PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM Biológiai és Sportbiológiai Doktori Iskola
A kolinerg és glutamáterg neurotranszmisszió interakciójának vizsgálata kognitív zavarok állatkísérletes modelljeiben.
PhD értekezés
Bali Zsolt Kristóf
Témavezető: Dr. Hernádi István PhD, habil. egyetemi docens
Témavezető aláírása
Iskolavezető aláírása
PÉCS, 2016
TARTALOMJEGYZÉK 1.
BEVEZETÉS .......................................................................................................................... 1
1.1. A tanulás és a memória pszichofiziológiája ................................................................ 1 1.2. A tanulási és memória funkciók leggyakoribb betegségei ......................................... 3 1.3. A glutamáterg neurotranszmisszió a kognitív folyamatokban és az Alzheimerkórban ............................................................................................................................ 4 1.3.1. Glutamáterg neuronok és receptorok szerepe a tanulásban és a memóriában ...... 4 1.3.2. A glutamáterg neurotranszmisszió zavarai Alzheimer-kórban ............................... 7 1.4. A kolinerg neurotranszmisszió a kognitív folyamatokban és az Alzheimer-kórban ......................................................................................................... 8 1.4.1. Kolinerg neuron-csoportok és projekcióik szerepe a tanulásban és a memóriában .............................................................................................................. 8 1.4.2. A kolinerg neurotranszmisszió zavarai Alzheimer-kórban ................................... 11 1.5. Neurokognitív zavarok állatkísérletes modellezése .................................................. 12 1.6. Kognitív zavarok gyógyszeres kezelése és az α7 nAChR, mint potenciális új célpont .......................................................................................................................... 16 2.
CÉLKITŰZÉSEK ................................................................................................................. 20
3.
ANYAG ÉS MÓDSZER ......................................................................................................... 21
3.1. Az α7 nAChR agonista PHA-543613 hatásainak vizsgálata a térbeli munkamemóriára két különböző farmakológiai amnézia-modellben ................... 21 3.1.1. Kísérleti állatok ....................................................................................................... 21 3.1.2. T-labirintus apparátus ............................................................................................ 21 3.1.3. Kísérleti protokoll ................................................................................................... 22 3.1.4. A vizsgált farmakonok és a kísérleti modell........................................................... 23 3.1.5. Statiszikai elemzés................................................................................................... 24 3.2. Glutamáterg illetve kolinerg hatások és interakcióik vizsgálata a hippocampus neuronjain in vivo elektrofiziológiai módszerekkel .................................................. 25 3.2.1. Az elektrofiziológiai módszerek általános bemutatása .......................................... 25 3.2.2. NMDA iontoforézisével kiváltott excitációk vizsgálata piramissejteken és interneuronokon ..................................................................................................... 29 3.2.3. Lokálisan adott NMDA-ra illetve ACh-ra adott tüzelési válaszok, valamint szisztémásan alkalmazott mAChR és α7 nAChR antagonisták hatásainak vizsgálata ................................................................................................................. 30 4.
EREDMÉNYEK ................................................................................................................... 33
4.1. Az α7 nAChR agonista PHA-543613 hatásainak vizsgálata a térbeli munkamemóriára két különböző farmakológiai amnézia-modellben ................... 33 4.1.1. PHA-543613 hatása a szkopolaminnal kiváltott tranziens amnézia-modellben .. 33 4.1.2. PHA-543613 hatása az MK-801-el kiváltott tranziens amnézia-modellben ......... 35 4.2. Glutamáterg illetve kolinerg hatások és interakcióik vizsgálata a hippocampus neuronjain in vivo elektrofiziológiai módszerekkel .................................................. 37 I
4.2.1. Neuronális szubpopulációk elkülönítése a hippocampus CA1-régiójában, a jelszeparálás validálása .......................................................................................... 37 4.2.2. NMDA iontoforézisével kiváltott excitációk vizsgálata hippocampalis piramissejteken és interneuronokon ...................................................................... 39 4.2.3. Iontoforetikusan adott NMDA és ACh önálló hatásainak és interakciójának vizsgálata hippocampalis piramissejteken ............................................................. 41 4.2.4. Szisztémásan alkalmazott muszkarinos illetve nikotinos AChR antagonisták hatásai a neuronok NMDA-ra és ACh-ra adott tónusos válaszaira ..................... 43 4.2.5. NMDA és ACh együttes iontoforézisekor fellépő szuperadditív hatás változása szkopolamin illetve MLA szisztémás alkalmazása után ........................................ 49 5.
