PEMBENTUKAN RADlKAL BEBAS PADA GRAFT TULANG MANUSIA DAN BOVINE lradiasi. Basril Abbas, Sutjipto Sudiro, dad Nazly Hilmy

Risalah Pel1emuan Ilmiah Penelitian

PEMBENTUKAN

dan Pengembangan

r eknologi

IsolOp dan Radias~ ZOOO

RADlKAL BEBAS PADA GRAFT TULANG MANUSIA DAN BOVINE lRADIASI Basril Abbas, Sutjipto Sudiro, daD Nazly Hilmy PuslitbangTeknologiIsotopdanRadiasi,BATAN, Jakarta

ABSTRAK PEMBENTUKAN RADIKAL BEBAS P ADA GRAFTS TULANG RAW AN MANUSIA DAN SAPI IRADIASL Graft tulang rawan rnanusia dan bovine liofilisasi steril- radiasi sebagai "allograft" dan "xenograft" telah diproduksi dan digunakan secara rutin di bidang ~~~gi di Indonesia. Dari studi radiobiologi diketahui bahwa salah satu efek dari radiasi ionisasi pada spe~ies biologi adalah dihasilkannya radikal bebas yang mempengaruhi fi.J)iko-kimia daDjuga sifat mekanik dari tulang iradiasi. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pembent~ bebas dari tulang rawan liofilisasi-radiasi yang diproses dengan metode "Triple A" (Autolyzed Antigen-Extracted Allograft) produksi oleh Batan Research Tissue Bank, Jakarta. Tulang rawan disiapka11 menurut cara AATB (American Association of Tissu Bank). Graft tulang diiradiasi dengan dosis 10, 20, daD 30 kGy dengan laju dosis 7,5 kGy/h pada temperatur kamar (30 °C :t 2 °C). Pengukuran radikal bebas dilakukan pada temperatur 24 °C :t 1°C, 30 menit setelah iradiasi dan pengukuran dilanjutkan hingga penyimpanan 9 bulan menggunakan JES-REIX ESR Spectrophotometer (JEOL) dengan standar Mn ++. Parameter yang diukur adalah efek penggilingan tulang secara mekanik, perendaman tulang iradiasi, dan dosis iradiasi terhadap pembentukan radikal bebas dalam tulang. Hasilnya menunjukkan bahwa luas spektrurn ESR dari tulang bovine dosis 30 kGy lebih tinggi dari tulang rawan lnanusia yaitu berturut-turut 1,4 x 107 dan 6,4 X 106 Au (arbitrry unit)/ g sampel. Spek1rum ESR meningkat seCaralinear dengan pertambahan dosis iradiasi dalam range dosis 10 -30 kgy daD menurun 30% akibat perendarnandalam air. Sinyal ESR menurun dengan tajam setelah dua hari penyimpanan dan kemudia11 meluruh perlahan sampai 14 hari dan kemudian konstall hingga 9 bulan penyimpanan pada temperatur kamar. Penggilingan tulang dengan mesin dapat menghasilkan radikal bebas. Kata Kunci : radikal bebas, iradiasi, graft tUlaJlgmaJlusia, graft tulaJlg sapi, penggilingan mekanis

ABSTRACT FREE RADICALS FORMATION OFIRRADIATED LYOPillLIZED CAN-CELLOUS HUMAN AND BOVINE BONE. Radiation sterilizationof Iyophlizedhumanand bovine boneas allograft and xenograft have beenproducedand usedin orthopaedicpracticein hldonesiaroutinely. It is well known from radiobiologic studiesthat one of the mostpronounceeffects of ionizing radiationon biologic speciesproducedthe free radicals that influencethe physico-chemicalas well asthe mechanicalpropertiesof irradiatedbone. The aim of our study is to investigatethe free radicalsformationof irradiatedIyophilzedcancelloustriple A bone(Autolyzed AtltigenExtracted Allograft) producedby BatanResearchTissueBank in Jakarta.The cancelloustriple A were prepared accordingto AA TB (AmericanAssociationof Tissue Bank)method.GammaIrradiationwas done at dosesof 10, 20, and 30 kGy with a doserate of 7.5 kGy& at roomtemperature(30 °C :!: 2 °C). Measurementof free radicals was done at 24 °C :!: I °C within 30 minutesafterirradiationand measurement werecontinuedup to 9 months of sotrageusing a JES-REIXESR Spectrophotometer (JEOL) with Mn++standard.Parametersmeasured,were the effects of mechanicalgrinding, water immersionand irrljdiation dose on free radicals formation in the bone. Results showthatthe signalareaof ESRspectrafrom irradiatedbovinebone of 30 kGy was higher thanthose of humanbone i.e. 1,4 x 107dan 6,4 x lObAu (arbitrry unit)! g satnplesrespectively.The signal of ESR spectra increasedlinearly with increasingdose in the rangeof 10-30kgy and it will reduceabout 30% causedby water ilnmersion.The ESR signalreducedsharplyafter 2 daysand graduallydecreasedup to 14 daysand thenbecame constantup to 9 monthsof storageat roomtemperature.A certainmethodof crushingcan producefree radicals. Key Words:

