PENGARUH EKSTRAK PROPOLIS TERHADAP PENINGKATAN EKSPRESI P21, EKSPRESI PROTEIN BAX DAN APOPTOSIS PADA KULTUR SEL KANKER KOLON (CELL LINE WiDr)
TESIS
Disusun untuk Memenuhi Sebagian Persyaratan Mencapai Derajat Magister Program Studi Magister Kedokteran Keluarga Minat Utama Ilmu Biomedik
Oleh: Didik Prasetyo S 501202021
PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA 2016
PENGARUH EKSTRAK PROPOLIS TERHADAP PENINGKATAN EKSPRESI P21, EKSPRESI PROTEIN BAX DAN APOPTOSIS PADA KULTUR SEL KANKER KOLON (CELL LINE WiDr)
TESIS Oleh Didik Prasetyo S 501202021
Telah disetujui oleh Tim Pembimbing Komisi Pembimbing Pembimbing I
Nama Suradi Maryono,dr. SpPDKHOM, FINASIM NIP.194708121973101001
Pembimbing II
Prof.Dr. HM.Bambang Purwanto,dr. SpPD,KGH, FINASIM NIP.194807191976091001
Tanda Tangan
Tanggal
………………..
…Juli 2016
………………..
…Juli 2016
Telah dinyatakan memenuhi syarat Pada tanggal ……Juli 2016
Ketua Program Studi Magister Kedokteran Keluarga Program Pascasarjana UNS
Prof.Dr.A.A. Subiyanto,dr,MS NIP. 194811071973101003
PENGARUH EKSTRAK PROPOLIS TERHADAP PENINGKATAN EKSPRESI P21, EKSPRESI PROTEIN BAX DAN APOPTOSIS PADA KULTUR SEL KANKER KOLON (CELL LINE WiDr)
TESIS Oleh: Didik Prasetyo S 501202021
Tim Penguji
Jabatan Ketua
Nama
Tanda Tangan
Tanggal
Dr. Ida Nurwati, dr. M.Kes NIP. 196502031997022001 ....……….............. ......Juli 2016
Sekretaris
Dr. Noer Rachma, dr. Sp.KFR NIP. 195506281983122001
Penguji
1. Suradi Maryono, dr. SpPDKHOM, FINASIM NIP. 194708121973101001
…...…................... ......Juli 2016
2. Prof. Dr. H.M. Bambang Purwanto, dr. SpPD-KGH, FINASIM NIP. 194807191976091001
...........................
......Juli 2016
............................
......Juli 2016
Mengetahui Direktur Program Pascasarjana UNS
Ketua Program Studi Magister Kedokteran Keluarga
Prof.Dr.M.Furqon Hidayatullah,M.Pd NIP. 19610717171986011
Prof.Dr.A.A.Subiyanto,dr.MS NIP. 196210221995031001
PERNYATAAN KEASLIAN DAN PERSYARATAN PUBLIKASI
Penulis menyatakan dengan sebesar-besarnya bahwa: 1. Tesis yang berjudul “Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Peningkatan Ekspresi P21, Ekspresi Protein Bax dan Apoptosis Pada Sel Kanker Kolon (Cell Line WiDr) ” ini adalah karya penelitian penulis sendiri dan tidak terdapat karya ilmiah yang pernah diajukan oleh orang lain untuk memperoleh gelar akademik serta tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitk an oleh orang lain, kecuali yang tertulis dengan acuan yang disebutkan sumbernya, baik dalam naskah karangan dan daftar pustaka. Apabila ternyata di dalam naskah tesis ini dapat dibuktikan terdapat unsur-unsur plagiasi, maka penulis bersedia menerima sanksi, baik Tesis beserta gelar magister penulis dibatalkan serta diproses sesuai dengan peraturan perundang-undangan yang berlaku. 2. Publikasi sebagian atau keseluruhan isi Tesis pada jurnal forum ilmiah harus menyertakan tim promotor sebagai author dan PPs UNS sebagai institusinya. Apabila penulis melakukan pelanggaran dari ketentuan publikasi ini, maka penulis bersedia mendapatkan sanksi akademik yang berlaku.
