Simposium Nasional XV PERHIPBA, Solo, 9‐10 November 2011
AKTIVITAS SITOTOKSIK Ocimum sanctum L PADA SEL KANKER KOLON WiDr
Sari Haryanti dan Katno Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional Badan Litbang Kesehatan, Kementerian Kesehatan RI
[email protected]; HP. 08122646342
ABSTRAK Ocimum sanctum L (kemangi) adalah salah satu tanaman dengan kandungan asam ursolat. Asam ursolat merupakan senyawa kimia golongan pentasiklik triterpenoid yang terdapat pada tanaman. Beberapa penelitiaan menunjukkan bahwa asam ursolat memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker karena kemampuannya dalam menghambat beberapa tahapan pada karsinogenesis dan didukung dengan keberadaannya yang tersebar luas pada banyak tanaman. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui profil KLT dan aktivitas sitotoksik in vitro ekstrak etanolik dan fraksi herba kemangi pada sel kanker kolon WiDr. Ekstraksi dilakukan dengan maserasi menggunakan penyari etanol 96% selama 3x24 jam; maserat dikeringkan dengan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kering. Identifikasi asam ursolat dengan KLT menggunakan fase diam silika gel, fase gerak kloroform‐aseton (9:1) dan penampak bercak asam sulfat 10% dalam etanol. Pengamatan dilakukan pada sinar tampak. Aktivitas sitotoksik ekstrak dan fraksinya dengan metode MTT assay untuk mendapatkan nilai IC50. Ekstrak aktif difraksinasi berturut‐turut menggunakan heksan, kloroform, etilasetat dan air. Profil KLT ekstrak etanol kemangi memperlihatkan adanya bercak dengan Rf dan warna yang sama dengan bercak standar asam ursolat (warna merah muda; Rf 0.65). Uji sitotoksik ekstrak etanolik memberikan nilai IC50 85 ug/ml. Berdasarkan profil KLT keempat fraksi, hanya fraksi kloroform yang mengandung asam ursolat. Fraksi kloroform merupakan satu‐satunya fraksi yang aktif dengan nilai IC50 25 ug/ml. Penelitian ini menunjukkan bahwa kemangi memiliki aktivitas penghambatan pertumbuhan dan menginduksi induksi kematian sel WiDr sehingga cukup potensial dikembangkan sebagai agen kemopreventif. Kata kunci: Ocimum sanctum, fraksi, aktivitas sitotoksik, sel WiDr, kemopreventif PENDAHULUAN Kanker merupakan sekumpulan penyakit yang disebabkan oleh perubahan sifat normal sel yaitu sel menjadi lebih agresif, tumbuh dan membelah tanpa terkendali, karena dapat memenuhi sinyal pertumbuhannya sendiri. Sel tersebut selanjutnya memiliki kemampuan invasive (menyusup dan merusak jaringan di dekatnya) dan metastasis (menyebar ke jaringan lainnya melalui sistem pembuluh darah dan 1
Simposium Nasional XV PERHIPBA, Solo, 9‐10 November 2011
limpa). Kanker berada di urutan ke dua penyebab kematian terbanyak di dunia setelah penyakit jantung. Semua organ dan bagian tubuh dapat menjadi target sel kanker. Kolon sebagai saluran terakhir pencernaan makanan juga berpotensi terkena kanker. Jumlah penderita kanker kolon berada di urutan teratas dari seluruh jenis kanker yang diderita pria dan wanita (Jemal et al., 2007). Pengembangan terapi yang komprehensif untuk mengatasi kanker kolon sangat diperlukan untuk menekan jumlah kematian penderita. Salah satu pengembangan terapi kanker diarahkan pada terapi kombinasi antara suatu agen kemoterapi dengan senyawa kemopreventif. Salah satu pendekatan untuk menemukan senyawa kemopreventif adalah melalui eksplorasi bahan alam terutama tumbuh‐tumbuhan. Beberapa penelitian mulai diarahkan pada pengujian kombinasi bahan alam dengan agen kemoterapi untuk mengurangi terjadinya resistensi dan efek samping obat. Bahan alam mengandung berbagai senyawa biologis yang beraksi pada sel kanker melalui mekanisme yang kompleks. Salah satu tumbuhan yang dapat dikembangkan sebagai agen kemopreventif adalah Ocimum sanctum L (kemangi). Kemangi bersifat sebagai adaptogen, di antaranya memiliki beberapa efek farmakologi seperti imunomodulator, anti‐stress, hepatoprotektif, kemopreventif, dan anti‐inflamasi. Senyawa aktif yang diketahui terdapat pada O. Sanctum L adalah flavonoids, orientin, vicenin, eugenol (1‐hydroxy‐2‐methoxy‐4‐allylbenzene), dan asam ursolat (Niture et al., 2006). Asam