Pengaruh Induksi DMBA (7,12-dimethylbenz (α) anthracene) Multiple Low Dose (MLD) Terhadap Kadar Estrogen pada Serum Darah Tikus (Rattus norvegicus) The Effect of Multiple Low Dose (MLD) DMBA (7,12- dimethylbenz (α) anthracene) Induction Toward Estrogen Levels in Rat (Rattus norvegicus) Blood Serum Syarofina Pratiniyata, Anna Roosdiana, dan Dyah Ayu Oktavianie A.P Program Studi Kedokteran Hewan, Program Kedokteran Hewan, Universitas Brawijaya
[email protected] ABSTRAK Kanker mammae merupakan penyakit akibat abnormalitas gen yang mengatur proliferasi sel pada jaringan mammae yang dapat dipicu zat karsinogenik 7,12-dimethylbenz (α) anthracene atau DMBA serta dipengaruhi oleh hormon estrogen yang berfungsi dalam perkembangan sel mammae. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh induksi DMBA terhadap peningkatan kadar estrogen pada serum darah tikus (Rattus norvegicus). Penelitian ini bersifat eksperimental laboratorik menggunakan tikus betina strain Sprague dawley usia 10-12 minggu dan berat badan 150-200 gram sebagai hewan coba yang dibagi dalam dua kelompok yaitu kelompok kontrol dan perlakuan. Pembuatan kanker mammae dilakukan dengan induksi DMBA pada kelompok perlakuan dengan dosis 10 mg/kg BB secara subkutan pada mammae sebanyak 10 kali serta induksi estrogen sintetik Ethinyl Estradiol (EE) dengan dosis 20.000 IU/kg BB secara intramuskular. Peningkatan kadar estrogen diukur menggunakan metode ELISA. Data yang diperoleh dari penelitian dianalisis secara kuantitatif menggunakan uji T tidak berpasangan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa induksi DMBA dengan dosis 10 mg/kg BB dan estrogen dengan dosis 20.000 IU/kg BB dapat meningkatkan kadar estrogen pada serum darah tikus sebanyak 0,7x (51,28 ng/L ± 13,47) pada kelompok perlakuan pada hari ke 29 pasca induksi DMBA. Kesimpulannya induksi DMBA secara subkutan pada mammae dapat meningkatkan kadar estrogen pada serum darah tikus (Rattus norvegicus). Kata kunci : Kanker Mammae, DMBA, Estrogen, Rattus norvegicus ABSTRACT Breast cancer is a disease caused by abnormalities in genes that regulate cell proliferation in mammary tissue, which can triggered by carcinogenic dimethylbenz 7,12- (α) anthracene or DMBA and affected by estrogen in mammary cell development. This research was aimed to determine the effect of DMBA induction toward increasing estrogen levels in rat (Rattus norvegicus) blood serum. The method of this research was experimental laboratory that used female Sprague Dawley rats aged 10-12 weeks and weight 150-200 grams as experimental animals and divided into two groups: control and treatment group. Mammary cancer were made by induction of DMBA in the treatment groups at a dose of 10 mg /kg BW subcutaneously on the mammary for 10 times and induction of synthetic estrogen Ethinyl Estradiol (EE) at a dose of 20.000 IU/kg intramuscularly. Estrogen levels was measured by ELISA. Data were analyzed by using independent T-test. Research showed that induction of DMBA at a dose of 10 mg/kg BW and EE at a dose 20.000 IU / kg BW could increasing 0,7x the levels of estrogen in the blood serum of rats (51.28 ng/L ± 13.47) in the treatment group for 29 days post induction of DMBA. The conclusion is the induction of DMBA subcutaneously could increasing estrogen levels in rat (Rattus norvegicus) blood serum. Keywords: Breast cancer, DMBA, Estrogen, Rattus norvegicus 1
insidensi kanker mammae yang mencapai
PENDAHULUAN Kanker merupakan penyakit akibat
100% pada minggu ke-12.
