dengan derajat modifikasi 23, 63, dan 67% mempunyai pI berturut-turut 6,5 ; 6,0 ; dan 6,0.. Sedangkan enzim hasil modifikasi dengan NPC-PEG dengan derajat modifikasi 56; 76; dan 89% mempunyai pI yang sama yaitu pH 6,0 . Enzim hasil pemurnian mempunyai pI pada pH 7,0. Semua enzim hasil modifikasi dengan CC-PEG dan NPC-PEG mengalami penurunan titik isoelektrik dibandingkan dengan enzim hasil pemurnian.
Kata kunci: titik isoelektrik, modifikasi kimia, Bacillus subtilis ITBCCB148
1. PENDAHULUAN Titik isoelektrik merupakan data yang sangat penting diketahui untuk proses pemurnian suatu protein. Jika titik isoelektrik (pI) sutu protein sudah diketahui maka strategi awal pemisahan dapat dengan mudah dikembangkan. Pada keadaan lain, bila informasi mengenai titik isoelektrik suatu protein tidak diketahui, beberapa percobaan pendahuluan menggunakan kromatografi penukar ion dapat dilakukan untuk mendapatkan titik isoelektrik protein tersebut, yang dapat digunakan untuk proses pemisahan berikutnya. Pemisahan dan pemurnian menggunakan kromatografi penukar ion pada prinsipnya sama dengan isoelectric focusing berdasarkan pada perbedaan dalam sifat ionik dari permukaan asam amino. Residu arginin, histidin, dan lisin yang terpapar ke permukaan biasanya bermuatan positif pada pH netral. Sehingga pada pH yang diberikan, protein akan mempunyai muatan netto keseluruhan. Pada pH yang lebih rendah, muatan netto akan lebih positif, dan pada pH yang lebih tinggi, muatan netto akan lebih negatif. Pada pH yang muatan positif sama dengan muatan negatif (muatan nettonya nol) disebut titik isoelektrik protein (pI). Untuk kromatografi penukar ion, aturan yang baik untuk pemisahan protein yang titik isoelektriknya diketahui adalah memilih pH kerja yaitu dengan jarak satu satuan dari pI protein1). Titik isoelektrik suatu protein dapat juga digunakan untuk meramalkan perubahan yang terjadi akibat proses modifikasi, terutama modifikasi terhadap residu lisin yang terpapar ke permukaan2), yang banyak mempengaruhi muatan dari protein tersebut dan secara langsung berpengaruh terhadap titik isoelektrik protein tersebut. Semakin banyak residu lisin yang
92
2011 FMIPA Universitas Lampung
J. Sains MIPA, Desember 2011, Vol. 17, No. 3
mengalami modifikasi, akan mempengaruhi muatan protein secara keseluruhan dan akan mempengaruhi titik isoelektrik protein tersebut. Pada penelitian ini enzim -amilase hasil pemurnian dari bakteri lokal Bacillus subtilis ITBCCB148 yang dimodifikasi menggunakan PEG teraktivasi yaitu CC-PEG dan NPC-PEG dipelajari pengaruh modifikasi kimia terhadap titik isoelektriknya. Untuk mencapai tujuan tersebut perlu dilakukan pemurnian enzim, sehingga diperoleh enzim dengan tingkat kemurnian yang tinggi, kemudian enzim hasil pemurnian dimodifikasi menggunakan CC-PEG dan NPC-PEG. Enzim hasil modifikasi dan tanpa modifikasi ditentukan pH isoelektriknya.
