PENGARUH METODE PENGERINGAN TERHADAP AKTIVITAS ENZIM FIBRINOLITIK CACING Lumbricus rubellus
EKO SETIAWAN
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
2
ABSTRAK EKO SETIAWAN. Pengaruh Metode Pengeringan terhadap Aktivitas Enzim Fibrinolitik Cacing Lumbricus rubellus. Dibimbing oleh DONDIN SAJUTHI dan IRMA HERAWATI SUPARTO. Tepung cacing Lumbricus rubellus diyakini sangat berkhasiat untuk menyembuhkan berbagai penyakit yang berhubungan dengan trombosis. Metode pengeringan yang efektif dan efisien untuk menghasilkan tepung cacing yang berdaya fibrinolitik tinggi belum pernah dilaporkan. Penelitian ini bertujuan mencari metode pengeringan cacing L. rubellus yang efektif dan efisien serta menghasilkan enzim fibrinolitik yang optimum. Cacing dikeringkan dengan metode kering-matahari, kering-oven vakum pada 50°C; 0.73 bar, dan kering-beku pada –80°C; 1 kbar. Rendemen tertinggi dihasilkan oleh metode kering-oven vakum, yaitu 11.42% dan biaya produksinya lebih murah 71% terhadap kering-beku. Kering-oven vakum menghasilkan tepung dengan kadar air terendah, yaitu 9.76%. Untuk mengisolasi enzim, tepung cacing (10% b/v) disentrifus pada laju 6000 G dan suhu 4°C selama 10 menit lalu aktivitas proteasenya ditentukan dengan modifikasi metode Bergmeyer. Hasilnya, aktivitas protease metode kering-oven vakum lebih rendah 0.93% terhadap kering-beku. Kadar protein contoh dari kering-oven vakum lebih rendah 24.53% terhadap kering-beku. Bobot molekul protein yang ditetapkan dengan analisis elektroforesis menunjukkan bahwa kering-beku memiliki 5 pita protein dengan bobot molekul 12.7, 42, 48, 58.6, dan 103 kD. Uji aktivitas fibrinolitik secara in vitro menunjukkan aktivitas enzim yang tinggi pada metode keringoven vakum dan kering-beku. Simpulannya adalah metode kering-oven vakum lebih efektif dan efisien bila dibandingkan dengan kering-matahari dan kering-beku serta enzim proteasenya masih memiliki aktivitas fibrinolitik yang cukup tinggi.
ABSTRACT EKO SETIAWAN. Influence of Drying Methods on Fibrinolytic Enzymes Activity in Lumbricus rubellus. Supervised by DONDIN SAJUTHI and IRMA HERAWATI SUPARTO. Lumbricus rubellus earthworm powder is believed to be effective to heal various diseases which related to thrombosis. The effective and efficient drying method to produce powered earthworm powder of high fibrinolytic activity has not been reported. The objective of this research is to evaluate the most effective and efficient drying method of earthworm L. rubellus which have the optimum fibrinolytic enzymes. Earthworms were dried by sun, vacuum oven at 50°C; 0.73 bar, and freeze drying methods at –80°C; 1 kbar. The highest yield was produced by vacuum oven drying method that is 11.42% and its production cost was 71% cheaper than freeze drying. Vacuum oven drying produced the lowest water content of powder that is 9.76%. To isolate enzymes, the earthworm powder (10% b/v) was sentrifused at 6000 G in 4°C for 10 minute then its protease activity was determined by Bergmeyer method modification. The result, protease activity of vacuum oven was 0.93% lower than freeze drying. Protein content of sample from vacuum oven was 24.53% lower than freeze drying. Molecular weight of protein which specified by electrophoresis analysis indicating that freeze drying has 5 protein ribbon with molecular weight 12.7, 42, 48, 58.6, and 103 kD. The highest in vitro fibrinolytic activity were shown by the vacuum oven and freeze drying. The conclusions were vacuum oven drying method more effective and efficient if compared to sun and freeze drying and also its protease enzymes still has high fibrinolytic activity.
