Pemanfaatan dan Pengembangan Bakteri Metanotrof sebagai Pereduksi Emisi Metan dan Pemfiksasi N2 (Biofertilizer) di Lahan Sawah
Dr. Ir. Iman Rusmana, MSi. Alina Akhdiya, MSi.
DEPARTEMEN BIOLOGI, BIOLOGI FAKULTAS MIPA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
LAHAN SAWAH
PENDAHULUAN
Æ Sumber utama produksi beras
Æsumber emisi metan (CH4) Æprodukdi Metan + 575 Tg year-1 (Hanson & Hanson, 1996). ÆIndonesia URUTAN KE TIGA kontribusi emisi metan dari sawah setelah cina dan india, diperkirakan 7.08 % dari total emisi metan dari sawah(Sass et al,, 2000). )
Methane Æk Ækonsentrasi i di atmosfer f meningkat i k 1 % per tahun h
(M (Mossier i et. al, l 1994) 1994).
ÆKontribusinya + 15-20 % dari total efek gas rumah kaca (Mossier et. al, 1994).
Reduksi Emisi CH4
Bakteri Metanotrof
Pengguna CH4 ; Aerobik; lapisan permukaan sedimen sawah p (Conrad & Rothfus 1991)
Oksidasi CH4 – Metan Monooksigenase (MMO)
•Oksidasi CH4 menjadi CO2 oleh bakteri metanotrof di lahan sawah dapat mencapai 80 % dari CH4 yang diproduksi oleh bakteri metanogen (Conrad & Rothfus 1991). •Oksidasi CH4 dilakukan oleh berbagai macam bakteri metanotrof seperti: Methylobacter luteus, Methylosinus trichosporium, Methylococcus capsulatus (Hanson & ) Hanson 1996).
Tipe I Methylomonas & Methylobacter
Bakteri Metanotrof
Tipe II Methylosinus & Methylosystis
Tipe X Methylococcus capsulatus
Fiksasi nitrogen (N2)
Tujuan penelitian (3 tahun) : 1. Mengukur aktivitas oksidasi metan dan fiksasi N2 dari isolate bakteri metanotrof asal sawah dan menyeleksi bakteri metanotrof potensial yang memiliki aktivitas oksidasi metan dan fiksasi nitrogen yang tinggi. 2. Menguji karakteristik fisiologi isolate bakteri metanotrof 3. Mengidentifikasi secara molekuler berdasarkan sekuen gen 16S rRNA isolate bakteri metanotrof asal sawah. 4. Karakterisasi molekuler gen penyandi enzim partikulate metan monooksigenase/ pMMO (pmoA) dan soluble metan monooksigenase/sMMO ( mmoX) dari bakteri metanotrof potensial. 5. Karakterisasi molekuler gen penyandi enzim pemfiksasi N2 yaitu gen enzim dinitrogenase reduktase (nifH) dan sub unit alfa dari dinitrogenase (nifD) dari bakteri metanotrof potensial 6 Menguji efektivitas oksidasi metan dan fiksasi N2 dan memformulasi 6. berbagai kombinasi inokulum bakteri metanotrof pada lumpur sawah. 7. Menguji efektivitas beberapa formulasi kombinasi bakteri metanotrof pada pertanaman padi di rumah kaca. kaca
M E T O D E
37 Isolat bakteri metanotrof asal sawah di Bogor dan Sukabumi (DIPA BIOTROP 2008) Pengukuran aktivitas oksidasi metan total
Pengukuran aktivitas fiksasi N2
Analisa Kromatografi Gas
Analisa pembentukan ammonium dikultur
5 IIsolat l t bakteri b kt i metanotrof t t f terbaik Uji karakteristik Fisiologi
Identifikasi Molekuler (gen 16S rRNA)
Analisa p pakai API test Strip p Kit
Isolasi DNA genom Amplifikasi A lifik i PCR gen 16S rRNA RNA Sekuensing, Alignment (BLAST N)
Tahun 1
5 Isolat terbaik terkarakterisasi dan teridentifikasi
Uji efektivitas di lumpur sawah Percobaan slury i l t ttunggall isolat Percobaan slury Formulasi kombinasi isolat
Tahun 2
Karakterisasi gen enzim metan monooksigenase
Karakterisasi gen enzim nitrogenase
Isolasi DNA g genom, Amplifikasi PCR gen mmoX dan pmoA Sekuensing, Alignment (Blast N)
Isolasi DNA genom, Amplifikasi PCR gen nifH dan nifD Sekuensing, Alignment (Blast N)
