PENGARUH INDUKSI PLUMBUM ASETAT TERHADAP MEMORI SPASIAL DAN INTAKE SUKROSA PADA TIKUS PUTIH JANTAN (RATTUS NOVERGICUS) GALUR SPRAGUE DAWLEY
(Skirpsi)
Oleh TEGUH DWI WICAKSONO
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2017
ABSTRACT
THE EFFECT OF LEAD ACETATE INDUCED TO SPATIAL MEMORY AND SUCROSE INTAKE ON MALE RATS (RATTUS NORVEGICUS) STRAIN SPRAGUE DAWLEY
By
TEGUH DWI WICAKSONO
Background: Vehicle contributes for 70%-80% of air pollution, one of the components such pollution is plumbum. Plumbum is a neurotoxic metal that can lower spatial memory and sucrose intake. Methods: This is a completely randomized design method used 24 male rats (Rattus norvegicus) Sprague-Dawley aged 2-3 months were divided into 4 groups induced by lead acetate for 7 days, the control group (K), group 1 dose of 50 mg/kg (P1), group 2 doses of 100 mg/kg (P2) and the treatment group 3 doses of 200 mg/kg (P3). Spatial memory assessed using a Morris water maze test probe method with exercise 4 times/day for 2 days and sucrose intake was assessed using method 2-hours access by looking at the percentage of consumption of sucrose 4% of the total fluid. Data were analyzed using One-way ANOVA. Result: The results of the average number of spatial memory in K: 35.28%, P1: 25.55%, P2: 25.28%, P3: 21.39% obtained significant influence with p = 0.037. The results of the average value of sucrose intake in K: 77.03%, P1: 17:58%, P2: 18.63%, P3: 11:03% obtained significant influence with p=0.000. Conclusion: Induction of plumbum acetate for 7 days can reduce spatial memory and sucrose intake of white rats (Rattus norvegicus) male Sprague-Dawley. Keywords: Intake of sucrose, Lead, Spatial memory
ABSTRAK
PENGARUH INDUKSI PLUMBUM ASETAT TERHADAP MEMORI SPASIAL DAN INTAKE SUKROSA PADA TIKUS PUTIH JANTAN (RATTUS NORVEGICUS) GALUR SPRAGUE DAWLEY
Oleh
TEGUH DWI WICAKSONO
Latar belakang: Kendaraan menyumbangkan 70%-80% polusi udara, salah satu komponen polusi tersebut adalah plumbum. Plumbum merupakan logam bersifat neurotoksik yang dapat menurunkan memori spasial dan intake sukrosa. Metode: Penelitian ini menggunakan metode rancangan acak lengkap dengan sampel 24 ekor tikus putih (Rattus norvegicus) jantan galur Sprague-dawley berusia 2-3 bulan terbagi ke dalam 4 kelompok yang diinduksi dengan plumbum asetat selama 7 hari, yaitu kelompok kontrol (K), kelompok perlakuan 1 dosis 50 mg/kg (P1), kelompok perlakuan 2 dosis 100 mg/kg (P2) dan kelompok perlakuan 3 dosis 200 mg/kg (P3). Memori spasial dinilai menggunakan alat Morris-water maze metode probe test dengan latihan 4 kali/hari selama 2 hari dan intake sukrosa dinilai menggunakan metode 2-hours access dengan melihat persentase konsumsi sukrosa 4% terhadap keseluruhan cairan. Data dianalisis menggunakan metode One-way Anova. Hasil penelitian: Hasil rerata nilai memori spasial pada K: 35.28%, P1: 25.55%, P2: 25.28%, P3: 21.39% didapatkan pengaruh yang bermakna dengan nilai p=0.037. Hasil rerata nilai intake sukrosa pada K: 77.03%, P1: 17.58%, P2: 18.63%, P3: 11.03 % didapatkan pengaruh yang bermakna dengan nilai p=0.000. Simpulan: Induksi plumbum asetat selama 7 hari dapat menurunkan memori spasial dan intake sukrosa tikus putih (Rattus norvegicus) jantan galur Sprague-dawley. Kata kunci : Intake sukrosa, Memori spasial, Plumbum
PENGARUH INDUKSI PLUMBUM ASETAT TERHADAP MEMORI SPASIAL DAN INTAKE SUKROSA PADA TIKUS PUTIH JANTAN (RATTUS NORVEGICUS) GALUR SPRAGUE DAWLEY
Oleh Teguh Dwi Wicaksono Skripsi Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar SARJANA KEDOKTERAN Pada Program Studi Pendidikan Dokter Fakultas Kedokteran Universitas Lampung
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2017
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan pada keluarga sederhana di Lampung Selatan pada tanggal 3 November 1995, sebagai anak kedua dari empat bersaudara dari Bapak Haryono dan Ibu Marmi yang sangat menyayangi penulis.
Penulis menempuh pendidikan Taman Kanak-kanak (TK) di TK Al-Muhajirin Sidoasih, Lampung Selatan dan selesai pada tahun 2000. Lalu penulis menempuh Sekolah Dasar di MI Al-Muhajirin Sidoasih, Lampung Selatan dan selesai pada tahun 2007. Selanjutnya, penulis melanjutkan pendidikan di SMP Negeri 1 Sragi yang diselesaikan pada tahun 2010, kemudian penulis melanjutkan pendidikan di SMA Negeri 1 Kalianda dan selesai pada tahun 2013.
Tahun 2013, Penulis diterima dan terdaftar sebagai Mahasiswa Fakultas Kedokteran Universitas Lampung melalui jalur SNMPTN Undangan. Selama menjadi mahasiswa, penulis aktif dalam FSI Ibnu Sina periode 2014-2015 yaitu sebagai Staf Bina Baca Quran, dan Wakil Ketua BPH As-syfa periode 2014-2015 serta syukur alhamdulilah penulis juga menjadi bagian dalam Asisten Dosen Anatomi periode 2015/2016.
“Sesungguhnya Kami telah mengemukakan amanat kepada langit, bumi dan gunung-gunung, maka semuanya enggan untuk memikul amanat itu dan mereka khawatir akan mengkhianatinya, dan dipikullah amanat itu oleh manusia. Sesungguhnya manusia itu sangat zalim dan bodoh ”. (QS. Al-Ahzab : 72)
Sebuah tulisan kecil teruntuk :
“Bapak dan Mama Tercinta” When you walk through the storm Hold your head up high
And don’t be afraid of the dark
At the end of the storm there’s a golden sky And the sweet silver song of a lark Walk on through a rain
Walk on through a wind
Though your dreams be tossed and blown
SANWACANA
Puji syukur Penulis ucapkan kehadirat Allah Subhanahu wa Ta’ala, karena atas rahmat dan hidayah-Nya skripsi ini dapat diselesaikan. Sholawat serta salam semoga selalu tercurahkan kepada Nabi Muhammad Solallahu Alaihi Wasalam.
Skripsi dengan judul “Pengaruh Induksi Plumbum Aseta terhadap Memori Spasial dan Intake Sukrosa Pada Tikus Putih Jantan (Rattus norvegicus) Galur Sprague Dawley” adalah salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana Kedokteran di Universitas Lampung.
Dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terimakasih kepada:
1.
Bapak Prof. Dr. Ir. Hasriadi Mat Akin, M.P., selaku Rektor Universitas Lampung.
2.
Dr. dr. Muhartono, M.Kes, Sp.PA., selaku Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Lampung.
3.
Dr. Anggraeni Janar Wulan, M.Sc., selaku Pembimbing Utama yang selalu bersedia meluangkan waktu dan kesediaannya untuk memberikan bimbingan,
kritik, saran serta nasihat yang bermanfaat dalam proses penyelesaian skripsi ini. 4.
dr. Ratna Dewi Puspita Sari, Sp.OG., selaku Pembimbing Kedua atas kesediannya untuk menyempatkan waktu memberikan bimbingan, saran dan kritik selama proses skripsi ini serta memberikan banyak ilmu selama lebih dari setahun terakhir ini.
5.
Dr. dr. Asep Sukohar, M.Kes., selaku Penguji Utama pada ujian skripsi untuk masukan dan saran-saran yang diberikan.
6.
dr. Oktadoni Syaputra, M.Med.Ed., selaku Pembimbing Akademik
7.
dr. Betta Kurniawan, M.Kes., selaku dosen dan juga guru yang telah memberikan banyak motivasi dan nasihat tentang dunia maupun akhirat.
8.
Ibuku tersayang, Marmi, terimakasih atas doa, kasih sayang, nasihat serta bimbingan yang telah diberikan untukku, serta selalu mengingatkan ku untuk selalu mengingat Allah SWT. Semoga Allah SWT selalu melindungi ibunda dan menjadikan ladang pahala.
9.
Ayahku tercinta, Haryono yang selalu memberikan doa dan semangat untukku
dalam
menjalankan
pendidikan
kedokteran
serta
selalu
mengingatkanku untuk selalu dekat dengan Allah SWT. Semoga Allah selalu memberikan kesehatan dan lindungan kepada ayahanda. 10. Kakak dan adik-adikku Primadhani, Tria dan Balint yang selalu memberikan doa, memotivasi dan mendukung. 11. Kepala Laboraturium Biologi Molekuler Fakultas Kedokteran Universitas Lampung Ibu Nuriah yang telah membantu dalam penelitian ini.