abnormalitas gen yang mengatur proliferasi
Kanker mammae dapat dipengaruhi
sel sehingga terjadi pertumbuhan yang
oleh sistem hormonal, salah satunya adalah
tidak terkendali. Kasus kanker mammae
hormon estrogen. Hormon estrogen dalam
banyak terjadi pada anjing, baik anjing ras besar
maupun
ras
kecil
dan
jumlah besar digunakan sebagai ligand dan
dapat
substrat enzim Cytochrome P-450 pada
menimbulkan kematian sekitar 27% anjing
proses inisiasi kanker mammae sehingga
purebred di Inggris (Adams et al., 2010).
kemungkinan terjadi peningkatan estrogen
Kejadian kanker mammae lebih banyak
dalam darah. Hormon estrogen akan
pada anjing berusia tua yaitu 10-13 tahun.
dimetabolisme secara oksidatif oleh tubuh
Tindakan ovariohisterectomi pada anjing
akibat pengaruh DMBA dan menghasilkan
sebelum estrus pertama akan menurunkan
metabolit kimia berupa ROS (Reactive
resiko kejadian kanker mammae hingga 0%
Oxygen
daripada operasi yang dilakukan setelah
Penelitian Kanker dapat dipicu oleh berbagai
menjelaskan pengaruh induksi DMBA pada
(α)
sistem hormonal tubuh saat terjadi kanker
antrasen (DMBA) yaitu zat kimia yang dalam
Polycyclic
mammae, sehingga dilakukan penelitian
Aromatic
lebih lanjut dengan metode induksi DMBA
Hydrocarbon (PAH) yang dikenal bersifat mutagenik,
teratogenik,
kanker
induksi secara per oral dan belum banyak
kimia yang dapat memicu terjadinya kanker
termasuk
mengenai
mammae selama ini menggunakan metode
hal antara lain oleh bahan kimia. Senyawa
7,12-dimetilbenz
menimbulkan
al., 2006).
hingga 26% (Zatloukal et al., 2005).
senyawa
yang
kerusakan DNA secara oksidatif (Crooke et
estrus yang meningkatkan resiko kejadian
adalah
Species)
secara
karsinogenik,
subkutan
pada
mammae
dan
pengaruhya terhadap kadar estrogen dalam
sitotoksik, dan immunosupresif (Lee et al.,
darah.
2002). Penggunaan senyawa DMBA dalam penelitian untuk induksi kanker pada
MATERI DAN METODE
hewan coba sering digunakan termasuk
Persiapan Hewan Coba
kanker mammae. Berdasarkan penelitian
Hewan coba yang digunakan adalah
Meiyanto et al (2007) senyawa DMBA
tikus (Rattus norvegicus) betina strain
yang diinduksikan pada hewan model tikus
Sprague Dawley usia 10-12 minggu dan
betina melalui per oral menunjukkan
berat badan antara 150-200 gram yang 2
diperoleh dari Unit Pengembangan Hewan
sekali hingga minggu ke-3 untuk melihat
Percobaan (UPHP) Universitas Gajah
perkembangan
Mada Yogyakarta. Tikus dibagi menjadi
ditandai oleh terbentuknya nodul di daerah
dua kelompok, yaitu kelompok kontrol dan
mammae tikus.
perlakuan
dan
lingkungan
diadaptasikan
laboratorium
dengan
selama
Serum
Penelitian
yang
darah
tikus
digunakan
sebagai bahan pengukuran kadar estrogen.
mendapatkan persetujuan laik etik oleh Etik
mammae
Koleksi Serum
satu
minggu. Penggunaan hewan coba telah
Komisi
kanker
Koleksi serum dilakukan dua kali yaitu
Universitas
sebelum induksi DMBA dan pasca koleksi
Brawijaya No. 189-KEP UB.
mammae. Koleksi serum sebelum induksi
Induksi DMBA dan Estrogen Sintetik
DMBA melalui pemotongan vena coccygea
Persiapan DMBA yaitu ditimbang
tikus sekitar 2 mm kemudian darah yang
sesuai dosis 10 mg/kg BB yang merupakan
keluar
dosis optimasi hasil modifikasi penelitian
(Ganong, 2008). Koleksi serum pasca
Cordeiro et al (2011), kemudian dilarutkan
induksi DMBA dengan membuka rongga
dalam sunflower oil dan NaCl fisiologis
thorax tikus hingga terlihat jantungnya.
dengan perbandingan 3:1 (Pugalendhi et
Kemudian dilakukan pengambilan darah
al., 2011). Dosis estrogen sintetik Ethynil
mengunakan spuit 3 ml. Darah yang telah
Estradiol yang diberikan adalah 20.000
diambil ditampung pada mikrotube dan
IU/kgBB yaitu dosis modifikasi penelitian
diposisikan miring 450 selama 3 jam.