DISZKUSSZIÓ ..................................................................................................................... 53
5.1. Az α7 nAChR agonista PHA-543613 hatásainak vizsgálata a térbeli munkamemóriára két különböző farmakológiai amnézia-modellben ................... 53 5.2. Glutamáterg illetve kolinerg hatások és interakcióik vizsgálata a hippocampus neuronjain in vivo elektrofiziológiai módszerekkel .................................................. 57 5.2.1. Neuronális szubpopulációk elkülönítése a CA1-es régióban és a jelszeparálás validálása ................................................................................................................ 57 5.2.2. NMDA iontoforézisével kiváltott excitációk vizsgálata hippocampalis piramissejteken és interneuronokon ...................................................................... 58 5.2.3. Iontoforetikusan adott NMDA illetve ACh hatásai a piramissejtek tónusos tüzelési aktivitására. A muszkarinos és a nikotinos AChR-ok szerepe a jelenségben .............................................................................................................. 59 5.2.4. Iontoforetikusan adott NMDA és ACh kombinációjának szuperadditív hatása. A muszkarinos és nikotinos AChR-ok szerepe a jelenségben ................................... 63 5.3. Összefoglaló következtetések ...................................................................................... 67 6.
ÖSSZEFOGLALÁS ............................................................................................................... 70
7.
SUMMARY .......................................................................................................................... 72
8.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS .................................................................................................. 74
9.
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE .................................................................................................. 75
10. IRODALOMJEGYZÉK ......................................................................................................... 77 11. PUBLIKÁCIÓS LISTA .......................................................................................................... 95 11.1. A PhD értekezés alapjául szolgáló közlemények ...................................................... 95 11.2. A PhD értekezés témájában készült konferencia-előadások és absztraktok ......... 95 11.3. Egyéb tudományos közlemények ............................................................................... 96 11.4. Egyéb témákban készült konferencia-előadások és absztraktok ............................ 96
II
1.
BEVEZETÉS
1.1. A tanulás és a memória pszichofiziológiája A memóriára és a tanulásra, mint neurobiológiai és pszichológiai fogalmakra, számos definíció létezik, ami tükrözi egyrészt a tudományág kutatásának sokféle megközelítési módját (behaviorista iskola, kognitív pszichológia stb.), másrészt a különféle tanulási folyamatok és memóriaműködések diverzitását. Jól használható általános megfogalmazást ad Dudai (1989) [1], miszerint a tanulás „tartós belső reprezentációk tapasztalat-függő módon való létrehozása, és/vagy az ilyen reprezentációk hosszútávú módosítása”. Ennek megfelelően a memória „a tapasztalat-függő belső reprezentációk időbeli megtartásának képessége”. A definíciónak a viszszahívást is magába kell foglalnia, ami pedig „a memória felhasználása neuronális és viselkedési folyamatokban” [1]. A három definíció együttesen magába foglalja, hogy a tanulás egy folyamat, ami tapasztalatok útján alakul ki, tartós változásokat hoz létre, melyek ki vannak téve további módosításoknak, és hogy a tárolt memória a későbbiekben befolyásol(hat)ja az organizmus idegrendszeri működését és magatartását. A meghatározásból következik az is, hogy a tanulás és a memória a belső reprezentációk jellege illetve a megtartás időbeli terjedelme szempontjából igen változatos lehet. Már a témakör modern kori kutatásának korai képviselői is foglalkoztak a memóriaműködések időbeli viszonyaival: James (1890) [2] elsődleges és másodlagos memóriáról beszélt, Ebbinghaus (1885) [3] pedig vizsgálta a késleltetés hatását a viszszaidézésre, valamint szólisták tanulása során feltárta a sorrendiség szerepét a felidézés sikerességére vonatkozóan (primácia- és recencia-hatás) [2,3]. A későbbiekben a rövid- és hosszútávú memória (short-term memory: STM, illetve long-term memory: LTM) mellett meghatároztak egy, az előbbinél is rövidebb időtartamú szenzoros memóriát, valamint egyes szerzők egy közép-hosszútávú memóriát is feltételeznek [4]. A STM és a LTM elkülönítésének jogosságát neurobiológiai alapon is megerősítette az elmúlt évszázad számos humán és állatkísérletes tapasztalata, mint például különböző agyterületek léziójának eltérő hatásai a STM és a LTM működésére [5]. A leghíresebb példák egyike Henry Molaison (H.M.) esete, akin a mediális temporális lebeny (MTL) bilaterális eltávolítása után a LTM szelektív zavara volt észlelhető a STM megtartottsága mellett. A gyrus dentatus, a hippocampus, a subiculum és néhány környező struktúra hiányában tehát a beteg képes volt a régmúlt eseményeit felidézni, azonban képtelen volt új információkat eltárolni a LTM-ba (anterográd amnézia). Ezzel szemben a STM (vagy munkamemória) funkcióival inkább neocorticalis területeket, leggyakrabban a prefrontális kérget (PFC) kapcsolják össze [6,7].