Surakarta, Juli 2016
Didik Prasetyo S501202021
KATA PENGANTAR
Puji syukur Alhamdulillaahirabbil’aalamin penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala limpahan kasih sayang, rahmat dan hidayah-Nya sehingga penyusunan tesis yang berjudul: Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Peningkatan Ekspresi P21, Ekspresi Protein Bax dan Apoptosis Pada Kultur Sel Kanker Kolon (Cell Line WiDr) ini dapat terselesaikan dengan baik. Penelitian ini untuk memenuhi sebagian persyaratan dalam memperoleh Gelar Magister Kedokteran Keluarga dan Spesialis Penyakit Dalam Program Pendidikan Dokter Spesialis I Penyakit Dalam Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang tulus dan penghargaan yang tinggi kepada: 1.
Prof. Dr. Ravik Karsidi, M.S., selaku Rektor Universitas Sebelas Maret Surakarta yang telah memberikan kemudahan penulis dalam melaksanakan pendidikan Pascasarjana Program studi Magister Kedokteran Keluarga minat utama Biomedik.
2.
Prof. Dr. Hartono, dr., M.Si selaku Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Negeri Sebelas Maret Surakarta, yang telah memberikan kemudahan dan dukungan kepada penulis selama menjalani pendidikan PPDS Ilmu Penyakit Dalam.
3.
Prof.Dr.M.Furqon Hidayatullah,M.Pd selaku Direktur Program Pascasarjana Universitas Negeri Sebelas Maret Surakarta yang telah memberikan kemudahan penulis dalam melaksanakan pendidikan Pascasarjana Program studi Magister Kedokteran Keluarga minat utama Biomedik.
4.
Prof.Dr.A.A.Subiyanto,dr.MS selaku Ketua
Program Studi Magister
Kedokteran Keluarga Universitas Negeri Sebelas Maret yang telah memberikan
kemudahan
penulis
dalam
melaksanakan
pendidikan
Pascasarjana Program studi Magister Kedokteran Keluarga minat utama Biomedik
5.
dr. Endang Agustinar, M.Kes sebagai Direktur RSUD Dr. Moewardi beserta seluruh jajaran staf direksi yang telah berkenan dan mengijinkan untuk menjalani program pendidikan PPDS interna.
6.
Prof. Dr. HM. Bambang Purwanto, dr., SpPD, KGH, FINASIM selaku Kepala Bagian Ilmu Penyakit Dalam FK UNS/ RSUD Dr Moewardi dan Pembimbing II yang telah memberikan ijin, bimbingan dan pengarahan dalam penyusunan usulan tesis ini, serta memberikan kemudahan penulis dalam melaksanakan program pendidikan Pascasarjana dan PPDS I Ilmu Penyakit Dalam.
7.
Dr. Sugiarto, dr., SpPD, KEMD, FINASIM selaku Ketua Program Studi PPDS I Interna, yang telah membimbing dan memberikan pengarahan penulis dalam melaksanakan program pendidikan Pascasarjana dan PPDS I Ilmu Penyakit Dalam.
8.
dr. Suradi Maryono, SpPD-KHOM, FINASIM selaku Pembimbing I yang telah memberikan ijin, bimbingan dan pengarahan dalam penyusunan usulan tesis ini.
9.
Dr. dr. Ida Nurwati, M.Kes selaku Penguji I, yang telah memberikan pengarahan, bimbingan dan koreksi dalam penyusunan tesis ini.