Naciff et al (2002). Induksi DMBA
Setelah terlihat pemisahan bagian serum
dilakukan secara subkutan pada mammae
dan darah, dilakukan sentrifugasi dengan
sebanyak sepuluh kali setiap dua hari sekali
kecepatan 3000 rpm selama 15 menit agar
hingga hari ke-21. Induksi estrogen sintetik
darah semakin mengendap dan berbatas
Ethynil Estradiol secara intramuscular
jelas dengan serum. Kemudian dilakukan
dengan dosis 20.000 IU/ kg BB dilakukan
isolasi serum menggunakan mikropipet.
sebanyak lima kali setiap empat hari sekali
Serum yang telah dikoleksi ditampung pada
bergantian diantara induksi DMBA.
mikrotube lainnya dan disimpan pada
induksi
sebanyak
1-2
ml
lemari pendingin suhu -200C.
Pemeriksaan Pasca Induksi Selama
ditampung
DMBA
dan
Pengukuran Kadar Estrogen
estrogen sintetik dilakukan penimbangan
Pengukuran kadar estrogen menggunakan
berat badan setiap empat hari sekali dan
teknik
palpasi daerah mammae tiap satu minggu
Assay (ELISA). Pengukuran kadar estrogen 3
Enzyme-linked
Immunosorbent
dilakukan sebanyak dua kali yaitu pada hari
Hasil pengukuran kadar estrogen pada
ke-1 dan hari ke-29. Pengukuran kadar
sampel serum darah tikus pada kelompok
estrogen membutuhkan sampel berupa
kontrol negatif dan perlakuan dapat dilihat
serum darah tikus. Prinsipnya dengan
di Tabel 1.
menggabungkan serum sebagai antigen,
Tabel 1. Perubahan konsentrasi estrogen pada serum darah tikus
antibodi estrogen tikus, dan enzim HRPconjugate berlabel. Reaksi tersebut akan
Kelompok
menjadi kompleks antibodi – antigen – enzim antibodi. Setelah itu ditambahkan substrat
TMB
Rata-rata kadar Peningkatan estrogen dalam darah (x) (ng/L darah) ± SD Sebelum Setelah Induksi Induksi
(Tetramethylbenzidine)
berupa Chromogen A dan B yang akan merubah warna cairan dalam well menjadi
Kontrol
6,03 ± 2,31 29,07 ± 9,93
Perlakuan
6,03 ± 2,31 51,28 ± 13,47
0.7x
Rata-rata kadar estrogen pada
biru, sebagai tanda bahwa enzim HRPReaksi
kelompok kontrol dan perlakuan sebelum
stop
induksi sebesar 6,03 ng/L meningkat pada
solution berupa asam sulfat. Perubahan
hari ke-28 yaitu sebanyak 29,07 ng/L pada
warna diukur dengan ELISA reader pada
kelompok kontrol dan 51,28 ng/L pada
panjang gelombang 450 nm. Konsentrasi
kelompok
estrogen tikus pada sampel dibandingkan
menyebabkan peningkatan kadar estrogen
dengan kurva baku estrogen.
tikus kelompok perlakuan sebanyak 0,7x
conjugate
sudah
terkatalis.
dihentikan
dengan
penambahan
perlakuan.
Induksi
DMBA
kadar estrogen kelompok kontrol. Hasil Analisis Data
analisa data menggunakan uji T tidak
Berdasarkan data yang diperoleh
berpasangan menunjukkan bahwa terdapat
dari penelitian yaitu peningkatan kadar
perbedaan yang signifikan antara kelompok
estrogen pasca induksi DMBA ditabulasi
kontrol dan kelompok perlakuan yaitu
dengan software Microsoft Office Excel
P<0,05 yang menunjukkan bahwa induksi
2013 dan dianalisis secara kuantitatif
DMBA berpengaruh terhadap peningkatan
menggunakan uji T tidak berpasangan pada
kadar estrogen dalam darah.