12. Seluruh Staf Dosen FK Unila atas ilmu dan pengalaman berharga yang telah diberikan kepada penulis untuk menambah wawasan yang menjadi landasan untuk mencapai cita-cita. 13. Seluruh Staf Akademik, TU dan Administrasi FK Unila, serta pegawai yang turut membantu dalam proses penelitian skripsi ini. 14. Sahabat-sahabat saya M. Ega Al-Farizi, Fuad Iqbal Elka Putra, Fathan Muhi Amrulloh, Raka Novadlu Cordita, Restu Pamanggih, M. Jyuldi Prayoga, Agus Fathul Muin, Ahmad Farishal. Sebagai teman seperjuangan, saling mengingatkan dan selalu memberikan semangat tentang kehidupan dunia maupun akhirat. 15. Sahabat-sahabat saya NWNC yaitu Ahmad sirajudin, Restu Pamanggih, Raka Novadlu Cordita, Ridho Pambudi, M. Marliando, Maldini Ningrat, Khairul Anam, dan Benny BPP. Terimakasih atas semangatnya, keseruannya, doa, dukungan dalam penyelesaian skripsi ini. 16. Keluarga Asisten Dosen Anatomi periode 2015-2016, dr. Anggraeni Janar Wulan, M.Sc, dr. Rekha Nova Iyos, dr. Catur Ari Wibowo, M. Jyuldi Prayoga, Teguh Dwi Wicaksono, Josua Tumpal, M. Marliando, M. Azzaky Bimandama, Fauziah Lubis, Azzren Virgita Pasya, Sutria Nirda Syati, Ria Arisandi, Indrani Nur WP, Rosi Indah Pratama, Indah Iswara, Shafira Fauzia, Seftia Farera Nanda. 17. Teman laki-laki seperjuangan kloter terakhir OSCE dan SOCA dari semester pertama hingga terakhir Tito Tri Saputra, yang selalu bersama menunggu berjam-jam ujian dan selalu mendoakan.
18. Teman-teman MoC dan angkatan 2013 yang tidak dapat disebutkan satupersatu, terimakasih atas pengalaman-pengalaman dan perjuangan selama ini. 19. Sahabat-sahabat saya yang dipertemukan sejak masih memahami arti kehidupan: Angga, Rama, Tian, Dedi, Tuko, Arif, Iqbal, Salamun, Endro, Agus yang telah mengajari penulis tujuan hidup ini.
Akhir kata, Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Akan tetapi, sedikit harapan semoga skripsi yang sederhana ini dapat berguna dan bermanfaat bagi kita semua. Aamiin. Bandar Lampung, 16 Januari 2017 Penulis
Teguh Dwi Wicaskono
i
DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR ISI...................................................................................................... i DAFTAR TABEL ............................................................................................. iii DAFTAR GAMBAR......................................................................................... iv
BAB 1 PENDAHULUAN 1.1.Latar Belakang ........................................................................................ 1 1.2.Rumusan Masalah ................................................................................... 5 1.3.Tujuan Penelitian .................................................................................... 5 1.4.Manfaat Penelitian .................................................................................. 6 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Memori Spasial ..................................................................................... 7 2.1.1. Pengertian dan Jenis-jenis memori................................................ 7 2.1.2. Mekanisme Penyimpanan Memori Spasial ................................... 9 2.2. Plumbum ............................................................................................... 12 2.2.1. Pengertian Plumbum ..................................................................... 12 2.2.2. Plumbum Sebagai Pemicu Stres Oksidatif.................................... 13 2.2.3. Pengaruh Stres Oksidatif terhadap Memori Spasial...................... 15 2.2.4. Pengaruh Stres Oksidatif terhadap Intake Sukrosa ....................... 18 2.3. Morris Water Maze ............................................................................... 19 2.4. Kerangka Teori ..................................................................................... 21 2.5. Kerangka Konsep.................................................................................. 23 2.5. Hipotesis ............................................................................................... 23 BAB 3 METODE PENELITIAN 3.1. Desain Penelitian .................................................................................. 24 3.2. Tempat dan Waktu Penelitian ............................................................... 24
ii
3.3. Populasi dan Sampel ............................................................................. 24 3.4. Kelompok Perlakuan............................................................................. 25 3.5. Kriteria Inklusi dan Eksklusi ................................................................ 26 3.6. Variabel Penelitian................................................................................ 26 3.7. Definisi Operasional ............................................................................. 27 3.8. Bahan dan Alat Penelitian..................................................................... 28 3.9. Prosedur Penelitian ............................................................................... 28 3.9.1. Pembuatan Larutan Plumbum Asetat.......................................... 28 3.9.2. Prosedur Pengujian Memori Spasial Morris Water Maze .......... 29 3.9.3. Prosedur Pengujian Intake Sukrosa ............................................ 31 3.9.4. Alur Penelitian ............................................................................ 32 3.10. Analisis Data....................................................................................... 33 3.11. Etika Penelitian ................................................................................... 33 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Gambaran Umum Penelitian................................................................. 35 4.2. Hasil Penelitian ..................................................................................... 36 4.2.1. Memori Spasial ............................................................................. 36 4.2.2. Intake Sukrosa ............................................................................... 37 4.2.3. Analisis Bivariat ............................................................................ 37 4.3. Pembahasan........................................................................................... 42 4.3.1. Hubungan Plumbum terhadap Memori Spasial ............................ 42 4.3.2. Hubungan Stres Oksidatif terhadap Intake Sukrosa...................... 46 BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN 5.1. Kesimpulan ........................................................................................... 49 5.2. Saran ..................................................................................................... 49 DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN
iii
DAFTAR TABEL Tabel
Halaman
Tabel 1. Definisi Operasional .............................................................................. 27 Tabel 2. Hasil Rerata Memori Spasial ................................................................. 36 Tabel 3. Hasil Rerata Intake Sukrosa................................................................... 37 Tabel 4. Uji Normalitas Data ............................................................................... 38 Tabel 5. Uji Homogenitas Levene’s..................................................................... 38 Tabel 6. Hasil Uji One-way anova Memori Spasial ............................................ 39 Tabel 7. Hasil Post Hoc LSD Memori Spasial .................................................... 40 Tabel 8. Hasil Uji One-Way Anova Intake Sukrosa............................................. 40 Tabel 9. Hasil Post Hoc LSD Intake Sukrosa ...................................................... 41
iv
DAFTAR GAMBAR
Gambar
Halaman
Gambar 1. Jalur Potensial Aksi Ingatan Jangka Panjang ..................................... 10 Gambar 2. Mekanisme Plumbum Mengakibatkan Kematian Sel ....................... 17 Gambar 3. Ilustrasi Morris Water Maze Test ....................................................... 20 Gambar 4. Kerangka Teori.................................................................................... 22 Gambar 5. Kerangka Konsep ................................................................................ 23 Gambar 6. Diagram Alur Penelitian ..................................................................... 32
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1
Latar Belakang
Jumlah Penduduk di Indonesia pada tahun 2010 tercatat sebanyak 238 juta jiwa. Setiap tahunnya jumlah penduduk indonesia meningkat, hal ini sebanding lurus dengan peningkatan jumlah kendaraan bermotor (BPS, 2012). Dimana, sampai tahun 2013 jumlah kendaraan bermotor di Indonesia sebesar 105 juta unit (BPS, 2014). Peningkatan jumlah kendaraan bermotor ini, tentunya akan menurunkan kualitas lingkungan yang disebabkan oleh meningkatnya polusi udara (Shafii, 2008). Hasil dari berbagai observasi menyebutkan bahwa konstribusi polusi udara dari kendaraan bermotor mencapai 70%-80% dari total pencemaran (Depkes, 2014).
Perlu disadari oleh masyarakat bahwa 89% karbon monoksida (CO), 100% plumbum (Pb), 73% hidrokarbon (HC), 61% oksida nitrogen (NOx), 53% karbon dioksida (CO2) dan 1% asap di udara dihasilkan oleh kendaraan bermotor bensin (spark ignition engine) dari keseluruhan gas buangan kendaraan bermotor (Irawan, 2008). Diantara sumber polusi yang terdapat pada gas buangan kendaraan bermotor tersebut, terdapat satu logam berat berbahaya yaitu plumbum (Pb). Plumbum merupakan salah
2
satu logam berat yang dapat berdampak buruk bagi kesehatan jika terhirup ke dalam sistem pernapasan. Plumbum banyak dihasilkan dari kendaraan bermotor bensin, kurang lebih 25%-50% Pb tinggal di udara. Dengan demikian, semakin banyak kendaraan yang digunakan, maka akan semakin banyak juga Pb yang tertinggal di udara (Sudarmaji et al., 2006).
Tingginya kadar Pb pada pencemaran udara oleh kendaraan bermotor ini, dapat mengakibatkan terhirupnya logam berat ini ke dalam saluran pernafasan. Plumbum akan masuk ke dalam tubuh manusia bersama udara yang terhirup melalui saluran pernapasan dan saluran pencernaan, sedangkan absorpsi melalui kulit sangat kecil sehingga dapat diabaikan. Rerata 10-30% Pb yang terinhalasi diabsorpsi oleh paru paru dan sekitar 5-10% dari yang tertelan diabsorpsi melalui
saluran cerna,
sedangkan sebanyak 30-40% Pb yang diabsorpsi melalui saluran pernapasan akan masuk ke aliran darah, masuknya Pb ke aliran darah tergantung pada ukuran partikel, daya larut, volume pernapasan dan variasi faal antar individu (Kurniawan, 2008).