1
H.M. esete alátámasztotta azt is, hogy a – definíciónknál maradva – tanulás folyamán kialakult belső reprezentációk jellege illetve azok létrejöttének módja alapján is csoportosíthatók a memóriafajták. A beteg már említett tanulási zavara ugyanis nem terjedt ki például motoros készségek elsajátítására (ún. tükörrajz feladat), kizárólag a tényszerű információkra. Utóbbi memóriát a jellegénél fogva deklaratív (explicit) memóriának nevezzük, ami arra utal, hogy tartalma szavakkal konkrétan és pontosan leírható („mi?”). Ide tartozik általános tények ismerete (szemantikus memória), mint például szavak jelentése, személyek nevének, adatainak az ismerete stb., valamint az ún. epizódikus memória, ami átélt eseményekre, tapasztalatokra épül [8]. A deklaratív memória két fajtájának neurobiológiai elkülönítését többek között a K.C. monogrammú beteg esete indokolja, akinél egy motorbalesetben szerzett különféle neocorticalis és MTL-i sérülések után az önéletrajzi emlékekre vonatkozó retrográd amnéziát figyeltek meg, miközben az általános ismeretei megtartottak maradtak [9]. A memóriafajták másik nagy csoportját a nem-deklaratív (implicit) memóriatípusok alkotják, melyek az előbbivel ellentétben verbálisan kevéssé kifejezhetők, és tanulásuk nem valamilyen tények ismeretében nyilvánul meg, hanem készségek elsajátításában, illetve feladatok végrehajtása során a teljesítmény növekedésében („hogyan?”). Ide tartoznak a motoros készségek (procedurális memória), a klasszikus és operáns kondicionálás valamint az előfeszítés (priming). A deklaratív LTM kialakításában és felhasználásában négy lépést szokás megkülönböztetni, melyek neuroanatómiai és -fiziológiai szempontból is elkülöníthetőek, ezek: 1.) a kódolás (információk kiválasztása és előkészítése tartós megőrzésre), 2.) a konszolidáció (kódolt információk rendszerezése és átírása LTM-ba), 3.) a tárolás és 4.) az előhívás (információ „előkeresése” a tartós tárakból, és előkészítés a felhasználásra). Egyre több klinikai esettanulmány és kísérletes adat támasztja alá azokat a modelleket, miszerint a tárolni kívánt információk kódolása neocorticalis területek és a MTL egyes struktúráinak együttműködését igényli, majd a konszolidációban a hippocampus játszik kulcsszerepet, a végső tárolás azonban a neocortex különböző területeinek neuronhálózataiban történik [10–13]. A konszolidált információ visszahívása a neocorticalis tárolókból valószínűleg már a MTL struktúráitól függetlenül történik, amire példa H.M. esete, aki anterográd amnéziája ellenére korábbi emlékeit nem vesztette el (retrográd amnézia), kivéve a műtétet közvetlenül megelőző rövid időtartamot, amire vonatkozó emlékek feltehetően – a fenti modell szerint – még nem mentek át megfelelő konszolidációs folyamaton. A MTL a deklaratív memória konszolidációján túl a térbeli memóriában és a tájékozódásban is fontos szerepet játszik. Az állati deklaratív memória vizsgálata során fontos szerepet töltenek be a térbeli feladatok, mint például a különböző jutalmazásos feladatok radiális labirintusban,
2
a spontán alternálási teszt vagy a Morris-féle víziútvesztő [14–16]. A kezdeti radikális behaviorista felfogástól elszakadva, Tolman [17] arra a következtetésre jutott, hogy az állatok egy labirintusban nem a bal és jobb kanyarok inger-válasz alapú kondícionálásán keresztül tanulják meg a megfelelő útvonalat, hanem létezik egy idegrendszerbe kódolt kognitív térkép, ami a korábban megismert térnek és viszonyainak a belső reprezentációját jelenti [17]. A MTL sérülése okán bekövetkező térbeli tájékozódási zavarok illetve a teret reprezentáló neuronális működések felfedezése (ld. később) nyomán a MTL (azon belül is elsősorban a hippocampus és az entorhinális kéreg) összekapcsolódott a kognitív térkép fogalmával is [18]. 1.2. A tanulási és memória funkciók leggyakoribb betegségei A Mentális zavarok diagnosztikai és statisztikai kézikönyvének 5. kiadásának (DSM-5) definíciója szerint a fő neurokognitív zavarok1 az önálló életvitelt jelentősen nehezítő, komoly kognitív hanyatlással járó állapotok, melyek nem magyarázhatók delíriummal vagy egyéb mentális zavarral [19]. Kognitív hanyatlás alatt olyan képességeknek a zavara értendő, mint a tanulás és a memória, az egzekutív funkciók, a nyelv illetve perceptuo-motoros és szociális képességek. A fő neurokognitív zavarok csoportjába számos neurodegeneratív betegség tartozik úgy, mint a frontotemporális demencia, a Lewy-test betegség, vagy az elsődlegesen motoros tüneteket produkáló Parkinson-kór, azonban leggyakoribb formája az Alzheimer-kór (AD). Az egyszerűség kedvéért ezért a továbbiakban a neurodegeneratív betegségek közül az AD-ra fókuszálunk. A fenti általános definíció és tünetek mellett az AD speciális jellemzői közé tartozik, hogy a betegség lappangva fejlődik ki, majd a kognitív tünetek fokozatosan súlyosbodnak. A kognitív zavar AD-ban elsősorban amnesztikus jellegeket ölt, különösen jellemzőek a vizuális-térbeli zavarok, valamint az afáziának olyan formái, melyek a megnevezés, mondatok elismétlésének és a beszéd sebességének, folyékonyságának zavarában jelentkeznek. A tünetek alapján az ADt nehéz elkülöníteni más neurokognitív zavaroktól, ezért „lehetséges” illetve „valószínűsíthető AD-ról” beszélhetünk. A kognitív képességek hanyatlásának mérésére a klinikai gyakorlatban elterjedten használt módszer a Mini Mentál Státusz Teszt, amiben elért pontszám jól korrelál az AD súlyosságával, és változása jól követi a betegség progresszióját [20,21]. Az AD mint neurodegeneratív betegség az agy neuronjainak elhalásával, az agyállomány zsugorodásával, illetve a barázdák és agykamrák tágulásával jár. A feltételezett AD-t post-mortem szövettani vizsgálatokkal lehet igazolni, mivel a neuronok degeneratív pusztulását az extracelluláris térben megjelenő amiloid-béta (Aβ) plakkok és neurofibrilláris kötegek (NFT) kísérik. Az Aβ peptidek
1
A DSM-4-ben demenciaként szerepeltek.
