PEMANFAATAN TEKNOLOGI IN VITRO UNTUK PERKEMBANGAN SPORA Gigaspora margarita DAN Acaulospora tuberculata
SITI CHALIMAH
SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2007
SURAT PERNYATAAN
Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya, bahwa segala pernyataan dalam disertasi yang berjudul :
PEMANFAATAN TEKNOLOGI IN VITRO UNTUK PERKEMBANGAN SPORA Gigaspora margarita DAN Acaulospora tuberculata merupakan hasil penelitian saya di bawah bimbingan komisi pembimbing. Penelitian ini terdiri dari lima topik. Penelitian dibiayai oleh APBN melalui Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia. Penelitian ini belum pernah diajukan untuk memperoleh gelar pada program sejenis di perguruan tinggi lain. Semua data dan informasi yang digunakan telah dinyatakan dengan jelas dan dapat diperiksa kebenarannya.
Bogor, Februari 2007
SITI CHALIMAH NRP. G361020111
ii
ABSTRAK SITI CHALIMAH. Pemanfaatan teknologi in vitro untuk perkembangan spora Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata. Dibimbing oleh MUHADIONO, LATIFAH K DARUSMAN, SAID HARAN dan NURITA TORUAN-MATHIUS. Cendawan mikorhiza arbuskular (CMA) adalah mikroorganisme bersifat simbion obligat. Perbanyakan CMA secara konvensional menggunakan kultur pot,
menghadapi beberapa kendala karena terkontaminasi mikroorganisme lain, dan keterbatasan lahan. Salah satu upaya menanggulangi masalah tersebut adalah memanfaatkan teknologi kultur in vitro. Tujuan penelitian ini adalah: (i) mendapatkan akar rambut yang mampu beradaptasi pada kultur ganda secara in vitro, (ii) mendapatkan tempat tumbuh dan inang kompatibel untuk perkembangan G margarita dan A. tuberculata secara konvensional, (iii) mendapatkan teknik sterilisasi spora dan inokulum steril CMA uji dengan eksplan tomat dan wortel, (iv) mengembangkan G. margarita dan A. tuberculata secara in vitro dengan teknologi akar rambut wortel, dan (v) teknik enkapsulasi spora dan propagul CMA dengan Na-alginat. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa akar rambut wortel mampu beradaptasi pada kultur ganda, selanjutnya digunakan sebagai inang perkembangan G. margarita dan A. tuberculata secara in vitro. Tempat tumbuh cawan Petri, inang sorghum dan Pueraria phaseoloides.L., dengan medium zeolit, kompatibel untuk perkembangan G. margarita dan A. tuberculata dalam kultur pot di rumah kaca, selanjutnya digunakan sebagai sumber spora. Teknik sterilisasi spora terbaik adalah pencucian dan pelembutan permukaan spora dengan MgSO4 .7H2 O dan Tween 20 (10%), permukaan spora dibersihkan dengan NaOCl2 0,52% (Bayclin10%), disterilisasi ke dalam antibiotik gentamisin, streptomisin, penisilin 100 ppm, dan tetrasiklin 2,5 ppm, dibilas dengan akuades, spora steril siap sebagai inokulum. Spora G. margarita dan A. tuberculata berkembang baik secara in vitro, memiliki daya infeksi tinggi terhadap inang planlet tomat, wortel maupun akar rambut. Kedua medium kultur ganda MM dan MSR, kedua inang eksplan wortel dan tomat dapat digunakan untuk perkembangan spora kultur aksenik, namun medium MM lebih baik dibandingkan dengan MSR, dan inang wortel lebih baik dibandingkan dengan inang tomat. Inang akar rambut wortel mempunyai kecenderungan yang sama, yaitu medium MM lebih baik dibandingkan dengan MSR. Tidak ditemukan perbedaan pola perkembangan struktur organ CMA dalam akar inang pada kultur pot, maupun inang tomat, wortel, akar rambut, secara in vitro. Enkapsulasi spora CMA terbaik kadar 1,75% Na-alginat, dengan daya viabilitas dan persentase infeksi akar tinggi, dalan masa simpan 2 bulan. Simpulan teknologi in vitro dapat digunakan untuk perkembangan dan perbanyakan kultur aksenik G. margarita dan A. tuberculata dengan teknik in vitro. Kata kunci : Akar rambut, Agrobacterium rhizogenes, kultur ganda, Gigaspora margarita, Acaulospora tuberculata
iii
ABSTRACT
SITI CHALIMAH. In vitro technology for development of Gigaspora margarita and Acaulospora tuberculata stores Under the impervition of MUHADIONO, LATIFAH K DARUSMAN, SAID HARAN and NURITA TORUAN-MATHIUS Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) is an obligatory symbion microorganism. Conventional technique for AMF propagation or production was by pot culture with the host plant, this technique faces many problems, due to contamination with other microorganisms, and limited farm area. One of the efforts to be overcome the weakness was by AMF in vitro culture. The objectives of this research were (i)) to obtain hairy root culture techniques of several host plants, (ii) to obtain growth container, inoculum and compatible host for spore production by conventional techniques, (iii) to obtain sterile inoculum of G. margarita and A. tuberculata in axenic culture of tomato and carrot as host plants (iv) to develop G. margarita and A. tuberculata in carrot hairy root culture, and (v) encapsulation technique of AMF spore and propagule, with Na-alginate. The results showed that carrot hairy root could adapt in dual culture medium, hence used as plants to develop G. margarita and A tuberculata in vitro. Sorghum and Pueraria phaseloides L. cultured in colored plastic cup with zeolith as a carrier, compatible for producing spores and inoculum in green house condition, than used as spores supply. The best sterilization technique consists of washing the surface of spore with MgSO4 .7H2 O and sterile Tween 20 (10 %), followed by sterilization with, gentamycin, streptomycin, penicillin 100 ppm each and cleaned by 0,52 % NaOCl2 . G. margarita and A. tuberculata spores can develop well and have high infection rate in axenic culture with tomato and carrot as host plants, cultured in minimal medium (MM). Carrot hairy root culture can be use as an host for G. margarita and A. tuberculata spores development by in vitro culture. G. margarita and A. tuberculata with carrot hairy root as an host cultured in MM medium were able to build external hyphae, sporulation and root infection. There is no difference in the development and root infection by AMF on host plants cultured in green house, axenic and hairy root culture. Spores of AMF encapsulation with 1.75% Na-alginate could producte spores with high viability and infection capability, in 2-month-storage period. It could be concluded that G. margarita and A. tuberculata can be developed by in vitro technology with axenic culture. -------------------------------------------------Key words :
Hairy root, Agrobacterium rhizogenes, dual culture, Gigaspora margarita, Acaulospora tuberculata
iv
Hak cipta milik Siti Chalimah, tahun 2007 Hak cipta dilindungi
Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam bentuk apapun, baik cetak, foto kopi, mikrofilm, dan sebagainya
v
PEMANFAATAN TEKNOLOGI IN VITRO UNTUK PERKEMBANGAN SPORA Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata
SITI CHALIMAH
DISERTASI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2007
vi
Ju Judul Disertasi
: PEMANFAATAN TEKNOLOGI IN VITRO UNTUK PERKEMBANGAN SPORA Gigaspora margarita DAN Acaulospora tuberculata
N Nama Mahasiswa
: SITI CHALIMAH
N Nomor Pokok
: G361020111
P Proogram Studi
: BIOLOGI
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr. Muhadiono, MSc. Ketua
Dr. Ir. Said Harran, MSc. Anggota
Prof. Dr. Latifah K. Darusman, MSc. Anggota
Dr. Nurita TORUAN-MATHIUS, MS. Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Dr. Ir. Dedi Duryadi Solihin, DEA. Tanggal ujian :
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr.Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS. Tanggal lulus :
vii
PRAKATA
Alhamdulillah puji syukur kehadirat Illahi Robbi atas segala karunia, nikmat, rahmat dan hidayahNYA, disertasi ini dapat diselesaikan dari bulan Maret 2003 sampai bulan Mei 2006, tentang perkembangan Cendawan Mikorhiza Arbuskula (CMA) dengan judul “Pemanfaatan Teknologi In Vitro Untuk Perkembangan Spora Gigaspora margarita Dan Acaulospora tuberculata”. Disertasi ini disusun berdasarkan lima topik penelitian, dan mendapatkan dana APBN melalui Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia. Dalam kesempatan ini disampaikan penghargaan yang tinggi dan ucapan terimakasih kepada yang terhormat : 1. Dr. Muhadiono, M.Sc. bertindak sebagai ketua komisi pembimbing, Prof. Dr. Ir Latifah K. Darusman, MS, Dr. Nurita-TORUAN MATHIUS,MS, dan Dr. Said Harran, M.Sc. sebagai anggota komisi pembimbing. Atas segala bantuan moril dan materiil, saran mulai dari rencana penelitian hingga penyelesaian penulisan. Tidak terhingga pengetahuan yang diberikan, kebijaksanaan, kesabaran, ketegasan, kedisiplinan serta tanggung jawab seorang peneliti ditanamkan secara tidak langsung sejalan dengan proses penyelesaian studi. Hanya Allah SWT yang dapat membalas segala kebaikan, dan sebagai catatan ibadah disis i Allah SWT 2. Pimpinan Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, di Bogor dan penanggung jawab Laboratorium Rekayasa Genetika dan Biomolekuler yang telah memberikan kesempatan untuk menggunakan fasilitas laboratorium. 3. Pimpinan PT Intidaya Agrolestari (INAGRO), Bogor yang telah memberikan inokulum CMA jenis Acaulospora tuberculata melalui Bapak Yudha Hartanto SP, MS. 4. Pimpinan Laboratorium Fisiologi Tumbuhan IPB yang telah memberikan kesempatan untuk menggunakan fasilitas laboratorium. 5. Pimpinan Southeast Asian Regional Center For Tropical Biology (SEAMEO BIOTROP), dan penanggung jawab Laboratorium Biotechnology & Tree Breeding, telah memberikan kesempatan untuk menggunakan fasilitas laboratorium
viii
6. Staf pengajar dan pegawai yang ada di lingkup Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, atas pendidikan, layanan administrasi dan bantuan yang telah diberikan. 7. Bapak Ketua Yayasan Drs Ngarbi dan Rektor IKIP PGRI TUBAN atas izin, dukungan, motivasi dan kebijakan yang diberikan dalam menyelesaikan studi program Doktor. 8. Ayahanda H. Setiohadi Woerjanto, lbunda Hj. Salmiah, Abi dan Umi A. Marzuki almarhum. Suami tercinta Edwi Mahajoeno, ananda tersayang Kautsar Hidayatullah, Nashril Abdillah dan Aldilla Arifatunurillah, dengan penuh keikhlasan berkorban, pengertian, dorongan dan semangat untuk terus maju serta do’a yang selalu dipanjatkan kepada Allah SWT, sehingga mampu menyelesaikan penulisan disertasi ini. 9. Kakak dan adikku tercinta Asjito sekeluarga, Eko Wicaksono sekeluarga, Zaenal Arifin Marzuki, Nurchikmah Marzuki, Hasan Sukarno Marzuki, Hindun Marzuki, terutama kakakku Drs.H. Totok Supiyanto,MM. sekeluarga dan Drs.Rameli,MSi. sekeluarga yang telah
banyak memberikan bantuan
materi dan dorongan serta do’a yang tiada hentinya 10. Bapak/Ibu sekaligus teman baik, berbagi cerita suka dan duka, yang mampu memotivasi dalam banyak kegiatan baik dalam perkuliahan, penelitian hingga penyelesaian disertasi ini, Dr. Sumarmi,MSc. Dr.Hj. Endang Gatilestari,MS. Dr. Enny Widyati., Ir. Abimanyu,MSi. sekeluarga, Dra. Fitma,MS, Dra. Eny Zulaika,MSi sekeluarga, Ir. Yeni Lucia,MSi., Dra. Agustin, MSc, Ir. Helen, MS. serta teman-teman seperjuangan yang tidak dapat saya sebutkan. Semoga disertasi ini dapat bermanfaat bagi pihak yang memerlukan, dan semoga bimbingan serta semua kebaikan menjadi nilai ibadah di sisi Allah SWT, Amin Amin Yarobbal ‘Alamiien.
Bogor, Januari 2007
Siti Chalimah Marzuki
ix
RIWAYAT HIDUP
SITI CHALIMAH, putri kedelapan dari sepuluh bersaudara, dari Ayah Achmad Marzuki (Alm) dan Ibu Chajatoen (Alm), dilahirkan pada tanggal 16 Desember 1959 di Tuban,
menikah tanggal 28 Januari 1988 dengan Edwi
Mahajoeno dikaruniai tiga anak putra dan putri, Kautsar Hidayatullah (Surabaya, 14 Oktober 1988), Nashril Abdillah (Tuban, 15
April 1990), Aldilla
Arifatunnurillah (Tuban, 21 Desember 1994), sampai sekarang penulis sebagai dosen tetap IKIP PGRI TUBAN di Tuban. Penulis menyelesaikan pendidikan dasar dan menengah pertama di Tuban, yaitu di SD Negeri Kutorejo I (tahun 1972) dan SMP Negeri I Tuban (tahun 1975), dan melanjutkan di SMA Negeri 2 Yogyakarta (Tahun 1979). Gelar sarjana Biologi diperoleh dari Fakultas Biologi Universitas Gajah Mada Jurusan Ekologi. Pada tahun 1998 mendapatkan gelar Magister Pendidikan Teknologi di IKIP Yogyakarta. Pada tahun 2002 melanjutkan studi pada jenjang Doktor (S3) program studi Biologi Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor di Bogor. Beasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh dari DIKTI melalui BPPS. Dua buah artikel berjudul ”Teknologi Enkapsulasi untuk pengemasan Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata dengan Na–alginat” telah disetujui dan akan diterbitkan pada jurnal Biosmart Universitas Sebelas Maret Surakarta No 8 ,Vol.1, April 2007.
x
DAFTAR ISI Halaman Daftar Gambar
…………………………………………
Daftar Tabel
……………………………………………
Daftar Lampiran ……………………………………….. BAB I
BAB II
BAB III
BAB IV
PENDAHULUAN
xiii xv xvii
Latar Belakang ..................................................................... Permasalahan ...................................................................... Tujuan Penelitian ………………………………………… Hipotesis .............................................................................. Pendekatan Penelitian ......................................................... Manfaat Penelitian ..............................................................
1 1 5 6 6 7 7
BAHAN DAN METODE
8
Materi Penelitian .................................................................. Alir Kerja dan Output Setiap Tahap Penelitian ...................
8 10
TINJAUAN PUSTAKA A. Agrobacterium rhizogenes .................................................. B. Cendawan Mikorhiza Arbuskula (CMA) ………………. C. Kultur Aksenik secara in vitro ............................................ D. Enkapsulasi spora ...............................................................
11 16 24 28
Pengembangan Teknologi Akar Rambut Beberapa Tanaman Secara In Vitro ABSTRAK ............................................................................... Abstract ..................................................................................... 1. PENDAHULUAN ............................................................... 2. BAHAN DAN METODE .................................................... 3. HASIL ……………………………………………………. 4. PEMBAHASAN …………………………………………. 5. SIMPULAN ........................................................................
30 30 31 34 39 43 48
xi
BAB V
BAB VI
BAB VII
BAB VIII
BAB IX BAB X
Perbanyakan Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata dengan Kultur Pot di Rumah Kaca. ABSTRAK ..................................................................... Abstract...................................................................................... 1. PENDAHULUAN ................................................................. 2. BAHAN DAN METODE .................................................... 3. H A S I L .............................................................................. 4. PEMBAHASAN .................................................................. 5. SIMPULAN............................................................................
49 49 50 52 55 64 70
Penyediaan Inokulum Steril Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata Kultur Aksenik dengan Eksplan Tomat dan Wortel ABSTRAK ................................................................................ Abstract …………………….………………………………… 1. PENDAHULUAN ………………………………………… 2. BAHAN DAN METODE ....……………………………… 3. HASIL ……………………………………………………. 4. PEMBAHASAN …………………………………………. 5. SIMPULAN ………………………………………………..
72 72 73 76 79 88 97
Perkembangan Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata In Vitro Dengan Teknologi Akar Rambut Wortel ABSTRAK …………………………………………………. Abstract ……………………………………………………… 1. PENDAHULUAN …………………………………........ 2. BAHAN DAN METODE ............................................... 3. HASIL ............................................................................. 4. PEMBAHASA.................................................................. 5. SIMPULAN ......................................................................
98 98 99 102 106 112 119
Teknologi Enkapsulasi Untuk Pengemasan G. margarita dan A. tuberculata dengan Natrium–alginat ABSTRAK ............................................................................... Abstract .................................................................................... 1. PENDAHULUAN ............................................................... 2. BAHAN DAN METODE ................................................... 3. HASIL ……………………………………………………. 4. PEMBAHASAN …………………………………………. 5. SIMPULAN ……………………………………………....
120 121 121 124 126 131 135
PEMBAHASAN UMUM SIMPULAN DAN SARAN DAFTAR PUSTAKA
136 151 153
xii
BAB I PENDAHULUAN Latar Belakang Cendawan mikorhiza arbuskula (CMA) adalah mikroorganisme tanah berperana n penting memperbaiki produktivitas lahan, bersifat simbion obligat, karena tanpa tanaman inang (asimbiotik) pertumbuhan hifa tidak berkembang dan hanya mampu bertahan hidup 20-30 hari (Fortin et al. 2002). CMA juga berperan penting dalam siklus hara, memperbaiki struktur tanah dan menyalurkan unsur karbon dari akar ke organisme tanah lainnya. Selain itu
CMA juga mampu
mengeluarkan enzim fosfatase dan asam organik, sehingga pada tanah yang kahat P, CMA mampu melepas P yang terikat membantu penyediaan unsur P tanah (Smith et al. 2003). Di dalam simbiosis, CMA memperoleh energi dari fotosintat tanaman dan tanaman memperoleh manfaat dari CMA tergant ung kedua simbion tersebut (tanaman dan CMA), serta karakteristik lingkungan (Bever 2002, Heijden 2002). Jasa paling utama diberikan oleh CMA berupa pengambilan, asimilasi, dan translokasi nutrisi di luar zona rhizosfir kepada akar tanaman. Pengambilan hara dilaksanakan oleh ekstraradikal miselium (Ezawa et al. 2002, Johansen et al. 1993). Penggunaan CMA umumnya meningkatkan kesuburan tanaman, daya tahan terhadap serangan patogen dan kekeringan (Ezawa et al. 2002). CMA juga menguntungkan untuk pertanian (Jeffries et al. 2003) maupun reklamasi lahan (Jasper 1994, de-Souza & Sulva 1996), dan sebagai sumber daya efisien yang dapat diperbaharui (Jakobsen 2000). Menurut Hardjowigeno (1995) dalam Baon (1996) umumnya kondisi lahan di Indonesia hampir 30 % luas daratan Nusantara bereaksi masam dengan pH berkisar 4,0 – 5,5. Jenis tanah masam paling luas di Indonesia adalah jenis tanah podzolik merah kuning (PMK). Tanah ini umumnya bersifat marjinal, karena kebutuhan unsur-unsur makro tanaman terfiksasi oleh unsur lain. Tanah marjinal merupakan lahan bermasalah baik untuk pertumbuhan maupun perkembangan tanaman, sedang tanaman kehutanan dan perkebunan umumnya ditanam dalam kondisi tanah tersebut. Salah satu masalah pembatas pertumbuhan tanaman pada
2
tanah marjinal adalah kemampuan serapan hara P. Simbiosis tanaman inang dan CMA dapat meningkatkan kemampuan akar tanaman untuk menyerap hara P. Hifa eksternal sebagai panjang tangan akar dapat membantu dalam serapan P, sehingga nutrisi P tanaman meningkat. Clark (1997) menyatakan bahwa ada peningkatan penyerapan mineral P dan Zn serta konsentrasi mineral oleh tanaman bermikorhiza, sekalipun terjadi defisiensi hara seperti Ca, Mg, dan K pada tanah masam.
Namun demikian
tanaman bermikorhiza juga mampu meningkatkan unsur N dan K (Smith & Read 1997) serta unsur mikro seperti Cu dan Zn (Marschner & Dell 1994). Hal tersebut menunjukkan bahwa manfaat CMA sangat luas, oleh karena itu perlu diupayakan teknik memperbanyak CMA yang lebih efisien dan efektif. Gigaspora margarita adalah salah satu CMA yang berhasil dikembangkan melalui kultur in vitro. Jenis CMA tersebut infektif dan efektif
terhadap
pertumbuhan tanaman perkebunan, di antaranya tanaman kelapa sawit (Widiastuti 2004), kakao, jambu mente (Trisilawati 2001). Di satu sisi A. tuberculata juga efisien terhadap pertumbuhan tanaman perkebunan (Widiastuti 2004), tanaman manggis (Lucia 2005). Schulz et al. (1999) menyatakan bahwa A. tuberculata adalah CMA yang efektif untuk meningkatkan daya hidup planlet kelapa sawit, dari 40 % tidak diinokulasi, menjadi 91% diinokulasi dengan CMA. Acaulospora tuberculata merupakan salah satu CMA yang belum dikembangkan secara in vitro. Kedua jenis CMA infektif dan efektif terhadap pertumbuhan tanaman perkebunan, pertanian dan hortikultura. Perkembangan dan perbanyakan jenis CMA tersebut sangat penting dipelajari untuk meningkatkan efisiensi, efektivitas, dan kualitasnya, sehingga penelitian untuk perbanyakan kultur aksenik spora in vitro menjadi sangat penting dilakukan. Upaya pengembangan kedua CMA tersebut masih mengalami kendala, khususnya perbanyakan secara masal menggunakan teknik konvensional (kultur pot), karena itu inovasi teknologi sangat diperlukan.
Sampai sejauh ini di
Indonesia belum diperoleh laporan pengembangan kultur aksenik G. margarita dan A. tuberculata baik secara monoaksenik maupun kultur akar rambut. Bahkan untuk A. tuberculata belum ditemukan jurnal luar negeri yang melaporkan perbanyakan atau perkembangan CMA tersebut secara in vitro. Laporan hasil
3
penelitian perkembangan dan perbanyakan kedua CMA tersebut dapat menambah khasanah ilmu pengetahuan, khususnya di Indonesia Perbanyakan CMA umumnya dilakukan menggunakan kultur pot. Teknik kultur in vivo kurang efektif karena spora yang dihasilkan tidak steril, dan besar kemungkinan terjadi kontaminasi jamur hiperparasitik atau asosiasi bakteri dengan dinding spora tidak mudah steril (Frances et al. 1996). Hijri et al. (2000) menyatakan bahwa kelemahan penggunaan kultur pot antara lain spora CMA terkontaminasi oleh jenis CMA lain dan tidak murni, juga kemungkinan kontaminan mikroorganisme lain, seperti Microdochium dapat menyebabkan perbanyakan spora menurun sangat cepat. Kesulitan yang dihadapi dalam mempelajari simbion obligat dan tujuan praktis memperbanyak inokulum CMA secara masal, memperkuat motivasi pengembangan kultur CMA secara aksenik. Menurut Diop et al. (1994) di negara-negara berkembang lebih baik memilih pengembangan CMA menggunakan kultur aksenik karena lebih murah dari pada kultur pot di rumah kaca. Perbanyakan spora dengan organ akar rambut atau akar transforman merupakan perspektif baru perbanyakan spora CMA masal (Fortin et al. 2002). Sistem tersebut memberi kemudahan pengamatan perkembangan biologi CMA melalui ekstraradikal miselium (Bago et al. 1998a). Selain itu bermanfaat untuk mempelajari urutan perkembangan spora CMA dan kemudahan dalam riset. Hasil penelitian juga mengungkapkan bahwa perbanyakan spora CMA dengan organ akar rambut lebih luas dibandingkan dengan kultur konvensional in vivo (deSouza 1999, Dalpe & Declerck 2002). Perbanyakan spora CMA kultur aksenik in vitro memerlukan inang eksplan dan ataupun akar rambut, karena CMA bersifat obligat. Perkembangan ilmu biologi modern memungkinkan perbanyakan CMA menggunakan akar rambut oleh Agrobacterium
rhizogenes, yaitu bakteri tanah yang dapat mentransfer
sebagian DNA ke dalam genom tanaman melalui pelukaan jaringan tanaman. Integrasi T-DNA A. rhizogenes ke dalam sel tanaman merubah susunan genetik sel, dan diturunkan ke dalam sel anak. Integrasi dan ekspresi gen yang ditransfer ke dalam genom tanaman membentuk akar adventif lazim disebut akar rambut (hairy root) (Nillson & Olsson 1997, Twyman 1998, Bevan & Chilton 2003).
4
Akar rambut mempunyai beberapa kelebihan yaitu (i) meningkatkan infeksi CMA (Becard & Piche 1992), (ii) mempermudah adaptasi sehingga mudah disubkultur dan meningkatkan biomas CMA lebih cepat (Tepfer 1989; Becard & Piche 1992), (iii) hidup lebih lama tanpa subkultur, dan (iv) memerlukan hara dalam jumlah lebih sedikit (Adholeya et al. 1997), (v) meningkatkan kestabilan beberapa karakter penting, seperti morfologi, kapasitas pertumbuhan, dan genetik maupun struktur biokimia (Tanaka, 1997), (vi) mampu mensintesis peningkatan biomasa seperti akar normal, dengan laju pertumbuhan lebih cepat, mudah tumbuh pada media kultur tanpa penambahan zat pengatur tumbuh (Rhodes 1994). Beberapa kelebihan teknik akar rambut tersebut menjadi pertimbangan utama inovasi teknologi perkembangan dan perbanyakan CMA secara efisien dan efektif untuk menghasilkan spora lebih berkualitas, murni dan steril. Kultur aksenik secara in vitro umumnya menggunakan inang akar rambut untuk perbanyakan CMA steril, dapat pula dengan eksplan tanaman untuk penyediaan inokulum CMA steril. Penggunaan kultur aksenik menunjukkan hasil yang menggembirakan untuk dikembangkan (Becard & Piche 1992, Becard & Fortin 1988). Kultur aksenik adalah biakan mikroorganisme tidak terkontaminasi mikroba lain, disebut juga biakan murni dan steril (Abercrombie et al. 1993, Anonimus 2006). Pemanfaatan kultur aksenik G. margarita dan atau A. tuberculata asli Indonesia sebagai biakan murni dan steril sampai saat ini belum dimanfaatkan
dan
dikembangkan,
dengan
demikian
perbanyakan CMA
indigenous (asli setempat) dengan kultur aksenik in vitro untuk mendukung pertanian dan kehutanan masih terbuka peluang dan perlu dilakukan penelitian untuk meningkatkan kualitas perbanyakan CMA in vitro. Pengemasan CMA umumnya menggunakan zeolit, pasir, limbah kayu gergaji dan campuran tanah. Pengemasan dengan cara tersebut sulit diketahui kuantitas maupun kualitas spora, juga tidak mudah dilihat secara kasat mata kandungan spora di dalam kemasan (carrier) dan kurang efisien. Sebaliknya secara komersial diperlukan pengemasan dan penyimpanan CMA lebih menarik, mudah dilakukan dan dapat segera diketahui kuantitas dan kualitas spora serta mudah dilihat dan efisien. Na-alginat berupa bahan agar padat dapat digunakan sebagai salah satu bahan pengemas dan penyimpan spora. Pengemasan dan penyimpanan spora
5
CMA menggunakan Na-alginat mengurangi kelemahan cara yang umum digunakan. Na-alginat senyawa karbohidrat berwarna putih bening atau transparan memungkinkan spora CMA terselimuti dalam Na-alginat, mudah dilihat ada tidaknya spora dan jumlah spora. Akhir-akhir ini Na-alginat banyak digunakan untuk pengemasan spora atau enkapsulasi di antaranya benih sintetik, planlet mikro, CMA dan lainnya (Papi et al. 2005, Wang et al. 2005). Permasalahan Permasalahan dalam perbanyakan masal CMA belum tersedia teknik perbanyakan CMA maupun cara pengemasan yang efektif dan efisien. Teknologi konvensional perbanyakan CMA umumnya digunakan dengan kultur pot di rumah kaca, tetapi seringkali perbanyakan CMA terkontaminasi oleh jenis lain maupun mikroorganisme pencemar, serta diperlukan areal luas dan waktu perkembangan cukup lama. Inovasi teknik perbanyakan dan perkembangan CMA efisien dan efektif masih perlu dikembangkan untuk menghasilkan spora masal, berkualitas, steril dan murni. Pengembangan kultur in vitro merupakan salah satu inovasi untuk menanggulangi permasalahan tersebut Eksplan tanaman ditransformasi dengan
T-DNA A. rhizogenes akan
dihasilkan akar rambut. Akar rambut terbentuk karena integrasi T-DNA pada genom sel tanaman. T-DNA adalah bagian DNA plasmid A. rhizogenes yang ditransfer ke dalam sel tanaman melalui pelukaan. T-DNA mengandung gen yang mensintesis hormon pertumbuhan. Ekspresi gen dalam sel tanaman mendorong pembentukan akar adventif pada tempat infeksi yang disebut akar rambut (Gelvin 2000). Transformasi gen pada akar tanaman meningkatkan pertumbuhan lebih baik dibandingkan dengan akar tanaman normal atau tanaman yang tidak ditransformasi. Akar rambut bersifat seperti akar tanaman normal dapat digunakan sebagai inang perkembangan CMA in vitro, namun tidak setiap tanaman mampu merespons T-DNA A. rhizogenes. CMA bersifat obligat, tumbuh dan perkembangannya sangat bergantung pada fotosintat tanaman, yang ditimbun pada akar tanaman hidup. Akar rambut bersifat seperti akar tanaman normal, dapat digunakan sebagai sarana infeksi CMA, dan perbanyakan aseptik, sehingga spora dan propagul CMA yang dihasilkan dapat digunakan untuk perkembangan CMA, dan pada periode
6
berikutnya dapat digunakan untuk perbanyakan CMA masal, murni, steril, efektif, efisien dan berkualitas. Permasalahan perbanyakan CMA dan cara pengemasan belum efisien dan efektif dapat ditanggulangi dengan perbanyakan spora CMA kultur aksenik in vitro.
Natrium alginat telah berhasil dikembangkan sebagai bahan pengemas
cendawan ektomikorhiza dan perlu diuji untuk pengemas CMA secara in vitro.
Tujuan Penelitian Berdasarkan identifikasi masalah, penelitian bertujuan untuk menguji: 1. Respons tanaman jagung, sorghum, kentang dan wortel
terhadap A.
rhizogenes, dan media pertumbuhan akar rambut 2. Pengaruh
tempat tumbuh, jenis inang terhadap perbanyakan spora G.
margarita dan A. tuberculata dalam kultur pot (konvensional). 3. Pengaruh jenis medium kultur ganda MM dan MSR terhadap kultur aksenik CMA uji, dan optimasi metode sterilisasi spora CMA uji. 4. Pengaruh jenis inang terhadap perkembangan inokulum CMA in vitro. 5. Teknik enkapsulasi spora dan propagul CMA uji dengan Na-alginat
Hipotesis Penelitian 1. Tanaman jagung, sorghum, kentang Granola, Atlantik dan wortel
tidak
semua dapat merespons T-DNA A. rhizogenes dengan membentuk akar rambut. 2. Tempat
tumbuh cawan Petri plastik, gelas plastik warna, jenis inang
sorghum dan P. phaseoloides,L., berpengaruh terhadap perbanyakan dan perkembangan
A. tuberculata dan G. margarita secara konvensional.
3. Media pertumbuhan kultur ganda MM dan MSR
berpengaruh terhadap
kultur aksenik CMA uji in vitro. 4. Eksplan tomat, wortel, dan akar rambut tanaman wortel, dapat digunakan sebagai inang kultur aksenik CMA 6
Na-alginat dengan konsentrasi 2 % dapat digunakan untuk enkapsulasi CMA
7
Pendekatan Penelitian Pendekatan penelitian melakukan dan mengamati beberapa hal antara lain: 1. Pengaruh
jenis
tanaman
dan
media
terhadap
pertumbuhan
dan
perkembangan akar rambut 2. Pengaruh tempat tumbuh, jenis inang terhadap perbanyakan inokulum CMA secara konvensional 3. Pengaruh jenis media kultur ganda terhadap penyediaan inokulum dan perbanyakan spora dalam kultur aksenik dan optimasi sterilisasi spora. 4. Pengaruh jenis inang untuk perbanyakan spora dan inokulum CMA steril dengan teknik in vitro 5. Enkapsulasi spora CMA dengan Na-alginat
Manfaat Penelitian Manfaat Penelitian untuk mendapatkan: 1. Medium terbaik untuk pertumbuhan optimal akar rambut wortel. 2. Teknik perbanyakan spora G. margarita dan A. tuberculata secara konvensional 3. Teknik
penyediaan
inokulum
CMA yang steril
sebagai dasar
perkembangan CMA in vitro. 4. Medium dan
inang
untuk
pertumbuhan G. margarita dan A.
tuberculata secara in vitro 5. Teknik pengemasan CMA dengan Na-alginat yang optimal 6. Sumbangan ilmu pengetahuan tentang CMA secara in vitro
BAB II
BAHAN DAN METODE A. Tempat dan waktu penelitian Penelitian ini dilakukan di rumah kaca dan Laboratorium Rekayasa Genetik Biomolekuler, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI), Bogor dan Laboratorium Fisiologi Tumbuhan Jurusan Biologi FMIPA, Institut Pertanian Bogor. Seluruh kegiatan penelitian dilaksanakan dari bulan Juli 2003 sampai Mei 2006. Penelitian ini terdiri dari lima percobaan, yaitu : 1. Pengembangan teknologi akar rambut beberapa tanaman secara in vitro 2. Perbanyakan G. margarita dan A. tuberculata dengan kultur pot di rumah kaca 3. Penyediaan inokulum steril G. margarita dan A. tuberculata dalam kultur aksenik dengan eksplan tomat dan wortel 4. Perkembangan G. margarita dan A. tuberculata secara in vitro menggunakan teknologi akar rambut wortel 5. Teknologi enkapsulasi untuk pengemasan G. margarita dan A. tuberculata dengan Na-alginat Bahan dan metode percobaan diuraikan secara lengkap pada masing- masing percobaan. Alur penelitian yang menunjukkan keterkaitan antar percobaan disajikan dalam Gambar 1.
B. Materi penelitian Materi penelitian secara keseluruhan digunakan beberapa bahan, yang dikelompokkan ke dalam satu sampai lima subtopik penelitian, sebagai berikut : Penelitian I. Untuk seleksi akar rambut digunakan lima
jenis tanaman
terdiri dari monokotil dan dikotil. Monokotil terdiri dari dua jenis yaitu sorghum dan jagung. Dikotil terdiri dari tiga jenis yaitu kentang Granola, kentang Atlantik dan wortel, yang diinokulasi dengan A. rhizogenes galur LBA 9457 koleksi BPBPI. Media yang digunakan adalah MS, B5, White dan kultur ganda MM dari
9
Becard & Fortin (1988). Primer yang digunakan adalah TL Primer TL-DNA rol B1
(5’atggatcccaaattgctattccccacga3’),
(’ttaggcttctttcattcgggtttactgcagc3’).
Primer
dan TR-DNA
rolB2 TR1
:
(5’ggaaattgtggctcgttgtggac3’ ) TR2: (5’aatcgttcagagagcgtccgaagtt3’). Penelitian II. Digunakan tempat tumbuh cawan Petri plastik dan gelas plastik warna dengan media tumbuh zeolit,
tanaman sorghum dan Pueraria
phaseoloides.L. sebagai inang untuk perbanyakan spora G. margarita koleksi BPBPI dan A. tuberculata koleksi PT. Intidaya Agrolestari (Inagro), yang diperbanyak di rumah kaca, dan digunakan sebagai sumber spora steril untuk penelitian III dan V. Penelitian III. Sumber spora diperoleh dari penelitian II. Digunakan tiga macam sterilisasi, yaitu menurut Buce et al. (2000) sebagai sterilisasi 1, Chabot (1992) sebagai sterilisasi 2, menurut Declerck et al. (1998) sebagai sterilisasi 3 (Lampiran 9), dan dua jenis cendawan mikorhiza arbuscula (CMA) yaitu G. margarita dan A. tuberculata.
Tanaman inang digunakan eksplan tomat dan
wortel, medium kultur ganda yang digunakan terdiri dari dua macam yaitu medium MM (Becard & Fortin, 1988) dan MSR (Strullu & Romand 1986) (Lampiran 1A). Penelitian IV. Sumber inokulum steril G. margarita dan A. tuberculata diperoleh dari penelitian III, dengan inang akar rambut diperoleh dari penelitian I, dipilih akar rambut yang mampu tumbuh baik pada medium kultur ganda, mempunyai percabangan akar banyak dan tidak terpengaruh dengan subkultur. Penelitian V. Digunakan
Na-alginat sebagai bahan enkapsulasi G.
margarita dan A. tuberculata, serta larutan CaCl2 5 %, sebagai bahan pembeku Na-alginat.
10
Percobaan 1 Pengembangan teknologi akar rambut beberapa tanaman secara in vitro Output: • Tanaman yang merespons T-DNA A.rhizogenes membentuk akar rambut • Mendapatkan medium optimal untuk pertumbuhan akar rambut • Mendapatkan akar rambut yang tumbuh kembang paling baik pada kultur ganda
Percobaan 2 Perbanyakan Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata kultur pot di rumah kaca Output : ? Tanaman inang yang kompatibel ? Tempat tumbuhan yang tepat untuk perbanyakan inokulum CMA secara optimal
Percobaan 3 Penyediaan inokulum steril Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata di dalam kultur aksenik dengan eksplan tomat dan wortel Output: • Mendapatkan spora, dan propagul sebagai inokulum steril. • Mengetahui pengaruh tanaman dan media, terhadap persediaan inokulum steril. • Mendapatkan teknis sterilisasi spora yang optimal Percobaan 4 Perkembangan Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata secara in vitro menggunakan teknologi akar rambut wortel Output: • Media kultur ganda terbaik untuk pertumbuhan CMA • Mengetahui pola pertumbuhan akar rambut yang diinokulasi dan yang tidak diinokulasi CMA
Percobaan 5 Teknologi pengemasan Na-alginat spora CMA (Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata) Output: • Teknik pengemasan spora CMA dengan Na-alginat
• • • •
Output penelitian Inang terbaik untuk perbanyakan CMA secara in vitro Mendapatkan inang yang kompatibel, dan metode untuk perbanyakan spora CMA secara konvensional di rumah kaca Mendapatkan teknik perbanyakan spora CMA steril secara in vitro dengan kultur aksenik maupun dengan kultur ganda Mendapatkan teknik enkapsulasi spora CMA
Gambar 1. Alur penelitian “Pemanfaatan teknologi in vitro untuk perkembangan spora G. margarita dan A. tuberculata”.
11
BAB III
TINJAUAN PUSTAKA Pemanfaatan teknologi in vitro merupakan salah satu upaya peningkatan kualitas produksi cendawan mikorhiza arbuskula (CMA). Teknologi in vitro adalah teknologi perkembangan mikroorganisme steril dalam laboratorium, dengan media khusus dikond usifkan untuk pertumbuhannya (Sarin 1996, Yatim 1999). Kultur aksenik adalah biakan mikroorganisme steril dan murni (Abercrombie et al. 1993, Anonimus 2006 a). Beberapa aspek diuraikan guna mendukung penelitian pemanfaatan teknologi in vitro untuk perkembangan spora Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata, yaitu aspek teknologi akar rambut oleh Agrobacterium rhizogenes, aspek perkembangan CMA kultur pot dan kultur aksenik CMA in vitro, serta enkapsulasi spora.
A. Agrobacterium rhizogenes A.1. Karakteristik A. rhizogenes. A.
rhizogenes
bakteri
Gram
negatif
termasuk
dalam
kelompok
Rhizobiaceae, hidup di tanah, bersifat aerobik, tidak membentuk spora, motil dan berbentuk batang. Agrobacterium dapat mentransfer T-DNA ke dalam genom tanaman. DNA terintegrasi
stabil pada kromosom tanaman dan mampu
mengubah susunan genetik tanaman, diturunkan ke sel anak dan ekspresi gen TDNA menimbulkan penyakit akar rambut. T-DNA berukuran sekitar 15-30 kb dan memiliki beberapa gen (Twyman 1998). T-DNA terdiri dua bagian yaitu TL dan TR. TR-DNA mengandung gen untuk biosintesis auksin dan membawa gen penyandi sintesis opin, yaitu asam amino derivatif yang tidak ditemukan dalam jaringan normal. Opin dimanfaatkan oleh Agrobacterium sebagai sumber karbon dan nitrogen (Lebowitz 1995). TLDNA mengkode satu set gen lokus, yaitu gen rol A, rol B dan ro1 C. Daerah TLDNA lebih penting menginduksi akar rambut karena gen tersebut menginduksi akar, dan berperan terhadap fenotip akar. Gen TL-DNA selalu ditemukan dalam
12
akar transformasi, sedang gen TR-DNA mengkode biosintesis opin dan auksin meskipun tidak selalu ditemukan (Nasir 2002).
Gambar 2. Plasmid Ri (Jacobsen 2004)
A.2. Transformasi gen oleh A. rhizogenes Sheng & Citovsky (1996) menyatakan bahwa tiga komponen genetik harus dimiliki oleh Agrobacterium untuk melaksanakan transfer T-DNA yaitu: 1) T-DNA ditransfer ke tanaman, 2) berbagai gen virulensi (vir) terdiri atas vir A, vir B, vir D dan vir G berfungsi untuk proses terjadinya transfer T-DNA dari bakteri ke tanaman, vir C dan vir E meningkatkan efisiensi transfer T-DNA ke sel tanaman dan,
3)
beberapa
gen
pada
kromosom Agrobacterium
yaitu
Chromosomal virulence (chv) terdiri dari chv A dan chv B, sebagai penyandi enzim untuk sintesis dan ekspresi β-1,2 glukan dari sel Agrobacterium berfungsi untuk pelekatan bakteri ke dalam sel tanaman. Gelvin (2000) menyatakan sedikitnya terdapat tujuh langkah dalam proses transfer molekul T-DNA sel Agrobacterium ke sel tanaman yaitu : 1) pengenalan sel tanaman rentan, 2) induksi ekspresi gen vir, 3) kopi T-DNA yang ditransfer, 4) transfer kompleks T-DNA ke dalam membran bakteri, 5) transfer kompleks TDNA membran bakteri ke sitoplasma tanaman, 6) tranfer kompleks
T-DNA
sitoplasma tanaman ke membran inti, dan 7) integrasi T-DNA ke dalam genom inti tanaman (Zambryski 1998). Proses transfer T-DNA sel Agrobacterium ke sel tanaman (Gambar 3) Winans (1992) menyatakan bahwa proses inisiasi transfer T-DNA diawali pengenalan Agrobacterium terhadap sel tanaman luka. Interaksi ini merupakan
13
respons kemotaksis terhadap metabolit, dikeluarkan oleh sel tanaman luka berupa monosiklik fenolik seperti asetosiringon dan monosakarida seperti glukosa dan galaktosa, dan Agrobacterium akan bergerak aktif menuju sel tanaman. T-DNA ditransfer lebih dari satu molekul T-DNA, situs kromosom
integrasi
T-DNA
pada
tanaman bersifat acak, dan T-DNA akan terintegrasi stabil pada
kromosom tanaman (Giri & Narasu 2000). Senyawa metabolit dikeluarkan oleh sel tanaman luka, berfungsi sebagai inducer mengaktifkan gen vir. Senyawa gula dan pH bersifat asam merupakan faktor penting dalam proses induksi gen vir, di samping senyawa asetosiringon (Baron & Zambryski 1995). Mekanisme selanjutnya induksi faktor vir mengatur pemotongan dan pemindahan T-DNA ke dalam sel tanaman. Faktor vir terinduksi akibat senyawa fenol yang dikeluarkan oleh tanaman yang dilukai. Beberapa senyawa fenol dapat menginduksi faktor vir yaitu asetosiringon, hidroksi asetosiringon, konifenil alkohol, koniferin (feniproponoid glukosida) dan etil firulat (Winans 1992). Apabila asetosiringon tidak diproduksi, monosakarida seperti glukosa, galaktosa, arabinosa, fr uktosa dan silosa menginduksi faktor vir (Cangelosi et al. 1989). Terdapat enam faktor virulens diketahui berfungsi untuk proses pemindahan T-DNA, yaitu vir A, vir B, vir C, vir D, vir E dan vir G. Senyawa fenolik dikeluarkan menginduksi vir A memproduksi suatu protein vir A. Protein vir A mengalami autofosforilasi dan menginduksi fosforilasi protein vir G. Selanjutnya potein vir G mengaktifkan gen vir lain. Produk berupa protein vir D1, dan vir D2 memotong T-DNA pada daerah flanking (daerah susunan DNA berulang). Daerah tersebut sebagai pembatas kiri (left border) dan pembatas kanan (right border) T-DNA. Komponen pembatas kanan mutlak diperlukan dalam transfer T-DNA. Adanya pemotongan gen vir D menyebabkan terbentuk molekul DNA utas tunggal (ss-DNA) atau disebut T-strand. Struktur T-strand ditransfer sel Agrobacterium ke sel tanaman berupa DNA-protein kompleks (Powell et al. 1989). Transportasi kompleks T-DNA ke sel tanaman dibantu oleh vir D4, 11 protein vir B dan hidrolisis ATP. Protein vir B akan membentuk pori trans membran yang berhubungan dengan sel tanaman.
vir D2
dan vir E2
memungkinkan masuknya kompleks T-DNA ke inti sel melalui nuclear pore
14
complex (NPC). T-DNA berintegrasi dengan genom tanaman dan ekspresi gen membentuk opin dan hormon pertumbuhan menyebabkan terjadinya proliferasi akar melimpah pada bagian tanaman terinfeksi (Baron & Zambryski 1995).
O
Transfer T -D N A dari A.rhizogenes ke tanaman
C
CH3
Asetosiringon pH asam Gula
OCH3
OCH3 OH
Pelukaan
Integrasi
Vir A
Hairy root
Vir G
Plasmid R i
Opine Induksi gen vir
Vir D4 Eksisi ATP TDNA Vir D2
Vir E 2
NPC Sitoplasmik transport
Vir B Reseptor tanaman
Sitokinin Auksin
A.rhizogenes S e l Tanaman
Gambar 3. Mekanisme transfer T-DNA Agrobacterium ke dalam sel tanaman (Gelvin 2000) A.3. Ekspresi T-DNA pada genom tanaman T-DNA mengandung gen berperan biosintesis senyawa opin yaitu turunan gula dan asam amino. Opin diekskresikan tanaman ke lingkungan, dan dimetabolisasi oleh Agrobacterium. Opin dimanfaatkan Agrobacterium sebagai sumber karbon dan nitrogen. Tujuan Agrobacterium menginfeksi sel tanaman adalah untuk mensintesis senyawa opin (Nillson & Olsson 1997). Selain gen sintesis opin, T-DNA mengandung onkogen yaitu gen penyandi pembentukan hormon pertumbuhan auksin dan sitokinin. Integrasi T-DNA di dalam kromosom tanaman mengakibatkan ketidak seimbangan hormon sel tanaman, sehingga terjadi over produksi hormon. Hal tersebut menyebabkan pertumbuhan sel tidak terkontrol, dan ekspresi gen tersebut membentuk akar rambut.
15
A.4. Faktor yang mempengaruhi kultur akar rambut Faktor yang berpengaruh terhadap pertumbuhan akar rambut antara lain, medium tumbuh, nutrisi,
lingkungan biotik dan abiotik.
Medium tumbuh di
dalam kultur jaringan ada tiga jenis yaitu padat, semi padat dan cair. Medium tumbuh harus dicukupi unsur makro dan mikro nutrien, baik kualitatif maupun kuantitatif tergantung keadaan fisiologi jaringan atau eksplan yang dikultur. Susunan nutrien, tekanan osmosis dan kekuatan ion timbul di dalam sel berpengaruh pada pertumbuhan akar rambut (Sikuli & Demeyer 1997). Ernawati (1990) memperoleh media terbaik perangsang pertumbuhan akar rambut P. tinchlorium. Ait., pada media Marashige dan Skoog (MS) (1962) yang mengandung 2mM NH4 NO3 1650 mg/l. Di samping itu dengan penurunan unsur fosfor media dapat meningkatkan kandungan flavonoid. Vitamin sering digunakan dalam kultur jaringan, di antaranya tiamin (vitamin B1 ), asam nikotinat (niasin) dan pyridoksin (B6). Vitamin berfungsi sebagai koenzim dalam metabolisme karbohidrat dan protein. Kecuali susunan medium buatan, pilihan penggunaan medium padat atau cair menentukan keberhasilan suatu kultur tumbuhan. Pilihan medium padat atau cair umumnya dilakukan sesuai kebutuhan dan tujuan penelitian serta fasilitas yang tersedia (Gunawan 1992). Lingkungan tumbuh mencakup suhu, kelembaban udara, pH dan cahaya, berpengaruh pada pertumbuhan kultur akar rambut. Lingkungan tumbuh optimum untuk pertumbuhan kultur akar bervariasi antar spesies. Toivonen et al. (1992) memperoleh pertumbuhan akar rambut Catharanthus roseus paling cepat apabila dikulturkan pada suhu 32 o C dibandingkan dengan suhu 19,5 o C dan 24 o C. Pada kedua suhu tersebut akar berwarna cokelat dan terbentuk kalus. Selain gen penyandi sintesis auksin dan sitokinin di dalam sel akar rambut, gen tersebut adalah gen ipt berasal dari transformasi bakteri A. rhizogenes dan rantai samping isopentil asam mevalonat. Biosintesis zeatin terutama terjadi di ujung akar dalam bibit yang berkecambah. Translokasi zeatin terutama melalui xilem (Wattimena 1992). Sitokinin sintetik terdiri dari zeatin, benzil adenin purin (BAP), 2- iP, dan Kinetin.