Berdasarkan hasil penelitian Manalu (2001) diketahui bahwa tingkat kepadatan lalu lintas berpengaruh terhadap kadar Pb dalam darah pedagang kaki lima. Pada kepadatan lalu lintas yang tinggi menunjukan kadar Pb di udara sebesar 0.007-0.021 µg/m3 dengan kadar Pb dalam darah pedangang kaki lima sebesar 0.366-0.806 ppm. Pada lalu lintas dengan kepadatan yang sedang menunjukan kadar Pb di udara sebesar 0.005-0.015 µg/m3 dengan kadar Pb dalam darah pedangang kaki lima sebesar 0.1240.339 ppm sedangkan pada lalu lintas dengan kepadatan yang rendah menunjukan
3
kadar Pb di udara sebesar 0.0048-0.0096 µg/m3 dengan kadar Pb dalam darah pedangang kaki lima sebesar 0.176-0.298 ppm.
Di dalam tubuh, Pb dapat menyebabkan stres oksidatif (Ostrovskaya et al, 2011). Induksi Pb selama 96 jam dapat menyebabkan stres akut yang ditandai dengan perubahan morfologi dan respon dari antioksidan diantaranya catalase (CAT), peroxidase (POD), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx), malondialhydeid (MDA) (Tian et al., 2014). Ambica et al., (2016) melakukan penilaian pengaruh Pb terhadap kadar enzim antioksidan pada 250 penduduk kota secara acak yang sering terpapar asap kendaraan. Terjadi peningkatan kadar CAT, SOD dan GPx pada penduduk yang memiliki kadar Pb darah diatas 15 µg/dl. Pada penelitian Li et al., (2015) induksi Pb dalam peroide akut dengan konsentrasi yang berbeda (0, 3.6, 7.3, 14, 29, 58 mg/dl) selama 7 hari menunjukan perubahan histopatologi testis dan peningkatan enzim CAT, GPx dan SOD yang menunjukan bahwa terjadinya stres oksidatif. Shafiq-ur-rehman (1984) menginduksi tikus dengan Pb asetat 2% selama 10 hari. Penelitian ini menunjukan terjadinya peroksidasi lipid pada membran sel di semua bagian otak tikus. Pada penelitian Ahmed et al., (2013) terjadi kematian sel pada otak tikus yang diinduksi dengan 25 dan 50 mg/kg plumbum asetat.
Salah satu organ yang paling peka terhadap stres oksidatif ialah hippocampus (Harbani, 2013). Ercal et al., (2001) menjelaskan bahwa oksidan yang dicetuskan oleh Pb maupun efek langsung terhadap membran sel dapat memicu terjadinya cidera
4
sel yang dapat berlanjut menjadi kematian sel-sel. Lebih lanjut dalam penelitian Shafiq-ur-rehman (1984) menunjukan bahwa Pb dapat dapat menginduksi peroksidasi lipid sel neuron di semua bagian otak. Jika peroksidasi lipid ini berlanjut maka kematian sel pun dapat terjadi (Kumar, 2007). Pada penelitian Meng et al., (2016) paparan Pb ini dapat menyebabkan kematian sel-sel di hippocampus dan mengakibatkan gangguan pada memori spasial.
Morris water maze pada penelitian Novita (2015) digunakan untuk menguji pengaruh stres kronis listrik terhadap memori spasial pada tikus putih galur dawley. Morris water maze, walaupun terlihat sederhana, merupakan suatu uji yang menantang bagi tikus karena memerlukan berbagai proses pemikiran yang rumit. Proses ini meliputi lokalisasi spasial berdasarkan petunjuk visual yang secara berurutan melibatkan peristiwa pemrosesan, konsolidasi, retensi, dan retrieval untuk bisa mencapai pada platform yang tersembunyi di water maze (Alvin & Terry, 2009).
Belakangan ini, ada beberapa penelitian tentang pengaruh stres terhadap perubahan perilaku yang dinilai dari intake sukrosa. Pada penelitian-penelitian tersebut menunjukan bahwa stres dapat menurunkan asupan sukrosa pada hewan coba (Grønli, 2006; Pothion et al., 2004). Hingga saat ini, belum ada penelitian mengenai pengaruh induksi plumbum terhadap intake sukrosa. Zat beracun merupakan salah satu pencetus terjadinya stres dan plumbum merupakan salah satu dari zat yang sangat beracun bagi tubuh (Sherwood, 2014 ; Widiowati, 2008). Oleh karena itu,
5
penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh dari induksi plumbum terhadap perubahan perilaku yang dinilai dari intake sukrosa.
Berdasarkan uraian latar belakang diatas, penulis berminat untuk melakukan penelitian tentang pengaruh induksi plumbum asetat dalam 7 hari terhadap memori spasial (Water Morris maze test) dan intake sukrosa pada tikus putih (Rattus novergicus) galur Sprague dawley.
1.2
Rumusan Masalah
Dari latar belakang diatas dapat dirumuskan masalah penelitian yaitu: 1.
Apakah terdapat pengaruh Pb asetat terhadap memori spasial pada tikus putih (Rattus norvegicus) galur Sprague dawley?
2.
Apakah terdapat pengaruh Pb asetat terhadap intake sukrosa pada tikus putih (Rattus norvegicus) galur Sprague dawley?
1.3
1.
Tujuan Penelitian
Untuk mengetahui pengaruh Pb asetat terhadap terhadap memori spasial dengan water morris maze test pada tikus putih (Rattus novergicus) galur Sprague dawley.
6
2.
Untuk mengetahui pengaruh Pb asetat terhadap perubahan prilaku yang dinilai dari intake sukrosa tikus putih (Rattus novergicus) galur Sprague dawley.
1.4
1.
Manfaat Penelitian
Bagi Peneliti
Untuk menambah pengetahuan mengenai tata cara penulisan karya ilmiah yang baik dan mengetahui pengaruh Pb asetat terhadap terhadap memori spasial dan perubahan prilaku yang dinilai dari intake sukrosa tikus putih (Rattus novergicus) 2.
Bagi Institusi Pendidikan
Hasil yang diperoleh dari penelitian ini diharapkan dapat dipublikasikan sehingga memberikan sumbangan informasi bagi ilmu pengetahuan di bidang kedokteran. 3.
Bagi Masyarakat
Memberikan informasi untuk meningkatkan pengetahuan masyarakat mengenai bahaya dari polutan (plumbum asetat).
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA
2.1
Memori Spasial
2.1.1 Pengertian dan jenis-jenis Memori
Memori merupakan bentuk penyimpanan informasi yang didapat dari proses pembelajaran atau latihan berulang (Dorland, 2010). Proses pembelajaran tersebut akan disandikan (coding), disimpan (storage) dan kemudian dikeluarkan kembali (retrieve atau recall) dalam bentuk ingatan (Kandel et al, 2000). Secara umum, yang disimpan adalah konsep bukan informasi verbatim (kata-kata). Namun demikian, informasi yang disimpan dapat juga berupa kata demi kata (Sherwood, 2014).
Penyimpanan informasi yang diperoleh dilakukan paling sedikit dalam dua cara: ingatan jangka-pendek (short term memory) dan ingatan jangka-panjang (long term memory) (Guyton & Hall, 2007). Ingatan jangka-pendek memiliki kapasitas penyimpanan terbatas dan berlangsung detik hingga jam, sedangkan ingatan jangka-panjang berkapasitas sangat besar dan dipertahankan dalam hitungan harian hingga tahunan (Sherwood, 2014).
8
Terdapat dua jenis memori berdasarkan jenis informasi yang disimpan, yaitu memori deklaratif (eksplisit) dan memori non-deklaratif (implisit). Memori eksplisit terlibat dalam proses mengingat secara sadar terhadap informasi tentang individu, kejadian spesifik, tempat, dan benda (Sherwood, 2014). Sedangkan memori implisit terlibat dalam proses mengingat bawah sadar dalam pelaksanaan tugas dan prosedur, seperti keterampilan motorik (Mann & Klemm, 2011).
Memori spasial termasuk dalam memori deklaratif atau eksplisit (Cassenti & Carlson, 2008). Memori spasial berkaitan dengan kemampuan mengingat ruang bidang, mengenali bentuk, jarak, dan luas, serta mengetahui arah atau posisi seseorang. Tanpa adanya memori spasial maka individu akan mengalami kesulitan dalam memahami posisi diri, melihat bentuk dan ruang bidang, tidak dapat mengingat arah atau letak suatu benda, serta tidak dapat memperkirakan jarak suatu tempat (Mastrangelo et al., 2008). Stimulus berupa gambar-gambar yang merepresentasikan peristiwa terkini dimasukkan ke hippocampus kemudian diasosiasikan dengan stimulus peristiwa di masa lampau (Japardi, 2002).
Berbeda dengan memori spasial yang berkaitan mengenali sesuatu yang luas, memori kerja merupakan ingatan yang digunakan untuk merencanakan, memutuskan dan melaksanakan suatu tindakan. Sebagai contoh sesuatu yang bergantung pada memori kerja diantaranya ketika kita hendak menyelesaikan suatu masalah matematika tanpa menggunakan kertas, menyimpulkan suatu pendapat yang panjang, dan tidak melakukan kesalahan dua kali saat menjawab suatu pertanyaan pilihan (Sherwood, 2014).