3
prekurzora az idegsejtekben normálisan jelenlévő membránfehérje, sőt, jelenléte szükséges a hippocampus megfelelő fejlődéséhez és működéséhez [22]. A plakkokat alkotó Aβ fragmentumok az amiloid prekurzor protein (APP) hibás hasítása következtében jönnek létre [23]. Az Aβ plakkok feltételezhetően neurotoxikus hatással vannak az idegsejtekre. A NFT-ek a mikrotubulusok felépítésében résztvevő tau fehérjék kóros foszforilációja nyomán alakulnak ki, aminek következménye a mikrotubulusok leépülése és a neuronok elhalása. A NFT-ek megjelenése jól korrelál a betegség progressziójával és tüneteivel, ezért Braak és Braak (1991) [24] ez alapján határozta meg az AD stádiumait. A betegség első két szakaszában (entorhinális illetve limbikus stádium) a NFT-ek az entorhinális kéregben illetve a hippocampus-ban, valamint ezekkel összefüggésben álló limbikus struktúrákban jelennek meg, a MTL fokozatos degenerációja pedig enyhe kognitív zavarokkal jár együtt. A betegség további progressziója során a NFT-ek elterjedése már a neocortex degenerációját is mutatja, ami súlyos kognitív zavarban, afáziákban, apraxiákban nyilvánul meg. Az AD-nak ismerjük családi halmozódást mutató familiális és sporadikus formáját is, a kettő előfordulása azonban nem különül el egymástól élesen [25]. Mindkét változatban szerepet játszanak genetikai rizikófaktorok, mint például az APP 21. kromoszómán található génjének mutációi (ugyanennek a kromoszómának a rendellenessége áll a Down-szindróma hátterében), melyek fiatal kori (early-onset) AD-ra hajlamosítanak [26,27], vagy például az ApoE nevű lipid-carrier fehérje génjének ε4-es allélváltozata, ami növeli az idős-kori (late-onset) AD valószínűségét [28,29]. Számos más életmódbeli, kórelőzményi és egyéb faktort ismerünk (kardiovaszkuláris betegségek, diabétesz, koponyasérülések), melyek növelik az AD rizikóját [30– 32], előfordulása azonban legjobban az életkorral korrelál, túlnyomó többségében időskori betegségként jelentkezik. A neurodegeneratív betegségeken túl fontos megjegyezni, hogy egyéb idegrendszeri betegségek is kognitív hanyatlással járhatnak: ide tartozik az agyi infarktusok következtében kialakuló vaszkuláris demencia, vagy például traumás agysérülések illetve alkohol-függőség következtében kialakuló neurokognitív zavarok. Kiemelendő továbbá a skizofrénia, melynek pszichotikus tünetei (pozitív tünetek) mellé kognitív zavarok (negatív tünetek) is társulnak [33]. 1.3. A glutamáterg neurotranszmisszió a kognitív folyamatokban és az Alzheimer-kórban 1.3.1. Glutamáterg neuronok és receptorok szerepe a tanulásban és a memóriában A MTL struktúráiban az egyes területek kimeneteit alkotó principális sejtek axonjai glutamát neurotranszmitterrel működnek. Ezeknek a glutamáterg neuronoknak a memóriában betöltött 4
fontos szerepére világítottak rá a szabadon mozgó rágcsálókón explorációs viselkedés alatt végzett neurofiziológiai vizsgálatok, melyek ugyanakkor a kognitív térkép elméleti koncepcióját is megerősítették. O’Keefe és Dostrovsky (1971) [34] szabadon mozgó patkányok hippocampusának CA1 régiójában talált először olyan piramissejteket, melyeknek tüzelési aktivitása az állat térbeli helyzetét, illetve fejének adott irányba történő fordítását reprezentálta, ezeket nevezzük „helysejteknek” (place cells). Később további térbeli helyzettel összefüggő aktivitást mutató neuron-típusokat is felfedeztek a MTL-ben, mint például az entorhinális kéreg „rács-sejtjei” (grid cells), melyeknek a tüzelése szabályos távolságokra lévő térbeli pontokhoz kötött [35,36], és szintén túlnyomó többségükben glutamáterg piramissejtek [37]. A térbeli memóriát reprezentáló, hippocampalis és entorhinális glutamáterg sejtek feltételezhetően részt vesznek az epizódikus memória MTL-hez kötődő folyamataiban is: a legújabb eredmények szerint az entorhinális kéreg rács-sejtjei a térbeli helyzeten és a térben megtett távolságokon túl az adott viselkedéssel eltöltött időt is reprezentálni képesek, ami az epizódikus emlékek egy fontos komponense [38]. A memóriaműködésekkel korreláló neuronális aktivitás másik alapvető példája a PFC-i piramissejtek tüzelésének kapcsolata a munkamemóriával: nem-humán főemlősökön munkamemória-tesztek végzése közben elvezetett extracelluláris tüskeaktivitás azt mutatta, hogy a dorzolaterális prefrontális kéregben (dlPFC) egyes sejtek fenntartott aktivitást mutatnak a