10. Dr. Noer Rachma, dr., Sp.KFR selaku Penguji II, yang telah memberikan pengarahan, bimbingan dan koreksi dalam penyusunan tesis ini. 11. Drs. Sumardi, MM selaku pembimbing/ konsultan statistik penelitian, yang dengan kesabaran telah membimbing dan memberikan pengarahan dalam penyusunan usulan tesis. 12. Seluruh Staf Pengajar Ilmu Penyakit Dalam FK UNS/ RSUD Dr Moewardi Surakarta. Prof. Dr. HA Guntur Hermawan, dr., SpPD-KPTI FINASIM (alm), Prof.Dr. Zainal Arifin Adnan,dr., SpPD-KR,FINASIM, Prof.Dr. Djoko Hardiman, dr., SpPD-KEMD FINASIM, dr. Suradi Maryono, SpPD-KHOM FINASIM, dr. Sumarmi Soewoto SpPD-KGER FINASIM, dr. Tatar Sumandjar, SpPD-KPTI FINASIM, dr. Tantoro Harmono, SpPD-KGEH FINASIM, dr. Tri Yuli Pramana SpPD-KGEH FINASIM, dr. Supriyanto Kartodarsono, SpPD-KEMD FINASIM, dr. Supriyanto Muktiatmojo, SpPD
FINASIM, dr. Dhani Redhono, SpPD-KPTI FINASIM, dr. Wachid Putranto, SpPD-KGH FINASIM, dr. Arifin, SpPD-KIC FINASIM, dr. Fatichati Budiningsih, SpPD-KGer FINASIM, dr. Agung Susanto,SpPD FINASIM, dr. Arief Nurudin SpPD FINASIM, dr. Agus Joko S,SpPD, FINASIM, dr. Yulyani Werdiningsih, SpPD FINASIM, dr.Sri Marwanta SpPD Mkes, dr.Aritantri D SpPD MSc, dr. Bayu Basuki Wijaya SpPD Mkes, dr.R. Satriyo SpPD Mkes, dr. Evi Nurhayatun SpPD Mkes, dr. Eva N SpPD Mkes, dr. Ratih Tri K SpPD, dr. Yudhi Hadjianto Sp.PD Mkes, dan dr. Agus Jati, Sp.PD yang telah memberi dorongan, bimbingan dan bantuan dalam segala bentuk sehingga penulis bisa menyelesaikan penyusunan tesis. 13. Ayahanda dan Ibunda tercinta Sunardi dan Suryatmi, Orang tua yang kami hormati dan sayangi Bapak Djoko Susanto dan Ibu Masitah. Istriku tercinta dr. Ratih Dewi Yudhani, MSc, buah hatiku Bama Radynka Aidan Pradhana dan Ailsayara Mahya Pradhani, saudara kandung Astuti Prasetya, saudara ipar Galuh yang telah memberikan kasih sayang dan semangat dengan sabar dan tulus memberikan dorongan moril dan materiil dalam penyelesaian tesis ini dan proses menjalani program pendidikan Pasca Sarjana dan PPDS I Ilmu Penyakit Dalam. 14. Seluruh teman sejawat seperjuangan Residen Penyakit Dalam yang telah memberikan dukungan dan bantuan kepada penulis dalam penelitian ini dan selama menjalani pendidikan. 15. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu-persatu, yang telah membantu penulis baik dalam menjalani pendidikan maupun dalam persiapan penelitian ini.
Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan dan penulisan tesis ini masih banyak terdapat kekurangan, untuk itu penyusun mohon maaf dan sangat mengharapkan saran serta kritik dalam rangka perbaikan penulisan tesis ini.