ursolat diketahui memiliki aktivitas antikanker dengan menghambat peristiwa karsinogenesis, promosi kanker, induksi differensiasi sel kanker, dan angiogenesis. Aktivitas tersebut di antaranya diperantarai oleh kemampuan asam ursolat menghambat aktivasi salah satu faktor transkripsi, nuclear factor‐kappaB (NF‐κB). NF‐κB adalah salah satu protein yang meregulasi ekspresi sejumlah gen yang berperan dalam proses pembentukan kanker; termasuk gen antiapoptosis, gen yang mengatur adhesi molekul, dan gen yang mengatur siklus sel. Senyawa yang dapat menghambat aktivasi NF‐κB memiliki potensi terapetik sebagai senyawa antikanker (Shishodia et al., 2003). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui profil KLT dan aktivitas sitotoksik in vitro ekstrak etanolik dan fraksi herba kemangi pada sel kanker kolon WiDr. Sel WiDr merupakan sel kanker kolon yang diambil dari jaringan epitelial seorang wanita, berupa sel adherent (melekat) dengan karakteristik antara lain resisten terhadap beberapa agen kemoterapi (Jean‐Claude et al., 1999), dan overekspresi COX‐2 (Kojima et al., 2000). METODE PENELITIAN Tempat dan waktu penelitian. Penelitian dilakukan di Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran UGM. Ekstrak etanolik dan fraksi herba kemangi (EHK). Herba kemangi diperoleh dari daerah Karanganyar. Ekstrak diperoleh dengan mengekstraksi herba kering dengan
2
Simposium Nasional XV PERHIPBA, Solo, 9‐10 November 2011
etanol 96%. Selanjutnya ekstrak etanol cair yang didapat dikentalkan dengan rotary evaporator, dikeringkan diatas waterbath hingga diperoleh ekstrak kering. Fraksinasi dilakukan dengan melarutkan 10 g ekstrak aktif dalam 50 mL akuades dan dibasakan sampai pH 8 dengan penambahan amoniak, kemudian difraksinasi menggunakan heksan, kloroform, dan etil asetat menggunakan corong pisah. Fraksinasi dilakukan sebanyak 3 kali replikasi, volume penyari yang digunakan tiap kali fraksinasi adalah ± 250 mL. Hasil fraksinasi kemudian dikentalkan dengan rotary evaporator sehingga diperoleh 4 fraksi kental, yang selanjutnya disebut fraksi heksan, fraksi kloroform, fraksi etil asetat dan fraksi air. Sel kanker kolon. Sel kanker kolon WiDr yang digunakan adalah koleksi Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Umum Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Kultur sel ditumbuhkan dalam media penumbuh Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Gibco) yang mengandung Foetal Bovine Serum (FBS) 10% (v/v) (Gibco), penisillin‐streptomisin 1 % (v/v) (Gibco). Deteksi asam ursolat. Sebanyak kurang lebih 1% EHK dan 0,1% standard asam ursolat dalam metanol ditotolkan pada lempeng KLT; kemudian dikembangkan dalam fase gerak kloroform‐aseton (9:1). Setelah batas elusi, lempeng dikeringkan dan disemprot dengan asam sulfat 10% dalam etanol hingga semua bagian lempeng terbasahi; ditunggu hingga lempeng kering. Lempeng dipanaskan dalam oven suhu 1100C selama 5 menit dan diamati pada sinar tampak. Lempeng kemudian dianalisa dengan TLC‐densitometer Uji sitotoksik in vitro. Sejumlah 5000 sel WiDr /sumuran ditanam pada microplate 96 sumuran dan diinkubasi selama 48 jam. Setelah itu medium diganti yang baru dengan ditambahkan EHK maupun fraksi pada berbagai konsentrasi (50‐200 μg/ml) dengan co‐solvent DMSO (Sigma) dan diinkubasi pada 37ºC dalam inkubator CO2 5% selama 48 jam. Pada akhir inkubasi, media dan ekstrak dibuang kemudian sel dicuci dengan PBS Pada masing‐masing sumuran, ditambahkan 100μl media kultur dan 10μl MTT (Sigma) 5 mg/ml. Sel diinkubasi kembali selama 4‐6 jam dalam inkubator CO2 5%, 37ºC. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen asam isopropanol (HCl 4N (Merck)‐isopropanol (Merck), (1:100), digoyang di atas shaker selama 10 menit. Serapan dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm. Analisis Data. Data absorbansi pada uji sitotoksik diolah dengan regresi linier program Excell MS Office 2007.
HASIL Profil KLT EHK memperlihatkan adanya bercak warna merah muda pada sinar tampak dengan intensitas warna dan Rf (0,6) yang sama dengan standard asam ursolat yang digunakan.