free mdicals, irradiation, allograft, xenograft, mechanical-grinding

PENDABULUAN Penggunaan jaringan manusia untuk tujuan terapi mempunyai sejarah yang panjang. Konsep penyimpanan jaringan untuk memperpanjang masa simpannya sebelum di transplantasi atau diimplantasi diawali dengan berdirinya bank jaringan pertama di Bathesda, USA pada tahun 19501. Walaupun tulang dan jaringan lunak lainnya merupak.w sesuatu yang biasa digunakan dalam

rekonstruksi sistem muskuloskeletal, tetapi jaringan tersebutjarang tersedia. Oi Indonesia, padatahun 1990 di Pusat Penelitian clan Pengembangan teknologi Isotop clan Radiasi (p3TIR -BATAN) telah didirikan Bank Jaringan Surgical pertama yang diberi nam Batan Research Tissue Bank (BRTB). Oi samping memproduksi amnion graft, BRTB juga memproduksi graft tulang manusia clan bovine liofilisasi steril-radiasi sebagai allograft clan ,'7

.'

Risalah Peltemuan Ilmiah Penelilian dan Pengembangan r eknologi IsOIOpdan Radia~ 2tXXJ

11arike dua, dan relatif kecil hingga 11arike 14 dan relatif stabil hingga penyimpanan 9 bulan. Hal ilU disebabkan karena di dalam tulang terdapat dua komponen kimia pokok yaitu komponen organik yang disebut dengan rase kolagen dan komponen anorganik yang disebut dengan rase hidroksiapatit 1.4.Radikal yang berasal dari kolagen merupakan radik31 yang tidak stabil sehingga penumnan jumlall radikal bebas selalna penyimpanan relatif lebih cepat.

Gambar 4 menunjukkan spektnun ESR daTi sampel tulang yang digiling menggunakan mesin penggiling dan mortar. Tulang yang digiling menggunakanmesin dapat menghasilkanradikal bebas denganpola yang sarnadengan tulang yang diiradiasi dengan sinar gamma,sedangkantulang yang ditumbuk denganmenggunakanmortar, spektmmradikalnya tidak terdeteksi. IM'O

:lOJII

.."..

10011

~ 12

~

'-' ~

10

--~'I\'

~

8

--./'0

~ c9;

6

)\,/"\/

,-"".

t0'

r/)

~

~

~

4 2

I

0

I

I

20

I

I

40

I

I

60

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

/'--

Gambar 4. Spektrum ESR dari tulang yang digiling dengan: (a) Mortar (b) Mesin

80100120140160180200220240260280

Waktu Penyimpanan (hari) Gambar 2. Luas spektrum ESR (Au) dari tulang iradiasi pada temperatur 24DC. Menurnt STATCHOWITCZ, dkk (1971Yo radikal bebas yang berasal dari kolagen menurnn selama penyimpanan 6 -10 hari. Selanjutnya radikal yang berasal daTi hidroksiapatit adalah radikal yang stabil. Pacta penelitian ini radikal bebas relatif stabil setelah 14 hari hingga 9 bulan penyimpanan. Luas spektrum ESR daTi tulang iradiasi berbanding lurns dengan dosis iradiasi, dan selama penyimpanan pacta subu karnar radikal bebas yang tidak stabil menurun sampai 50% sampai hari ke 14 penyimpanan (Gambar 3). Penurunan radikal bebas tersebut berlaku untuk ketiga dosis iradiasi (10, 20, dan 30 kGy).

Gambar 5 menunjukkan radikal bebas yang terbentuk pacta tulang setelah diiradiasi dan tuiang iradiasi yang direndam di dalam air selama30 meDii. Jumlahradikal bebasdaTitulang iradiasiyang direndam di dalamair menurun 30% dibandingkandengantanpa perendaman.Hal ini membuktikan bahwa sebahagian daTi radikal bebas yang terbentuk di didalam tuiang iradiasidapatlarut.

