158 PENENTUAN KREATININ DALAM URIN SECARA KOLORIMETRI DENGAN SEQUENTIAL INJECTION-FLOW REVERSAL MIXING (SI-FRM) Colorimetric Determination of Creatinine in Urin with Sequential Injection-Flow Reversal Mixing (SI-FRM) Hermin Sulistyarti1 , Akhmad Sabarudin1, Yudha Ikoma Istanti1, Eka Ratri Noor Wulandari1 1 Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Brawijaya, Malang, Indonesia
[email protected]
ABSTRAK Sequential injection analysis (SIA), generasi kedua dari sistem injeksi alir telah dikembangkan untuk penentuan kreatinin sebagai indeks medis kegagalan ginjal kronis. Pendeteksian kreatinin didasarkan pada reaksi Jaffe yang terjadi antara kreatinin dan asam pikrat dalam medium basa untuk membentuk senyawa berwarna merah-oranye. Absorbansi dari senyawa yang terbentuk diukur pada panjang gelombang 530 nm. Dalam penelitian ini, suatu konsep baru dari SIA yang disebut “lab-at-valve” dikembangkan dengan menambahkan suatu Valve Mixing sebagai tempat untuk memaksimalkan pembentukan senyawa antara kreatinin dan alkali-pikrat. Parameter-parameter yang mempengaruhi metode ini antara lain laju alir produk, waktu delay, volume sampel, volume reagen, konsentrasi reagen dan senyawa pengganggu telah dipelajari secara rinci. Dari hasil penelitian diperoleh bahwa kondisi optimum akan tercapai pada laju alir 20 µL/detik, waktu delay 5 detik, komposisi penggunaan 100 µL sampel dengan 300 µL reagen (asam pikrat 0,03 M dan NaOH 3 %) sehingga limit deteksi pada penentuan kreatinin yang dihasilkan sebesar 3,01 µg/g. Aplikasi dari metode ini ditujukan untuk penentuan kreatinin dalam sampel urin. Kata kunci : Kreatinin, reaksi Jaffe, SI-VM, RGB kolorimetri, urin ABSTRACT Sequential injection analysis (SIA), a second-generation of Flow Injection system has been developed for the determination of creatinine as an index of chronic renal failure. Creatinine detection was measured by Jaffe’s reaction between creatinine and picrate in alkaline medium to form a colored product (red-orange). The absorbance was measured at wavelength of 530 nm. In this system, a new concept of SIA, called “lab-at-valve (LAV)”, has been developed by designing of a valve mixing to maximize formation of creatinine-alkaline picrate compound. The influence of variables such as effect of rate flow of product, delay time, sample volume, reagent volume, reagent concentration, and interference was investigated. The results showed that optimum conditions was obtained at flow rate of 20 µL/s, delay time of 5 s, the composition of 100 µL sample volume with 300 µL reagent volume (0.03 M picrate acid and 3 % NaOH) and detection limit of creatinine is 3.01 µg/g. Application of the proposed method was successfully applied to the determination of creatinine in urine samples. Keywords : Creatinine, Jaffe’s reaction, SI-VM, RGB colorimetry, urine
Penentuan Kreatinin dalam Urin Secara Kolorimetri… (Hermin Sulistyarti dkk)
159 antara
PENDAHULUAN Dewasa ini,
tingginya
tingkat
kematian merupakan masalah utama bagi kesehatan
manusia.
memang
belum
Penyakit
mencapai
ginjal sepuluh
penyebab utama kematian di Indonesia, akan tetapi kelompok penyakit ini semakin banyak ditemukan pada berbagai jenis pelayanan kesehatan. Pola penyakit ini sering cepat berubah, sejalan dengan perubahan budaya.