9
2.1.2 Mekanisme Penyimpanan Memori Spasial
Hippocampus merupakan tempat dominan terjadinya penyimpanan jangkapanjang serta krusial bagi perubahan ingatan jangka-pendek menjadi ingatan jangka-panjang. Hippocampus juga
berperan sangat penting dalam ingatan
spasial (Sherwood, 2014). Hippocampus sendiri adalah bagian tengah lobus temporalis yang merupakan bagian sistem limbik (Snell, 2011).
Proses penyimpanan dan mengingat kembali sesuatu hal dimulai ketika neuron presinaps melepaskan neurotransmitter eksitatorik glutamat sebagai respon potensial aksi (Sherwood, 2014). Glutamat berikatan dengan dua jenis reseptor di neuron pascasinaps, yaitu reseptor N-methyl-D-aspartic acid (NMDA) dan reseptor
α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic
acid
(AMPA).
Reseptor AMPA adalah kanal-reseptor yang biasa terdapat pada sinaps, yang terbuka jika berikatan dengan glutamat dan memungkinakan ion
masuk ke
dalam neuron pascasinaps (Gümrü & Arıcıoğlu, 2012). Sedangkan reseptor NMDA adalah kanal-reseptor yang memungkinkan masuknya
ketika
terbuka. Akan tetapi, kanal-reseptor ini ditutup oleh pintu dan ion magnesium (
) yang secara fisik menghambat kanal untuk membuka pada potensial
istirahatnya (Zito, 2009). Untuk membuka kanal NMDA, harus ada dua kejadian yang terjadi hampir bersamaan, yaitu pelepasan glutamat prasinaps dan depolarisasi pascasinaps oleh masukan lain. (Zito, 2009). Kanal NMDA terbuka jika berikatan dengan glutamat, akan tetapi aksi ini sendiri tidak mengizinkan masuknya
. Depolarisasi
10
tambahan pada neuron pascasinaps, akibat terikatnya glutamat pada reseptor AMPA cukup diperlukan untuk mendepolarisasikan neuron pascasinaps agar dapat dipaksa keluar dari kanal ini (Sherwood, 2014).
Gambar 1. Jalur Potensial Aksi Memori (Sumber : Sherwood, 2014)
Ketika kanal-reseptor NMDA terbuka akibat pembukaan pintu dan pengeluaran secara bersamaan,
memasuki sel pascasinaps.
yang masuk
mengaktifkan jalur caraka kedua (second messenger) pada neuron ini. Jalur caraka kedua ini
menyebabkan penyisipan fisik reseptor AMPA
tambahan pada
11
membran pascasinaps, sehingga menyebabkan peningkatan ketersediaan reseptor AMPA. Peningkatan ketersediaan reseptor AMPA ini akan meningkatkan potensial aksi eksitatorik pada neuron pascasinaps. Peningkatan sensitivitas neuron pascasinaps ini akan membantu mempertahankan ingatan jangka panjang. Selain itu, jalur caraka kedua ini juga mengeluarkan nitrat oksida yang akan memberikan umpan balik positif. Umpan balik positif ini akan meningkatkan pelepasan glutamat dan membantu mempertahankan ingatan (Sherwood, 2014).
Modifikasi yang berlangsung selama pembentukan ingatan jangka panjang akan bertahan lama meskipun aktivitas yang menyebabkan perubahan ini telah berhenti. Oleh karena itu, informasi dapat disampaikan disepanjang jalur sinaps yang sama ini dengan lebih efisien jika terkativasi kembali di masa yang akan datang (meningat). Ingatan jangka panjang bersifat spesifik bagi jalur yang teraktivasi. Jalur di antara masukan prasinaps inaktif lainnya dan sel pascasinpas yang sama tidak terpengaruh (Sherwood, 2014). Sehingga jika kita mengingat sesuatu yang baru dalam jangka panjang, maka akan ada pembentukan sinaps baru khusus yang permanen dalam jalur pengingatan hal tersebut. Berbeda dengan ingatan jangka pendek yang hanya memperkuat hubungan sinaps-sinaps yang sudah ada (Guyton & Hall, 2007).
12
2.2
Plumbum (Pb)
2.2.1 Pengertian Plumbum
Plumbum (Pb) atau lebih dikenal dengan nama timah hitam (timbal) merupakan saah satu logam berat yang terdapat secara alami di kerak bumi. Plumbum dimasukan ke dalam logam berat karena memiliki massa jenis lebih dari 5gr/cm3 atau lima kali lebih besar dibandingkan massa jenis air (1gr/cm3) (Ernawati, 2010). Plumbum sendiri memiliki massa jenis 11.34 g/cm3 (Widiowati, 2008).
Plumbum pada awalnya merupakan logam berat yang terdapat di kerak bumi (Widowati, 2008). Di dalam bumi sebenarnya jumlah Plumbum sangatlah sedikit, yaitu hanya 0.0002% dari jumlah kerak bumi jika dibandingkan dengan logam lain (Palar, 1994). Akan tetapi, jumlah plumbum di permukaan bumi dapat mencapai 300 kali lebih banyak dibandingkan Pb alami. Peningkatan jumlah Pb di permukaan bumi tersebut terjadi karena penggunaan Pb dalam kehidupan manusia (Widiowati, 2008). Zat ini banyak ditemukan pada peralatan sehari-hari, seperti kabel telepon, kabel listrik, pipa air minum, zat pewarna ada cat, zat penkilap pada keramik dan bahan bakar kendaraan bermotor (Nasution, 2004).
Plumbum merupakan salah satu logam berat dan oksidan kuat. Plumbum akan sangat berbahaya bagi tubuh karena dapat menyebabkan iritasi kulit, mata dan saluran napas, merusak gusi, sistem saraf pusat, ginjal dan sistem reproduksi (MSDS, 2006). Zat ini dapat masuk kedalam tubuh melalui makanan, air, udara
13
yang tercemar oleh logam Pb. Plumbum yang masuk akan diabsorpsi oleh tubuh. Orang dewasa mengabsorpsi Pb 5-15% dari seluruh Pb yang masuk, Sedangkan anak-anak mengabsorpsi Pb lebih besar yaitu 41.5% (Widiowati, 2008).
2.2.2 Plumbum Sebagai Pemicu Stres Oksidatif
Plumbum merupakan racun yang dapat menyebabkan berbagai gangguan di dalam tubuh. Berbagai gangguan tersebut diantaranya seperti gangguan neurologis, hematologi, dan reproduksi. Aktivitas senyawa Pb dalam tubuh dikaitkan dengan stres oksidatif, melalui pembentukan molekul reactive oxygen species (ROS) (Aykin-Burns et al., 2003; Ding et al., 2000).
Oksigen dapat menerima elektron tunggal dan membentuk molekul tak stabil yang dikenal dengan molekul ROS. Beberapa contoh ROS antara lain radikal singlet oksigen (O-), superoksid (O2-), dan radikal hidroksil (HO). Dalam homeostasis tubuh manusia, normalnya pembentukan ROS umumnya dijaga seminimal mungkin oleh mekanisme pertahanan antioksidan (Sherwood, 2014). Beberapa kondisi tertentu dimana peningkatan radikal bebas tidak diimbangi dengan peningkatan pertahanan antioksidan, akan menyebabkan beberapa kerusakan dalam jaringan, yang dikenal sebagai stres oksidatif (Mc Kee, 2003).
Menurut Ercal et al, (2001) mekanisme Pb dalam pembentukan radikal bebas terdiri dari 2 cara berbeda yang berhubungan, yakni pembentukan ROS dan penekanan sistem antioksidan
14
1. Pembentukan ROS Ion Plumbum memiliki efek langsung terhadap membran sel, dimana pajanan berlebihan Pb pada membran sel mungkin meningkatan perubahan intregitas pada komponen membran sel (Gurer & Ercal, 2000). Pajanan Pb di membran sel otak meyebabkan
perubahan
level
dari
phospolipid pada membran
dimana
berhubungan lurus dengan peningkatan peroksidasi lemak (Shafiq-ur-rehman, 1984). Menurut Ercal et al., (2001) perubahan komposisi lipid ini adalah penyebab perubahan integritas, permeabilitas dan fungsi membran sel yang akan meningkatkan peroksidasi lemak. Selain itu. senyawa Pb juga menghambat dehidrogenase
(DALAD),
enzim
utama
delta aminolevulinic acid
dalam
biosintesis
heme
yang
menyebabkan peninggian kadar substrat aminolevulinic acid (ALA). Peningkatan kadar ALA menyebabkan pembentukan hidrogen peroksida, radikal superoksida dan juga interaksi keduanya menghasilkan radikal hidroksil, suatu radikal bebas yang paling reaktif (Ercal et al., 2001).
2. Penekanan sistem antioksidan Plumbum memiliki affinitas tinggi terhadap gugus sulfhidril (SH) (Widiowati, 2008). Zat ini menghambat beberapa enzim dengan gugus fungsional SH seperti enzim DALAD dan glucose 6-phosphat dehidrogenase (G6PD). G6PD adalah enzim yang bertanggung jawab untuk menyediakan NADPH di luar mitokondria. Molekul pereduksi NADPH ini penting dalam menjaga tersedianya glutathione (γ-
15
glutamyl-cysteinyl-glycine;
GSH)
yang dibentuk
kembali
dari
glutation
teroksidasi (GSSG) oleh enzim glutation reduktase (GR) (Devlin, 2002). Glutathione mempunyai gugus tiol (-SH) yang besifat reduktif yang menjadikan molekul ini pelindung sel dari stres oksidatif. Plumbum yang berikatan dengan gugus tiol dari GSH, menyebabkan kadar GSH menurun dan mempengaruhi aktivitas antioksidannya. Selain itu, Enzim GR membantu sistem pertahanan antioksidan secara tak langsung. Enzim ini memiliki disulfida pada tempat katalitiknya, yang merupakan target dari Pb. Dengan demikian, Pb yang terikat pada enzim ini akan menghambat aktivitasnya (Ercal et al., 2001).