20,..

10"0

Joost

lO...

Gambar 5. Spektrum ESR dari tulang yang diiradiasi dengan dosis 30 kGy : ---: Direndam di dalam air selama 15 menit -:

Gambar 3. Hubungan antara luas spektrum ESR dengan dosis iradiasi pada 24 DC.

Tanpa perendaman

Gambar 6 adalah luas spektrum ESR dari tulang manusia daD bovine yang diiradiasi 30 kGy. lumlah radikal bebas dari tulang bovine terlihat lebih tinggi dibandingkan dengan tulang manusia yaitu 1,4 xl07 daD 6,5 x 106 Au (Arbitrary Unit)/g sampel. Hal ini membuktikan bahwa kandungan hidroksiapatit (fase mineral) di dalmn tulang bovine lebih tinggi dibandingkan dengan tulang manusia, karena menurut Ostrowski et. al. (1974Y I, semakin tinggi kandungan mineral di dalmn jaringan biologi iradiasi semakin tinggi

59

Risalah Pel1emuanIlmiah Penelitian dan Pengembangan r eknologi IsOIOpdan Radla~ 2000

8. DZIEDZIC-GOCLA WSKA,A., Effect of Radiation Sterilization on Biostatic Tissue and Their Constituents. In Gaugllran, E.R.L and Goredi, A.J. (eds): Sterilization by Ionizing Radiation, vol. 2, Multi Science, Montreal, 1978, p. 156.

9. AA TB, Technical Manual for Tissue Bangking, Copyright 1987, Suite 220-A, 1350, Beverly Road.McLean, Virginia 22101,M-18. 10. STACHOWICKZ, W., MICHALIK, J. OSTROWSKI, K., and DZIEDZIC-GOCLA WSKA, A., Bone Powder as Suitable Dosimeter for Control of Radiation Sterilization of Biostatic Graft, 3m European Conference on Tissue Banking and Clinical Application of Grafts, EA TB/IAEA,

II. OSTROWSKI,K., DZIEDZIC-GOCLAWSKA,A., STACHOWICZ,W., and MICHALIK,J., Accuracy, Sensitivity, and Specificity of EPR Analysis of Mineral Constituents of lrradiatin Tissues,Ann.N.Y. Acad. Sci. 238,186-201. 12. SLIWOWSKI,A., and DZIEDZIC. GOCLAWSKA,A., Influence of Gamma Irradiation on the solubility of Collagen-derived Membranes, Materia Medica Polona, No.4, 1976,p.3

Oct. 4-7,1994, Vienna,Austria.

61

6.

Risalah Pel1emuan

Ilmiah Penelilian

dan Pengembangan

r eknologi

IsOIOp dan RadiaSl; 2CXXJ

pula radikal bebas yang terbentuk. Baik radikal bebas yang terdapat pactatulang bovine maupWl tulang I1laDusia iradiasi mempunyai karakteristik yang SaJna yaitu menurun dari hari pertalna pengukuran hingga hari ke 14 dengan jUmlaIl yang relatif saJna, selanjutnya konstan llingga 6 bulaJl.

<0

+ w

-'5" CI

~ (k: U)

w E

KESIMPULAN Dari penelitian dapat disimpulkan bahwa: 1. Radikal bebasyang terjadi di dalam tulang bukan saja disebabkan oleh radiasi, tetapi dapat pula disebabkan oleh penggilingan dengan mesin. 2. Radikal bebas menunm hingga 14 hari dan relatif stabil hingga 9 bulan 3. Semakin tinggi kandungan air di dalam tulang semakin turun radikal bebas ang terbentuk 4. Jumlah Radikal bebas dari tulang iradiasi yang di rendam di dalam air selarna 30 menit dapat turun hingga 30%. 5. Jumlall radikal bebas tulang "bovine" lebih tinggi dibandingkan dengan tulang manusia.

~ L-

~

Q) a.

DAFTARPUSTAKA

U) on ca

TOMFORD,W.W., MusculoskletalTissue banking, RavenPress,New York, pp 149-180(1992).