2. METODE PENELITIAN 2.1. Bahan dan Alat yang Digunakan Enzim -amilase yang akan digunakan dalam penelitian ini diperoleh dengan mengisolasi dan memurnikan dari bakteri lokal Bacillus subtilis ITBCCB1483) . Bahan kimia yang digunakan mempunyai derajat proanalisis. Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: Spektrofotometer UV-Visible Shimadzu; Mikropipet Socorex; Oven Memmert-Germany; Neraca analitis Sartorius-Germany; pH meter FisherCanada; Magnetic stirrer NUOVA II-USA. 2.2. Prosedur Penelitian Tahapan penelitian yang dilakukan adalah sebagai berikut: Pemurnian enzim dan modifikasi kimia enzim hasil pemurnian dengan menggunakan CC-PEG dan NPC-PEG4,5). Enzim hasil pemurnian dan hasil modifikasi ditentukan pH isoelektriknya6). 3. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1. Penentuan Titik isoelektrik enzim hasil pemurnian dan enzim hasil modifikasi Penentuan pI enzim hasil pemurnian dan enzim hasil modifikasi dilakukan dengan menentukan kondisi yang sesuai untuk enzim agar dapat menukar counter ion atau kondisi enzim tidak dapat menukar counter ion. Untuk mendapatkan kondisi tersebut enzim dielusi pada penukar anion (DEAE) dan penukar kation (CMC) pada berbagai pH. Aktivitas enzim ditentukan untuk masing-masing pH yang digunakan. 3.2. Titik isoelektrik enzim hasil pemurnian Grafik pada Gambar 1 menunjukkan enzim -amilase hasil pemurnian mempunyai titik isoelektrik (pI) pada pH 7,0. Karakterisasi enzim hasil pemurnian menggunakan matriks penukar anion (DEAE-Selulosa) menunjukkan enzim ini dapat menukar counter ion dengan baik pada pH 9,0. Sedangkan pada karakterisasi menggunakan matriks penukar kation (CM-Selulosa), enzim hasil pemurnian mampu dengan baik menukar counter ion pada pH 5,0. Data penentuan pI enzim hasil pemurnian berdasarkan aktivitas enzim yang lepas menunjukkan enzim ini mempunyai pI pada pH 7,0.
2011 FMIPA Universitas Lampung
93
Yandri A.S . Pengaruh Modifikasi Kimia terhadap Titik Isoelektrik
120
100
Aktivitas (%)
80
60
40
20
0 4
4 ,5
5
5 ,5
6
6 ,5
7
7 ,5
8
8 ,5
9
9 ,5
pH % Aktivitas (DEAE)
% Aktivitas (CMC)
Gambar 1. Hubungan antara pH dengan aktivitas (%) enzim hasil pemurnian, untuk penentuan pI. Titik isoelektrik enzim hasil pemurnian ditentukan pada DEAE-selulosa dan CM-selulosa yang dielusi dengan berbagai pH 3.3. Titik isoelektrik enzim hasil modifikasi dengan CC-PEG Berdasarkan Gambar 2, 3, dan 4 enzim hasil modifikasi dengan CC-PEG mempunyai pI sebagai berikut: CC-PEG 23% mempunyai pI pada pH 6,5; CC-PEG 63% pada pH 6,0; dan CC-PEG 67% pada pH 6,0. 120
Aktivitas (%)
100
80
60
40
20
0 4
4 .5
5
5 .5
6
6 .5
7
7 .5
8
8 .5
9
9 .5
pH % A ktivitas (C M C )
% A ktivitas (D E A E )
Gambar 2. Hubungan antara pH dengan aktivitas (%) enzim hasil modifikasi (CC-PEG 23%), untuk penentuan pI. Titik isoelektrik enzim hasil modifikasi ditentukan pada DEAE-selulosa dan CMselulosa yang dielusi dengan berbagai pH
94
2011 FMIPA Universitas Lampung
J. Sains MIPA, Desember 2011, Vol. 17, No. 3
120
100
Aktivitas (%)
80
60
40
20
0 4
4.5
5
5.5
6
6.5
7
7.5
8
8.5
9
9.5
pH % Aktivitas (CMC)
% Aktivitas (DEAE)