5 formulasi kombinasi isolat terbaik yang gen enzim nitrogenase dan metan monooksigenase terkarakterisasi
M E T O D E
Tahun 2
5 formulasi kombinasi isolat terbaik yang gen enzim nitrogenase dan metan monooksigenase terkarakterisasi
Uji efektivitas di Rumah Kaca Percobaan di pot pertanaman padi Analisa/monitor Emisi Metan & Pertumbuhan padi
Tahun 3
Pemilihan Komposisi Media Produksi Terbaik
Pemilihan Jenis Media Produk Kemasan
Analisa /Monitor pertumbuhan sel dan aktivitas sel selama pertumbuhan
Percobaan jenis produk kemasan padat & cair Monitor setelah masa simpan : - Jumlah & aktivitas sel hidup
2 jenis formulasi prototipe produk yang siap uji lapangan p g
Metode__________ Uji kemampuan fiksasi N2 isolat terpilih pada konsentrasi O2 berbeda MENGKONDISIKAN MEDIUM PERTUMBUHAN ANAEROB 5 MENIT
Headspace
NMS Udara saturasi 10% & 30%
6,6 ml gas
6,6 ml 19,8 ml gas gas
19,8 ml gas
Gas nitrogen g murni U.saturasi 10%
U.saturasi 30%
Metode__________
33 ml N2
33 ml gas
U.saturasi 50%
13,2 ml N2
13,2 ml gas
U.saturasi 80%
U.saturasi 100%
Metode__________ Pengukuran jumlah amonium yang diakumulasikan dalam kultur 1 tetes HgCl2
Sentifugasi 10 menit 4000 rpm
1 ml supernatan + 4 ml MillQ water 0,2 ml fenol-alkohol 10%
0,2 ml Na-nitroprusid 0,5% 0 5 mll campuran asam sitrat 0,5 it t : hipoklorit (1:4)
640 nm
Jumlah amonium yang diakumulasi (µM)
Diamkan 1 jam sampai berubah warna menjadi biru
METODE Menumbuhkan bakteri metanotrof
rubber septum
type II methanotrophs headspace: -20 20 % air air, -5 % CO2, -25 % N2 -50 % methane Mineral Salts media
headspace: -50 50 % Methane -50 % air Nitrate Mineral Salts media room temperature 5-6 days streak plate technique
headspace: -20 % air, -5 % CO2, -25 % N2 -50 % methane anaerobic jar
Nitrate Minral Salts agar room temperature 5-6 days
ISOLASI DNA •
Genomic DNA of selected isolates will be extracted using alkaline lyses methods (Lazo et al. 1987). )
Amplification of 16S rRNA gene •
Amplification of 16S rRNA gene will used specific primers (Marchesi et al. 1998). Primer 63F 1387R
• • • • • •
Sequence (5’ to 3’) 5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC 5’-GGGCGGWGTGTACAAGGC
PCR condition: (Marchesi et al. 1998). initial denaturation initial denaturation : 94oC for 2 min, : 94 C for 2 min Denaturation : 92oC for 30 sec, Annealing : 55oC for 30 sec, 30 cycles PCR Products Extention : 75oC for 1 min. A final extention : 75oC for 5 min
Sequensing Alignment (Blast N)
Uji Fisiologi
BGM 1 BGM 2
BGM 3
SKM 14
BGM 9
Hasil Tabel 1 Densitas sel (620 nm) dan akumulasi amonium (640 nm) bakteri isolat BGM dan SKM No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Isolat BGM 1 BGM 2 BGM 3 BGM 4 BGM 5 BGM 6 BGM 9 BGM 12 SKM 1 SKM 2 SKM 4 SKM 5 SKM 7 SKM 9 SKM 10 SKM 14 SKM 15 SKM 16 SKM 18
Konsentrasi sel (OD λ= 620 nm) 0,016 0 034 0,034 0,023 0,015 0,039 0,036 0,038 0,04 0 024 0,024 0,023 0,023 0,049 0,02 0,047 0,031 0 016 0,016 0,042 0,017 0,028
Akumulasi Amonium (mM) 46 21 39 13 93 0 47 34 10 25 30 14 25 0 0 15 1 0 0
Pertumbuhan dan Fiksasi N2 Metanotrof Terpilih pada Konsentrasi O2 yang Berbeda 0.16 0.14
OD sel
0.12 0.1 0.08 0.06 0 04 0.04 0.02 0 10%
30%
50%
80%
100%
‐0.02
Saturasi udara
Gambar 1 OD sel isolat
BGM 1,
BGM 3,
BGM 5,
BGM 9
100 90 80 70
[Amoniu um]
60 50 40 30 20 10 0 10%
30%
50%
80%
100%
‐10
Saturasi udara
G b 2K Gambar Konsentrasi t i amonium i isolat i l t
BGM 1, 1
BGM 3, 3
BGM 55,
BGM 9