3
PENGARUH METODE PENGERINGAN TERHADAP AKTIVITAS ENZIM FIBRINOLITIK CACING Lumbricus rubellus
EKO SETIAWAN
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
4
Judul
: Pengaruh Metode Pengeringan terhadap Aktivitas Enzim Fibrinolitik Cacing Lumbricus rubellus Nama : Eko Setiawan NIM : G44203069
Menyetujui,
Pembimbing I
Pembimbing II
Prof. drh. Dondin Sajuthi, MST, Ph.D NIP 131 536 684
Dr. dr. Irma H Suparto, MS NIP 131 606 776
Mengetahui, Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
Dr. drh. Hasim, DEA NIP 131 578 806
Tanggal Lulus :
5
PRAKATA Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas limpahan rahmat dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Shalawat serta salam semoga tercurah kepada manusia termulia, Muhammad SAW. Penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Juli 2007 ini mengambil judul “Pengaruh Metode Pengeringan terhadap Aktivitas Enzim Fibrinolitik Cacing Lumbricus rubellus”. Ucapan terima kasih kepada Bapak Prof. drh. Dondin Sajuthi, MST, Ph.D. dan Ibu Dr. dr. Irma H Suparto, MS. selaku pembimbing atas kesabaran dan pengarahannya selama menyusun rencana dan pelaksanaan penelitian serta penulisan skripsi. Di samping itu, ucapan terima kasih juga disampaikan kepada seluruh staf Laboratorium Kimia Anorganik (Pak Sawal, Pak Mul, Pak Caca) dan staf Laboratorium Mikrobiologi Pusat Studi Satwa Primata atas pelayanannya selama pelaksanaan penelitian. Penghargaan penulis terhadap Agus Saputra, SSi dan Ibu Nenah yang telah memberi masukan secara teknis selama penelitian berlangsung. Teristimewa ucapan terima kasih yang tulus dan mendalam penulis sampaikan kepada Ayah dan almarhumah Ibu tercinta, serta kakak-kakakku atas segala doa dan kasih sayangnya. Tak lupa, rasa terima kasih kepada sahabat-sahabatku seperjuangan di Laboratorium Kimia Anorganik (Ono, Mario, dan Uti) atas kebersamaan selama melakukan penelitian. Terima kasih kepada rekan-rekan Kimia-Q yang selalu membawa keceriaan di setiap kebersamaan, terutama Ichan, Dicky, Rani, dan Julia yang bersedia membantu dalam menyelesaikan masalah yang penulis hadapi. Ucapan terima kasih juga tidak lupa kepada Mas Heri atas bantuannya. Semoga karya ilmiah ini dapat memberikan manfaat bagi semua orang yang membacanya.
Bogor, Maret 2008
Eko Setiawan
6
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 17 Juni 1984 dari ayah Sumardi dan ibu almarhumah Samini. Penulis adalah anak ketiga dari tiga bersaudara. Tahun 2003, penulis lulus dari Sekolah Menengah Umum Negeri 47 Jakarta dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru, kemudian diterima pada Program Studi Kimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Kimia Dasar tahun ajaran 2005/2006, 2006/2007, dan alih semester 2007 serta mata kuliah Kimia Organik berbasis kompetensi pada tahun ajaran 2006/2007. Pelaksanaan praktik lapangan dilakukan di Pusat Penelitian dan Pengembangan Hasil Hutan Bogor selama dua bulan, yakni Juli–Agustus 2006 dengan judul “Isolasi Asam Sinamat dari Kemenyan Durame (Styrax benzoin Dryand) Tapanuli Utara pada Berbagai Mutu”.
7
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ......................................................................................................
vii
DAFTAR GAMBAR .................................................................................................
vii
DAFTAR LAMPIRAN ..............................................................................................
vii
PENDAHULUAN .....................................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA Cacing Lumbricus rubellus ............................................................................... Protease Cacing ................................................................................................. Metode Pengeringan .......................................................................................... Spektrofotometri UV/Vis .................................................................................. Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) .. Fibrinolisis ........................................................................................................
1 2 3 4 4 5
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat .................................................................................................. Metode Penelitian ..............................................................................................
6 6
HASIL DAN PEMBAHASAN Rendemen Tepung ............................................................................................ Kadar Air ........................................................................................................... Penentuan Aktivitas Protease ............................................................................ Penentuan Bobot Molekul Protein dengan Metode Elektroforesis SDS-PAGE Uji Aktivitas Fibrinolitik ...................................................................................