Gambar 3. Hubungan antara pH dengan aktivitas (%) enzim hasil modifikasi (CC-PEG 63%), untuk penentuan pI. Titik isoelektrik enzim hasil modifikasi ditentukan pada DEAE-selulosa dan CMselulosa yang dielusi pada berbagai pH 120
100
Aktivitas (%)
80
60
40
20
0 4
4.5
5
5.5
6
6.5
7
7.5
8
8.5
9
9.5
pH % Aktivitas (CMC)
% Aktivitas (DEAE)
Gambar 4. Hubungan antara pH dengan aktivitas (%) enzim hasil modifikasi (CC-PEG 67%), untuk penentuan pI. Titik isoelektrik enzim hasil modifikasi ditentukan pada DEAE-selulosa dan CMselulosa yang dielusi dengan berbagai pH Grafik pada Gambar di atas menunjukkan semua enzim hasil modifikasi dapat menukar counter ion dengan baik pada pH 9,0. Aktivitas (%) yang diperoleh pada pH tersebut sangat kecil dibandingkan dengan aktivitas tertinggi. Aktivitas (%) enzim hasil modifikasi yang tidak dapat menukar counter ion pada pH 9,0
2011 FMIPA Universitas Lampung
95
Yandri A.S . Pengaruh Modifikasi Kimia terhadap Titik Isoelektrik
adalah: 7 untuk CC-PEG 23%; 5,7 untuk CC-PEG 63%; dan 2,3 untuk CC-PEG 67%. Sedangkan pada pH 5,0 semua enzim hasil modifikasi tidak dapat menukar counter ion dengan baik. Aktivitas (%) enzim yang tidak dapat menukar counter ion pada pH 5,0 adalah: 94,1 untuk CC-PEG 23%; 94,4 untuk CC-PEG 63%; dan 95,3 untuk CC-PEG 67%. Enzim hasil pemurnian dapat menukar counter ion dengan baik pada pH 5,0. Dari data ini dapat diperkirakan telah terjadi perubahan pada enzim hasil modifikasi dengan CC-PEG dibandingkan dengan enzim hasil pemurnian. 3.4. Titik isoelektrik enzim hasil modifikasi dengan NPC-PEG Grafik penentuan pI enzim hasil modifikasi dengan NPC-PEG dapat dilihat pada Gambar 5, 6, dan 7. Grafik pada Gambar 5, 6, dan 7 di bawah menunjukkan enzim hasil modifikasi dengan NPC-PEG dengan derajat modifikasi 56%, 76%, dan 89% mempunyai harga pI yang sama, yaitu pada pH 6,0. Gambar tersebut juga menunjukkan semua enzim hasil modifikasi dapat menukar counter ion dengan baik pada pH 9,0. Aktivitas yang diperoleh pada pH tersebut sangat kecil dibandingkan dengan aktivitas tertinggi. Aktivitas enzim hasil modifikasi yang tidak dapat menukar counter ion pada pH 9,0 adalah: 4,3% untuk NPC-PEG 56%; 3,9% untuk NPC-PEG 76%; dan 2,8% untuk NPC-PEG 89%. 120
100
Aktivitas (%)
80
60
40
20
0 4
4.5
5
5.5
6
6.5
7
7.5
8
8.5
9
9.5
pH % Aktivitas (CMC)
% Aktivitas (DEAE)
Gambar 5. Hubungan antara pH dengan aktivitas (%) enzim hasil modifikasi (NPC-PEG 56%), untuk penentuan pI. Titik isoelektrik enzim hasil modifikasi ditentukan pada DEAE-selulosa dan CMselulosa yang dielusi dengan berbagai pH Sedangkan pada pH 5,0 semua enzim hasil modifikasi tidak dapat menukar counter ion. Aktivitas enzim yang tidak dapat menukar counter ion pada pH 5,0 adalah: 80,6% untuk NPC-PEG 56%; 84,2% untuk NPC-PEG 76%; dan 85% untuk NPC-PEG 89%. Dari data ini juga dapat diperkirakan telah terjadi perubahan pada enzim hasil modifikasi dengan NPC-PEG dibandingkan dengan enzim hasil pemurnian. Dari data penentuan pI enzim hasil modifikasi dengan CC-PEG dan NPC-PEG menunjukkan semua enzim hasil modifikasi dapat mengusir counter ion dengan baik pada pH 9,0 menggunakan penukar anion DEAE-selulosa, hasil ini sama dengan enzim hasil pemurnian. Sedangkan pada penukar