~

..J

Gambar 6. Perbandingan luas spektrum ESR dati tulang manusia daD tulang bovine yang diiradiasi dengan dosis 30 kGy

Gambar 7 adalah tiga tingkatan kandunganair didalam tulang yaitu 5, 10 daD 15% yang selanjutnya diiradiasi dengan 30 kGy. Dati spektrumESR terlihat bahwajUlulah radikal bebasberbandingterbalik dengan konsentrasiair yang terdapat di dalmll twang. Diduga bahwa air yang terkandung di dalam twang bereaksi dengan sebagiandari radikal yang terbentuk di dalam tulang iradiasi. PengukurandilakUkansatujam setelah iradiasi.

+

w

6

~

5

II: (/J

4

E 2

3

~

w

!

(/)

~

-I

1

v -I

0

4,

GOPAL,N.G.S., SHARMA,G., and PATEL,K.M., Radiation Sterilization of Phannaceuticalsand Disposable Madical Products. In IAEATECDOC-454: Technical and Economic Comparation of Irradiation and Conventional Methods,1986,p. 20.

STACHOWICKZ,W., OSTROWSKI,K., DZIEDZICGOCLAWSKA, A., and KOMENDER,A., On Free Radicals evoked by Radiosterilizationin PreservedBone Grafts. In: IAEA Panel Proceeding Series "Sterilization and Preservation of Biological Tissues by Ionizing Radiation", IAEA-PL-333/3, Vienna, pp 15-27.

I

10

I

I

I

20

I

30

40

Dosis (kGy)

Gambar 7. Luas spektrum ESR (Au) pada 3 tingkatan kandungan air tulang manusia liofilisasi yang diiradiasi dengan dosis 30 kGy

--

TEGillI,A., ImplantasiTulang Xenograft Produksi Batan Research TissueBank,Tesis,1997.

2

0

60

3

5. OSTROWSKI,K., DZIEDZIC-GOCLAWSKA, A., STACHOWICKZ, W., and MICHALIK,I., Radiation -induced ParamagneticCenters in Researchon bone Physiopathology,Dept. of Histology, Institue of Biostructure, Medical Academy,Warsaw,Poland,1990,p.21.

7 IQ

2. DARWONO,B., Experiences on Autograft, Hydroxyapatite, Allgrafi, and Xenograft Used on Orthopadic Surgery in Gatot Subroto Army Hospital, Symposium and Workshop on "Tissue -organ Banking and Trauma", Oct. 19-20, 1995, Jakarta, Indonesia.

7,

KOMENDER,J., KOMENDER,A., DZIEDZICGOCLAWSKA,A., and OSTROWSKI,K., Radiation-sterilizedBone Grafts Evaluated by Electron Spin Resonance Technique and Mechanical Tests. Transplant PrOto 8, Suppl 1:25,1976.

~ ,co..

Risalah Pet1emuan

Ilmiah Penelilian

dan Pengembangan

I eknolo.qi IsOlop dan Radias~ 2{)(x)

xenograft. Hingga saat ini graft produksi BRTB telah dipakai dibeberapa mmah sakit di Indonesia secara rutin dan dari basil uji klinik yang dilakukan, xenograft produksi BRTB tidak menunjukkan reaksi imunologi pactaresipien2.3. Salah satu lnisi dari BRTB adalah memperkenalkan radiasi untuk tujuan sterilisasi jaringan biologi, khususnya graft yang siap untuk diimplantasikan. Metoda sterilisasi dengan teknik iradiasi khususnya sinar gmnma mempunyai keunggulan antara lain: kemanlpuan penetrasi yang baik, kenaikan SuilU selama proses sterilisasi relatif kecil sehingga disebut juga dengan proses dingin, dan sampel jaringan dapat disterilkan dalam kondisi yang telah dikemas sehingga kontmninasi setelall sterilisasi dapat dihindari4. Sebaliknya penggunaan radiasi sebagaimetoda sterilisasi pacta graft mempunyai beberapa kelemahan. Satu di antaranya ialall meningkatnya radikal bebas di dalmn jaringan yang telall diiradiasi. Hasil dari beberapa peneliti menunjukkan ballwa graft tulang yang diiradiasi pacta temperatur kalnar menglmsilkan konsentrasi radikal bebas relatif tinggi namun demikian komponen paramagnetik ESR yang berasal dari kolagen turun dalam waktu 6-10 hari penyimpanan5. Radikal bebas yang dihasilkcw dari ballaD organik tulang atau rase kolagen berumur pendek dan akan llilang di dalam udara. Sebaliknya radikal yang stabil berumur panjang yang diidentifikasi sebagai hidroksiapatit atau rasa minerall.6. Diduga ballwa radikal bebas dapat menyebabkan perubahan kimia dan fisika graft tulang7,8. Tujuan penelitiml adalall untuk mengetahui pembentukan radikal dari ttllang rowan manusia dan bovine liofilisasi radiasi yang disiapkan sebagai triple A oleh Batan ResearchTissue Bank,