α = 0,05. Peningkatan HASIL DAN PEMBAHASAN
kelompok
perlakuan
kadar
estrogen
dibandingkan
Pengaruh induksi DMBA terhadap
kelompok kontrol pasca induksi DMBA
kadar estrogen tikus (Rattus norvegicus)
menunjukkan bahwa estrogen ikut berperan
diamati menggunakan metode ELISA
dalam metabolisme DMBA dan diproduksi
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay). 4
lebih banyak selama proses karsinogenesis
Metabolit ini akan dioksidasi oleh fase
pada kanker mammae. Tinggi rendahnya
pertama enzim Cytochrome P-450 yaitu
hormon estrogen tubuh dipengaruhi proses
CYP1A1 atau CYP1B1 menjadi metabolit
aklimatisasi, usia, dan siklus estrus. Proses
ultimate carcinogenic (DMBA-3,4- diol-
aklimatisasi dapat menimbulkan stress
1,2-epoxide) (Smith, 2000).
yang berpengaruh pada ketidakseimbangan
Metabolit ultimate carcinogenic
hormon tubuh. Usia tikus 10-12 minggu
akan mengikat DNA dari nukleus dan
sudah terlalu tua dibandingkan awal pubertas tikus pada usia 7-8 minggu. Keadaan hormonal tikus berbeda-beda pada setiap
siklus
estrus,
puncak
menimbulkan
reaksi
menimbulkan
kerusakan
oksidatif
hormon
oksidatif
yang
yang
DNA
secara
dimediasi
oleh
ketidakseimbangan ROS (Reactive Oxygen
estrogen pada fase estrus, sedangkan
Species). Dalam keadaan sel normal,
hormon estrogen rendah pada fase diestrus.
ketidakseimbangan
Siklus estrus tidak diketahui karena tidak dilakukan swab vagina saat pengambilan sampel serum.
tersebut
dapat
dinetralisir
oleh
glutathione
yang
merupakan
enzim
antioksidan
untuk
detoksifikasi
ROS.
Pada kondisi
sel
Induksi DMBA secara subkutan
abnormal enzim glutathione tidak berfungsi
pada mammae akan menghasilkan ikatan
sehingga terjadi ketidakseimbangan ROS.
antara
(Aryl
Ketidakseimbangan antara produksi dan
Hydrocarbon Receptor) yang berfungsi
eliminasi ROS akan menghasilkan radikal
sebagai reseptor DMBA di sitosol. Ikatan
bebas yang memicu terjadinya stress
DMBA dengan Ahr akan menuju ke
oksidatif pada jaringan (Held, 2012). Stress
nucleus dan berikatan dengan ARNT (Aryl
oksidatif akan menyebabkan kerusakan
Hydrocarbon
DNA
DMBA
dengan
Nuclear
Ahr
Translocator).
dari
nukleus
Ikatan DMBA, Ahr, dan ARNT tersebut
kerusakan
akan
karsinogenesis (Park et al., 2009).
mengaktivasi
enzim
oksidasi
Cytochrome P-450. Enzim Cytochrome P-
oleh hormon estrogen dalam tubuh. Bagian
terjadi hidrolisis epoxides oleh Microsomal
menghasilkan carcinogenic
(MEH)
metabolit dan
berkembang
menimbulkan kerusakan DNA didukung
menjadi bentuk 3,4-epoxides, kemudian
hydrolase
yang
terjadi
Pengaruh induksi DMBA yang
450 yang aktif akan mengoksidasi DMBA
epoxide
sel
sehingga
estrogen yaitu estradiol (E2) berfungsi
yang
sebagai ligand untuk estrogen receptor
proximate
(ER), serta menjadi substrat CYP1A1 dan
DMBA-3,4-diol.