3
Simposium Nasional XV PERHIPBA, Solo, 9‐10 November 2011
Gambar 1. Profil KLT EHK (A1) dan standard asam ursolat (A2) pada pengamatan dengan sinar tampak; B adalah profil EHK saat dianalisa dengan TLC‐densitometer
Hasil uji sitotoksik menunjukkan bahwa perlakuan EHK kadar 50‐200 µg/mL pada sel WiDr menyebabkan terjadinya perubahan morfologi dibandingkan sel tanpa perlakuan (Gambar 1). Berdasarkan morfologi serta viabilitas sel terdapat hubungan linier antara konsentrasi dan efek sitotoksik yang dihasilkan. Perubahan morfologi tersebut dimungkinkan mengarah pada kematian sel. EHK mampu menghambat pertumbuhan sel WiDr dengan IC50 sebesar 85 µg/ml. 100
B
% viabilitas
80 60 40 20
A
C
0 30
60
90
120
150
200
kadar EHK (ug/ml)
Gambar 1. Viabilitas sel WiDr akibat perlakuan EHK. Uji dilakukan dengan menginkubasi 5x103 sel dengan EHK (50‐200 µg/mL) selama 48 jam. Terjadi perubahan morfologi pada perlakuan EHK 120 µg/mL (B) dibandingkan sel kontrol (A). Grafik C memperlihatkan adanya hubungan konsentrasi EHK terhadap persentase viabilitas sel.
Uji sitotoksik fraksi EHK menunjukkan tidak semua fraksi memiliki aktivitas pada sel WiDr. Fraksi aktif adalah fraksi kloroform dengan IC50 25µg/mL. Profil KLT memperlihatkan bahwa hanya fraksi kloroform yang mengandung asam ursolat.
4
Simposium Nasional XV PERHIPBA, Solo, 9‐10 November 2011
120
B
A
% viabilitas
100
C
80 heksan 60
kloroform
40
EtOAc
20
air
0 5
10
30
60
Kadar fraksi (ug/ml)
90
120
Gambar 2. Viabilitas sel WiDr akibat perlakuan fraksi EHK. Uji dilakukan dengan menginkubasi 5x103 sel dengan fraksi EHK (5‐120 µg/mL) selama 48 jam. Terjadi perubahan morfologi pada perlakuan fraksi kloroform 120 µg/mL (B) dibandingkan sel kontrol (A). Grafik C memperlihatkan hubungan konsentrasi tiap fraksi terhadap persentase viabilitas sel.
PEMBAHASAN EHK memberikan hambatan pertumbuhan sel kanker kolom WIDR dengan IC50 yang relatif kecil (85μg/ml, kurang dari 100μg/ml) sehingga cukup potensial untuk dikembangkan sebagai alternatif agen kemopreventif. Di antara keempat fraksi yang digunakan, hanya fraksi kloroform yang memiliki aktifitas penghambatan pertumbuhan sel. Berdasarkan profil KLT hanya fraksi kloroform yang memperlihatkan adanya asam ursolat. Hal tersebut menunjukkan bahwa senyawa yang bertanggung jawab terhadap aktifitas sitotoksik kemangi adalah asam ursolat. Shishodia et al., 2003, menunjukkan bahwa asam ursolat mampu menurunkan aktivitas NF‐κB melalui penghambatan IκBα kinase dan fosforilasi p65 yang berkorelasi dengan penurunan ekspresi cyclin D, COX‐2, dan MMP 9. NF‐κB berperan dalam proses kemoresistensi dengan cara aktivasi protein Myc sebagai perantara aktivasi transkripsi cyclin A dan D. Hal ini menyebabkan apoptosis terabaikan dan siklus sel terus berlanjut. Stimulasi NF‐κB dapat melalui death receptors kemudian berinteraksi dengan gen target seperti IAPs dan menghambat jalur caspase (Schimmer, 2004); atau melalui sinyal proliferasi melewati jalur Akt sehingga mengakibatkan peningkatan ekspresi protein antiapoptosis. Penelitian yang lebih mendalam perlu dilakukan untuk mengkaji peran EHK dan relevansinya dengan penghambatan aktivitas NF‐κB sehingga memberikan efek sitotoksik. KESIMPULAN Ekstrak etanolik herba kemangi (Ocimum sanctum L.) memiliki efek sitotoksik dengan nilai IC50 85µg/mL. Fraksi aktif adalah kloroform dengan nilai IC50 25µg/mL. Senyawa yang bertanggung jawab terhadap aktifitas tersebut adalah asam ursolat. 5
Siimposium N Nasional XV P PERHIPBA, S Solo, 9‐10 No ovember 201 11
