Přehled rychlých metod stanovení mikroorganismů: biochemické, imunochemické, fyzikální metody. Sabina Purkrtová

Přehled rychlých metod stanovení mikroorganismů: biochemické, imunochemické, fyzikální metody

Sabina Purkrtová

Konvenční metody Stanovení počtu

Ředění - kultivace – konfirmace – stanovení počtu

Ředění - izolace konfirmace – stanovení počtu

MPN

Průkaz Pomnožení – izolace – konfirmace

Konfirmace (identifikace, příp. sérotypizace) Membránová filtrace

Barvení a světelná mikroskopie Roztěr, přeliv KONVENČNÍ METODY = KULTIVAČNÍ METODY A KONFIRMACE + JEDNODUCHÁ BARVENÍ A ZÁKLADNÍ SVĚTELNÁ MIKROSKOPIE Biochemické reakce

Konvenční metody Výhody

Omezení

Dobře charakterizované

Pomalé : doba nutná k získání výsledku obvykle 2-10 dní

Obecně akceptované

Náročné na materiál a práci

Omezení dobře známa

Zdlouhavé

Relativně málo validačních výzev

Nekonzistentní – výsledky se liší v závislosti na mikrobiální populaci, médiích a podmínkách

Pro nás spolehlivé paradigma

Spóry a stresované pomalu rostoucí mikroorganismy vyžadují prodloužení času pro růs

Uznávány a požadovány národními a mezinárodními regulačními orgány pro oficiáln kontroly

Náchylné k chybě operátora

Konvenční metody

Průkaz

Zrychlit a zjednodušit – nové postupy ?

POMNOŽENÍ Pomnožovací krok je takřka vždy zachován (hledání jehly v kupce sena – jedné buňky v 25 g/10 g – vysoké nároky na sensitivitu metody Nová selektivní pomnožovací média

Počet IZOLACE

IZOLACE

Vývoj selektivních a specifických půd (chromogenní a fluorogenní půdy) Rychlé metody pro možnost detekce již z pomnožovací suspenze Nové přístupy pro detekci (např. konduktance)

KONFIRMACE A IDENTIFIKACE

Nové metody stanovení počtu

Rychlé metody identifikace

Vylepšit a zjednodušit stávající metody ? Technické pomůcky, Automatizace, Minituarizace

KONFIRMACE A IDENTIFIKACE

Konvenční vs. alternativní metody VERIFIKACE – ověření fungování dané standardní konvenční metody za podmínek dané laboratoře VALIDACE – ověření alternativní metody vůči dané standardní konvenční metodě – náročný proces, alternativní metoda musí poskytovat stejné nebo lepší výsledky než standardní konvenční metoda ISO 16140:2003 – Mikrobiologie potravin a krmiv – Protokol pro validaci alternativních metod 2 části : srovnávací studie obou metod (aplikace na různé typy vzorků s různými kmeny sledovaného patogenu při různých koncentracích apod.) mezilaboratorní srovnání (provedení dané metody na stejných vzorcích paralelně ve více laboratořích) Velice nákladný a zdlouhavý proces – validaci alternativních metod obvykle provádějí specializované organizace na náklady výrobce alternativní metody Referenční metoda – obvykle mezinárodní normy (ISO)

http://www.aoac.org/ http://www.afnor.org/en http://www.nmkl.org/NordVal/NordVal.htm

Konvenční vs. alternativní metody Kvalitativní metody - kritéria 1. Selektivita (inkluzivita: schopnost detekovat cílový mikroorganismu z

velkého množství kmenů/ exkluzivita: zanedbatelná interference relevantního rozsahu necílových mikroorganismů) 2. Relativní přesnost (stupeň shody mezi výsledky získanými oběma metodami na stejných vzorcích) 3. Mez detekce 4. Relativní sensitivita (schopnost alt. metody detekovat shodně s referenční metodou) /Relativní specifita (schopnost alt. metody nedetekovat, pokud není detekováno referenční metodou) shodně s referenční metodou 5. Shoda mezi metodami

Konvenční vs. alternativní metody Kvantitativní metody – příklady kritérií linearita

Relativní přesnost Limit detekce a limit kvantifikace Specifita a sensitivita selektivita Robustnost (odolnost vůči vyhnutelným i nevyhnutelným okolnostem – jiný pracovník, jiná šarže apod.) Přesnost a správnost Opakovatelnost (stejný vzorek – stejné podmínky – stejná laboratoř) a reprodukovatelnost (stejný vzorek – stejné podmínky – různá laboratoř)