kondisi
Dikemudian
sosial-ekonomihari,
diduga
di
Indonesia penyakit ginjal akan meningkat dalam jumlah dan kepentingan. darah, terdapat pada seseorang yang ginjalnya sudah tidak berfungsi dengan normal. Senyawa ini dihasilkan ketika terjadi kontraksi pada otot. Dalam darah, filtrasi
dihilangkan
melalui
dengan
glomerulus
proses
ginjal
dan
disekresikan dalam bentuk urin. Ginjal yang sehat menghilangkan kreatinin dari darah dan memasukkannya pada urin untuk dikeluarkan dari tubuh (Anonim, 2009). Analisis kadar kreatinin dalam tubuh merupakan indeks medis yang penting untuk mengetahui kondisi laju filtrasi glomerulus, keadaan ginjal, dan berfungsinya kerja otot (Spiritia, 2009) Metode yang sering digunakan untuk penentuan
kreatinin
adalah
metode
analisis secara kolorimetri melalui reaksi Jaffe. Reaksi Jaffe merupakan reaksi yang sederhana dan mudah. Metode ini didasarkan pada pembentukan senyawa berwarna
merah–oranye
yang
terjadi
pikrat
dengan
kreatinin
dalam suasana basa (Siangproh et al., 2009). Dalam aplikasinya, reaksi Jaffe umumnya
dilakukan
menggunakan batch
metode
sering
menyempurnakan dengan
cara
dengan
asam
penangas
dengan
batch.
Metode
digunakan
untuk
reaksi
Jaffe
mereaksikan pikrat
listrik,
yaitu
kreatinin
dalam
namun
suatu
dikarenakan
jumlah sampel yang dibutuhkan besar maka dibutuhkan jumlah reagen yang banyak dengan konsentrasi yang tinggi sehingga
Kreatinin adalah zat racun dalam
kreatinin
asam
mengakibatkan
dibutuhkan
waktu
untuk
yang
mencapai
kesempurnaan reaksi memerlukan waktu yang lama yaitu sekitar 30 menit (Faria & Pasquini,
1992).
Untuk
mengatasi
kelemahan pada metode batch
maka
diperkenalkan metode analisis berbasis teknik alir dengan menggunakan sistem sequential
injection
Penggunaan
SIA
mempercepat
analysis
(SIA).
ditujukan
untuk
proses
mengefisienkan
analisis,
penggunaan
reagen,
analisis secara otomatis dan memperkecil larutan
yang
menghemat harganya
dibuang
pemakaian mahal
sehingga
reagen
dan
yang
berbahaya
(Christian, 2005). Siangproh et al. (2009), melakukan
penentuan
kreatinin
yang
didasarkan pada reaksi Jaffe dengan menggunakan metode SIA. Parameter yang diteliti yaitu konsentrasi Na-pikrat dan NaOH, volume sampel serta reagen, dan jumlah flow reversal.
Akan tetapi
dalam aplikasinya kurang efektif karena
Sains dan Terapan Kimia, Vol.5, No. 2 (Juli 2011), 70-79
160 proses analisis menggunakan laju alir
dan sensitifitas tinggi (limit deteksi 5,69
yang lambat yaitu 50 µL/menit selain itu
µg/g).
tidak adanya tempat untuk bercampurnya sampel
dan
reagen
sehingga
Berdasarkan pada
uraian
penelitian
ini
diatas,
maka
digunakan
suatu
pembentukan
metode pengaplikasian dari metode SIA-
senyawa kreatinin-pikrat tidak berjalan
LAV yang disebut dengan Sequential
dengan sempurna.
Injection-Valve Mixing (SI-VM). Metode ini
dimungkinkan
reaksi
Untuk itulah
dikembangkan suatu
konsep terbaru dari SIA yaitu Lab-at-Valve
merupakan metode alternatif dari metode SI-FRM
yang
telah
dilakukan
oleh
[7]
tehnik
Wulandari (2010) . Sebagai tempat untuk
analisis on-line yang
sederhana dan
terjadinya reaksi antara asam pikrat dan
ekonomis.
pada
kreatinin dibuat suatu valve mixing dimana
(LAV)
yang
merupakan
Komponen
suatu
SIA-LAV
disusun hampir sama dengan tehnik SIA
untuk
sebelumnya, hanya saja ditambahkan
pembentukan
suatu separating chamber yang diletakkan
dilakukan dengan pendiaman sampel dan
di port 1 pada selection valve sebagai
reagen dalam valve mixing selama jangka
tempat terjadinya reaksi antara reagen
waktu
dan
akan
sederhana
pada
(2010)
sampel.