AKA DAFFTAR PUSTA Agggarwal, B.B., Sethi, G., Nair, A. an nd Ichikawaa H. 2006. Nuclear Factor‐κB: A Holy Grail in C Cancer Prevvention and d Therapy. Current Signal Transdu uction Therrapy. 1: 25‐52. Cheen, Y.H., Chang, F.R., Wu, W C.C., Yeen, M.H., Liaw, C.C., Huang, H H.C., Kuo, Y.H. and 9‐Hedyotiscone A‐C, from f Wu, Y.C.., 2005, New Cytotoxxic 6‐Oxygenated 8,9 Hedyotis biflora. Pla anta Med.72: 75‐78. Dau ucas, H., Garcea, G G., Neal, C..P., Manso on, M.M., and Berryy, D.P., 2006, Chemoprrevention of o Pancreatic Cancer: A A Review of the Molecular Pathw ways Involved, and Eviden nce for the Potential ffor Chemop prevention, Pancreatollogy; 6: 429–43 39. Dhaarmananda,, S. 2004. O Oldenlandia and Scutellaria Antito oxin and An nticancer He erbs. Institute for Traditio onal Medicine, Portland, Oregon.JJemal, A., Siegel, R., W Ward, E., Murraay, T., Jiaquan Xu and d Michael J.T. 2007. Cancer Staatistic 2007, CA Cancer J C Clin., 57: 43 3‐66 Jean n‐Claude, B.J., Mustafaa, A., Watso on, A.J., Dam mian, Z., Vasilescu, D., Chan, T.H., and Leyland‐Jones, B., 19 999, Tetrazeepinones arre Equally C Cytotoxic to o Mer+ and Mer Humaan Tumor Cell C Lines, The T Journal l Of Pharma acology And Experimeental Therapeu utics, 288 (2 2): 484‐489. Kingg, R.J.B., 200 00, Cancer B Biology, 2ndd edition, Pe earson Educcation Ltd., London. Kojima, M., Morisaki, T., Izuhara, K.., Uchiyamaa, A., Matsunari, Y., K Katano, M., and Tanaka, M., M 2000, Lipopolysacc L charide Increases Cyclo‐Oxygenasse‐2 Expresssion In A Colon Carcinom ma Cell Line Through Nu uclear Facto or‐κB Activaation, Onco ogen, 25‐1231 19(9): 122 Leiggh, M.J., 20 003, Health Benefits of o Grape Se eed Proanth hocyanidin Extract (GSSPE), Nutrition Noteworth hy, 6(1): article 5. Nitu ure, SK., Rao, US., Sriveenugopal K K., 2006, Chemopreven ntative strattegies targe eting MT repair protein: Auggmented exxpression in n human lymphocytes and the MGM kanker ceells by eth hanolic and aqueous extracts e of f several In ndian mediccinal plants. IN NTERNATION NAL JOURNA NAL OF ONCO OLOGY 29: 1269‐1278 Schimmer, A.D D. 2004 Inh hibitor of Apoptosis Prroteins: Traanslating Baasic Knowle edge into Cliniccal Practice. Review. Ca ancer Resea arch 64:718 83‐7190. Shehata, M.F. 2005. Rel/Nuclear factor‐kapp f a B apopttosis pathw ways in human cervical ccancer cells.. Review. Ca ancer Cell In nternational 5:10‐23. d Aggarwal, B.B. 200 03. Ursolic acid Shisshodia, S., Majumdar,, S., Banerrjee, S. and Inhibits Nuclear N Factor‐κBα Kin nase and p6 65 Phospho orylation: C Correlation with Down‐Regulation off Cyclooxygeenase 2, Matrix Metalloproteinasse 9, and Cyyclin D1. Canceer Researh. 63, 4375‐4383.
6
Simposium Nasional XV PERHIPBA, Solo, 9‐10 November 2011
Simstein, R., Burow, M., Parker, A., Weldon, C., and Beckman, B., 2003, Apoptosis, Chemoresistance, and Breast Cancer: Insights from the WIDR Cell Model System, Exp Biol Med, 228:995–1003. Srivastava, R.K., Sasaki, C.Y., Hardwick, J.M. and Longo, D.L. 1999. Bcl‐2‐mediated Drug Resistance: Inhibition of Apoptosis by Blocking Nuclear Factor of Activated T Lymphocytes (NFAT)‐induced fas Ligand Transcription. The Journal of Experimental Medicine 190 (2):253‐265. Wickenden, J.A., Clarke, M.C.H., Rossi, A.G., Rahman, I., Faux,, S.P., Donaldson, K, and MacNee, W., 2003, Cigarette Smoke Prevents Apoptosis through Inhibition of Caspase Activation and Induces Necrosis, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 29:562–570. Wyllie, A., Donahue, V., Fischer, B., Hill, D., Keesey, J., and Manzow, S., 2000, Cell Death Apoptosis and Necrosis, Rosche Diagnostic Corporation.
7