Surakarta, Juli 2016 Penulis
Didik Prasetyo. S501202021. 2016. Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Peningkatan Ekspresi P21, Ekspresi protein Bax dan Apoptosis Pada Kultur Sel Kanker Kolon ( Cell line WiDr). TESIS. Pembimbing I: dr. Suradi Maryono, SpPD-KHOM,FINASIM, Pembimbing II: Prof. Dr.dr.H. Bambang Purwanto, SpPD-KGH,FINASIM. Program Studi Kedokteran Keluarga, Program Pascasarjana, Universitas Sebelas Maret Surakarta. ABSTRAK Latar Belakang Kanker kolorektal merupakan kanker ketiga terbanyak dengan lebih dari 1 juta kasus setiap tahunnya dan salah satu kanker dengan mortalitas tertinggi di seluruh dunia. Radioterapi dan kemoterapi pada kanker relatif terbatas karena toksisitasnya yang tinggi dan efek samping yang bersifat merusak. Pengembangan propolis merupakan strategi baru untuk terapi adjuvan yang diharapkan meminimalkan efek samping terapi standar yang ada. Peran propolis pada keganasan terkait kemampuannya dalam menginduksi apoptosis dan aktivitas antiproliferasi. Penelitian in vitro, menunjukkan propolis memiliki aktivitas proapoptosis pada berbagai jenis sel kanker, meliputi : kanker laring, kanker paru, kanker pankreas, kanker tiroid, kanker payudara, kanker prostat dan glioma.. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian propolis yang berasal dari Kerjo, Karanganyar, Indonesia terhadap aktivitas antiproliferasi, terkait peningkatan ekspresi p21 dan apoptosis terkait peningkatan ekspresi protein bax pada kultur sel kanker kolon (cell line WiDr). Metode Penelitian Jenis penelitian ini, eksperimental laboratorik dengan post test with control group design. Penelitian menggunakan kultur sel WiDr (sel kanker kolon) dengan pemberian ekstrak etanol propolis (EEP). Pengamatan ekspresi p21 dan protein Bax dengan metode imunositokimia, sedangkan pengamatan apoptosis dengan flowcytometry. Analisis statistik menggunakan uji Kruskall Wallis dilanjutkan Mann WhutneyU test. Hasil Penelitian EEP cenderung menekan viabilitas sel WiDr dengan IC 50 sebesar 140 µg/mL. EEP konsentrasi 70,140, 280 µg/mL mampu meningkatkan ekspresi p21 yang sebanding dengan peningkatan konsentrasi yang diberikan. EEP konsentrasi 70 µg/mL (1/2 IC50) paling efektif dalam menginduksi apoptosis dan meningkatkan ekspresi Bax pada sel WiDr. Peningkatan konsentrasi EEP mengakibatkan kematian sel WiDr ke arah nekrosis. Kesimpulan Penelitian ini menunjukkan EEP mampu menekan viabilitas sel WiDr. Aktivitas ini kemungkinan terkait dengan kemampuannya dalam meningkatkan ekspresi p21 sebanding dengan peningkatan konsentrasi EEP. EEP pada konsentrasi 70µg/mL mampu menginduksi apoptosis pada sel WiDr terkait dengan peningkatan ekspresi Bax. Peningkatan konsentrasi EEP (140 dan 280 µg/mL) mengakibatkan nekrosis sel WiDr. Kata kunci : EEP, cell line WiDr, p21, apoptosis, protein bax
Didik Prasetyo. S501202021. 2016. Effect of Propolis Extract on Increasing Expression of P21, Bax protein expression and Apoptosis In Colon Cancer Cell Culture (Cell line WiDr). THESIS. Supervisor I: dr. Suradi Maryono, SpPDKHOM, FINASIM, Supervisor II: Prof. Dr.dr.H. Bambang Purwanto, SpPDKGH, FINASIM. Master Program of Family Medicine focusing on Biomedical Sciences, Sebelas Maret University Surakarta. ABSTRACT Background Colorectal cancer is the third leading cancer worldwide, with more than 1 million cases annually. In 2012, this cancer caused 0.7 million of deaths and became one of the cancers with the highest mortality rates in the world. Radiotherapy and chemotherapy for cancer are relatively limited because of high toxicity and side effects. The development of propolis as a stretegy for adjuvant therapy for cancer which expected reduce the side effects of cancer treatment. The role of propolis in the treatment of malignancy associated with its ability to induce apoptosis and its anti-proliferation activities. In studies in vitro, propolis showed proapoptosis activity on various types of cancer cells, including: laryngeal cancer, lung cancer, pancreatic cancer, thyroid cancer, breast cancer, prostate cancer and glioma. Objectives This study aimed to determine the effect of propolis originating from Kerjo, Karanganyar, Indonesia for anti-proliferation activities, especially associated with the increase in p21 expression and apoptosis associated with increased expression of Bax protein in culture of colon cancer cells (cell line WiDr). Methods This study was experimental study using post test with control group design. The study was conducted on cell cultures WiDr (colon cancer cells) with ethanol extract of propolis. Observations expression of p21 and Bax protein expression using immunocytochemistry, whereas observation of apoptosis by flowcytometry. Statistical analysis using Kruskall Wallis continue with Mann WhitneyU test. Result EEP suppressed WiDr cell viability with IC50 of 140 mg / mL. EEP concentration of 70, 140, 280 µg/mL able to increase p21 expression in a dose dependent manner. EEP at certain concentration (70 µg/mL) was most effective in inducing apoptosis and increasing the expression of Bax in WiDr cells. Increasing concentrations of EEP (140, 280 µg/mL) resulting in WiDr cell death toward necrosis. Conclusion This study shows EEP was able to suppress viability of WiDr cell. This ability may associated with its ability to increase p21 expression in a dose dependent manner. EEP at concentration 70μg / mL was able to induce apoptosis in cells WiDr associated with increased expression of Bax protein. Increasing concentrations of EEP (140 and 280 µg/mL) WiDr cell necrosis. Keywords: EEP, cell line WiDr, p21, bax protein
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR …..….....…………..……………………...................