8 9 10 11 11
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ........................................................................................................... Saran ..................................................................................................................
13 13
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................
13
LAMPIRAN ................................................................................................................
16
8
DAFTAR TABEL Halaman 1 2
Komposisi gel pemisah dan gel penahan untuk SDS-PAGE .............................. Kadar protein ekstrak kasar L. rubellus pada tiap metode pengeringan ..............
8 11
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 2 3 4 5 6 7 8
Cacing Lumbricus rubellus .................................................................................. Rendemen tepung cacing pada tiap metode pengeringan .................................... Rerata kadar air pada tiap metode pengeringan ................................................... Rerata aktivitas enzim pada tiap metode pengeringan ........................................ Pita protein hasil SDS-PAGE 15% tiap metode pengeringan: (M) marker; (KM) kering-oven vakum; (KM) kering-matahari; (KB) kering-beku ................ Produk degradasi fibrin oleh enzim (a) 10%; (b) 5%; (c) 2.5% dengan perbesaran 40x ..................................................................................................... Perbandingan produk degradasi fibrin oleh enzim 10% (b/v) dengan perbesaran 40x: (KB) kering-beku; (KO) kering-oven vakum; (KM) kering-matahari; (K) kontrol (tanpa enzim) .................................................................................... Pengaruh konsentrasi substrat (a) 0.01 g dan (b) 0.02 g pada produk degradasi fibrin oleh enzim 2.5%; perbesaran 40x ..............................................................
2 8 9 10 11 12 12 13
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 2 3
Prosedur pembuatan pereaksi kimia .................................................................... Bagan alir penelitian ............................................................................................ Rendemen tepung cacing yang dihasilkan dengan metode kering-matahari, kering-oven vakum, dan kering-beku .................................................................. 4 Biaya produksi tepung cacing dengan metode kering-matahari, kering-oven vakum, dan kering-beku ...................................................................................... 5 Kadar air tepung cacing dari metode kering-matahari, kering-oven vakum, dan kering-beku ................................................................................................... 6 Data penentuan aktivitas enzim protease pada λmaks = 578 nm ........................... 7 Penentuan panjang gelombang maksimum pada kisaran 560–580 nm ............... 8 Pembuatan kurva standar Bradford dan penentuan kadar protein contoh ........... 9 Kurva standar SDS-PAGE 15% dan penentuan BM protein contoh ................... 10 Data kualitatif aktivitas fibrinolitik dari ekstrak kasar enzim protease cacing L. rubellus ................................................................................................
17 19 20 21 22 24 26 27 28 29
PENDAHULUAN Cacing Lumbricus rubellus sering dianggap sebagai hewan yang sangat menjijikkan, padahal cacing tersebut memiliki manfaat dalam dunia pengobatan yang tidak dapat diabaikan begitu saja. Khasiat L. rubellus sudah diketahui sejak dahulu kala oleh negara-negara bagian timur, seperti Jepang, Cina, Taiwan, dan Korea sebagai pengobatan tradisional untuk penyakit tifus dan demam. Seiring dengan kemajuan teknologi, cacing ini mulai digunakan untuk pengobatan modern seperti antitrombosis, hipotensi, hiperlipidemia, diabetes, hipertensi, antipiretik, dan analgesik (Ishii et al. 1992). Ekstrak enzimnya pertama kali ditemukan oleh Mihara et al. (1991), yaitu enam fraksi protease fibrinolitik yang diberi nama generik lumbrokinase, sedangkan Yanti (2003) melaporkan bahwa ekstraknya memiliki tiga fraksi enzim dengan aktivitas optimum pada suhu 60°C dan pH 8.0. Enzim lumbrokinase yang dihasilkan memiliki daya proteolitik dan fibrinolitik yang tinggi sehingga berpotensi untuk dikembangkan sebagai obat antitrombosis (Mihara et al. 1991; Yanti 2003). Lumbrokinase merupakan kelompok enzim protease fibrinolitik dari ekstrak L. rubellus yang bekerja secara ganda dalam menghidrolisis fibrin atau fibrinogen dan sekaligus menstimulasi plasminogen menjadi plasmin (Mihara et al. 1991; Nakajima et al. 1993). Kelebihan lumbrokinase dibandingkan enzim fibrinolitik komersial lainnya ialah dapat dikonsumsi secara oral, aman, tidak toksik, dan tidak menimbulkan efek samping terhadap fungsi jantung, hati, ginjal, sistem respirasi, dan sistem saraf (Suhartono et al. 2004). Oleh karena itu, lumbrokinase sangat menjanjikan untuk dikembangkan sebagai obat antitrombosis yang berdaya fibrinolitik tinggi sehingga dapat berkompetisi dengan obat trombolitik komersial lainnya yang telah ada di Indonesia. Obat berbahan baku cacing dijual dalam bentuk tepung yang dikemas, seperti kapsul. Kelebihan tepung cacing adalah lebih tahan lama, karakteristik sifat tetap dan seimbang, tidak mempengaruhi penampakan fisik (warna dan bau), kandungan bakteri kontaminan minim, dan tidak mengalami degradasi selama proses penyimpanan (Yanti 2003). Nakajima et al. (2000) menyatakan bahwa protease cacing dari tepung cukup stabil (aktivitas relatif >80%) pada penyimpanan suhu ruang hingga lima tahun.