CYP1B1. 5
Rendahnya
rata-rata
kadar
estrogen tikus sebelum induksi DMBA
yaitu
yaitu 6,03 ng/L dbandingkan dengan kadar
meningkatkan jumlah metabolit estrogen.
normal estrogen sebesar 43-50 ng/L maka
Sedangkan fase kedua adalah mereduksi
dilakukan induksi estrogen sintetik Ethynil
enzim detoksifikasi yaitu catechol O-
estradiol (EE). Induksi EE diharapkan
methyltransfrase (COMT) dan glutathione
dapat membantu memenuhi kekurangan
S- transferase (GST). Enzim COMT dan
kebutuhan estrogen. Ethinyl estradiol atau
GST berfungsi sebagai penghambat reaksi
17-α estradiol merupakan hormon estrogen
yang dilakukan oleh metabolit oksidatif
eksogen yang struktur dan fungsinya mirip
estrogen namun karena tereduksi oleh CYP
dengan estradiol (E2). Ethinyl estradiol
maka
yang diinduksikan dalam tubuh hewan coba
meningkatkan resiko karsinogenesis pada
akan berikatan dengan ERα (Estrogen
mammae. Proses ini menimbulkan estrogen
receptor α) yang dapat memicu proliferasi
dalam jaringan mammae dapat terukur
sel mammae (Mueller et al., 2002).
lebih tinggi 10-50 kali daripada estrogen
darah
menunjukkan
pasca adanya
induksi
aktivitasnya
CYP1B1
rendah
yang
dan
Proses sirkulasi juga mempengaruhi tinggi
DMBA
aktivitas
dan
dalam darah (Yager and Nancy, 2006).
Kadar estrogen yang meningkat dalam
CYP1A1
rendahnya kadar estrogen yang terukur
dari
melalui serum atau plasma darah. Hormon
estrogen endogen terutama estradiol yang
estrogen tidak terukur signifikan karena
dihasilkan di sel theca ovarium. Estradiol
sirkulasi hormon estrogen melalui darah ke
maupun EE akan menjadi ligand ER di
seluruh tubuh.
mammae, uterus dan ovarium. Estradiol juga berfungsi sebagai substrat enzim
Kadar estrogen yang tinggi dalam
Cytochrome P-450 (CYP) dan berperan
tubuh
dalam
Aktivitas
estrogen berikatan dengan ER dalam
aromatase melibatkan jaringan adipose
fungsinya untuk memicu proliferasi sel
mammae dan sel theca ovarium yang akan
mammae. Sebagian estrogen yang bebas
memproduksi hormon androstenedion dan
digunakan sebagai substrat Cytochrome P-
testosteron yang berfungsi sebagai substrat
450 dan menyebabkan kerusakan DNA
CYP
proses
melalui oksidasi reaksi cincin aromatik A
aromatisasi in situ yang masing-masing
yang menghasilkan metabolit oksidasi
akan membentuk estron dan estradiol
berupa
(Gruber et al., 2002). Fase pertama
estrogen akan teroksidasi lagi menjadi
aromatisasi dilakukan oleh derivat CYP
bentuk semiquinon dan quinon yang sangat
aktivitas
kemudian
aromatase.
akan
terjadi
6
mengakibatkan
catechol
tidak
estrogen.
seluruh
Catechol
reaktif dan tidak stabil. Proses oksidasi
SARAN
tersebut diperantarai oleh enzim cathecol
1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut
O-methyltransferase (COMT) yang akan
mengenai hubungan estrogen dengan
mengikat ER. Dalam bentuk semiquinon
kejadian
dan quinon, estrogen dapat membentuk
dibuktikan dengan analisa ekspresi
ikatan tidak stabil dengan basa nitrogen
estrogen
adenine dan guanine di DNA melalui siklus
immunohistokimia di jaringan mammae
redox (reduksi-oksidasi). Dalam siklus
pasca induksi DMBA
redox terjadi reduksi estrogen dari bentuk
2. Perlu
kanker
mammae
menggunakan
dilakukan
perbaikan
yang
metode
metode
semiquinon dan quinon kembali menjadi
pengambilan sampel serum untuk uji
bentuk catechol estrogen yang memicu
ELISA dengan melakukan swab vagina
ROS (Reactive Oxygen Species) (Yager and
agar mengetahui siklus estrus yang
Nancy, 2006).
sedang terjadi.