mendeteksi separating
Spektrofotometer secara
chamber
langsung sehingga
proses
penyempurnaan senyawa
tertentu. dari
ini
kreatinin-pikrat
Proses
yang
penelitian
diharapkan
mempercepat
reaksi
proses
lebih
Wulandari akan
lebih
analisis
yang
yang terjadi di dalamya dapat langsung
dilakukan tetapi tetap mempertahankan
diketahui (Burakham et al., 2005)
sensitifitas
Pengembangan metode SIA-LAV ini
yang
tinggi.
Untuk
meningkatkan absorbansi dari kreatinin
telah dilakukan pada penelitian yang
dilakukan
dilakukan oleh Wulandari (2010), hanya
meliputi laju alir produk, volume sampel
saja sebagai tempat terjadinya reaksi
dan reagen yang dipakai, waktu delay dan
antara reagen dan sampel dibuat suatu
konsentrasi asam pikrat serta NaOH yang
mixing coil dan pada prosesnya untuk
digunakan. Sebelum dilakukan aplikasi
menyempurnakan
penentuan kreatinin dalam sampel urin,
senyawa
reaksi
pembentukan
parameter
yang
dilakukan
dilakukan
terlebih
pembentukan segmen antara sampel dan
mengenai
pengaruh
reagen di holding coil yang selanjutnya
yang terdapat pada sampel urin yang
dilakukan
pada
dapat mengganggu terhadap pengukuran
pengaplikasiannya
kadar kreatinin. Senyawa pengganggu
metode ini cukup efektif dimana proses
yang diuji dalam penelitian ini yaitu
analisis
kreatin.
mixing
kreatinin-pikrat
optimasi
proses
coil.
flow
Pada
berlangsung
reversal
cepat
yaitu
12
sampel/jam, penggunaan sedikit reagen
Kemudian
dahulu
penelitian
senyawa-senyawa
dilakukan
aplikasi
metode SI-VM untuk penentuan kadar
Penentuan Kreatinin dalam Urin Secara Kolorimetri… (Hermin Sulistyarti dkk)
1661 kreatinin pada sam mpel urin. Hasil dari
hidrokksida (SAP Kemika), assam nitrat 65 6
m pikrat dan n kreatinin reaksi antara asam
% (Merck KGaA, Jerman), kecuali k etanol
akan
mika), sampel techniical grade (SAP Kem
o men nggunakan dideteksii secara on-line
urin dan d akuadess yang buka an merupaka an
RGB kolo orimeter.
bahan n kimia pro a analisis.
dalam
suasana
basa b
tersebut
Penen ntuan Parameter Optimum secarra
METODE E PENELITIAN
on lin ne Alat Alat--alat
digunaka an
yang
dalam
penelitian n ini antara lain:, perala atan gelas, oven,
n neraca
ana alitis
Mettller,
botol
semprot, pipet mikrro 1 mL dan 5 mL, gkat alat SI-VM yang terdiri t dari seperang syringe
pump
P; (SP
Hamilto on,
Reno,
gan kapasita as volume Nevada, USA) deng v (SL; 2,5 mL, delapan selection valve n, Reno, Ne evada, USA A), pompa Hamilton dan dettektor berup pa RGB kolorimeter k yang diko ontrol melalu ui komputer..
P Penentuan la aju alir optiimum produ uk dilaku ukan
menggunakan
c cara
on-line e,
yaitu dengan ala at SI-VM ya ang dirangkkai an kompute er. Adapun gambar da ari denga alat te ersebut ditun njukkan pada a Gambar 1. Penentuan laju alir opttimum produ uk dilaku ukan melalui 4 tahap berrikut ini: Tahap p 1: Pencuciian line dan detektor Pada tahap ini d dilakukan pengkondisia p an d cara a: switching g valve (SV V) alat dengan berada pada possisi mengisi dan syring ge pump (SP) meng gambil 2100 0 μL Akuade es m hold ding coil (HC C) untuk dialirkan menuju
Bahan an-bahan ya ang digunakkan dalam Baha
ui port 2 den ngan laju aliir 30 μL/detik, melalu
penelitian n ini merupa akan bahan kimia pro
port 3 dengan la aju alir 50 μL/detik da an
analisis (p.a) yaitu u padatan kreatinin
melalu ui port 4 den ngan laju aliir 50 μL/detik.