2.2.3 Pengaruh Stres Oksidatif terhadap Memori Spasial
Penelitian mengenai pengaruh stres oksidatif terhadap memori spasial mulai banyak dilakukan dalam satu dekade terakhir. Penelitian-penelitian tersebut menunjukan bahwa stres oksidatif dapat melemahkan memori spasial pada hewan coba (Hritcu et al., 2011; Pandey et al., 2015; Sandi et al., 2005). Stres oksidatif sendiri adalah ketidakseimbangan antara jumlah radikal dan antioksidan, dimana jumlah radikal bebas lebih banyak dibandingkan dengan antioksidan. Sebelumnya telah dijelaskan bagaimana Plumbum dapat menyebabkan stres oksidatif (Murray et al., 2009).
Radikal bebas merupakan spesies kimiawi dengan satu elektron tak berpasangan di orbital terluar. Keadaan kimiawi tersebut sangat tidak stabil dan mudah bereaksi dengan zat kimia anorganik atau organik (Murray et al., 2009). Saat
16
dibentuk dalam sel radikal bebas segera menyerang dan mendegradasi asam nukleat serta berbagai molekui membran. Selain itu, radikal bebas menginisiasi reaksi autokatalitik. sebaliknya, molekul yang bereaksi dengan radikal bebas diubah menjadi radikai bebas, semakin memperbanyak rantai kerusakan (Kumar, et al., 2007).
Menurut Kumar (2007) tiga reaksi yang paling relevan dengan jejas sel yang diperantarai radikal bebas 1. Peroksidasi lipid membran Ikatan ganda pada lemak tak jenuh membran mudah terkena serangan radikal bebas berasal dari oksigen. Interaksi radikal lemak menghasilkan peroksida, yang tidak stabil dan reaktif, dan terjadi reaksi rantai autokatalitik. Sebelumnya juga telah dijelaskan bahwa Pb memiliki efek langsung terhadap membran sel hippocampus yang dapat mengakibatkan peroksidasi lemak (Ercal et al., 2001; Shafiq-ur-rehman, 1984). 2. Fragmentasi DNA Reaksi radikal bebas dengan timin pada DNA mitokondria dan nuklear menimbulkan rusaknya untai tunggai. Kerusakan DNA tersebut telah memberikan implikasi pada pembunuhan se1 dan perubahan sel menjadi ganas. 3. Ikatan silang protein Radikal bebas mencetuskan ikatan silang protein yang diperantarai sulfhidril, menyebabkan peningkatan kecepatan degradasi atau hilangnya aktivitas
17
enzimatik. Reaksi radikal bebas juga bisa secara langsung menyebabkan fragmentasi polipeptida. Melalui reaksi-reaksi tersebut, radikal bebas maupun ROS dapat mengakibatkan Jejas pada sel yang kemudian dapat berlanjut menjadi kematian sel (Kumar, 2007). Plumbum maupun ROS yang dihasilkan oleh reaksi Pb dapat mngakibatkan kematian sel-sel pada hippocampus yang akan melemahkan dari memori spasial (Meng et al., 2016).
Gambar 1. Mekanisme Plumbum Mengakibatkan Kematian Sel (Sumber : Ercal et al., 2001)
18
2.2.4 Pengaruh Stres Oksidatif terhadap Intake Sukrosa
Ketidakseimbangan antara radikal bebas dan antioksidan dalam tubuh akan menimbulkan respon fisiologis. Pada keadaan ini disekresikan beberapa hormon dalam mempertahankan homeostasis tubuh. Epinefrin merupakan hormon yang disekresikan karena respon stres terhadap peningkatan tonus saraf simpatis (Sherwood, 2014). Selain itu, epinefrin juga akan memobilisisasi simpanan energi lemak dan karbohidrat untuk meningkatkan glukosa dan asam lemak darah sebagai respon dalam mempertahankan kondisi tubuh (Guyton & Hall, 2007).
Selain epinefrin, sejumlah hormon lain berperan dalam respon stres secara keseluruhan Respon hormon utama adalah pengaktifan sistem corticotropin releasing hormone (CRH) – adrenocorticotropin hormone (ACTH) – kortisol. Peran kortisol dalam membantu tubuh menghadapi stres diperkirakan berkaitan dengan efek metaboliknya. Kortisol menguraikan simpanan lemak dan protein sembari memperbanyak simpanan karbohidrat dan meningkatkan ketersediaan glukosa darah (Sherwood, 2014).
Peningkatan glukosa dan asam lemak darah juga terjadi karena penurunan hormon insulin dan peningkatan hormon glukagon. Baik sistem saraf simpatis maupun epinefrin yang disekresikan keduanya menghambat insulin dan merangsang glukagon (Sherwood, 2014). Perubahan hormon ini bekerja sama untuk meningkatkan kadar glukosa dan asam lemak darah. Epinefrin dan glukagon mendorong glikogenolisis hati. Hormon-hormon ini juga bersama kortisol
19
mendorong glukoneogenesis hati. Namun, insulin yang sekresinya tertekan selama stres, melawan penguraian simpanan glikogen hati. Semua efek ini membantu meningkatkan konsentrasi glukosa darah (Guyton & Hall, 2007).
Peningkatan glukosa darah tersebut akan didistribusikan ke jaringan yang lebih aktif saat terjadinya stres, seperti otak dan otot skelet. Aktivitas yang tidak diperlukan seperti pencernaan, produksi hormone pertumbuhan dan gonad akan dikurangi. Sehingga pada saat terjadi stres hal seperti aktivitas makan, pertumbuhan dan aktivitas seksual akan mengalami penurunan (Schneiderman et al., 2005). Pada penelitian Pothion et al., (2004) dan Murray et al., (2013) menunjukan penurunan aktivitas makan pada tikus yang diinduksi oleh stres melalui penurunan intake sukrosa per oral.
2.3
Morris Water Maze
Morris water maze merupakan suatu uji yang menantang bagi tikus karena memerlukan berbagai proses pemikiran yang rumit. Proses ini meliputi lokalisasi spasial berdasarkan petunjuk visual yang secara berurutan melibatkan peristiwa pemrosesan, konsolidasi, retensi, dan retrieval untuk bisa mencapai pada platform yang tersembunyi di water maze. Proses umum pada tikus yang menggunakan navigasi visuospasial ini juga dianggap mempunyai kontribusi yang sama pada manusia untuk penggunaan proses kognitif sehari-hari. Oleh karena itu, model uji menggunakan Morris water maze ini dianggap relevan dengan studi pada penyakit
20
neurodegeneratif atau neuropsikiatri di mana terdapat gangguan fungsi memori (Alvin & Terry, 2009).
Morris water maze secara umum menggunakan kolam air berbentuk bulat berdiameter 120-180 cm dan kedalaman 60cm dengan air yang dijaga suhunya sesuai suhu ruang serta memiliki platform yang tersembunyi di bawah permukaan air. Platform ini disembunyikan dengan cara : menambahkan bahan tertentu (susu atau zat pewarna yang tidak berbahaya) agar air terlihat opaque, atau platform diberi cat yang sama dengan dasar dan dinding kolam. Beberapa objek gambar dengan bentuk geometri yang berbeda-beda (lingkaran, segitiga, persegi, dll.) ditempelkan pada dinding kolam untuk menandai kuadran kolam dan dapat digunakan tikus sebagai alat bantu navigasi dalam kolam. Tikus secara individu dimasukkan ke dalam kolam untuk kemudian dicatat waktu dan jarak tempuh yang dibutuhkan untuk mencapai platform (Alvin & Terry, 2009; Watermaze, 2013).
Gambar 3. Ilustrasi Morris Water Maze Test (Sumber : Alvin & Terry, 2009)
21
2.4
Kerangka Teori
Plumbum merupakan logam berat yang bersifat toksis bagi tubuh dan dapat masuk kedalam tubuh melalui sistem pernapasan maupun pencernaan. Plumbum yang masuk dapat menyebabkan stres oksidatif dengan meningkatkan radikal bebas dan menekan sistem antioksidan (Ercal et al., 2001). Stres oksidatif ini dapat menyebabkan kerusakan pada sel neuron hippocampus yang pada akhirnya sel tersebut mengalami kematian (Shafiq-ur-rehman, 1984). Kematian sel-sel neuron hippocampus ini akan menurunkan memori spasial. Ketidakseimbangan antara radikal bebas dan antioksidan dalam tubuh akan menimbulkan respon fisiologis yaitu dengan perubahan hormonal, seperti peningkatan hormon epinefrin, glukagon dan kortisol (Sherwood, 2014). Hormon-hormon tersebut akan meningkatkan glukosa darah yang akan didistribusikan ke jaringan yang lebih aktif saat stres seperti otak. Sehingga pada saat stres aktivitas seperti makan akan menurun (Schneiderman et al., 2005).