v
ABSTRAK.............................……...……..…………………..........................
viii
DAFTAR ISI
…………………….....………………………....................
x
DAFTAR GAMBAR ………………………………………...........................
xii
DAFTAR TABEL…………………………………………...….....................
xiii
DAFTAR LAMPIRAN …………………….……………………………......
xiv
DAFTAR SINGKATAN
…………………………………........................
xv
BAB I. PENDAHULUAN………………………………………..................
1
A. Latar Belakang Masalah ……………………………..........................
1
B. Rumusan Masalah ..………………....…………………......................
3
C. Tujuan Penelitian ..………………………………………..................
4
1. Tujuan umum …………………………………………......……..
4
2. Tujuan khusus …..…………………………………....…………..
4
D. Manfaat penelitian …..………………………………...….……..........
4
1. Manfaat teoritis ……………………………….....……………….
4
2. Manfaat terapan ……………………………….....……………….
4
BAB II. LANDASAN TEORI...............……………….....…….…….............
5
A. Tinjauan Pustaka ..................................................................................
5
1. Kanker..............................................................................................
5
2. Kanker Kolon...................................................................................
7
a. Epidemiologi......................... …................................................
8
b. Etiologi.......................... …….………………….......................
9
c. Patofisiologi...............................................................................
10
d. Terapi........................................................................................
13
3. Sel WiDr..........................................................................................
15
4. Siklus Sel.........................................................................................
16
5. Protein 21 (P21)...... ………….........................................................
19
6. Apoptosis.........................................................................................
19
7. Propolis............................................................................................
23
B. Penelitian yang relevan …....…………………………………………
31
C. Kerangka Berpikir..... …….....….…………….....…………………...
32
D. Kerangka Konsep.................................................................................
34
…. ……......…………………………...............
35
BAB III. METODE PENELITIAN ...…………………………....................
36
A. Tempat dan Waktu.... .........................................................................
36
B.
Jenis Penelitian........ ……………………………..............................
37
C.
Subyek Penelitian...............................................................................
37
D.
Identifikasi Variabel..........................................................................
37
E.
Definisi Operasional..... ….….........................................................
37
F.
Bahan dan Alat Penelitian.......………..............................................
39
G.
Jalannya Penelitian....... ...................................................................
41
H.
Teknik Analisis Data........................................................................
49
BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN .….....…………..
51
A. Hasil Penelitian...................... .…………………………………….
51
E. Hipotesis Penelitian
1. Uji sitotoksisitas MTTassay menetapkan IC50 ekstrak etanol propolis dan 5-fluorouracil...........................................................
51
2. Pengamatan ekspresi p21.............................................................
54
3. Uji Induksi apoptosis EEP dengan flowcytometry........................
57
4. Pengamatan ekspresi protein bax..................................................
61
B. Pembahasan ….………………………………………………..........
64
1. Aspek Ontologi ………………………………………......……
64
2. Aspek Epistemiologi ……………………………........………..
66
3. Aspek Aksiologi …………………………..........……………...
69
4. Keterbatasan Penelitian ……………..........…………………....
70
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ………………………………….....
71
DAFTAR PUSTAKA …………………………………………………........
72
LAMPIRAN
72
................…….………….…….....………….………….....
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1.
Skema dasar molekular kanker.................................…..
6
Gambar 2.
10 besar kanker di RSKD tahun 2010............................
9
Gambar 3.