feladatok késleltetési fázisában, amikor a bemutatott és megjegyzendő stimulus egy rövid időre megszűnik. Ezeket delay- azaz késleltetési-sejteknek nevezték el. A megfigyelés alátámasztja azt a feltételezést, hogy az információk rövidtávon idegsejtek fenntartott aktivitásában, reverberáló körökben tárolódnak [39]. Másrészt az, hogy a késleltetési sejtek fenntartott tüzelése elsősorban glutamát receptorokon keresztül valósul meg [40,41], további példát szolgáltat a glutamáterg neurotranszmisszió kritikus szerepére a kognitív funkciókban. Amennyiben a tanulási folyamatok során az idegsejtekben lejátszódó celluláris mechanizmusokat és az ún. neuronális plaszticitást vizsgáljuk, itt is szembeötlő a glutamát szerepe. Neuronális plaszticitás alatt az idegrendszer folyamatos strukturális és funkcionális változásra való képességét értjük a tapasztalatok és hatások függvényében [42], aminek elméleti koncepcióját Hebb (1949) [43] fektette le: feltételezve két neuron (A és B) közötti kapcsolatot, „ha A neuron axonja elég közel van ahhoz, hogy gerjessze B neuront, és ismételten vagy folyamatosan hozzájárul annak aktivitásához, akkor valamilyen növekedési folyamat vagy metabolikus változás játszódik le egyik vagy mindkét sejtben, ami miatt A neuron tüzelése a későbbiekben egyre hatékonyabban fogja aktiválni B neuront”. Két idegsejt közötti kapcsolat erősödhet például az ingerület-átvitel hatékonyságának növekedésével a közöttük lévő szinapszisokban, ami 5
megvalósulhat a preszinaptikus sejt transzmitter-leadásának változásával, a posztszinaptikus oldal érzékenységének változásával (több receptor illetve konduktancia-növekedés), illetve egy harmadik neuron által modulált preszinaptikus facilitáción keresztül. Strukturális plaszticitás is létrejöhet azáltal, hogy a neuronok közötti kapcsolatrendszerek épülnek át a „használat” függvényében: új szinapszisok épülnek ki, illetve egyes szinapszisok megszűnnek. A szinaptikus plaszticitásnak egy speciális elektrofiziológiai modellje a hosszútávú potenciáció (long-term potentiation, LTP), ami mind a MTL, mind a PFC glutamáterg memóriasejtjeinek kapcsolatrendszerében kiváltható [44,45], és szoros összefüggést mutat a memóriafeladatokban nyújtott teljesítménnyel [46,47]. Először a hippocampus különböző szakaszait összekötő pályákon (perforáns pálya, moharostok, Schaffer-kollaterálisok) mutatták ki, hogy ha az afferensen nagy-frekvenciás sorozatingerlést alkalmazunk, akkor a későbbiekben egyszeres ingerekkel nagyobb excitátoros posztszinaptikus potenciálok (EPSP) válthatók ki, mint a tetanikus ingerlés előtt [44]. A perforáns pályán és a Schaffer-kollaterálison megfigyelhető, ún. asszociatív LTP esetén a szinaptikus változások létrejöttéhez több afferens axon, valamint a pre- és posztszinaptikus sejt szimultán aktiválódására van szükség és elsősorban a posztszinaptikus receptorok számának és működésének változásán alapul (vö. Hebb koncepciója). A moharostok nem-asszociatív LTP-je ugyanakkor a preszinaptikus transzmitter-leadás facilitációjára épül, amiben valószínűleg modulátoros inputok játszanak szerepet [48]. Az LTP fenti két formája kb. 1-3 órán át áll fenn (korai LTP), de ismerjük a LTP késői, hosszabb távú fázisát is, amit több egymásutáni tetanikus ingerléssel lehet kiváltani, és legalább 24 órán át fennmarad. A LTP ezen formájában már a strukturális plaszticitásnak is szerepe van: a késői LTP folyamán új szinaptikus kapcsolatok alakulnak ki a preszinaptikus és a posztszinaptikus neuron között, így hosszú távon növekszik az ingerület-átvitel hatékonysága [49–51]. A LTP jelenségében beigazolódott a glutamát metabotróp és ionotróp receptorainak fontossága, melyek közül elsősorban a N-metil-D-aszpartát (NMDA) típusú illetve a 2-amino-3-(5metil-3-oxo-1,2-oxazol-4-il)propánsav (AMPA) típusú receptorok szinaptikus plaszticitásban betöltött szerepét mutatjuk be. A moharostok szakaszán megfigyelhető nem-asszociatív LTP nem igényli az NMDA-receptorok (NMDAR) aktiválódását, a két másik fő hippocampalis pálya valamint a hippocampus-PFC szinapszisok asszociatív LTP-je azonban gátolható NMDAR antagonistákkal [46,48,52,53]. Az NMDAR-ok speciális tulajdonsága, hogy centrális Ca2+-csatornájukat Mg2+ ionok zárják el (Mg2+-dugó), amikor egyébként a ligandkötődés következtében az ioncsatorna nyitott állapotban lenne. A Mg2+-dugó eltávolítása és az NMDAR-on keresztüli Ca2+ influx csak egy megadott (hipopolarizált) membránpotenciálon történik meg, ezért a NMDA-függő LTP feltétele a posztszinaptikus neuronnak egy kritikus időablakon belül történő 6