16
B. Cendawan Mikorhiza Arbuskula (CMA) B.1. Struktur umum CMA Mikorhiza merupakan asosiasi cendawan dengan akar tanaman dalam bentuk simbiosis. Pada kondisi alami, hampir sebagian besar tanaman darat di dunia bersimbiosis dengan mikorhiza. Namun, CMA adalah tipe mikorhiza paling umum dijumpai sekitar 80% spesies tanaman darat (de-Souza 2005, Heijden & Sanders 2002, Smith & Read 1997). Pada saat ini sudah diakui secara luas peran penting simbiosis mikorhiza pada ketersediaan hara tumbuhan. Pada pertanian berkelanjutan, simbiosis CMA dengan tanaman memainkan peran kunci membantu tidak hanya ketahanan hidup tanaman, tetapi menjadikan lebih produktif pada kondisi tanah marjinal (Jeffries et al. 2003) Banyak sekali jenis CMA dalam tanah, misalkan Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata. CMA tersebut telah diteliti untuk tanaman perkebunan dan buah di antaranya adalah, kelapa sawit, kakao (Widiastuti 2004, Baon 1995), dan tanaman
manggis
(Lucia 2005). CMA tersebut digunakan untuk
perkembangan in vitro, yaitu G. margarita dan A. tuberculata.
A
A
B
D
C
D
Gambar 4. Spora CMA genus Acaulospora dan Gigaspora (Lucia 2005). A. Acaulospora tuberculata, B. Acaulospora rehmi, C. Gigaspora microsporophora, D. Gigaspora margarita
17
B.2. Karakteristik interaksi CMA dan simbion Genus Gigaspora dan Acaulospora, merupakan CMA yang mempunyai ciri specifik yaitu, Gigaspora dengan bulbus suspensor, dan substanding hifa (sporophore), dinding luar terdiri dari satu lapis, dan halus. Sedang ciri specifik Acaulospora adanya hyphal terminus, pada spora matang terdapat lubang kecil disebut ciatrik, sebagai penghubung spora dan hifa terminus. Dinding luar terdiri tiga lapis, dan permukaan kasar seperti kulit jeruk (Gambar 3). Kedua genus tersebut disebut azygospora, karena spora terbentuk tidak langsung, berasal dari hifa, tetapi spora berkembang dari suspensor (Delvian et al. 2001, Lucia 2005).
B.3. Mekanisme infeksi CMA Sebelum terjadi infeksi, spora CMA berkecambah dan terjadi pertumb uhan hifa. Selanjutnya terjadi kontak antara hifa dengan permukaan akar inang dan menghasilkan apresoria. Jaringan akar yang terinfeksi akan membentuk hifa interseluler dan intraseluler, hifa eksternal, dan arbuskula. Sedang beberapa spesies lain membentuk vesikula. Jaringan akar spesifik seperti epidermis dan korteks membentuk koloni, karena CMA tidak mempunyai enzim untuk degradasi lignin dan suberin. Secara umum proses infeksi CMA akar tanaman melewati empat tahap yaitu, 1) induksi perkecambahan spora dan pertumbuhan hifa, 2) kontak hifa dan permukaan akar, menyebabkan pengenalan dan pembentukan apresorium, 3) penetrasi hifa ke dalam akar, dan 4) perkembangan struktur arbuskula internal, sehingga terjadi simbiosis fungsional (Bonfante & Perotto 1995). Mekanisme infeksi akar, baik secara in vitro maupun konvensional (in vivo) hampir tidak berbeda. Perbedaan hanya pada perlakuan inokulum, untuk in vitro proses sterilisasi permukaan spora, dan stratifikasi pendinginan untuk mencegah dormansi, sedang untuk in vivo tanpa melalui proses tersebut. Untuk spora in vitro spora yang dihasilkan steril, dan sebaliknya secara konvensional sering tercemar. Juge et al. (2001) menyatakan bahwa perawatan dengan stratifikasi dingin dapat memecahkan spora dorman, dan perawatan tersebut tidak hanya mempengaruhi perkecambahan spora, tetapi dapat mempercepat pemecahan tabung perkecambahan, sehingga mampu mendorong percepatan perkecambahan
18
sampai 14 hari. Sumber karbon di dalam kultur pot berasal dari hasil fotosintesis, sedang pada sistem in vitro bersumber pada metabolisme proses siklus glikolisis.
B.4. Induksi perkecambahan spora dan pertumbuhan hifa Beberapa peneliti mengemukakan bahwa eksudat akar mempengaruhi perkecambahan spora dan pertumbuhan hifa, yaitu pembengkakan dan percabangan hifa (Giovannetti et al. 1993). Orcutt & Nielsen (2000) mengelompokkan
senyawa
organik
yang
dikeluarkan
akar
berdasarkan
pergerakannya di tanah ke dalam tiga kelompok yaitu 1) larut air dan berdifusi, 2) volatil dan berdifusi, dan 3) tidak dapat berdifusi. Kemampuan eksudat akar volatil menarik tabung perkecambahan lebih tinggi dibandingkan dengan yang larut air, sebab eksudat volatil dapat menarik tabung perkecambahan pada jarak lebih dari 10 mm, sedang eksudat yang larut air aktivitas biolo ginya hilang pada jarak 1 mm. Selanjutnya ditunjukkan bahwa eksudat volatil bukan berasal dari inang yang menghambat perkecambahan spora CMA. Beberapa peneliti mengemukakan bahwa eksudat akar tanaman inang tidak hanya menstimulasi pertumbuhan hifa, tetapi juga memberikan pengaruh morfogenetik terhadap cendawan. Beberapa flavonoid seperti kuersetin yang terdapat dalam eksudat akar dapat menginduksi perkecambahan spora dan pemanjangan hifa Glomus etunicatum (Tsai & Phillips 1991). Selanjutnya Bécard et al. (1995) mengemukakan bahwa sebagian besar metabolit termasuk flavonoid menstimulasi pertumbuhan CMA, walaupun dalam
pengembangan simbiosis
flavonoid tidak diperlukan lagi. Isoflavon sebagai molekul penanda dalam simbiosis CMA dengan tanaman dapat menginduksi pertumbuhan hifa, percabangan, dan diferensiasi serta penetrasi hifa ke sel inang, karena mempengaruhi permiabilitas membran akar. Pinior et al. (1999) mengemukakan bahwa eksudat akar paling sedikit terdapat dua sinyal yaitu 1) sinyal untuk panjang hifa jumlah menurun pada tanaman bermikorhiza, dan 2) sinyal pertumbuhan hifa terdapat baik pada tanaman bermikorhiza maupun tidak bermikorhiza. Konsentrasi P dan genotip tanaman dapat mempengaruhi kemampuan eksudat akar dalam menarik tabung perkecambahan. Pinior et al. (1999) mengemukakan bahwa, terdapat perbedaan
19
baik secara kuantitatif maupun kualitatif komponen eksudat akar tanaman yang tidak dipupuk P dan dipupuk P. Pada konsentrasi P eksternal rendah, jumlah eksudat lebih banyak bila dibandingkan dengan keadaan P tinggi. Hubungan antara tingkat efisiensi P empat kultivar jagung dan kemampuan menarik tabung perkecambahan menunjukkan, bahwa kultivar efisien kurang mampu menarik tabung perkecambahan spora, sedang kultivar tidak efisien lebih mampu menarik tabung perkecambahan (Suriyapperuma & Koske 1995).
B.5. Pembentukan apresorium Hasil penelitian Giovannetti et al. (1993, 1994, 1995), dan Nagahashi et al. (1995) menunjukkan bahwa tanaman mengeluarkan sinyal kimia dalam bentuk eksudat akar yang penyebabkan perubahan morfologi hifa, berupa proliferasi dan percabangan hifa sebelum pembentukan apresorium. Sinyal ini tidak diinduksi oleh cendawan, namun merupakan komponen konstitutif eksudat inang (Nagahashi et al. 1995). Perkembangan hifa ekstensif berasosiasi dengan akar tanaman inang, menyebabkan terbentuknya apresorium. Apresorium merupakan ujung hifa berbentuk elips, rata dan terbentuk pada permukaan akar inang.
B.6. Mekanisme penetrasi hifa ke dalam akar Mekanisme penetrasi hifa ke dalam akar sistem pot (konvensional) dengan sistem in vitro tidak berbeda, yaitu diawali dengan induksi perkecambahan spora dan pertumbuhan hifa, serta pengenalan inang diawali dengan pembentukan apresorium. Tetapi mekanisme penetrasi hifa ke dalam akar berbeda dengan patogen, proses infeksi cendawan dicirikan dengan produksi enzim pendegradasi dinding sel, dalam jumlah kecil dan terkontrol. Infeksi G. mosseae menghasilkan enzim pendegradasi dinding sel seperti pektinase dan selulase (Garcia et al. 1991). Kitinase dan kalkonsintetase terdapat pada Phaseolus vulgaris, peroksidase dan kitinase pada Allium porrum. Rendahnya produksi dan adanya lokalisasi enzim, memungkinkan viabilitas sel inang tetap terjaga dan mekanisme pertahanan tidak terinduksi, sehingga terjadi kompatibilitas (Saizer & Boller 2000).
20
Penetrasi CMA ke jaringan inang di samping secara enzimatis juga secara mekanik. Hal ini ditunjukkan dengan tingginya tekanan dihasilkan oleh apresorium. Tekanan mekanis menyebabkan cendawan mampu menembus dinding sel khususnya me lalui pembentukan kaki penetrasi. Beberapa komponen dinding sel seperti, melanin berperan penting dalam meningkatkan tekanan hidrostatik,
karena komponen dinding sel tersebut menangkap cairan dalam
apresoria, dapat menyebabkan terjadinya peningkatan gradien osmose dan penyerapan air (Bonfante & Perotto 1995). Apresoria menghasilkan hifa cenderung tumbuh di antara sel epidermis dan tidak memotong dinding luar. Masuknya apresoria ke dalam akar, terbentuk hifa interseluler tumbuh dalam saluran banyak udara (Brundrett & Kendrick 1990). Memotong dinding sel korteks menjadi hifa intraseluler, menghasilkan kaki penetrasi dan hanya sedikit menyebabkan perubahan struktur dinding sel inang (Bonfante & Vian 1989). Sedikitnya perubahan struktur dinding sel inang menunjukkan penetrasi CMA ke akar merupakan kombinasi mekanik dan enzimatis (Bonfante & Perotto 1995). Di sisi lain penetrasi CMA ke akar tanaman melakukan serangkaian mekanisme pertahanan. Salah satunya adalah dengan akumulasi protein berkaitan dengan patogenesis melalui aktivitas antimikroba. Enzim yang berkaitan dengan pertahanan tanaman seperti kitinase dapat dilawan dengan penyebaran hifa cendawan. Kitinase berperan dalam melawan cendawan patogen melalui reaksi hidrolisis (Pozo et al. 2002). Infeksi mikorhiza akar tanaman meningkatkan kemampuan menyerap hara terikat, tidak tersedia bagi tanaman, dan meningkatkan kemampuan menyerap air, sehingga tanaman dapat hidup baik pada kondisi tanah kering (Jeffries et al. 2003). Mekanisme penyerapan hara pada tanama n terinfeksi CMA adalah bertambah luas permukaan absorbsi dan meningkatkan volume daerah penyerapan hifa eksternal, serta kemampuan hifa lebih tinggi mengabsorbsi zat makanan dibandingkan dengan bulu akar (Abbott et al. 1992). Kondisi demikian menyebabkan tanaman bermikorhiza mampu menyerap hara lebih banyak dan lebih baik dibandingkan dengan tanaman tidak bermikorhiza.
21
Secara umum peningkatan pertumbuhan tanaman bermikorhiza disebabkan oleh penyerapan P, khusus dari sumber P tersedia. Selain daya jelajah hifa sangat tinggi dibandingkan dengan akar, mikorhiza mampu meningkatkan enzim fosfatase, yang berfungsi menguraikan unsur P terfiksasi atau terikat. Selain itu diameter hifa sangat kecil (2–4 µm) menyebabkan daya terobos lebih besar (Bolan 1991, Marschner & Dell 1994). Marschner & Dell (1994) menyatakan bahwa pengambilan dan tansport N15 oleh hifa pada tanaman seledri, menunjukkan peningkatan N total sebesar 2,5 % dan 3,5 % setelah 30 hari. Kondisi ini terjadi pada tanaman bermikorhiza. Arbuskula adalah struktur paling berarti dalam CMA berfungsi komplek sebagai tempat pertukaran metabolit antara cendawan dan tanaman. Bonfante & Scannerini (1992) menyatakan bahwa arbuskula sangat penting untuk identifikasi terjadinya infeksi pada akar tanaman. Seluruh endofit termasuk genus Gigaspora, Scutellospora, Glomus, Sclerocystis, dan Acaulospora mampu membentuk arbuskula. Vesikula menurut Abbott & Gazey (1994) berbentuk globus berasal dari gelembung hifa internal CMA. Vesikula ditemukan baik di dalam maupun di luar lapisan kortek parenkhim, dan tidak semua CMA membentuk vesikula dalam akar inang. Pada umumnya vesikula berfungsi sebagai organ reproduktif atau organ tempat menyimpan makanan, kemudian diangkut ke dalam sel dimana metabolisme berlangsung. Pendapat la in menganggap vesikula sebagai organ istirahat, karena jumlahnya meningkat pada saat tanaman tua atau tanaman menuju kematian (Abbott & Gazey 1994, Bonfante & Vian 1989).
B.7. Perubahan struktur cendawan dan tanaman selama proses infeksi Pengamatan morfologi menunjukkan terjadinya perubahan struktur CMA ekstensif selama proses infeksi dan pembentukan arbuskula. Pembentukan arbuskula diawali dari suatu struktur batang, selanjutnya pada batang terjadi percabangan hifa, dan tipe percabangannya dipengaruhi oleh tanaman inang. Analisis morfologi dan morfometrik menunjukkan bahwa arbuskula melengkapi perkembangannya dalam 2,5 sampai 4 hari (Alexander et al. 1989). Selanjutnya akan hancur membentuk gumpalan (Bonfante 1994). Aari et al. (2003)
22
mengemukakan bahwa umur arbuskula Scutellospora, Acaulospora dan Glomus caledonium berkisar antara 16 hari. Pengujian ultra struktur menunjukkan bahwa sebagian besar modifikasi terjadi pada bagian sel cendawan, seperti dinding sel secara progresif menjadi lebih tipis dengan adanya infeksi di akar dan sitoplasma (Bonfante & Scannerini 1992). Selain itu aktivitas enzimatis cendawan spesifik dimulai selama infeksi jaringan tanaman seperti ekspresi alkalin fosfatase. Bagaimanapun juga, mekanisme pengendali diferensiasi struktur CMA khususnya arbuskula belum dikenal. Ruang interfase adalah tempat terjadinya pertukaran hara dua arah (Smith & Smith 1990). Hasil analisis aktivitas ATPase menunjukkan bahwa kemungkinan membran di sekitar cendawan (perifungi) sangat berperan dalam transport hara. Sebagian aktivitas ini disebabkan adanya H+/ATPase terdapat di membran perifungi mengalami invaginasi di sekitar arbuskula. Membran cendawan merupakan bagian penting karena pada bagian ini terjadi transfer dua arah antara tanaman dan cendawan. Menurut Gianinazzi-Pearson (1994), berdasarkan konsistensi aktivitas H+/ATPase, pertukaran terjadi baik pada interfase arbuskula maupun interfase dinding sel korteks dan hifa interseluler. Adanya aktivitas H+ /ATPase mencirikan simbiosis mutualisme,
sebagaimana
dijumpai membran tanaman sekitar bakteri bintil akar. Hal ini tidak dijumpai pada membran haustoria di sekitar interaksi patogen-tanaman (Bonfante & Perotto 1995).
B.8. Peningkatan serapan P tanaman sebagai respons kolonisasi CMA Eksploitasi fisik difasilitasi oleh kecilnya diameter hifa yaitu berkisar 2-15 µm (Friese & Alien 1991) dengan rata rata 3-4 µm (O'Keefe & Sylvia 1992). Ukuran hifa lebih cocok untuk memanfaatkan P di ruang pori mikro tanah yang tidak dapat dicapai oleh akar dan rambut akar (diameter >10 µm). Selain itu, hifa juga dapat menyerap air. Hanya pori kurang dari 20 µm dapat diisi air pada kapasitas lapang dengan kandungan liat 70 % (O'Kefee & Sylvia 1992). Smith et al. (2003) menyatakan bahwa simbiosis CMA dengan tanaman dapat menyediakan jalur dominan penyediaan P tanaman.
23
Serapan P oleh hifa sangat dipengaruhi oleh jarak dan kualitas hifa. Semakin dekat hifa terhadap sumber P, maka serapan P semakin tinggi demikian pula hifa yang matang akan lebih mampu menyerap P dibandingkan dengan hifa belum matang. Bago (2004) menyatakan bahwa morfogenesis, arsitektur, percabangan,
struktur
penyerapan,
dan
sporulasi
miselia
ekstraradikal
dipengaruhi oleh senyawa kimia dalam medium. Respons ditimbulkan dengan adanya PO4 3- sama dengan respons yang ditumbuhkan pada medium agar murni, yaitu hifa jelajah (hifa runner) meluas secara radial di sekitar koloni. Sedangkan adanya NO3- akan menambah jumlah hifa runner meningkatkan percabangan struktur penyerapan, meningkatkan jumlah spora dan derajat kebasaan. Pemberian NH4 + berlebih menyebabkan penurunan sporulasi, dan induksi perubahan morfologi. Peningkatan ketersediaan P organik kemungkinan berkaitan dengan produksi fosfatase asam dan alkalin CMA di rhizosfir maupun hifosfer yang diinokulasi G. mosseae (Tarafdar & Marschner 1994). Namun pada medium yang diinokulasi G. caledonium dan G. inverinaium dengan penambahan 1 % bahan organik tidak terjadi peningkatan fosfatase. Hifa eksternal CMA dapat menghasilkan fosfatase yang berperan dalam mineralisasi P organik secara langsung (Joner & Johansen 2000) ataupun tidak langsung (Joner et al. 1995). Hasil penelitian Joner & Johansen (2000) me nunjukkan bahwa hifa eksternal Glomus intraradices dan Glomus claroideum mampu menghasilkan fosfatase. Mekanisme transport senyawa P dalam CMA atau mekanisme efluks P pada cendawan masih belum banyak diketahui. Pi dan P organik (seperti polifosfat) melalui aliran sitoplasma dibawa dalam cendawan atau dengan aliran bongkahan ke akar tanaman dari hifa eksternal yang terdapat di tanah. Menurut Smith & Read (1997) fosfat dimasukkan ke dalam vakuola dan diubah menjadi polifosfat oleh polifosfat-kinase dan ditransport ke interfase simbiotik. Pi adalah bentuk utama efluks cendawan melewati membran interfase, dan membran ini merupakan kunci translokasi P cendawan ke inang (Jakobsen et al. 1992).
Tanaman
bermikorhiza mengalami peningkatan serapan N khususnya pada tanah dengan tingkat hara rendah (Cruz et al. 2004). Perubahan atau kenaikan kapasitas serapan hara tergantung pada perubahan morfologi akar.
24
C. Kultur Aksenik CMA secara in vitro Kultur aksenik CMA adalah kultur CMA tidak terkontaminasi mikroba lain disebut biakan murni dan atau steril (Abercrombie et al. 1993, Anonimus 2006 a). Di Indosesia teknik tersebut belum dikembangkan, sehingga inovasi produksi CMA asli Indonesia perlu dilakukan. Kultur aksenik merupakan salah satu inovasi untuk meningkatkan kualitas produksi spora, maupun spora CMA yang dihasilkan. Produksi spora masal kultur aksenik in vitro umum menggunakan inang akar rambut, tetapi juga dapat dilakukan dengan eksplan tanaman untuk penyediaan inokulum, dan teknik tersebut berpotensi dikembangkan (Becard & Piche 1992, Becard & Fortin 1988, Dalpe & Declerck 2002). Tidak semua CMA dapat dikembangkan dengan kultur tersebut, namun pada umumnya Glomus dan Gigaspora, Acaulospora rehmii (Dalpe & Declerck 2002) dan Scutellospora (de-Souza 2005). Kultur aksenik secara in vitro dengan menggunakan akar rambut dapat digunakan sebagai alat penyederhanaan dalam mempelajari tahapan CMA bersimbiosis. Fortin et al. (2002) menyatakan bahwa akar rambut telah digunakan sebagai terobosan baru ke arah interaksi langsung CMA dan jasad renik tanah, pengambilan bahan nutrisi oleh CMA (Jolicoeur 2002, Bago et al. 2000, Toussaint 2002), meningkatkan produksi CMA dan propagul (Jolicoeur 1999). Pada umumnya percobaan secara in vitro dilakukan dengan menggunakan akar rambut wortel (Becard & Fortin 1988), akar rambut arbei (Nuutile et al. 2001) dan tomat (Khaliq & Bagyaraj et al. 2000). Untuk kultur aksenik CMA diperlukan informasi tentang beberapa hal yang berpengaruh terhadap kultur aksenik yaitu sterilisasi spora, dan produksi spora CMA in vitro.
C.1. Sterilisasi spora CMA Hal penting dalam perbanyakan spora secara in vitro di antaranya adalah sterilisasi spora. Ada beberapa tahap penting dalam pelaksanaan sterilisasi spora, di antaranya jenis sterilan, sumber spora dan teknik sterilisasi. Sumber spora umum diperoleh dari kultur pot terbuka, sehingga kontaminasi mikroorganisme lain sangat tinggi. Hal tersebut menyebabkan permukaan spora harus disterilkan.
25
Fortin et al. (2002) menyatakan bahwa sterilisasi permukaan spora sangat penting untuk keberlanjutan pertumbuhan dan perkembangan spora secara in vitro, atau penyediaan kultur aksenik CMA. Pada umumnya penggunaan bahan sterilan dari beberapa metode memberikan hasil kurang memuaskan. Hal ini ditunjukkan oleh tingkat kontaminasi sangat tinggi. Dalam waktu singkat hampir semua kultur terkontaminasi oleh bakteri. Frances et al. (1996) memperlihatkan permukaan spora belum disterilisasi memberikan kenampakan permukaan berlendir, membentuk pupil atau tonjolan mengkilat diindikasikan bakteri. Bakteri tersebut menempel di permukaan spora, namun ada beberapa bakteri yang tinggal di dalam dinding spora. Kondisi ini menyebabkan sulit memperoleh spora steril. Will & Sylvia (1990) melaporkan bahwa organisme yang berhubungan dengan permukaan spora CMA dapat saling merangsang, dapat pula menghalangi dan atau menunda perkecambahan spora. Pada prinsipnya sterilisasi dilakukan untuk membersihkan permukaan spora, dilanjutkan dengan membunuh mikroba dalam epidermis CMA dengan antibiotik. Namun ada beberapa sterilan menggunakan perlakuan menekan terjadinya dormansi spora. Buce et al. (2000) menggunakan MgSO4 .7H2 O 0,1 % dan Tween 20 steril untuk sterilisasi permukaan spora. MgSO4 .7H2 O berfungsi mencegah dormansi spora (Frances et al.1996). Menurut Fortin et al. (2002) Tween 20 berfungsi pelembut spora, sehingga
antibiotik berfungsi sebagai
pembunuh organisme pencemar dengan baik. Antibiotik streptomisin sering digunakan untuk membunuh bakteri Gram negatif. Antibiotik lainnya adalah penisilin pembunuh bakteri Gram positif, gentamisin dan tetrasiklin mempunyai spektrum lebih luas berfungsi pembunuh kuman bersifat Gram negatif maupun positif dan kemoterapi. Banyak jenis antibiotik yang digunakan diharapkan fungsi antibiotik semakin luas. Di dalam proses sterilisasi perlu dipertimbangkan beberapa hal, di antaranya karakteristik spora bergantung pada jenis CMA. Karakteristik tersebut meliputi permukaan dan ketebalan dinding spora (Frances et al. 1996). Sterilisasi spora dapat mempengaruhi perkecambahan spora, baik menghambat maupun mematikan, terjadi pecahnya spora dan spora kosong. de-Souza & Declerck
26
(2003) menyatakan bahwa kegagalan perkecambahan mungkin disebabkan kerusakan tabung perkecambahan atau fisiologi CMA, misalkan spora belum matang, juga kemungkinan faktor lingkungan kurang mendukung. Di samping itu adanya pengaruh bahan kimia digunakan untuk sterilisasi dan lama waktu sterilisasi kurang tepat, sehingga dapat mempengaruhi tabung perkecambahan dan akhirnya spora tidak mampu berkecambah. Bahan kimia adalah salah satu faktor yang dapat menghambat perkecambahan (Giovanetti et al. 1993, Bianciotto & Bonfante 1993). Diop et al. (1994) menyatakan bahwa konsentrasi Zn dan Mg di dalam media agar menghambat perkecambahan spora. Di satu sisi kehadiran eksudat tanaman sangat diperlukan, karena bersifat kemoatraktif terhadap hifa CMA.
C.2. Produksi CMA in vitro Produksi CMA in vitro menggunakan kultur ga nda yaitu media MM dan MSR, pada umumnya inang yang digunakan akar rambut wortel. Banyak faktor mempengaruhi produksi CMA in vitro. Jenis CMA, karena tidak semua CMA dapat dikultur in vitro, sampai saat ini yang sudah dapat dikultur in vitro pada umumnya Glomus, Gigaspora dan Acaulospora rehmii (Dalpe & Declerck 2002) dan Scutellospora (de-Souza 2005). Produksi spora dapat terjadi apabila kedua simbion sudah membentuk asosiasi mantap dan stabil. Asosiasi tersebut diawali dengan spora berkecambah, hifa dapat berkembang dengan baik, terbentuk arbuskula dan vesikula. Terbentuknya struktur organ tersebut sebagai ciri spesifik suksesnya simbiosis antara inang dan CMA (Dalpe & Declerck 2002). Akhirnya dapat dikatakan bahwa simbiosis telah terjadi dan stabil, CMA dapat berkembang maka produksi spora CMA bisa diperoleh. G. margarita memproduksi banyak spora dewasa per tahun, spora pertama diproduksi setelah 2 bulan. Rata-rata produksi 3 spora baru Gigaspora margarita setelah 2 bulan, Diop et al. (1992), Wideman & Watrud (1984) menggunakan tanaman tomat sebagai inang, diinokulasi sebanyak 10 butir spora berkecambah G. margarita. Cendawan secara langsung mengubah material biotropik melalui intraradikal. Studi menunjukkan bahwa sistem kultur akar merupakan metode menghasilkan inokulum CMA bersih dari kontaminan. Dengan hanya 3 spora
27
sebagai inokulum, akar terinfeksi
tinggi dan menghasilkan 450 spora G.
margarita dalam 30 ml medium. Produksi spora sistem in vitro menghasilkan spora sangat banyak, pertumbuhan akar lebih aktif jika nutrisi dalam kultur dikurangi (miskin). Oleh sebab itu penting sekali dibuat suatu sistem untuk meningkatkan produksi inokulum CMA (Douts & Schenk 1990). Perkecambahan spora terlihat setelah 2 minggu inokulasi. Kolonisasi akar rambut wortel dan tomat terlihat setelah 40 hari, dan kolonisasi akar wortel lebih tinggi apabila dibandingkan dengan kolonisasi tomat, dan meningkat cepat antara hari ke 36–72 hari dan mencapai 2,5 % - 3,35 % (Klironomos & Hart 2002). Selain itu ditemukan juga konsentrasi fosfat rendah (22:7), tetapi dapat memacu proses simbiosis, sedang dengan P awal tinggi dapat menghambat pembentukan mikorhiza, dengan kata lain konsentrasi P awal dalam media merupakan faktor penentu proses simbiosis. Peranan fosfat dalam simbiosis CMA masih belum jelas, ketersediaan P lebih rendah dalam medium dan pengambilan sangat cepat, diduga awal penetapan simbiosis. Selanjutnya konsentrasi N, sukrosa, fosfat dan Na2 SO4 di dalam sistem in vitro infeksi CMA mengalami penurunan. Pengaruh pengurangan unsur-unsur tersebut akan meningkatkan produksi eksudat akar rambut, sebagai faktor petunjuk terbentuknya simbiosis lebih luas. Namun demikian eksudat akar juga dapat merangsang percabangan hifa CMA (Nagashi & Douds 2000). Eksudat akar hidrofobik, fosfat rendah dapat merangsang pertumbuhan hifa sebelum terjadinya kolonisasi (Nagahashi 2000). Tahir (2003)
menyatakan bahwa
produksi spora CMA secara in vitro mempunyai prospek penting
untuk
mendapatkan spora dan propagul steril. Medium digunakan adalah medium kultur ganda, yaitu media pertumbuhan dan
perkembangan
dua
organisme
berbeda
(makroorganisme
dan
mikroorganisme) dan bersimbiosis. Konsep dasar kultur ganda adalah kultur dapat dipakai untuk pertumbuhan dua jenis organisme, dalam hal ini CMA yang bersifat obligat, dan inang adalah akar rambut dan atau tanaman lain. Diop et al (1994) menyatakan bahwa media kultur ganda digunakan untuk perkecambahan CMA yaitu media miskin dan konsentrasi unsur P sangat rendah yaitu 4,8 mg/l, sedang media al in rata-rata lebih dari 600 mg/l. Diop et al (1994) menyatakan bahwa
28
media kultur ganda adalah media miskin untuk perkecambahan CMA. Ada dua macam media kultur ganda yaitu MM (Becard & Fortin 1988), dan MSR (Strullu & Romand 1986). Sedang Strullu & Romand (1986) menyatakan bahwa kultur ganda adalah medium yang digunakan untuk perkembangan CMA in vitro dengan kadar P 44 mg/l. Faktor yang berpengaruh dalam kultur ganda, seperti kultur umumnya, yaitu komposisi nutrisi media, jenis media, cahaya dan suhu. Jenis medium berpengaruh nyata terhadap induksi akar rambut (Giri & Narasu 2000).
D. Enkapsulasi spora Enkapsulasi spora adalah spora dibungkus dengan Na-alginat atau sodium alginat. Maggies et al. (2005) menyatakan bahwa mikroenkapsulasi adalah suatu pendekatan alternatif gen terapi. Sel genetikal dimasukkan ke dalam mikrokapsul untuk pengiriman produk obat rekombinasi efektif untuk manusia. Umumnya mikrokapsul menggunakan alginat dimasukkan dalam zat kapur. Anonimus (2006 c) menyatakan bahwa alginat dihasilkan dari tanaman hidup di laut dalam atau ganggang cokelat. Fungsi utama alginat adalah sebagai agen gelasi. Beberapa jenis ganggang cokelat menghasilkan alginat antara lain Microcystis pyryfera dan Ascophyllum nodosum berasal dari lautan Atlantis Utara dan Selatan. Struktur ganggang penghasil alginat berbentuk linier tidak bercabang, bersifat polimer berisi ß-1 asam D- mannuronic 4 (M) dan a-1 asam L-guluronic 4(G). Calvet et al. (1996) menyatakan bahwa sodium alginat digunakan untuk pengemasan dan penyimpanan mikroorganisme termasuk Glomus mosseae dan Glomus intraradices. Dalam percobaan digunakan sodium alginat 2 %. Setelah diinkubasi pada suhu 25
o
C selama 4 hari dapat berkecambah. Pengamatan
perkecambahan dengan membuka lapisan sodium alginat di bawah mikroskop binokuler. Persentase perkecambahan 44 % untuk G. mosseae dan 28 % untuk G. intraradices. Spora enkapsulasi diujikan pada tanaman bawang Bombay diperoleh spora infektif dan kolonisasi akar G. mosseae sebanyak 35,8 % ± 20,5 % sedang G. intraradices 13,3 % ± 6 %. Hasil tersebut disimpulkan bahwa spora terbungkus dalam sodium-alginat 2 % digunakan sebagai sumber inokulum dan sodium-
29
alginat tidak menghambat perkecambahan cendawan mikorhiza arbuskula, khususnya G. mosseae dan G. intraradices (Calvet 1996). Keuntungan Na alginat sebagai pengemas spora cendawan mikorhiza arbuskula di antaranya (i) material carrier (pembawa) berbobot masa rendah, (ii) spora terlihat jelas dalam pembungkus, (iii) melindungi propagul (akar yang terinfeksi hifa) dan bahan mudah larut, (iv) pengemasan dan transportasi lebih mudah (Giovanetti & Mosse 1980).
BAB IV Pengembangan Teknologi Akar Rambut Beberapa Tanaman Secara In Vitro ABSTRAK Teknologi akar rambut pada umumnya dimanfaatkan untuk perbanyakan dan perkembangan CMA in vitro, namun di Indonesia belum dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan (1) tanaman yang mampu menginduksi akar rambut, (2) medium terbaik untuk pertumbuhan akar rambut kentang dan wortel, (3) pertumbuhan akar rambut yang mampu tumbuh dengan baik dalam medium kultur ganda, dan (4) konfirmasi hasil T-DNA A. rhizogenes pada akar rambut tanaman uji. Percobaan menggunakan tanaman jagung, sorghum, kentang Granola, kentang Atlantik dan wortel diinfeksi A. rhizogenes galur LBA 9457. Eksplan dik ulturkan dalam medium MS, B5 dan White tanpa penambahan zat pengatur tumbuh. Kultur diinkubasi dalam ruang gelap. Percobaan menggunakan Rancangan Acak Lengkap Faktorial, dengan ulangan lima kali. Integrasi T-DNA A. rhizogenes dalam akar rambut tanaman uji dianalisis dengan primer spesifik TL dan TR dengan PCR. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa pertumbuhan akar rambut paling baik tanaman wortel dikulturkan pada medium White, dapat beradaptasi pada medium modifikasi minimal MM. Uji integrasi T-DNA menunjukkan bahwa masing- masing akar rambut teramplifikasi TL dan TR-DNA pada ukuran basa 780 pb TL dan TR 1600 pb. Disimpulkan bahwa akar rambut wortel berpotensi untuk digunakan sebagai inang perbanyakan dan perkembangan CMA G. margarita dan A. tuberculata in vitro. ----------------------------Kata kunci : Akar rambut, Agrobacterium rhizogenes, Gigaspora margarita, Acaulospora tuberculata, kultur in vitro, kultur ganda, Daucus carota, Solanum tuberosum, sorghum, Zea mays.
The development of hairy root technology of several plants through in vitro culture Abstract Hairy root technology have been used for propagation and development of sterile AMF. However, hairy root technique for mass production of AMF has not developed yet in Indonesia. The objectives of this study are (i) to find the host plant that produce hairy root, (ii) to formulate the appropriate medium for supporting the growth of hairy root of potato and carrot, (iii) to observe the growth of hairy root able to grow well in dual culture, (iv) to confirm the integration of T-DNA of A. rhizogenes LBA 9457 on hairy root tested plants. Plants used in this study are Zea mays, sorghum, Granola potato, Atlantic potato
31
and carrot infected by A. rhizogenes strain LBA 9457. Explants were cultured on MS, B5, and White medium without the addition of growth hormones, and incubated in dark culture room. Completely Randomized Design were used in these experiments with five replications of each treatment. Hairy root with the best performance were cultured in minimum medium (MM), so that medium MSR for dual culture. The integration of T-DNA of A. rhizogenes on hairy root of tested host plants was analyzed by TL and TR primer by PCR. The result showed that carrot cultured on the White medium gave the best growth of hairy root. Carrot hairy root is the most adaptable on minimum medium (MM). Confirmation test of insertions of A. rhizogenes T-DNA found that there are two bands of DNA with base size of 1600 bp TR and 780 bp TL. It showed that TL and TR DNA from A. rhizogenes have well integrated in hairy root. This research suggested that carrot hairy root can be further developed on AMF host in vitro, especially for G. margarita and A. tuberculata. --------------------------Keys words : Hairy root, Agrobacterium rhizogenes, Gigaspora margarita, Acaulospora tuberculata, dual culture, in vitro- culture, Daucus carota, Solanum tuberosum, sorghum, Zea mays.
1. PENDAHULUAN
Akar transforman merupakan salah satu hasil teknologi kultur jaringan, dan hasil induksi T-DNA A. rhizogenes yang dapat mengekspresikan pembentukan akar rambut (Giri & Narasu 2000). Perpindahan T-DNA A. rhizogenes ke dalam sel tanaman, ditandai dengan pembentukan dan pertumbuhan akar rambut yang cepat disebut dengan hairy root (Downs et al. 1994, Frugis et al. 1995), dan ekspresi onkogen plasmid Ri memacu terbentuknya akar adventif (hairy root) pada tempat terinfeksi (Nillson & Olsson 1997). A. rhizogenes merupakan
bakteri gram negatif masuk dalam kelompok
Rhizobiaceae. Bakteri ini hidup di tanah, bersifat aerobik, tidak membentuk spora, motil dan berbentuk batang.
Organisme tersebut mempunyai kemampuan
mentransfer sebagian DNA (T-DNA dari plasmid Ri) ke dalam genom tanaman melalui pelukaan (Nillson & Olsson, 1997). T-DNA plasmid Ri terdiri dari dua bagian yaitu daerah TL dan TR. TR-DNA mengandung gen untuk biosintesis auksin dan gen untuk sintesis opin yaitu asam amino derivatif yang tidak ditemukan pada jaringan normal (tanpa inokulasi A. rhizogenes). TL-DNA mengkode satu set gen lokus akar yaitu gen rol A, rol B, dan rol C (Ooms 1992, Frugis et al. 1995).
32
Gen tersebut penyandi hormon pertumbuhan auksin dan sitokinin. Apabila onkogen terekspresi maka terjadi pertumbuhan sel yang sangat cepat, sehingga mencirikan pembentukan akar adventif pada tempat yang diinfeksi (Nillson & Olsson 1997). Akar tersebut bersifat otonomi terhadap fitohormon. Gen tersebut selalu ditemukan dalam akar tanaman yang ditransformasi oleh Agrobacterium, sedang TR-DNA yang mengkode biosintesis opin dan auksin
tidak selalu
ditemukan pada akar transforman (Nasir 2002, Christey & Braun 2004). Christey & Braun (2004) menyatakan bahwa sedikitnya ada tujuh langkah dalam proses transfer molekul T-DNA dari sel Agrobacterium ke sel tanaman, yaitu (1) pengenalan sel tanaman yang rentan (2) induksi ekspresi gen vir, (3) produksi kopy T-DNA yang dapat ditransfer, (4) transfer kompleks T-DNA ke membran bakteri, (5) transfer kompleks T-DNA melalui membran bakteri dan sitoplasma tanaman, (6) transfer kompleks T-DNA melalui sitoplasma tanaman dan membran inti, terakhir integrasi elemen T-DNA kedalam genom inti tanaman. Keberhasilan integrasi
T-DNA pada sel tanaman dapat diuji dengan
menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) yaitu suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro (Handoyo & Ruditerna 2000, Bourgaize et al. 2000, Mondal et al. 2001). Toruan-Mathius
et
al.
(2004)
melaporkan bahwa tanaman kina C. ledgeriana dan C. succirubra mampu membentuk akar rambut melalui eksplan daun yang dilukai dan diinfeksi dengan A. rhisogenes galur LBA 9457. Eksplan yang mampu membentuk akar rambut berkembang baik dalam medium Murashige & Skoog (1962) tanpa penambahan zat pengatur tumbuh. Akar rambut mempunyai keunggulan dalam beberapa karakter penting, seperti morfologi, kapasitas pertumbuhan, dan struktur biokimianya, sehingga banyak digunakan sebagai inang CMA dalam kultur aksenik (Tanaka 1997). Akar rambut banyak digunakan dalam mempelajari proses simbiosis dan perkembangan CMA obligat. Fortin et al. (2002) menyatakan bahwa akar rambut merupakan alat untuk mempelajari tahapan simbiosis CMA. Sejak pertengahan 1980 akar rambut digunakan untuk mempelajari kultur CMA secara in vitro, interaksi CMA dan jasad renik (Filion et al. 1999), di samping itu kultur akar rambut juga digunakan untuk mempelajari penyerapan nutrisi CMA (Jolicoeur et
33
al. 2002, Bago et al. 2000, Toussains 2002). Jolicoeur et al. (1999) menyatakan bahwa CMA yang dikembangkan dalam kultur akar rambut in vitro
dapat
meningkatkan propagul. Pada
umumnya
penelitian pengembangan
CMA
secara
in
vitro
menggunakan akar rambut (Becard & Fortin 1988, Nuutile et al. 2001, Khaliq & Bagyaraj 2000). Boisson-Sernier et al. (2001) menyatakan akar rambut Medicago trunculata digunakan untuk mempelajari asosiasi antara CMA dan Rhizobium. Selain itu kultur akar rambut juga dapat diamplifkasi sebagai inang
untuk
menghasilkan protein asing seperti anti bodi (Wongsamuth & Doran 1997). Giri & Narasu (2000) menyatakan bahwa ada beberapa faktor yang mempengaruhi pertumbuhan dan biomasa kultur akar rambut, antara lain komposisi nutrisi di dalam medium, jenis medium, jenis tanaman dan faktor fisik seperti suhu, dan cahaya. Ernawati (1990) melaporkan bahwa peningkatan konsentrasi sukrosa sampai 6 % dapat meningkatkan produksi senyawa anti jamur pada kultur akar rambut Polygonum tinchorium.Ait. Selain itu juga diperoleh media terbaik merangsang pertumbuhan akar rambut P. tinchorium.Ait., dengan media dasar MS, demikian juga bobot kering dan antosianin yang dihasilkan. Tidak semua tanaman memberikan respons terhadap T-DNA dari A. rhizogenes, karena proses terakumulasinya T-DNA A. rhizogenes pada tanaman merupakan
suatu
proses
yang
sangat
kompleks.
Banyak
faktor
yang
mempengaruhi, di antaranya eksplan yang akan diinokulasi, jenis tanaman, media dan jenis bakteri yang digunakan, serta lingkungan abiotik dan biotik (Aneloi 2004, Reflini 2002). Tujuan penelitian adalah untuk mendapatkan (i)
tanaman inang yang
mampu membentuk akar rambut, (ii) medium terbaik untuk pertumbuhan akar rambut kentang dan wortel, (iii) medium kultur ganda terbaik untuk pertumb uhan akar rambut kentang Granola dan wortel, dan (iv) konfirmasi hasil T-DNA A. rhizogenes pada akar rambut tanaman yang diuji.
34
2. BAHAN DAN METODE
Penelitian dilakukan di Laboratorium Biomolekuler dan Rekayasa Genetik, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia dan Laboratorium Fisiologi Tumbuhan, Jurusan Biologi FMIPA Institut Pertanian Bogor dari bulan Juni 2003–Desember 2003. Penelitian terdiri dari beberapa percobaan, yaitu (1) seleksi tanaman inang yang mampu membentuk akar rambut, (2) seleksi media pertumbuhan akar rambut (3) pertumbuhan akar rambut dalam medium modifikasi minimal (kultur ganda), dan (4) uji konfirmasi T-DNA A. rhizogenes
2.1. Seleksi tanaman inang membentuk akar rambut Bahan tanaman yang digunakan adalah jagung, sorghum, kentang Granola, kentang Atlantik dan wortel. Benih jagung, sorghum dan wortel disterilkan dengan alkohol 70 % 3 menit dan Bayclin 30 % (NaOCl2,1,56 %), selama 5 menit, kemudian dicuci dengan akuades steril. Benih dikecambahkan di dalam cawan Petri berisi kertas saring steril yang dilembabkan dengan akuades steril, dan digunakan setelah kecambah umur dua minggu. Selanjutnya lima kecambah dari masing- masing tanaman dik ulturkan dalam botol berisi medium MS. Kultur diinkubasi dalam ruang bercahaya 75-100 luks 12 jam/hari, Rh 80-90 %, dan suhu 26 o C. Untuk bahan tanam kentang Granola dan Atlantik digunakan planlet berumur 1-2 bulan berasal dari Lab. Kultur Jaringan jurusan Agronomi IPB. Secara rutin setiap 1 bulan kultur diremajakan melalui penggandaan tunas aksilar dalam medium MS dengan penambahan 0,1 mg/l kinetin. Sebelum A. rhizogenes galur LBA 9457 diinokulasikan, terlebih dahulu diperbanyak dengan dikulturkan dalam medium suspensi YMB (Lampiran 2) dan dikocok menggunakan mesin pengocok dengan kecepatan 100 rpm (12 jam/hari) (Sambrook et al. 1989). Kultur ditempatkan dalam ruang kultur bercahaya 12 jam /hari, suhu 26 o C Rh 80-90 %. Kultur berumur 48 jam siap digunakan untuk inokulasi tanaman uji. Inokulasi A. rhizogenes
terhadap tanaman uji dilakukan dengan cara
melukai jaringan batang tanaman dengan pisau bedah steril, kemudian dipotongpotong sepanjang 2 cm dan dikokultivasi selama 1 jam dalam suspensi bakteri.
35
Setelah dikeringkan di atas kertas saring steril, sebanyak tiga potong dari masingmasing tanaman dik ulturkan dalam medium Murashige dan Skoog (MS), B5 dan White (Lampiran 1), dengan penambahan 100 mg/l ampisilin. Respons tanaman terhadap A. rhizogenes ditentukan berdasarkan terbentuk tidaknya akar rambut dan waktu inisiasi terbentuknya akar rambut.
2.2.Seleksi media pertumbuhan akar rambut dari tanaman yang merespons A. rhizogenes Akar rambut yang terbentuk pada percobaan (1) dipotong sepanjang 2 cm dan dikulturkan dalam medium yang sama dengan percobaan (1). Akar rambut yang pertumbuhan dan regenerasinya paling baik, tidak
terpengaruh dengan
subkultur, mempunyai percabangan akar yang banyak, dan mampu beradaptasi pada media modifikasi minimal (MM) (Becard & Fortin 1988) akan digunakan sebagai inang CMA secara in vitro. Peubah yang diamati pada pengaruh medium dan jenis tanaman terhadap pertumbuhan akar rambut adalah berat kering akar rambut pada umur 6 minggu setelah dik ulturkan, serta penampakan akar rambut secara visual.
2.3. Pertumbuhan akar rambut dalam medium minimal (kultur ganda) Setelah diperoleh pertumbuhan akar rambut yang terbaik dari percobaan (II), diadaptasikan pada medium modifikasi minimal (MM) (Becard & Fortin 1988). ujung akar rambut dipotong sepanjang 2 cm, sebanyak 3 potong kemudian dikulturkan pada cawan Petri. Pengamatan dilakukan pada umur 0,3 dan 6 minggu setelah kultur, masing- masing pengamatan diulang sebanyak sepuluh kali. Peubah yang diamati adalah berat kering akar rambut dan visual akar. Data yang dikumpul adalah rerata berat kering/mg sampel pada setiap umur pengamatan.
2.4. Uji konfirmasi integrasi T-DNA A. rhizogenes. Uji konfirmasi T-DNA menggunakan analisis PCR, terdiri atas beberapa tahapan, yaitu : 1) isolasi DNA plasmid A rhizogenes, 2) isolasi DNA tanaman yang merespons T-DNA A rhizogenes dan akar rambut.
Uji konfirmasi
transformasi dengan PCR terdiri atas beberapa tahap yaitu isolasi DNA plasmid A.
36
rhizogenes, isolasi DNA tanaman uji in vitro dan DNA akar rambut tanaman uji, penetapan kualitas dan kuantitas DNA dengan elektroforesis, dan uji DNA dengan PCR. Kontrol positif digunakan DNA plasmid A. rhizogenes galur LBA 9457. DNA tanaman yang tidak diinokulasi dengan A. rhizogenes digunakan sebagai kontrol negatif, dan DNA uji adalah DNA akar rambut. DNA Plasmid A. rhizogenes diisolasi menggunakan modifikasi metode Sambrook et al. (1989). Sedang isolasi DNA tanaman dan akar rambut kentang Granola, kentang Atlantik dan wortel diisolasi menggunakan modifikasi metode Orozco-Castillo et al. (1994). (Lampiran 3, 4). Untuk deteksi TL-DNA digunakan pasangan primer rol B1 (5'ATGGATCCAAATTGCTATTCCCCACGA3') dan rol B2
(5'TTAGGCTTTCATTCGGGTTTACTGCAGC3').
primer
TR1
Sedangkan
(5'GGAAATTGTGGCGTTGTTGTGGAC3')
(5'AATCGTTCAGAGAGCGTCCGAAGTT3')
digunakan
pasangan
dan untuk
TR2 deteksi
TR-DNA (Ermayanti et al. 2000).
Isolasi DNA Plasmid A. rhizogenes Isolasi DNA plasmid dilakukan dengan modifikasi metode Sambrook et al (1989). Satu mata ose isolat A. rhizogenes galur LBA 9457 murni, dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 100 ml yang berisi 50 ml medium YMB (komposisi dalam Lampiran 3) dan diletakkan pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 100 rpm selama 48 jam. Kultur dituang ke dalam tabung Eppendorf 2 ml dan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit sehingga terbentuk pelet. Pelet dilarutkan dengan 500 µl bufer TE dan 50 µl lisozim 10 mg/ml. Campuran dikocok selama 5 menit dan diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 1 jam. Selanjutnya campuran ditempatkan di dalam penangas air selama 1-2 menit, lalu dimasukkan ke dalam air es beberapa saat. Ke dalam campuran ditambahkan 50 µl SDS 10 % dan dikocok perlahanlahan sampai sel-sel lisis dan terlihat berlendir. Campuran lalu disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 30 menit pada suhu ruang. Supernatan yang terbentuk dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf yang baru dan ke dalamnya ditambahkan 2-3 x volume etanol absolut dingin. Untuk memurnikan DNA ke
37
dalam campuran ditambahkan 0,1 volume Na-asetat 3 M dan disimpan pada suhu -20 oC selama 30 menit. Selanjutnya campuran disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit sehingga terbentuk pelet DNA. Pelet DNA dicuci dengan alkohol 70 %, dikeringkan dengan vakum, dilarutkan dengan akuades steril dan
ditambah 10 µl RNAase 10 mg/ml. Campuran dihomogenkan,
selanjutnya diinkubasi pada 37 o C selama 1 jam. Untuk pemurnian ditambahkan 0,1 x volume Na-asetat dan 2,5 x volume etanol absolut. Campuran dihomogenkan dan disimpan pada -20
o
C
selama 30 menit, kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit. Selanjutnya supernatan dibuang, dan pelet DNA dicuci dengan alkohol 70 % dikering anginkan. Pelet dilarutkan dengan akuabides steril dan disimpan pada suhu -20 o C. Kemudian pelet dikeringkan dan dilarutkan dalam bufer TE pH 8.0. DNA yang diperoleh digunakan untuk pengujian PCR. Isolasi DNA tanaman
dan
akar rambut
dilakukan dengan menggunakan modifikasi metode Orozco-Castillo et al. (1994) (Lampiran 4).