22
Induksi Akut Plumbum Asetat
Efek langsung radikal Pb dan Peningkatan ROS
Penekanan Sistem Antioksidan
Stres Oksidatif
Kerusakan Sel Neuron Hippocampus
Gangguan pada Memori Spasial
↑ Epinefrin
↑ Kortisol
↑ Glukagon
Peningkatan Glukosa darah, Asam amino darah dan asam lemak darah
Perubahan Intake Sukrosa
Keterangan : = Memicu = Yang diteliti
Gambar 4. Kerangka Teori Pengaruh induksi plumbum asetat pada tikus putih jantan terhadap memori spasial dan intake sukrosa
23
2.5
Kerangka Konsep
Variabel Independen
Variabel Dependen
Memori Spasial
Induksi Plumbum Asetat Intake Sukrosa
Gambar 5. Kerangka Konsep 2.6
Hipotesis
1. H0: Tidak terdapat pengaruh induksi plumbum asetat terhadap memori spasial tikus putih (Rattus novergicus) galur Sprague dawley. H1: Terdapat pengaruh induksi plumbum asetat terhadap memori spasial tikus putih (Rattus novergicus) galur Sprague dawley.
2. H0: Tidak terdapat pengaruh induksi plumbum asetat terhadap intake sukrosa tikus putih (Rattus novergicus) galur Sprague dawley. H1: Terdapat pengaruh induksi plumbum asetat terhadap intake sukrosa tikus putih (Rattus novergicus) galur Sprague dawley.
BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1
Desain Penelitian
Penelitian ini merupakan studi eksperimental dengan metode rancangan acak lengkap (RAL) dengan pendekatan post test only control group design. Dengan rancangan ini, peneliti dapat membandingkan hasil perlakuan antara kelompok perlakuan dan kelompok kontrol.
3.2
Tempat dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September-Oktober tahun 2016 di animal house Fakultas Kedokteran Universitas Lampung.
3.3
Populasi dan Sampel
Sampel yang dipakai pada penelitian ini adalah tikus, menurut Watermaze (2013) tikus adalah hewan terbaik sebagai hewan coba pada morris water maze, karena hewan ini adalah hewan yang sama digunakan morris pada penelitian memori spasial.
25
Populasi penelitian ini adalah tikus putih jantan (Rattus norvegicus) galur Sprague dawley berumur 2-3 bulan atau 10-12 minggu yang diperoleh dari Institut Pertanian Bogor. Jumlah sampel berdasarkan kriteria sampel WHO yaitu minimal 5 ekor pada setiap kelompok. Penentuan besar sampel ditentukan dengan menggunakan rumus Federer: t (n-1) ≥ 15 4 (n-1) ≥ 15 4n - 4 ≥ 15 4n ≥ 19 n≥ 5 Untuk mengantisipasi drop out, maka sampel ditambah 10% pada setiap kelompok (Notoatmodjo, 2005). Sehingga didapatkan sampel sebanyak 24 ekor, dengan masing-masing kelompok terdiri 6 ekor tikus sampai akhir penelitian.
3.4
Kelompok Perlakuan
1. Kelompok 1: Kelompok tikus yang tidak diinduksi plumbum asetat (Kelompok Kontrol). 2. Kelompok 2: Kelompok tikus yang diinduksi plumbum asetat 50mg/kgbb per hari (Kelompok P1). 3. Kelompok 3: Kelompok tikus yang diinduksi plumbum asetat 100mg/kgbb per hari (Kelompok P2).
26
4. Kelompok 4: Kelompok tikus yang diinduksi plumbum asetat 200mg/kgbb per hari (Kelompok P3).
3.5
Kriteria Inklusi dan Ekslusi
Kriteria inklusi sampel pada penelitian adalah: 1. Tikus putih jantan (Rattus norvegicus) galur Sprague dawley 2. Sehat 3. Berat Badan 150-250 gram 4. Usia 2-3 bulan atau 10-12 minggu.
Kriteria ekslusi sampel pada penelitian adalah: 1. Rambut botak atau rontok 2. Aktivitas tidak aktif
3.6
Variabel Penelitian
Variabel penelitian yang digunakan adalah sebagai berikut:
1. Variabel Bebas: Variabel bebas pada penelitian ini adalah induksi plumbum asetat. 2. Variabel Terikat: Variabel terikat pada penelitian ini adalah memori spasial dan intake sukrosa.
27
3.7
Definisi Operasional
Pada tabel 1 dapat dilihat variabel-variabel yang akan digunakan pada penelitian ini, berikut dengan definisi operasional, alat ukur yang digunakan, cara pengukuran, hasil ukur, dan skala variabel yang digunakan untuk penetuan uji analasis yang akan digunakan.
Tabel 1. Definisi Operasional No Variabel
Definisi
Alat Ukur
Hasil Ukur
Skala Kategorik
1.
Plumbum Asetat Bahan kimia beracun Spuit yang diberikan pada tikus jantan secara intraperitoneal
K = kontrol P1 = 50 mg/kg P2 = 100 mg/kg P2 = 200 mg/kg
2.
Memori Spasial
Kemampuan Stopwatch mengingat ruang bidang, mengenali bentuk, jarak, dan luas serta posisi yang dinilai dengan menggunakan alat morris maze radial (Mastrangelo et al., 2008).
3.
Intake Sukrosa
Jumlah sukrosa yang Gelas ukur dikonsumsi
Persentase waktu Numerik yang dihabiskan tikus berenang pada kuadran target terhadap keseluruhan waktu yang ditempuh tikus melewati seluruh kuadran (Alvin & Terry, 2009). Persentase Numerik konsumsi larutan sukrosa dengan jumlah keseluruhan cairan yang diminum (Pothion et al., 2004)
28
3.8
Bahan dan Alat Penelitian
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah sebagai berikut 1. Tikus jantan (Rattus norvegicus) galur Sprague dawley sehat 150-250 gram usia 2-3 bulan 2. Pb Asetat (Pb(CH3COO)2) 3. 60 ml air 4. 60 ml larutan sukrosa 4% Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah sebagai berikut 1. Spuit 1 cc/ml 2. Kandang tikus 3. Botol minuman 60 ml 4. Tempat makan 5. Stopwatch 6. Kamera 7. Morris water maze
3.9
Prosedur Penelitian
3.9.1 Pembuatan larutan Pb Asetat
Larutan plumbum asetat dibuat dengan cara melarutkan Pb asetat ke dalam aquades agar mudah untuk diinjesikan. Plumbum asetat memiliki kelarutan sebesar 20g/100ml dalam air, yang berarti plumbum asetat dapat dilarutkan ke
29
dalam aquades. Larutan stok Pb asetat dibuat dari dosis yang paling besar, yaitu 200 mg/kg. Tikus yang digunakan memiliki rerata berat badan 200 gram, sehingga didapatkan dosis 40 mg atau 0.04 gram yang akan dilarutkan ke dalam aquades. Besarnya pelarut didapatkan dari perbandingan dengan kelarautan dari plumbum asetat dalam air. 20 100 =
0.04
= 20
0.04 100
= 0.2
Berdasarkan perbandingan diatas, didapatkan bahwa 40 mg Pb asetat akan larut dalam 0.2 ml aquades. Sehingga didapatkan larutan stok Pb asetat sebesar 4gr/20ml aquades. Selanjutnya dilakukan pengenceran dari larutan stok untuk dosis 100 mg/kg dan 50 mg/kg.
3.9.2 Prosedur Pengujian Memori Spsial dengan Morris Water Maze
Uji memori spasial dilakukan sesudah perlakuan untuk membandingkan memori spasial tikus sesudah perlakuan pada tiap kelompok tikus. Semua hewan coba sebelumnya diberikan latihan dahulu dengan Morris water maze metode invisible platform trials selama 2 hari sebanyak 4 kali latihan dan dihitung waktunya mencapai platform (Watermaze, 2013).
Setiap awal percobaan, ditentukan satu titik awal tempat tikus diletakkan pertama kali di dalam kolam, lalu tikus akan berenang mencari platform dan naik ke atas
30
platform. Waktu yang dibutuhkan tikus untuk mencapai platform (escape latency) dicatat. Setelah tikus berhasil mencapai platform maka diberi waktu untuk beristirahat di atas platform selama 30 detik, lalu dikeringkan dan dikembalikan ke dalam kandang untuk menghangatkan tubuh sebelum dilakukan percobaan lagi berikutnya. Setiap kali percobaan harus selesai dalam waktu 60 detik. Bila dalam 60 detik tikus gagal mencapai platform, maka tikus dituntun ke arah platform dan dibiarkan selama 20 detik untuk beristirahat. Setelah itu, tikus diletakkan kembali ke kandang untuk persiapan diadakan percobaan berikutnya. Pada percobaan ketiga dan keempat, ditentukan lagi satu titik awal secara random tempat tikus diletakkan di dalam kolam pada awal uji ini, lalu tikus akan berenang mencari platform dan naik ke atas platform. Waktu yang dibutuhkan tikus untuk mencapai platform (escape latency) dicatat (Alvin & Terry, 2009).