Usaha untuk mendapatkan produk tepung cacing yang efektif dan efisien belum banyak dilakukan oleh kalangan industri. Proses pengeringan dengan cahaya matahari telah dilakukan oleh industri kecil. Walaupun biaya yang dikeluarkan relatif rendah, metode ini membutuhkan waktu yang lama karena suhu udara yang tidak stabil. Kelebihan dari metode ini adalah mudah dan murah. Sementara, metode kering-beku baru beberapa industri yang sudah mulai melakukannya, terutama industri besar. Namun, biaya produksi yang relatif tinggi mengakibatkan harga jual produk ikut melonjak. Keuntungan dari metode ini adalah enzim yang terdapat dalam cacing tidak terganggu aktivitasnya akibat panas (Widodo & Suwondo 2006). Di sisi lain, metode pengeringan dengan oven vakum bisa menjadi pilihan alternatif dalam usaha memproduksi tepung cacing. Kelebihan metode ini dibandingkan dengan oven biasa (tanpa vakum) adalah sirkulasi udara yang terjadi selama proses pemanasan lebih baik karena menggunakan pompa vakum sehingga pengeringan merata (Thomas & Holly 1997). Penelitian ini bertujuan mencari metode pengeringan cacing yang efektif dan efisien serta menghasilkan enzim dengan aktivitas fibrinolitik yang optimum. Adapun metode pengeringan yang dipilih adalah metode kering-matahari, kering-oven vakum, dan kering-beku.
TINJAUAN PUSTAKA Cacing Lumbricus rubellus Di Indonesia, cacing L. rubellus sering disebut juga dengan nama cacing Jayagiri. Cacing ini mampu menghasilkan kompos dan bahan organik dalam jumlah besar. Perkembangbiakannya dapat berlangsung pada media yang rendah nutrisi dengan daya reproduksi yang tinggi, yaitu 106 kokon per tahun (Rukmana 1999). Cacing jenis ini hidup di tanah yang lembab dan kaya akan zat organik seperti di bawah pohon atau tumpukan sampah organik. Jika musim hujan, cacing hidup di dekat permukaan tanah. Ketika kondisi sangat kering, cacing ini hidup di dalam tanah, menyelubungi diri dengan bahan berlendir dan mengalami dorman. Habitat alaminya adalah tanah dengan suhu 15–25°C, kelembapan hingga 15–50%, dan pH netral atau sekitar 7.2 (Rukmana 1999). Secara umum, cacing ini
2
memiliki sifat hermaprodit biparental, peka terhadap cahaya, sentuhan, dan getaran, tidak memiliki gigi, serta rentan pada berbagai minyak dan detergen (Palungkun 1999). Hegner dan Engemann (1968) mengklasifikasikan cacing L. rubellus sebagai berikut: Dunia : Animalia Divisi : Vermes Filum : Annelida Kelas : Oligochaeta Ordo : Opisthopora Famili : Lumbricidae Genus : Lumbricus Spesies : rubellus
dan valin) dan 4 asam amino non-esensial (sistein, glisin, serin, dan tirosin) (Palungkun 1999).