Penetapan Kuantitas dan Kualitas DNA Penetapan
kuantitas (konsentrasi) dan kualitas DNA dapat dilakukan
dengan cara elektroforesis menurut Sambrook et al. (1989). Uji Kualitas dan kuantitas DNA dilakukan dengan menggunakan larutan DNA contoh sebanyak 2 µl dilarutkan dengan 8 µl akuades steril dan ditambah 2 µl loading buffer, kemudian dikocok perlahan sampai merata. Kuantitas dan kualitas DNA dapat ditentukan dengan cara elektroforesis menggunakan gel agarose 1 % (b/v). Pembuatan gel agarose dilakukan dengan melarutkan 0,4 g agarose ke dalam 30 ml larutan TAE 1x dengan pemanasan dalam microwave selama
1
menit. Larutan agarose diinkubasi pada suhu 65 o C selama 30 menit dan ditambah 1,5 µl etidium bromida. Setelah itu dikocok perlahan hingga larut dan dituang ke dalam cetakan gel. Gel akan memadat setelah 1 jam lalu dimasukkan ke dalam bak elektroforesis. Larutan TAE 1x dimasukkan ke dalam bak elektroforesis sampai seluruh gel terendam. Elektroforesis DNA dilakukan dengan memasukkan 12 µl larutan DNA ke dalam sumur gel. Elekroforesis dijalankan pada tegangan 50 V selama 1,25 jam. Hasil elektroforesis diamati dengan UV transluminator.
38
Uji Konfirmasi DNA dengan PCR Amplifikasi DNA dilakukan dengan teknik PCR menggunakan modifikasi metode Aoki et al. (1997). Sebelum melakukan PCR, terlebih dahulu dibuat campuran utama (master mix) (Lampiran 5 b). Masing- masing contoh DNA sebanyak 2 µl (100 ng) di masukkan ke dalam tabung Eppendorf volume 500 µl dan ditambahkan ke dalamnya 23 µl master mix, dan dikocok perlahan-lahan. Untuk mencegah terjadinya penguapan ditambahkan 23 µl minyak mineral. Tabung-tabung tersebut selanj utnya dimasukkan ke dalam blok-blok pada alat Thermal Cycler. Suhu dan lamanya pemanasan dibagi menjadi tiga tahap, yaitu tahap
denaturasi
pada
suhu 94 o C selama 1 menit, tahap annealing pada
suhu 55 o C selama 1 menit dan tahap ekstension pada suhu 72 o C selama 2,5 menit. Seluruh reaksi dilakukan sebanyak 35 siklus reaksi. Hasil PCR difraksinasi dengan elektroforesis menggunakan 0,8 % (b/v) gel agarose yang mengandung 2,5 µl etidium bromida 1 % di dalam bak elektroforesis yang berisi 1x bufer TAE dengan kondisi arus 36 mA dan 50 volt selama kurang lebih 1 jam. Sebagai marker digunakan DNA 1 Kb Ladder. DNA hasil elektroforesis divisualisasikan di atas UV transluminator dan untuk dokumentasi dilakukan pemotretan dengan menggunakan film polaroid 665. Pengamatan dilakukan dengan melihat adanya pita DNA dari akar rambut yang mempunyai ukuran molekul yang sama dengan TR dan TL-DNA plasmid
A.
rhizogenes pada gel elektroforesis hasil PCR. Amplifikasi ditambah 5 µl loading bufer dan difraksinasi menggunakan elek troforesis yang berisi 1 x bufer TAE pada arus 36 mA dan 50 volt selama kurang lebih 1 jam. Standar yang digunakan adalah DNA 1 kb Ladder.
39
3. HASIL
3.1. Seleksi tanaman inang membentuk akar rambut Respons kelima jenis eksplan yang digunakan terhadap inokulasi A. rhizogenes, menunjukkan bahwa jagung dan sorghum tidak terjadi induksi, sehingga tidak
membentuk akar rambut. Sedang eksplan kentang Granola,
kentang Atlantik dan wortel terjadi induksi, sehingga terbentuk akar rambut pada bagian yang dilukai tanpa didahului pembentukan kalus, dan akar rambut tumbuh pada ketiga medium yang digunakan (Tabel 4.1.). Tabel 4.1. Respons eksplan terhadap A. rhizogenes galur LBA 9457, dik ulturkan dalam medium MS, B5 dan White Bahan tanam Sorghum Jagung Kentang Granola Kentang Atlantik Wortel
MS - *) + + +
Jenis media B5 + + +
White + + +
Keterangan *) : - : Tidak terjadi induksi pembentukan akar rambut ; + : Terjadi induksi pembentukan akar rambut
Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa kentang Granola, kentang Atlantik dan wortel merespons A. rhizogenes dengan membentuk akar rambut. Pertumbuhan akar rambut paling cepat pada medium MS dibandingkan dengan media lain, yaitu antara 5–7 hari, dan medium lain membutuhkan waktu lebih 7 hari (Tabel 4.2.). Tabel 4.2. Waktu inisiasi pembentukan akar rambut pada eksplan kentang Granola, kentang Atlantik dan wortel pada media MS, B5 dan White. Bahan tanaman Kentang Granola Kentang Atlantik Wortel
MS 5 5 7
Media dasar (hari) B5 12 12 12
White 12 13 12
40
3.2. Seleksi media pertumbuhan akar rambut kentang dan wortel Interaksi jenis medium dan jenis eksplan terhadap berat kering akar rambut terlihat bahwa pertumbuhan paling baik tanaman wortel yang dikultur dalam medium White. Sedang berat kering akar rambut kentang Granola dan kentang Atlantik paling baik pada medium MS (Tabel 4.3., Gambar 4.1. dan 4.2.). Selanjutnya akar rambut kentang Granola dan wortel dilakukan pengujian di dalam kultur ganda (MM). Tabel 4.3. Berat kering akar rambut yang dikulturkan dalam media B5, MS, dan White umur 6 minggu setelah dikulturkan Jenis medium
Kentang Granola
Kentang Atlantik
Wortel
------------------------ mg -----------------------------------B5
5,80 e
5,26 f
8,44 d
MS
13,94 b
8,86 c
3,40 h
White
4,66 g
4,50 g
36,02 a
Keterangan*) :Huruf yang sama dalam baris yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT(P< 0,05)
Diagram pertumbuhan akar rambut (bobot kering) yang dikultur pada medium MS, B5 dan White menunjukkan bahwa akar rambut kentang Granola dan Atlantik tumbuh paling baik pada medium MS. Sedang akar rambut wortel pada medium White. Pertumbuhan ketiga akar rambut paling baik adalah wortel pada medium White (Gambar 4.1.).
40 35 30 Bobot kering 25 akar rambut 20 (mg) 15
k. Granola k. Atlantik Wortel
10 5 0 MS
B5
White
Jenis medium
Gambar 4.1. Diagram pertumbuhan akar rambut pada media MS, B5 dan White umur 6 minggu setelah kultur.
41
Hasil visua l pertumbuhan akar rambut menunjukkan bahwa, pertumbuhan
akar rambut paling baik adalah wortel yang dik ultur pada medium White, apabila dibandingkan dengan perlakuan lain, terlihat pada umur yang sama akar rambut tumbuh memenuhi cawan Petri (Gambar 4.2.). Medium MS
Medium B5
A
B
C
Medium White
A
A
B
B
C
3 cm
C
Gambar 4.2. Pertumbuhan akar rambut pada masing- masing tanaman dan medium umur 6 minggu setelah kultur. A. kentang Granola B. kentang Atlantik; C. Akar rambut wortel (perbesaran 3 x).
3.3. Pertumbuhan akar rambut kentang Granola dan Wortel pada medium kultur ganda (MM) Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa, bobot kering akar rambut wortel yang ditumbuhkan dalam medium MM lebih tinggi dibandingkan dengan akar rambut kentang Granola. Sehingga dapat dikatakan bahwa di dalam medium
42
MM pertumbuhan akar rambut kentang Granola mengalami hambatan, sedang pertumbuhan akar rambut wortel tumbuh baik (Gambar 4.3.).
100,0 90,0 80,0 70,0 Bobot kering 60,0 akar rambut 50,0 40,0 (mg) 30,0 20,0 10,0 0,0
k.Granola wortel
0
3
6
Umur (minggu)
Gambar 4.3. Diagram pertumbuhan akar rambut pada medium MM pada umur 0,3 dan 6 minggu setelah kultur
3.4. Konfirmasi T-DNA A. rhizogenes dengan teknik PCR A B Hasil elektroforesis akar rambut membentuk pita-pita DNA, selanjutnya digunakan untuk menghitung konsentrasi DNA secara kualitatif (Gambar 4.4.)
1
2
3
4
5
6
7
8
Gambar 4.4. Elektroforesis total DNA genomik akar rambut dan tanaman kentang Granola, Atlantik, dan wortel Keterangan : (1) Lamda DNA (Standar DNA), (2) plasmid A rhizogenes; (3) kentang Atlantik HR (4) planlet kentang Atlantik, (5) wortel HR, (6). planlet wortel; (7). kentang Granola HR; (8). planlet kentang Granola
3.4.1. Hasil Uji konfirmasi T-DNA dalam Akar Rambut kentang Granola, kentang Atlantik dan wortel Hasil uji konfirmasi T-DNA akar rambut kentang Granola, kentang Atlantik dan wortel, digunakan kontrol positif Plasmad A. rhizogenes, dan kontrol negatif digunakan dari tanaman uji tanpa inokulasi A. rhizogenes memberikan hasil dengan membentuk pita-pita DNA (Gambar 4.5.)
43
1 2
3
4
5
6 7
8 9 10 11 12 13
14 15 16 17 18
1600bp 780 bp
Gambar 4.5. Hasil PCR tanaman yang telah ditransformasi Keterangan:(1) Marker 1 kb DNA Ladder (2). Plasmad A. rhizogenes + primer TL, (3). Plasmid A. rhizogenes + primer TR (4). Wortel HR + TL, (5). Wortel HR + TR, (6). kentang Atlantik HR +TL (7) kentang Atlantik HR + TR (8). Tanaman wortel+TL, (9) tanaman wortel + TR (10). tanaman kentang Atlantik +TR (11). Tanaman kentang Atlantik +TL, (12) Tanaman kentang Granola+TL(13) Tanaman kentang Granola +TL, (14) Marker 1 kb DNA Ladder, (15) Plasmid A. rhizogenes + primer + TL (16) Plasmid A. rhizogenes + primer + TR (17) kentang Granola HR +TL, (18)kentang Granola HR+ TR.
Profil DNA
setelah fraksinasi
menunjukkan bahwa semua sampel
menghasilkan pola pita yang sama dengan kontrol positif (plasmid), kecuali kontrol negatif (non transforman). Berdasar pola pita terbentuk bagian T-DNA, yaitu TL-DNA dan TR-DNA telah terintegrasi pada semua akar rambut kentang Granola, kentang Atlantik dan Wortel. Bagian TL-DNA (rol B) terlihat pada hasil amplifikasi terletak pada 780 bp, sedang bagian TR-DNA (rol A) pada 1600 bp.
4. PEMBAHASAN
4.1. Seleksi tanaman inang yang mampu membentuk akar rambut Respons dari kelima jenis eksplan terhadap inokulasi A. rhizogenes, menunjukkan bahwa jagung dan sorghum tidak membentuk akar rambut. Sedang pada eksplan kentang Granola, kentang Atlantik dan wortel terjadi induksi pembentukan akar rambut pada bagian yang dilukai tanpa didahului pembentukan kalus, dan dapat tumbuh pada ketiga medium yang digunakan (MS, B5, White). agung dan sorghum tidak
memberikan respons terhadap T-DNA
A.
rhizogenes. Hal ini mungkin karena tanaman monokotil saat dilukai tidak mengeluarkan
senyawa aktif misalkan asetosiringon yang berfungsi untuk
44
menginduksi gen virulen dari A rhizogenes. Menurut Douglas et al. (1985) secara alami tanaman dilukai akan mengeluarkan senyawa yang dapat menstimulus TDNA dalam plasmid A. rhizogenes. Senyawa tersebut di antaranya, asam amino, gula, dan senyawa fenolik. Tahapan pelepasan senyawa kimia dari tanaman dan terjadinya gerak kemotoksis dari A. rhizogenes merupakan langkah awal dari infeksi (Christey & Braun 2004). Sedang tanaman wortel, kentang Granola dan Atlantik (dikotil) dapat merespons T-DNA A. rhizogenes, karena tanaman tersebut saat pelukaan dapat menghasilkan senyawa fenolik yang berfungsi merangsang gerak kemotaksis, sehingga terjadi kontak sel yaitu pelekatan plasmid A rhizogenes ke dalam sel tanaman sasaran. Pelekatan tersebut terjadi karena A. rhizogenes memiliki gen virulen tersusun pada tujuh lokus utama, yaitu vir A, vir B, vir C, vir D, vir E, vir G dan vir H (Christey & Braun 2004). Gen virulen diinduksi beberapa senyawa aktif yang disekresikan oleh tanaman yang rentan. Senyawa tersebut adalah asetosiringon, hidroksi asetosiringon, konoferil alkohol, konoferin dan etil firulat (Winans 1992). Induksi berbagai produk gen vir akan menghasilkan utas tunggal linier, yaitu T-DNA yang ditransfer ke dalam sel tanaman. Gen-gen yang tersusun di dalam T-DNA dibedakan menurut peranannya, yaitu gen yang mempengaruhi keseimbangan fitohormon bersifat endogen, dan gen memproduksi opin. Ekspresi dari gen tersebut membentuk akar rambut. Kentang Granola, kentang Atlantik dan wortel merupakan tanaman ya ng dapat merespons T-DNA A rhizogenes. Pembentukan akar rambut sebagai respons T-DNA A. rhizogenes galur LBA 5947, tidak selalu didahului dengan pembentukan kalus. Respons yang dihasilkan dari tanaman uji, tidak sama dengan tanaman kina, yang didahului dengan terbentuknya kalus (Aneloi 2004). Pembentukan kalus setelah inokulasi tergantung jenis eksplan yang digunakan. Reflini (2002) menyatakan bahwa eksplan batang dapat membentuk akar rambut lebih banyak dibandingkan dengan eksplan daun. Tidak semua eksplan yang diinokulasi, membentuk kalus sebelum menghasilkan akar rambut. Transfer T-DNA
ke dalam sel tanaman merupakan proses kompleks dan
dipengaruhi oleh berbagai faktor baik tanaman, maupun jenis Agrobacterium. Menurut Gelvin (2000), beberapa faktor perlu diperhatikan untuk keberhasilan
45
dan efisiensi transformasi adalah optimasi dan kondisi fisiologi eksplan, komposisi medium, pemilihan jaringan sebagai materi awal, kondisi kokultivasi, serta faktor lingkungan, di antaranya adalah suhu, pH dan cahaya. Infeksi tanaman oleh A. rhizogenes menyebabkan masuknya TL dan atau TR plasmid bakteri, kemudian berintegrasi ke dalam genom tanaman (Saurwein et al. 1999, Bajaj & Ishimaru 1999). Integrasi DNA plasmid Ri ke dalam genom sel tanaman menyebabkan berkembangnya akar adventif pada situs infeksi. Proses pembentukan akar rambut terjadi, karena T-DNA membawa gen rol yang penting untuk menginduksi akar rambut. T-DNA juga pembawa gen penyandi protein, yang berperan di dalam proses biosintesis zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin. Ekspresi gen tersebut menyebabkan adanya keseimbangan baru dari zat pengatur tumbuh internal, sehingga menyebabkan terjadinya induksi akar rambut. Sedang eksplan yang tidak membentuk akar rambut setelah diinduksi disebabkan T-DNA tidak terintegrasi pada sel tanaman (Bajaj & Ishimaru 1999). Pertumbuhan akar rambut hasil transformasi T-DNA A. rhizogenes berbeda dengan akar tanaman. Akar tanaman menunjukkan tipe pertumbuhan akar bersifat geometris positif, sedang akar transforman menunjukkan tipe pertumbuhan geometris negatif. Selain itu akar transforman memiliki percabangan akar yang banyak, sehingga sesuai untuk
produksi inokulum G. margarita
dan A.
tuberculata (CMA uji), yang bersifat obligat. Chabot et al. (1992) menyatakan bahwa kultur akar rambut mempunyai kemampuan melakukan biosintesis seperti akar tanaman normal dengan laju pertumbuhan lebih cepat dan tidak teratur. Sifat lain yang sangat penting dari akar rambut adalah, mudah tumbuh pada media kultur tanpa penambahan zat pengatur tumbuh, dapat tumbuh di dalam media padat maupun cair (Aneloi 2004). Fleksibilitas pertumbuhan pada setiap medium sangat tinggi ( Christey & Braun 2004).
4.2. Seleksi media pertumbuhan akar rambut kentang dan wortel Berdasarkan bobot kering akar rambut diperoleh adanya interaksi antara jenis medium dan jenis eksplan. Berat kering akar rambut tertinggi diperoleh dari tanaman wortel yang dik ulturkan dalam medium White. Sedang pertumbuhan akar rambut kentang terbaik diperoleh dari kentang Granola ditumbuhkan dalam
46
medium MS (Tabel 4.2.). Tampaknya untuk petumbuhan akar rambut kedua jenis kentang medium MS memberikan hasil yang terbaik. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa pertumbuhan akar rambut sangat dipengaruhi oleh jenis tanaman asalnya dan medium kultur yang digunakan. Terlihat bahwa akar rambut kentang tumbuh baik pada medium MS yang memiliki komposisi nutrisi hara lebih lengkap dibandingkan dengan medium B5 dan medium White (Lampiran 1A dan 1B). Sebaliknya akar rambut wortel tumbuh lebih baik dalam medium White, dengan komposisi nutrisi hara lebih sederhana khususnya untuk hara makro. Ridgway et al. (2004) menyatakan bahwa potongan akar rambut wortel diinokulasi dengan A. rhizogenes A4T dapat tumbuh baik dalam medium Lauria-Bertoni (+/- asetosiringon) atau dalam medium Yeast Mannitol. Christey & Braun (2004) menyatakan bahwa wortel adalah salah satu spesies yang sukses dan mudah beradaptasi untuk memproduksi akar rambut.
4.3. Pertumbuhan akar rambut kentang Granola dan Wortel pada medium MM (kultur ganda) Komposisi media kultur ganda sederhana, dengan unsur P yang sangat rendah (4,8 mg/l), sehingga tidak setiap kultur akar rambut mampu beradaptasi. Seleksi terhadap dua kultur akar rambut kentang Granola dan wortel didapatkan pertumbuhan akar rambut wortel jauh lebih cepat dan percabangan akar banyak dibandingkan dengan kentang Granola. Hal tersebut karena akar kentang Granola sudah teradaptasi dan dapat tumbuh dengan baik pada media yang komposisi mediumnya kompleks dan dalam jumlah nutrisi cuk up banyak, sedang pada akar rambut wortel, telah tumbuh baik pada media sederhana, sehingga tidak terganggu
yang mempunyai komposisi
pertumbuhannnya apabila dikultur pada
media kultur ganda. Pertumbuhan kultur akar kentang Granola paling baik pada media MS. Hal ini bisa dimengerti karena media MS mempunyai komposisi yang lebih kaya, dibandingkan dengan medium lain. Hal tersebut sesuai dengan pernyataan Giri dan Narasu (2000) bahwa jenis medium memberikan pengaruh yang nyata terhadap induksi akar rambut. Medium mengandung garam dalam jumlah tinggi seperti medium MS, lebih sesuai untuk pembentukan akar rambut pada beberapa
47
tanaman. Medium mengandung garam rendah, seperti medium B5 dapat menyebabkan multiplikasi bakteri berlebihan di dalam medium, sehingga memerlukan subkultur eksplan berulang kali dalam medium dekontaminan. Menurut Gunawan (1998) unsur makro media MS merupakan unsur-unsur yang penting dalam pengembangan media lain. Tetapi perbandingan unsur–unsur tertentu dari medium MS dapat menentukan pertumbuhan akar lebih baik. Sismunandar & Julianto (2000) menyatakan bahwa vitamin yang ditambahkan ke dalam medium berfungsi mempercepat pembelahan sel pada meristem akar sebagai koenzim yang dapat menghasilkan energi dalam reaksi enzimatis.
4.4. Konfirmasi T-DNA A. rhizogenes dengan teknik PCR Untuk membuktikan bahwa T-DNA A. rhizogenes telah terintegrasi dalam jaringan akar rambut kentang Granola, kentang Atlantik dan tanaman wortel, dilakukan pengujian menggunakan PCR. Sebagai
pembanding
digunakan
kontrol positif DNA dari plasmid A. rhizogenes dan kontrol negatif DNA tanaman yang
tidak ditransformasi. Profil DNA setelah fraksinasi menggunakan
elektroforesis, pada semua sampel menghasilkan pola pita sama dengan kontrol positif (plasmid), kecuali kontrol negatif (non transforman). Dari pola pita tersebut menunjukkan bahwa kedua bagian T-DNA yaitu TL-DNA dan TR-DNA telah terintegrasi pada
akar rambut kentang Granola, kentang
Atlantik dan
wortel. Bagian TL-DNA (rol B) terletak pada posisi 780 bp, sedang bagian TRDNA (rol A)
terlihat pada posisi 1600 bp. Hal tersebut sesuai dengan hasil
penelitian tanaman Cinchonia Toruan-Mathius et al. 2004).
legendaris dan C. succirubra (Aneloi 2004,
48
5. SIMPULAN
1. Akar rambut dapat diinduksi dari eksplan tanaman wortel, kentang Granola dan kentang Atlantik menggunakan A. rhizogenes galur LBA 9475, yang dikulturkan dalam medium MS, B5 dan white. 2. Medium MS terbaik untuk pertumbuhan akar rambut kentang Granola dan kentang Atlantik, sedang medium White baik untuk pertumbuhan akar rambut wortel. 3. Akar rambut wortel berkembang baik dalam medium MM (kultur ganda), sedang pertumbuhan akar rambut kentang Granola mengalami hambatan. 4. Berdasarkan uji konfirmasi transfer T-DNA dengan PCR terdapat dua pola pita ukuran basa 780 pb TL dan 1600 pb TR, menunjukkan bahwa TL dan TRDNA telah terintegrasi pada akar rambut.
BAB V Perbanyakan Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata dengan Kultur Pot di Rumah Kaca ABSTRAK Umumnya perbanyakan spora CMA menggunakan kultur pot, inang sorghum dan Pueraria phaseoloides. Tanaman inang, jenis CMA serta tempat tumbuh merupakan faktor penting dalam memperbanyak spora CMA. Penelitian ini bertujuan mengetahui (i) pengaruh faktor tempat tumbuh, jenis CMA, dan tanaman inang terhadap perbanyakan inokulum Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata, (ii) pengaruh kombinasi faktor terhadap produksi spora, dan (iii) jenis tanaman inang kompatibel untuk memperbanyakan inokulum G. margarita dan A. tuberculata. Bahan tanaman sorghum dan P. phaseoloides. ditumbuhkan dalam cawan Petri plastik dan gelas plastik warna dengan zeolit sebagai kariernya. Masing- masing tanaman diinokulasi dengan G. margarita dan A. tuberculata . Percobaan dilaksanakan dalam rumah kaca dengan Rancangan Acak Lengkap Faktorial 2x2x2x5. Hasil menunjukkan bahwa produksi spora meningkat seiring dengan meningkatnya umur tanaman inang. Jumlah spora tertinggi diperoleh dari G. margarita dengan inang P. phaseoloides sebanyak 155 spora dalam 50 g inokulum, sedang A. tuberculata dengan inang yang sama, jumlah spora 161 spora dalam 50 g inokulum. Infeksi akar rata-rata lebih dari 90 % baik pada tanaman sorghum maupun P. phaseoloides pada umur 5 bulan setelah tanam. Tempat tumbuh paling baik untuk memperbanyak inokulum adalah gelas plastik warna. Sedang tempat tumbuh cawan Petri plastik mampu menghasilkan spora dengan bentuk dan ukuran yang seragam, di samping itu kontaminasi jenis spora lain dapat ditekan. Berdasarkan hasil yang diperoleh ternyata kedua tanaman inang kompatibel untuk perbanyakan G. margarita dan A. tuberculata . -----------------------------------Kata kunci: P. phaseoloides, Gigaspora margarita, Acaulospora tuberculata , sorghum, kultur pot,
Spore Productions of Gigaspora margarita and Acaulospora tuberculata using Pot Culture in the Green House Abstract Spore production of AMF was usually carried out in pot culture with sorghum and P. phaseoloides. as host plants. Host plant, genotype of AMF, and growth container are important factors for AMF spores production. The objectives of this research were to observe (i) the effect of growth container, AMF species, and host plants on spore production of G. margarita and A. tuberculata, (ii) the effect of those combinations on spore productions, and (iii)
50
the compatibility of host plant-AMF interaction on spore production. The experiment was conducted in green house condition, G. margarita and A. tuberculata were cultured in Petri dish and colored glass plastic pot containing zeolith as a carrier with sorghum and P. phaseoloides, host plants. Completely Randomized Design with Factorial 2x2x2x5 was used in this experiment. The results showed that spore production increased in line with the increase of host plant age. The highest spore number was obtained from G. margarita with P. phaseoloides as host plant producing 155 spores/50 g inoculum, on the other hand spore production of A. tuberculata with P. phaseoloides as host was 161 spores/50 g inoculum. The average root infection occurred in 5 month old host plant i.e. around 90 % in 5-month-old host plant. The best container for inoculum production is the coloured plastic pot, however Petri dish considered as the best growth container for producing uniform spores and the contamination of other spores could be inhibited. Based on the result It could be concluded that sorghum and P. phaseoloides, can be further developed as host plants for mass production of Gigaspora margarita and Acaulospora tuberculata spores. ------------------------------Key words
: Pueraria phaseoloides, sorghum, Gigaspora margarita, tuberculata , pot culture, host plant-AMF
Acaulospora
1. PENDAHULUAN Hal penting untuk diperhatikan dalam perbanyakan inokulum adalah inang yang kompatibel, tempat tumbuh, dan lingkungan. Hal tersebut penting dipertimbangkan karena CMA bersifat obligat, dan kebutuhan masing- masing CMA terhadap faktor tersebut tidak selalu sama. Menurut Bagyaraj (1992) perbanyakan inokulum harus mempunyai daya infektivitas dan efektivitas tinggi, kolonisasi akar inang cepat dan menghasilkan spora banyak. CMA tidak memilih inang spesifik, semua tanaman berpotensi terinfeksi CMA, namun tingkat infektivitas dan efektivitas berbeda setiap asosiasi inang dan CMA. (2002) menyatakan
Bakhtiar
bahwa meskipun CMA menginfeksi dan mengkolonisasi
akar berbagai spesies
tanaman, namun ada yang lebih disukai dengan
memperlihatkan respon kolonisasi akar maksimum. Spora merupakan inokulum utama untuk CMA, namun akar bermikorhiza dan ekstraradikal hifa dapat digunakan sebagai inokulum (Smith & Read 1997). Tidak semua CMA mampu menggunakan tiga jenis inokulum tersebut, tergantung perbedaan siklus hidup dan lingkungan. Klironomos & Hart (2002) menyatakan bahwa inokulum Gigaspora berupa spora, sedang inokulum Acaulospora dan Glomus berupa spora, akar bermikorhiza dan ekstraradikal hifa.
51
Widiastuti (2004) menyatakan bahwa perbanyakan CMA indigenous (setempat) di bawah tegakan kelapa sawit menggunakan tanaman inang P. phaseoloides, dan sorghum. Perbanyakan spora menggunakan sorghum yang memperlihatkan hasil lebih rendah bila dibandingkan dengan inang P. phaseoloides. Namun pada trapping (memperbanyak inokulum dari lapang) menggunakan kedua inang tersebut menunjukkan hasil yang sama. Fenomena tersebut menunjukkan bahwa kedua inang kompatibel untuk perbanyakan CMA dari tegakan kelapa sawit secara in vivo (konvensional). Persediaan energi untuk pertumbuhan CMA diperoleh dari hasil fotosintat tanaman. Manfaat yang diperoleh tumbuhan tergantung kedua simbion tersebut (tanaman dan CMA), dan karakteristik lingkungan (Bever 2002, Heijden 2002). Pemanfaatan CMA untuk pertanian dan perkebunan berkembang pesat, oleh sebab itu CMA perlu dikembangkan dan diperbanyak secara masal. Kolonisasi dan sporulasi merupakan hal penting dalam perbanyakan inokulum CMA. Banyak faktor yang berpengaruh terhadap kondisi tersebut, salah satunya adalah lama waktu inkubasi (Vaast & Zasoski 1991). Abbot & Gazey (1994) melaporkan bahwa faktor dormansi, tingkat kematangan spora, kelembapan dan inokulum berpengaruh terhadap kolonisasi. Hasil tersebut menunjukkan bahwa secara tidak langsung, tempat tumbuh merupakan salah satu faktor berpengaruh terhadap kolonisasi dan sporulasi CMA. Bakhtiar (2002) menyatakan bahwa pemilihan inang kultur pot sangat berpengaruh terhadap sporulasi, dan infeksi akar. Pertimbangan utama untuk memilih inang adalah tanaman yang toleran terhadap lingkungan rumah kaca. CMA tidak memilih inang spesifik, tetapi CMA mampu bersimbiosis terhadap sebagian besar tanaman, bahkan ada yang menyatakan 90 % CMA bersimbiosis dengan akar tanaman termasuk Angiospermae, Gymnospermae, Pteridophyta dan Briophyta (Varma & Hock 1998). Namun daya infeksi, serta efektivitas berbeda pada setiap inang. Hanya inang yang disukai CMA, memberi tanggapan simbiotik dan kolonisasi maksimal (Bagyaraj 1992). Beberapa inang sering digunakan untuk perbanyakan inokulum, di antaranya adalah sorghum, jewawut, kacang-kacangan, jagung, asparagus dan kapas (Menge 1984). Diop et al. (1994) menyatakan bahwa spora dan propagul
52
(akar berkoloni) merupakan material efektif sebagai inokulum. Selain itu dinyatakan bahwa akar tanaman mempengaruhi fisiologi CMA. Pemilihan inokulum dan tanaman inang merupakan kunci sukses dalam sistem kerjasama kedua organisme tersebut. Buce et al. (2000) menyatakan bahwa CMA mampu berkecambah secara spontan tanpa kehadiran inang, namun memutus langkah perkembangan, pertumbuhan dan berkolonisasi. Kolonisasi merupakan bentuk awal proses simbiosis terhadap akar tanaman inang. Perbanyakan spora in vivo sebagai sumber spora kultur aksenik dan enkapsulasi Na-alginat. Pada umumnya sumber inokulum kultur aksenik CMA in vitro diperoleh dari kultur pot, selanjutnya disterilkan dan dikultur secara in vitro. Fortin et al. (2002) menyatakan bahwa perbanyakan spora kultur pot digunakan sebagai sumber spora, disterilkan dan digunakan sebagai sumber inokulum steril untuk perkembangan dan perbanyakan CMA kultur aksenik secara in vitro. Penelitian ini bertujuan mengetahui (1) pengaruh interaksi dan faktor tempat tumbuh, jenis CMA dan tanaman inang, (2) jenis tanaman simbion yang kompatibel untuk perbanyakan inokulum G. margarita dan A. tuberculata, (3) pengaruh tempat tumbuh terhadap perkembangan G. margarita dan A. tuberculata (4) pengaruh lama waktu inkubasi terhadap perbanyakan inokulum G. margarita dan A. tuberculata terbaik di rumah kaca.
2. BAHAN DAN METODE
Pelaksanaan penelitian di laboratorium dan di rumah kaca Biomolekuler dan Rekayasa Genetik,
Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia
(BPBPI) dari bulan Oktober 2003 –Juli 2004. Penelitian terdiri beberapa tahap, yaitu, (1) pengaruh interaksi tempat tumbuh, jenis CMA dan tanaman inang (2) penyediaan inokulum
G. margarita dan A. tuberculata, (3) inokulasi G.
margarita dan A. tuberculata pada tanaman inang.
53
2.1. Pengaruh interaksi tempat tumbuh, jenis CMA dan inang Tanaman inang yang digunakan adalah sorghum dan P. phaseoloides, jenis CMA G. margarita dari koleksi laboratorium Mikrobiologi dan Bioproses BPBPI di Bogor dan A. tuberculata diperoleh dari PT. Inagro Parung. Perbanyakan CMA dilakukan subkultur menggunakan inang P. phaseoloides, dan sorghum ditumbuhkan di dalam gelas plastik
warna dan cawan Petri plastik di rumah
kaca. Benih tanaman dicuci, dan diseleksi, selanjutnya benih direndam dalam air, benih yang terapung dibuang, dan benih yang tenggelam direndam akuades steril selama 5 jam. Selanjutnya benih disterilkan dengan NaOCl2 1,56 % (Bayclin 30 %) selama 10 menit dan dicuci air kran, dan direndam fungisida selama 5 menit, dicuci dengan akuades steril, dan rendap selama 5 jam. Benih steril selanjutnya dikecambahkan di kotak mika transparan. Benih yang berkecambah dan tumbuh dua daun, ditanam pada Petri plastik dan gelas plastik berwarna yang berisi medium zeolit, sebagai perlakuan, dan diinokulasi dengan CMA uji.
2.2. Penyediaan inokulum G. margarita dan A. tuberculata Penyaringan CMA menggunakan metode tuang saring basah (Pacioni 1992), dan dilanjutkan metode sentrifugasi (Brundrett et al. 1994) (Lampiran 6-8). Zeolit dihomogenkan, diambil sampel 50 g media, diaduk dalam air 200 – 300 ml, kemudian disaring dengan satu set saringan berukuran 1000 µm, 250 µm dan 45 µm secara berurutan dari atas paling besar. Partikel tertinggal pada saringan berukuran 250 dan 45 µm disentrifus berkecepatan 2.000-2.500 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang, tabung diisi larutan gula 50 %, disentrifugasi kecepatan dan waktu yang sama. Lapisan antara gula dan air diambil dituang dalam saringan berukuran 45 µm, selanjutnya dicuci air mengalir sampai larutan gula hilang. CMA siap digunakan sebagai inokulum.
2.3. Pelaksanaan Penelitian 2.3.1. Inokulasi G. margarita dan A. tuberculata pada tanaman inang Sebelum spora G. margarita dan A. tuberculata digunakan,
diseleksi
berdasarkan bentuk, ukuran dan warna spora seragam. Tempat tumbuh tanaman
54
inang berupa Petri diisi 150 g zeolit, sedang tempat tumbuh gelas berwarna diisi 250 g zeolit. Cawan Petri diberi lubang berdiameter 2 cm tepat di bagian tengah berfungsi tempat keluar tanaman inang sehingga dapat tumbuh dengan baik. Untuk tempat tumbuh gelas berwarna diberi lima buah lubang dibagian bawah berfungsi untuk penyerapan air. Kecambah tanaman inang ditanam pada cawan Petri plastik dan diinokulasi CMA, selanjutnya ditutup dan diikat lakban agar Petri plastik tidak terbuka. Ujung akar lateral tanaman inang diinokulasi G. margarita dan A . tuberculata masingmasing sebanyak 10 spora untuk cawan Petri plastik dan 20 spora untuk gelas plastik warna. Selanjutnya masing- masing perlakuan disusun dalam bak diisi air. Penyiraman dilakukan dengan menambahkan air sebanyak 1 l ke dalam setiap bak setiap 2 hari dan dibiarkan selama 45 hari tanpa pemupukan (stress). Setelah kultur berumur lebih 45 hari dilakukan pemupukan setiap minggu dengan hiponeks merah sebanyak 1,5 g/l. Pengaruh perlakuan diukur pada tanaman berumur 3, 4 dan 5 bulan setelah tanam. Pengumpulan data tanaman berumur 4 bulan dilakukan dengan memetik daun tua. Sedang pengumpulan data tanaman umur 5 bulan, 15 hari sebelum dipanen, bagian atas tanaman dipangkas dan disisakan 5-10 cm dari permukaan media, kemudian air dikeringkan. Peubah diamati adalah biomasa tanaman, nisbah pucuk akar, jumlah spora dan persentase infeksi akar, serta perubahan struktur CMA pada akar secara histologi menggunakan metode Koske & Gema (1989) dengan modifikasi lama waktu. Penghitungan spora, dilakukan melalui teknik tuang saring menurut Pacioni (1992),
dilanjutkan metode sentrifugasi
sebanyak 50 g medium (Brund rett et al. 1994). Hasil saringan dituang ke dalam cawan Petri, kemudian dihitung di bawah mikroskop binokuler.
2.4. Rancangan percobaan Rancangan percobaan digunakan Rancangan Acak Lengkap faktorial lima ulangan 2x2x2x5. Faktor pertama adalah tempat tumbuh tanaman inang terdiri dua macam, yaitu cawan Petri plastik dan gelas plastik berwarna. Faktor kedua
55
adalah jenis inokulum, yaitu G. margarita dan A. tuberculata. Faktor ketiga adalah jenis inang, yaitu sorghum dan P. phaseoloides, dengan ulangan lima kali. Analisis data hasil penelitian dengan ANOVA, sedang kesimpulan diambil berdasarkan uji F. Apabila hasil uji F tersebut menunjukkan beda nyata atau beda sangat nyata antar perlakuan, maka pengujian dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan (DMRT) tingkat kepercayaan 95 % ( P< 0,05).
3. H A S I L
3.1. Pengaruh interaksi tempat tumbuh, jenis CMA dan tanaman inang Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa pengaruh tempat tumbuh, jenis inang, dan jenis CMA berbeda secara nyata terhadap peubah biomasa, nisbah pucuk akar, jumlah spora dan infeksi akar. Biomasa tertinggi diperoleh tanaman inang sorghum ditanam pada gelas plastik berwarna, baik diinokulasi G. margarita maupun A. tuberculata, dan meningkat dengan bertambahnya umur tanaman. Nisbah pucuk akar menunjukkan keseimbangan pertumbuhan dimulai umur tanaman 4–5 bulan, sedang nisbah pucuk akar tertinggi umur 3 bulan pada tanaman P. phaseoloides, diinokulasi A. tuberculata. Jumlah spora dan persentase infeksi akar menunjukkan peningkatan, sejalan dengan meningkatnya umur tanaman inang. Jumlah spora jenis G. margarita dan A. tuberculata tertinggi diperoleh inang P. phaseoloides. dikultur gelas plastik warna, umur 5 bulan setelah tanam, demikian pula hasil infeksi akar. (Gambar 5.1 A,B,C dan D) Pengaruh faktor tempat tumbuh menunjukkan perbedaan yang nyata pada masing masing peubah umur 3, 4 dan 5 bulan, kecuali nisbah pucuk akar dan infeksi akar umur tanaman 5 bulan. Biomasa, jumlah spora dan infeksi akar meningkat sejalan meningkatnya umur tanaman. Sedang nisbah pucuk akar menunjukkan pertumbuhan seimbang dengan meningkatnya umur tanaman. Jenis CMA dan tanaman menunjukkan kecenderungan yang sama pengaruh masingmasing faktor terhadap semua peubah yang diamati (Gambar 5.1; 5.2; 5.3, A,B,C dan D)
56
Hasil analisis interaksi pengaruh tempat tumbuh cawan Petri plastik dan gelas plastik terhadap peubah (Biomassa, nisbah pucuk akar, jumlah spora dan persentase infeksi akar) menunjukkan perbedaan yang nyata, pada umur 3, 4 dan 5 bulan setelah tanam (Tabel 5.1.). Jenis CMA berpengaruh nyata terhadap biomasa tanaman, nilai nisbah pucuk akar, jumlah spora dan persentase infeksi akar umur 3, 4 dan 5 bulan setelah tanam, kecuali infeksi akar umur 5 bulan setelah tanam (Tabel 5.1). Jenis
inang sorghum dan P. phaseoloides,
berpengaruh nyata terhadap biomasa tanaman, nilai nisbah akar pucuk, jumlah spora, kecuali persentase infeksi akar umur 4 dan 5 bulan setelah tanaman (Tabel 5.1). Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa biomasa tanaman tertinggi pada sorghum dikultur gelas plastik warna umur 5 bulan, diinokulasi A. tuberculata. Sedang nilai terendah diperoleh tanaman P. phaseoloides, dikultur dalam cawan Petri plastik, diinokulasi G. margarita umur 3 bulan. Nisbah pucuk akar tertinggi pada P. phaseoloides, yang diinokulasi A. tuberculata dan dikultur pada gelas plastik warna umur 3 bulan setelah tanam, dan terendah pada P. phaseoloides, yang diinokulasi G. margarita umur 3 bulan. Jumlah spora tertinggi diperoleh tanaman P. phaseoloides, yang diinokulasi A. tuberculata dan dikultur pada gelas plastik umur 5 bulan setelah tanam. Jumlah spora terendah pada tanaman sorghum dikultur dalam cawan Petri plastik yang diinokulasi G. margarita, umur 3 bulan. Infeksi akar tanaman sorghum dan P. phaseoloides, yang diinokulasi A. tuberculata yang dikultur dalam gelas plastik warna umur 5 bulan tidak berbeda nyata. Infeksi akar terendah pada akar tanaman sorghum yang diinokulasi G. margarita, dan ditanam pada cawan Petri plastik umur 3 bulan. Berdasar hasil yang diperoleh ternyata umur penga matan berpengaruh terhadap semua peubah dan menunjukkan peningkatan yang nyata.
57
Biomasa Tanaman
Biomasa (g)
4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0
cwn Petri Glas plast
1
2
3
Umur Kultur (bulan)
Gambar 5.1.A. Pengaruh jenis tempat tumbuh terhadap biomasa tanaman umur 3, 4 dan 5 bulan
Nisbah Pucuk Akar
3 2.5 2
Rasio Pucuk 1.5 Akar
cwn Petri Glas plast
1 0.5 0 1
2
3
Umur Kultur (bulan)
Gambar 5.1.B. Pengaruh jenis tempat tumbuh terhadap nisbah puc uk akar tanaman umur 3, 4 dan 5 bulan
58
Jumlah Spora
Jumlah spora (butir)
160 140 120 100 80 60 40 20 0
cwn Petri Glas plast
1
2
3
Umur kultur (bulan)
Gambar 5.1.C. Pengaruh jenis tempat tumbuh terhadap jumlah spora umur 3, 4 dan 5 bulan
Persentase Infeksi Akar 100 80
Infeksi akar 60 (%) 40
cwn Petri Glas plast
20 0 1
2
3
Umur kultur (bulan)
Gambar 5.1.D. Pengaruh jenis tempat tumbuh terhadap persentase infeksi akar umur 3, 4 dan 5 bulan
59
Biomasa Tanaman 3.5 3 2.5
Biomasa (g)
2 1.5
G. margarita
1
A. tuberculata
0.5 0 1
2
3
Umur kultur (bulan)
Gambar 5.2.A. Pengaruh G. margarita dan A. tuberculata terhadap biomasa akar umur 3, 4 dan 5 bulan setelah tanam.
Nisbah Pucuk Akar 3 2.5 2
Rasio pucuk 1.5 akar
G. margarita
1
A. tuberculata
0.5 0 1
2
3
Umur kultur (bulan)
Gambar 5.2.B. Pengaruh G. margarita dan A. tuberculata terhadap nisbah pucuk akar umur 3, 4 dan 5 bulan setelah tanam
60
Jumlah Spora
Jumlah spora
(butir)
160 140 120 100 80 60 40 20 0
G. margarita A. tuberculata
1
2
3
Umur kultur (bulan)
Gambar 5.2.C. Pengaruh jenis G. margarita dan A. tuberculata terhadap jumlah spora umur 3, 4 dan 5 bulan setelah tanam
Persentase Infeksi Akar
Infeksi akar (%)
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
G. margarita A. tuberculata
1
2
3
Umur kultur (bulan)
Gambar 5.2.D. Pengaruh jenis G. margarita dan A. tuberculata terhadap persentase infeksi akar umur 3, 4 dan 5 bulan setelah tanam
61
Biomasa Tanaman
Biomasa (g)
4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0
Sorghum P.phaseoloides
1
2
3
Umur kultur (bulan)
Gambar 5.3.A. Pengaruh jenis tanaman inang Sorghum dan P. Phaseoloides terhadap biomasa umur 3, 4 dan 5 bulan setelah tanam
Nisbah Pucuk Akar 3 2.5 2
Nisbah 1.5 pucuk akar
Sorghum
1
P. phaseoloides
0.5 0 1
2
3
Umur kultur (bulan)
Gambar 5.3.B. Pengaruh jenis tanaman inang Sorghum dan P. Phaseoloides terhadap nisbah umur 3, 4 dan 5 bulan setelah tanam
62
Jumlah Spora
Jumlah spora (%)
160 140 120 100 80 60 40 20 0
Sorghum P. phaseoloides
1
2
3
Umur kultur (bulan)
Gambar 5.3.C. Pengaruh jenis tanaman inang Sorghum dan P. Phaseoloides terhadap jumlah spora umur 3, 4 dan 5 bulan setelah tanam
Persentase Infeksi Akar
Infeksi akar (%)
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
G. margarita A. tuberculata
1
2
3
Umur kultur (bulan)
Gambar 5.3.D. Pengaruh jenis tanaman inang Sorghum dan P. Phaseoloides terhadap persentase infeksi akar umur 3, 4 dan 5 bulan setelah tanam
63
Tabel 5.1. Pengaruh interaksi jenis tempat tumbuh, CMA dan tanaman inang terhadap biomasa, nisbah pucuk dan akar, jumlah spora dan infeksi spora. Umur/ bl
Peubah
Tempat tumbuh
Gigaspora margarita Sorghum
Pueraria phaseoloides 0,3 h
Acaulospora tuberculata Sorghum
Pueraria phaseoloides 1,3 e
Cawan Petri 1,6 d 2,9 c b f Gelas plastik 3,3 1,2 3,9 a 1,1 g c d b 4 Cawan Petri 2,0 0,9 3,5 2,0 c b c a Gelas plastik 4,4 1,6 4,6 2,1 c d h c 5 Cawan Petri 3,0 1,2 4,0 2,1 g a f b Gelas plastik 5,2 2,6 4,7 2,9 e 3 Nisbah Cawan Petri 2,1b 0,4 h 0,9 g 1,7 e f b d pucuk Gelas plastik 1,0 2,1 2,0 6,6 a c i h 4 akar/g Cawan Petri 1,9 0,5 1,0 2,5 a g b f Gelas plastik 1,2 2,4 1,6 1,8 d c i g 5 Cawan Petri 2,3 0,5 1,1 2,5 b Gelas plastik 1,2f 3,1 a 1,7 e 1,8 de e de c 3 Jum Spora Cawan Petri 32,2 33,0 43, 2 47,4 b d d b (butir) Gelas plastik 34,8 35,6 49,4 55,6 a b b ab 4 Cawan Petri 92,2 93,0 93,2 97,4 a ab ab ab Gelas plastik 94,8 95,6 95,0 95,5 ab 5 Cawan Petri 136,0 f 151,4 cd 143,2 e 147,4 c b b d Gelas plastik 156,6 155,6 149,4 161,2 a b ab ab 3 Infeksi Cawan Petri 68,0 73,0 72,0 75,8 a a ab a akar (%) Gelas plastik 75,0 71,0 76,0 71,0 ab c c b 4 Cawan Petri 86,0 86,2 96,0 96,2 b c c a Gelas plastik 88,2 87,0 98,5 93,3 ab 5 Cawan Petri 93,2b 98,8 a 98,2 b 98,8 a a a a Gelas plastik 98,0 98,4 99,6 99,4 a Keterangan : Huruf yang sama pada baris dari masing-masing peubah tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT (P< 0,05). 3
Biomasa/g
3.2. Hasil analisis korelasi Hasil analisis korelasi masing- masing peubah menunjukkan tidak semua peubah berkorelasi. jumlah spora dan persentase infeksi akar berkorelasi dengan biomasa tanaman, dan jumlah akar berkorelasi dengan infeksi akar akar (Tabel 5.2.).
64
Tabel 5.2. Analisis korelasi biomasa tanaman, nisbah akar pucuk, jumlah spora dan infeksi akar Parameter
Biomasa tanaman 0,442 0,902*) 0,817*)
Nisbah pucuk akar Jumlah spora Infeksi akar
Nisbah akar pucuk 0,613*) 0,227
Jumlah spora 0,494*)
Keterangan : *) ada korelasi positif
3.3. Perubahan struktur CMA di dalam akar inang Infeksi spora CMA mempunyai formasi karakteristik, yaitu
spora
berkecambah, yaitu terbentuknya hifa dari permukaan spora, menginfeksi akar membentuk apresorium. Hifa masuk ke dalam kortek membentuk hifa internal diikuti pembentukan arbuskula, vesikula, dan hifa gelung. Vesikula hanya ditemukan pada A. tuberculata (Gambar 5.4).
1000µm A
B
C
Gambar 5. 4. Struktur morfologi organ CMA pada kortek akar tanaman inang A. hifa gelung dan vesikula ( 100 µm) (A. tuberculata), B. arbuskula (100 µm) dan hifa internal, C. hifa eksternal (2 µm)
4. PEMBAHASAN
Hasil analisis me nunjukkan bahwa biomasa tanaman berbeda nyata antar jenis tempat tumbuh pada setiap waktu pengamatan. CMA bersifat obligat, maka CMA harus bersimbiosis. Pada umumnya
tanaman dan CMA merupakan
simbiosis mutualistis, tanaman memberikan karbon dari fotosintat untuk pertumbuhan dan perkembangan CMA. Jasa paling utama diberikan oleh CMA kepada tanaman adalah pengambilan, asimilasi, dan translokasi nutrisi di luar
65
zona rhizosfir ke akar tanaman, dan tugas tersebut dilaksanakan oleh ekstraradikal miselium CMA (Johansen et al. 1993, Ezawa et al. 2002). Hasil fotosintesis berupa karbohidrat, diubah menjadi senyawa lain, digunakan untuk pembentukan daun, batang, jaringan baru dan sistem organ lainnya. Biomasa juga merupakan indikator pertumbuhan tanaman. Nilai biomasa tinggi menunjukkan terjadi peningkatan proses fotosintesis, karena unsur hara diperlukan cukup tersedia sehingga memberikan pengaruh nyata pada biomassa tanaman (Suraya 2002). Oleh karena itu umumnya CMA meningkatkan kesuburan tanaman, daya tahan terhadap serangan patogen, dan kekeringan serta meningkatkan biomasa (Ezawa et al. 2002). Hasil analisis kombinasi dua maupun tiga faktor, yaitu jenis tempat, inokulum, dan inang menghasilkan berat kering (biomasa) tanaman berbeda nyata dan memperlihatkan peningkatan setiap pertambahan lama waktu pengamatan. Hal tersebut terkait simbiosis G. margarita dan A. tuberculata, serta kompatibilitas antara inang dan inokulum meningkatkan biomassa tanaman. Simbiosis tanaman dengan CMA dilaporkan meningkatkan berat kering tanaman (biomassa) manggis (Garcinia mangostana) (Lucia 2005), klon jati (Tectona grandis) (Suraya 2002), kelapa sawit
(Widiastuti 2004) dan kopi arabika
(Winarsih & Baon 1999).