Untuk menilai retensi memori spasial, dilakukan probe test sehari setelah selesainya keseluruhan uji Morris water maze metode hidden platform test. Pada uji retensi memori spasial ini, platform diangkat dari kolam, sedangkan komponen lain dibiarkan seperti semula. Selama 60 detik tikus dibiarkan berenang di kolam, dihitung persentase waktu yang dihabiskan tikus untuk berenang pada kuadran target (kuadran yang sebelumnya diletakkan platform) terhadap keseluruhan waktu yang ditempuh tikus melewati seluruh kuadran (Alvin & Terry, 2009).
31
3.9.3 Prosedur Pengujian Intake Sukrosa
Larutan sukrosa 4% dibuat dengan cara mencampurkan 240 ml air dengan 10 gr sukrosa. Sebelum masa pemberian plumbum asetat tikus dilatih untuk mengkonsumsi larutan sukrosa 4%. Pengujian intake sukrosa dilakukan dengan mengukur persentase konsumsi larutan sukrosa 4% (Pothion et al., 2004) pada hari ke 1 setelah induksi plumbum asetat sampai hari ke 7. Pengukuran dilakukan dengan melihat persentase sukrosa yang dikonsumsi
per jumlah keseluruhan
cairan yang dikonsumsi oleh tikus pada jam 17.30-19.30 WIB (2-hours access) setiap hari. Larutan sukrosa 4% dibuat dan diganti setiap hari.
32
3.9.4
Alur Penelitian Penimbangan Berat Badan Tikus
Pembagian Kelompok Secara Random dan Aklimitisasi
K
P1
P2
P3
Penimbangan Berat Badan Tikus
Tidak diinduksi Pb asetat selama 7 hari
Diinduksi 50mg/kgbb Pb asetat selama 7 hari
Diinduksi 100mg/kgbb Pb asetat selama 7 hari
Pengukuran Jumlah Asupan Larutan Sukrosa Selama 7 hari
Uji Memori Spasial dengan Morris Water Maze (Post test)
Intepretasi Hasil Penelitian
Gambar 6. Diagram Alur Penelitian
Diinduksi 200mg/kgbb Pb asetat selama 7 hari
33
3.10
Analisis Data
Kelompok penelitian ini terdiri atas tiga kelompok yaitu satu kelompok kontrol negatif, dan dua kelompok perlakuan. Hasil penelitian diuji secara statistik dengan uji normalitas (Shapiro-Wilk) dan homogenitas (Levene). Data dianalisis menggunakan uji One-Way Anova. Data memori spasial terdistribusi normal dan homogen sedangkan data intake sukrosa terdistribusi normal namun tidak homogen sehingga dilakukan transformasi akar kuadrat (Square root) untuk memenuhi persyaratan uji One-Way anova. Selanjutnya dilakukan uji One-Way anova pada kedua variabel. Pada uji One-Way anova didapatkan nilai p<0.05 (hipotesis dianggap bermakna) pada kedua variabel, dilanjutkan dengan melakukan analisis Post hoc LSD untuk mengetahui perbedaan antar kelompok yang lebih rinci.
3.11
Etik Penelitian
Penelitian ini telah diajukan ke Komisi Etik Penelitian Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Lampung, dengan menerapkan prinsip 3R dalam protokol penelitian, yaitu: 1. Replacement, adalah keperluan memanfaatkan hewan percobaan sudah diperhitungkan secara seksama, baik dari pengalaman terdahulu maupun literatur untuk menjawab pertanyaan penelitian dan tidak dapat digantikan oleh makhluk hidup lain seperti sel atau biakan jaringan.
34
2. Reduction, adalah pemanfaatan hewan dalam penelitian sesedikit mungkin, tetapi tetap dapat mendapatkan hasil yang optimal. Dalam penelitian ini sample dihitung berdasarkan rumus federer yaitu t (n-1) ≥ 15 dengan n adalah jumlah hewan yang diperlukan dan t adalah jumlah kelompok perlakuan. 3. Refinement adalah memperlakukan hewan percobaan secara manusiawi dengan prinsip dasar membebaskan hewan coba dalam beberapa kondisi seperti: a. Bebas dari rasa lapar dan haus, pada penelitian ini hewan coba diberikan pakan standar dan minum secara ad libitum. b. Bebas dari ketidak-nyamanan, pada penelitian hewan coba ditempatkan di animal house dengan suhu terjaga 20-25°C, kemudian hewan coba terbagi menjadi 6 ekor tiap kandang. Animal house berada jauh dari gangguan bising dan aktivitas manusia serta kandang dijaga kebersihannya sehingga, mengurangi stress pada hewan coba. c. Bebas dari nyeri dan penyakit dengan menjalankan program kesehatan, pencegahan, dan pemantauan, serta pengobatan terhadap hewan percobaan jika diperlukan.
Prosedur pengambilan sampel pada akhir penelitian telah dijelaskan dengan mempertimbangkan tindakan manusiawi dan anesthesia serta euthanasia dengan metode yang manusiawi oleh orang yang terlatih untuk meminimalisasi atau bahkan meniadakan penderitaan hewan coba sesuai dengan IACUC (Ridwan, 2013).
BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN
5.1
Kesimpulan
Dari penelitian ini didapatkan kesimpulan sebagai berikut: 1.
Induksi plumbum asetat selama 7 hari dapat menurunkan memori spasial pada tikus putih jantan (Rattus norvegicus) galur Sprague-Dawley.
2.
Induksi plumbum asetat selama 7 hari dapat menurunkan intake sukrosa pada tikus putih jantan (Rattus norvegicus) galur Sprague-Dawley.
5.2
Saran
Adapun saran yang dapat disampaikan dari penelitian ini
untuk dilakukan oleh
peneliti lain adalah sebagai berikut: 1. Disarankan untuk meneliti lebih lanjut mengenai induksi kronik plumbum asetat terhadap memori spasial. 2. Disarankan untuk meneliti lebih lanjut mengenai pengaruh induksi plumbum asetat terhadap spatial learning dan visual discrimination learning
50
3. Disarankan untuk meneliti lebih lanjut mengenai pengaruh induksi plumbum asetat terhadap kadar gluthatione peroxidase, catalase, caspase 8, dan caspase 9. 4. Disarankan untuk meneliti zat yang dapat mengahambat atau memperbaiki penurunan fungsi memori spasial akibat dari induksi plumbum asetat 5. Disarankan untuk menggunakan metode lain untuk menilai pengaruh stres terhadap perubahan intake sukrosa.
DAFTAR PUSTAKA
Ahmed MB, Ahmed MI, Meki AR, Abdarboh N.. 2013. Neurotoxic effect of lead on rats: Relationship to apoptosis. Int J Health Sci Qassim. 7(2): 192-9. Alvin V, Terry J. 2009. Methods of behaviour analisys in neuroscience: Spatial Navigation (Water Maze) Tasks. edisi ke-2. Georgia: Medical college of Georgia. Ambica PJ, Shekawat PS, Pareek H, Yadav D, Sharma P, John PJ. 2016. Effect of lead on human blood antioxidant enzymes and glutathione. Int J Biochem Res Re. 13(1):1-9 Aykin-Burns N, Laegeler A, Kellog G, Ercal N. 2003. Oxidative effects of lead in young and adult fisher 344 rats. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 44 (1): 417– 20. Barkour RR, Bairy LK. 2015. Evaluation of passive avoidance learning and spatial memory in rats exposed to low levels of lead during specific periods of early brain development. Int J Occup Med Environ Health. 28(3): 533-44. Bazgar M, Goudarzi I, Abrari K, Elahdadi-salmani M, Lashkarbolouki T. 2015. Effect of postnatal chronic lead exposure on spatial learning and memory in male rat. Zahedan J Res Sci. 17(9): 29-32. BPS. 2012. Penduduk Indonesia menurut provinsi. Tersedia pada: www.bps.go.id/linkTabelStatis/View/id/1426 diakses tanggal 12 Mei 2016. BPS. 2014. Perkembangan jumlah kendaraan bermotor. Tersedia pada: www.bps.go.id/linkTabelStatis/View/id/1413 diakses tanggal 12 Mei 2016. Cassenti D, Carlson R. 2008. Effect of pacing and working memory load on error type patterns in a routine skill. Am J Phsycol. 121 (1): 57–81. Depkes. 2014. Dampak kesehatan akibat polusi udara. Tersedia pada: http://pppl.depkes.go.id/berita?id1382 diakses tanggal 12 Mei 2016. Devlin MT. 2002. Bioenergetics and oxidative metabolism In: Biochemistry with clinical correlations. Edisi ke-5. Canada: Wiley-liss. Ding Y, Gonick HC, Vaziri ND. 2000. Lead promotes hydroxyl radical generation
and lipid peroxidation in cultured aortic endothelial cells. Am J Hypertens, 13 (5): 552–5. Dorland W. 2010. Kamus Kedokteran Dorland. Edisi ke-31. Jakarta: Buku Kedokteran EGC. Ercal N, Gurer H, Aykin-Burns N. 2001. Toxic metals and oxidative stress. Part 1. Mechanisms involved in metal induced oxidative damage. Curr Top Med Chem. 1 (6): 529–39. Ernawati, 2010. Kerang bulu (Anadara inflata) Sebagai Bioindikator Pencemaran Logam Berat Timbal (Pb) dan Cadmium (Cd) di Muara Sungai Asahan. Universitas Sumatera Utara. Grønli J. 2006. an Animal model of depression. University of bergen: Department of Biomedicine, Section of Physiology. Gümrü S, Arıcıoğlu F. 2012. Ampakines: Selective AMPA Receptor Modulators with Potential Benefits. MUSBED. 2(4): 143–8. Gurer H, Ercal N. 2000. Can antioxidan be benefical in the treatment lead posioning. Free radic biol med. 29 (10): 927–45. Guyton AC, Hall JE. 2007. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran Edisi ke-11. Jakarta: Buku Kedokteran EGC. Harbani N. 2013. Korelasi Kadar Plumbum dalam Darah dengan Gangguan Kognitif pada Petugas Stasiun Pengisian Bahan Bakar Umum Kotamadya Yogyakarta [Thesis]. Universitas Gajah Mada. Hritcu L, Ciobica A, Stefan M, Lavinia M, Toshitaka P, Nabeshima. 2011. Spatial memory deficit and oxidatve stress damage following exposure to lypopolysccharide in a rodent model of parkinson’s disease.J Neu Res. 77(1): 35–43. Irawan RM. 2008. Pengaruh methanol terhadap pengurangan emisi gas buang carbon monoksida pada kendaraan motor bensin. Traksi. 1(6): 39–47. Japardi I. 2002. Learning and Memory. Fakultas Kedokteran bagian Bedah: Universitas Sumatera Utara. Jett DA, Kuhlmann AC, Guilarte TR. 1997, Intrahippocampal administration lead (Pb) impairs performance of rats in the morris water maze. Pharmacol Biochem Behav. 57(1): 263-96. Jones JB, Tan T, Bloom SR. 2012. Minireview: glucagon in stress and energy homeostasis. Endocrinology. 153(3): 1049-54.