Konvenční metody - automatizace Technické pomůcky pro jednotlivé kroky konvenčních metod – automatizace - zrychlení, - vyšší míra standardizace výsledků, - snížení nároků na pracnost Prvotní ředění vzorku – gravimetrické ředící jednotky Automatické přidání ředícího média

Video: http://www.iul-inst.com/en/sample-preparation/gravimentric-diluter

Homogenizace vzorku – „pádlový“ typ, pulsifikační typ Odlišná konstrukce

http://www.iul-inst.com/images/masticator_cap.jpg

https://weberscientific.com/product-resources/images/3068-57_opt.jpg

Konvenční metody - automatizace Desítkové ředění vzorku

Video: http://www.iul-inst.com/en/innoculation/bio-dilutor

Inokulace vzorku Očkování pomocí spirály – až tři ředění po sobě jsou ve spirále naneseny na plotnu, vyhodnocení pomocí software – obrazová analýza Video: http://www.iul-inst.com/en/innoculation/spiral-plater http://www.youtube.com/watch?v=bOVLc4PXTgo

- Využití též pro testování kvality půd

Konvenční metody - automatizace Počítání kolonií PC automatické počítačky kolonií – načtení obrazu plotny do PC označení kolonií, které se počítají a) uživatelem b) Pomocí software VIDEO: http://www.biomic.com/colony-counting1.html

http://www.hpcimedia.com/images/website/ManChemNews/DIR_6/F_10443.jpg

Měření zón (ATB rezistence)

Manuální počítačky kolonií – plotna umístěna na prosvětlený průzor, kolonie značeny fixem na víčko – snímání dotyku

Video: http://www.iul-inst.com/en/colony-counting-zone-reading/zone-reader

Konvenční metody - automatizace Barvení

Barvící stanice – 4 nádobky na jednotlivá činidla, možnost se závěrečným ožehem či bez

Video: http://www.iulinst.com/images/poly_stainer_cap.jpg

Biosenzory Biosenzor = analytický nástroj, který převádí biologickou odpověď do elektrického signálu Biosenzor = bioreceptor nebo biorekognitivní element (rozeznává cílový analyt) - celá buňka/mikroorganismus nebo její specifická část (buněčné systémy, enzymy, neenzymatické proteiny) schopná se specificky vázat na mikroorganismy určitých druhů - tkáň, mikroorganismus, buňka, enzym, protilátka, nukleová kyselina apod. + převaděč (transducer), převádí událost rozpoznání do měřitelného elektrického signálu – optický, elektrochemický, thermometrický, piezoelektický, magnetický a mikromechanický nebo jejich kombinace

Fluorescence - princip

http://www.onlinetensiometer.com/produkte/cleanospector/bilder/fluorescence_jabolinski_diagram.j pg

Princip fluorescence Látka absorbuje energii záření o určité vlnové délce, přejde do excitovaného stavu a při návratu do základního stavu emituje záření o nižší vlnové délce Pro látku schopnou fluorescence je vlnová délka excitačního a emisního záření specifická Epifluorescence Záření dopadá na vzorek (epi=na), neprochází jím

http://www.perceptive.co.uk/img/applications/applications_deft1.jpg

Fluorescence - aplikace Odlišení živých/mrtvých buňky - kity

LIVE BacLight™ Bacterial Gram Stain Kit Cíl Výsledek

Fluorescenční látky

Standardní filtry

Ex/Em (nm)

LIVE/DEAD® BacLight™ Bacterial Viability Kit

LIVE/DEAD® Reduced Biohazard Cell Viability Kit #1

Bakterie Živé G-+ se barví zeleně a živé Gse barví červeně

LIVE/DEAD® Yeast Viability Kit Kvasinky

Odlišné zbarvení je založeno na propustnosti membrán. Živé buňky se barví hlavně zeleně a mrvé buňky převážně červeně (proniknou obě barviva)