4.2. Nisbah pucuk akar Nilai nisbah pucuk akar tanaman dalam kondisi seimbang, kecuali umur 3 bulan. Hal tersebut menunjukkan bahwa umur 3 bulan, tanaman memperlihatkan pertumbuhan pucuk cepat. Nilai nisbah pucuk akar ditentukan perkembangan akar dan pucuk tanaman. Apabila akar tumbuh baik, maka pucuk juga tumbuh baik. Pertumbuhan pucuk tanaman baik dan normal ditunjukkan nilai nisbah pucuk akar mendekati seimbang antara tajuk dan akar. Banyak faktor mempengaruhi pertumbuhan pucuk, baik secara internal yaitu kondisi fisiologis tanaman, faktor lingkungan, persediaan nutrisi dan air, serta simbiosis CMA. Widiastuti (2004) menyatakan bahwa infeksi CMA terhadap kelapa sawit menyebabkan perubahan bentuk organ CMA, terlihat hifa eksternal, internal, hifa gelung, vesikula dan arbuskula dalam kortek akar, serta hifa eksternal. Citernesi et
66
al. (1998) menyatakan bahwa kolonisasi CMA merubah sistem dan arsitektur perakaran tanaman Olea europaea, demikian pula pernyataan Widiastuti (2004) pada tanaman kelapa sawit. Perubahan tersebut disebabkan nutrisi (hara), dan peran hormon terinduksi akibat infeksi CMA. Disatu sisi perakaran mempunyai arti penting, selain sebagai penopang tegak tanaman, untuk menyerap hara tidak mudah bergerak, yaitu P, dan air. Simbiosis CMA mengubah arsitektur perakaran sehingga zona rhizosfir lebih luas, dan pengambilan nutrisi maupun air digunakan sebagai bahan dasar proses fotosintesis tersedia optimal. Akibatnya pertumbuhan dan perkembangan tanaman mencapai optimal, karena proses fotosintesis berlangsung optimal, sehingga menghasilkan biomasa optimal (Widiastuti 2004, Lucia 2005). Orcutt dan Nielsen (2000) menyatakan bahwa ada empat cara peningkatan serapan hara tanaman oleh CMA, yaitu: (i) melalui luas perakaran tanaman, sehingga memperluas area penyerapan, (ii) hifa eksternal memperluas area penyerapan
karena diameter lebih
kecil dibandingkan dengan
akar (1µm),
sehingga meningkatkan serapan hara 60 kali (Bolan 1991), (iii) menyebabkan pergerakan P lebih baik, (iv) menginduksi pembentukan asam organik dan fosfatase, masing- masing meningkatkan persediaan
P
tanaman
melalui
pelarutan dan mineralisasi, (v) meningkatkan langsung atau tidak langsung transfer hara sesama tanaman bermikorhiza, dan (vi) meningkatkan kapasitas serapan hara akar, karena akar bermikorhiza hidup lebih lama. Inokulasi CMA mempercepat pertumbuhan akar dan dapat mengubah bentuk percabangan akar sehingga tanaman lebih banyak akar lateral (Tisserant et al. 1996, Masri & Azizah 1998). Lucia (2005) menyatakan bahwa semua inokulum CMA diinokulasi bibit manggis menghasilkan jumlah akar lateral nyata lebih banyak dibanding tidak diinokulasi CMA. Berdasarkan uraian tersebut dapat disimpulkan bahwa perbaikan struktur akar tanaman akibat terbentuk simbiosis CMA meningkatkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman, proses fotosintesis, dan menstabilkan pertumbuhan.
67
4.3. Perbanyakan Spora Pengaruh perlakuan tempat tumbuh tanaman inang dan lama waktu memberikan hasil berbeda nyata terhadap perbanyakan spora (jumlah spora). Faktor penentu di dalam perbanyakan spora adalah perkecambahan spora, karena dari spora berkecambah menginfeksi akar tanaman, dan hifa berkembang. Perkembangan diikuti sporulasi. Namun, banyak faktor mempengaruhi proses sporulasi (terbentuknya spora) antara lain lingkungan, jenis inang, kemampuan infektif dan efektif spora dan lama waktu inkubasi (Sancayaningsih 2005). Spora merupakan salah satu tahapan di dalam siklus hidup CMA, (de-Souza 2005) menyatakan bahwa siklus hidup CMA ada tiga tahap yaitu, tahap pertama penetapan simbiosis, melibatkan aktivitas propagul, inang tanaman, apresorium, penetrasi akar dan arbuskula. Pada tahap tersebut keterlibatan jenis inokulum dan jenis tanaman sebagai kunci utama, karena energi digunakan untuk pertumbuhan dan perkembangan CMA berasal dari fotosintat tanaman, demikian pula sebaliknya CMA memberikan nutrisi dan air sebagai bahan dasar fotosintesis (Bever 2002, Heijden 2002, Ezawa et al. 2002). Tahap kedua pertumbuhan dan perkembangan melibatkan hifa eksternal, internal dan ekstraradikal secara keseluruhan meningkatkan biomasa CMA, pembentukan struktur hifa dan perluasan CMA di luar maupun antar tanaman. Perkembangan hifa berfungsi sebagai saluran meluas secara radikal, selanjutnya terjadi perkembangan struktur arbuskula berperan untuk mengambil nutrien, dan pembentukan vesikula yang berfungsi untuk penyimpana n lipid. Tahap ketiga adalah tahap perbanyakan yang melibatkan struktur reproduktif, yaitu pembentukan spora merupakan inokulum utama untuk CMA (Bago et al. 1998a). Diop et al. (1994) menyatakan bahwa pemilihan inokulum dan tanaman inang merupakan kunci sukses, sistem penanaman kedua organisme bersimbiosis. Selanjutnya Buce et al. (2000) menyatakan bahwa eksudat inang sangat berpengaruh terhadap lingkungan dan mampu merangsang perkecambahan spora. Hal ini disebabkan eksudat akar merupakan isyarat merangsang pertumbuhan hifa, dengan memecah kantong perkecambahan. Lebih lanjut spora berkecambah dan mengkolonisasi akar, maka mulai terjadi simbiosis, dan sporulasi.
68
Vaast & Zasoski (1991) melaporkan bahwa lama waktu inkubasi berpengaruh terhadap kolonisasi, demikian pula
faktor dormasi, tingkat
kematangan spora, kelembapan, dan tempat pertumbuhan dan perkembangan inokulum (Abbot & Gazey 1994). Siqueira et al. (1998) melaporkan bahwa keadaan spora, cekaman lingkungan, dan media tumbuh merupakan salah satu faktor mempengaruhi perkecambahan spora dan kolonisasi CMA. Sancayaningsih (2005) menggunakan jenis inokulum dan jenis inang berbeda, menghasilkan pertumbuhan tanaman, kolonisasi, dan sporulasi berbeda.
4.4. Infeksi akar Hasil menunjukkan bahwa kombinasi faktor tempat, jenis inokulum dan jenis inang
berbeda nyata terhadap peubah yang diukur. Banyak faktor
mempengaruhi infeksi akar, antara lain kemampuan spora berkecambah. Perkecambahan spora berperan penting di dalam infeksi akar, yang dipengaruhi oleh beberapa faktor di antaranya kompatibilitas inang, eksudat akar, jenis inokulum dan faktor lingkungan. eksudat inang berpengaruh terhadap
Bakhtiar (2002) menyatakan bahwa lingkungan, dan mampu
merangsang
perkecambahan. Selain itu Sancayaningsih (2005) melaporkan bahwa kolonisasi CMA dipengaruhi jenis spora, kemampuan infeksi dan efektivitas spora, serta kompatibilitas inang dan faktor lingkungan berpengaruh terhadap induksi akar. Lucia (2005) menyatakan bahwa keefektivan inokulum CMA bervariasi dalam memberikan respons terhadap pertumbuhan. Hal tersebut berkaitan infektivitas dan efektivitas inokulum. Muas (2003) menyatakan bahwa tidak semua species CMA efektif meningkatkan pertumbuhan tanaman. Kolonisasi CMA tidak selalu berhubungan jumlah spora yang dihasilkan, karena proses dipengaruhi kondisi inokulum, lingkungan, jenis inang, serta media (Siqueira et al. 1989). Vaast & Zasoski (1991) melaporkan bahwa lama waktu inkubasi, tingkat kematangan spora berpengaruh terhadap kolonisasi. Kelembapan, keadaan spora, cekaman lingkungan, dan
media merupakan faktor yang dapat mempengaruhi
perkecambahan spora dan kolonisasi CMA. Sejalan penelitian Bakhtiar (2002) menggunakan
jenis
inokulum
dan
jenis
inang
berbeda,
menghasilkan
69
pertumbuhan tanaman, kolonisasi, dan sporulasi berbeda, dimana keduanya berpengaruh nyata terhadap peubah yang diamati, walaupun besar respon tidak sama. Faktor luar dan dalam berpengaruh terhadap infeksi akar. Faktor luar di antaranya adalah fotosintat dihasilkan inang, inang yang kompatibel mampu memacu pertumbuhan dan perkembangan CMA melalui pembentukan struktur CMA di dalam akar. Fotosintat merupakan faktor eksternal berpengaruh terhadap penyebaran hifa, selanjutnya berperan terhadap infeksi akar. Penyebaran tersebut sering berhubungan dengan efisiensi penggunaan inang
terkait perbanyakan
fotosintat (Bago et al. 1998a). Faktor internal meliputi infektivitas, penyerangan, agresif dan kepadatan propagul. Selain itu dinyatakan bahwa faktor eksternal mencakup pH lahan, persediaan fosfor dan potensi air. Infektivitas adalah jumlah akar tanaman terinfeksi oleh CMA tanpa melihat kemampuan menginfeksi dan penyebaran hifa jenis lain. Infektivitas tersebut sangat bergantung pada banyak inokulum
atau kepadatan inokulum, dan
penempatan inokulum (Wilson &
Tommerup 1992).
4.5. Korelasi Antar Peubah Hasil analisis korelasi antar peubah, menunjukkan bahwa peubah jumlah spora dan infeksi akar serta biomasa tanaman berkorelasi positif. Fenomena terlihat bahwa jumlah spora berkorelasi dengan infeksi akar dan biomasa. Hal tersebut dipahami, karena proses infeksi, dipengaruhi efektivitas dan infektivitas spora CMA, dan melalui struktur organ CMA dalam korteks akar dapat mengubah arsitektur tanaman (Widiastuti 2004, Lucia 2005), sehingga zone rhizosfir lebih luas, nutrisi yang tersedia dan diserap lebih banyak, proses fotosintesis optimal, sehingga biomasa meningkat. Bakhtiar (2002) menyatakan bahwa kolonisasi CMA dipengaruhi jenis spora. Kemampuan infektivitas dan efektivitas spora, serta kompatibilitas terhadap inang dan faktor lingkungan berpengaruh terhadap induksi akar. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perbanyakan inokulum perlu mempertimbangkan (i) kombinasi tempat tumbuh tanaman, (ii) jenis CMA dan jenis inang yang digunakan, (iii) lingkungan, (iv) fisiologi CMA, karena setiap
70
jenis CMA mempunyai karakter beda.. Selain itu cekaman fisik mampu meningkatkan sporulasi, yaitu pemotongan kotiledon (Widiastuti 2004). Di dalam penelitian tersebut dilakukan cekaman dengan pemotongan daun tua setelah 3 bulan, serta pemotongan tanaman bagian atas setelah umur 4 bulan, dan diamati pada umur 5 bulan. Hasil penelitian yang diperoleh mendukung fenomena lapang dimana inang sorghum dan P. phaseoloides merupakan inang yang sering digunakan perbanyakan spora dengan kultur pot terbuka. Percobaan ini memberikan jawaban bahwa penggunaan kedua tanaman tersebut untuk perbanyakan spora di rumah kaca dengan kultur pot memberi informasi peningkatan perbanyakan CMA berdasar berbagai faktor. Perbanyakan spora
secara
massal
dilakukan dalam pot
terbuka
(konvensional) di rumah kaca mempunyai beberapa kelemahan, yaitu spora tidak murni dan spora terkontaminasi CMA jenis lain, atau mikroorganisme lain menurunkan perbanyakan spora secara cepat, yaitu Microdochium sp, sebagai mikroba kontaminan sangat merugikan usaha perbanyakan spora CMA (Hijri et al. 2000). Oleh sebab itu spora steril merupakan kunci peningkatan kualitas perbanyakan CMA in vitro (Becard & Piche 1992). Fortin et al. (2002) menyatakan bahwa sumber inokulum untuk perkembangan spora CMA in vitro diperoleh dari kultur pot. Oleh karena itu hasil penelitian digunakan sebagai sumber spora yang disterilkan sebagai sumber inokulum steril, dan dikultur pada medium kultur ganda, yaitu medium MM (Becard & Fortin 1988) dan MSR (Strullu & Romand 1986) dengan inang eksplan tomat dan wortel in vitro. Selain sebagai sumber spora, spora dihasilkan juga digunakan untuk uji coba enkapsulasi spora CMA (G. margarita & A. tuberculata) dengan Na-alginat, serta uji daya viabilitas perkecambahan spora dengan inang P. phaseoloides.L.
71
5. SIMPULAN
1. Tempat tumbuh tanaman (cawan Petri plastik dan gelas plastik warna), jenis CMA (G. margarita dan A. tuberculata) serta jenis inang tanaman (sorghum dan P. phaseoloides) berpengaruh nyata terhadap biomasa tanaman, nisbah pucuk akar, jumlah spora dan infeksi akar. Terjadi korelasi antar peubah terkecuali biomasa tanaman dan nisbah pucuk akar. 2. Sorghum dan
P. phaseoloides merupakan tanaman inang kompatibel
terhadap perbanyakan G. margarita dan A. tuberculata kultur pot (in vivo) di rumah kaca. 3. Cawan Petri plastik menghasilkan bentuk dan ukuran spora CMA uji seragam, menekan kontaminasi, menghasilkan spora banyak dan infeksi akar tinggi. 4. Gelas plastik warna menghasilkan spora yang ukuran bervariasi, kontaminan lebih tinggi,
jumlah spora dan infeksi spora relatif lebih
tinggi dibandingkan dengan tempat tumbuh cawan Petri.
5. Lama waktu inkubasi meningkatkan perbanyakan spora dan persentse infeksi akar G. margarita dan A. tuberculata. Inang tanaman P. phaseoloides menghasilkan jumlah G. margarita maupun A. tuberculata tertinggi .
BAB VI Penyediaan Inokulum Steril Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata Kultur Aksenik dengan Eksplan Tomat dan Wortel ABSTRAK Penyediaan inokulum CMA pada umumnya menggunakan kultur pot dalam rumah kaca, kendala yang dihadapai yaitu kultur tidak murni terkontaminasi oleh mikroorganisme lain, dan keterbatasan lahan. Salah satu upaya menanggulangi masalah tersebut adalah pemanfaatan kultur aksenik in vitro. Namun, belum diperoleh teknik sterilisasi CMA yang tepat. Tujuan penelitian mendapat (i) metode sterilisasi spora CMA, (ii) media dan tanaman inang sesuai atau kompatibel untuk penyediaan inokulum CMA steril, (iii) perkembangan G. magarita dan A. tuberculata in vitro. Perbanyakan tanaman wortel dengan perkecambahan biji. Perbanyakan tanaman tomat menggunakan tunas, dan media ditambah kinetin 0,1, 0,5 dan 1,0 mg/l. Bahan wortel dan tomat in vitro diadaptasikan pada medium minimum (MM) dan medium Strullu dan Romand (MSR). Sumber spora G. margarita dan A. tuberculata dari kultur in vivo di rumah kaca (percobaan II), disterilisasi dengan tiga metode. Masing–masing pora steril diinokulasikan ke dalam akar plantlet wortel dan diinkubasi dalam ruang kultur cahaya 75-100 luks 12 jam/hari, suhu 26 o C dan Rh 80 %. Percobaan dilaksanakan menggunakan Ra ncangan Acak Lengkap Faktorial 2x2x2x5. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa sterilisasi terbaik menggunakan MgSO4 .7H2 O 0,1%, 10 % Tween 20 steril, dan permukaan spora dibersihkan NaOCl2 0,52 % (Bayclin10%). Spora disterilkan dengan antibiotik gentamisin, streptomisin dan penisilin masing- masing 100 mg/l dan tetrasiklin 2,5 mg/ l. Spora G. margarita steril berkecambah antara 11-15 hari sedang A. tuberculata 40-50 hari setelah inokulasi. Media yang sesui untuk kedua jenis CMA adalah MM dan MSR, sedang yang terbaik adalah MM. Tanaman wortel dan tomat kompatibel, namun lebih baik wortel untuk perkembangan G. magarita dan A. tuberculata kultur aksenik. Kedua CMA tersebut berkecambah, hifa eksternal berkembang menginfeksi akar inang, membentuk arbuskula, ve sikula dan membentuk spora baru (sporulasi). Kesimpulan bahwa kedua CMA uji dapat dikembangkan secara in vitro, walaupun perbanyakan spora masih rendah. ---------------------------------------Kata kunci: G. margarita, A. tuberculata, teknologi kultur-aksenik, sterilisasi spora, perkecambahan spora CMA, wortel, tomat
73
Sterile Inoculum Supply of AMF Gigaspora margarita and Acaulospora tuberculata Axenic Culture with Explant of Tomato and Carrot ABSTRACT Generally conventional production AMF inoculum was carried out with culture pot in green house or in the field, this method faced many problems because of contamination with other microorganisms and limited farm area. The weakness can be overcome by AMF in vitro culture with sterile AMF inoculum. The objectives of the research are (i) to obtain AMF spore sterilization technique, (ii) to formulate media and host plants for supporting the sufficient sterile spore, and (iii) to develop the inoculum of G. margarita and A. tuberculata by axenic culture. Plant materials such as carrots multiplied by seeds and tomato could be also propagated by axillary buds in Murashige and Skoog medium with the addition of 0.1, 0.5 and 1.0 mg/l kinetin. Furthermore, planlets were adapted in minimum medium (MM) and Strullu and Romand medium (MSR). Spores of G. margarita and A. tuberculata propagated in green house from experiment II with three types of sterilants were used in this experiment. Spore from each AMF was inoculated into planlet roots of each tested plants, and incubated in light rooms 75-100 lux for 12 hours/days, temperature 26 o C, Rh 80 %. This study is designed in Randomized Completed Design factorial 2x2x2x5. The results showed that sterilants consisted of MgSO4 .7H2 O 0.1 % and 10 % sterile Tween 20, while the spore surface was cleaned by NaOCl2 0.52 % (Bayclin10 %). The spores were sterilized by antibiotics gentamycin, streptomycin, penicillin of 100 mg/l each and tetracycline of 2.5 mg/l. The results showed that sterile G. margarita germinated between 11-15 days, while A. tuberculata germinated between 40-50 days after inoculation. The most suitable media for those AMF are MM and MSR while MM is the best. These two host plants are compatible for growing and developing of G. margarita and A. tuberculata in monoaxenic culture. G. margarita and A. tuberculata were able to infect tomato and carrot in the MM and MSR forming external hyphae which infect root producing, arbuscular, vesicular and sporulation. This concluded that the development of G. margarita and A. tuberculata can be carried out by carrot and tomato as a host in axenic culture. Association of AMF (G. margarita and A. tuberculata) with tomato and carrot plants could successfully be carried out by axenic culture, however the sporulation was low. -------------------------------Key words: G. margarita, A. tuberculata, monoaxcenic culture, sterilization-spore, germination-AMF spore, tomato, carrot. 1. PENDAHULUAN Tanaman yang bermikorhiza dapat meningkatkan penyerapan P, Zn, N, K, dan Cu, sehingga tanaman yang bermikorhiza meningkatkan pertumbuhan, serta
74
meningkatkan ketahanan cekaman kekeringan dan hama penyakit. Hal tersebut dikatakan bahwa manfaat CMA sangat luas (Clark 1997, Smith & Read 1997, Marschner & Dell 1995). Oleh sebab itu diupayakan peningkatan CMA lebih efisien dan efektif dengan teknologi in vitro, karena menghasilkan spora yang steril, murni, efektif dan efisien. Tiwari & Adholeya (2002) menyatakan bahwa spora Gigaspora dan Glomus dapat diproduksi secara in vitro, hasil yang diperoleh masing- masing 490 butir dan Glomus 6695 butir dalam satu cawan Petri yang berisi 30 ml medium dengan inokulum steril secara in vitro. Diop et al. (1992) menyatakan bahwa dihasilkan 790 butir Gigaspora dengan inokulum steril dalam 25 ml medium. Menurut de-Souza (2005) Scutellospora dapat menghasilkan spora sebanyak 56 butir/ 30 ml media. Hasil tersebut memberikan gambaran bahwa CMA dapat dikembangkan dan diproduksi secara in vitro, walaupun hanya terbatas pada genus tertentu. Sedang Acaulospora tuberculata belum ada laporan perkembangan kultur aksenik in vitro baik di Indonesia maupun mancanegara. Dari hasil tersebut menunjukkan bahwa produksi spora secara in vitro mempunyai prospek yang menjanjikan, sehingga teknologi in vitro untuk mendapatkan kultur aksenik CMA perlu dikembangkan. Sedang untuk A. tuberculata
perlu
di
lakukan
pengujian,
untuk
menambah
informasi
perkembangan kultur aksenik CMA asal Indonesia (indigenous). Untuk pengembangan produksi inokulum CMA in vitro, penyediakan spora steril mampu berkecambah merupakan tuntutan utama yang harus disiapkan. Teknik sterilisasi spora CMA telah dikembangkan oleh Buce et al. (2000), Declerck et al. (1998), dan Chabot (1992). Sterilisasi permukaan spora CMA diperlukan
dalam
perkembangan
spora
in
vitro,
untuk
menghindari
perkembangbiakan mikroorganisme pencemar. Pemilihan inang, medium dan optimasi sterilisasi yang sesuai, kunci perkembangan CMA monoaksenik atau kultur aksenik. Pada dasarnya sterilisasi spora CMA ada beberapa tahap yaitu, membersihkan permukaan spora, pelembutan permukaan spora dan sterilisasi dengan antibiotik. Membersihkan permukaan spora menggunakan kloramin T (2%) (Chabot 1992), Bayclin (Buce et al. 2000) dan Alkohol (Declerck 1998). Pelembutan spora (surfactant) Tween (20/80) dan zat pembunuh bakteri atau
75
antibiotik antara lain gentamisin, streptomisin dan penisillin. Menurut Buce et al. (2000) penggunaan antibiotik lebih bervariasi, karena ada penambahan tetrasiklin 2,5 mg/l yang berfungsi sebagai sokterapi, serta menggunakan MgSO4 .7H2 O 0,1 % steril untuk mencegah dormansi. Selain menggunakan zat tersebut, inkubasi dalam suhu rendah (4 o C) dapat mencegah dormansi (Diop 2003, Buce et al. 2000). Sejumlah metode sterilisasi spora telah dipublikasikan, Paula & Siqueira (1990) menyatakan bahwa sterilisasi permukaan spora digunakan secara rutin, tetapi
dilaporkan
keberhasilannya
kontradiktif.
Mosse
(1962)
berhasil
memperoleh spora steril mencapai 90 %, metode tersebut digunakan oleh Mertz et al. (1979) menyatakan bahwa spora steril hanya mencapai 32-68 %. Sterilisasi permukaan spora CMA tidak selalu berhasil baik, kegagalan disebabkan adanya bakteri yang berhubungan erat dengan dinding spora. Bakteri menempel di permukaan spora, namun ada beberapa bakteri tinggal di dalam dinding spora. Mikroorganisme tersebut dapat terdeteksi ketika spora dikulturkan pada medium sesuai (Frances et al. 1996). Proses sterilisasi perlu dipertimbangkan beberapa hal, yaitu karakteristik spora, yang tergantung jenis CMA, meliputi permukaan dan ketebalan dinding spora (Frances et al. 1996). Faktor yang harus diperhatikan dalam penyediaan inokulum steril adalah teknik sterilisasi, sumber spora, media perkecambahan spora, dan bahan sterilisasi (Bianciotto & Bonfante 1993). Faktor penting untuk produksi inokulum adalah pemilihan inang kompatibel terhadap CMA, medium, infektivitas dan efektivitas inokulum harus tinggi, kolonisasi akar inang cepat dan menghasilkan spora banyak (Bagyaraj 1992). CMA tidak memilih inang spesifik, semua tanaman berpotensi terinfeksi CMA, namun tingkat infektivitas dan efektivitas berbeda setiap kombinasi inang dan CMA. Meskipun CMA tertentu dapat menginfeksi dan kolonisasi akar tanaman, namun ada yang lebih disukai, yang memperlihatkan respons simbiosis kolonisasi akar maksimum (Bakhtiar 2002). Declerck et al. (2000) menyatakan bahwa faktor yang berpengaruh terhadap perkecambahan spora CMA adalah nutrisi, perlakuan kimia, dan faktor genetik CMA. Buce et al. (2000) menyatakan bahwa spora tanpa inang atau
76
dikecambahkan dala m media biasa dapat berkecambah, walaupun persentase perkecambahan sangat rendah. Konsentrasi Mg dan Zn dalam media, dapat menghambat perkecambahan spora (Diop et al. 1994). Gianinazzi-Pearson et al. (1989)
menyatakan
bahwa
flavonoid
alami
atau
sintetik
merangsang
perkecambahan CMA. Pemilihan kualitas inokulum merupakan hal penting baik untuk kultur in vitro maupun in vivo (Vestberg & Uosukainen 1996). Inokulum diharapkan dalam kondisi murni sehingga mampu memberikan efek biologis yang diinginkan. Di samping itu spora maupun propagul dalam kondisi infektif dan efektif terhadap pertumbuhan (Vestberg
& Uosukainen 1996, Declerck et al.
1996b, Plenchette et al. 1996). Medium modifikasi minimal MM (Becard & Fortin 1988) salah satu medium kultur ganda yang digunakan dalam perkembangan dan produksi CMA in vitro. Strullu & Romand (1986) mengembangkan media kultur ganda yang disebut MSR. Kedua medium tersebut pada umumnya digunakan untuk perkembangan CMA dan mempelajari simbiosis dua organisme, yaitu CMA dan inang. Kehadiran tanaman merupakan faktor penting dalam perkembangan CMA, hal ini disebabkan CMA bersifat obligat dan eksudat tanaman membantu perkecambahan spora CMA. Perkecambahan spora terjadi apabila kondisi fisiologi dan beberapa faktor fisik serta lingkungan dipenuhi. Becard & Pfeffer (1989b) menyatakan bahwa pertumbuhan tabung benih terjadi 1-3 minggu tergantung dari jenis cendawan, tetapi pertumbuhan berhenti apabila tidak ada inang di lingkungan tersebut. Kehadiran inang merangsang perkecambahan, hal tersebut terkait dengan eksudat tanaman (Twaraya et al. 1996). Oleh karenanya eksudat diperlukan untuk perkembangan dan pertumbuhan CMA, yaitu proses kolonisasi akar. Giovannetti et al. (1993) menyatakan bahwa CMA dapat aktif apabila eksudat berada di lingkungan perkecambahan spora. Tujuan penelitian untuk mendapatkan (1) metode sterilisasi spora CMA, (2) media dan tanaman inang yang cocok untuk penyediaan spora CMA steril, dan (3) teknik perkembangan G. margarita dan A. tuberculata in vitro dengan inang eksplan tomat dan wortel.
77
1. BAHAN DAN METODE
Percobaan dilakukan di Laboratorium Biomolekuler dan Rekayasa Genetik, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, dan Laboratorium Fisiologi Tumbuhan Jurusan Biologi FMIPA Institut Pertanian Bogor. Penelitian dimulai bulan April 2004 –Januari 2006. Penelitian terdiri dari tiga percobaan yaitu (1) perkecambahan spora dalam kondisi tidak steril, (2) optimasi metode strerilisasi spora CMA dan (3) penyediaan inokulum steril G. margarita dan A. tuberculata
2.1. Perkecambahan spora dalam kondisi tidak steril Perkecambahan spora tanpa sterilisasi dilakukan untuk mengetahui lama waktu perkecambahan G. margarita dan A. tuberculata, masing- masing berjumlah 5 spora, dan diulang sebanyak tiga kali. Spora diperoleh dari perbanyakan kultur pot di rumah kaca dengan metode tuang saring basah (Pacioni 1992), dan dilanjutkan dengan metode sentrifugasi (Brundrett et al. 1994). Sebanyak 50 g media zeolit diaduk dengan air sebanyak 200–300 ml, kemudian disaring menggunakan satu set saringan berukuran 1000 µm, 250 µm dan 45 µm secara berurutan dari atas paling besar. Partikel yang tertinggal pada saringan berukuran 450 µm dan 45 µm disentrifugasi dengan kecepatan 2.000-2500 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan tabung diisi larutan gula 50% yang berfungsi untuk menjerap spora, selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan dan waktu yang sama. Lapisan gula diambil dan dituang dalam saringan berukuran 45 µm, dan dicuci dengan air mengalir sampai larutan gula hilang. CMA yang diperoleh siap untuk disterilisasi. Hasil sieving spora diletakkan di atas kertas selulase, kemudian di masukkan ke dalam medium zeolit yang steril dan yang tidak steril, selanjutnya diinkubasi di dalam ruang gelap. Pengamatan dilakukan pada setiap minggu selama 10–12 minggu. Peubah yang diamati adalah waktu perkecambahan dan persentase perkecambahan. Analisis dilakukan secara statistik kualitatif, dan hasil tersebut digunakan sebagai standar waktu perkecambahan spora yang disterilkan pada percobaan selanjutnya.
78
2.2. Optimasi metode sterilisasi Spora CMA yang digunakan adalah hasil perbanyakan di rumah kaca dengan kultur pot terbuka (konvensional). Beberapa metode sterilisasi yang diuji adalah Buce et al. (2000) sebagai sterilisasi 1, Chabot (1992) sterilisasi 2, dan Declerck (1998) sterilisasi 3 (Lampiran 9). Optimasi metode sterilisasi, masing- masing metode menggunakan 300 butir spora uji (30 butir x 10 ulangan), dikultur pada medium agar murni. Waktu perkecambahan dibatasi 10-12 minggu, kecuali ada kontaminasi. Peubah yang diukur adalah persentase perkecambahan dan lama waktu perkecambahan. Sterilisasi dikatakan baik apabila menghasilkan spora steril berkecambah, dan selanjutnya digunakan untuk sterilisasi spora. 2.3. penyediaan inokulum steril G. magarita dan A. tuberculata. 2.3.1. Persiapan inang wortel dan tomat Biji wortel dan tomat disterilkan dengan alkohol 70% selama 3 menit dan Bayclin 30% (NaOCl2 1,56%) selama 5 menit, kemudian dicuci tiga kali dengan akuades steril. Benih steril dikecambahkan dalam cawan Petri berisi kertas saring steril, dilembabkan dengan akuades steril, sampai berumur dua minggu. Lima kecambah dari masing- masing tanaman dikulturkan dalam botol berisi medium MS. Untuk tanaman tomat dilakukan penggandaan tunas aksiler pada medium MS ditambah 0,1; 0,5 dan 1,0 mg/l kinetin. Kultur diinkubasi dalam ruang bercahaya 75-100 luks 12 jam/hari, Rh 80-90 % dan suhu 26 o C. Inang siap diinokulasi spora CMA uji. 2.4. Pelaksanana percobaan Kecambah steril tanaman wortel dan tomat berumur 2-3 minggu di kulturkan masing- masing pada medium MS dengan penambahan kinetin 0,1; 0,5; dan 1,0 mg/l. Setelah diperoleh konsentrasi kinetin optimal untuk pembentukan dan penggandaan tunas, tanaman tomat diadaptasikan pada medium kultur ga nda yaitu medium minimum (MM) (Becard & Fortin 1988) dan medium Strullu & Romand (1986) (MSR) sampai terbentuk akar baru lebih banyak. Selanjutnya spora CMA di saring (sieving) dan disterilisasi menggunakan metode modifikasi
79
Buce et al. (2000) (Lampiran 10). Inokulasi spora steril menggunakan pipet mikro 10 µl mengandung 10 butir spora untuk G. margarita, dan 20 butir spora A. tuberculata. Penyemprotan spora diletakkan langsung di ujung akar, selanjutnya kultur diinkubasi dalam ruang bercahaya 75-100 luks 12 jam/hari dengan Rh 80-90 %, suhu 26 o C. Untuk G. margarita digunakan kertas selulase steril, sedang A. tuberculata tidak menggunakan kertas selulase. Pengamatan dilakukan setiap minggu, sampai umur 3 bulan, peubah yang diukur yaitu waktu perkecambahan, persentase perkecambahan spora steril, perkembangan hifa eksternal, sporulasi dan persentase infeksi akar serta pengamatan histologi akar tanaman. Untuk pengukuran hifa eksternal dilakukan dengan pembanding dan pemberian skor nilai kategori.
Skor nilai 1 untuk
pertumbuhan hifa tidak banyak (pertumbuhan hifa sedikit), nilai 2 pertumbuhan hifa agak banyak, nilai 3 pertumbuhan hifa banyak dan skor 4 pertumbuhan hifa sangat banyak. Berdasarkan nilai tersebut dibuat sebaran kategori yaitu skor nilai 1,0-1,9 dinyatakan bahwa pertumbuhan hifa eksternal tidak banyak, 2,0– 2,9 pertumbuhan hifa cukup banyak, 3,0–3,9 pertumbuhan hifa banyak, dan lebih dari 3,9 sangat banyak. Percobaan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola faktorial 2x2x2x5 lima kali ulangan. Analisis terhadap masing- masing faktor dan interaksi tiga faktor. Faktor pertama jenis medium, yaitu medium MM dan MSR. Faktor kedua jenis CMA yaitu G. margarita dan A. tuberculata, dan faktor ketiga jenis tanaman inang yaitu wortel dan tomat in vitro, serta korelasi masing- masing peubah. Hasil penelitian masing- masing percobaan dianalisis varian, sedang kesimpulan diambil berdasarkan uji F (Fisher test), apabila hasil uji F tersebut menunjukkan beda nyata atau beda sangat nyata antar perlakuan, maka pengujian dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan (DMRT) tingkat kepercayaan 95% ( P< 0,05).
80
3. HASIL
3.1. Perkecambahan spora tidak steril Perkecambahan spora tidak steril dikultur dalam medium zeolit. Hasil perkecambahan antara G. margarita dan A. tuberculata berbeda, dan media zeolit disterilisasi dapat menghambat perkecambahan spora G. margarita maupun A. tuberculata. Medium zeolit tidak disterilisasi waktu perkecambahan G. margarita 12–16 hari setelah tanam, sedang media zeolit steril 14–18 hari setelah kultur. Sedang persentase perkecambahan masing- masing 100 % untuk media tidak steril, dan 93 % media steril (Tabel 6.1.).
1000 µm B
A
Gambar 6.1. Ciri spesifik CMA yang digunakan di dalam penelitian A. bulbus (G. margarita= 380 µm) B. suspensor (A. tuberculata = 400 µm)
Tabel 6.1. Perkecambahan spora yang tidak disterilisasi pada medium zeolit Jenis Inokulum
Media zeolit
G. margarita
A. tuberculata
Jumlah kecambahan
% Perkecamb ahan
Tidak steril
Waktu perkecamb ahan (hari) 12 -16
15
100
Steril
14 -18
14
93
Tidak steril
60-70
13
83
Steril
65 - 75
12
80
A. tuberculata memerlukan waktu perkecambahan 60–70
hari setelah
kultur, waktu perkecambahan dengan media zeolit steril memerlukan waktu perkecambahan 65–75 hari setelah tanam. Persentase perkecambahan sedikit lebih rendah, yaitu 83% untuk medium tidak steril dan 80% untuk medium steril (Tabel
81
6.1.). Media zeolit steril sedikit menghambat perkecambahan kedua CMA uji. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa kisaran waktu yang diperlukan untuk perkecambahan spora G. margarita 12–18 hari, dan A. tuberculata 60–75 hari.
3.2. Optimasi sterilisasi spora Sterilisasi spora CMA uji menggunakan beberapa metode yaitu Buce et al. (2000) sterilisasi 1, Chabot (1992) sterilisasi 2, dan Declerck et al. (1998) sterilisasi 3. Sterilisasi spora belum didapat hasil memuaskan oleh karena spora pecah dan hilang atau larut dalam pencucian.
Sterilisasi dimodifikasi baik
konsentrasi bahan, lama waktu sterilisasi, media, dan penggunaan agar dari Swallow (merek dagang) diganti dengan “gelrite” yaitu agar murni, pada umumnya untuk media kultur in vitro (Lampiran 10) . Hasil modifikasi sterilisasi pertama, belum memperlihatkan spora kecambah bebas dari kontaminasi. G. margarita berkecambah dalam waktu 34 hari hanya 1 spora dari 300 spora yang disterilkan atau 0,3 % (Tabel 6.2.). Spora tersebut dipindahkan ke dalam medium kultur ganda dengan inang akar rambut, ternyata setelah 3 hari dikultur mengalami kontaminasi. Sterilisasi gaga l, hampir merata terjadi kontaminasi hebat. Kemudian dilakukan modifikasi konsentrasi dan lama waktu sterilisasi kedua. Hasil yang diperoleh relatif sama, hanya sedikit peningkatan spora berkecambah 0,7 % ( Tabel 6.3) Tabel 6.2. Perkecambahan spora steril pada media agar murni (modifikasi 1) Jenis inokulum
Jenis sterilan
G. margarita
1 2 3 1 2 3
A. tuberculata
Waktu perkecambahan (hari) 34 22-30 24-32 46 40 56
Keterangan : * = spora terkontaminasi
Rataan jumlah kecambah 0,003 51,0±4,93 53,66±9,12 5,7±3,51 4,60±2,06 7,0±2,42
Persentase perkecambahan (%) 0,3 51,0* 53,7* 53,0* 4,7* 7,0*
82
Tabel 6.3. Perkecambahan spora steril pada media agar murni (modifikasi II) Jenis inokulum
G. margarita
A. tuberculata
Jenis Waktu sterilan perkecambahan (hari) 1 34 2 22-30 3 24-33 1 46 2 40 3 56
Rataan jumlah kecambah 0,007 52,0±4,98 58,66±9,72 5,3±3,51 4,60±2,96 7,0±2,0
Persentase perkecambahan (%) 0,7 51,3* 54,7* 53,0* 4,7* 7,0*
Keterangan : * = spora terkontaminasi
Modifikasi sterilisasi ketiga, nampak ada peningkatan perkecambahan spora walaupun masih sangat rendah, yaitu 2 % pada medium agar murni. Hal tersebut tampak bahwa dari ketiga metode sterilisasi yang digunakan, hanya metode sterilisasi Buce et al. (2000) yang menghasilkan spora berkecambah. Modifikasi sterilisasi kesatu hingga ketiga menunjukkan adanya peningkatan berkecambah spora dari 0,3 %, 0,7 %, modifikasi ketiga 2 %, dan kontaminasi dapat ditekan (Tabel 6.2., 6.3., 6.4.). Hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa modifikasi bahan sterilan dan waktu sterilisasi belum mampu menginduksi perkecambahan spora optimal. Tabel 6.4. Perkecambahan spora steril dikultur pada medium agar urni, Potato agar dan MS ( modifikasi III) Jenis CMA
Gigaspora margarita
Sterilan
Medium
1
Agar murni Kentang MS Agar murni Kentang MS Agar murni Kentang MS Agar murni Kentang MS Agar murni Kentang MS Agar murni Kentang MS
2
3
Acaulospora. tuberculata
1
2
3
Waktu perkecambahan (hari) 30 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75
Rataan jumlah kecambah 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Persentase perkecambahan (%) 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
83
3.3. Perkemba ngan spora kultur aksenik Perkembangan spora CMA kultur aksenik membutuhkan inang, karena CMA bersifat obligat. Tanaman tomat dan wortel in vitro digunakan sebagai inang. Perbanyakan wortel dengan biji, sedang tomat dengan tunas aksiler. Perbanyakan tunas aksiler menggunakan medium MS dengan penambahan kinetin, yaitu zat pengatur tumbuh merangsang terbentuknya tunas. Hasil menunjukkan bahwa konsentrasi kinetin terbaik untuk inisiasi tunas tomat adalah 0,5 mg/l. Konsentrasi kinetin 0,1 mg/l membutuhkan waktu inisiasi tunas 5– 9 hari setelah kultur, sedang konsentrasi 0,5 dan 1,0 mg/l membutuhkan waktu inisiasi tunas 5-7 hari setelah kultur. Selanjutnya penggandaan tunas tomat dalam medium MS dengan penambahan 0,5 mg/l kinetin (Lampiran 13). Hasil terbaik ditetapkan untuk penggandaan tunas aksiler tanaman tomat yaitu kinetin 0,5 mg/l. Setelah hasil optimasi sterilisasi ditemukan yaitu modifikasi ketiga, sterilisasi I (Buce et al. 2000), jenis agar diganti dari agar swallow (komersial) menjadi ”gelrite” yaitu agar khusus untuk kultur jaringan dan penelitian, agar tersebut lebih murni dibandingkan dengan swallow. Tanaman inang di kultur dalam medium kultur ganda yaitu medium modifikasi minimal MM (Becard & Fortin 1988) dan MSR (Strullu & Romand 1986). Hasil modifikasi sterilisasi spora yang diinokulasikan pada inang wortel dan tomat in vitro, dikultur pada kedua medium kultur ganda yang menggunakan ”gelrite” menunjukkan bahwa spora steril CMA uji (G. margarita dan A. tuberculata) dapat berkecambah. Waktu perkecambahan G. margarita steril antara 11-15 hari untuk medium MM dan 11-16 hari untuk MSR baik pada inang wortel maupun tomat. Waktu perkecambahan A. tuberculata 40-50 hari setelah inokulasi pada inang tomat maupun wortel, baik pada medium MM maupun MSR. Hasil perlakuan jenis media, dan jenis inang, menunjukkan bahwa persentase perkecambahan G. margarita pada medium MM 78,7 % inang wortel dan 54,4 % inang tomat. Sedang persentase perkecambahan A. tuberculata 76,5 % inang wortel dan 67,6 % inang tomat, dalam waktu 3 bulan setelah inokulasi. Medium MM lebih baik dibandingkan dengan MSR, dan inang wortel lebih baik
84
dibandingkan dengan inang tomat baik pada persentase perkecambahan spora, hifa eksternal, sporulasi dan persentase infeksi akar (Tabel 6.5). CMA uji steril dapat berkembang pada kedua jenis medium kultur ganda, dengan kedua jenis inang, yaitu ekaplan tomat dan wortel. Namun Spora steril CMA uji berkembang paling baik menggunakan medium MM dengan inang wortel. Hasil yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa kedua macam media kultur ganda, dan kedua jenis inang kompatibel untuk perkembangan spora steril. Selanjutnya tampak bahwa hifa dapat berkembang, menginfeksi akar dan di dalam kortek akar membentuk struktur organ CMA yaitu hifa internal, arbuskula, dan vesikula. Hasil menunjukkan bahwa masing- masing peubah berkorelasi positif, dan nilai korelasi mendekati 1 artinya berkorelasi sangat erat (Tabel 6.6.). Faktor jenis inang wortel dan tomat memberikan pengaruh nyata
terhadap
persentase
perkecambahan, infeksi akar, dan hasil terbaik pada eksplan wortel. Faktor jenis CMA yaitu G. margarita dan A. tuberculata berpengaruh nyata terhadap peubah yang diukur (Tabel 6.5.). Tabel 6.5. Perlakuan jenis media, jenis CMA dan jenis inang terhadap peubah umur 3 bulan setelah tanam Peubah
Jenis media
% perkecambahan Hifa eksternal
MM MSR MM MSR MM MSR MM MSR
sporulasi (butir) % infeksi akar
Gigaspora Wortel Tomat 78,7 a 24,0 c 2,6 ab 1,0 de 3,6 c 0,0 d 60,2 b 30,0 c
54,4 b 8,0 d 2,8 a 0,4 e 3,6 c 0,0 d 60,8 b 12,08 d
Acaulospora Wortel Tomat 76,5 a 19,3 cd 3,2 a 2,0b c 12,0 a 2,0 cd 72,0 a 31,0 c
67,6 a 10,3 d 3,0 a 1,4c d 9,0 b 1,8 d 58,0 b 30,2 c
Keterangan*) : Huruf yang sama pada baris dari masing-masing peubah tidak berbeda nyata berdasarkan uji BNT (P< 0,05). MM = Medium modifikasi minimum (Becard & Fortin, 1988), MSR= Medium modifikasi minimal ( Strullu & Romand, 1986)
85
Tabel 6.6. Korelasi antar peubah pada umur 3 bulan setelah tanam Peubah
% Perkecambahan
Hifa eksternal
Sporulasi
Hifa eksternal
0,8*
-
0,8*
Sporulasi
0,7*
0,8*
-
Infeksi akar
0,9*
0,9*
0,7*
Keterangan : * ada korelasi
3.4. Perubahan struktur organ CMA uji dalam akar inang A. tuberculata di dalam kultur monoaksenik berkecambah membentuk hifa (Gambar 6.2.A), hifa eksternal berkembang (Gambar 6.2.B). A. tuberculata menginfeksi akar membentuk hifa internal dan hifa sekunder (Gambar 6.2.C), membentuk spora baru (Gambar 6.2.D). Demikian pula pada G. margarita (Gambar 6.3.A,B,C dan D). Perkembangan spora G. margarita maupun A. tuberculata terjadi perubahan warna. Spora terbentuk di antara hifa berwarna putih merupakan spora muda (Gambar 6.4.A). Selanjutnya warna spora berubah menjadi kuning pucat, dan kuning tua disebut spora dewasa atau spora masak (Gambar 6.4.B). Demikian pula terjadi pada A. tuberculata, perubahan warna dari cokelat muda menunjukkan spora muda, berkembang menjadi cokelat agak tua dan cokelat tua (Gambar 6.4.C dan 6.4.D).
86
A
A
1000 µm
B
A
C
D
Gambar.6.2. Perkembangan A. tuberculata monoaksenik dengan eksplan dalam kultur ganda umur 3 bulan setelah tanam A. spora berkecambah (400 µm), B. hifa eksternal (1µm), C. infeksi akar (hifa sekunder 15 µm) D. Sporulasi (100 µm).
87
1000 µm A
B
C
D
Gambar 6.3.Perkembangan G. margarita monoaksenik dengan eksplan kultur ganda umur 3 bulan setelah tanam A. Spora berkecambah (350 µm), B. Hifa eksternal (1µm), spora muda (200 µm), C. Infeksi akar (hifa jelajah 2 µm, hifa sekunder 10 µm), D. Sporulasi (350µm)
A
1000µm
C
D B Gambar 6.4.Perubahan warna selama perkembangan spora A. G. margarita Spora muda (200 µm) dan B. spora masak (350 µm). C. A. tuberculata C. spora masak (400 µm). dan D. spora muda (350 µm).
88
Perkembangan
struktur
CMA
ke
dalam
sel
akar
dimulai
dari
perkecambahan, selanjutnya hifa berkembang dan menginfeksi akar (Gambar 6.5.A), membentuk apresorium. Hifa eksternal membentuk percabangan hifa (Gambar 6.5.B), dan hifa menginfeksi akar, masuk dalam sel kortek membentuk hifa internal dan antar sel (Gambar 6.5.C). Hifa internal bercabang membentuk arbuskula (Gambar 6.5.D), dan hifa yang menggelembung atau membengkak membentuk vesikula (khusus pada A. tuberculata) (Gambar 6.5.E), selanjutnya membentuk spora baru (Gambar 6.5.F).
1000 µm A
B
C
D
D D
E
F
Gambar 6.5. Perkembangan struktur organ CMA dalam akar secara histologis, A. hifa menginfeksi akar inang = 350 µm, B. Hifa eksternal bercabang, C. hifa internal (hifa sekunder 7 µm, dan penjelajah 2 µm), D. Arbuskula (100 µm), E vesikula (100 µm), dan F. spora baru (sporulasi F = 350 µm)
89
4. PEMBAHASAN 4.1. Perkecambahan spora tanpa sterilisasi Spora yang digunakan adalah G. margarita dan A. tuberculata. G. margarita mempunyai ciri adanya bulbus, spora berwarna kuning kecokelatan, berdinding tipis, terdiri dari satu lapis dengan permukaan halus. A. tuberculata mempunyai ciri khas adanya sisa sel induk yang disebut suspensor, spora berwarna cokelat gelap, berdinding tebal terdiri dari tiga lapis, dan permukaan spora seperti kulit jeruk kerlekuk. G. margarita berkecambah melalui permukaan spora, akibat pecahnya tabung perkecambahan spora dan mengeluarkan hifa, demikian pula pada A. tuberculata (Lucia 2005). Hasil uji spora tanpa disterilisasi menunjukkan bahwa G. margarita berkecambah lebih cepat, sedang A. tuberculata memerlukan waktu agak panjang, hal tersebut bisa dipahami karena kedua jenis CMA memiliki morfologi dan fisiologi berbeda, sehingga memberikan respons perkecambahan berbeda. Perbedaan morfologi G. margarita memiliki lapisan lebih tipis dibandingkan dengan A. tuberculata sehingga waktu perkecambahan lebih cepat (Tabel 6.1.). Lucia (2005) menyatakan bahwa A. tuberculata mempunyai dinding relatif tebal, terdiri dari tiga lapis, permukaan kasar, kondisi ini mungkin dapat menyebabkan waktu perkecambahan relatif lebih lama dibandingkan denga n G. margarita. Media zeolit yang disterilkan menghambat perkecambahan, dan belum mampu menekan kontaminasi. Tampak bahwa sterilisasi zeolit bukan faktor penentu untuk perkecambahan spora, dan sumber kontaminasi diduga berasal dari spora itu sendiri. Hal ini disebabkan dalam spora CMA terdapat organisme lain yang hidup di lapisan dinding sebelah dalam CMA (Frances et al. 1996). Banyak faktor mempengaruhi perkecambahan spora, terutama faktor dalam CMA itu sendiri, dan tanaman inang. Eksudat tanaman inang
mampu mempercepat
pecahnya tabung kecambah. Twaraya et al. (1996) menyatakan bahwa hadirnya inang dapat merangsang perkecambahan, hal
tersebut
terkait
terbentuknya eksudat tanaman. Oleh karena eksudat diperlukan
dengan
untuk suatu
langkah awal perkembangan dan pertumbuhan CMA, yaitu proses kolonisasi
90
akar. Giovannetti et al. (1994) menyatakan bahwa CMA dapat aktif apabila eksudat akar ada di lingkungan perkecambahan.