Aktivitas Oksidasi metan pada saturasi udara yang berbeda
Aktivitas Oksidasi metan pada saturasi udara yang berbeda
Aktivitas Oksidasi metan pada saturasi udara yang berbeda
Aktivitas Oksidasi metan pada konsentrasi metan berbeda
Aktivitas Oksidasi metan pada konsentrasi metan berbeda
Tabel 1 Karakteristik morfologi g sel dan pewarnaan Gram isolat‐isolat bakteri metanotrof Isolat
Bentuk dan
Pewarnaan
BGM 1 BGM 1
penataan sel batang rantai batang, rantai
Gram ‐
BGM 2
bulat, rantai
‐
BGM 3 BGM 9 SKM 14
batang, rantai bulat, rantai batang, rantai
‐ ‐ ‐
Tabel 2 Ciri-ciri fisiologi isolat bakteri metanotrof Isolat B kt i Bakteri Metanotrof
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
BGM 1
+/-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
BGM 2
+/-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
-
-
BGM 3
+/-
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
BGM 9
-/+
-
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
SKM 14
+/-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
+
-
Ket : 1.Nitrat ((NO2/N2) 2. Triptofan p 3. Glukosa 4. Arginin g 5. Urea 6. Esculin ferric sitrat 7. Gelatin 8. 4-nitrophenil-βD-galaktopiranosida 9. Glukosa 10. Arabinosa 11. Manosa 12. Manitol 13. N-asetil-glukosamin 14. Maltosa 15. Potasium g glukonat 16. Asam capric 17. Asam adipic 18. Asam malat 19. Trisodium sitrat 20. Asam penilasetik
1
2
3
4
5
M
10.0 kb
1 5 kb 1.5 1.0 kb
Gambar 1 Hasil elektroforesis dari amplifikasi gen 16S rRNA menunjukan pita DNA berukuran ~1.3 kb. M: marker 1 kb DNA ladder, ladder sumur 1: BGM 1, 1 sumur 2: BGM 2, 2 sumur 3: BGM 3, sumur 4: BGM 9, sumur 5: SKM 14
•Hasil BLAST-N sekuen gen 16S rRNA parsial dengan data G B k iisolat GenBank l t BGM 1
•Hasil BLAST-N sekuen gen 16S rRNA parsial dengan data GenBank isolat BGM 2
•Hasil BLAST-N sekuen g gen 16S rRNA parsial dengan data GenBank isolat BGM 3
•Hasil BLAST-N sekuen k gen 16S rRNA RNA parsial dengan data GenBank isolat BGM 9
•Hasil BLAST-N sekuen gen 16S rRNA parsial dengan data GenBank isolat SKM 14
Tabel 3 Hasil analisis sekuen gen 16S rRNA dengan menggunakan program BLAST-N Isolat
Spesies Bakteri Metanotrof homolog
% identitas No.akses
BGM 1
Methylocystis rosea strain SV97T
74%
AJ414656.1
BGM 2
Methylococcus capsulatus strain texas
83%
AJ563935.1
BGM 3
Methylocystis rosea strain SV97T
70%
AJ414656.1
BGM 9
Methylococcus capsulatus strain texas
85%
AJ563935.1
SKM 14
Methylobacter sp. Clone GASP-OKA65% 565-E11
EU043582 1 EU043582.1
M th l Methylocystis ti rosea strain t i SV97T
57 89
Methylosinus trichosporium strain KS24b Methylobacterium extorquens strain MMA
87
BGM 1 42
98
BGM 3
Methylomonas methylovora 62
100 62
Methylophilus methylotrophus Methylovorus glucosetrophus
Methylococcus capsulatus strain texas Methylobacter sp. clone GASP-OKA-565-E11
73 97
Methylomicrobium buryatense strain 5B
BGM 2 97
BGM 9 SKM 14
0.05
KESIMPULAN TAHUN PERTAMA Fiksasi N2: Æ 4 isolat terbaik yaitu BGM 1, BGM 3, BGM 5, dan BGM 9. Aktivitas Oksidasi metan : Æ 3 isolat terbaik : BGM 2, BGM 9 dan SKM 14 Æ BGM 2 udara saturasi 10% ÆBGM 9 udara saturasi 50%. 50% ÆSKM 14 udara saturasi 20% Identifikasi berdasar sekuen g gen16S 6S rRNA: ÆBGM 1 ~ Methylocystis rosea strain SV97T (74%) ÆBGM 3 ~ Methylocystis parvus strain 57 (69%), ÆBGM 2 dan BGM 9 ~ Methylococcus capsulatus strain texas (83% dan 85%), ÆSKM 14 ~ Methylobacter sp. clone GASP-OKA-565-E11 (65%).