Aldrich, (Sigma-A
kreatin
Tahap p ini dilaku ukan sebanyyak tiga ka ali
(Sigma-A Aldrich, Co.,J Jerman), assam pikrat
agar dihasilkan kkondisi alat yang bena ar-
(Sigma-A Aldrich,
benarr
C Co.,Jerman), Co o.,Jerman),
natrium
.
Gambar 1
Rangkaiian Alat SI-V VM
bersih
saat
digunaka an
162 Tahap 2: Pengisian Line dengan larutan
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada tahap ini dilakukan pengisian line-
Optimasi Parameter
line yang akan digunakan dengan cara:
Parameter Fisik
SV berada pada posisi “OUT” dan SP mengambil
500
μL
larutan
standar
Penentuan laju alir optimum produk dilakukan
dengan
cara
memvariasi
kreatinin dan 500 μL reagen dari port 3
kecepatan laju alir menuju ke detektor
dan 4 yang akan dikeluarkan melalui port
sehingga akan dihasilkan nilai absorbansi
7 dengan laju 50 μL/detik.
kreatinin yang berbeda pada berbagai
Tahap 3: Pendeteksian kreatinin
tingkatan laju alir. Besarnya laju alir
Pada tahap ini dilakukan absorbansi
produk
larutan standar kreatinin dideteksi dengan
mempengaruhi absorbansi kreatinin yang
cara: SV berada pada posisi “OUT” dan
diperoleh,
SP mengambil masing-masing 150 μL
mempengaruhi
larutan standar kreatinin dan larutan asam
senyawa kreatinin-pikrat, cepat lambatnya
pikrat-NaOH untuk dialirkan menuju port 1
analisis serapan senyawa kreatinin-pikrat
dengan laju alir 5 μL/detik, kemudian
yang mampu dibaca oleh detektor dan
dilakukan delay yang dilanjutkan dengan
proses
mengalirkan larutan campuran ini menuju
senyawa kreatinin-pikrat dengan carrier
detektor.
yaitu
(akuades). Sesuai dengan Gambar 2
mengalirkan akuades kedalam detektor
maka laju alir 20 µl/s dipilih sebagai laju
untuk membawa sisa-sisa larutan yang
alir optimum ke detektor karena diperoleh
masih tertinggal. Nilai Absorbansi yang
sensitivitas yang paling tinggi. Waktu
diperoleh akan terbaca oleh komputer.
delay
Langkah
berikutnya
Penetuan Kreatinin dalam Urin secara on line Pada penentuan kadar kreatinin dalam urin dilakukan prosedur seperti pada penentuan optimasi parameter dengan menggunakan seluruh kondisi optimum dari parameter yang digunakan. Sebelum digunakan urin diencerkan 30 kali dengan akuades. kemudian dilakukan prosedur seperti di atas. Nilai absorbansi diplotkan
yang
melalui
dikarenakan
pembentukan
yang
pembentukan
terjadi
mempengaruhi senyawa
dapat
laju alir akan
proses
dispersi
dapat
detektor
antara
proses
kreatinin-pikrat
yang terjadi karena berpengaruh terhadap lamanya waktu kontak antara sampel dan reagen. Semakin lama waktu kontak antara sampel dan reagen maka senyawa kreatinin-pikrat
yang
terbentuk
akan
semakin stabil, sehingga absorbansi yang diperoleh akan semakin tinggi. Namun waktu kontak yang terlalu lamapun dapat menurunkan absorbansi.
ke dalam kurva baku untuk mengetahui kadar kreatinin dalam sampel urin. .