4. 2. Optimasi Sterilisasi spora Sebelum dilakukan modifikasi, proses sterilisasi memberikan hasil yang kurang memuaskan, spora pecah, kosong dan bahkan hilang. Hal tersebut mungkin disebabkan konsentrasi bahan sterilan dan lama waktu sterilisasi, serta teknik sterilisasi kurang tepat, sehingga spora mungkin lisis atau kosong, dapat pula merubah warna spora, sehingga spora tidak dapat berkecambah. Disatu sisi tingkat kontaminasi sangat tinggi, dan dalam waktu singkat hampir semua kultur terkontaminasi. Frances et al. (1996) memperlihatkan permukaan spora sebelum disterilisasi spora berlendir, membentuk pupil atau tonjolan mengkilat, diduga adanya bakteri. Bakteri tersebut menempel di permukaan spora, namun ada beberapa bakteri yang tinggal di dalam dinding spora. Kondisi ini menyebabkan sulitnya memperoleh spora steril. Will & Sylvia (1990) menyatakan bahwa organisme yang berhubungan dengan permukaan spora CMA dapat saling merangsang, dapat pula menghalangi atau menunda perkecambahan spora. Metode sterilisasi Buce et al. (2000) memberikan hasil terbaik untuk sterilisasi spora, yaitu MgSO4 .7H2 O dan Tween 20 steril. MgSO4 .7H2 O berfungsi untuk mencegah dormansi spora (Frances et al. 1996). Fortin et al. (2002) menyatakan bahwa Tween 20 berfungsi untuk pelembut spora, sehingga fungsi sterilan untuk membunuh organisme pencemar dapat bekerja secara optimal, dan NaOCl2 0,52 % (Bayclin 10 %) berfungsi untuk membersihkan permukaan spora. Penggunaan antibiotik streptomisin berfungsi membunuh bakteri gram negatif, penisillin membunuh bakteri gram positif, gentamisin dan tetrasiklin mempunyai spektrum lebih luas berfungsi membunuh kuman bersifat gram negatif maupun positif dan sokterapi. Banyaknya jenis antibiotik yang digunakan dalam metode sterilisasi Buce et al. (2000), agar fungsi antibiotik lebih luas. Chabot (1992) menyatakan bahwa sterilisasi permukaan spora dengan Tween 20 dan Khloramine T, berfungsi sebagai pelembut dan pembersih bakteri. Spora CMA steril menunjukkan permukaan yang halus, tidak berlendir (Frances et al. 1996).
91
Sterilisasi permukaan spora menggunakan alkohol dan kalsium hipokhlorit Declerck (1998). Dari tiga macam metode sterilisasi hanya Buce et al. (2002) yang menggunakan antibiotik lebih beragam, dan terapi untuk mencegah dormansi, sehingga spora CMA G. margarita yang dikultur dalam agar murni mampu berkecambah, walaupun persentase perkecambahan masih sangat rendah. Modifikasi sterilisasi ketiga dari semua metode yang digunakan, kontaminasi spora dapat ditekan namun spora masih belum mampu berkecambah. Banyak faktor yang dapat menyebabkan spora steril tidak berkecambah, antara lain pengaruh bahan sterilan, faktor internal CMA yaitu dormansi, ketidak hadiran inang dan kompatibilitas inang, organisme pencemar, nutrisi media, dan faktor lingkungan yang kurang mendukung (Will & Sylvia 1990, Diop et al. 1994, Giovanetti et al. 1993). Beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam melakukan sterilisasi, yaitu jenis CMA, teknik sterilisasi, waktu dan bahan sterilan. Sedang prinsip
pokok
sterilisasi
spora
adalah,
mensterilkan
permukaan
spora,
melembutkan dinding permukaan spora, dan jenis anti biotik yang lebih beragam, sehingga dapat berfungsi secara optimal, serta perlakuan pencegahan dormansi spora. Perkecambahan
spora
merupakan
titik
awal
pertumbuhan
dan
perkembangan spora. Apabila spora tidak mampu berkecambah, maka proses simbiosis tidak berjalan. Di dalam pengembangan dan produksi inokulum secara in vitro penyediaan spora steril dan mampu berkecambah, merupakan tuntutan utama yang harus dipersiapkan. Faktor yang perlu diperhatikan di dalam penyediaan inokulum steril adalah teknik sterilisasi, sumber spora, media untuk perkecambahan spora, bahan sterilan, nutrisi, perlakuan kimia, inang dan faktor genetik CMA (Bianciotto & Bonfante 1993, Frances et al. 1996, Chabot 1992, Fortin et al 2000 Declerck et al. 1996) Sterilisasi
spora dapat mempengaruhi perkecambahan spora, baik
menghambat maupun mematikan, terjadi pecahnya spora dan spora kosong. Setelah dimodifikasi kontaminasi spora dapat ditekan, tetapi spora belum memberikan hasil perkecambahan optimal. de-Souza & Declerck (2003) menyatakan bahwa kegagalan perkecambahan mungkin disebabkan
kerusakan
tabung perkecambahan atau fisiologi CMA, misalkan spora belum matang, faktor
92
lingkungan kurang mendukung, pengaruh bahan, lama waktu dan teknik sterilisasi kurang tepat, sehingga dapat mempengaruhi tabung perkecambahan dan akhirnya spora tidak mampu berkecambah. Giovanetti et al. (1993) menyatakan bahwa perlakuan bahan kimia dapat menghambat perkecambahan. Demikian pula konsentrasi Zn dan Mg dalam media turut andil di dalam perkecambaha n yang berdampak menghambat, sedang kehadiran eksudat tanaman sangat diperlukan, karena bersifat chemoattraktif terhadap hifa CMA dan berdampak memacu pecahnya tabung perkecambahan spora (Bianciotto & Bonfante (1993). Hasil modifikasi sterilisasi sampai tiga kali, hanya mampu meningkatkan persentase perkecambahan G. margarita dari 0,3 %, 0,7 % menjadi 2,0 % dari 300 butir spora masing- masing CMA uji. Namun hasil tersebut masih sangat jauh dari harapan. Setelah dilakukan modifikasi penggunaan agar konsumsi (Swallow) diganti ”gelrite” yaitu agar yang lebih murni, spora dapat berkecambah, dan meningkatkan persentase perkecambahan hanya dalam waktu relatif singkat. Diduga beberapa senyawa dalam agar komersial merupakan media yang baik untuk pertumbuhan bakteri, sehingga mempengaruhi perkecambahan CMA uji steril. Ternyata ”gelrite” ikut berperan di dalam memacu perkecambahan spora CMA steril.
4.3. Perkembangan spora kultur aksenik Hasil modifikasi sterilisasi dan penggunaan ”gelrite”, spora dapat berkembang dengan baik pada media kultur ganda MM dan MSR, dengan inang eksplan tomat dan wortel in vitro, namun sporulasi yang dihasilkan masih sangat rendah (percobaan 4.2.). G. margarita dan A. tuberculata yang diinokulasikan pada inang eksplan wortel dan tomat in vitro dapat berkecambah, dan G. margarita memerlukan waktu berkecambah 11 - 16 hari setelah inokulasi. Waktu yang diperlukan untuk perkecambahan dari kedua inang dan medium kultur ganda relatif sama. Hasil tersebut sesuai dengan pernyataan (de-Souza 2005) bahwa perkecambahan G. margarita terjadi antara 3–25 hari.
Perkecambahan A.
tuberculata lebih lambat yaitu 40-55 hari setelah inokulasi, baik pada eksplan wortel, maupun tomat yang dikultur pada medium MM maupun MSR. Perkecambahan spora CMA tergantung kondisi morfologi, dan fisiologi CMA
93
(Lucia 2005, Diop et al 1994, de-Souza 2005). Hasil tersebut menunjukkan bahwa perbedaan inang dan medium tidak mempengaruhi waktu perkecambahan, tetapi dapat menghambat perkembangan lebih lanjut antara kedua CMA uji. Mungkin berkaitan dengan konsentrasi P dalam medium, atau kompatibilitas inang. Inang yang kompatibel dapat meningkatkan perkecambahan, infeksi akar dan sporulasi spora CMA (Bagyaraj 1992, Bakhtiar 2002, Baron et al. 1995 ). Eksudat akar memberi pengaruh sangat signifikan dalam perkembangan spora CMA steril, karena dapat memacu pecahnya tabung perkecambahan dan berkembangnya hifa eksternal, juga menyediakan karbon sebagai sumber energi, serta mempengaruhi status fisiologis CMA (Juge et al. 2002, Diop et al. 1994). Perkecambahan spora CMA dan berkembangnya hifa merupakan titik awal yang sangat penting terjadinya asosiasi antara CMA dan inang (Orcutt & Nielsen 2000). Perlakuan dengan terapi suhu rendah (4o C), salah satu cara mematahkan dormansi, sehingga dapat merangsang percepatan proses perkecambahan (Fortin et al. 2002). Medium MM lebih sesuai untuk perkecambahan, sporulasi, dan infeksi akar tanaman inang dan CMA uji steril, karena kandungan fosfat lebih rendah (4,8 mg/l) dibandingkan dengan medium MSR yaitu 44 mg/l. Hal tersebut mungkin terkait dengan perbedaan konsentrasi P kedua medium tersebut. Konsentrasi P tinggi dapat menghambat terbentuknya eksudat akar, di satu sisi eksudat akar sangat diperlukan didalam perkembangan CMA steril, dari mulai fungsi penanda (sinyal) sampai terjadi perkecambahan spora, hifa berkembang, dan menginfeksi akar sampai terbentuk asosiasi dari kedua simbion, yang ditandai dengan terbentuknya struktur organ CMA dalam kortek akar (Labour et al. (2003). Hal tersebut terlihat adanya hubungan yang signifikan antara konsentrasi P dan pembentukan eksudat akar. Semakin tinggi konsentrasi P eksudat akar menurun dan sebaliknya (Pinior et al. 1999, Ezawa et al. 2000). Tamasloukht et al. (2003) menyatakan bahwa simbiosis antara CMA dengan akar tanaman inang dimulai setelah spora berkecambah, ditandai dengan percabangan hifa eksternal aktif,
berkembang dan kontak dengan akar
membentuk appresorium, dan membentuk hifa internal, hifa interseluler, arbuskula dan vesikula pada A. tuberculata sedang G. margarita tidak membentuk
94
vesikula, selanjutnya dapat membentuk spora baru (sporulasi). Jane et al. (1998) menyatakan bahwa spora berkecambah melakukan kontak dengan akar membentuk apresorium dan berkembang membentuk hifa internal, hifa intrasel, arbuskula, vesikula dan hifa koil. Perkembangan spora CMA dalam kortek akar mengalami perubahan struktur organ CMA yang terlihat dengan pewarnaan tripan blue. Hasil sporulasi rendah, dapat disebabkan oleh beberapa hal yaitu faktor lingkungan, media, inang dan umur kultur baru 3 bulan. CMA uji asli Indonesia, yang mempunyai suhu lingkungan rata-rata antara 30-31o C, dan kultur diinkubasi di ruang dengan suhu 26 o C, kurang sesuai dengan kondisi habitat alamnya, sehingga dimungkinkan faktor suhu ruang me nghambat sporulasi. Media dapat mempengaruhi perkembangan CMA, atau sporulasi secara tidak langsung, terkait dengan konsentrasi unsur P. Semakin rendah P dalam medium, meningkatkan eksudat akar, yang berperan dalam perkecambahan dan perkembangan hifa, sehingga CMA berkembang lebih optimal menginfeksi akar dan bersporulasi (Pinior et al. 1999, Ezawa et al. 2000, Labour et al. 2003). Peran inang dalam perkembangan kultur aksenik terkait dengan sifat obligat CMA, yaitu tanpa inang tidak dapat berkembang secara optimal, karena sumber karbon untuk pertumbuhan dan perkembangan CMA membutuhkan bantuan tanaman. Hanya inang yang kompatibel akan meningkatkan daya infektiv dan efektiv CMA Sancayaningsih (2005), Mansur et al. (2001) dan Lucia (2005). Perkembangan CMA membutuhkan waktu untuk berproses, hal tersebut nampak bahwa hasil pengamatan dari kultur pot, waktu 3, 4 dan 5 bulan meningkat baik persentase infeksi akar dan dan jumlah spora (Penelitian II). Hal tersebut menunjukkan bahwa umur dapat meningkatkan perkembangan dan perbanyakan spora CMA (Vaast & Zasoski 1998). Diop et al. (1992) menyatakan bahwa sporulasi G. margarita meningkat setelah umur 4 bulan diinokulasi. Sporulasi lebih aktif dimulai 6-12 bulan setelah inokulasi. Namun menurut (deSouza 2005) pembentukan spora Glomus pertama diperkirakan antara 10-12 minggu (2-3 bulan) setelah kolonisasi, sporulasi terjadi setelah 5–8 bulan, dan rata-rata produksi spora 56 butir setiap 30 ml, demikian pula pernyataan yang mendukung dari de-Souza (2005) dan Vaast & Zasoski (1991). Dari uraian
95
tersebut
menunjukkan
bahwa
meningkatnya
umur
kultur,
cenderung
meningkatkan sporulasi dan persentase infeksi akar. Diop & Declerck (2003) menyatakan bahwa terbentuknya struktur CMA dalam akar, sebagai ciri khas bahwa simbiosis tersebut sudah stabil, dan selanjutnya meningkatkan peran dari masing- masing simbion. Berkembangnya hifa eksternal merupakan sarana awal proses simbiosis, karena hifa akan menginfeksi akar, selanjutnya berperan di dalam pengambilan karbon sebagai sumber energi pertumbuhan dan perkembangan CMA. Sebaliknya CMA membantu dalam pengambilan nutrisi dan air melalui hifa, proses fotosintesis meningkat, sehingga memacu pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Hasil diperoleh menunjukkan bahwa perkembangan hifa paling banyak pada eksplan wortel yang diinokulasi dengan A. tuberculata bila dibandingkan dengan G. margarita, sehingga disimpulkan bahwa eksplan wortel lebih kompatibel untuk perkembangan spora A. tuberculata. Wilson
&
Tommerup
(1999)
menyatakan
bahwa
flavonoid
atau
isoflavonoid merupakan eksudat akar yang mempengaruhi perluasan hifa kearah akar. Penyebaran hifa dipengaruhi oleh faktor internal dan faktor eksternal. Faktor internal meliputi infektivitas dan efektivitas CMA, perkembangan hifa, agresifitas dan kepadatan propagul. Sedang faktor eksternal meliputi medium khususnya persediaan P, pH, suhu dan pencemaran. Infeksi hifa diawali dengan terbentuknya apresorium, menembus dinding sel tanaman, sebagai awal terjadinya simbiosis antara CMA dan akar tanaman. Sela njutnya terjadi perubahan struktur organ CMA membentuk organ
penting di antaranya, arbuskula, vesikula dan hifa
internal. Pembentukan organ CMA di dalam sel kortek akar menunjukkan adanya simbiosis dari kedua organisme tersebut stabil (Diop & Declerck 2002). Sehingga dapat dikatakan bahwa G. margarita dan A. tuberculata dapat dikembangkan secara in vitro. Dari hasil tersebut baik G. margarita maupun A. tuberculata paling baik dengan inang eksplan wortel yang dikultur pada medium MM. Hasil korelasi antar peubah menunjukkan bahwa setiap peubah berkorelasi positif dan sangat erat, hal tersebut dapat dimengerti karena perkecambahan, terbentuknya hifa eksternal maupun internal, dan sporulasi serta infeksi akar merupakan satu kesatuan perkembangan CMA. Hal tersebut mencerminkan
96
adanya simbiosis, dan simbiosis merupakan proses panjang dengan terbentuknya organ-organ CMA dalam akar, sehingga hasil yang diperoleh saling terkait. Diop & Declerck (2002) menyatakan bahwa terbentuknya struktur organ CMA dalam kortek akar, merupakan ciri spesifik terjadinya simbiosis stabil.
4.4. Perubahan struktur organ CMA dalam akar Perkembangan A. tuberculata (Gambar 6.5.) dan G. margarita (Gambar 6.6.), perkembangan spora muda ke spora masak digambarkan dengan perubahan warna G. margarita dan A. tuberculata (Gambar 6.7.), dan perkembangan struktur CMA didalam akar eksplan dari awal sampai dengan sporulasi (Gambar 6.8.). Pada dasarnya siklus hidup CMA dibagi tiga tahap. Tahap pertama yaitu penetapan simbiosis melibatkan aktivitas propagul, inang tanaman, apresorium, penetrasi akar, dan arbuskula. Tahap kedua tahap pertumbuhan, melibatkan hifa eksternal, internal dan ekstraradikal secara keseluruhan dapat meningkatkan biomasa, pembentukan struktur hifa dan perluasan CMA di luar maupun antar tanaman. Tahap ketiga reproduktif, melibatkan struktur reproduktif, di antaranya spora, propagul, serta hifa eksternal. Spora dorman propagul, dan hifa merupakan organ reproduktif utama dari Acaulosporae dan organ reproduktif Gigasporaceae pada umumnya spora (Heijden & Sanders 2002, Heijden et al. 1998). Perkecambahan merupakan kunci perkembangan simbiosis CMA dan inang. Selanjutnya diikuti perkembangan hifa eksternal meluas dan menginfeksi akar. Hifa eksternal mempunyai arti penting sebagai kunci CMA menyangkut simbiosis, dan bertanggung jawab di dalam kolonisasi akar inang (Smith & Read 1997 Giovannetti et al. 2000, Giovannetti et al. 2003). Jasa paling utama CMA adalah pengambilan, asimilasi, dan translokasi nutrisi di luar zona rhizosfir kepada akar tanaman, dan tugas tersebut dilaksanakan oleh ekstraradikal miselium CMA (Ezawa et al. 2002). Oleh karena itu umumnya CMA meningkatkan kesuburan tanaman, daya tahan terhadap serangan patogen, dan kekeringan (Ezawa et al. 2002). CMA juga menguntungkan pertanian (Jeffries et al. 2003), reklamasi lahan (de-Souza & Silva 1996). Penggunaan CMA merupakan sumber daya yang efisien dan dapat diperbaharui, di antaranya fosfat (Jakobsen 2000).
97
Ada dua langkah penyebaran dan perkembangan ekstraradikal sistem monoaksenik in vitro yaitu, perkembangan hifa berfungsi sebagai alur meluas secara radikal, dan pengembangan struktur arbuskula berperan untuk mengambil nutrient (Bago et al. 1998a). Miselium CMA adalah organ utama tidak bersekat dan mempunyai dua bentuk yaitu hifa jelajah berukuran lebih kecil dan hifa sekunder lebih besar (Mosse 1981). Hifa tidak bersekat membawa sitoplasma dengan
cepat,
tidak
hanya
membawa
sumber
daya
berkaitan
dengan
perkembangan dan penjelajahan hifa pada akar inang, tetapi juga mengangkut organel cendawan, yaitu mitokondria dan nukleus (Bago et al. 1998b, Bago et al. 1999). Struktur miselia utama ditandai dengan struktur organ yang disebut arbuskula, yaitu struktur khusus berbentuk dikotomis, dan berkembang membentuk selaput penghub ung antara fungal dan selaput plasma tanaman. Arbuskula diduga sebagai alat penghubung lokalisasi nutrien
dan pertukaran
karbon antar kedua simbion tersebut, sehingga arbuskula dianggap struktur kunci simbiosis antara tanaman dan CMA. Struktur arbuskula umumnya berumur pendek 1–3 minggu, ditemukan di dalam akar muda dan pembentukan arbuskula dikendalikan oleh sifat tanaman inang, serta ketersediaan nutrisi (Harrison 1999). Hifa internal berkembang membentuk gelembung yang disebut vesik ula berfungsi menyimpan lipid di dalam akar (Declerck et al. 1998). Struktur tersebut jumlahnya meningkat sejalan berkembangnya koloni akar, dan hanya dibentuk oleh keluarga Acaulosporaceae, Glomeraceae, dan Pacisporaceae. Hasil penelitian tampak bahwa infeksi spora G. margarita dan A. tuberculata baik kondisi steril (aksenik) maupun tidak, memiliki pola perkembangan struktur organ yang sama, yaitu spora berkecambah, hifa berkembang dan menginfeksi akar. Di dalam korteks akar hifa internal berkembang membentuk arbuskula dan vesikula. Perkembangan struktur organ CMA sebagai ciri khas perkembangan stabil membentuk asosiasi atau simbiosis antara CMA dan inang. Hasil menunjukkan teknik kultur aksenik in vitro baik dikembangkan untuk produksi spora steril, mempelajari interaksi CMA dan tanaman inang, maupun sebagai sumber inokulum steril untuk perkembangan kultur aksenik CMA uji dengan akar mupun akar rambut.
98
5. SIMPULAN
1. Sterilisasi spora A. tuberculata dan G. margarita terbaik adalah MgSO4 .7H2O (0,1 %) dan Tween 20 (10 %), NaOCl2 (0,52 %) (Bayclin 10 %), antibiotik gentamisin, streptomisin dan penisillin masing- masing 100 ppm serta tetrasiklin 2,5 ppm. 2. Spora A. tuberculata memerlukan waktu perkecambahan lebih lama dibandingkan dengan G. margarita. 3. Medium MM lebih baik dibandingkan dengan MSR untuk perkembangan dan atau penyediaan inokulum CMA uji steril (A. tuberculata dan G. margarita). 4. Wortel dan tomat kompatibel bersimbiosis dengan CMA uji. Wortel inang terbaik untuk penyediaan inokulum steril CMA uji in vitro dibandingkan dengan tomat. 5. Inokulum A. tuberculata dan G. margarita baik dikembangkan dalam kultur aksenik in vitro dengan inang ekspla n wortel dan media MM. .
.
BAB VII Perkembangan Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata In Vitro Dengan Teknologi Akar Rambut Wortel ABSTRAK CMA pada umumnya dimanfaatkan untuk perbaikan lingkungan, meningkatkan pertumbuhan tanaman, daya tahan terhadap pathogen serta kekeringan atau meningkatkan efisiensi penyerapan hara nutrisi. Salah satu upaya perbanyakan yang dilakukan adalah menggunakan kultur aksenik akar rambut in vitro. Tujuan penelitian untuk mengetahui (i) pertumbuhan akar rambut wortel pada medium MM dan MSR, (ii) pertumbuhan akar rambut wortel diinokulasi dan tidak diinokulasi G. margarita dan A. tuberculata steril (iii) perkembangan G. margarita dan A. tuberculata steril dengan inang akar rambut. (iv) perkembangan struktur organ G. margarita dan A. tuberculata steril ke dalam akar rambut. Bahan yang digunakan adalah G. margarita dan A. tuberculata steril, medium MM dan MSR (kultur ganda), dan inang akar rambut wortel. Rancangan percobaan dengan RAL faktorial 2x3x5, ulangan lima kali. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa bobot basah dan bobot kering akar rambut dalam medium MM dan MSR tidak berbeda nyata, demikian pula untuk akar rambut diinokulasi dan yang tidak, sehingga kedua medium tersebut digunakan untuk percobaan berikutnya. Waktu perkecambahan G. margarita antara 11-15 hari, sedang A. tuberculata 40-55 hari. Dalam medium MM dan MSR dengan inang akar rambut G. margarita dan A. tuberculata mampu berkecambah, menghasilkan hifa eksternal dan berkembang menginfeksi akar rambut wortel, membentuk hifa interna l, arbuskula, dan vesikula, serta bersporulasi. Dapat disimpulkan bahwa G. margarita dan A. tuberculata steril dan dapat dikembangkan secara in vitro dengan teknologi akar rambut. ----------------------Kata kunci : Akar rambut-wortel, G. margarita, A. tuberculata, kultur ganda, in vitro
In Vitro Development of Gigaspora margarita and Acaulospora tuberculata with Carrot Hairy Root Technique Abstract Numerous studies have demonstrated the beneficial role of arbuscular mycorrhizal fungi in improving plant growth by increasing resistance to drought and disease or by enhancing the efficiency of nutrient absorption. One of the efforts is to use axenic culture of hairy root in vitro. The objectives of this research were to study (i) the growth of carrot hairy root on the MM and MSR medium, (ii) the growth of carrot hairy root compared to non-inoculated hairy root, (iii) the development of G. margarita and A. tuberculata inoculated on hairy root culture, (iv) the structure organ of G. margarita and A. tuberculata
100
development in hairy root as AMF inoculum, were inoculated into carrot hairy root culture grown in MM and MSR media. The experiment was conducted by Completely Randomized Design Factorial 2x3x5 with five replications. The effect of media and inoculation on hairy root growth were studied using root histology. The result showed that the carrot hairy root fresh weight grown on MM or MSR was not significantly different. The inoculated and non-inoculated hairy root also tended to give the same result. The results showed that sterile G. margarita germinated in 11-15 days, while A. tuberculata germinated in 40-55 days. G. margarita and A. tuberculata spores on the two media germinated successfully, resulting in external hypha, sporulation, and root infection. It showed that G. margarita and A. tuberculata could be developed in carrot hairy root culture. ------------------------------Key words : Carrot hairy root, Agrobacterium rhizogenes, dual culture, G. margarita, A. tuberculata.
1. PENDAHULUAN
CMA
pada
umumnya
dimanfaatkan
untuk
perbaikan
lingkungan,
meningkatkan pertumbuhan tanaman, meningkatkan daya tahan terhadap patogen dan kekeringan. Oleh sebab itu upaya meningkatan produksi CMA ber kualitas menjadi prioritas (Smith & Read 1997). Peningkatan kualitas produksi CMA menggunakan kultur aksenik akar rambut in vitro, mendapatkan spora steril, berkualitas, efektif dan efisien (Fortin et al. 2002). Produksi spora CMA dengan kultur pot sering mengalami kendala dengan adanya kontaminasi, tidak efisien dan efektif, dan memungkinkan terkontaminasi dengan mikroorganisme pencemar yang berdampak negative dalam perbanyakan spora atau inokulum (Hijri et al. 2000). Kultur in vitro dengan pemanfaatan teknologi akar rambut dapat digunakan untuk mempelajari urutan perkembangan spora CMA (Dalpe & Declerck 2002), meningkatkan perbanyakan CMA, mendapat spora steril, berkualitas, efektif dan efisien (Fortin et al. 2002). Kultur aksenik akar rambut juga dapat dimanfaatkan untuk mempelajari urutan perkembangan spora CMA (Dalpe & Declerck 2002). Maka kultur aksenik atau perkembangan secara in vitro dengan akar rambut menyediakan perspektif baru untuk mengkulturkan CMA secara luas dan tidak merusak ekstraradikal miselium (Bago et al.1998 a).
101
Perkecambahan spora untuk kultur pot mencapai 59%, sedang kultur aksenik mencapai 70 %, dan hasil tersebut masih dapat ditingkatkan dengan memainkan faktor lingkungan (Declerck et al. 1998). Produksi spora yang dihasilkan oleh kultur aksenik in vitro antara 24-130 butir spora dalam 30 ml media, sedang kultur pot terbuka mencapai 2 spora dalam 100 gram tanah kering (Diop et al. 1992). Declerck et al. (2000 & 2001) menyatakan bahwa produksi spora G. margarita kultur aksenik dengan inang akar rambut memerlukan waktu 1 bulan, dengan kultur pot terbuka memerlukan waktu 2-3 bulan. Fortin et al. (2002) menyatakan bahwa kultur monoaksenik akar rambut wortel sukses mengembangkan 25 jenis CMA. Namun demikian terbatas pada Glomus dan Gigaspora. Hal tersebut menunjukkan bahwa kultur aksenik mempunyai potensi jangka panjang untuk kelangsungan hidup CMA. Kultur aksenik telah banyak digunakan untuk mempelajari CMA secara in vitro sejak pertengahan tahun 1980 oleh (Becard & Fortin 1988), dengan terobosan baru kearah interaksi langsung antara CMA dan mikroorgasnisme tanah (Fillion et al. 1999), penyerapan hara oleh CMA (Jolicoeur et al. 1999). Jolicoeur et al. (2002), Bago et al. (2000), Toussaint (2002) menyatakan bahwa produksi propagul CMA dapat ditingkatkan melalui kultur in vitro. Percobaan tersebut umumnya menggunakan akar rambut wortel, dikultur pada medium MM (Becard & Fortin, 1988). Keuntungan model tersebut adalah perkembangan biologi CMA mudah diamati dan diikuti dengan jelas, sedang dalam kultur in vivo tidak mudah untuk pengamatan setiap fase perkembangan. Inokulasi CMA pada akar rambut membuka peluang untuk mempelajari ekstraradikal hifa CMA (de-Souza & Barbara 1999, Fortin et al. 2002). Sampai saat ini belum banyak jenis CMA yang dikembangkan secara in vitro dengan kultur akar rambut. Perkembangan CMA bersimbiosis dengan tanaman didahului dengan perkecambahan dan perkembangan hifa. Perkecambahan merupakan titik awal di dalam perkembangan CMA, banyak faktor dapat mempengaruhi perkecambahan CMA di antaranya adalah nutrisi, perlakuan kimia, dan faktor genetik CMA (Fortin et al. 2002). Diop et al. (1994) menyatakan bahwa pertumbuhan hifa berhenti apabila akar tidak ada, dan eksudat akar dapat mempengaruhi status
102
fisiologis CMA. Di samping itu dinyatakan bahwa pemilihan inokulum dan tanaman inang merupakan kunci sukses terbentuknya simbiosis. CMA bersifat obligat, sehingga kehadiran inang sangat penting merangsang perkecambahan, hal tersebut terkait dengan terbentuknya eksudat tanaman (Twaraya et al. 1996). Eksudat diperlukan untuk perkembangan dan pertumbuhan CMA khususya dalam melakukan proses kolonisasi di dalam akar. CMA aktif melakukan perkembangan apabila eksudat akar ada dilingkungan perkecambahan spora tersebut (Giovannetti et al. 1993). Kemampuan CMA bersporulasi tergantung dari jenis CMA, misalnya Glomus memiliki ukuran spora sangat kecil berproduksi sangat banyak. Sebaliknya spesies Gigaspora dan Acaulospora mempunyai ukuran spora mencapai 400 µm hanya menghasilkan spora dalam jumlah sedikit (Mansur 2003). G. margarita mempunyai ukuran spora lebih besar yang telah berhasil dikembangkan melalui kultur in vitro. G.
margarita
efisien
untuk
meningkatkan
pertumbuhan
tanaman
perkebunan, di antaranya tanaman kelapa sawit (Widiastuti 2004), kakao, jambu mente dan kacang tanah (Trisilawati 2001), Sedang A. tuberculata merupakan salah satu CMA yang belum berhasil dikembangkan secara in vitro. Disatu sisi A. tuberculata juga efisien terhadap pertumbuhan tanaman perkebunan (Widiastuti 2004), tanaman manggis (Lucia 2005). Schulz et al. (1999) menyatakan bahwa
A. tuberculata efektif meningkatkan daya hidup planlet
kelapa sawit dari 40 % tidak diinokulasi menjadi 91 % diinokulasi. Mengingat G. margaritadan A, tuberculata efisien terhadap pertumbuhan tanaman perkebunan, pertanian dan holtik ultura, maka pengembangan CMA secara efisien perlu dilakukan. Tujuan penelitian adalah untuk mengetahui (1) pertumbuhan akar rambut wortel pada medium MM dan MSR, (2) pertumbuhan akar rambut wortel diinokulasi spora G. margarita dan A. tuberculata dan tidak diinokulasi, (3) perkembangan G. margarita dan A. tuiberculata dengan inang akar rambut. (4) perkembangan struktur organ CMA secara histologis.
103
2. BAHAN DAN METODE
Percobaan dilakukan di laboratorium Biomolekuler dan Rekayasa Genetik, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, dan Laboratorium Fisiologi Tumbuhan Jurusan Biologi FMIPA Institut Pertanian Bogor. Penelitian dimulai bulan Juni 2003 – Mei 2006. Bahan yang digunakan antara lain, tanaman wortel, medium MS, A. rhizogenes galur LBA 9457, G. margarita dan A. tuberculata steril. Alat yang digunakan saringan bertingkat dengan ukuran dari atas 1000 µm, 250 µm dan 45µm, pH meter, tungku pemanas, panci, sendok sayur, outoklaf, kompor gas, gelas jam, labu ukur, bunsen dan laminar air flow. Penelitian terdiri dari beberapa percobaan yaitu (1) Uji pertumbuhan akar rambut wortel pada medium MM dan MSR (2) pertumbuhan akar rambut tidak diinokulasi dan diinokulasi G. margarita dan A. tuberculata (3) perkembangan G. margarita dan A. tuberculata dengan kultur aksenik akar rambut wortel, (4) perkembangan G. margarita dan A. tuberculata secara histologis.
2.1. Uji pertumbuhan akar rambut wortel pada kultur ganda dari medium MM dan MSR 2.1.1. Persiapan eksplan Benih wortel disterilkan dengan alkoho l 70 % selama 3 menit, dicuci dengan akuades steril 3 kali, dan disterilkan kembali dengan NaOCl2 1,56 % (Bayclin 30 %) selama 5 menit, kemudian dicuci tiga kali dengan akuades steril. Benih direndam dengan akuades steril pada suhu 60 o C selama 5 jam, dan benih yang terapung tidak digunakan. Benih dikecambahkan dalam botol kultur diberi alas kertas saring sterilkan yang dibasahi dengan akuades untuk memberikan kondisi lembab. Kultur diinkubasi dalam ruang dengan pencahayaan 75-100 luks selama 12jam/hari, Rh 80-90 % dan suhu 26 o C. Setelah kecambah berdaun dua bulan dipindah ke dalam medium MS. Setelah kecambah berumur 2 bulan dilakukan inokulasi dengan A. rhizogenes galur LBA 9457.
104
2.1.2. Persiapan kultur A. rhizogenes galur LBA 9457 Sebelum dilakukan inokulasi, A. rhizogenes galur LBA 9457 dikulturkan dalam medium suspensi YMB dan dikocok dengan mesin pengocok pada kecepatan 100 rpm (12 jam/hari) (Sambrook et al. 1989). Diinkubasi dalam ruang kultur bercahaya 75-100 luks 12 jam/hari dengan Rh 80-90 %, dan suhu 26 o C. Kultur berumur 48 jam siap untuk digunakan pada eksplan batang tanaman wortel. Inokulasi A. rhizogenes terhadap eksplan batang tanaman wortel dilakukan dengan cara melukai batang eksplan menggunakan pisau bedah steril, kemudian dipotong-potong sepanjang 2 cm dan dikokultivasi selama 1 jam dalam suspensi bakteri. Setelah dikeringkan di atas kertas saring steril, sebanyak tiga potong dari masing- masing eksplan dikulturkan dalam medium White (White 1934). Setelah akar rambut wortel yang tumbuh dipotong sepanjang 5 cm, kemudian dikultur dalam medium MM dan MSR. Pertumbuhan akar rambut diukur berdasarkan bobot basah dan kering pada umur 6 minggu setelah kultur. 2.2. Pertumbuhan akar rambut yang tidak diinokulasi dan yang diinokulasi G. margarita dan A. tuberculata steril Bahan yang digunakan adalah medium MM ( Becard & Fortin 1988). dan medium MSR Strullu dan Romand (1986). Akar rambut hasil percobaan (2.1) di potong sepanjang 5 cm dikulturkan pada medium perlakuan, dan pengamatan dilakukan pada umur 6 minggu setelah inokulasi. Spora G. margarita dan A. tuberculata diperoleh dari kultur pot di rumah kaca. Spora disaring dengan metode tuang saring basah (Pacoini 1992), dan dilanjutkan dengan metode sentrifugasi (Brund rett et al. 1994). 50 gram zeolit (inokulum) diaduk dengan air sebanyak 200 – 300 ml, kemudian disaring dengan satu set saringan dengan ukuran 1000 µm, 250 µm dan 45. Patikel yang tertinggal pada saringan berukuran 450 µm dan 45 µm disentrifugasi dengan kecepatan 2.000-2500 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan tabung diisi dengan larutan gula 50 %, berfungsi untuk menjerab spora, selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan dan waktu yang sama. Lapisan antar gula dan air diambil, ditampung dalam saringan 45 µm, dan dic uci dengan air mengalir sampai larutan gula hilang. CMA yang diperoleh siap untuk disterilisasi. Sterilisasi spora
105
dilakukan dengan metode modifikasi Buce et al. (2000). Spora G. margarita dan A. tuberculata
yang sudah steril dan yang belum disterilkan kemudian
diinokulasikan pada akar rambut wortel. 2.3. Perkembangan G. margarita dan A. tuberculata dengan kultur akar rambut wortel Bahan yang digunakan adalah G. margarita dan A. tuberculata berasal dari kultur pot di rumah kaca, isolasi spora dilakukan sama seperti percobaan (2.1). Akar rambut wortel diperoleh dari percobaan (BAB IV) dan spora G. margarita dan A. tuberculata, yang disterilkan dengan metode modifikasi (Buce et al. 2000). Percobaan ini dilakukan untuk mengetahui lama waktu perkecambahan G. margarita dan A. tuberculata secara in vitro dengan menggunakan medium kultur ganda. Akar rambut wortel dipotong 5 cm dan dikultur di dalam medium kultur ganda, diinokulasi dengan G. margarita dan A. tuberculata steril sebanyak 10 µl yang mengandung 10-15 spora. Pengamatan terhadap perkembangan spora di dalam kultur akar rambut dilakukan pada umur 3 bulan. Tingkat infeksi dilihat dari akar rambut wortel yang diwarnai trypan blue, dan perhitungan persentase kolonisasi spora dihitung dengan metode (Koske & Gemma 1989). Akar rambut dibersihkan dari medium, kemudian dimasukkan dalam larutan KOH 2.5 % dan dipanaskan dalam penangas air pada suhu 50 o C selama 45 menit. Larutan KOH kemudian dibuang, dan akar rambut direndam di dalam HCl 2 % dipanaskan penangas air pada suhu 50 o C selama 45 menit. Selanjutnya larutan dibuang diikuti dengan pencucian akar rambut dengan air mengalir, apabila akar kurang bersih dimasukkan kembali ke dalam larutan H2 O2 2 % dan dipanaskan dalam pengangas air pada suhu 50 o C selama 45 menit. Larutan H2 O2 2 % dibuang, diganti dengan pewarna akar tryplan blue, dipanaskan dalam pengangas air pada suhu 50 o C selama 45 menit, kemudian direndam selama 24 jam. Untuk membersihkan sediaan dari pewarnaan yang tertinggal, sediaan dicuc i dan dimasukkan ke dalam gliserin. Sediaan akar siap diamati di bawah mikroskop binokuler untuk menghitung tingkat infeksi akar. Pengamatan secara histologi pada akar berumur 3 bulan.
106
2.4. Pelaksanana percobaan Akar rambut dipotong 5 cm, dikultur pada medium MM dan MSR, peubah yang diamati berat basah dan kering umur 6 minggu. Untuk melihat pengaruh inokulasi CMA terhadap berat basah dan berat kering akar rambut, dipotong 5 cm, dikultur pada medium MM, diinokulasi dengan CMA uji (G. margarita dan A. tuberculata), dan tidak diinokulasi (kontrol). Penggunaan inokulum kultur aksenik dengan organ akar rambut, seharusnya menggunakan inokulum steril diperoleh dari penelitian III, namun karena jumlah perkecambahan spora steril hanya diperoleh 118 butir spora G. margarita dan 175 butir spora A. tuberculata (Lampiran 14), Jumlah spora steril tidak mencukupi untuk perlakuan. Sehingga perkembangan spora kultur aksenik, sumber spora diperoleh dari kultur pot (in vivo). Selain persediaan inokulum steril tidak menc ukupi, ada faktor lain sebagai pertimbangan yaitu, penelitian produksi kultur aksenik CMA in vitro merupakan penelitian pendahuluan atau pemula, karena belum ada laporan tentang produksi kultur aksenik di Indonesia menggunakan organ akar rambut dan CMA indigenous (asli Indonesia). Oleh sebab itu diperlukan data informasi lengkap tentang waktu perkecambahan, persentase perkecambahan, perkembangan hifa dan lainnya. Pertimbangan inilah maka inokulum steril diperoleh dari sterilisasi spora in vivo (Penelitian II). Sedang inokulum steril dimanfaatkan untuk uji pengaruh inokulum CMA uji steril terhadap pertumbuhan akar rambut. Akar rambut dipotong 5 cm dikultur pada kultur ganda, umur 1 minggu diinokulasi masing- masing dengan spora CMA uji steril. Untuk inokulasi spora digunakan mikropipet stiril sebanyak 10 µl, berisi antara 10 butir G. margarita dan 20 butir spora A. tuberculata. Penyemprotan spora dilakukan dengan dua cara yaitu disemprotkan pada kertas selulase stiril, dan disemprotkan langsung pada ujung akar. Kertas selulase berisi spora diinkubasi dalam medium agar murni selama 1 minggu, spora diletakkan pada ujung akar tanaman. Selanjutnya kultur diinkubasi dalam ruang gelap dengan suhu 26 o C, Rh 80 %. Pengamatan dilakukan 5 hari sekali sampai umur 3 bulan, dan peubah yang diamati waktu perkecambahan, persentase perkecambahan, hifa eksternal, sporulasi, infeksi akar, berat basah dan berat kering akar rambut wortel. Peubah
107
hifa eksternal diukur dengan rataan nilai kategori. Nilai kategori satu dinyatakan bahwa hifa eksternal yang terbentuk tidak banyak, nilai kategori dua cukup banyak, kategori tiga banyak, dan kategori empat sangat banyak. Interval nilai yang digunakan adalah 1,0–1,9 pembentukan hifa tidak banyak, 2,0–2,9 pembentukan hifa cukup banyak, 3,0–3,9 pembentukan hifa banyak, dan = 4 pembentukan hifa sangat banyak. Rancangan Percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL). Untuk percobaan (1) dan (2) menggunakan pola satu faktor dari perhitungan bobot basah dan kering. Percobaan
(3) pola faktorial 2x3x5.
Percobaan dianalisis masing- masing faktor dan interaksi 2 faktor, faktor pertama adalah jenis medium MM dan MSR, faktor kedua jenis CMA G. margarita dan A. tubeculata. Kesimpulan diambil berdasarkan uji F (Fisher test), apabila hasil uji F tersebut menunjukkan beda nyata atau beda sangat nyata antar perlakuan, maka pengujian dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan (DMRT) dengan tingkat kepercayaan 95 % ( P<0.05).
3. HASIL 3.1. Uji pertumbuhan akar rambut wortel kultur ganda pada medium MM dan MSR Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa bobot basah dan kering akar rambut wortel yang dikultur pada medium MM dan MSR, tidak berbeda nyata (Tabel 7.1.) Tabel 7.1. Pertumbuhan akar rambut wortel kultur ganda dalam medium MM dan MSR umur 6 Minggu Peubah Bobot basah/mg Bobot kering/mg
Jenis medium Medium MM Medium MSR 17,4 a 17,4 a 5,0 a 4,8 a
Keterangan : Huruf yang sama pada baris yang sama tidak berbeda nyata 3 cm berdasarkan uji DMRT(P< 0,05)
108
B
A
3 cm
Gambar 7.1. Pertumbuhan akar rambut pada medium kultur ganda umur 6 minggu, (A) medium MM, (B) medium MSR (Diameter cawan Petri 9 cm))
3.2. Pertumbuhan akar rambut wortel tidak diinokulasi dan diinokulasi G. margarita dan A. tuberculata Hasil menunjukkan bahwa bobot basah dan bobot kering akar rambut diinokulasi dengan G. margarita dan A. tuberculata, maupun akar rambut yang tidak diinokulasi dengan CMA memberikan pengaruh tidak nyata (Tabel 7.2.). Tabel 7.2. Pertumbuhan akar rambut yang tidak diinokulasi dan yang diinokulasi CMA pada medium MM umur 6 minggu Peubah
Akar rambut yang diinokulasi dan tidak dengan CMA G. margarita A. tuberculata Tanpa inokulasi
Bobot Basah
17,4 a
17,4 a
17,4 a
Bobot kering
5,0 a
5,1 a
4,9 a
Keterangan : Huruf yang sama pada baris yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT (P< 0,05)
A A
3 cm
B B C
Gambar 7.2. Pertumbuhan akar rambut pada medium kultur ganda (medium MM) umur 6 minggu yang diinokulasi dan tidak, (A) Inokulasi dengan G. margarita, (B) Inokulasi dengan A. tuberculata, (C) tanpa inokulasi (diameter cawan Petri 9 cm)
109
3.3. Perkembangan G.margarita dan A. tuberculata dengan kultur akar rambut wortel Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa G. margarita dan A. tuberculata dapat dikembangkan secara in vitro dengan teknologi akar rambut. Waktu perkecambahan G. margarita 11-15 hari untuk medium MM, dan 11-16 hari untuk MSR A. tuberculata 40-55 hari setelah diinokulasi baik pada medium MM maupun MSR. Kedua CMA tersebut dapat membentuk hifa eksternal, menghasilkan spora baru (sporulasi) dan CMA juga mampu menginfeksi akar rambut (Tabel 7.3.). Tabel 7.3. Perlakuan jenis medium dan CMA G. margarita terhadap persentase perkecambahan, hifa eksternal, sporulasi dan infensi akar pada umur 3 bulan Jenis medium modifikasi Peubah perkecambahan (%) Hifa eksternal Sporulasi (butir) Infeksi akar(%)
MM (Becard & Fortin 1988)
MSR (Strullu & Romand 1986)
70,3 a 2,5 a 3,6 b 56,2 a
30, 8 c 1,8 b 2,0 c 13,0 c
Keterangan : Huruf yang sama pada baris yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT (P< 0.05)
Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa G. margarita maupun A. tuberculata yang dikulturkan pada medium MM dan MSR memberikan pengaruh berbeda nyata terhadap peubah yang diukur, yaitu persentase perkecambahan, pertumbuhan hifa eksternal, sporulasi dan infeksi akar (Tabel 7.3. dan 7.4.). G. margarita yang dikultur dalam medium MM dan MSR memberikan perbedaan yang nyata terhadap peubah yang diukur. Medium MM lebih baik dibandingkan dengan MSR. Tampak bahwa G. margarita dapat dikembangkan secara in vitro dengan teknologi akar rambut. Demikian pula pengaruh media terhadap perkembangan A. tuberculata yaitu memberikan pengaruh nyata terhadap masingmasing peubah, dan mempunyai kecenderungan yang sama, yaitu medium MM lebih baik bila dibandingkan dengan MSR (Tabel 7.4.).
110
Tabel 7.4. Perlakuan jenis medium dan CMA A. tuberculata terhadap persentase perkecambahan, hifa eksternal, sporulasi dan infensi akar pada umur 3 bulan Jenis medium modifikasi Peubah perkecambahan (%) Hifa eksternal Sporulasi (butir) Infeksi akar(%)
MM (Becard & Fortin 1988) 73,7 a 3,0 a 10,2 a 57,8 a
MSR (Strullu & Romand 1986) 41,4 b 2,0 b 1,4 c 34,6 d
Keterangan : Huruf yang sama pada baris yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT (P< 0.05)
Untuk mengetahui hubungan antar peubah, maka dilakukan analisis korelasi, dan hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa perkecambahan spora, pertumbuhan hifa eksternal, sporulasi dan infeksi akar berkorelasi positif, sedang bobot kering dan bobot basah dengan peubah lain tidak ada korelasi (Tabel 7.5.).
Tabel 7.5. Korelasi antar peubah pada umur 3 bulan setelah tanam Peubah
Perkecambahan (% )
Hifa eksternal
Sporulasi
0.80* 0.77* 0.79*
Bobot Basah Akar TK TK TK TK
Bobot kering Akar TK TK TK TK
Hifa eksternal Sporulasi (butir) Infeksi akar (%) Perkecambahan (%) Bobot kering akar (mg)
0.96* 0.79* 0.97* -
0.75* 0.92* 0.96*
TK
TK
TK
TK
-
Keterangan : * ada korelasi , TK = Tidak ada korelasi
3.4. Perkembangan G. margarita dan A. tuberculata secara histologis Perkecambahan dan perkembangan spora G. margarita dan A. tuberculata dipelajari secara histologi. Tampak bahwa perkembangan A. tuberculata dalam kultur akar rambut terbentuk truktur organ akar dengan lengkap terkecuali appresorium tidak ditemukan, namun terlihat adanya hifa yang kontak dengan permukaan akar rambut (Gambar 7.3.C). Perkembangangan hifa eksternal membentuk dikotomi atau percabangan (Gambar 7.3.D), terlihat adanya hifa
111
sekunder yang ukurannya lebih besar dan membentuk percabangan (Gambar 7.3.E). Dalam kultur juga dibentuk hifa internal dan eksternal (Gambar 7.3.F), dan terjadi sporulasi (Gambar 7.3.G). Perluasan hifa internal akan membentuk Vesikula (Gambar 7.3.H) dan arbuskula (Gambar 7.3.I). Perkembangan G. margarita tidak jauh berbeda dengan A. tuiberculata, hanya G. margarita tidak membentuk vesikula. G. margarita dalam kultur akar rambut dapat berkecambah (Gambar 7.4.A), hifa berkembang dan membentuk percabangan dikotomis (Gambar 7.4.B), apresorium (Gambar 7.4.C), hifa internal dan eksternal (Gambar 7.4.D), percabangan hifa sekunder mempunyai ukuran lebih besar (Gambar 7.4.E) dan terjadi sporulasi (Gambar 7.4.F).