Cacing ini memiliki ciri-ciri tubuh gilig ventral pipih, panjang 7.5–10 cm, warna tubuh bagian punggung cokelat cerah sampai ungu kemerahan, warna tubuh bagian ventral krem, dan bagian ekor kekuningan. Jumlah segmen 95–100, klitelium berbentuk sadel dan menonjol, jumlah segmen pada klitelium antara 6–7 segmen yang berada pada segmen ke-27 sampai 32. Lubang kelamin jantan terletak pada segmen ke-14, sedangkan lubang kelamin betina pada segmen ke-13, bergerak kurang aktif, dan kadar air berkisar antara 70– 80% (Edward dan Lofty 1977; Minnich 1977; Rukmana 1999). Cacing jenis ini mempunyai peran yang penting bagi umat manusia. Selain sebagai obat-obatan, cacing juga berperan sebagai dekomposer dan membantu pengolahan tanah dan taman. Sebagai obat, cacing ini diyakini ampuh menyembuhkan berbagai macam penyakit seperti tifus, demam, antitrombosis, hipotensi, hiperlipidemia, diabetes, hipertensi, antipiretik, dan analgesik (Ishii et al. 1992). Ekstraknya juga mengandung berbagai enzim dan asam amino esensial yang potensial untuk menghaluskan dan melembutkan kulit sehingga dapat diaplikasikan sebagai bahan baku kosmetik. Sebagai dekomposer, cacing dapat menguraikan dan merombak bendabenda yang sudah lapuk menjadi tanah. Di dalam pertamanan, cacing ini dapat membantu membawa udara dan mengalirkan air hujan ke dalam tanah, serta mencampur mineralmineral (Rukmana 1999). Secara umum, kandungan gizi pada cacing sebagai berikut: protein (64–76%), lemak (7–10%), kalsium (0.55%), fosfor (1%), dan serat kasar (1.08%). Komposisi asam amino cacing tanah terdiri atas 9 asam amino esensial (arginin, histidin, leusin, isoleusin, lisin, metionin, fenilalanin, treonin,
Protease merupakan enzim yang menghidrolisis ikatan peptida pada protein dengan bantuan molekul air. Sumber protease berasal dari hewan, tumbuhan, dan mikroba. Enzim ini dapat diproduksi secara ekstraseluler maupun intraseluler. Cacing tanah mensekresikan protease secara intraseluler (Ward 1985). Mihara et al. (1991) pertama kali berhasil mengekstrak dan memurnikan enam fraksi protease dari cacing L. rubellus yang diberi nama generik lumbrokinase. Nakajima et al. (2000) menyatakan bahwa enzim protease L. rubellus memiliki aktivitas proteolitik dan fibrinolitik yang potensial dan tahan terhadap pelarut organik, termasuk toluena dan nheksana. Selain itu, enzim ini juga mampu mendigesti berbagai substrat protein, seperti kasein, elastin, hemoglobin, kolagen, albumin, dan keratin serta dapat mengkatalisis hidrolisis ester, terutama etil asetat dan bioplastik poli (R)3-hidroksibutirat. Lumbrokinase dikelompokkan dalam proteinase yang bekerja menghidrolisis protein menjadi fragmen-fragmen polipeptida. Berdasarkan pemecahan ikatan peptidanya, enzim ini termasuk endopeptidase karena menguraikan ikatan peptida pada rantai dalam protein secara acak sehingga didapatkan produk peptida dan polipeptida (Nakajima et al. 1996). Bila ditinjau dari sifat kimia sisi aktifnya, lumbrokinase tergolong ke dalam protease serin yang memiliki asam amino serin pada sisi aktifnya dan memotong ikatan peptida secara acak. Protease serin umumnya bekerja aktif pada kondisi pH netral dan alkali (pH 7–11) serta dihambat spesifik oleh senyawa fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF), diisopropil fluorofosfat (DFP), Nα-p-tosil-Llisinklorometilketon (TLCK), soybean trypsin inhibitor (SBTI), dan lima bean trypsin inhibitor (LBTI) atau aprotinin. Khusus
Gambar 1 Cacing Lumbricus rubellus.
Protease Cacing