Aktivní buněčné vakuoly se barví oranžově, živé i mrvé buněčné stěny modře

SYTO® 9

SYTO® 9

SYTO® 10

FUN® 1

Hexidium iodid

Promidium iodid

Ethidium homodimer-2

Calcofluor White M2R

FITC

FITC

FITC

FITC

Texas Red®

Texas Red®

Texas Red®

DAPI

480/500

480/500

484/505

488/560–610

480/625

536/617

535/624

365/440

http://lib.jiangnan.edu.cn/asm/254-Introduce.htm

Fluorescence – rychlé metody DEFT - direct epifluorescent filter technique – přímá epiflurescenční technika spojená s filtrací

Bakteriální buňky jsou filtrací zachyceny na membránu Po krátké inkubaci je membrána obarvena akridinovou červení – vizualizace a spočtení zatím okem neviditelných kolonií. Re-inkubace membrány – možná izolace a identifikace vykultivovaných mikroorganismů. http://www.perceptive.co.uk/img/applications/applications_deft1.jpg

http://www.pharmtech.com/pharmtech/data/articlestandard//pharmtech/182012/771886/i1.gif

Fluorescence – rychlé metody

Escherichia coli s probou

http://www.biovisible.com/photopage.shtml

FISH – fluorescenční hybridizace in situ Identifikace bakterií – vazby specifické fluorescenčně značené DNA próby na gen pro 16S rRNA

Enterococcus faecium s probou

Fluorescence + MPN – aplikace Miniaturizace a automatizace stanovení TEMPO© (výr. bioMérieux) Automatizovaný systém na kvantifikaci mikroorganismů metodou MPN Následně kultivace a detekce

Nanesení vzorku – Automatic ky se rozplní do všech jamek

2.25 µl

22.5 µl 225 µl Patentovaná karta s jamkami různých velikostí Jednotlivé jamky obsahují příslušné dehydratované médium

Fluorescence + MPN – aplikace Metody detekce – dvou fázová 1) Speciálně navržená média umožňují cílovým mikroorganismům růst 2) Detekce růstu prováděna fluorescenčně a) fluorescentní pH indikátor Celkový počet koliformů: definice koliformů dle ISO: Enterobacteriaceae zkvašující laktózu – dochází ke změně pH fluorescentní pH indikátor : 4-Methylumbelliferone (4MU)

4MU fluorescene při pH 7

Pozitivní jamka: bez fluorescence Negativní jamka: fluorescence

4MU bez fluorescence při pH 

Fluorescence + MPN – aplikace b) Fluorescenční substrát pro specifický enzym – detekce specifické enzymatické aktivity E. coli medium : přítomnost β-D-glukuronidázy Specifický substrát: 4-methylumbelliferyl-b-D-glukuronid (MUG) (viz využití v agarových půdách)

+

β-D-glukuronidáza

MUG

(95 % E. coli)

glukuronát nefluorescenční mol.

Pozitivní jamka : fluorescence Negativní jamka: bez fluorescence

4-methylumbelliferon fluorescenční mol.

Fluorescence + MPN – aplikace UV světlo TEMPO – PŘÍPRAVNÁ STANICE

Kód (počet pozitivních jamek):

16 / 15 / 4

MPN tabulky + Úroveň ředění

KTJ/g TEMPO-ODEČÍTACÍ STANICE

Imunochemické metody - princip Princip: využití specifické vazby mezi protilátkou (antibody; polyklonální, monoklonální, rekombinantní) a příslušným antigenem – vznik komplexu protilátkaantigen Protilátka je obvykle imobilizovaná na substrátu Detekce komplexu protilátka-antigen - přímá detekce: k reakci s antigenem použita značená protilátka, která slouží i k detekci - nepřímá detekce: k reakci s antigenem použita neznačená primární protilátka , k detekci použita další značená sekundární protilátka Způsoby značení: enzymy, biotin, fluorofory, radioaktivní izotopy apod.

Imunomagnetická separace

PCR amplifikace Imunodetekce Přímý výsev

Protilátka je vázaná na magnetickou částici = imunomagnetická částice

Vazba antigenu na povrchu buněčné stěny na imunomagnetickou částici = „vychytání“ příslušných buněk bakterií či virů

Oddělení imunokomplexu za použití magnetu – imunomagnetická separace

http://oh.water.usgs.gov/micro2/images/ims_figure.jpg

Imunomagnetická separace Např. využití k izolaci E. coli O157:H7 dle ČSN EN ISO 16654 Kmen Enterohemoragické/ Shigatoxigenní (EHEC/STEC) E. coli