A
D
B
C
E
F
1000 µm
Gambar 7.3. Perkembangan A. tuberculata umur 3 bulan setelah tanam dalam kultur akar rambut wortel. A. Spora berkecambah = 400 µm, B. Perkembangan hifa eksternal C. Perkembangan hifa yang menusuk akar rambut membentuk apresoriun. D. Percabangan hifa eksternal = 2 µm, E. Vesikula = 150 µm, F. Sporulasi
112
G
A
D
B
E
C
F
1000 µm
Gambar 7.4. Perkembangan G. margarita umur 3 bulan setelah tanam dalam kultur akar rambut wortel. A. Spora berkecambah= 400 µm hifa eksternal (7µm), B. Perkembangan hifa dan percabangan hifa = 400 µm, C. Apresorium 5 µm, D. Hifa internal (2-7µm) E. Percabangan hifa sekender (8µm). F. Sporulasi = 350 µm
4. PEMBAHASAN
4.1. Pertumbuhan akar rambut wortel pada medium MM dan MSR Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa bobot basah dan bobot kering akar rambut wortel yang dikultur pada medium MM dan MSR (kultur ganda), tidak berbeda nyata (Tabel 7.1.). Hal tersebut menunjukkan bahwa akar rambut wortel dapat tumbuh baik dalam kedua medium tersebut dengan hara nutrisi relatif rendah dan hanya berbeda pada konsentrasi unsur P. Konsentrasi unsur P pada medium MM dan MSR masing- masing sebanyak 4,8 mg/l dan 44 mg/l. Perbedaan unsur P dalam medium tidak memberikan pengaruh nyata terhadap bobot basah dan bobot kering akar rambut wortel. Ridgway et al. (2004) menyatakan bahwa potongan akar rambut wortel diinokulasi dengan A. rhizogenes A4T dapat tumbuh baik dalam medium Lauria-Bertoni (+/- asetosiringon) atau dalam medium Yeast Mannitol. Menurut Christey & Braun (2004) akar rambut wortel memiliki daya
113
adaptabilitas yang baik terhadap berbagai medium, dan mudah membentuk akar rambut. Oleh sebab itu
akar rambut wortel banyak dimanfaatkan untuk
perkembangan dan produksi spora CMA dalam kultur in vitro
4.2. Pertumbuhan akar rambut wortel tidak diinokulasi dan diinokulasi CMA Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa
akar rambut wortel yang
diinokulasi denga n G. margarita dan A. tuberculata steril, maupun yang tidak diinokulasi, memberikan pengaruh tidak nyata terhadap bobot basah dan bobot kering akar rambut wortel (Tabel 7.2.). Hal tersebut karena akar rambut merupakan hasil ekspresi gen dari A. rhizogenes dalam sel tanaman yang dapat menyandi
hormon
pertumbuhan
auksin
dan
sitokinin,
sehingga
terjadi
pertumbuhan sel yang sangat cepat (N illson & Olsson 1997). Sistem in vitro adalah sistem tertutup, di mana semua nutrisi bebas dan tersedia, sehingga G. margarita dan A. tuberculata tidak berpengaruh nyata terhadap bobot basah dan kering akar rambut wortel. Giri dan Narasu (2000) menyatakan bahwa ada beberapa faktor yang dapat mempengaruhi pertumbuhan dan biomasa kultur akar rambut, antara lain komposisi nutrisi di dalam medium, jenis medium, jenis tanaman dan faktor fisik seperti suhu dan cahaya, demikian pula dinyatakan oleh Aneloi (2004). Reflini (2002) menyatakan bahwa jenis dan bagian eksplan juga mempengaruhi pertumbuhan akar rambut. Sehingga peran CMA di dalam pertumbuhan akar rambut tidak nyata. Akar rambut digunakan sebagai inang oleh G. margarita dan A. tuberculata karena CMA bersifat simbiosis obligat.
4.3. Perkembangan G. margarita dan A. tuberculata dengan inang akar rambut Hifa eksternal merupakan sarana awal proses terbentuknya simbiosis, karena hifa akan menginfeksi akar, selanjutnya berperan di dalam pengambilan karbon sebagai sumber energi bagi pertumbuhan dan perkembangan CMA. Sebaliknya dengan hifa tersebut CMA membantu dalam pengambilan nutrisi dan air, yang dibutuhkan oleh tanaman untuk membantu pertumbuhan dan perkembangan
114
tanaman. Tampak bahwa perkembangan hifa paling banyak pada eksplan wortel yang diinokulasi dengan A. tuberculata. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa G. margarita dan A. tuberculata dapat dikembangkan secara in vitro dengan teknologi akar rambut. Teknologi tersebut merupakan salah satu alternatif yang dapat digunakan untuk mempelajari siklus hidup CMA (Fortin et al. 2002). Keuntungan dengan menggunakan model tersebut karena perkembangan simbion dapat digambarkan secara jelas di dalam medium, sedang pada in vivo tidak mudah melakukan pengamatan. Teknologi in vitro akar rambut membuka peluang untuk mempelajari ekstraradikal hifa CMA, sebagai kunci perkembangan selanjutnya (Bago et al. 1998 ab, de-Souza & Barbara 1999, Fortin et al. 2002). Sampai saat ini masih sedikit jenis CMA yang dikembangkan secara in vitro dengan kultur akar rambut. Perkecambahan G. margarita lebih cepat dibandingkan dengan A. tuberculata, hal tersebut bisa dipahami karena morfologi dan fisiologi yang berbeda, memberikan respons perkecambahan yang berbeda. G. margarita memiliki dinding spora lebih tipis dibandingkan dengan A. tuberculata, sehingga waktu perkecambahan
G. margarita lebih cepat dibandingkan dengan A
tuberculata. Lucia (2005) menyatakan bahwa A. tuberculata memiliki dinding tebal, sedang G. margarita mempunyai dinding spora lebih tipis, halus, dan terdiri dari satu lapis, sehingga kantong kecambah lebih mudah pecah, lebih lanjut dinyatakan bahwa kematangan spora juga dapat mempengaruhi perkecambahan spora. Faktor yang berpengaruh terhadap perkecambahan spora antara lain eksudat akar. Eksudat akar berperan di dalam perkecambahan spora dan pertumbuhan hifa CMA, dimana proses tersebut merupakan titik awal terjadinya simbiosis antara inang dan CMA (Giovanetti et al. 1993). Peran inang menyediakan eksudat akar, untuk mempercepat pecahnya tabung perkecambahan dan sumber karbon yang digunakan untuk kelangsungan hidup CMA. Akar rambut berfungsi sebagai inang, eksudat akar dan persediaan karbon diperoleh dari proses glikolisis. Apabila inang dalam bentuk tanaman (planlet) maka persediaan karbon diperoleh dari hasil proses fotosintesis (Juge et al. 2002). Eksudat akar juga berpengaruh
115
terhadap fisiologi CMA, yaitu kematangan spora sehingga dapat mempengaruhi perkecambahan CMA (Orcutt & Nielsen 2000). Eksudat akar merupakan sinyal atau tanda yang dikeluarkan oleh inang untuk menarik perhatian CMA dalam menjalin kerjasama yang disebut simbiosis. Oleh karenanya eksudat akar mempengaruhi status fisiologi CMA, sehingga dapat memacu perkecambahan (Diop et al. 1994). Titik awal terjadinya simbiosis antara inang dan CMA dengan terbentuknya CO2 yang dikeluarkan tanaman melalui akar, dapat merangsang dan memacu spora berkecambah, dilanjutkan dengan perkembangan baru yang ditandai dengan percabangan hifa yang intensif (Giovanetti et al. 1993, Tamasloukht et al. (2003). Medium MM lebih sesuai untuk perkecambahan, sporulasi, dan infeksi akar, hal ini disebabkan kandungan fosfat lebih rendah yaitu 4,4 mg/l dibandingkan dengan MSR yang kandungan fosfatnya 44 mg/l. Labor et al. (2003) menyatakan bahwa konsentrasi fosfat tinggi dalam medium menghambat proses sporulasi dan kolonisasi akar. Konsentrasi P rendah, merangsang pembentukan eksudat akar lebih banyak. Eksudat akar selain merangsang perkecambahan spora juga sebagai sumber karbon untuk kelangsungan hidup CMA, selanjutnya CMA berkembang dan melakukan simbiosis. Spora steril yang mampu berkecambah merupakan titik awal terbentuknya simbiosis, selanjutnya dapat berpengaruh terhadap kesuburan tanaman dan status fisiologi CMA. Oleh karena itu kompatibilitas antara inang dan CMA merupakan kunci sukses simbiosis (Juge et al. 2002) Ada perbedaan kualitatif dan kuantitatif eksudat akar tanaman yang dipupuk dan tidak. Konsentrasi P yang tinggi menghambat produksi eksudat akar (Pinior et al. 1999), dan sebaliknya. Perbedaan tersebut berdampak terhadap perkembangan hifa, dan eksudat akar banyak memacu perkembangan struktur organ CMA dalam korteks akar (Abbott et al. 1994).
Eksudat akar khususnya flavonoid dan
isoflafonoid mempengaruhi perluasan hifa kearah akar. Penyebaran hifa dipengaruhi faktor internal dan eksternal. Faktor internal me liputi infektivitas dan agresifitas
CMA.
Faktor
eksternal
meliputi
ketersediaan
eksudat
akar,
kompatibilitas inang, suhu, cahaya, dan media pertumbuhan, yaitu persediaan P, NH4 , pH dan mikroba pencemar (Wilson & Tommerup 1992). Kuantitas dan kualitas eksudat yang tersedia dapat memacu perkecambahan spora CMA, sebagai
116
titik awal yang penting untuk perkembangan struktur organ CMA dalam kortek akar. Juge et al. (2002) menjelaskan peranan tanaman inang adalah menyediakan eksudat akar untuk mempercepat pecahnya tabung perkecambahan, dan sumber karbon untuk kelangsungan hidup CMA. Perkembangan CMA yang bersimbiosis dengan tanaman didahului dengan perkecambahan dan perkembangan hifa. Perkecambahan merupakan titik awal di dalam perkembangan CMA, banyak faktor yang dapat mempengaruhi diantaranya adalah nutrisi, perlakuan kimia, dan faktor genetik CMA (Fortin et al. 2002). Diop et al. (1994) menyatakan bahwa beberapa peneliti telah menyatakan pertumbuhan hifa diberhentikan ketika akar tidak ada, dan eksudat akar dapat mempengaruhi status fisiologi CMA. Selanjutnya dinyatakan bahwa pemilihan inokulum dan tanaman inang merupakan kunci sukses terbentuknya simbiosis. Setelah spora berkecambah hifa berkembang aktif menginfeksi akar, terbentuk struktur organ CMA dalam korteks akar, membentuk apresorium, hifa internal berkembang membentuk arbuskula dan vesikula, terkecuali G. margarita tidak membentuk vesikula, dan pada
kondisi tertentu terjadi sporulasi.
Perkembangan struktur organ CMA merupakan ciri spesifik terjadinya simbiosis yang stabil, dan
truktur organ tersebut dapat diamati melalui histologi akar
menggunakan pewarna trypan blue (Tamasloukht et al. 2003, Jane et al. 1998). Selain itu Pinior et al. (1999) menyatakan bahwa terdapat perbedaan secara kualitatif maupun kuantitatif komponen eksudat akar tanaman yang dipupuk dan yang tidak. Pada konsentrasi P eksternal yang rendah jumlah eksudat yang dikeluarkan tanaman lebih banyak dibandingkan dengan kondisi P eksternal yang tinggi (Abbott et al. 1994). Hubungan unsur P dalam medium yang rendah dapat
memacu
terbentuknya
eksudat
akar,
yang
berdampak
terhadap
perkembangan hifa. Flavonoid atau isoflavonoid mempengaruhi perluasan hifa kearah akar. Penyebaran hifa dipengaruhi oleh faktor internal dan faktor eksternal. Faktor internal meliputi infektivitas, agresifitas CMA dan kepadatan propagul. Sedang faktor eksternal meliputi medium, khususnya persediaan P dan NH4, pH, mikroba pencemar (Wilson & Tommerup 1999, Bago 2004). Terbentuknya organorgan penting CMA dalam akar tanaman menunjukkan adanya simbiosis dari
117
kedua organisme tersebut stabil. Sehingga disimpulkan bahwa G. margarita dan A. tuberculata dapat dikembangkan secara in vitro dengan kultur akar rambut. Dalpe & Declerck (2002) menyatakan bahwa simbiosis stabil dan mantap dengan terbent uknya organ CMA dalam akar yaitu arbuskula, vesikula, hifa eksternal atau perkembangan hifa internal dalam sel korteks. Struktur organ tersebut sebagai ciri spesifik suksesnya simbiosis antara inang dan CMA. Hasil sporulasi yang diperoleh relatif rendah, mungkin karena umur kultur baru 3 bulan. Menurut Diop et al. (1992) simbiosis G. margarita
yang
diinokulasikan pada akar rambut tanaman wortel, sporulasi terjadi 4 bulan setelah inokulasi dan berlangsung relatif lambat. Sporulasi lebih aktif dimulai 6-12 bulan setelah inokulasi. Namun menurut (de-Souza 2005) pembentukan spora Glomus pertama diperkirakan antara 10-12 minggu (2-3 bulan) setelah kolonisasi dan sporulasi terjadi setelah 5 – 8 bulan, produksi spora rata-rata 56 butir setiap 30 ml medium. Yunli et al. (2004) menyatakan bahwa produksi spora 47 butir setelah 6 bulan, dan spora muda terbentuk setelah 4 bulan. Hasil penelitian memberikan gambaran bahwa produksi spora secara in vitro dapat dilakukan secara masal. Produksi spora dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu musim dan nutrisi (Bever et al. 2001), inang dan jenis CMA (Bever 20002), Fisiologi inang, interaksi dengan predator dan organisme pencemar (Bakhtiar et al. 2001), Faktor yang sangat menentukan adalah hubungan dengan pengembangan tahap intraradial hifa (de-Souza 2005). Hasil korelasi antar peubah menunjukkan bahwa setiap peubah berkorelasi positif dan sangat erat, hal tersebut dapat dimengerti karena perkecambahan, terbentuknya hifa eksternal maupun internal, dan sporulasi serta infeksi akar merupakan satu kesatuan perkembangan CMA yang berimbiosis dengan inang. Giovanetti et al. (1993) dan Tamasloukht et al. ( 2003) menyatakan bahwa proses perkecambahan spora yang merupakan titik awal terjadinya simbiosis antara inang dan CMA, dimulai dengan adanya eksudat akar dan CO2 yang dihasilkan oleh tanaman inang, dan perkembangan struktur organ CMA merupakan satu kesatuan yang saling terkait.
118
4.4. Perkembangan Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata secara histologis Perkembangan histologi A. tuberculata (Gambar 7.3.), G. margarita (Gambar 7.4.) Siklus hidup CMA dibagi dalam tiga tahap. Tahap pertama penetapan simbiosis, melibatkan aktifitas propagul, inang tanaman, apresorium, penetrasi akar. Tahap kedua, melibatkan hifa eksternal, internal dan ekstraradikal secara keseluruhan dapat meningkatkan biomasa, pembentukan struktur hifa dan perluasan CMA diluar maupun antar tanaman. Tahap ketiga reproduktif, melibatkan struktur reproduktif, spora dorman merupakan jenis utama untuk propagul Acaulosporaceae dan Gigasporaceae. Vesikula, yaitu hifa internal yang menggelembung, berfungsi untuk kantung penyimpan berupa lipid. Percabangan dikotomi dari hifa internal membentuk lapisan yang disebut arbuskula, yaitu organ yang sangat penting berfungsi sebagai lokasi tempat pertukaran nutrisi dan air dari kedua simbion (Heijden & Sanders 2002). Perkecambahan merupakan kunci perkembangan simbiosis. Selanjutnya diikuti perkembangan hifa eksternal meluas dan menginfeksi akar. Hifa eksternal mempunya i arti penting sebagai kunci simbiosis, bertanggung jawab di dalam penyebaran kolonisasi (Smith & Read 1997). Riset tentang hifa eksternal dari jenis Glomus telah dilakukan dan disamaratakan terhadap kelompok CMA (Giovannetti et al. 1999, 2001, 2003), Jasa paling utama CMA adalah pengambilan, asimilasi, dan translokasi nutrisi di luar zone rhizosfir, diberikan pada akar tanaman, dan tugas tersebut dilaksanakan oleh ekstraradikal miselium CMA (Ezawa et al. 2002). Oleh karena itu kehadiran CMA dapat meningkatkan kesuburan tanaman, daya tahan terhadap serangan patogen, dan kekeringan. CMA juga menguntungkan untuk pertanian (Jeffries et al. 2003), reklamasi lahan (de-Souza & Sulva, 1996). Penggunaan CMA merupakan sumber daya yang efisien dan dapat diperbaharui, yaitu fosfat (Jakobsen 2000). Ada tiga langkah penyebaran dan perkembangan ekstraradikal dalam sistem monoaksenik in vitro yaitu, perkembangan hifa berfungsi sebagai alur meluas secara radikal, dan pengembangan struktur arbuskula berperan untuk mengambil nutrient (Bago et al. 1998 a). Pada penelitian lain menunjukkan bahwa kolonisasi
119
kelompok Glomeraceae rendah, yang diukur oleh pengembangan ekstra radikal miselium (Giovannetti et al. 2001, 2003). Arbuskula diduga sebagai alat penghubung lokalisasi nutrient dan pertukaran karbon antar kedua simbion tersebut, sehingga arbuskula dianggap sebagai struktur kunci dalam suatu simbiosis antara tanaman dan CMA (Smith & Read 1997). Struktur arbuskula pada umumnya berumur pendek antara 1–3 minggu, ditemukan di dalam akar muda tahap kolonisasinya, dan pembentukan arbuskula dikendalikan oleh genetik tanaman inang, dan ketersediaan nutrisi (Harrison 1999), struktur tersebut tidak selalu dapat ditemukan. Jumlah vesikula meningkat dengan berkembangnya koloni akar, dan hanya dibentuk oleh keluarga Acaulosporaceae, Glomeraceae, dan Pacisporaceae. Miselium CMA adalah organ utama tidak bersekat dan mempunyai dua bentuk. Hifa yang tidak bersekat membawa sitoplasma dengan cepat, tidak hanya membawa sumber daya yang berkaitan dengan perkembangan dan penjelajahan hifa pada akar inang, tetapi juga mengangkut organel cendawan, misalkan mitokondria dan nucleus (Bago et al. 1998 b, Bago et al. 1999). Struktur ekstra radial miselium utama ditandai sebagai struktur yang berbentuk arbuskula yaitu struktur khusus berbentuk dikotomis, bercabang, setelah masuk kedalam sel akar tanaman membentuk selaput yang menghubungkan antara fungal dan selaput plasma tanaman (Giovannetti et al. 2001, 2003).
Hart & Reader (2002)
mempelajari pengembangan dan biomasa miselium sebanyak 21 jenis dari keluarga Acaulosporaceae, Glomeraceae dan Gigasporaceae 5. SIMPULAN
1. Akar rambut wortel tumbuh baik dan berkembang dalam medium kultur ganda yaitu medium MM, dan MSR. 2. G. margarita dan A. tuberculata steril diinokulasikan pada akar rambut, dikulktur pada medium MM memberikan pengaruh tidak nyata terhadap bobot basah dan kering akar rambut wortel. 3. Medium MM dan MSR berpengaruh nyata terhadap perkecambahan, perkembangan hifa eksternal, sporulasi dan infeksi akar baik pada G.
120
margarita maupun A. tuberculata. Medium MM menunjukkan hasil lebih baik dibandingkan dengan MSR dari semua peubah yang diukur. 4. Teknologi akar rambut baik digunakan untuk mempelajari perkembangan. G. margarita maupun A. tuberculata.
BAB VIII Teknologi Enkapsulasi Untuk Pengemasan Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata dengan Natrium-alginat ABSTRAK Formulasi pengemasan inokulum CMA umumnya terdiri dari zeolit, pasir, limbah gergaji, atau campuran tanah dan pasir sebagai kariernya. Formulasi tersebut menghadapi banyak masalah untuk mengamati spora yang ada, dan jumlah spora di dalam formulasi inokulum. Na-alginat sebagai alternatif telah sukses dikembangkan untuk enkapsulasi ektomikorhiza. Adalah suatu inovasi untuk mengembangkan enkapsulasi Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata sehingga keberadaan spora dapat jelas terlihat. Tujuan penelitian ini adalah (i) mendapatkan formulasi dosis Na-alginat yang optimum, (ii) menetapkan komposisi yang terbaik antara jumlah spora dan volume alginat (iii) menetapkan viabilitas CMA dalam kapsul Na-alginat. Rancangan Acak Lengkap Faktorial 4x2x5 digunakan dalam percobaan ini. Inokulum G. margarita dan A. tuberculata dipanen dari kultur pot dengan medium zeolit dan inang P. phaseoloides, dan konsentrasi Na-alginat untuk enkapsulasi spora adalah 1,5 %; 1,75 % dan 2,0 %. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa dosis optimal dari Na-alginat adalah 1,75 % dengan 200 spora/2 ml Na-alginat. Viabilitas G. margarita maupun A. tuberculata yang enkapsulasi adalah lebih besar dari 60 %, sementara itu lebih dari 50 spora mampu menginfeksi setelah 3 bulan diinokulasi. Viabilitas inokulum menurun setelah 1 dan 2 bulan enkapsulasi, dan inokulum ini akan menghasilkan 40-46 spora, 40 % akar diinfeksi setelah 3 bulan diinfeksi pada P phaseoloides. Dapat disimpulkan bahwa enkapsulasi spora dengan Naalginat dapat digunakan untuk formulasi pengemasan CMA. --------------------Key words: Viabilitas spora CMA, G. margarita, A. tuberculata, enkapsulasi spora, Na-alginat.
Encapsulation Technique with Sodium Alginate for Packaging of Gigaspora margarita and Acaulospora tuberculata Abstract AMF inoculum packaging formulation usually consists of sand, zeolith, saw dust or the mixture of sand and soil as its carrier. Those formulations faced many difficulties for observing the spore existence, and the number of spores in the inoculum formulation. Sodium alginate as an alternative has been successfully developed for ectomycorrhiza encapsulation. It is an innovation to develop G margarita and A. tuberculata encapsulation so that the existence of spores can be clearly seen. The objectives of this study were (i) to formulate the appropriate dosage of Na-alginate, (ii) to determine the suitable composition among the
122
number of spores and the volume of alginate, (iii) to determine the viability of AMF in sodium alginate capsule. Completely Randomize Design with factorial 4x2x5 was used. Inocula of G. margarita and A. tuberculata were harvested from pot culture with zeolith as a medium and P. phaseoloides, as a host plant and the concentrations of Na-alginate for spore encapsulation were 1.5 %; 1.75 %; and 2.0 %. The result showed that the optimal dosage of alginate is 1.75% with 200 spore/2 ml sodium alginate. The viability of encapsulated G. margarita and A. tuberculata was more than 60 %, while moré than 50 spores were infected after 3 month inoculation. The viability of inoculum decreased after 1 and 2 month encapsulation, and this inoculum can produced 40-46 spores, 40% root infection after 3-month inoculated on P. phaseoloides. It is suggested that spores encapsulation with Na-alginate can be used as a packaging formulation for AMF. -----------------------------Key words : AMF spore-viability, G. margarita, A. tuberculata,, spore encapsulation, Na alginate.
1. PENDAHULUAN
Untuk keperluan komersial umumnya spora CMA dikemas menggunakan zeolit, pasir, limbah kayu gergaji, campuran tanah dan pasir sebagai kariernya. Penyediaan inokulum CMA dihadapkan pada permasalahan cara pengemasan tidak efisien, spora tidak tampak sehingga kesulitan untuk mengetahui ada tidaknya spora dalam kemasan, dan jumlah spora tidak dapat diketahui. Alginat merupakan salah satu cara yang dapat digunakan untuk menanggulangi kelemahan tersebut, karena alginat berpenampakan putih bening atau transparan sehingga spora yang ada di dalam kemasan terlihat, mempunyai masa yang rendah, dapat melindungi spora dan propagul, serta efisien di dalam penyimpanan, pengiriman dan transportasi. Pengemasan
dan
penyimpanan
dengan
Na-alginat
telah
berhasil
dikembangkan untuk cendawan ektomikorhiza, oleh sebab itu perlu dilakukan pengujian enkapsulasi endomikorhiza, khususnya pada G. margarita dan A. tuberculata. Akhir-akhir ini Na-alginat telah banyak digunakan untuk pengemasan dan penyimpanan, dikenal dengan enkapsulasi, misalkan benih sintetik, planlet mikro dan lain sebagainya (Papi et al. 2005, Wang et al. 2006)
123
Propagul maupun spora yang dihasilkan dapat dienkapsulasi dengan menggunakan Na-alginat. Enkapsulasi berfungsi sebagai penyimpan dan pengemas CMA yang stabil (Declerck et al. 1996 b). Selain itu enkapsulasi juga menawarkan bentuk keanekaragaman inokulum, karena secara bersamaan dapat diberikan stimulan campuran seperti flavonoids ataupun jasad renik sinergi (Hildebrant et al. 2002). Maggie et al. (2005) menyatakan bahwa enkapsulasi yang dimodifikasi dengan penambahan jaringan venil polimerase dapat digunakan untuk menyimpan produk gen dalam jangka panjang. Enkapsulasi disimpan selama 4 bulan dalam kondisi lingkungan yang bersifat garam, 70 % tetap utuh artinya bahwa enkapsulasi Na-alginat tahan terhadap tekanan osmotik tinggi. Selain itu alginat dapat menyerap air atau gas sehingga sel tetap dalam kondisi mampu bertahan hidup. Enkapsulasi spora adalah spora yang dibungkus dengan Na-alginat atau sodium alginat. Alginat dihasilkan oleh tanaman laut yang disebut ganggang cokelat, dan hidup di laut yang dalam. Fungsi utama alginat adalah sebagai agen gelasi. Beberapa jenis ganggang cokelat yang dapat menghasilkan alginat antara lain Microcystis poryfera dan Ascophyllum nodosum yang berasal dari lautan Atlantis Utara bagian Selatan. Struktur ganggang yang menghasilkan alginat berbentuk linier tidak bercabang, bersifat polimer yang berisi ß-1 asam Dmannuronic 4 ( M) dan a-1 asam L-guluronic 4 (G) (Wang et al. 2006). Keuntungan Na-alginat sebagai enkapsulasi spora cendawan mikorhiza arbuskula di antaranya (i) material pembawa (carrier) berbobot masa rendah, (ii) spora tampak terlihat jelas dalam pembungkus, (iii) melindungi propagul dan spora dari bahan mudah larut, (iv) pengemasan dan transportasi lebih mudah (Calvet & Camprubi 1996). Wang et al. (2005) menyatakan bahwa enkapsulasi dengan menggunakan alginat merupakan pendekatan alternatif gen terapi, dimana sel genetikal target dapat dimasukkan ke dalam mikrokapsul, untuk pengiriman dan penyimpanan produk obat rekombinasi yang efektif untuk manusia. Selain untuk mikro enkapsulasi gen, Na-alginat juga digunakan untuk penyimpanan dan pengemasan mikroorganisme lain yaitu cendawan mikorhiza arbuskula (CMA). Calvet & Camprubi (1996) menyatakan bahwa sodium alginat 2 % dapat digunakan untuk pengemasan dan atau penyimpanan Glomus mosseae dan G.
124 intraradices, setelah diinkubasi pada suhu 25 o C selama 4 hari, CMA dapat berkecambah. Pengamatan perkecambahan dilakukan dengan membuka lapisan sodium alginat yang diamati di bawah mikroskop binokuler. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa persentase perkecambahan G. mosseae adalah sebanyak 44 %, dan G. intraradices sebanyak 28 %. Spora enkapsulasi diujikan pada tanaman bawang Bombay dan diperoleh spora infektif dan kolonisasi akar oleh G. mosseae sebanyak 35,8 % sedangkan G. intraradices 13,3 %. Dari hasil tersebut dapat dikatakan bahwa spora yang terbungkus di dalam sodium-alginat 2 %, dapat digunakan sebagai sumber inokulum. Artinya bahwa sodium-alginat yang digunakan sebagai enkapsulasi tidak menghambat perkecambahan cendawan mikorhiza arbuskula, khususnya pada G. mosseae dan G. intraradices (Calvet & Camprubi 1996). Dari uraian di atas dikatakan bahwa enkapsulasi spora dapat berfungsi sebagai penyimpan dan pengemas spora. Oleh karenanya perlu dilakukan pengujian untuk daya viabilitas perkecambahan spora baik secara in vivo maupun in vitro dengan perbedaan perlakuan yaitu kondisi tidak steril dan steril. Pengujian daya viabilitas perkecambahan spora CMA akan diinokulasikan pada tanaman P. phaseoloides.L. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan (1) dosis Na-alginat yang optimal untuk pengemasan CMA uji, (2) perbandingan jumlah spora dan volume Na-alginat optimal, dan (3) viabilitas spora CMA yang dienkapsulasi dengan Naalginat.
2. BAHAN DAN METODE
Percobaan dilakukan di Laboratorium Biomolekuler dan Rekayasa Genetik, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, dan Laboratorium Fisiologi Tumbuhan Jurusan Biologi FMIPA Institut Pertanian Bogor. Penelitian dimulai bulan Juli 2004 –Desember 2004. Penelitian terdiri dari tiga percobaan yaitu (1) optimasi kadar Na-alginat untuk enkapsulasi, (2) perbandingan jumlah spora dan volume Na-alginat optimal, dan (3) uji viabilitas spora enkapsulasi
125
2.1. Optimasi kadar Na-alginat untuk enkapsulasi G. margarita dan A. tuberculata berasal dari perbanyakan spora teknik kultur pot di rumah kaca (Percobaan II), dan disaring (sieving) dengan teknik tuang saring Pacioni (1992), kemudian disaring dengan saringan bertingkat. Hasil saringan dimasukkan ke dalam tabung sentrifus yang ditambah dengan larutan gula 50 % sampai volume 45 ml. Sela njutnya disentrifugasi dengan kecepatan 2.000 rpm selama 5 menit. Hasil yang diperoleh di saring dengan saringan berukuran 45 µm dan dicuci air mengalir sampai larutan gula hilang Brundrett et al. (1996). Bahan enkapsulasi spora digunakan Na-alginat denga n kadar 1,5 %, 1,75 %, dan 2,0 %. Untuk mengetahui jumlah spora dalam 10 µl Na-alginat diambil sampling, diulang sebanyak tiga kali. Hal ini dilakukan untuk menentukan keseragaman jumlah spora dari masing- masing perlakuan dosis Na-alginat. Peubah yang diamati adalah bentuk enkapsulasi dan kelenturan secara kualitatif.
2.2. Perbandingan jumlah spora dan volume Na-alginat optimal G. margarita dan A. tuberculata diambil dari kultur pot di rumah kaca, disaring dengan metode tuang saring Pacioni (1992), dilanjutkan dengan teknik Brundrett et al. (1996) dan spora yang dihasilkan dimasukkan ke dalam tabung steril volume 2 ml. Hasil percobaan (2.1) selanjutnya digunakan untuk percobaan (2.2). Jumlah spora perlakuan sebanyak 200, 150, dan 100 butir spora/2 ml Na-alginat dengan kadar Na-alginat hasil percobaan (2.2) dan diulang sebanyak tiga kali. Peubah yang diamati adalah jumlah spora yang terbungkus dari masing- masing bulatan Na-alginat, dan persentasenya.
2.3. Uji viabilitas spora CMA enkapsulasi Hasil percobaan (2.1 dan 2.2) digunakan untuk percobaan (2.3). Benih P. phaseoloides.L. dicuci, disterilkan dengan alkohol 70 % selama 3 menit, dicuci tiga kali dengan akuades steril, dilanjutkan dengan Bayclin 30 % selama 10 menit. Dicuci dengan akuades steril tiga kali, dan direndam dengan akuades steril yang dipanaskan pada suhu 70 o C, dituangkan ke dalam bibit P. phaseoloides.L.,
126
dan direndam selama 5 jam. Benih yang mengapung dibuang, selanjutkan benih ditiriskan selama 30 menit, dan dikecambahkan. Bibit yang sudah berkecambah umur 3 minggu siap diinokulasi dengan spora enkapsulasi Na-alginat. Enkapsulasi spora diinkubasi 0, 1 dan 2 bulan dan kontrol tanpa enkapsulasi, selanjutnya masing- masing diinokulasikan pada P. phaseoloides.L. dan diulang masing- masing 5 kali. Peubah yang diamati jumlah spora dan persentase infeksi akar.
2.4. Pelaksanaan percobaan Hasil percobaan 1 yang terbaik digunakan untuk percobaan 2, selanjutnya digunakan untuk pengujian viabilitas spora enkapsulasi. Sebagai tanaman penguji digunakan P. phaseoloides.L.
umur 3 minggu,
spora yang dienkapsulasi
diinokulasikan dan diinkubasi selama 0, 1, dan 2 bulan. Masing- masing perlakuan diulang sebanyak lima kali. Tanaman inang yang sudah diinokulasi diletakkan pada ember berukuran 60x40 cm yang berisi air sebanyak 2 l. Tanaman disiram 2 hari sekali dengan me masukkan air sebanyak 1 l ke dalam ember percobaan. Setelah tanaman inang berumur 6 minggu dilakukan pemupukan 2 kali seminggu sampai umur 8 minggu dengan hiponeks merah 1,5 g/l. Selanjutnya dilakukan pemupukan 1 minggu sekali, dan
kadar pupuknya diturunkan menjadi 1 g/l
sampai umur 11 minggu, selanjutnya tidak dilakukan pemupukan sampai umur 12 minggu (3 bulan). Rancangan percobaan yang digunakan antara lain percobaan (1) menggunakan uji kualitatif, percobaan (2) menggunakan analisis statistik kualitatif, yaitu dengan menghitung rataan jumlah spora yang terenkapsulasi, dan percobaan (3) digunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktorial 4x2x5 dengan 5 ulangan. Faktor pertama adalah lama waktu inkubasi spora dalam enkapsulasi Na-alginat dan faktor kedua adalah jenis CMA. Data hasil penelitian dari masing- masing percobaan yang diperoleh dianalisis dengan analisis varians, sedang kesimpulan diambil berdasarkan uji F (Fisher test), apabila hasil uji F tersebut menunjukkan beda nyata atau beda sangat nyata antar perlakuan, maka pengujian dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan (DMRT) dengan tingkat kepercayaan 95 % ( P< 0,05).
127
3. HASIL
3. 1. Optimasi kadar Na-alginat untuk enkapsulasi Konsent rasi 1,75 % menunjukkan hasil terbaik dibandingkan dengan perlakuan yang lain, enkapsulasi yang dihasilkan berbentuk bulat teratur, seragam, kelenturan baik dan transparan (Tabel 6.1.).
Tabel 8.1. Rataan nilai kategori dari uji kualitatif kadar Na-alginat Konsentrasi Naalginat dalam % 1,5 1,75 2,0 Keterangan:
Nilai kategori bentuk dan kekenyalan enkapsulasi Bentuk morfologi Kekenyalan + + +++ +++ ++ ++
+ : Bentuk dan kekenyalan tidak baik, lembek, ++ : Bentuk dan kekenyalan cukup baik; +++ : Bentuk dan kekenyalan baik
Kapsul alginat dengan kadar 1,5 % menghasilkan bentuk yang tidak seragam dan atau tidak teratur, ada yang lonjong dan kelenturan lunak sehingga tidak memberikan penampakan yang menarik. Sedang kapsul alginat dengan konsentrasi 2 % menghasilkan bentuk yang bulat seragam, tetapi kelenturannya cenderung keras dengan penampakan yang mengkerut (Tabel 8.1. dan Gambar 8.1.).
A
B
C
Gambar 8. 1. Enkapsulasi spora CMA (G. margarita dan A. tuberculata ) dengan konsentrasi Na-alginat yang berbeda. A. 1,5 %; B. 1,75 %; dan C. 2,0 % (perbesaran 50 x)
128
3. 2. Perbandingan jumlah spora dan volume Na-alginat optimal Hasil yang diperoleh dari percobaan (1 ) yaitu kadar Na-alginat terbaik adalah 1,75 %, selanjutnya digunakan untuk menentukan efisiensi jumlah spora yang akan dikemas dalam 2 ml Na-alginat. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa jumlah spora optimal untuk volume 2 ml adalah 200 butir spora. Hal tersebut dilihat dari persentase Na-alginat yang kosong (tidak berisi spora) sebanyak 4 %, sedang yang lain 7,3 – 27,0 %. Satu
bulatan enkapsulasi Na-alginat berisi 5–8 spora memperlihatkan
cukup representatif untuk melakukan aktivitas. Apabila kapsul alginat terlalu padat, dikhawatirkan akan mengganggu aktivitas mikroorganisme di dalamnya. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa satu bulatan enkapsulasi Na-alginat berisi 5 – 7 spora dibandingkan dengan perlakuan yang lain (Tabel 8.2.) . Jumlah sporulasi tertinggi terjadi baik pada G. margarita maupun A. tuberculata dari spora yang tidak terbungkus (telanjang), namun tidak berbeda nyata dengan spora yang dienkapsulasi tanpa inkubasi yaitu 60 butir spora untuk G. margarita, dan 66 butir untuk A. tuberculata. Spora enkapsulasi yang diinkubasi 1 dan 2 bulan menunjukkan perbedaan yang tidak nyata baik untuk Gigaspora sp maupun A. tuberculata, tetapi menunjukkan perbedaan yang nyata dengan spora enkapsulasi tanpa inkubasi (Tabel 8.3.). Tabel 8.2. Rataan jumlah spora yang terenkapsulasi dalam 2 ml Na-alginat Jumlah spora yang terbungkus Naalginat 0 1 2 3 4 5 6 7 Jumlah spora dalam Naalginat: Enkapsulasi yang terbentuk/2ml :
Jumlah spora dan persentase jumlah spora dalam enkapsulasi Naalginat 200 butir % 150 % 100 butir % spora jml. butir jml. spora jml. spora spora spora spora 8 4 11 7.3 27 27 6 3 9 6.0 9 9 9 4 12 7.3 9 9 10 5 7 4.7 3 3 9 4.5 13 8.7 5 5 8 4 4 2.7 4 3 6 3 3 2.0 4 3 5 2.3 1 0.7 201
151
100
61
60
61
129
3. 3. Uji viabilitas spora enkapsulasi Tabel 8.3. Pengaruh enkapsulasi spora dan lama waktu inkubasi terhadap peubah umur 3 bulan Peubah Tanpa enkapsulasi Jumlah spora (butir) Infeksi akar (%)
54,7 b 65,6 b
Perlakuan Enkapsulasi Enkapsulasi inkubasi 0 inkubasi 1 bulan bulan 54,4 b 50,6 c 64,9 b
Enkapsulasi inkubasi 2 bulan 44,65 d
55,8 c
52,8 d
Keterangan : Huruf yang sama pada baris masing-masing peubah tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT (P< 0,05)
Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa jumlah spora maupun persentase infeksi akar G. margarita dan A. tuberculata enkapsulasi
menunjukkan
perbedaan nyata, dan A. tuberculata lebih tinggi dari semua peubah yang diukur (Tabel 8.4.) Tabel 8.4. Pengaruh jenis CMA G. margarita dan A. tuberculata terhadap peubah umur 3 bulan Peubah
Perlakuan jenis CMA G. margarita A. tuberculata
Jumlah spora (butir )
45,0 b
54,0 a
Infeksi akar (%)
55,0 b
62,01 a
Keterangan : Huruf yang sama pada baris masing-masing peubah tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT (P< 0,05)
Persentase infeksi akar pada G. margarita tidak beda nyata antara perlakuan dengan spora telanjang dan spora enkapsulasi tanpa inkubasi, yaitu 60 % akar yang terinfeksi dan jumlah spora 48 butir/50 g medium. Sedang perlakuan dengan spora enkapsulasi yang diinkubasi 1 dan 2 bulan persentase infeksi akar dan jumlah spora menunjukkan beda nyata terhadap spora enkapsulasi yang diinkubasi, dan hasil menunjukkan kecenderungan menurun 44-48 % dan jumlah spora 40-42 butir spora/50 g medium untuk enkapsulasi inkubasi. Persentase infeksi akar pada A. tuberculata menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata antara spora telanjang (61 %) dan spora yang dienkapsulasi tanpa
130
inkubasi (60,8 %). Sedang persentase infeksi akar (56 %) dengan spora yang dienkapsulasi dengan diinkubasi selama 1 dan 2 bula n (Tabel 8.5.). Tabel 8.5. Interaksi dua faktor jenis CMA enkapsulasi dan lama waktu inkubasi Peubah
G. margarita
A. tuberculata
Jumlah spora
(a) 48.4 b
(b) 48.0 b
(c) 40.4 c
(d) 42.0 c
(a) 61.0 a
(b) 60.8 a
(c) 47.0 c
(d) 47.3 c
Infeksi akar
63.0 b
63.4 b
44.8 e
48.8 d
68.2 a
66.6 a
56.8 c
56.8 c
Keterangan : * Huruf yang sama pada baris masing-masing peubah tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT (P<0,05)* (a) Spora telanjang (tidak dengan enkapsulasi); (b) Spora dalam Na-alginat tanpa inkubasi; c) Spora dalam Na-alginat inkubasi 1 bulan (d) Spora dalam Na-alginat inkubasi 2 bulan .
Produksi G. margarita dan A. tuberculata secara in vivo dikemas dengan menggunakan Na-alginat. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa sporulasi tanpa enkapsulasi dan dikemas di dalam Na-alginat 0 bulan tidak menunjukkan perbedaan yang nyata terhadap kontrol (spora telanjang), namun pada spora yang dienkapsulasi dan diinkubasikan selama 1 dan 2 bulan menunjukkan perbedaan yang nyata terhadap peubah yang diukur. 3.4. Perkembangan CMA dalam akar inang Perkembangan yang diamati dari perkembangan histologi akar yang terinfeksi oleh spora CMA yang dienkapsulasi umur 3 bulan setelah tanam, menunjukkan bahwa spora enkapsulasi, baik yang diinkubasi maupun yang tidak, serta spora telanjang menggambarkan histologi yang sama (Gambar 8.1.). Organ CMA yang ada di dalam akar semua sama yaitu, terbentuknya vesikula (Gambar 8.1.A), organ tersebut dibentuk oleh A. tuberculata, sedang G. margarita tidak membentuk organ tersebut. Kedua CMA membentuk hifa eksternal (Gambar 8 .1.B) dan hifa internal (Gambar 8.1.C), serta arbuskula (Gambar 8.1.D) yang membentuk percabangan dikotomik, nampak terbentuknya spora (sporulasi) (Gambar 8.1.E). Pada dasarnya organ CMA yang ada di dalam korteks akar sama, terkecuali organ vesikula, yang hanya dibentuk oleh A. tuberculata.
131
AA
B
B
1000 µm
C C
D
Gambar 8. 2. Perkembangan G. margarita dan A. tuberculata yang dienkapsulasi. A. vesikula (100 E µm), B. hifa eksternal (anak panah putih)= 2 µm, dan hifa intraseluler (anak panah hitam)= 7 µm, D. arbuskula (100 µm), E. sporulasi dalam akar 250 µm 4. PEMBAHASAN
Bentuk dan kelenturan enkapsulasi Na-alginat terbaik untuk pengemasan spora adalah 1,75 %, karena memberikan estetika kapsul terbaik .Calvet & Camprubi (1996) melaporkan bahwa kadar Na-alginat untuk enkapsulasi spora CMA yang terbaik adalah 2 %. Dengan demikian hasil penelitian yang diperoleh lebih efisien 12,5 % dibandingkan dengan hasil penelian sebelumnya. Pengemasan CMA dengan enkapsulasi Na-alginat sebagai inovasi pengemasan spora,
umumnya menggunakan karier berupa zeolit, tanah, limbah
kayu gergaji, dan lain- lain, yang tidak dapat diketahui ada tidaknya spora dalam kemasan tersebut. Pengemasan dan penyimpanan merupakan salah satu faktor yang penting, karena produk yang dikemas dengan menarik dan mampu mempertahankan kualitas spora,
akan meningkatkan daya jual yang tinggi.
Namun demikian faktor lain perlu dipertimbangkan, misalkan dalam efisiensi
132
pengemasan CMA tersebut. Selain faktor estetika dan bentuk, faktor lain yang tidak kalah penting
untuk dipertimbangkan adalah efisiensi. Oleh sebab itu
dilakukan pengujian efisiensi dengan menguji jumlah spora dalam volume tertentu. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa jumlah
200 butir spora,
merupakan jumlah optimal dalam 2 ml Na-alginat, baik pada spora G. margarita maupun A. tuberculata. Hasil kadar Na-alginat terbaik (1,75 %), dan jumlah spora optimal (200 butir/2ml Na-alginat), selanjutnya digunakan untuk uji viabilitas spora enkapsulasi. Setelah spora CMA dikemas dengan Na-alginat atau enkapsulasi spora, dilakukan uji viabilitas untuk mengetahui daya simpan dan pengemasan. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa enkapsulasi spora mampu mempertahankan viabilitas spora. Hal tersebut dapat dilihat dari jumlah spora dan infeksi akar menunjukkan tidak berbeda nyata dengan spora telanjang (spora yang tidak dikemas). Sedang enkapsulasi inkubasi 1-2 bulan menunjukkan perbedaan yang nyata. Menurut Sancayaningsih (2005) sporulasi dan infeksi akar dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor, di antaranya adalah jenis inang, jenis CMA, lama waktu inkubasi, kondisi lingkungan, dan kemampuan infektif dan efektivitas spora. Inkubasi spora diduga menyebabkan dormansi spora (masa istirahat) yang dapat mempengaruhi perkembangan spora. Hasil yang diperoleh menunjukkan terjadinya infeksi akar, karena terlihat struktur organ CMA dalam kortek akar secara histologis dengan pewarnaan Tryplan blue. Artinya bahwa perkecambahan spora telah terjadi, dan terbentuk organ-organ yang sangat penting di dalam spora itu. Rataan persentase infeksi akar yang diperoleh lebih dari 50 %, yang berarti lebih dari 50 % akar tanaman inang terinfeksi oleh CMA. Infeksi akar mempunyai peran yang sangat penting di dalam simbiosis CMA dan inang. Infeksi akar menggambarkan karakteristik tahapan pertumbuhan
CMA dimana peran dari hifa akan membantu fungsi
rambut akar sehingga akan memperluas zona rhizosfer tanaman. Pembentukan spora merupakan tahapan reproduktif yang akan digunakan sebagai inokulum atau propagul (de-Souza 2005). Infeksi akar juga memberikan gambaran perkembangan CMA, dimana hifa yang menginfeksi akar inang berfungsi sebagai saluran meluas secara radikal, membentuk arbuskula yang berperan untuk
133
mengambil nutrien. Bago et al. (1998 a) menyatakan bahwa perkembangan CMA yaitu perkembangan hifa dan pengembangan struktur arbuskula yang berfungsi untuk memperluas zona rhizosfer, dan pengambilan nutrien, sehingga daerah pengambilan nutrien dapat lebih luas, dampak tersebut berakibat memacu pertumbuhan inang tanaman. Di dalam uji viabilitas spora enkapsulasi, jenis CMA yaitu G. margarita dan A. tuberculata memberikan perbedaan yang nyata terhadap jumlah spora dan infeksi akar. Hal tersebut dapat dipahami karena setiap jenis CMA mempunyai perbedaan dalam strategi siklus hidup dan lingkungannya (Brundrett et al. 1999), baik di dalam kemampuan menginfeksi inang, pertumbuhan dan perkembangan yang berbeda. Perbedaan tersebut tidak hanya disebabkan karena jenis CMA dan inang, tetapi ada beberapa faktor yang dapat mempengaruhinya, yaitu musim dan nutrisi (Bever et al. 2001), fisiologi inang, interaksi predator dan organisme pencemar (Bakhtiar et al. 2001). Faktor yang sangat menentukan dalam pertumbuhan dan perkembangan adalah infeksi akar dan sporulasi (Klironomos & Hart 2002). Uji viabilitas yang diperoleh menunjukkan bahwa G. margarita dan A. tuberculata
yang dienkapsulasi masih mampu melakukan pertumbuhan dan
perkembangan dengan melihat peubah yang diamati yaitu jumlah spora dan infeksi akar. Selanjutnya dapat diperlihatkan struktur perkembangan spora yang dienkapsulasi dengan histologi akar tanaman inang yang terinfeksi. Perkembangan spora enkapsulasi menunjukkan adanya vesikula yang berfungsi sebagai kantung penyimpan,
dan tidak semua CMA membentuk
vesikula, misalkan G. margarita (Abbott et al. 1992). Hifa yang membentuk gelembung yang disebut struktur vesikula berfungsi untuk penyimpan lipid di dalam akar. Struktur tersebut jumlahnya meningkat dengan berkembangnya koloni akar, dan hanya dibentuk oleh keluarga Acaulosporaceae, Glomeraceae, dan Pacisporaceae (Declerck et al. 1998). Ekstraradikal miselium (ERM) adalah kumpulan hifa yang berada di luar sel inang, yang mempunyai arti penting sebagai kunci CMA yang menyangkut simbiosis (Gambar 8.2.B dan C). ERM juga bertanggung jawab di dalam penyebaran kolonisasi di dalam akar inang (Smith & Read 1997). Hart & Reader (2002) mempelajari perkembangan dan biomas miselium sebanyak 21 jenis dari
134
keluarga Acaulosporaceae, Glomeraceae dan Gigasporaceae diperoleh adanya perbedaan perkembangan
intra dan ekstraradikal miselium CMA. Perbedaan
tersebut dapat dihubungkan dengan perbedaan taksonomi antar keluarga, dan hasilnya tidak tergantung dari jenis inang tanaman. Glomeraceae lebih cepat menjelajah akar dan kolonisasi akar paling luas apabila dibandingkan dengan Acaulosporaceae dan Gigasporaceae. Pada penelitian lain menunjukkan bahwa kolonisasi lahan keluarga Glomeraceae adalah rendah apabila diukur dari pengembangan ERM. Sedang Gigasporaceae menunjukkan pengembangan ERM yang paling tinggi, 2 - 4 kali lebih panjang dibandingkan dengan dua keluarga lain. Hifa yang tumbuh di antara deretan sel disebut intraseluler (Gambar 8.2.C) (Giovannetti et al. 2003) Arbuskula (Gambar 8.2.D) adalah struktur khusus yang berbentuk dikotomis, bercabang setelah masuk ke dalam sel akar tanaman membentuk selaput yang menghubungkan antara fungal dan selaput plasma tanaman. Arbuskula diduga sebagai alat penghubung lokalisasi nutrient dan pertukaran karbon antar kedua simbion tersebut, sehingga arbuskula dianggap sebagai struktur kunci dalam suatu simbiosis antara tanaman dan CMA. Pembentukan arbuskula dikendalikan oleh genetik tanaman inangnya, dan ketersediaan nutrisi (Harrison 1999). Sporulasi adalah proses terbentuknya spora, yaitu pertemuan hifa positif dan negatif yang akan membentuk individu baru (Gambar 8.1.E). Produksi spora tergantung dari intramiselium dan ekstramiselium (de-Souza 2005). Hasil enkapsulasi dengan
menggunakan
konsentrasi
Na-alginat
yang
berbeda
menunjukkan hasil yang berbeda. Hasil konsentrasi Na-alginat untuk enkapsulasi G. margarita dan A. tuberculata yang terbaik diperoleh adalah 1,75 %. Keunggulan enkapsulasi spora adalah spora yang terbungkus oleh Na-alginat dapat terlihat jelas dan jumlah dapat dihitung karena Na-alginat mempunyai kenampakan yang bening dan trasparan serta mempunyai masa yang rendah, sehingga lebih praktis dan efisien. Enkapsulasi spora G. margarita dan A. tuberculata dari hasil kultur pot menunjukkan bahwa dengan cara tersebut CMA mampu mempertahankan viabilitas spora. Hasil yang diperoleh membuka peluang untuk memanfaatkan
135
teknik enkapsulasi dalam skala lebih besar dalam upaya penyediaan spora untuk jangka waktu tertentu. Teknik enkapsulasi spora juga dapat dimanfaatkan untuk penyimpanan dan pengemasan spora-spora dalam keadaan steril, yang selanjutnya dikembangkan dengan teknik kultur ganda menggunakan kultur akar rambut in vitro.