RENCANA PENELITIAN TAHUN SELANJUTNYA Hasil penelitian Tahun I (2009) 5 Isolat terbaik terkarakterisasi aktivitas fiksasi N2 dan Oksidasi O metan yang teridentifikasi f secara molekuler
Ujij efektivitas di lumpur sawah Percobaan slury isolat tunggal Percobaan P b slury l Formulasi kombinasi isolat
Tahun 2 (2010)
Isolasi DNA genom, Amplifikasi PCR gen mmoX dan pmoA Sekuensing, Alignment (Blast N)
Karakterisasi gen enzim nitrogenase Isolasi DNA genom, Amplifikasi PCR gen nifH dan nifD Sekuensing, Alignment (Blast N)
5 formulasi kombinasi isolat terbaik yang gen enzim nitrogenase dan metan monooksigenase terkarakterisasi
Uji efektivitas di Rumah Kaca Percobaan di pot pertanaman padi Analisa/monitor Emisi Metan & Pertumbuhan padi
Tahun 3 (2011)
Karakterisasi gen enzim metan monooksigenase
Pemilihan Komposisi Media Produksi Terbaik Analisa /Monitor pertumbuhan sel dan aktivitas sel selama pertumbuhan
Pemilihan Jenis Media Produk Kemasan Percobaan jenis produk kemasan padat & cair Monitor setelah masa simpan : - Jumlah & aktivitas sel hidup p
2 jenis formulasi prototipe produk yang siap uji lapangan
Isolasi DNA •
Genomic DNA of selected isolates will be extracted using alkaline lyses methods ( (Sambrook et al, 1989). , )
Amplifikasi gen pmoA and mmoX •
Amplification of pmoA and mmoX genes will used specific primers (Bourne et al, 2001). Primer
• • • • • •
Sequence (5’ to 3’)
Target
A189F
GGNGACTGGGACTTCTGG
pmoA
mb661
CCGGMGCAACGTCYTTACC
pmoA
mmoXA
ACCAAGGARCARTTCAAG
mmoX
mmoXB
TGGCACTCRTARCGCTC
mmoX
PCR condition: (Bourne et al, 2001). initial denaturation : 96oC for 5 min, Denaturation : 94oC for 1 min, Annealing : 56oC for 1 min, 30 cycles PCR Products Extention : 72oC for 1 min. A final extention : 72oC for 5 min
Sequensing and alignment
Amplifikasi, Sekuensing dan Aligment gen nifH dan nifD Amplifikasi p gen nifH dan nifD menggunakan g gg primer p spesifik. Primer den nifH (Dedysh et al, 2004). : ÆF1 (TAYGGNAARGGNGGNATYGG NAARTC) ÆnifH-R (ADNGCCATCATYCTNCC) Primer P i gen nifD(Dedysh ifD(D d h ett al, l 2004). 2004) : ÆnifHD-F (CAGGAAATCT ACATCGTCATGTC) ÆnifD-R ((TCCCANGARTGCATCTGRC GGA)) Proses PCR: Ætahapan denaturasi awal (94oC 30 detik), Æ 35 siklus 92oC 1 menit, 55oC 1 menit, dan 72oC 1 menit. ÆFinal extention: 72oC selama 5 menit (Dedysh et al, 2004).