kation CM-selulosa semua enzim hasil modifikasi tidak dapat mengusir counter ion pada pH 5,0; hal ini menunjukkan telah terjadi perubahan pada enzim hasil modifikasi dibandingkan dengan enzim hasil pemurnian. Enzim hasil modifikasi tidak dapat mengusir counter ion pada pH 5,0 menunjukkan terjadinya perubahan pada muatan enzim hasil modifikasi khususnya residu lisin yang banyak memberikan muatan positif pada protein. Pada proses modifikasi residu lisin akan berikatan dengan PEG teraktivasi sehingga muatan protein pada pH 5,0 tidak terlalu positif dan tidak dapat mengusir counter ion. Data ini mendukung hasil yang diperoleh pada proses penentuan derajat modifikasi menggunakan TNBS7) yang menunjukkan telah terjadi modifikasi pada protein hasil pemurnian dengan PEG teraktivasi dengan berkurangnya residu lisin bebas pada enzim hasil modifikasi. 96
2011 FMIPA Universitas Lampung
J. Sains MIPA, Desember 2011, Vol. 17, No. 3
120
Aktivitas (%)
100
80
60
40
20
0 4
4.5
5
5.5
6
6.5
7
7.5
8
8.5
9
9.5
pH % Aktivitas (CMC)
% Aktivitas (DEAE)
Gambar 6. Hubungan antara pH dengan aktivitas (%) enzim hasil modifikasi (NPC-PEG 76%), untuk penentuan pI. Titik isoelektrik enzim hasil modifikasi ditentukan pada DEAE-selulosa dan CMselulosa yang dielusi dengan berbagai pH
120
100
Aktivitas (%)
80
60
40
20
0 4
4.5
5
5.5
6
6.5
7
7.5
8
8.5
9
9.5
pH % Aktivitas (CMC)
% Aktivitas (DEAE)
Gambar 7. Hubungan antara pH dengan aktivitas (%) enzim hasil modifikasi (NPC-PEG 89%), untuk penentuan pI. Titik isoelektrik enzim hasil modifikasi ditentukan pada DEAE-selulosa dan CMselulosa yang dielusi dengan berbagai pH
2011 FMIPA Universitas Lampung
97
Yandri A.S . Pengaruh Modifikasi Kimia terhadap Titik Isoelektrik
4. KESIMPULAN Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa modifikasi kimia menggunakan PEG teraktivasi yaitu CC-PEG dan NPC-PEG menyebabkan penurunan titik isoelektrik dibandingkan dengan enzim hasil pemurnian.
DAFTAR PUSTAKA 1.
Bollag, D. M., Rozycki, M. D., Edelstein, S. J. ,1996, Protein Methods, John Wiley & Sons, Inc., Publication, New York, 91-93; 232-274.
2.
Janecek, S., 1993, Strategies for obtaining stable enzymes, Process Biochem., 28, 435-445.
3.
Yandri, A.S. , Kosasih, P., Soetijoso, S., Muliawati, S., 2000, Isolasi, pemurnian dan karakterisasi enzim -amilase termostabil dari bakteri lokal Bacillus sp. B. 148, Prosiding Kimia Bersama ITB-UKM Keempat, Bandung, 294-302.
4.
Yandri, A.S. , Kosasih, P., Soetijoso, S., Muliawati S., 2003, Modifikasi kimia enzim -amilase dari bakteri lokal Bacillus sp. B. 148 dengan sianurat klorida polietilenglikol, J. Sains Tek., 9 (1), 9-16.
5.
Yandri, A.S., 2004, Modifikasi kimia enzim -amilase dari bakteri lokal Bacillus sp. B. 148 dengan nitrofenol karbonat polietilen-glikol, Prosiding Seminar Nasional , Bandar Lampung, 94-201.
6.
Lampson, G.P. and Tytell, A.A., 1965, A simple methods for estimating isoelectric points, Anal. Biochem., 11, 374-377.
7.
Synder, S.L. and Sobocinski, P.Z., 1975, An improved 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid method for the determination of amines, Anal. Biochem., 64, 284-288.
98
2011 FMIPA Universitas Lampung