Metabolit
estrogen
bersifat
DAFTAR PUSTAKA Adams, V.J., K.M. Evans, J. Sampson, and J. L. N. Wood. 2010. Methods and Mortality Result of A Health Survey of Purebred Dogs in the UK. Journal of Small Animal Practice (2010) 51; 512-524. Cordeiro, M.C., and Kaliwal B.B. 2011. Antioxidant Activity of Bark Extract of Bridelia Retusa Spreng on Dmba Induced Mammary Carcinogenesis in Female Sprague Dawley Rats. Journal of Pharmacognosy Vol. 2, Issue 1, 2011; 14-20. Crooke, P.S., Marylyn D.R., David L.H., Sheila D., Nady R., Fritz F.P. 2006. Estrogens, Enzyme Variants, and Breast Cancer : A Risk Model. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2006; 15; 1620-1629. Ganong, W.F. 2008. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran Edisi 20. Jakarta. EGC. Terjemahan dari Review of Medical Physiology : 486-507. Gruber CJ, Tschugguei W, Schneebeger C, Huber JC. 2002. Production and action of estrogens. N Engl J Med 2002; 346: 340-50. Held, Paul. 2012. An Introduction to Reactive Oygen Species
berpotensi genotoksik dan karsinogenik. Sedangkan ketidakseimbangan ROS yang dihasilkan dari metabolisme estrogen juga dapat merusak DNA secara oksidatif (Crooke et al., 2006). Kerusakan DNA secara oksidatif akibat ikatan estrogen dan reseptornya dapat menyebabkan mutasi tumor suppressor gen yaitu p53 pada mammae. Pada kondisi normal, p53 berfungsi
untuk
mengendalikan
pertumbuhan sel mammae, tetapi dalam kondisi kanker mammae gen p53 tidak mampu mengendalikan proliferasi sel mammae. KESIMPULAN Induksi DMBA dengan dosis 10 mg/kgBB secara subkutan pada mammae dapat meningkatkan kadar estrogen pada serum darah tikus sebanyak 0,7 kali. 7
Measurement of ROS in Cell. Biotek Instrument Inc. USA. Lee LL, Lee JSC, Waldman SD, Casper RF, Grynpas MD. 2002. Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Present in Cigarette Smoke Cause Bone Loss in an Ovariectomized Rat Model. 2002; 30: 917–923. Meiyanto, E., Sri T., Sri S., Retno M., Sugiyanto. 2007. Penghambatan karsinogenesis kanker payudara tikus terinduksi DMBA pada fase post inisiasi oleh ekstrak etanolik daun Gynura procumbens (Lour), Merr. Majalah Farmasi Indonesia, 18(4), 169 – 175, 200. Mueller, S.O., James A.C., Page H.M., and Kenneth S.K. 2002. Mammary Gland Development in Adult Mice Requires Epithelial and Stromal Estrogen Receptor α. Endocrinology 143(6):2357–2365 Naciff, J.M., M. Lynn J., Suzanne M. T., Gregory J. C., Jay P. T., Gary J. O., and George P. D. 2002. Gene Expression Profile Induced by 17 a Ethynyl Estradiol, Bisphenol A, and Genistein in the Developing Female Reproductive System of the Rat. Toxicological Sciences 2002,68 :184–199 Park, J.H., Dipti M., Alexander J.F., Ronald G.H., Ian A.B., Trevor M.P. 2009. Aryl Hydrocarbon Receptor Facilitates DNA Strand Breaks and 8Oxo-2-deoxyguanosine Formation by the Aldo-Keto Reductase Product Benzo[a]pyrene-7,8-dione. J. Biol. Chem. 2009, 284 : 29725-29734. Pugalendhi, P., Shanmugam M., Kathiresan S., Nagarethinam B. 2011. Genistein and daidzein, in combination, protect cellular integrity during 7,12dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) induced mammary carcinogenesis in sprague-dawley rats. Afr J Tradit Complement Altern Med 8(2):91-9. Smith, AD. 2000. Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology.
Revised Ed. London : Oxford University Pr. pp. 345. Yager, J.D., Nancy, E.D. 2006. Estrogen Carcinogenesis in Breast Cancer. New England Journal of Medicine 2006, 354 ; 270-282. Zatloukal, J., J. Lorenzova, F. Tichy, A. Nechas, H. Kecova, P. Kohout. 2005. Breed and Age as Risk Factors for Canine Mammary Tumours. ACTA VET.BRNO 2005, 74 : 103-109.
8