Penentuan Kreatinin dalam Urin Secara Kolorimetri… (Hermin Sulistyarti dkk)
1663
Gam mbar 2
Hal
ini
kreatinin--pikrat
G Grafik Penen ntuan Laju Alir A Optimum m Produk
dikkarenakan ya ang
senyawa telah
akan mampu unttuk memben ntuk senyaw wa
terbentukk dapat te erdispersi ke k dalam
uruh kreatinin kreatinin-pikrat dengan selu
terjadi
angkan apa abila volum me yang ada. Seda
an absorba ansi yang diperoleh. penuruna
en yang dig gunakan te erlalu banya ak reage
Waktu de elay optimum m yaitu 5 dettik.
maka selain pe emborosan penggunaa an
carrier
(akuades)
tadinyya
dalam m jumlah ya ang sedikit maka tida ak
sehingga a
Volu ume reagen n (larutan Na-pikrat)
en konsentra asi larutan sampel jug ga reage
yang dig gunakan dala am penelitia an ini juga
akan
mengalam mi
pengen nceran
perlu dite eliti karena berpengaruh b h terhadap
nceran yang terjadi haru us besarrnya pengen
jumlah vo olume samp pel yang mam mpu untuk
diperh hitungkan kkembali. Va ariasi volum me
membentuk senyaw wa dengan sejumlah
reage en yang digunakan yaitu 150, 300,
volume reagen tertentu. Perlunya untuk
450, 600, dan 7 750 µL. Vo olume reage en
me reagen optimum, menentukan volum
0 µL. optimum yaitu 300
en yang digu unakan karena apabila reage
Gambar 3
Grafik Penenttuan Konsen ntrasi NaOH Optimum
da an
164
Gambarr 4
Grafik Penentuan n Konsentra asi Asam Pikkrat Optimum m
masi volum me sampel ditentukan Optim untuk
meminimum mkan
sampel
tetapi
teta ap
pe enggunaan
mempe ertahankan
memp pengaruhi
pembentuka an
senyaw wa
kreatinin-pikrat (S Siangproh et al., 2009). ai Sesua
Gambarr
3
maka
asi konsentra
as yang tinggi denga an tingkat sensitifita
NaOH H optimum yaitu 3% karena pad da
ketelitian n yang besa ar (Siangprroh et al.,
konse entrasi
2009).
pengu ukuran lebih tinggi.
Abso orbansi
diperoleh
yang
tersebut
sensitifita as
Penga aruh konsen ntrasi asam m pikrat yaittu
berbanding lurus de engan volum me sampel
sebag gai
gunakan, ab bsorbansi akan a terus yang dig
senya awa dengan n kreatinin. Berdasarka an
meningka at sejalan dengan d bertambahnya
Gamb bar 4 maka dapat dike etahui bahw wa
volume sampel yan ng digunaka an hingga
absorrbansi sema akin meningkat denga an
( & keadaan steady statte tercapai (Ruzicka
semakin bertamb bahnya konssentrasi asam
Hansen, 1988).
pikrat,
ume sampel optimum ya ang dipilih Volu adalah
100
µL
dikarenaka an
me volum
sampel
pada
reagen
dan
untuk
ab bsorbansi
pembentu uk
akan
mulai
an berkurang pada kkonsentrasi 0,035 M da usnya. Konssentrasi asam pikrat 0,0 03 seteru
µL
M dip pilih sebaga ai konsentrrasi optimum
k yan ng ada tepatt berikatan seluruh kreatinin
dikare enakan asam m pikrat pada konsentra asi
dengan
lebih tinggi dari konsentrasi k tersebut t tida ak
penggunaan
sejumlah
reagen
100
ya ang
telah
an. disediaka
ngkatkan menin
Parametter Kimia
asam pikrat yan ng tinggi menyebabka m an
Penga aruh konsen ntrasi NaOH H sebagai
h jumlah
asam
ssensitifitas. p pikrat
Konsentra asi
sema akin
banya ak
reagen untuk u pemb bentuk suassana basa
sehing gga kelebih han asam pikrat yan ng
dalam pembentukan p n senyawa kreatinin-
tidak bereaksi dengan kre eatinin aka an
pikrat perlu diteliti karena konsentrasi k
aksi dengan ion Na+ da ari NaOH da an berea
ang digunaka an akan NaOH ya
dihasiilkan
e endapan
Na-pikra at.