5. SIMPULAN
1. Na-alginat dapat digunakan untuk enkapsulasi spora G. margarita dan A. tuberculata, dan konsentrasi terbaik adalah 1,75 % 2. Perbandingan jumlah spora dan volume Na-alginat optimal adalah 200 butir spora CMA (G. margarita dan A. tuberculata) di dalam 2 ml Na-alginat 3. Daya viabilitas spora G. margarita dan A. tuberculata yang dienkapsulasi tetap terjaga dengan baik.
BAB IX
PEMBAHASAN UMUM Perbanyakan
spora
CMA
secara
konvensional
pada
umumnya
menggunakan kultur pot di rumah kaca dengan tanaman inang sorghum, jagung atau P. phaseoloides. Kelemahan kultur pot adalah tidak menghasilkan CMA murni dan kurang efisien. Salah satu upaya yang dapat dilakukan untuk menanggulangi kelemahan tersebut adalah dengan menggunakan kultur in vitro. Keberadaan CMA di lingkungan penting untuk kesuburan tanah dan tanaman, maka upaya pengembangan CMA terus dilakukan, terutama untuk mendapatkan kultur CMA yang murni, dan berkualitas dengan pengemasan yang lebih efisien, efektif dan dapat mempertahankan viabilitas CMA. Titik awal yang sangat penting di dalam perkembangan spora secara in vitro adalah sumber spora steril yang mampu berkembang, jenis inang dan medium perkembangan. Untuk mengatasi permasalahan tersebut telah dilakukan penelitian dengan tujuan untuk mengetahui : (i) pengembangan teknologi akar rambut beberapa tanaman secara in vitro, (ii) perbanyakan Gigaspora margarita
dan Acaulospora tuberculata
dengan kultur pot di rumah kaca, (iii) penyediaan inokulum steril G. margarita dan A. tuberculata di dalam kultur aksenik dengan eksplan tomat dan wortel, (iv) perkembangan G. margarita dan A. tuberculata menggunakan akar rambut dan (v) teknologi enkapsulasi untuk pengemasan spora G. margarita dan A. tuberculata dengan Na-alginat. Tanaman uji yang digunakan untuk pembentukan akar rambut adalah jagung, sorghum, kentang Granola, kentang Atlantik dan wortel, diinokulasi dengan Agrobacterium rhizogenes galur LBA 5947, selanjutnya dikultur pada medium MS, B5 dan White. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa kentang Granola, kentang Atlantik dan wortel mampu membentuk akar rambut, sedang jagung dan sorghum tidak dapat membentuk akar rambut. Sehingga dapat disimpulkan bahwa eksplan yang mampu membentuk akar rambut, yaitu eksplan yang merespons T-DNA A. rhizogenes.
137
Jagung dan sorghum tergolong dalam tanaman monokotil, ternyata memberikan respons terhadap T-DNA
A. rhizogenes. Hal ini
tidak
disebabkan
tanaman monokotil saat dilukai tidak mengeluarkan senyawa aktif yang berfungsi untuk menginduksi gen virulen A. rhizogenes . Menurut Douglas et al. (1985) secara alami tanaman dilukai mengeluarkan senyawa yang dapat menarik T-DNA dalam plasmid A. rhizogenes. Senyawa tersebut di antaranya adalah asam amino, gula, dan senyawa fenolik. Tahapan pelepasan senyawa kimia dari tanaman dan terjadinya gerak kemotoksin dari A. rhizogenes merupakan langkah awal dari infeksi (Christey & Braun 2004). Tanaman wortel, kentang Granola dan Atlantik (dikotil) dapat merespons T-DNA A. rhizogenes, karena tanaman tersebut saat pelukaan dapat menghasilkan senyawa fenolik yang berfungsi untuk merangsang gerak kemotaksis, sehingga terjadi kontak sel, dan plasmid A. rhizogenes melekat ke dalam sel tanaman sasaran. Pelekatan tersebut terjadi karena A. rhizogenes memiliki gen virulen yang tersusun pada tujuh lokus utama, yaitu vir A, vir B, vir C, vir D, vir E, vir G vir H,
dan proses terbentuk nya akar rambut sangat
kompleks (Sheng & Citovsky 1996, Christey & Braun 2004). Akar rambut kentang Granola dan Atlantik tumbuh paling baik pada medium MS, sedang akar rambut wortel pada medium White. Pertumbuhan Akar rambut paling baik adalah kentang granola dan wortel, selanjutnya diadaptasikan pada kultur ganda, yaitu medium modifikasi minimal (MM) dari Becard & Fortin (1988). Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa akar rambut wortel berkembang dengan baik, memiliki percabangan akar yang banyak, hal tersebut dapat dipahami karena akar rambut wortel telah teradaptasi pada medium White, yang komposisi hara nutrisinya relatif sederhana. Sedang medium kultur ganda adalah medium modifikasi minimal (Becard & Fortin, 1988) yang mempunyai P rendah. Giri dan Narasu (2000) menyatakan bahwa ada beberapa faktor yang mempengaruhi pertumbuhan dan biomasa kultur akar rambut, antara lain komposisi nutrisi di dalam medium, jenis medium, jenis tanaman dan faktor fisik seperti suhu, dan cahaya. Lingkungan tumbuh optimum untuk pertumbuha n kultur akar bervariasi antar spesies. Toivonen et al. (1992) memperoleh pertumbuhan akar rambut Catharanthus roseus paling cepat apabila dikulturkan pada suhu 32o C dibandingkan dengan suhu 19,5 o C dan 24 o C. Pada kedua suhu tersebut akar
138
berwarna coklat dan terbentuk kalus. Ridgway (2004) menyatakan bahwa akar rambut wortel tumbuh baik dalam medium Lauria-Bertani dan medium yeast manitol. Christey & Braun (2004) menyatakan bahwa wortel salah satu spesies yang sukses dan mudah beradaptasi untuk memproduksi akar rambut. Oleh sebab itu akar rambut wortel dapat digunakan sebagai inang untuk perkembangan dan perbanyakan masal CMA uji secara in vitro. Dalpe & Declerck (2002), de-Souza (2005) dan Diop (2003) menyatakan bahwa akar rambut wortel pada umumnya digunakan untuk perkembangan CMA secra in vitro. Hasil konfirmasi T-DNA Agrobacterium rhizogenes menunjukkan bahwa DNA dari tanaman akar rambut terampklifikasi pada ukuran basa 780 pb untuk TL dan 1600 pb TR DNA. Gelvin (2000) menyatakan bahwa tanpa penambahan zat pengatur tumbuh akar rambut tetap tumbuh dengan baik, karena gen TR dan TL DNA dapat memacu pembentukan sitokinin dan auksin, sehingga dapat memacu pertumbuhan akar rambut secara adventif Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa jenis tanaman uji memiliki respons yang berbeda terhadap T-DNA A. rhizogenes. Terintegrasinya TL dan TR DNA dapat lebih meyakinkan bahwa akar rambut wortel dapat tumbuh baik tanpa penambahan zat pengatur tumbuh. Sehingga akar rambut dapat digunakan untuk inang perkembangan dan perbanyakan masal CMA
uji secara in vitro.
Sumber spora G. margarita dan A. tuberculata (CMA uji) diperoleh dari kultur pot di rumah kaca (secara konvensional), dengan inang sorghum dan P. phaseoloide,. yang ditumbuhkan dalam cawan Petri plastik dan gelas plastik berwarna (tidak transparan). Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa jenis tempat tumbuh dan
jenis inang yang digunakan berpengaruh nyata terhadap
biomasa tanaman, nisbah pucuk akar, jumlah spora dan persentase infeksi akar. Nilai biomasa yang tinggi menunjukkan terjadinya peningkatan proses fotosintesis, karena unsur hara yang diperlukan cukup tersedia sehingga memberikan pengaruh yang nyata pada biomassa tanaman. Biomasa tanaman memperlihatkan peningkatan setiap pertambahan lama waktu pengamatan. Hal tersebut terkait dengan adanya simbiosis G. margarita dan A. tuberculata, serta kompatibilitas antara inang dan inokulum yang dapat meningkatkan biomassa tanaman. Lucia (2005), Suraya (2002), Widiastuti (2004), Winarsih & Baon
139
(1999) menyatakan bahwa simbiosis CMA dapat meningkatkan biomassa tanaman. Pertumbuhan tajuk tanaman yang baik ditunjukkan oleh nilai nisbah tajuk akar mendekati seimbang antara tajuk dan akarnya. Banyak faktor yang dapat mempengaruhi pertumbuhan tanaman, baik secara internal dalam hal ini kondisi fisiologis tanaman, faktor lingkungan, persediaan nutrisi dan air, serta adanya simbiosis dari CMA. Widiastuti (2004) menyatakan bahwa infeksi CMA terhadap kelapa sawit dapat menyebabkan terjadinya perubahan akar pada tingkat sel, yaitu dengan terlihat adanya hifa eksternal, internal, hifa gelung, vesikula dan arbuskula dalam kortek akar, serta hifa eksternal di rhizosfir. Citernesi et al. (1998) menyatakan bahwa kolonisasi CMA dapat merubah sistem dan arsitektur perakaran tanaman Olea europaea, L. Perubahan tersebut disebabkan adanya perubahan nutrisi (hara), dan peran hormon
yang terinduksi dengan adanya
infeksi CMA. Disatu sisi perakaran mempunyai arti penting, selain untuk mendukung tegaknya tanaman, penyerapan air dan hara yang tidak mudah bergerak, diantaranya unsur P. Simbiosis CMA akan mengubah arsitektur perakaran sehingga zona rhizosfir lebih luas, dan pengambilan nutrisi maupun air yang digunakan sebagai bahan dasar proses fotosintesis tersedia secara optimal. Hal tersebut menyebabkan proses fotosintesis dapat berlangsung secara optimal, sehingga pertumbuhan dan perkembangan tanaman dapat mencapai optimal, dan menghasilkan pertumbuhan tajuk dan akar yang optimal (Widiastuti 2004, Lucia 2005). Orcutt dan Nielsen (2000) menyatakan bahwa ada enam cara peningkatan serapan hara tanaman oleh CMA, yaitu: (1) melalui luasnya perakaran tanaman, sehingga memperluas area penyerapan, (2) adanya hifa eksternal akan memperluas area penyerapan
karena diameter yang lebih kecil dibandingkan
dengan akar, sehingga dapat meningkatkan serapan hara 60 kali (Bolan, 1991), (3) dapat menyebabkan pergerakan P dengan baik, (4) menginduksi pembentukan asam organik dan fosfatase, meningkatkan persediaan P untuk tanaman melalui pelarutan dan mineralisasi, (5) meningkatkan secara langsung atau tidak langsung transfer hara sesama tanaman bermikoriza, dan (6) meningkatkan kapasitas serapan hara oleh akar, karena akar bermikoriza dapat hidup lebih lama.
140
Inokulasi CMA dapat mempercepat pertumbuhan akar
dan dapat
mengubah bentuk percabangan akar sehingga tanaman mempunyai lebih banyak akar lateral (Tisserant et al. 1996, Masri & Azizah 1998). Lucia (2005) menyatakan bahwa
semua inokulum CMA yang diinokulasikan pada bibit
manggis menghasilkan jumlah akar lateral yang nyata lebih banyak dibandingkan dengan bibit manggis yang tidak diinokulasi CMA. Hal ini menunjukkan bahwa perbaikan struktur akar tanaman yang bersimbiosis dengan CMA
dapat
meningkatkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman, meningkatkan proses fotosintesis, dan menstabilkan pertumbuhan. Faktor penentu di dalam perbanyakan spora yang paling utama adalah perkecambahan spora, karena spora yang berkecambah dapat menginfeksi akar tanaman, dan hifa akan berkembang diikuti dengan terjadinya sporulasi. Namun banyak faktor yang mempengaruhi proses sporulasi (terbentuknya spora), antara lain lingkungan, jenis inang, kemampuan infektivitas dan efektivitas spora dalam proses sporulasi, kolonisasi akar, dan lama waktu inkubasi (Sancayaningsih 2005, Vaast & Zasoski 1991). Pada tahap tersebut keterlibatan jenis inokulum dan jenis inang tanaman sebagai kunci utama, karena energi yang digunakan untuk pertumbuhan dan perkembangan CMA berasal dari fotosintat tanaman, demikian pula sebaliknya CMA memberikan nutrisi dan air sebagai bahan dasar fotosintesis (Bever 2002, Heijden 2002, Ezawa et al. 2002). Diop et al. (1994) menyatakan bahwa pemilihan inokulum dan tanaman inang merupakan kunci sukses dalam simbiosis. Buce et al. (2000) melaporkan bahwa eksudat inang sangat berpengaruh terhadap lingkungan dan mampu merangsang perkecambahan spora. Hal ini disebabkan eksudat akar dapat merangsang pertumbuhan hifa, dengan memecahkan kantong perkecambahan. Selanjutnya akar akan berkecambah dan mengkolonisasi akar, maka akan dimulai terjadinya simbiosis, selanjutnya terjadi infeksi akar dan sporulasi. Vaast & Zasoski (1991) melaporkan bahwa lama waktu inkubasi berpengaruh terhadap kolonisasi, tingkat kematangan spora, dan peningkatan jumlah spora (sporulasi). Cekaman lingkungan, dan
media merupakan faktor
yang dapat mempengaruhi perkecambahan spora dan kolonisasi CMA. Bakhtiar (2002) dan Sancayaningsih (2005) menggunakan jenis inokulum dan inang yang
141
berbeda, menghasilkan pertumbuhan tanaman, kolonisasi, dan sporulasi yang berbeda. Hal tersebut menunjukkan bahwa penggunaan jenis dan inang yang berbeda memberikan respons yang berbeda. Terjadi korelasi antara jumlah spora dan infeksi akar. Hal tersebut disebabkan
proses infeksi akar oleh CMA dipengaruhi oleh efektivitas dan
infektivitas spora, jenis dan jumlah spora, kompatibilitas antara inang dan CMA serta faktor lingkungan (Bakhtiar 2002). Untuk memproduksi inokulum diperlukan pertimbangan, antara lain (i) kombinasi tempat tumbuh tanaman, (ii) jenis CMA dan jenis inang yang digunakan, (iii) lingkungan, (iv) serta memahami fisiologi CMA, karena setiap jenis CMA mempunyai karakter yang berbeda, baik infektivitasnya maupun efektivitasnya (Vaast & Zasoski 1991, Bakhtiar 2002, Sancayaningsih 2005). Dapat disimpulkan bahwa tempat tumbuh terbaik untuk memperoleh sumber spora secara konvensional adalah cawan Petri plastik, karena menghasilkan spora ukuran dan bentuk yang seragam. Inang P. phaseoloides, lebih baik, karena menghasilkan jumlah spora dan persentase infeksi akar lebih tinggi dibandingkan dengan sorghum.. Widiastuti (2004) menyatakan bahwa kedua inang tersebut kompatibel untuk perbanyakan CMA G. margarita dan A. tuberculata yang diisolasi dari perakaran kelapa sawit secara in vivo, dan P. phaseoloides, lebih baik dibandingkan dengan sorghum. Tampak bahwa tempat tumbuh dan jenis inang mempengaruhi perbanyakan CMA uji secara konvensional. Sterilisasi spora untuk memperoleh inokulum CMA uji yang steril dilakukan optimasi tiga metode sterilisasi. Metode sterilisasi dikatakan baik apabila spora yang disterilkan dapat berkecambah. Tiga metode sterilisasi yang digunakan, metode sterilisasi oleh Buce et al. (2000) spora G. margarita dapat berkecambah walaupun sangat rendah (2%), sedang perlakua n yang lain tidak menunjukkan perkecambahan spora. Dengan demikian metode sterilisasi yang digunakan lebih lanjut adalah metode sterilisasi Buce et al. (2000). Namun demikian perlu dilakukan modifikasi, karena setiap jenis CMA mempunyai ukuran dan bentuk yang berbeda, serta kualitas sumber spora yang tidak sama. Modifikasi sterilisasi dilakukan pada konsentrasi sterilan dan lama waktu
142
sterilisasi, hasil modifikasi optimal yang digunakan adalah MgSO4 .7H2 O (0,1%) dan Tween 20 (10%) steril, MgSO4 .7H2 O mencegah dormansi spora, sedang Tween 20 untuk pelembut dinding sel spora, sehingga sterilan dapat berfungsi dengan baik, dan NaOCl2 (0,52%) (Bayclin 10%) untuk sterilisasi permukaan spora (Fortin et al. 2002). Antibiotik yang digunakan adalah gentamisin, streptomisin, penisillin masing- masing 100 ppm dan tetrasiklin 2,5 ppm. Streptomisin berfungsi untuk membunuh bakteri gram negatif, penisillin membunuh bakteri gram positif, gentamisin dan tetrasiklin mempunyai spektrum yang lebih luas sehingga fungsi antibio tik lebih luas. Artinya dapat membunuh kuman yang bersifat gram negatif maupun positif dan chemoterapi (Anonimus 2006b). Frances et al. (1996) menyatakan bahwa bakteri, selain menempel dipermukaan spora, ada yang tinggal di dalam dinding spora sebelah dala m. Biancioto & Bonfante (1993) menyatakan bahwa ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dan dipertimbangkan dalam sterilisasi spora CMA, yaitu karakteristik spora yang tergantung dari jenis CMA, meliputi kondisi permukaan spora dan ketebalan dinding spora. Hasil modifikasi metode sterilisasi Buce et al. (2002) yang diperoleh, selanjutnya digunakan untuk percobaan lebih lanjut. Hasil optimasi sterilisasi menunjukkan bahwa tidak setiapmetode sterilisasi dapat digunakan untuk mensterilkan spora CMA, tetapi perlu dimodifikasi sesuai dengan jenis CMA yang akan disterilkan. Pada dasarnya metode sterilisasi spora CMA adalah membersihkan permukaan spora, melembutkan dinding sel spora, penggunaan zat atau perlakuan yang dapat menekan atau mencegah dormansi spora CMA, serta antibiotik untuk membunuh organisme lain yang tidak diinginkan. CMA bersifat obligat, maka untuk perkembangan dan pertumbuhan CMA diperlukan inang kompatibel agar daya sporulasi dan persentase infeksi akar tinggi, sehingga persaratan untuk inokulum dapat dipenuhi. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa inang tomat dan wortel in vitro kompatibel untuk perkembangan kultur aksenik CMA uji, namun inang wortel lebih baik dibandingkan inang tomat. Selain optimasi sterilisasi dan jenis inang, medium
143
pertumbuhan merupakan faktor yang berpengaruh terhadap perkembangan dan perbanyakan spora CMA uji in vitro, maka perlu dilakukan optimasi medium. Medium kultur ganda, yaitu medium yang dapat digunakan untuk pertumbuhan dan perkembangan dua organisme simbion (tanaman dan CMA). Jenis medium kultur ganda yang digunakan MM (Becard & Fortin 1988) dan MSR (Strullu & Romand 1986), yaitu medium minimais yang dapat digunakan untuk perkembangan CMA secara in vitro. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa kedua jenis medium yaitu MM dan MSR dapat digunakan untuk perkembangan dan perbanyakan spora CMA uji in vitro, namun hasil paling baik adalah medium MM. Hal tersebut diduga terkait dengan rendahnya unsur P pada medium MM dibandingkan dengan MSR. P rendah dapat meningkatkan produksi eksudat akar, dan eksudat akar dapat mempercepat pecahnya tabung kecambah spora, sehingga spora dapat segera berkecambah. Selain mempercepat perkecambahan spora CMA, eksudat akar juga membantu mempercepat pertumbuhan hifa eksternal, dan sebagai sinyal untuk terjadinya simbiosis antara inang dan CMA (Suriyapperuma & Koske 1995, Nagahashi & Douds 1997, Becard et al. 1995, Tsai & Phillips 1991). Disimpulkan bahwa medium yang mengandung P rendah lebih baik dibandingkan dengan P tinggi, dan medium MM mengandung P lebih rendah dibandingkan dengan MSR, sehingga medium MM lebih baik untuk perkembangan CMA uji dibandingkan dengan MSR. Perkecambahan
spora
merupakan
titik
awal
pertumbuhan
dan
perkembangan spora. Apabila spora tidak mampu berkecambah, maka proses simbiosis tidak berjalan. Untuk penyediaan inokulum steril mampu berkecambah, merupakan tuntutan utama yang harus dipersiapkan. Faktor yang harus diperhatikan di dalam proses perkecambahan spora steril adalah penyediaan inokulum steril (sumber spora), sterilisasi spora, meliputi bahan dan waktu yang digunakan untuk sterilisasi. Nutrisi medium untuk perkecambahan spora CMA, inang yang kompatibel, dan faktor genetik CMA juga berpengaruh terhadap perkecambahan spora (Bianciotto & Bonfante 1993). Paula & Siqueira (1991) menyatakan walaupun prosedur sterilisasi permukaan spora telah digunakan secara rutin, tetapi dilaporkan keberhasilan perkecambahan kontradiktif. Sebagai
144
contoh sterilisasi dikemukakan oleh Mosse (1962), spora steril yang diperoleh mencapai 90%. Metode tersebut digunakan oleh Mertz et al. (1979), dilaporkan spora yang steril mencapai 32-68%. Disamping itu perkecambahan spora steril juga ditentukan oleh tingkat kemurnian agar yang digunakan dalam media, ternyata “gelrite”. mampu menstimulasi perkecambahan spora steril. Faktor lain yang berpengaruh terhadap perkecambahan di antaranya adalah nutrisi, perlakuan kimia, dan faktor genetik CMA (de-Souza & Declerck 2003). Diop et al. (1994) menyatakan bahwa pertumbuhan hifa berhenti apabila akar tidak ada, dan eksudat akar dapat mempengaruhi status fisiologi CMA. Di samping itu inokulum dan tanaman inang yang tepat merupakan kunci sukses terbentuknya simbiosis. Organisme yang berhubungan dengan permukaan spora CMA dapat saling merangsang, dapat pula menghalangi dan atau menunda perkecambahan spora (Paulitz & Linderman 1989, Will & Sylvia 1990). Selain itu
kegagalan
perkecambahan
mungkin
disebabkan
kerusakan
tabung
perkecambahan atau fisiologi CMA, spora belum matang, atau faktor lingkungan yang kurang mendukung (de-Souza & Declerck 2003). Bahan kimia yang digunakan untuk sterilisasi dan lama waktu sterilisasi kurang tepat, dapat mempengaruhi tabung perkecambahan dan akhirnya spora tidak mampu berkecambah. Mungkin juga disebabkan tidak adanya inang di dalam lingkungan perkecambahan. Hal tersebut dapat dipahami, karena perlakuan bahan kimia adalah salah satu faktor yang dapat menghambat perkecambahan. Gianinazzi-Person et al. (1989), Becard & Pfeffer (1993). Bianciotto & Bonfante (1993) menyatakan bahwa faktor perlakuan kimia dapat mempengaruhi perkecambahan spora. Diop et al. (1994) menyatakan bahwa konsentrasi Zn dan Mg di dalam media agar dapat menghambat perkecambahan spora. Disatu sisi kehadiran eksudat tanaman sangat diperlukan, karena bersifat kemoatraktif terhadap hifa CMA. Penggunaan teknologi akar rambut dimanfaatkan untuk perkembangan dan perbanyakan CMA uji secara masal, dengan menggunakan medium kultur ganda MM dan MSR. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa rerata berat basah dan kering akar rambut yang ditumbuhkan pada medium MM dan MSR tidak berbedanyata, karena kedua medium adalah medium minimais, dan perbedaan
145
konsentrasi P dalam
medium tidak mempengaruhi pertumbuhan dan
perkembangan akar rambut wortel. Hal tersebut dapat dipahami karena akar rambut wortel telah terintegrasi TL dan TR DNA, yang berfungsi untuk meningkatkan zat pengatur tumbuh sitokinin dan auksin secara internal, sehingga pertumbuhan akar rambut wortel tetap baik. Demikian pula akar rambut wortel yang dikultur pada medium MM, dan diinokulasi dengan CMA uji maupun yang tidak diinokulasi (kontrol), memberikan pengaruh yang tidak nyata terhadap berat basah dan berat kering akar rambut wotel. Christey & Braun (2004) menyatakan bahwa wortel adalah salah satu species yang sukses, mudah beradaptasi dan memproduksi akar rambut dengan cepat. Perkembangan CMA uji dengan akar rambut wortel yang dikultur pada kultur ganda MM dan MSR, dapat digunakan untuk perkembangan dan perbanyakan CMA uji steril secara masal. Hal tersebut terlihat bahwa CMA uji dapat menginfeksi akar, berkembang membentuk struktur organ CMA dalam akar yaitu, arbuskula, hifa internal, eksternal, namun sporulasi masih rendah. Terbentuknya organ-organ tersebut menunjukkan bahwa CMA dapat bersimbiosis dengan inang akar rambut wortel secara baik. Dalpe & Declerck (2002) menyatakan bahwa simbiosis stabil bila terbentuk struktur organ CMA dalam akar, dan sebagai ciri specifik suksesnya simbiosis antar simbion. Fortin et al. (2002) menyatakan bahwa akar rambut dapat digunakan sebagai alat penyederhanaan mempelajari tahapan simbiosis CMA. Teknologi akar rambut dapat meningkatkan produksi CMA dan propagul (Jolicoeur 1999), dan umumnya percobaan CMA in vitro menggunakan akar rambut wortel (Becard & Fortin 1988). Hasil penelitian yang diperoleh menunjukkan bahwa inang akar rambut wortel dapat digunakan untuk perkembangan dan perbanyakan G. margarita dan A. tuberculata in vitro, menggunakan medium MM dan MSR, dan medium MM lebih baik dibandingkan dengan MSR. Kultur in vitro CMA uji yang diperoleh menunjukkan bahwa inang eksplant wortel, tomat dan akar rambut wortel kompatibel untuk penyediaan inokulum maupun perbanyakan CMA uji kultur aksenik secara masal. Dari hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa jenis inang dan medium pertumbuhan berpengaruh terhadap kultur aksenik CMA uji in vitro.
146
Hasil dari beberapa penelitian yang telah dilakukan menunjukkan bahwa produksi Gigaspora dapat mencapai 790 butir dan Glomus 6695 butir spora dalam satu cawan Petri berisi 30 ml medium dengan inokulum steril (Diop et al. 1992), sedang de-Souza (2005) menghasilkan Scutellospora sebanyak 56 butir/30 ml medium. Dari hasil tersebut menunjukkan bahwa produksi spora secara in vitro dapat digunakan untuk perbanyakan kultur aksenik CMA yang menghasilkan spora sterril yang berkualitas. Pemanfaatan teknologi in vitro dapat digunakan untuk perbanyakan dan perkembangan spora CMA uji, selanjutnya digunakan sebagai teknik dasar, yang membuka peluang penggunaan media, inang tanaman tomat, wortel maupun akar rambut wortel untuk penyediaan inokulum steril maupun perbanyakan spora secara masal, khususnya G. margarita dan A. tuberculata, maupun CMA jenis lain. Untuk tujuan jangka panjang spora kultur aksenik akan diperbanyak secara masal, oleh sebab itu perlu dipersiapkan
pengemasan hasil produksi.
Maka
diperlukan pengujian enkapsulasi spora CMA dengan Na-alginat, baik optimasi konsentrasi Na-alginat, jumlah spora dalam volume 2 ml Na-alginat dan uji daya viabilitas kecambah spora CMA. Sehubungan hasil perbanyakan spora CMA uji kultur aksenik masih rendah, maka pengujian enkapsulasi CMA steril belum sepenuhnya dapat dilakukan. Oleh sebab itu sumber spora yang digunakan adalah spora CMA konvensional, dan perlakuan tersebut dapat digunakan sebagai model enkapsulasi CMA steril. Pada umumnya pengemasan CMA yang dilakukan saat ini kurang efisien dan efektif, sehingga upaya untuk peningkatan pengemasan sangat diperlukan. Na-alginat adalah bahan berupa agar padat, mempunyai bobot masa rendah, berpenampakan bening transparan, menyerap air dan pertukaran gas tetap terjaga, tahan terhadap tekanan osmotik tinggi, sehingga organisme di dalamnya tetap hidup, dan dapat digunakan sebagai pengemas dan penyimpan spora CMA (Calvet et al. 1996, Wang et al. 2005, Wang 2006). Untuk mendapatkan hasil pengemsan CMA yang baik dan efisien dilakukan optimasi penggunaan kadar Naalginat yaitu 1,5 %, 1,75 % dan 2 %. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa kadar Na-alginat terbaik 1,75 %, karena bentuk dan ukuran seragam, kelenturan baik, penampakan menarik
147
dibandingkan dengan perlakuan lain. Untuk memperoleh jumlah spora enkapsulasi optimum, dilakukan optimasi jumlah spora dalam 2 ml liter Naalginat konsentrasi 1,75 % sebanyak 100 butir, 150 butir dan 200 butir spora CMA uji. Hasil terbaik menunjukkan bahwa 200 butir CMA uji dalam 2 ml Naalginat paling efisien dibandingkan dengan perlakuan lain. Selanjutnya hasil yang diperoleh digunakan untuk uji daya viabilitas spora enkapsulasi dengan pembanding spora telanjang atau spora tanpa enkapsulasi (kontrol). Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa Na-alginat dapat digunakan sebagai enkapsulasi spora, karena jumlah spora dan persentase infeksi akar pada umur 3 bulan tidak menunjukkan perbedaan yang nyata dengan spora telanjang. Sedang enkapsulasi spora dengan inkubasi 1-2 bulan menunjukkan perbedaan yang nyata terhadap spora enkapsulasi tanpa inkubasi, baik jumlah spora maupun persentase inf. Hal tersebut diduga spora enkapsulasi yang diinkubasi 1-2 bulan mengalami dormansi, sehingga memerlukan waktu untuk meningkatkan jumlah spora dan persentase infeksi akar yang dihasilkan. Vaast & Zasoski (1991) menyatakan bahwa lama waktu inkubasi dan tingkat kematangan spora berpengaruh terhadap kolonisasi akar dan sporulasi. Pada umumnya enkapsulasi CMA menggunakan kadar 2 % Na-alginat (Calvet et al.1996), namun hasil yang diperoleh lebih efisien, karena pada kadar 1,75 % Na-alginat memperlihatkan kenampakan (performance) terbaik sehingga dapat disimpulkan bahwa kadar 1,75% Na alginat dapat digunakan untuk enkapsulasi spora CMA uji.
Hasil tersebut menunjukkan ada efisiensi bahan
enkapsulasi kurang lebih 12,5 %. Sehingga dapat disimpulkan bahwa enkapsulasi dengan konsentrasi 1,75 % lebih efisien, dan daya viabilitas spora CMA tetap baik, maka penggunaan enkapsulasi Na-alginat efisien dan berkualitas.
148
Fenomena yang diperoleh dari hasil penelitian Untuk mengembangkan CMA A. tuberculata dan G. margarita secara in vitro diperlukan inokulum yang berkualitas yaitu memiliki ukuran, bentuk dan umur yang seragam, tingkat kontaminasi yang rendah, daya menginfeksi akar tinggi serta dapat diproduksi secara massal. Penyediaan sumber spora A. tuberculata dan G. margarita yang berkualitas untuk kultur in vitro dapat diproduksi menggunakan inang P. phaseoloides, yang ditumbuhkan dalam cawan Petri plastik dengan media zeolit steril, dan dipelihara dalam rumah kaca. Kondisi lingkungan mikro dalam cawan Petri dan media yang steril mampu menghasilkan spora dengan ukuran yang seragam dalam jumlah banyak. Hal yang menentukan tingkat keberhasilan sterilisasi spora untuk kultur in vitro adalah penggunaan senyawa kimia yang mampu meningkatkan daya serap dinding sel spora terhadap bahan sterilan, yaitu Tween. Selanjutnya dibersihkan dinding permukaan spora dengan Bayclin, diikuti dengan penggunaan senyawa antibakteri dan antifungi untuk menekan pertumbuhan mikroba yang hidup bersimbiosis dalam dinding sel bagian dalam spora CMA. Senyawa yang terbaik untuk digunakan adalah antibiotik sptreptomisin, gentamisin, penisillin dan tetrasiklin. Dalam sistem pengembangan CMA secara in vitro, akar inang tanaman dapat disediakan berupa akar tanaman yang dikecambahkan dalam kultur secara in vitro dan akar rambut tanaman wortel. Penyediaan akar rambut yang terbaik sangat ditentukan oleh kompatibilitas jenis tanaman dengan A. rhizogenes. TDNA A. rhizogenes yang ditransfer ke dalam sel eksplan batang tanaman inang yang dilukai mampu terintegrasi ke dalam DNA sel tanaman.
T-DNA A.
rhizogenes adalah gen pengontrol produksi auksin dan sitokinin yang ekspresinya berupa kemampuan tanaman membentuk akar rambut. T-DNA yang telah terintegrasi di dalam sel tanaman inang wortel, menyebabkan sel-sel tanaman memiliki kemampuan untuk memproduksi kedua zat pengatur tumbuh secara mandiri. Ekspresi gen tersebut ditunjukkan dengan terbentuknya akar rambut dari eksplan tanaman wortel secara terus menerus dalam kultur in vitro. Dalam kultur in vitro simbiosis CMA dan inang dipengaruhi oleh kompatibilitas inang dan jenis CMA serta lingkungan mikro berupa medium
149
tumbuh. Sifat CMA secara alami hanya mampu tumbuh dan berkembang dengan baik dalam kondisi media yang miskin hara, kondisi ini juga terjadi dalam sistem pengembangan CMA menggunakan kultur in vitro.
Medium yang mampu
memberikan pertumbuhan dan perkembangan akar rambut tanaman wortel dan spora CMA A. tuberculata dan G. margarita dengan baik adalah medium yang mampu menyediakan sumber hara untuk keduanya, disebut kultur ganda. Komposisi medium untuk kultur ganda yang memiliki sumber fosfat relatif rendah yang dapat mendukung pertumbuhan dan perkembangan A. tuberculata dan G. margarita serta pertumbuhan akar rambut wortel, yaitu medium MM dari Becard & Fortin (1988). Akar rambut menunjukkan beberapa keunggulan dibandingkan dengan akar tanaman in vivo dan in vitro, di antaranya kemampuan untuk tumbuh secara berkesinambungan, pertumbuhan akar cepat, mempunyai sifat seperti akar tanaman normal, sifat genetiknya stabil, dan berarsitektur akar yang lebat, didominasi oleh akar sekunder dan tertitier. Kedua jenis akar in vitro ini memiliki dinding sel yang relatif lebih lunak dibandingkan dengan akar in vivo. Infeksi akar tanaman dan akar rambut dalam kultur in vitro menunjukkan pola yang relatif sama dengan pola infeksi CMA terhadap akar tanaman inang dalam kultur in vivo. Perbedaan yang tampak adalah dalam kecepatan menginfeksi, infeksi akar oleh CMA dalam kultur in vitro relatif lebih cepat dibandingkan dengan kultur in vivo. Di samping itu hifa CMA dapat menginfeksi seluruh permukaan akar. Tampaknya hal ini didukung oleh struktur akar rambut yang didominasi oleh dinding sel yang relatif lunak. Sedang kultur in vivo, percabangan akar relatif sedikit apabila dibandingkan dengan akar in vitro, dan dinding sel relatif lebih keras sehingga CMA hanya menginfeksi pada bagian ujung- ujung akar sekunder dan tersier. Kondisi tumbuh yang berbeda juga mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan jenis hifa CMA (hifa penjelajah dan hifa sekunder). Dalam kultur in vivo perkembangan hifa didominasi oleh hifa penjelajah, yang berfungsi sebagai alat untuk mendapatkan air dan hara nutrisi dari dalam tanah atau media tumbuh, dan hifa sekunder umumnya tidak berkembang dengan baik. Sedang dalam kultur in vitro didominasi oleh hifa sekunder karena air dan seluruh hara nutrisi telah tersedia di dalam medium. Hal tersebut menyebabkan hifa penjelajah
150
ditemukan dalam jumlah relatif sedikit. Hifa sekunder berfungsi sebagai alat transportasi organel dan inti sel yang aktif dibentuk pada saat spora berkecambah. Ukuran hifa sekunder yang relatif besar, memudahkan terjadinya migrasi inti dan organel sel yang merupakan tahap awal dari proses sporulasi. Hal tersebut menyebabkan pembentukan spora baru terjadi lebih cepat dibandingkan dengan kondisi in vivo. Hal menarik lain khususnya dalam medium kultur in vitro dengan CMA A. tuberculata, baik dengan inang berupa kecambah maupun akar ambut wortel ditemukan adanya bakteri yang turut berperan dalam sistem invasi CMA tersebut terhadap akar. Namun, hal ini masih perlu ditelaah lebih jauh lagi. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa A. tuberculata dan G. margarita dapat dikembangkan dengan menggunakan teknologi kultur ganda baik dengan kecambah maupun akar rambut wortel. Pemilihan inang yang kompatibel oleh A. tuberculata dan G. margarita dalam kultur in vivo dan in vitro berbeda. Dalam kultur in vivo CMA A. tuberculata dan G. margarita
dapat tumbuh dan berkembang dengan baik
menggunakan inang P. phaseoloides, sedang dalam kultur in vitro inang terbaik adalah tanaman dan akar rambut wortel. Perbedaan inang dalam dua kondisi kultur yang berbeda ini masih memerlukan penelaahan yang lebih jauh. Enkapsulasi
spora
hasil
pengembangan
dengan
kultur
in
vivo
menunjukkan bahwa teknik ini mampu memperpanjang masa simpan spora sampai umur dua bulan, dengan viabilitas spora tetap terjaga dengan baik. Upaya memperpanjang daya simpan spora dengan sistem enkapsulasi masih perlu dikembangkan dengan memperhatikan faktor fisis lingkungan. Di samping itu pengujian untuk spora hasil pengembangan dengan kultur in vitro perlu dikaji.
151
BAB X SIMPULAN DAN SARAN 1. Telah diperoleh teknik perkembangan akar rambut
wortel dengan A.
rhizogenes yang dikultur pada medium kultur ganda MM 2. Telah diperoleh teknik memperbanyak spora G. margarita dan A. tuberculata sebagai sumber spora untuk kultur in vitro secara konvensional 3. Telah diperoleh teknik sterilisasi optimal spora G. margarita dan A. tuberculata 4. Spora steril mampu berkembang secara in vitro dengan inang tanaman tomat, wortel maupun akar rambut wortel dalam medium MM. 5. Pola perkembangan spora G. margarita dan A. tuberculata dalam kultur pot maupun kultur in vitro tidak berbeda, kecuali lama waktu perkembangan CMA 6. Kultur akar rambut wortel dapat digunakan untuk perbanyakan kultur aksenik spora G. margarita dan A. tuberculata secara masal. 7. Teknologi enkapsulasi Na-alginat dapat digunakan untuk pengemas CMA uji
SARAN
Untuk pemanfaatan teknologi in vitro perbanyakan spora G. margarita dan A. tuberculata kultur aksenik perlu dikaji : 1. Laju penggandaan sporulasi setelah dilakukan beberapa kali sub kultur 2. Eksplorasi akar rambut berbagai jenis tanaman yang dapat digunakan sebagai inang untuk perbanyakan G. margarita dan A. tuberculata secara in vitro 3. Cekaman (stressing) fisik dan biologis yang tepat untuk peningkatan perbanyakan spora in vitro maupun in vivo. 4. Optimasi penggunaan konsentrasi fosfat, dan jenis fosfat (organik dan atau anorganik) dalam medium untuk peningkatan sporulasi dan kolonisasi CMA steril
152
5. Penggunaan bioreaktor untuk memproduksi spora CMA kultur aksenik dengan inang akar rambut, dan penggunaan jenis inokulum spora, propagul, atau keduanya. 6. Pengkajian
teknoekonomi
pemanfaatan
teknologi
in
vitro
untuk
perkembangan kultur aksenik G. margarita dan A. tuberculata serta enkapsulasi spora.
DAFTAR PUSTAKA Aari IM, Oisson PA. 2003. Fungal lipid accumulation development of mycelial structures by two arbuscular mycorrhizal fungi. Appl. Environ. Microb. 69:6762-6767. Abbott LK, Gazey C. 1994. An ecological view of the formation of VA mycorrhizas. Plant and Soil. 159:69-78. Abbott LK, Robson AD, Jasper DA, Gazey C. 1992. What is the role of VA mycorrhizal hyphae in soil?. p:37-41. Mycorrhizas in Ecosystems. C.A.B. International. Abercrombie M, Hickman M, Johnson ML, Thain M. 1993. Kamus Lengkap Biologi. Edisi kedelapan Erlangga. Jakarta. Adholeya A, Verma AK, Bhatia NP. 1997. Influence of media gelling agents on root biomass and in vitro VA-mycorrhizal symbioses of carrot with Gigaspora margarita. Biotropical. 10:63-74. Akiyoshi DE, Klee H, Amasino RM, Nester EW, Gordon MP. 1984. T-DNA of Agrobacterium tumefasciens encodes an enzyme of cytokinin biosyntesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5994-5998. Alexander TR, Toth R, Meier HC, Weber. 1989. Dynamics of arbuscule development and degenaratio n in onion, bean, and tomato with reference to vesicular arbuscular mycorrhizas in grasses. Can. J. Bot. 67:2505-2513. Aneloi ZN. 2004. Pertumbuhan dan produksi alkaloid kinolina pada kultur akar rambut Kina (Cinchona ledgeriana Moens dan C. succirubra Pavon ez Koltzsch). Disertasi. Program Pascasarjana Univ. Padjadjaran:Bandung. Anonimus. 2006a. http://www. Biology online, Dictionary/Axenic culture. (Diakses 12 November 2006). Anonimus. 2006b. Biochemicals, Reagents dan Kits for life science research. SIGMA. Aoki T, Matsumoto H, Asako Y, Matsunaga Y, Shimomura K. 1997. Variation of alkaloid productivity among several clones of hairy roots and regenerated plants of Atropa belladonna transformed with Agrobacterium rhizogenes 15834. Plant Cell Rep. 16:282-286. Bago B, Azcon AC, Piche Y. 1998a. Architecture and developmental dynamics of the external mycelium of the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus intraradices grown under monoxenic conditions. Mycologia. 90:52- 62. Bago B, Pfeffer RE, Douds DD, Brouillette Jr, Becard JG, Shachar-Hill Y. 1998b. Carbon metabolism in spores of the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus intraradices as revealed by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Plant Physiol. 121: 263-271. Bago B, Shachar-Hill Y, Pfeffer PE. 2000. Dissecting carbon pathways in arbuscular mycorrhizas with NRM apectroscopy, in current advances in mycorrhizae research. Edited by G.K.Podila and D.D. Douds. American Phytopathological Society, St.Paul, Minn. pp. 111-126. Bago B, Zipfel W, Williams RM, Piche Y. 1999. Nuclei of symbiotic arbuscular mycorrhizal fungi as revealed by in vivo two-photon microscopy. Protoplasma. 209:77-89.
151
Bago, B, J. Custodia, C. Azcon-Aguilar, J. Samson, AP Coughlan, & Y. Piche. 2004. Differential morphogenesis of the extraradical mycelium of an arbuscular mycorrhizal fungus grown monoxenically on spatial heterogenous culture media. Mycologia, 96:452-462. Bagyaraj DJ. 1992. Ecology of vesicular-arbuscular mycorrhizae. p. 3-34. In D.K. Arora, B. Rai, K.G. Mukerti and G.R. Knudsen (Eds.) Handbook of Applied Mycology, Soil and Plants. Marcel Dekker, New York. Bajaj YPS, Ishimaru K. 1999. Genetic Transformation of Medicinal Plants. In Bajai, Y. P. S (eds.) Biotechnology in Agriculture and Forestry. Diterbitkan kembali pada Transgenic Medicinal Plants. Springer-verlag. Berlin. p.3-7. Bakhtiar Y. 2002. Selection of vasecular arbuscular mycorrhiza (VAM) fungi, host plants and spore numbers for producing inoculum. J. Biosains dan Bioteknologi Indonesia. 2:36-40. Baon JB. 1996. Variation growth respons and nutrient efficiency of coffee cultivars infected by a mycorrhizae fungus. Pelita Perkebunan 12:36-47. Baron, C. and P. C. Zambryski. 1995. Notes from the underground: highlights from plant- microbe interaction. Tibtech 13:356-361. Becard G, Taylor LP, Douds DD, Pfeffer PE, Doner LW. 1995. Flavonoids are not necessary plant signal compounds in arbuscular mycorrhizal symbioses. Mol. Plant-Microbe Interact. 8:252-258, Becard G, Piche Y. 1992. Fungal growth stimulation by CO2 and root exudates in vesicular-arbuscular mycorrhizal symbioses. Appl Environ Microbiol 55:2320-2325. Becard G, Fortin JA. 1988. Early events of vesicular-arbuscular mycorrhiza formation on Ri T-DNA transformed roots. New Phytol. 108:211-218. Becard G, Pfeffer PE. 1993b. Extensive in vitro hyphal growth of vesiculararbuscular mycorrhizal fungi in the presence of CO2 and flavonoids. Appl. Environ. Microbiol. 58:821-825. Becard G, Piché Y. 1989. New aspects on the acquisition of biotrophic status by a vesicular-arbuscula r mycorrhizal fungus, Gigaspora margarita. New Phytol. 112:77-83. Becard G, Piche Y. 1989b. Fungal growth stimulation by CO2 and root exudates in vasecular-arbuscular mycorrhizal symbiosis. Appl Environ Microbiol 55:2320-2325 Becard G, Piché Y. 1992. Establishment of vesicular-arbuscular mycorrhizal in root organ culture: review and proposed methodology. In: Norris JR, Read DJ, Varma AK, eds. Methods in Microbiology: Techniques for Study of Mycorrhiza. Vol. 24. London, UK: Academic Press. p. 89-108. Bevan, Chilton. 2003. Interactions of Plants With Agrobacteria rhizogenes http://www.uky.edu . (Diakses 28 Agustus 2004). Bever JD. 2002. Negative feedback within a mutualism: host-specific growth of mycorrhizal fungi reduces plant benefit. Proceedings of the Royal Society of London Series B. Biol. Sci. 269:2595-2601. Bever JD, Schultz PA, Pringle A, Morton JB. 2001. Arbuscular mycorrhizal fungi: More diverse than meets the eye, and the ecological tale of why. Bioscience 51:923-931.