Perubahan genetik kanker kolorektal.............................
12
Gambar 4.
Sel WiDr.........................................................................
15
Gambar 5.
Siklus Sel.......................... .............................................
18
Gambar 6.
Apoptosis jalur ekstrinsik dan intrinsik...........…….....
21
Gambar 7.
Struktur molekul flavonoid............................................
25
Gambar 8.
Struktur molekul asam fenolat.......................................
28
Gambar 9.
Struktur molekul CAPE...……………………………...
28
Gambar 10.
Kerangka Berpikir.......................................................
32
Gambar 11.
Kerangka Konsep........................................................
34
Gambar 12.
Skema pengisian plat mikrokultur uji sitotoksisitas.......
44
Gambar 13.
Skema pengisian plat mikrokultur p21 dan bax...........
45
Gambar 14.
Alur Penelitian................................................................
49
Gambar 15.
Morfologi Sel WiDr.......................................................
51
Gambar 16.
Pembentukan kristal formazan………..........................
52
Gambar 17.
Hasil imunositokimia p21....………………………......
55
Gambar 18.
Grafik hubungan konsentrasi bahan uji dengan ekspresi p21...................................................................
56
Gambar 19.
Uji apoptosis sel WiDr inkubasi 24 jam........................
58
Gambar 20.
Hasil Flowcytometry.................................................
59
Gambar 21.
Grafik hubungan konsentrasi bahan uji dengan apoptosis sel WiDr.........................................................
60
Gambar 22.
Hasil imunositokimia protein bax..................................
62
Gambar 23.
Grafik hubungan konsentrasi bahan uji dengan ekspresi Protein bax........................................................................
63
DAFTAR TABEL
Tabel 1.
Faktor resiko kanker usus besar..... ................................
10
Tabel 2.
Senyawa utama propolis...................................................
26
Tabel 3.
Jadwal Penelitian......................................................... ...
36
Tabel 4.
Nilai rata-rata viabilitas sel WiDr ....................................
53
Tabel 5.
Persentase ekspresi p21 sel WiDr.........................................
56
Tabel 6.
Persentase sel WiDr yang mengalami apoptosis..............
60
Tabel 7.
Persentase ekspresi protein bax sel WiDr.........................
63
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Ethical clearance Lampiran 2. Sertifikat kursus kultur jaringan Lampiran 3. Absorbansi sel WiDr setelah pemberian bahan uji Lampiran 4. Persentase viabilitas sel WiDr setelah pemberian bahan uji Lampiran 5. Analisis regresi linear untuk menentukan IC50 EEP Lampiran 6. Analisis statistik ekspresi p21 dan protein bax pada kelima kelompok Lampiran 7. Hasil Flowcytometry Lampiran 8. Analisis statistik uji induksi apoptosis Lampiran 9. Dokumentasi penelitian
DAFTAR SINGKATAN
AP-1
: Activator protein-1
APAF 1
: Apoptotic protease activating factor 1
APC
: Antigen Presenting Cell
BCl
: B-cell lymphoma
CAPE
: Caffeic Acid Phenethyl Ester
CDK
: Cyclin dependent kinase
CIN
: Cromosomal Instability
COX2
: Cyclooxygenase-2
DCC
: Deleted in Colon Cancer
DISC
: Death-inducing singnalling complex
DNA
: Deoksiribonucleid Acid
dUMP
: deoxyuridine monophosphite
EEP
: Ekstrak etanol propolis
EGFR
: Endotheal Growth Factor Receptor
FADD
: Fas-associated death domain
FU
: Fluoro Uracil
MIN
: Microsatellite Instability
MMR
: Missmatch repair
NCCN
: National Comprehensive Cancer Network
NFkB
: Nuclear factor kappa B
NFAT
: Nuclear factor of activated cells
P21
: Protein 21
pGP
: P-glikoprotein
PS
: Phosphatidylserine
RB
: Retinoblastoma
RNA
: Ribonucleic acid
TNFR
: Necrosis FactorReceptor
TRADD
: TNF receptor-associated death domain
TS
: Timidilat sintetase
VEGF
: Vascular Endothel Growth Factor
WHO
: World Health Organization