165 Tabel 1.
Penentuan kadar kreatinin dalam sampel urin
No
Sampel
Konsentrasi Sampel (µg/g)
1
Urin 1
759,37 ± 3,213
2
Urin 2
853,12 ± 0,643
3
Urin 3
1415,6 ± 1,928
Aplikasi SI-VM untuk Pengukuran Kreatinin dalam Urin Aplikasi SI-VM pada penentuan kreatinin dalam sampel urin dilakukan pada beberapa sampel urin yang telah diperoleh.
Seluruh sampel urin
diperoleh
terlebih
dahulu
yang
dilakukan
berbagai individu tergantung dari berbagai faktor seperti jenis kelamin, berat badan, kebiasaan
hidup
banyaknya
konsumsi
macam
sehari-hari
makanan
air
yang
misalnya
putih
serta
berbeda-beda
yang dikonsumsi pada setiap individu.
pengenceran sebanyak 30 kali dengan KESIMPULAN
menggunakan akuades. Dari hasil uji analisa kadar kreatinin dalam urin diperoleh nilai absorbansi yang kemudian diplotkan dengan menggunakan kurva baku kreatinin dengan persamaan garis lurus yang diperoleh yaitu y = 0,00016x
+
0,00670,
sehingga
akan
diperoleh besarnya konsentrasi kreatinin yang terdapat dalam masing-masing urin. Berdasarkan hasil uji sampel urin pada kondisi optimumnya diperoleh hasil analisa yang ditunjukkan pada Tabel 1. Tabel
1
menunjukkan
bahwa
konsentrasi kreatinin yang terdapat pada masing-masing urin berbeda-beda pada
Metode
SI-VM
dapat
direkomendasikan
sebagai
metode
penentukan
kadar
kreatinin,
hal
dikarenakan
metode
yang
ini
digunakan
memiliki sensitifitas yang tinggi dengan limit deteksi sebesar 3,01 µg/g dan waktu analisis
selama
±2
optimum
penentuan
menit.
Kondisi
kreatinin
dengan
menggunakan metode SI-VM berlangsung pada kondisi laju alir produk 20 µL/detik, waktu
5
delay
sampel/larutan
standar
detik, 100
volume µL
dan
volume reagen (asam pikrat 0,03 M dan NaOH 3%) 300 µL.
Sains dan Terapan Kimia, Vol.5, No. 2 (Juli 2011), 70-79
166 DAFTAR PUSTAKA Anonim, 2009, Urin Test, http://kidshealth.org/parent/general/ body_basics/kidneys_urinary.html
Ruzicka, J., and E.H. Hansen,1988, Flow Injection Analysis 2nd Edition, John Willey & Sons, Inc, New York, USA ISBN 0-47181355-9
Burakham, R., J. Jakmunee, and K. Grudpan, 2005, Development of Sequential Injection Lab at Valve (SI-LAV) Micro Extraction Instrumentation for the Spectrophotometric Determination of an Anionic Surfactant, Thailand
Siangproh,W., N. Teshima, T. Sakai, S. Katoh, O. Chailapakul, 2009, Alternative Method for Measurement of Albumin/Creatinine Ratio Using Spectrophotometric Sequential Injection Analysis, Talanta, 79:1111-1117
Christian, S., 2005, FIA/SIA Principles, http://www.flowinjection. com/method2.aspx
Wulandari, E.R.N, 2010, Penentuan Kreatinin dalam Urin Secara Kolorimetri dengan Sequential Injection-Flow Reversal Mixing (SI-FRM), Skripsi Jurusan Kimia Universitas Brawijaya, Malang
Faria, L.C. and C. Pasquini, 1992, Spectrophotometric Determination Of Creatinine by Monosegmented Continuous-Flow Analysis, Journal of Automatic Chemistry, 14(3): 97-100
Yayasan Spiritia, (2009), HIV Penyakit Ginjal, http://spiritia.or.id/
Penentuan Kreatinin dalam Urin Secara Kolorimetri… (Hermin Sulistyarti dkk)
dan