depolarizációja, ami megtörténhet egy másik axonról jövő ingerület által, vagy a posztszinaptikus denzitásban megtalálható AMPA receptorok (AMPAR) nagy mértékű aktivációjával (nagy-frekvenciás ingerlés). A NMDAR felszabadulása a Mg2+-dugó alól lehetővé teszi, hogy glutamát megkötése után meginduljon a Ca2+ beáramlása a posztszinaptikus sejtbe, ami változatos intracelluláris szignáltranszdukciós útvonalakat aktivál [54]. Az egyik legfontosabb végeredmény a posztszinaptikus denzitásban megtalálható AMPARok számának és konduktanciájának növekedése lesz, így egy későbbi, kisebb intenzitású ingerület által kiváltott glutamát-felszabadulás is nagyobb mértékű EPSP-ok létrehozására lesz képes az AMPAR keresztül, vagyis a szinapszis megnövekedett érzékenységgel működik tovább [55,56]. A Ca2+ influx által indukált intracelluláris folyamatok egy másik útján retrográd messenger molekulák (pl. NO) szintézise indul meg, melyek visszahatva a preszinaptikus terminálokra növelik a felszabadított glutamát mennyiségét [57,58]. Ismételt tetanikus ingerek hatására az intracelluláris messengerek felhalmozódása már olyan génexpressziós utakat is aktivál, melyek a szinapszisok strukturális átépülését indukálják. A glutamát receptorok szinaptikus plaszticitásban való közreműködését tehát a következőképp foglalhatjuk össze: az AMPAR-on keresztüli hatása – mind a potenciáció előtt és után, mind a potenciáció kialakulása során – elsődleges szerepe a posztszinaptikus oldal depolarizációjában van, míg az NMDARok ún. koincidencia-detektorként működnek, és a tartós változásokhoz szükséges intracelluláris jelek elindítói [59,60]. 1.3.2. A glutamáterg neurotranszmisszió zavarai Alzheimer-kórban Az AD-ban megfigyelhető mind a glutamáterg, mind a kolinerg neurotranszmisszió zavara, ezen abnormalitások alapos áttekintését adja Schaeffer és Gattaz (2008) összefoglalója [61]. A glutamáterg deficit nyilvánvaló megnyilvánulása a MTL glutamáttal kommunikáló principális sejtjeinek (pl. helysejtek, rácssejtek) egészen korai pusztulása AD-ban (ld. korábban Braak és Braak (1991) [24]), majd később a neocorticalis piramissejtek degenerációja (többek közt a PFC-ben). A sejtpusztulás egyik feltételezett okának, a glutamát-neurotoxicitásnak mindezek a principális neuronok jobban ki vannak téve, mint a gamma-amino-vajsavval (GABA) kommunikáló interneuronok [62]. A piramissejtek pusztulása mellett megfigyelhetőek a különböző glutamát-receptorok denzitásában és működésében beállt változások. Az AD-ban szenvedők agyának entorhinális kérgi részén jelentősen csökken az AMPAR-ok száma [63], az entorhinális kéreg abnormalitásai pedig a betegek jelentős hányadában a gyrus dentatus degenerációját okozzák, ami kóros gliózisban nyilvánul meg [64]. Az entorhinális kéreg mellett a hippocampus-ban és környező struktúrákban is csökkent AMPAR-kötődést találtak AD-os betegeknél [61]. Az NMDAR-ok kötődésének és az NR1, NR2A és NR2B alegységek 7
denzitásának csökkenése is jellemző AD-ban a MTL struktúráiban, továbbá alacsonyabb ligandkötődés jellemzi a subiculum és a frontális agykéreg metabotróp típusú glutamát-receptorait (mGluR) is. 1.4. A kolinerg neurotranszmisszió a kognitív folyamatokban és az Alzheimer-kórban 1.4.1. Kolinerg neuron-csoportok és projekcióik szerepe a tanulásban és a memóriában Az acetilkolin (ACh) a perifériás idegrendszerben nagyon gyakori transzmitter, mind a szomatikus, mind a vegetatív motoros működések fontos mediátora. A központi idegrendszerben a leggyakoribb serkentő neurotranszmitter a glutamát, ugyanakkor kolinerg neuronok is nagy számban előfordulnak egyes struktúrák belső kapcsolatrendszerében (pl. neocortex, striatum), valamint jól körülírható sejtcsoportokat alkotnak, melyek más agyterületek kolinerg beidegzéséért felelnek. Az ACh központi idegrendszeri szerepe változatos módon kötődik a kognitív funkciókhoz. Jól ismert a kolinerg projekciók alapvető szerepe az alvás és az ébrenlét fázisainak szabályozásában: a híd és a középagy határának tegmentális területén elhelyezkedő kolinerg sejtcsoportok (a nucleus tegmentalis pedunculopontinus, PPN és a nucleus tegmentalis laterodorsalis, LDT) izolálása a felsőbb központoktól szinkronizált