Toxiny Shiga toxin, verotoxin

Sérotyp O157:H7, O103:H2, O111:H8, O121:H19

Onemocnění Kolonizace v tlustém střevě, shigatoxiny – afinita ke stěně cév

 pomnožení - mTSB (modifikovaný bujón s enzymaticky natráveným kaseinem, sójou a novobiocinem ) – 25 ml vzorku a 225 ml mTSB, 41,5 °C, 18-24 hodin

 separace bakterií po 8 a 16 hodinách pomocí imunomagnetických částic, na jejichž povrchu je protilátka vůči antigenu E. coli O157:H7 (Dynabeads E. coli O157:H7 )  kultivace imunomagnetických částic na selektivních půdách (SMAC-agar se sorbitolem dle MacConkeyho, FLU-fluorocult E. coli O157:H7 agar) - k odlišení E. coli O157:H7 od ostatních kmenů E. coli je využito nepřítomnosti β-glukuronidázy – nedochází ke zkvašování sorbitolu (SMAC agar) nebo štěpení fluorogenního substrátu MUG (FLU agar)  konfirmace : k odlišení E. coli O157:H7 od ostatních sorbitol-negativních gramnegativních střevních tyčinek, např. rod Shigella, je provedena detekce tvorby indolu (typická pro E.coli)

Imunochemické rychlé metody C-kontrolní zóna – dochází k navázání a vizualizaci volných primárních protilátek – potvrzení funkčnosti testu T - testovací zóna – obsahuje sekundární imobilizované protilátky specifické k Listeria monocytogenes – komplex s primární značenou protilátkou putující z reakční zóny je zachycen a imobilizován a vizualizován díky zlatému značení – červený pruh Reakční zóna– obsahuje koloidní, zlatem značené protilátky specifické k Listeria monocytogenes – pokud je L. monocytogenes přítomna, dojde ke vzniku komplexu http://thefutureofthings.com/upload/image/articles/ 2006/biopen/biopen-elisa-schematic.jpg

aplikace vzorku na podložku v okénku vzorek: pomnožená suspenze zahřátá 20 minut při 80 °C a zchlazená na pokojovou teplotu – lýze buněk – části buněčné stěny s antigeny mají lepší pohyblivost podložka: chromatografický papír http://www.meridianbioscience.eu/media/home_3columns_images/751630.jpg

Imunochemické rychlé metody Využití metody ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) – nepřímá metoda detekce (sendvičové uspořádání) Princip metody ELISA

Sendvičové uspořádání – vazba sekundární protilátky konjugované s enzymem na zachycený antigen

http://thefutureofthings.com/upload/image/articles/ 2006/biopen/biopen-elisa-schematic.jpg

Imunochemické rychlé metody VIDAS systém : ELISA + fluorescenční vizualizace - ELFA Průběh stanovení: pomnožení vzorku v doporučených pomnožovacích médiích nanesení vzorku do vzorkovací jamky stripu vložení do přístroje – reagencie pro jednotlivé kroky imunochemické reakce jsou v ostatních jamkách stripu a imunoreakce probíhá automaticky včetně vyhodnocení

Zachycení cílového patogenu přes antigen na primární protilátku (přes antigen)

Navázání sekundární protilátky značené alkalickou fosfatázou

Detekce Přidání fluorescenčního substrátu (4-methyl umbeliferyl fosfát) – v přítomnosti alkalické fosfatázy dochází k jeho štěpení – intenzita fluorescence odpovídá množství zachycené antigenu

Video: http://www.biomerieux-industry.com/food/vidas-listeriamonocytogenes-detection#VIDAS LMO2

Imunochemické rychlé metody Detekce a konfirmace bakterií rodu Salmonella v potravinách, krmivu a prostředí validováno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR, N°BIO 12/1609/05

Detekce a konfirmace Listeria monocytogenes validováno dle ISO 16140 - provedeno AFNOR (vzorky potravin a z prostředí) a validováno AOAC (vzorky potravin) dle Method no. 2004.02) bioMérieux http://www.biomerieux.com/

Průtoková cytometrie http://www.eawag.ch/medien/bulletin/20130124/prinzip_flowzyto2_e.gif?hires

Průtoková cytometrie (průtokové měření buněk) – od 80. let používána v medicíně pro počítání relativně velkých krevních buněk Modifikace pro účely mikrobiologie: buňky barveny fluorescenčními barvivy. Buňky dále po jedné procházejí úzkou skleněnou kapilárou, kde jsou prosvěcovány laserem - dochází k fluorescenci a rozptylu. Každé prošlé buňce náleží hodnoty sledovaných fluorescencí a rozptylu světla (závisí na velikosti a složitosti povrchu). LZE URČIT POČET PROŠLÝCH BUNĚK (až 1000 buněk/sekunda) A TÉŽ JEJICH VLASTNOSTI V ZÁVISLOSTI NA POUŽITÝCH BARVIVECH.