BAHAN DAN METODA Bilhan: Tulang lnanusia didapatkankan dari Rumall Sakit Siaga Raya, Jakarta. Tulang caput femur di alnbil dari pasien melalui operasi hip replacement, kemudian secara aseptis dimasukkan kedalam kantong plastik poli etilen steril di kamar operasi. Plastik yang berisi tulang dimasukkan ke dalam kontainer yang berisi es daDdibawa ke Batan Rese.1rchTissue Bank. Tulang femur daD tibia dari bovine yang berumur kurang dc1fi2 tallun didapat dari RUlnah Potong Hewan (RPH) Darma Jaya, Jakarta. Masing-masing tulang panjang tersebut dimasllkkan ke dalam kantong plastik poli etilen steril, kemudian dengan menggunakan kontainer yang berisi es tulang tersebut dibawa ke Batan Research Tissue Bank. Dari kedua jenis hllang tersebut disiapkan graft huang sebagai allograft daD xenograft dengan metode triple A, menurut American Association

Resonance (ESR) Spectrophotometer model .JES-REIX

(JEOL)buatanJepang. Percobaan: Tulang dipotong dengan ukuran Icm x lcm menggunakan band saw. Unhlk merninimalkan kandungan marrow daD lemak, tulang dicuci dengan air daD khloroform-metanol (I: I). Chip tulang dikeringkan dengan cara liofilisasi menggunakan freeze-dryer Christ Beta-1 selama 72 jam hingga kadar air mencapai 5%. Tulang liofilisasi di tumbuk di dalam mortar dan sebagian lagi digiling dengan mesin. Sampel diiradiasi dengan sinar gamma Co-60 pacta temperatur 30 DC :t 2 DC dengan dosis 10, 20, daD 30 kGy daD laju dosisnya 7,5 kGy/jam. Sebagian dari sampel iradiasi direndam selama 30 menit daD dikeringkan kembali dengan freezedryer. Radikal bebas yang terbentuk diukur dengan Electron Spin Resonance (ESR) Spektrofotometer model JES-REIX (JEOL) 30 menit setelah iradiasi hingga penyimpanan 9 bulan. Kondisi pengukuran sebagai berikut: Temperatur 24 DC :t I DC, frequency 9,4350 Ghz, lnicrowive power I mW, centre field 335,5, sweep width I x 10 ruT, sweep time 1,0 ruin, modulation widtll 1,25 x 0,1, time constant 0,03 sec, dan humidity 50%. Parameter yang diukur adalah efek penggilingan, perendaman, daD dosis iradiasi terhadap pembentukan radikal bebas di dalam tulang rawan rnanusia daD hewan yang diproses dengan metode triple A. Radikal bebas yang terbentuk dihitung berdasarkan luas spektrum ESR per gram sampel.

HASIL DAN DISKUSI Gambar I menunjukkan spektnun ESR tulang iradiasi,dosis 0, 10, 20, dan 30 kay, yang diobservasi 30 menit setelah diiradisi. Garis spektrnm yang ditunjukkanoleh tanda panahadalah spektnunmangan, yang digunakan sebagaipenandadari ESR. Spektnun tersbutterlihat secarakonsistenpactasemuatingkat dosis iradiasidari semuasampel.

'0'.'

..0

... Gambar

of TissueBank (AATB)9. Peralatan: Alat yang digunakaIl daiaIn percobaan ini antara lain: lradiator IRPASENA dengaIl smnber iradiasi Co-60, Band saw model AEW buataIl Italia, Lmnpang beserta ahmya, mesin penghaIlcur tuIang merk

I.'

r-~/'--

~.

""'(m"

'to

.t.

Spektrum ESR dari tulang bovine iradiasi (a) 0 kGy, (b) 10 kGy, (c) 20 kGy, (d) 30 kGy

JANKE & KUNKEL buatanJennan,Freeze-dryermodel

Berdasarkan luas spektrum radikal bebas daTi signal ESR setelall 30 menit hingga 9 bulan penyimpanan sebagaimana yang ditunjukkan pacta Gambar 2, maka dapat dijelaskan bahwa radikal bebas

Christ Beta

dari tulangyang diiradiasi menurundengancepatsampai

58

I buatan Jennan, dan Electron

.Spin