152
Bianciotto V, Bonfante P. 1993. Evidence of DNA replication in an arbuscular mycorrhizal in the absence of host plants. Protoplasma. 176:100-105. Boisson-Sernier, Chabaud M, Becard G, Rosenberg C, Barker DG. 2001. Agrobacterim rhizogenes transformed root of Medicago trunculata for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Mol Plant-Microb Interact. 14:695-700 Bolan NS, 1991. A critical review on the role of mycorrhizal fungi in the uptake of phosphorus by plants. Plant and Soil. 134:189-207. Bonfante P. 1994. Alteration of host cell surface by mycorrhizal fungi. In O Petrini, GB Ouelette (Ed.) Host Cell Wall Alteration by Parasitic Fungi. St Paul Minnesota, APS Press. p.103-114. Bonfante P, Scannerini S. 1992. The cellular basis of plant- fungus interchanges in mycorrhizal associations. In Alien M. G (ed.) Functioning Mycorrhizae. New York, London: Chapman Hall, p. 65-101. Bonfante P, Perotto S. 1995. Strategies of arbuscular mycorrhizal fungi when infecting host plants. New Phytol. 130:3-21 Bonfante P, Vian B. 1989. Cell wall texture in symbiotic roots of Allium parum, L. Annals Sci. Naturales Botaniques. 10:97-109. Brundrett MC, Bougher N, Dells B, Grove T, Malajckuk N. 1996. Working with mycorrhizas in forestry and agriculture. ACIAR. Canberra, pp 374. Brundrett MC, B Kendrick. 1990. The roots and mycorrhizas of herbeceous woodland plants 11. Structural aspects of morphology, New Phytol. 114:469-479. Brundrett MC, Melville L, Peterson L. 1994. Practical methods in mycorrhiza research. Mycology Publications, p. 95-100. Buce M, Rossignol M, Jauneau A, Ranjeva R, Becard G. 2000. The presymbiotic growth of Arbuscula Micorrhizal fungi is induced by a branching factor partially purified plant root exudates Mol. Plant. 13:693-698 Calvet C, Camprubi A, Rogriguez-Kabana. 1996. Inoculation of Arbuscular mycorrhizal fungi in alginate film for experimental studies and plant inoculation. Hort. Sci. 31:285. Chabot S. 1992. Utilisation d'un systeme de culture monoxenique, comme modele pour l'etude des endomycorhizes a vesicules et arbuscules. Thesis, CRBF, Universite Laval, Quebec. Changelosi GA, Martinetti G, Leigh JA, Lee CC, Theines C, Nester EW. 1989. Role of Agrobacterium tumefaciens chv A protein in export of ß - 1 - 2 glucan. J. Bacteriol. 171:1609 - 1615. Christey MC, Braun RH. 2004. Production of hairy root and trangenic plants by Agrobacterium rhizogenes mediated transformation. In Pena, L (ed) Methods in Molecular Biology, vol. 268, Transgenic Plants. pp.47-60. Citernesi KS, Vitagliano C, Giovannetti M. 1998. Plant growth and root system morphology of Olea europaea, L. rooted cuttings as influenced by arbuscular mycorrhizas. J. Hort. Sci. & Biotechnol. 73:647-654. Clark RB. 1997. Arbuscular mycorrhizal adaptation, spore germination, root colonization, and host plant growth and mineral acquisition at low pH. Plant and Soil. 192:15-22
153
Cruz C, Green JJ, Watson CA, Wilson F, Martin- Loucao MA. 2004. Functional aspects of root architecture and mycorrhizal inoculation with respect to nutrient uptake capacity. Mycorrhiza. 14:177-184. Dalpé Y, Monreal M. 2004. Arbuscular mycorrhiza inoculum to support sustainable cropping systems. Plant Management. p.234-236 Dalpé Y, Declerck S. 2002. Development of Acaulospora rehmii spore and hyphal swellings under root-organ culture. Mycologia 94:850-855. Declerck S, Strullu DG, Plenchette C. 1998. Monoxenic cultur of the intraradical forms of Glomus sp. Isolated from a tropical ecosystem: a proposed methodology for germplant colection. Mycologia, 90:579-585. Declerck S, Strullu DG, Plenchette C. Guillemette T. 1996b. Entrapment of in vitro produced spores of Glomus versiforme in alginate beads : in vitro and in vivo inoculum potentials. J. Biotechnol. 48:51-57. Declerck S, Cranenbrouck S, Dalpé Y, Seguin S, Grandmougin FA, Fontaine J, Sancholle M. 2000. Glomus proliferum sp nov.: a description based on morphological, biochemical, molecular and monoxenic cultivation data. Mycologia 92:1178-1187. Declerck S, D'Or D, Cranenbrouck S, Le Boulenge E. 2001. Modelling the sporulation dynamics of arbuscular mycorrhizal fungi in monoxenic culture. Mycorrhiza. 11: 225-230. Declerck S, Strullu DG, Plenchette C. 1996. In vitro mass-production of the arbuscular mycorrhizal fungus, Glomus versiforme, associated with Ri TDNA transformed carrot roots. Mycologia Res. 100:1237-12426. Declerck S, Strullu DG, Plenchette C. 1998. Monoxenic culture of the intraradical forms of Glomus sp. Isolated from a tropical ecosystem: a proposed methodology for germplasm collection. Mycologia 90:579-585. Delvian Y, 2003. Keanekaragaman cendawan mikoriza arbuscula (CMA) di hutan pantai dan potensi pemanfaatan. Studi kasus di hutan cagar alam Leuweung Sancang Kabupaten Garut, Jawa Barat. Disertasi Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Delvian Y, Setiadi, Mansur I, Soedarmadi. 2001. Correlation between soil salinity with arbuscular mycorrhizal fungi distribution, population and seasonal dynamics in coastal forest. Paper presented at the National Seminar and Workshop on the Utilization of Mycorrhiza, in Agriculture and Land Rehabilitation, University of Bengkulu 11-13 de-Souza FA, Declerck S. 2003. Mycelium development and architecture, and spore production of Scutellospora reticulata in monoxenic culture with Ri T-DNA transformed carrot roots. Mycologia 95:1004-1012. de-Souza FA. 2005. Biology, Ecology and evolusion of the family Gigasporaceae arbuscular mycorrhizal fungi (Glomeromycota), Dissertation. Nederlands Institute of Ecology, p. 121-158 de-Souza FA, Sulva EMR. 1996. Micorrizas arbusculares na revegetação de areas degradadas. p. 255-290. In: Siqueira JO. Avanços e Aplicações Na Pesquisa Com Micorrizas. UFLA, DCS-DCF, Lavras, MG, Brazil. de-Souza FA, Barbara RLL. 1999. Ontogeny of Glomus clarum in Ri T-DNA transformed roots. Mycologia 88: 845-850
154
Diop TA, Plenchentte C, Strullu DG. 1994. Dual axenis culture of sheared root inocula of vesicular arbuscular mycorrhizal fungi associated with tomato roots. Mycorrhiza 5:17-22 Diop TA, Becard G, Piche Y. 1992. Long Term in vitro culture of an Endomycorrhizal fungus, Gigaspora margarita, on Ri-TDNA transformed root of carrot. University Laval. Balapan, Philadelphia, p. 249–259. Diop TA. 2003. In vitro culture of arbuscular mycorrhizal fungi : advances and future prospects. African J. Biotechnology 2:692-697. Douds, DD and Schenk, N.C. 1990. Increased sporulation of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi by manipulation of nutrient regimes. Appl. Environ. Microbiol. 76: 413– 418. Douglas CJ, Stanloni RJ, Rubin RA, Nester EW. 1985. Identification and genetic analysis of an Agrobacterium tumefaciens chromosomal virulence region. J. Bacteriol. 161:850-860. Downs CG, Christey MC, Davies KM, King GA, Seekye JF, Sinclair BK, Stevenson DG. 1994. Hairy roots of Brassica napus:II. Glutamine systhetase overexpression alters ammonia assimilation and the response to phosphinothricin. Plant Cell Reports 14:41– 46. Ermayanti TM, L. Sari, EMR. Siregar, dan D. Sudrajat. 2000. Transformasi Mimba (Azadirachta indica A. Juss) dengan A. rhizogenes Galur ATCC15834. Prosiding Seminar Nasional Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta, 7-9 November 2000. Ernawati A. 1990. Studies on the in vitro production of anthocyanin and antifungal compounds of Polygonum tinchtorium Ait. Thesis of Kagawa University Japan. Ezawa T, Smith SE, Smith FA. 2002. P metabolism and transport in AM fungi. Plant and Soil 244:221-230. Fillion M, St-Armaud M, Fortin. 1999. Direct interaction between the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus intraradices and different rhizosphere microorganisms. New Phytol. 141:525-533. Fortin JA, Becard G, Declerck S, Dalpe Y, St-Arnaud M, Coughlan AP, Piche Y. 2002. Arbuscula mycorrhiza on root organ culture, Can. J. Bot.80:1-20 Frances L, Walley, J. and J, Germida. 1996. Failure to decontaminate Glomus clarum NT4 spores is due to spore wall-associated bacteria. Plant Cells. Annu. Rev. Genet.22:1-30 Friese CF, Alien MF. 1991. The spread of VA mycorrhizal fungal hyphae in the soil: Inoculum types and external hyphal architecture. Mycologia. 83:409-418. Frugis G, Caretto S, Santini L, Mariotti D. 1995. Agrobacterium rhizogenes rol genes induce productivity-related phenotypical modification in creeping-rooted Afalfa. Plant Cell Report 14:448-492. Garcia-Romera I, Garcia-Garrido JM, Ocampo JA. 1991. Pectinase activity In vesicular-arbuscular mycorrhiza during colonization of lettuce. Symbiosis, 12:189-198. Gelvin SB. 2000. Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and integration. Annu. Rev. Plant. Mol. Biol. 51:223-256. Gianinazzi-Pearson V, Branzanti B, Gianinazzi S. 1989. In vitro enhancement of spore germination and early hyphal growth of a vesicular-arbuscular
155
mycorrhizal fungus by host root exudates and plant flavonoids. Symbiosis, 7:243-255. Giovannetti M, Sbrana C, Logi C. 1994. Early processes involved in host recognition by arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytol. 127:703-709. Giovannetti M, Avio L, Sbrana C, Citernesi AS. 1993a. Factors affecting appresorium development in the vesicular-arbuscular myorrhizal fungus Glomus mosseae (Nicol. & Gerd.) Gerd. Trappe. New Phytol. 123:114122. Giovannetti M, Azzolini D, Citernesi AS. 1999. Anastomosis formation and nuclear and protoplasmic exchange in arbuscular mycorrhizal fungi. App. Environ. Microb. 65:5571-5575. Giovannetti M, Mosse B. 1980. An evaluation of techniques for measuring vesicular arbuscular mycorrhizal infection in roots. New Phytol. 84:489500. Giovannetti M, Sbrana C, Avio L, Citernesi AS, Logi C. 1993b. Deferential hyphal morphogenesis in arbuscular mycorrhizal fungi during preinfection stages. New Phytol.125:587-593. Giovannetti M, Sbrana C, Logi C. 2000. Microchambers and video-enhanced light microscopy for monitoring cellular events in living hyphae of arbuscularmycorhhizal fungi. Plant and Soil 226:153-159. Giovannetti M, Sbrana C, Strani P, Agnolucci M, Rinaldo V, Avio L. 2003. Genetic diversity of isolates of Glomus mosseae from different geographic areas detected by vegetative compatibility testing and biochemical and molecular analysis. App. Environ. Microb..169:616-624. Giri A, Narasu MI. 2000. Transgenic hairy root: recent trends and applications. Biotechnology Advances 18:1-22. Gunawan LW. 1998. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. PAU. IPB Bogor. Handoyo D, Ruditerna A. 2000. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR). Unitas. 9:17 – 25 Harrison MJ. 1999. Molecular and cellular aspects of the arbuscular mycorrhizal symbioses. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50: 361-389. Hart MM, Reader RJ. 2002. Taxonomic basis for varia tion in the colonization strategy of arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytol. 153:335-344. Heijden MGA, Klironomos JN, Ursic M, Moutoglis P, Streitwolf ER, Boller T, Wiemken A, Sanders IR. 1998. Mycorrhizal fungal diversity determines plant biodiversity, ecosystem variability and productivity. Nature 396:6972. Heijden MGA. 2002b. Arbuscular mycorrhizal fungi as a determinant of plant diversity: In search for underlyng mechanisms and general principles. p.243-265 In: Heijden MGA and IR. Sanders (Eds.), Mycorrhizal Ecology, Ecological Studies vol. 157. Springer-Verlag, Berlin Heijden, MGA, Sanders IR. 2002a. Preface. In: Heijden MGA and IR Sanders. (Ed.), Mycorrhizal Ecology, Ecological Studies vol. 157. Springer-Verlag, Berlin. Hijri M, Redecker D, Petetot JAMC, Voigt K, Wostemeyer J, Sanders IR. 2002. Identification and isolation of two ascomycete fungi from spores of the arbuscular mycorrhizal fungus Scutellospora castanea. App. Environ. Microb. 68:4567-4573.
156
Hildebrandt U, Janetta K, Bothe H. 2002. Towards growth of arbuscular mycorrhizal fungi independent of a plant host. App. and Environ. Microb. 68:1919-1924. Jakobsen I, Abbott LK, Robson AD. 1992. External hyphae of vesicular arbuscular mycorrhizal fungi associated with Trifolium subterraneum, L. Spread of hyphae and phosphorus inflow into roots. New Phytol. 120:371-380. Jakobsen I. 2000. Mycorrhizal fungi - a biological resource in plant nutrition. Phosphorus balance and utilization in agriculture towards sustainability, New Phytol. 137:113-118. Jakobsen I. 2000. Mycorrhizal fungi - a biological resource in plant nutrition. Phosphorus balance and utilization in agriculture towards sustainability, proceedings of a seminar, 17 19 March 1997 137, 113-118. Jane BS, Tgu D, Delp G. 1998. Regulation of root and fungal morphogenesis. Mycorrhizal Symbioses, 116:1201-1207. Jasper DA. 1994. Management of mycorrhiza in revegetation. In A. D. Robson, L. K. Abbott and N. Malajczuk (ed.), Management of Mycorrhizas in Agriculture, Horticulture and Forestry,. Kluwer Academic Publishers, Netherlands. Jeffries P, Gianinazzi S, Perotto S, Turnau K, Barea JM. 2003. The contribution of arbuscular mycorrhizal fungi in sustainable maintenance of plant health and soil fertility. Biology and Fertility of Soils 37:1-16. Jeffries P. and JM. Barea, 2001. Arbuscular Mycorhhiza- a Key Component of Sustainable Plant-Soil Ecosystems. In: The Mycota a Comprehensive Treatise on fungi as Experimental Systems for Basic and Applied Research, Fungal Associations, K Esser (Ed). p. 95 Johansen A, Jakobsen I, Jensen ES. 1993. External hyphae of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi associated with Trifolium subterraneum L. 3. Hyphal transport of 32P and 15N New Phytol. 124: 61-68. Jolicoeur M, Bouchard-archand E, Becard G, Perruer M. 2002. Regulation of mycorrhizal symbioses: Development of a structured nutritional dual model. Ecol. Modell. 158:121–142. Jolicoeur M, Williams RD, Chavarie C, Fortin JA, Archambault J. 1999. Production of Glomus intraradices propagules, an arbuscular mycorrhizal fungus, in an airlift bioreactor. Biotechnol. Bioeng. 63:224-232. Joner EJ, Johansen A. 2000. Phosphatase activity of external hyphae of two arbuscular mycorrhizal fungi. Mycol. Res. 104:81-86. Joner EJ, Magid J, Gahoonia TS, Jacobsen, L. 1995. Phosphorus depletion and activity of phosphatases in the rhizosphere of mycorrhizal and nonmycorrhizal cucumber (Cucumis sativus L.) Soil Biol. Biochem. 27:11451151. Juge C, Samson J, Bastien C, Vierheilig H, Coughlan A, Piche Y. 2002. Breaking dormancy in spores of the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus intraradices: a critical cold-storage period. Mycorrhiza 12:37-42. Khaliq A, Bagyaraj DJ. 2000. Colonization of arbuscular mycorrhizal fungi on Ri T-DNA Transformed roots in synthetic medium. Indian J. Exp. Biol. 38: 1147-1151.
157
Klironomos JN, Hart MM. 2002. Colonization of roots by arbuscular mycorrhizal fungi using different sources of inoculum. Mycorrhiza 12:181-184. Labour K, Jolicoeur M, Marc, St-.Armaud. 2003. Arbuscular mycorrhizae responsiveness of in vitro tomato root lines is not related to growth and nutrient uptake notice. Plant Physiol. 124:943-953 Lebowitz, R.J. 1995. Plant Biotechnology, A Laboratory Manual. WCB Publisher, Dubuque, USA. p.59-65. Lucia Y. 2005. Cendawan mikoriza arbuskula di bawah tegakan tanaman manggis dan peranannya dalam pertumbuhan bibit manggis (Garcinia mangostana, L.). Tesis, Sekolah Pasca Sarjana IPB, Bogor. Maggie SW, Ronald F, Patricia LC. 2005. A novel method to enhance the stability of alginate-poly-L- lysine-alginat microcapsules. J. Biomaterials Scien. 16:89-111. Mansur I, Wilarso S, Kartika E, Rainiyati. 2003. Status of research on arbuscular mycorrhizal fungi in Indonesia. Graduate School of Bogor Agricultural University, Bogor, Indonesia. (unpublished). Marschner H, Dell B. 1994. Nutrient uptake in mycorrizal symbiosis. Plant and Soil. 159:89–102. Masri M, Azizah H. 1998. Root alternations and nutrient uptake of mangosteen (Garcinia mangostana, L.) seedling in response to arbuscular mycorrhizal inoculation . J Trop Agric and Food Scien. 26:119-1286 Menge JA. 1984. Inoculum Production in VA Mycorrhiza, Powell, C.L., and Bagyaraj, D.J. (Eds), CRC Press, Florida, pp.187-203. Mertz SM, Heithaus J.J.,III, Bush RL. 1979. Mass production of axenic spores of the endomycorrhizal fungus Gigaspora margarita. Trans.Br. Mycol. Soc. 72:167-169 Miller RM, Reinhardt, DR, & JD Jastrow. 1995. External hyphal production of vesicular arbuscular mycorrhizal fungi in pasture and taligrass prairie communities. Oecologia. 103:17-23. Mondal TK, Bliattacharya A, Ahuja PS, Chand PK. 2001. Transgenic tea (Camellia sinensis (L) O. Kuntze cv. Kangra Jat) plant obtained by Agrobacterium- mediated transformation of somatic embryos. Plant Cell Report 20:712-720. Mosse B. 1962. The establishment of vesicular-arbuscular mycorrhiza under aseptic conditions. J. Gen. Microbiol. 27:509-520 Muas I. 2003. Peranan cendawan mikoriza arbuscula terhadap peningkatan serapan hara oleh bibit papaya. J. Hort. 12:165-171. Murashige T, Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiol Plant. 15: 473-497. Nagahashi G, Douds D, Abbey G. 1995. Separation and partial identification of secreted cell wall associated and cytoplasmic. Associated phenotipic compound of cultured carrot roots In Phytochemicals and Health. Nagahashi G. & D Douds Jr. 1997. Appresorium formation by AM fungi on isolated cell walls of carrot roots. New Phytol. 136:299-304. Nasir M. 2002. Bioteknologi Molekuler, Teknik Rekayasa Genetik Tanaman. PT. Citra Aditya Bakti, Bandung.
158
Nillson O, Olsson O. 1997. Getting to the root : The role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots. Physiol Plant 100:463-473 Nuutile AM, Vestberg, Kauppinen MV. 2001. Infection of hairy root of strawberry (Fragaria x Ananasa Duch) arbuscular mycorrhizal fungus. Pland Cell Rep. 14:505–509 diterbikan kembali pada New Phytol. 88:327-339. O'Keefe DM, & DM Sylvia. 1992. Chronology and mechanisms of Puptake by mycorrhizal sweet potato plants. New Phytol. 122:651-659. Orcutt DM, Nillsen ET. 2000. The Physiology of Plants Under Stress: Soil and Biotic Factors. John Wiley & Sons Inc. New York. Orozco-Castillo K, Chaliners J, Waugh R, Powell W. 1994. Detection of genetic diversity and selective gene Integration in coffee using RAPD Marker. Theor. Appl. Genet. 87:934-938 Pacioni G. 1992. Wet sieving and decanting techniques foe the extraction of spores of VA mycorrhizal fungi. pp 317-322. Papi RM, Chaitidou SA, Trikka FA, Kyriakidis DA. 2005. Encapsulated Escheria coli in alginate beads capable of secreting a heterologous pectin lyase. Microb Cell Fac. 4:35-37. Paula MA, Siqueira JO. 1991. Simulation of hyphal growth of the VA mycorrhizal fungus of Gigaspora margarita by suspension culturedPueraria phaseoloides cell products. New Phytol. 115:69-75 Paulitz TC, Linderman RG. 1989. Interactions between fluorescent pseudomonads and VA mycorrhizal fungi. New Phytol. 113:37–45. Pinior M, Palazon J, Cusido RM, Ribo M. 1999. Influence of calcium ion-concentration in the medium on propane alkaloid accumulation in Datura stramonium hairy roots. Plant Sci. 141:41-49. Plenchette C, Declerck S, Diop TA, Strullu DG. 1996. Infectivity of monoxenic subcultures of the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus versiforme associated with Ri T-DNA transformed carrot root. Appl. Microbiol. Biotechnol. 46:545-548. Powell BS, Morel P, Huang Y, Kado C. 1989. An Agrobacterium positif regulatory DNA-binding protein is phosphorylated in vitro. In Moleculer Biology Plant Pathogen p.14. Pozo MJ, Cordier C, Dumas-Gaudot E, Gianinazzi S, Barea JM, Azcon JA.2002. Localized versus systemic effect of arbuscular mycorrhizal fungi on defense responses to Phytophthora infection in tomato plants. J. Exp. Bot. 53:525-534. Quarles W. 1999. Plant disease biocontrol and VAM fungi. IPM Pract. 21:1-9. Rao MS, Kerry BR, Gowen SR, Bourne JM, Parvatha RP. 1997. Management of Meloidogyne incognita in tomato nurseries by integration of Glomus deserticola with Verticillium chlamydosporium. Planzenschutz. 104:419422. Ravnskov S, Larsen, Jakobsen L. 2002. Phosphorus uptake of an arbuscular mycorrhizal fungus is not affected by the biocontrol bacterium Burkholderia cepacia. Soil Biol. Biochem. 34:1875-1881. Reflini 2002. Kajian Pertumbuhan Akar Rambut Cinchona sp dari Inokulasi Beberapa Galur A. rhizogenes. Tesis Program Pascasarjana IPB. Bogor.
159
Rhodes MJ, Parr AJ, Giulietti AEL, Aird H. 1994. Influence of exogenous hormones on the growth and secondary metabolite formation in transformed roots culture. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 38:1493-1513. Ridgway HJ, Kandula J, Stewart A. 2004. Optimising production of carrot hairy roots. 57th Conf. Proc. The New Zeland Plant Protection Soc. Inc. p.77-80. Saizer P, Boller T. 2000. Elicitor-Induced Reactions in Mycorrhizae and Their Suppression. Dalam Current Advances in Mycorrhizae, Research. Gopi K P & DD Douds, Jr. (Ed. ) The American Phytopathological Society, USA Salisbury FB, Ross CW. 1995. Fisiologi Tumbuhan. Edisi keempat. ITB Bandung Sambrook JE, Fritsch ET, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning, a Laboratory Manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Lab Press New York p. 568 –600. Sancayaningsih RP. 2005. The effects of single and dual inoculations of arbusscula mycorrhizal fungi on plant growth and the EST and MDH isozyme profiles of maize roots (Zea mays. L) grown on limited growth media. Disertasi UGM, Yogyakarta. Sarin C. 1996. Dictionary of Biology. Karnal Road Delhi, India. Sauerwein M, Ishimaru K, Shimamora K. 1999. A piperidine alkaloid from Hyoscyamus albus roots transformed with Agrobacterium rhizogenes. Phytochemistry. 30:2977-2978. Schultz C, Subronto, Latif S, Moawad AM, Viek PLG. 1999. Peranan mikoriza vesikuler-arbuskuler (MVA) dalam meningkatkan penyesuaian diri planlet kelapa sawit terhadap kondisi lingkungan tumbuh alami. J. Penelitian Kelapa Sawit. 7:145-156. Sheng J, Citovsky V. 1996. Agrobacterium-plant cell DNA transport: have virulence proteins, will travel. Plant Cell. 17:199-210. Sikuli NN, Demeyer K. 1997. Influence of the ion-composition of the medium on alkaloid production by "hairy roots" of Datura stramonium. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 47:261-267. Siqueira JO, Colozzi-Filho A, de-Oliveira E. 1989. Occurrence of vesiculararbuscular mycorrhizae in agro- and natural ecosystem of Minas Gerais State. Pesquisa Agropecuaria Brasileira. 24:1499-1506. Siqueira JO, Saggin-Junior OJ, Flores-Aylas WW, Guimaraes PTG. 1998. Arbuscular mycorrhizal inoculation and superphosphate application influence. Mycologia. 74:952-959 Sismunandar, Julianto T, 2000. Induksi kalus dan regenerasi tumbuhan melinjo Gnetum gnemon dari eksplan daun. Laporan Penelitian Universitas Muhamadiyah Purwokerto Purwokerto. Smith SE, Read DJ. (Eds) 1997. Mycorrhizal symbiosis. 2nd edn. Academic, San Diego. pp 59-61 Smith FA, Smith SE 1997. Tansley Review No 96. Structural diversity in (vesicular)-arbuscular mycorrhizal symbioses. New Phytol. 137:373-388. Smith SE, Smith FA, Jacobsen I. 2003. Mycorrhizal fungi can dominate phosphate supply to pints irrespective of growth responses. Plant Physiol. 133:16-20. Strullu DG, Romand C. 1986. Méthod d’obtention d’endomycorrhizaes à ésicules et arbuscules en conditions axéniques. Comptes Rendus de l’Acade´mie des Sciences Paris 303:245-250.
160
Suraya. 2002. Kajian kompatibilitas isolate cendawan mikoriza arbuskula ( CMA) terhadap pertumbuhan dua klon jati (Tectona grandis, L.) hasil perbanyakan kultur jaringan. Tesis Program Pasca Sarjana IPB. p. 23 -54 Suriyapperuma, SP & RE Koske. 1995. Attraction of germ tubes and germination of spores of the arbuscular mycorrhizal fungus Gigaspora gigantea in the presence of roots of maize exposed to different concentrations of phosphorus. Mycologia. 87:772-778. Tahir A. 2003. In vitro culture of arbuscular mycorrhizal fungi: advances and futue prospects. African Journal of Biotechnology. 2:692-697 Tamasloukht M, Sejalon-Delmas N, Kluever A, Roux AJC, Becard G. P. Franken. 2003. Root factors induce mitochondrial-related gene express fungal respiration during the developmental switch for asymbioses to presymbiosis in the arbuscular mycorrhiza Gigaspora rosea. Plant Physiol. 131:1468-1478. Tanaka N. 1997. Strategies for the production of secondary metabolites by pRi-transformed regenerants. Plant Tissue Culture and Biotechnology. 3:128137. Tarafdar, JC & H Marschner. 1994. Phosphatase activity in the rhizosphere and hiposphere of VA mycorrhizal wheat supplied with inorganic and organic phosphorus. Soil Biol. Biochem. 26:387-395. Tepfer D. 1989. Ri t- DNA from Agrobacterium rhizogenes: a source of genes having applications in rhizosphere biology and plant development, ecology and evolution. p.294-342: Plant-Microbe Interactions, Vol. 3. T. Kosuge, and E. W. Nester, eds. New York : McGraw-Hill Publishing. Tisserant BS, Gianinazzi V, Ganinazzi-Pearson. 1996. Relationships between lateral root order, arbuscular mycorrhiza development and the physiological state of the symbiotic fungus in Platamus acerifolia. Can J. Bot. 74:1974-1955. Tiwari P, Adholeya A. 2001. In vitro co-culture of two AMF isolates Gigaspora margarita and Glomus intraradices in Ri T-DNA transformed roots. FEMA Microbiology Letters 1033:1-5. Toivonen L, Laakso S, Rosenqvist H. 1992. The effect of temperature on hairy root culture of Catharanthus roseus: Growth, indole alkaloid accumulation and membrane lipid composition. Plant Cell Rep. 11:395-399. Toruan-Mathius N, Reflini, Nurhaimi- Haris, Joko-Santoso, Priangani- Roswiem A. 2004. Kultur akar rambut Cinchona ledgeriana dan C. succirubra dalam kultur in vitro. Menara Perkebunan. 72:72-87. Toussain JP. 2002. Nitrogen transfer and assimilation in a mycorrhizae in vitro root culture system. Thesis, Department of Biology. Universitaty of Ottawa Trisilawati O, Supriatun T, Indrawati I. 2001.Pengaruh mikoriza arbuskula dan pupuk fosfat terhadap pertumbuhan jambu mente pada tanah podsolik merah kuning. J.Biol. lndon.3:91-98. Tsai SM, DA Phillips. 1991. Flavonoids released naturally from alfalfa promote development of symbiotic Glomus sp. in vitro Appl. Environ. Microbiol. 57:1485-1488. Twaraya K, Watanabe S, Yoshida E, Wagatsuma T. 1996. Effect onion (Allium cepa) root exudates on the hyphae growth of Gigaspora margarita. Mycorrhizae. 6:57-59.
161
Twyman R.M. 1998. Advanced Molecular Biology. Singapore: Bios Scientific Publisher, Springer-Verlag,. Vaast PH, Zasoski RJ. 1991. Effect of nitrogen sources and mycorrhizal inoculation wih different species on growth and nutrient composition of young arabica seedlings. Café Cacao. 35:121-128 . Varma AK, Hock. 1998. Mycorrhiza: structure, function, molecular biology and biotechnology, 2nd Ed. Springer-verlag.Berlin, Heidelberg, New York, p. 704 Vestberg M, Uosukainen. 1996. Arbuscular mycorrhizal inoculation of micropropagated strowberry and field observations in finland. Agronomia 12:865-867 Vidyasekaran P. 1990. Mycorrhiza induced risistance, a mechanism for management of crop disease In S.L. Jalali dan H. Chand (Eds) Current Trens in Mycorrhizal Research. TERI and Hartana Agricultural University. pp:91-93. Vigo C, Norman JR, Hooker J E. 2000. Biocontrol of the pathogen Phytophthora parasitica by arbuscular mycorrhizal fungi is a consequence of effects on infection loci. Plant Path. 49:509-514. Wang MS, Ronald F, Patricia LC. 2005. A novel method to enhance the stability of alginate-poly- l- lysine-alginate microcapsules. J.Biomaterials Sci. 16: 89-111. Wang NS. 2006. Enzyme immobilization protocol entrapment in alginate gel. Department of Chemical Engineering. Maryland, pp 34-35 Wattimena GA. 1992. Bioteknologi Tanaman. Depdikbud Dirjen Dikti PAU Bioteknologi IPB. Bogor. Widiastuti H. 2004. Biologi interaksi cendawan mikoriza arbuskula kelapa sawit pada tanah asam sebagai dasar pengembangan teknologi aplikasi dini Disertasi, Sekolah Pascasarjana, IPB. Bogor. Widiastuti H, Tahardi JS. 1993. Effect of vesicular-arbuscular mycorrhizal inoculation on growth and nutrient uptake of micropropagated oil palm. Menara Perkebunan, 61:56-60. Will ME, Sylvia DM. 1990. Interaction of rhizosphere bacteria fertilizer and vesicular arbuscular mycorrhizal fungi with sea oats. Appl Environ Microbiol. 56:2073-2079 Wilson JM, Tommerup. 1992. Interactions between fungal symbionts: VA mycorrhyzae. In Mycorrhizal Functioning: an integrative plant-fungal process. Allen MF. Ed. Chapman & Hall, New York, London. p.199–248. Winans S. 1992. Two way chemical signaling Agrobacterium-plant interaction. Microbiol. Rev. 56:12–31. Winarsih S, Baon J. 1999. Pengaruh masa inkubasi dan jumlah spora terhadap infeksi mikoriza dan pertumbuhan planlet kopi. Pelita Perkebunan. 15:1321. Wongsamuth R, Doran PM. 1997. Production of monoclonal antibodies by tobacco roots. Biotechnol Bioeng. 54:401-415 Yatim W. 1999. Kamus Biologi. Yayasan Obor Indonesia. Yinli Bi, Xiaolin Li, Wang H, Christina P 2004. Establishment of monoaxenic culture mycorrhizal fungus Glomus sinuosum and Ri T-DNA- transformed carrot roots. Plant and Soil 161:239-244
162
Zambryski, P. 1988. Basic processes underlying Agrobacterium-mediated DNA transfer to virulence proteins. Plant Cell 8:1699-1710.
166
Lampiran 1A. Komposisi medium MS, B5, White, MM dan MSR Senyawa yang dibutuhkan
Medium MS (mg/l)
Medium B5 (mg/l)
Medium White
MM (BF, 1988) (mg/l)
MSR (mg/l)
MAKRONUTRIEN MgSO4 .7H2 O KNO3 KH2 PO4 Ca(NO3 )2 .4H2 O KCl NH4 NO3 CaCl2 .2H2 O FeSO4 .7H2O (NH4 )6 Mo7 .(O2 )4 .4H2O
370 1.900 340 288 65 1.650 440 278 -
250 2.500 300 135 150 278 -
720 80 200 300 65 -
731 80 4,8 288 -
365 303 44 2040 0,035
MIKRO NUTRIEN KI MnSO4 .4H2 O ZnSO4 .7H2 O H3 BO3 CuSO4 .5H2 O Na2 MoO4 .2H2 O NaEDT0A CoCl2 .6H2 O MnCl2 .4H2 O NaFeEDTA
0,83 22,3 8,6 6,2 0,025 0,25 0,025 -
0,75 10,0 2,0 3,0 0,025 0,25 0,025 150 -
0,75 7 3 1,5 16,5 -
0,75 1,5 0,13 0,002 6 8
2,23 1,86 0,24 65
2 0,1 0,5 0,5 -
1 1 51 -
3 0,1 0,1 0,5 1 1
3 0,1 0,1 0,5
1 1 1
-
0,5
50 30.000 5,6 Swallow globe
50 15.000 5,6 Swallow globe
50 15.000 5,6 Swallow globe
50 10.000 2000 5,5 65 Gelrite (2gr/l)
15.000 2000 5,5 Gelrite (2gr/l)
VITAMIN Glisin Tiamin HCl Piridoksin HCl Asam Nikotinat kalsium pantotenat Cianokobalamin
Unsur Lain Myoinositol Sukrosa Agar pH KCl Agar
167
Lampiran 1.B. Hasil perhitungan nutrisi dalam bebera pa jenis media Jenis nutrisi N P K Vitamin Glisin Tiamin HCl Peridoksin Asam Nikotinat kalsium Pantotenat Cianokobalamin Sukrosa Myoinositol Agar
Makro nutrisi masing- masing jenis media/mg/l MS B5 White MM MSR 330,29 318,2 45,08 44,68 40,98 77,5 38,6 45,6 1,1 10,03 771,1 933,2 160,1 34,26 40,98 2 0,1 0,5 0,5 -
1 1 -
3 0,1 0,1 1 1
3 0,1 0,1 0,5 -
1 1 1 -
30.000 50 Swallow globe 7.000
15.000 50 Swallow globe 7.000
1 15.000 50 Swallow globe 7.000
10.000 50 Gel rite 2000
0,5 15.000 Gel rite 2000
Lampiran 2. Media YMB padat (Agar miring untuk pengkultur A. rhizogenes) Bahan Manitol NaCl MgSO4 .7H2 O KH2 PO4 Yeast ekstrak agar Disterilkan dengan autoklaf
Mg/l 10.000 100 200 500 400 7.000 -
Keperluan 250 cc 2500 250 50 125 100 1750 121 0 C
Semua bahan dilarutkan denga n akuades sebanyak 250 ml, dengan pH 4,8 ditambahkan agar dan dimasak sampai mendidih. Setelah mendidih, di masukkan ke dalam tabung sebanyak
10 ml dan ditutup dengan kapas yang dibungkus
dengan kain kasa, selanjutnya disterilkan. Setelah steril tabung dimiringkan sampai padat, kultur media siap digunakan.
168
Lampiran 3. Komposisi pereaksi dan bufer untuk analisis DNA tanaman. akar rambut dan plasmid A. Rhizogenes Larutan
Komposisi
Bufer ekstrak Orozco-Castillo dkk. CTAB 10 %
10 mL
(1994)
NaCl 5 M
12 mL
Tris-HCl 1 M pH 8
5 mL
EDTA 0.5 M pH 8 Akuades steril
Bufer TE
2 mL 20.4 mL
Tris-HCl 1 M pH 8
1 mL
EDTA 0.5 M pH 8
0.2 mL
Larutkan dengan akuades hingga 100 mL
Tris Base Bufer TAE 50x
24.2 g
Asam Asetat glasial
5.7 mL
EDTA 0.5 M pH 8
10 mL
Larutkan dengan akuades hingga 100 mL
Bromophenol Blue Loading Bufer
Sukrosa
0.25 % 40 %
Tris-HCl 1 M pH 7.5 50mM 500µL Bufer TELT
EDTA 82 mM
0.305 g
LiCl 10 M 2.5 mM
2.5 mL
Triton X-100 0.4 %
40 µL
Sumber: Laboratorium Rekayasa Genetik dan Biomolekuler Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor. 2002.
169
Lampiran 4. Isolasi DNA dengan modifikasi metode (CTAB) (Orozco-Castilo et al. 1994)
170
Lampiran 5. Stacking gel 4.0% gel, 0.125 M tris pH 6.8 Bahan Kimia
Volume
H2 O
3.05 ml
61 ml
Tris HCL 1.5 M pH 6.8
1.25 ml
2.5 ml
SDS 10 %
50 µl
100 µl
Akrilamida/bis(30%)
0.65 µl
1.3
Campuran divakum 15 menit APS 10%
25 µl
50 µl
TEMED
5µl
10µl
Total
5 ml
10 ml
171
Lampiran 6. Skematis teknis perbanyakan CMA dengan kultur pot di rumah kaca
172
Lampiran 7 . Metode sieving spora (Pacioni 1992 dan Brundrett, 1994)
Sebanyak 50 gram
Larutan gula 50%
1000µm 450µm
450µm + 45µm
45µm
inokulum CMA
hasil saringan Disentrifuge 20.000 rpm 5menit
air mengalir 3 menit
45 µm
45 µm Spora siap disterilisasi & enkapsulasi
173
Lampiran 8. Teknik sterilisasi spora CMA (modifikasi Buce et al. 2000)
spora
air steril
MgSO4 .7H2 O + Tween 20 steril
air steril Divorteks 2mnt diulang2X disentrifus dibuang
cucian pertama dan kedua divortek 1mnt, cairan dibuang 10.000 rpm 2mnt
cairan
(Ependorf steril 2ml) cairan dibuang
masing- masing
+Chloramin T(2%)(2X) divorteks
dicuci akuades
cairan dibuang steril 2 X, divortek, dan sentrifuge 12.000 rpm 1mnt
antibiotic cairan dibuang dicuci aquades cairan dibuang -gentamisin,treptomisin steril 2 x, diforteks pinisillin,tetrasiklin, maing- masing 1x disentrifus 10.000 rpm 2mnt diforteks 1mnt rendam campuran spora steril siap diinokulasikan antibiotik yang digunakan dg kadar 50 ppm, disimpan pada suhu 40 C, 24 jam
174
Lampiran 9. Metode sterilisasi spora CMA Jenis sterilan
Bahan sterilisasi permukaan spora spora I Buce et al. (2000) MgSO4 .7H2 O steril Tween 20 Steril Bayclin Sterptomisin Pnisilin Gentamisin Tetrasiklin II. Chabot (1992) Tween 20 Khloramin T Gentamisisn Streptomisin III.Declereck et al. (1998) Alkohol kalsium hipoklorit Gentamisisn Streptomisin
Konsentrasi
0,1%
Waktu proses (menit) 2
50 ppm
10
20% 200 ppm 200 ppm 200 ppm 2,5 ppm 20% 2% 200 ppm 200 ppm 96% 50 %
5 240 240 240 120 4 45 45 45 3 4
200 ppm 200 ppm
60 60
175
Lampiran 10. Modifikasi metode sterilisasi spora Sterilisasi
I
II
III
Bahan
Konsen tarasi
Wkt/ mnt
MgSO4 steril Tween 20 Sterptomisin
0,1% 50 ppm 200 ppm
2 10 240
Penisilin
200 ppm
240
Gentamisin
200 ppm
240
Tetrasiklin NaOCl (Bayclin) Tween 20 Chlora min T Gentamis in Streptomisin
2,5 ppm 20%
Alkohol Calsium Hipokhlorit Streptomisin sulfat Gentamisin sulfat
Modifikasi I Konsen Wkt/ Tarasi mnt
Modifikasi II Konsen Wkt Tarasi/ /mnt % idem idem 20% 10 150 100 ppm 150 100 ppm 150 100 ppm idem 130 15 3
Modifikasi III Kons Wkt/ en mnt tarasi idem idem 10% 15 100p 100-120 pm 100 100-120 ppm 100 100-120 ppm idem 100-120 10 5
4 5 200
120 5
idem 30% 150 ppm 150 ppm 150 ppm idem idem
20 % 2% 200 ppm 200 ppm
4 45 45 45
idem idem 150 pm 150 pm
3 30 60 60
15% idem idem idem
2 20 90 90
10% idem 100 100
4 10 120 120
96% 50 %
2 4
idem 15%
1 10
70% 10%
2 10
idem idem
3 5
200 ppm
100
150
100
100
100
Idem
120
200 ppm
100
150
100
100
100
idem
120
200 200 110 3
176
Lampiran 11 . Pembuatan preparat histologi akar inang kultur pot (Koske & Gemma 1989)
Bahan : - 50% etanol - 0,5% KOH - 0,1 N HCl - 2,5% H2 O2 - Gliserin 50% - Tripan biru (Trypan blue) 0,02% Alat : - Botol - Pinset - Saringan kasa - Pengangas air - Mokroskop binokuler Cara Kerja : 1. Diambil ujung akar dari percabangan sekunder dan atau tersier, masukkan ke dalam tabung reaksi 2. Dicuci dengan air mengalir (ledeng) sampai bersih, selanjutnya air dibuang 3. Dibersihkan dengan 2,5% KOH sampai akar terendam 4. Panaskan 700 C, selama 60 menit dalam pengangas air 5. Apabila akar belum nampak putih bersih, KOH dibuang, diganti denga H2 O2 di masukkan dalam pengangas air suhu 700 C 30 menit sampai akar nampak putih bersih, waktu dan suhu dapat disesuaikan dengan kondisi preparat. 6. Buang larutan, cuci dengan akuades seteril 3 kali, akuades di buang 7. Masukkan larutan HCl 0,1 N, panaskan dalam pengangas air suhu 700 C selama 30 menit, cairan dibuang 8. masukkan pewarna trypan blue 0,02 dalam campuran air 30% dan gliserol 70%, panaskan dalam pengangas air suhu 700 C selama 60 menit. 9. Inkubasi pada suhu ruangan selama 24 jam 10. Cuci pewarna dengan akuades sampai bersih 11. Selanjutnya direndam di dalam larutan 50% gliserol. 12. Potong akar secara acak sepanjang 1 cm sebanyak 10 potong setiap obyek glas 13. Akar siap diamati di bawah mikroskop, untuk melihat perubahan struktur CMA di dalam akar, dan menghitung tingkat infeksi akar
Untuk menghitung persentase akar yang terinfeksi (dengan rumus : Koske & Gemma 1989) % akar yang terinfeksi =
? bidang pandang positif X 100%
Ttl ? bidang pandang Positif dan Negatif
177
Lampiran 12. Proses enkapsulasi Gigaspora margarita dan Acaulospora tuberculata dengan Na-alginat
Produksi CMA in vivo dan atau in vitro
Na-alginat , 1,5%; 1,75%; 2%. Sebanyak 2 ml, di dalam cawan Petri diameter 3 cm, distirer
Dipipet dengan mikropipet vol 1 ml
Dikeluarkan sedikit demi sedikit, ditampung dan dibekukan di dalam larutan CaCl2 5 %
Dicuci dengan akuades sebanyak 5 kali, sambil digoyang-goyang
Disimpan dalam botol berisi akuades air steril
Diaplikasikan
178
Lampiran 13. Waktu inisiasi dan jumlah tunas yang dibentuk dari tunas aksiler tomat yang dikulturkan dalam medium MS. Kadar kinetin/ppm
Jumlah Eksplan
Wkt inisiasi hari ke.......
Jumlah tunas yang terbentuk
% tunas terbentuk
0,1
30
5 6 7 8 9 5 6 7 5 6 7 -
5 14 5 6 30 9 15 6 30 8 17 5 30
100
Jumlah eksplan yang terbentuk: 0,5 30
Jumlah eksplan yang terbentuk: 1,0 30
Jumlah eksplan yang terbentuk
100
100
Lampiran 14. Hasil perhitungan persediaan inokulum steril dihasilkan Penelitian III (BAB VI) Jenis CMA
Jumlah Jenis inokulum Medium (butir) G. margarita Wortel: MM MSR 15x5 = 75 Jumlah Tomat: MM 15x5 = 75 MSR Jumlah A. tuberculata Wortel: MM 20x5 = 100 MSR Tomat: MM 20x5=100 MSR Jumlah
% Jumlah sporta perkecambahan berkecambah (butir) 75 56 24 18 74 50 38 8 6 44 76 76 19 19 95 67 67 10 10 77
Jumlah total spora berkecambah 118 butir spora G. margarteta berkecambah 175 butir spora A. tuberculata berkecambah
179
Lampiran 15 A : PENELITIAN I
Pengaruh jenis media dan jenis tanaman terhadap berat kering akar rambut (Penelitian I) Perlakuan
BBK Akar Rambut 20,72 ** 21,45 ** 18,65 ** 0,1266
A (Tempat) B (Jenis CMA) AB(Tempat + Jenis CMA) CV
Keterangan : * signifikan,, ** Sangat signifikan,, TS Tidak signifikan
Lampiran 15 B : PENELITIAN II
Pengaruh tiga faktor terhadap peubah umur 3 bulan setelah tanam (Penelitian 2) Perlakuan
Biomassa
A (Tempat)
4,871**
Shoot Root Rasio (S/R) 2564492**
B (Jenis CMA)
2,83 **
2003363**
489,13**
2,55 TS
AB(Tempat + Jenis CMA)
725579**
1686392**
11,50*
1,41 TS
C ( Jenis inang)
2,46 **
53124,9 **
19,57**
0,00 TS
AC (Tempat + Jenis inang)
1,556**
2569534**
0,54 TS
0,20 TS
BC(Jenis CMA+ Jenis inang )
3875229**
2137985**
10,52*
0,00 TS
ABC(Tempat + CMA + inang) CV
1,426 **
1391941**
0,54 TS
13,29*
0,0201
0,1537
5,1806
5,3077
Keterangan : * signifikan, ** Sangat signifikan, TS Tidak signifikan
Jumlah spora 52,20**
Infeksi akar 0,74TS
180
Pengaruh tiga faktor terhadap peubah umur 4 bulan setelah tanam (Penelitian 2) Perlakuan
Biomassa
A (Tempat)
7,815**
Shoot Root Rasio (S/R) 4534057**
Jumlah spora 5,41*
Infeksi akar 5,95*
B (Jenis CMA)
4,175**
2909901**
5,35*
1,60TS
AB(Tempat + Jenis CMA)
1,719 **
6402170**
1,25TS
7,00*
C ( Jenis inang)
2978015** 4,924E7**
2,19TS
1,40TS
AC (Tempat + Jenis inang)
3,133 **
4763683**
1,25TS
1,24TS
BC (Jenis CMA+ Jenis inang ) ABC(Tempat + CMA + inang) CV
182882**
1,11E7 **
1,86TS
1,40TS
2,817**
6342345 **
7,32TS
1,18TS
0,014243
0,027734
25,21167 27,81928
Keterangan : * signifikan, ** Sangat signifikan, TS Tidak signifikan
Pengaruh tiga faktor terhadap peubah umur 5 bulan setelah tanam (Penelitian 2) Perlakuan
Biomassa
A (Tempat)
7,815**
Shoot Root Rasio (S/R) 4534057**
Jumlah spora 5,41*
Infeksi akar 5,95*
B (Jenis CMA)
2978015**
2909901**
5,35*
1,60TS
AB(Tempat + Jenis CMA)
1,719**
4,924**
1,25TS
7,00*
C ( Jenis inang)
2,817**
4763683**
2,19*
1,40 TS
AC (Tempat + Jenis inang)
3,133**
1,11**
0,1484TS 1,18 TS
BC (Jenis CMA+ Jenis inang )
182882**
6402170**
1,86TS
1,40 TS
ABC(Tempat + CMA + inang)
4,175**
6342345**
7,32TS
1,24TS
CV
0,011804
0,032727
2,360159
1,773843
Keterangan : * signifikan, ** Sangat signifikan, TS Tidak signifikan
Lampiran 15 C : PENELITIAN III Pengaruh tiga Faktor terhadap peubah umur 3 bulan setelah tanam (Penelitian III)
181
Perlakuan A (Media ) B (Jenis CMA) AB(Media + Jenis CMA) C ( Jenis inang) AC (Media+ Jenis inang) BC (Jenis CMA+ Jenis inang ) ABC(Media + CMA + inang) CV
% Perkecambahan 285,65** 0,44TS 1,10TS 20,79** 0,40TS 3,05TS
Hifa eksternal 128,44** 21,78** 0,44TS 4,00TS 0,44TS 4,00TS
Jumlah spora 154,24** 80,25** 25,91** 2,65TS 2,03TS 2,65TS
Infeksi akar 23,24** 18,25* 23,84** ,63TS 2,33TS 0,13TS
0,45TS
4,00TS
2,03TS
507,12**
23,81308
23,13862 38,83056
Keterangan : * signifikan,, ** Sangat signifikan,, TS Tidak signifikan
Lampiran 15 D : PENELITIAN IV Pengaruh jenis media terhadap berat kering dan basah akar rambut Perlakuan A (Media MM ) B (Media MSR) AB(Media MM+MSR) CV
BB BBK Akar ambut AkarRambut 0,03TS 2,94TS TS 0,10 0,86TS 0,05 TS 0,77TS 3,138371 7,951382
Keterangan : * signifikan,, ** Sangat signifikan,, TS Tidak signifikan
Pengaruh jenis inokulasi terhadap berat kering dan basah akar rambut Perlakuan A (Media ) B (Jenis CMA) AB(Media + Jenis CMA) CV
BB Akar Rambut 0,05TS 0,12 TS 0,07 TS 3,239381
BBK Akar Rambut 3,96TS 0,93TS 0,97TS 6,651382
Keterangan : * signifikan,, ** Sangat signifikan,, TS Tidak signifikan
11,69684
182
Pengaruh dua faktor terhadap peubah umur 3 bulan setelah tanam (Penelitian IV) Perlakuan
A (Media ) B (Jenis CMA) AB(Media + Jenis CMA) CV
% Perkecamba han 264,27** 600,93** 68,26** 11,23746
Hifa eksternal
Jumlah spora
Infeksi akar
50,00** 289,50** 12,50* 16,13743
163,88** 152,97** 99,88** 25,87046
841,40** 1322,96** 267,60** 7,758628
Lampiran 15 E : PENELITIAN V Pengaruh enkapsulasi spora terhadap jumlah spora dan infeksi akar Perlakuan A (Alginat ) B (Jenis CMA) AB(Alginat + Jenis CMA) CV
Jumlah spora 59,69** 8,53TS 1,42TS 9,495292
Infeksi Akar 198,43** 82,54** 15,87** 4,777800