Průtoková cytometrie Jednotlivé v čase získané signály jsou složeny a zobrazeny v grafu na základě fluorescence při dvou sledovaných vlnových délkách (zelená – 520 nm, červená – 630 nm) – slouží k odlišení buněk (znám poměr obou fluorescencí) od jiných částic. Dole: Zelená fluorescence vynesená proti vedlejšímu rozptylu (SSC) určuje poměr buněk s nízkým a vysokým obsahem nukleových kyselin

http://www.bdbiosciences.com/eu/wcmimages/Eawag_bacteria.jpg

Průtoková cytometrie

Počítání živých a mrtvých buněk – např. BacLight®. Živé buňky fluoreskují zeleně (FL1), mrvé červeně (FL3), po excitaci 488 nm argonovým laserem. stained marine bacteria.

ATP bioluminiscence

http://www.biotek.pt/assets/tech_resources/143/clarity_atp_conc_fig2.gif http://www.promega.co.uk/~/media/images/resources/figures/enotes/fe0027_fig1.jpg?la=en

Princip: detekce úrovně přítomnosti ATP (úměrná přítomnosti mikroorganismů či produktových residuí) V přítomnosti ATP a kyslíku katalyzuje enzym luciferáza přeměnu d-luciferinu na oxyluciferin za vyzáření světla o vlnové délce 560 nm

ATP bioluminiscence

http://www.micromatic.com/draft-keg-beer/linecleaning-hygiene-pid-ATP-100-tab-reviews.html

http://www.bioxys.com/images2/figure-B11.gif

ATP Hygiene Monitoring System - SystemSURE II

Konduktance

Změna konduktance (vodivosti) živného bujónu (μS) v průběhu času (h)

Malthus – v průběhu kultivace v selektivním médiu pro daný mikroorganismus dochází ke změně konduktance

Chorianopoulos N G et al. Appl. Environ. Microbiol. 2010;76:2018-2022

Buněčné biosensory Biosenzor =celá buňka/mikroorganismus (CBS – cell-based sensors)

Patogenní mikroorganismy interagují během infekce se svačími buňkami - využití příslušných savčích tkáňových buněk k detekci patogenů či jejich toxinů. Systém je vhodný pro živé bakterie a aktivní toxiny. Poškození tkáňových buněk je měřeno opticky či elektricky.

Buněčné biosensory

Chromatofor: pigmentové buňky ryby bojovnice pestrá (Betta splendens) – důsledkem kontaktu se specifickými biologickými agens dochází k jejich agregaci

http://patentimages.storage.googleapis.com/US6913877B1/US069138 77-20050705-D00007.png

Bakteriofágové biosensory Bakteriofágové jsou schopni rozeznat specifické receptory na povrchu buněk, na které se váží Vazba buněk na pro ně specifické bakteriofágy Detekce vazby: optická/elektrická (vazbou se mění procházející proud)

http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2014/an/c3an01989f

Děkuji vám za pozornost [email protected]

Využití MALDI-TOF MS k identifikaci mikroorganismů Sabina Purkrtová1 , Petra Junková2 1Laboratoř

potravinářské mikrobiologie, 2Laboratoř aplikované proteomiky

Ústav biochemie a mikrobiologie, Fakulta potravinářské a biochemické technologie, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze

[email protected], [email protected]

IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ

Identifikace na základě fenotypu: Fyziologické + biochemické znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barvení, tvar) b) požadavky na teplotu, atmosféru, živné látky c) základní biochemické testy: oxidáza, kataláza, fermentace/oxidace glukózy, hemolýzy apod. d) Biochemické testy specifické pro určitou skupinu mikrorganismů testů Např. Bacillus cereus G+ tyčka tvořící endospóry, vlhké, snadno rostoucí kolonie při 37 °C kataláza pozitivní, β-hemolýza, nefermentuje manitol + enzym lecitináza: na půdě MYP roste v růžových koloniích se zónou precipitace Souprava biochemických testů Microgen Bacillus ID (doba stanovení: 48 hodin)

http://www.napavalley.edu/people/srose/Publishing Images/Bacillus%20cereus%202(Gram%20stain).jpg

http://www.foodhaccp.com/memberonly/newsle tter164.html

39

IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na základě genotypu: Kritérium druhu u prokaryot (bakterie a archea): Sbírka kmenů, které jsou charakterizovány nejméně jedním diagnostickým fenotypovým znakem a jejich purifikované DNA molekuly vykazují nejméně 70% DNA-DNA hybridizaci, což odpovídá nejméně 97% shodě v sekvenci genu pro 16S rRNA Sekvenace genu pro 16S rRNA a analýza získané sekvence

Mapa genomu pro B. cereus ATCC 14579

40 http://www.acgtinc.com/specialty_dna_sequencing.htm

MALDI-TOF MS

Identifikace na základě fenotypu: Analýza převážně intracelulárních proteinů – MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry = Hmotnostní spektrometrie s průletovým analyzátorem a ionizací laserovou desorpcí v přítomnost matrice měkká ionizační metoda - nízký stupeň fragmentace vzorku matrice absorbuje energii laseru – při odpařování s sebou matrice strhává molekuly vzorku, převádí je do plynného skupenství a ionizuje přenosem protonu vznik pseudomolekulové ionty [A+H] + Obrázek 1: Schéma MALDI (http://biomikro.vscht.cz (květen 2008)

vzorek: mikrobiální kultura (buněčný materiál jedné nebo více kolonií) nebo extrakt intracelulárních proteinů nanesen na vodivou kovovou desku a překryt matricí 41

MALDI-TOF MS Průletový analyzátor - měření tzv. doby letu - doba letu je funkcí měrné hmotnosti iontu (m/z)

m t2  2eU 2 z L Obrázek 2: Schéma MALDI TOF MS (http://biomikro.vscht.cz (květen 2008)).

m hmotnost, z náboj, L délka driftové zóny, e elementární náboj, U urychlovací napětí

Provedení analýzy – získání proteinového profilu daného izolátu specifického jako otisk prstu (fingerprint)

Proteinový profil mikroorganismu

Proteinový profil -složený z jednotlivých spekter (jedna expozice laseru = jedno spektrum) -velikost píků odpovídá měrné hmotnosti iontu m/z (z obvykle rovno jedné = molekulové hmotnosti) – rozsah obvykle 2000 -20 000 - intenzita odpovídá množství přítomného 42 proteinu

MALDI-TOF MS

Volba matrice absorpce při vlnové délce použitého laseru (obvykle 337 nm) tvorby žádoucích krystalů s analytem (nutno stanovit empiricky) matrice obvykle kyselého charakteru (účinná ionizace přenosem protonu na analyt) - obvykle organické kyseliny: -kyano-4-hydroxyskořicová kyselina (CHC) 3,5-dimethoxy-4-hydroxyskořicová kyselina (sinapová kyselina - SA) 2,5-dihydroxybenzoová kyselina (DHB)

Proteinový profil mikroorganismu Obsahuje převážně intracelulární (vnitrobuněčné) proteiny menší než 15 kDa, které se vyskytují ve velkém množství, jsou bazické a středně hydrofobní většina ribozomální proteiny dále proteiny vážící se na DNA, cold-shock proteiny, heat-shock proteiny, chaperony atd. většina proteinů přítomných v profilu jsou tedy konzervované provozní (house-keeping) geny – nižší ovlivnitelnost kultivačními podmínkami + shoda s identifikací založenou na genotypu (sekvenace 16S rRNA) Příprava vzorku Přímé nanesení intaktních buněk - k lýzi buněk dochází samovolně při kontaktu s matricí– většina bakterií Plná extrakce proteinů - organické kyseliny a/nebo alkoholy (kvasinky, plísně, některé druhy bakterií – v závislosti na odolnosti buněčné stěny) – např. 43 extrakce za použití kyseliny mravenčí a ethanolu

MALDI-TOF MS

Současné komerční databáze od výrobců MALDI-TOF MS Bruker Daltonics – MALDI BIOTYPER Shimadzu - Shimadzu Launchpad software + SARAMIS database Biomérieux - VITEK® MS Další databáze kompatibilní s oběma hardware systémy např. Andromas