Kandel E, Schwart JH, Jessel T. 2000. Principles of Neural Science. Edisi ke-4. USA: McGraw-Hill. Koelsch S, Boehlig A, Hohenadel M, Nitsche I, Bauer K, Sack U. 2016. The impact of acute stress on hormones and cytokines, and how their recovery is affected by music-evoked positive mood. Scientific Reports. Tersedia pada: http://www.nature.com/articles/srep23008#supplementary-information diakses tanggal 4 desember 2016 Kumar V, Cotran RS, & Robin SL. 2007. Buku Ajar Patologi Robin. Edisi ke-7. Jakarta: EGC. Kurniawan W. 2008. Hubungan Kadar Pb Dalam Darah dengan Profil Darah pada Mekanik Kendaraan Bermotor di Kota Pontianak [Thesis]. Progam Pascasarjana Universitas Diponegoro Semarang. Universitas Diponegoro. Laurence RR dan Bacharach AL. 1964. Evaluation of drug activities, pharmachometrics. London: Academic Press Li N, Hou Y, Ma D, Jing W, Dham H, Wang L. 2015. Lead accumulation, oxidative damage and histopathological alteration in testes and accessory glands of freshwater crab, Sinopotamon henanense , induced by acute lead exposure. Exotoxiol Envioren Saf. 17 (2015): 20–7. Li N, Jia J, Zheng Y, Liu X, Zhu M, Shi B et al. 2010. Lead impairs ability of learning and memory and effects expression of synapstosomal-assosiated protein-25 in hippocampus of offspring. Zonghua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi. 28 (9): 652-5. Mann M, Klemm K. 2011. Efficient exploration of discrete energy landscape. phsy. E. Stat. Nonlin. Soft. Matter Phys. 83(11): 1-8. Manalu J, Siregar T, Widiowati W. 2006. Hubungan kepadatan lalulintas kendaran bermotor dengan kandungan timbal udara, timbal dalam darah pedagang kaki lima di kota Surakarta. Bionatura. 8(2): 20-6 Mitra A, Guevremont G Timofeeva E. 2016. Stress and sucrose intake modulate neuronal activity in the anterior hypothalamic area in rats. PLoS ONE. 11(5): 1-21 Mastrangelo ME, Schleich CE, & Zenuto RR. 2008. Short-term effects of an acute exposure to predatory cues on the spatial working and reference memory performance in a subtteranean rodent. Anim Behav. 77(3): 685–92. Mc Kee T, Mc Kee JR. 2003. Aerobic metabolism II: electron transport and oxidative phosphorylation In: Biochemistry the molecular basis of life Edisi ke-3. New york: McGraw-Hill.
Meng H, Wang L, He J, Wang Z. 2016. The Protective Effect of Gangliosides on Lead (Pb)-Induced Neurotoxicity Is Mediated by Autophagic Pathways. Int J Environ Res Public Health. 13(4): 365. Tersedia pada: http://www.mdpi.com/1660-4601/13/4/365. MSDS-Material Safety Data Sheet. 2006. Lead nitrate. MSDS no L3130. hlm.1–8. Murray R, Boss-Williams KA, Weiss JM. 2013. Effects Of Chronic Mild Stress On Rats Selectively Bred For Behavior Related To Bipolar Disorder And Depression. Elsevier Inc. 119 (1): 115–29. Murray RK, Granner DK, Rodwell VW. 2009. Biokimia Harper. Edisi ke-27. Jakarta: EGC. Nasution FA. 2004. Bahaya Timbal dan Permasalahanya. Bandung: Intstitut Teknologi Bandung. Notoatmodjo. 2005. Metodologi Penelitian Kesehatan. Jakarta: PT. Rineka Cipta Novita Y. 2015. Pengaruh Ekstrak Etanol Pegagan (centella Asciatica sp.) Terhadap Pembentukan Memori Spasial Pascastres Listrik Kronis Kajian pada Tikus Putih (sprague Dawley). Universitas Gajah Mada. Ostrovskaya SS, Shatornaya VF, Kolosova I. 2011. Combined impact of plumbum and cadmium on the organism. Foreigning Literature Review. hlm.2011–13. Palar H. 1994. Pencemaran dan Toksikologi Logam Berat. Jakarta: Rineka Cipta. Pandey SP, Singh HK, & Prasad S. 2015. Alterations in hippocampal oxidative stress, expression of AMPA receptor GluR2 subunit and associated spatial memory loss by Bacopa monnieri extract (CDRI-08) in streptozotocininduced diabetes mellitus type 2 mice. PLoS ONE. 10(7): 1–23. Pothion S et al. 2004. Strain differences in sucrose preference and in the consequences of unpredictable chronic mild stress. Behav Brain Res. 155 (2004): 135–46. Remus JL, Stewart LT, Camp RM, Novak CM, Johnson JD. 2015. Interaction of metabolic stress with chronic mild stress in altering brain cytokins and sucrose preference. Behav Neurosct. 129(3): 321-30. Ridwan, E. 2013. Etika Pemanfaatan Hewan Percobaan dalam Penelitian Kesehatan. J Indon Med Assoc. 3 (63): 112-6. Sandi C. et al. 2005. Acute Stress-Induced Impairment of Spatial Memory Is Associated with Decreased Expression of Neural Cell Adhesion Molecule in the Hippocampus and Prefrontal Cortex. J Bio Psych. 57(2005): 856–64.
Schneiderman NG, Ironson, SD, & Siegel. 2005. Stress and health: Psychological, Behavioral, and Biological Determinants. Annu Rev Clin Psychol. 1(2005): 607–28. Shafii S. 2008. The removal of zinc and plumbum (lead) by using hydrogen peroxide [Thesis]. University Malaysia Pahang. Shafiq-ur-rehman. 1984. Lead-induced regional lipid peroxidation lipid in brain. Toxx let. 21(1): 333–7. Sherwood L. 2014. Fisiologi Manusia dari Sel ke Sistem. Edisi ke-8. Editor Pendit et al. Jakarta: Buku Kedokteran EGC. Snell R. 2011. Neuroanatomi Klinik. Edisi ke-7. Editor Sugiharto L, Djayasaputra, Sali C. Jakarta: EGC. Strekalova T, Couch Y, kholod N, Boyks M, Malin D, Laprince P et al. 2011. Update in the methodology of chronic stress paradigm: internal control matters. Behav Brain Func. 7(9): 1-18. Sudarmaji, Mukono J, Corie I. 2006. Toksikologi logam berat b3 dan dampaknya terhadap kesehatan. JKL. 2(2): 129–42. Takahashi A. 1975. Problem of hygine maintenance for food coming into contact with rubber and plastics products. Nippon Gomu Kyokaishi: 48(9):537 [translated by Inglis EA. 1976. Int Polymer Sci Tech. 3(1): 93-105] Tian Y. et al. 2014. Acute and chronic toxic effects of Pb on polychaete Perinereis aibuhitensis: morphological changes and responses of the antioxidant system. environ Sci. 26(8): 1681–8. Watermaze. 2013. Learning about Morris Water Mazw. Richard Baker. Tersedia pada: watermaze.org diakses tanggal 3 juni 2016. Widiowati W. 2008. Efek Toksik Logam. Edisi ke-1. Yogyakarta: ANDI. Vollmer LE, Ghosal S, Rush JA, Sallae FR, Herman JP, Weinert M et al. 2013. Attenuated stress-evoked anxiety, increased sucrose preference and delayed spatial learning in glucocorticoid-induced receptor-deficient mice. Genes Brain Behav. 2013 (12): 241-9. Xiao Y, Fu H, Han X, Hu X, Gu H, Chen Y et al. 2014. Role of sypnatic structural plasticity in impairment of spatial learning and memory induced by developmental lead exposure in wistar rats. PloS ONE. 9(12): 1-16. Zito K. 2009. NMDA Receptor Function and Physiological Modulation. USA: University of California