EEG aktivitást és alvást idéz elő [65]. A két agytörzsi mag az ún. felszálló retikuláris aktiváló rendszer kulcsfontosságú tagjai, melynek kolinerg sejtjei éber állapotban (deszinkronizált EEG aktivitás mellett) magas frekvenciával tüzelnek, míg a lassú-hullámú alvás állapotában alacsony az aktivitásuk. A PPN és az LDT beidegzi a thalamusnak mind retikuláris magját, mind relémagjait. Ezeken a projekciókon keresztül a kolinerg hatás alapvetően meghatározza a thalamus kapuzó funkcióját az agykéreg felé [66]. Egy másik fontos kolinerg központ a bazális előagyban található, és egyik legfontosabb magja emberben a Meynert-mag (nucleus basalis), ami elsősorban a neocortex ACh-szintjének szabályozásáért felelős. A Meynert-mag kolinerg neuronjai is éber állapotban rendelkeznek magas tüzelési aktivitással, ami az agykéreg sejtjeinek megnövekedett serkenthetőségével jár együtt, emiatt sokszor ennek a kolinerg projekciónak a szerepét is az éberséggel hozzák összefüggésbe. A bazális előagyi kolinerg központnak azonban sokkal nagyobb a jelentősége a figyelmi funkciókban [67], ami összefüggésben áll ugyan az éberséggel, de annál specifikusabb működést takar. Figyelemről akkor beszélünk például, amikor egy félelmet vagy más erős emóciókat keltő, új vagy egyéb okból kiemelkedő fontosságú inger serkenti az információk keresését, detektálását és szelekcióját, valamint hatására az idegrendszer átcsoportosítja az erőforrásait a kiemelkedő inger jobb feldolgozására. Ennek megfelelően a figyelmi funkciók működése 8
illetve a bazális előagyból eredő kolinerg neuronok aktivitása nagyobb mértékben függ előagyból (pl. nucleus accumbens, amygdala) származó afferensek szabályozásától. A nucleus basalis–neocortex kapcsolatrendszerben a kolinerg és a glutamáterg neurotranszmisszió fontos interakcióit mutatták ki: komplex stimulusok alkalmazásával kiváltott neocorticalis ACh felszabadulás például blokkolható glutamát-receptor antagonista kinureninsav bazális előagyi infúziójával [68]. Másrészt a nucleus basalisból eredő kolinerg hatás a neocortexben a muszkarinos ACh receptorokon (mAChR) hatva a piramissejtek depolarizációjával, míg a nikotinos ACh receptorokon (nAChR) keresztül a glutamát-felszabadulás preszinaptikus facilitációjával járul hozzá az agykérgi neuronok magasabb aktivitásához [69], ami elősegíti, hogy a kiemelkedő ingerekre erősebb választ adjanak, ezáltal javuljon az információ feldolgozásában a jel/zaj arány [70]. A hippocampus legfontosabb kolinerg bemenetét a septalis magoktól (illetve a közelben elhelyezkedő Broca-féle diagonális sávtól) kapja a fornixon keresztül [71]. A kolinerg bemenet fontos szerepet játszik a hippocampus-függő tanulási és memóriafolyamatokban, amit számos kísérleti eredmény támaszt alá. Térbeli tesztekben, amilyen például a spontán alternálási teszt, a medialis septum léziója mind fejlődő, mind felnőtt korban elrontja a patkányok teljesítményét [72], más jellegű magatartástesztekben pedig azt találták, hogy a septalis lézión átesett állatoknak a helyfelismerési memóriája romlott, a tárgyfelismerésben azonban nem teljesítettek roszszabbul a kontrollnál [73]. Továbbá a teljes septalis lézió térbeli memóriadeficitet előidéző hatásával szemben a septum kolinerg sejtjeinek szelektív írtása csak bizonyos tesztekben és csak a térbeli memória bizonyos doménjeire hat, tehát a hippocampus a septalis afferentáció kolinerg rostjai nélkül is képes bizonyos funkciókat normálisan ellátni, feltehetően a GABAerg rostoknak köszönhetően [74,75]. A tanulási folyamatok és a hippocampalis ACh felszabadulás között sok esetben pozitív korrelációt lehetett kimutatni: térbeli és más memóriatesztek során ACh felszabadulás mérhető a hippocampus-ban, a kolinerg moduláció pedig szoros összefüggést mutat a hely-sejtek működésével [74,76]. Érdekes, hogy az ACh hippocampalis szintjének növekedése nem csak a tesztek alatt, hanem a próbák közötti szünetben is megfigyelhető, valamint progresszív (több napon át tartó) tanulási folyamatokban folytonos növekedését lehet megfigyelni [77]. A septum kolinerg afferentációjának szerepét hangsúlyozza továbbá, hogy ingerlése facilitálja a szinaptikus plaszticitással összefüggésben mérhető elektrofiziológiai jeleket [78], másrészt a medialis septum kolinerg sejtjeinek szelektív pusztítása után zavart szenved az LTP kiváltása és a glutamáterg transzmisszió [79].