Analýza proteinového profilu 2) srovnání proteinového profilu (fingerprint) s referenční (komerční) databází kontrolních kmenů - provádí software – 3 komponenty 1)shodnost neznámého spektra s nejpodobnějším spektrem databáze 2) shodnost vybraného nejpodobnějšího spektra s neznámým spektrem 3) korelace mezi intenzitami píků daných spekter hodnota 0 (žádná shoda) až 1000 (absolutní shoda) – převedeno do dekadického logaritmu – skóre podobnosti v intervalu 0-3 - ukazatel přesnosti identifikace

vizualizace proteinových profilů - program mMass 5 (Strohalm a kol., 2010) 44

MALDI-TOF MS - POSTUP Přímá metoda nanášení vzorku – nanesení vzorku ve dvou paralelách o nižší a vyšší koncentraci buněk – po zaschnutí na kovové spotovací desce překryty matricovým matricovým roztokem (1 µl) a ponechány ke krystalizaci při pokojové teplotě Matrice: nasycený roztok -kyano-4-hydroxyskořicové kyseliny (obvykle 10 mg/ml) v 50% acetonitrilu s 2,5 % kyseliny trifluoroctové Proteinový standard (1 μl): Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics, SRN) –proteiny extrahované z Escherichia coli DH5alpha BRL + některé další přidané Přístroj Bruker Autoflex Speed Databáze MALDI Biotyper 3 45

Bacillus cereus

Rozsah skore 2.300 ... 3.000 2.000 ... 2.299 1.700 ... 1.999 0.000 ... 1.699

Rank (Quality )

Matched Pattern

Score Value

NCBI Identifier

1 ( +++ )

Bacillus cereus 994000168 LBK

2.358

1396

2 ( ++ )

Bacillus cereus 4080 LBK

2.246

1396

3 (+)

Bacillus cereus DSM 31T DSM

1.977

1396

4 (+)

Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM

1.782

64104

5 (-)

Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM

1.596

1428

6 (-)

Bacillus mycoides DSM 2048T DSM

1.529

1405

7 (-)

Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 CHB

1.486

1282

8 (-)

Staphylococcus schleiferi subsp. schleiferi DSM 4809 DSM

1.452

74707

9 (-)

Lactobacillus paralimentarius DSM 13238T DSM

1.45

83526

10 (-)

Acidovorax temperans DSM 7270T HAM

1.438

80878

Popis vysoce pravděpodobná druhová identifikace bezpečná rodová identifikace, pravděpodobná druhová identifikace pravděpodobná rodová identifikace nespolehlivá identifikace

Symbol ( +++ ) ( ++ ) (+) (-) 46

Bacillus cereus Rank (Qualit y)

Matched Pattern

Score Value

1 (+)

Bacillus cereus 4080 LBK

1.964

6 (-)

2 (+)

Bacillus cereus 994000168 LBK

1.851

7 (-)

3 (-)

Clostridium novyi A 1025_NCTC 538 BOG

1.388

8 (-)

4 (-)

Rhizobium rubi DSM 6772T HAM

1.388

9 (-)

Clostridium paraputrificum 1083_ATCC 17796 BOG

1.313

5 (-)

Sphingobacterium mizutaii DSM 11724T HAM

1.378

10 (-)

Bacillus cereus DSM 31T DSM

1.311

6 (-)

Bacillus hwajinpoensis DSM 16206T DSM

1.403

7 (-)

Tsukamurella sp RV_Feb_05 MLD

1.338

8 (-)

Staphylococcus aureus ssp aureus DSM 4910 DSM

1.304

9 (-)

Pandoraea pulmonicola LMG 18106T HAM

1.297

10 (-)

Streptomyces chartreusis HKI 249 HKJ

1.289

Rank (Quality )

Matched Pattern

1 ( ++ )

Bacillus cereus 4080 LBK

2 (+)

Bacillus cereus 994000168 LBK

3 (-)

Bacillus pseudomycoides DSM 12442T DSM

1.654

4 (-)

Bacillus cereus DSM 31T DSM

1.514

5 (-)

Acinetobacter towneri DSM 14962T HAM

Streptococcus pyogenes ATCC 1.361 19615 THL Staphylococcus aureus ssp aureus DSM 3463 DSM

1.352

Curtobacterium albidum HKI 1.341 11500 HKJ

Score Value

2.034

1.967

1.479

47

Děkujeme vám za pozornost [email protected], [email protected]