9
A hippocampus-függő magatartástesztekben jellemzően csökkenthető a teljesítmény szisztémásan, intrahippocampalisan vagy intraseptalisan adott AChR antagonistákkal [72,80]. Érdekes azonban, hogy intrahippocampalis és intraseptalis beadás esetén AChR agonistákkal is előidézhető a memóriazavar, ami arra utal, hogy a memóriafolyamatok normális működése nem feltétlenül magas, hanem inkább egy optimális hippocampalis ACh-szintet igényel [72,75]. A jelenség alátámasztja a hipotézist, miszerint a hippocampus-nak különböző működési állapotai vannak, melyek közötti váltást alapvetően meghatározzák a kolinerg afferensek és a hippocampalis ACh-szint [75,81]. Eszerint a hippocampus-t a magas ACh-szint (ami leginkább az ébrenlétre jellemző) nyitja a corticalis bemeneteken érkező új információk előtt, így a hálózatot a kódolás „munkafázisába” állítja be, míg az emléknyomok konszolidációja alacsony kolinerg aktivitás mellett (pl. lassú-hullámú alvás), a belső reverberáló körök nagyobb aktivitásával történik [81,82]. Ezen a ponton összefüggést fedezhetünk fel a neocorticalis kolinerg moduláció figyelemhez kapcsolódó hatásai és a hippocampalis szabályozás között: mindkét funkciót (figyelem és kódolás) új stimulusok, információk felismerése hajtja. Jó példa a kolinerg innerváció meghatározó szerepére a memórianyomok kialakulásának fázisaiban az a megfigyelés, miszerint az acetilkolin-észteráz (AChE) blokkoló farmakonok – melyek hatékonynak bizonyultak memóriazavarok enyhítésére – éppen ellentétes hatást váltanak ki, ha alvás előtt veszik be. Tehát ha alvási periódusban, amikor alacsony kolinerg tónusra van szükség, mesterségesen megnöveljük az agyban az ACh szintjét, akkor a memóriateljesítmény romlani fog, feltehetőleg az alvás alatti konszolidációs folyamat gátlásának következtében [83]. A kolinerg projekciónak fontos szerepet tulajdonítanak a hippocampus oszcillációs aktivitásában, ami feltehetőleg órajel-funkcióval bír az információk feldolgozásában a neuronok kommunikációjának időbeli rendezésében. Két fontos viselkedésfüggő oszcillációt kell itt megemlítenünk: a théta-hullám (6-9 Hz) az explorációs viselkedés és REM alvás során jelentkezik, míg a lassú-hullámú alvás és automatikus viselkedések alatt egy irreguláris elektromos aktivitást lehet megfigyelni, amit nagy amlitudójú, 50-120 ms hosszú szinkronizált kisülések szakítanak meg (éles hullám, angolul: sharp-wave ripple) [84,85]. Buzsáki (1989) [86] elmélete szerint a théta-aktivitás alatt történhet az új információk reprezentációja a hippocampus-ban, majd az ezt követő pihenési szakaszokban az éles hullámok vésik be az új információt a memóriába. Így az éles hullámok az asszociatív LTP fiziológiás megfelelői lehetnek, hiszen ezek is nagy intenzitású és nagy frekvenciás sorozat-kisülések, melyeket a CA3 piramissejtjei generálnak a CA1-be futó rostokon. Az éber állapotban elvezethető théta-oszcilláció azonban összefüggésben lehet a kódolás és az előhívás folyamatainak ritmusos váltakozásával is: eszerint a théta-
10
ritmus megadott fázisában a kódolásban, míg az ellentétes fázisban az előhívásban szerepet játszó neuronális kapcsolatok aktívak [75]. A théta-ritmus fenntartásában úgy tűnik, kulcsszerepük van a septalis magoknak, mind a kolinerg, mind a GABAerg projekcióknak, mégpedig a piramissejtek és a különféle interneuronok eltérő modulációján keresztül [87–90]. A medialis septum és a diagonális sáv neuronjai ritmikus sorozattüzelési aktivitást mutatnak [91], a hippocampus-ban pedig a thétaritmusos oszcilláció mind a septalis neuronok ingerlésével, mind kolinerg agonisták illetve kognitív serkentőként ismeretes AChE gátlók lokális beadásával előidézhető illetve erősíthető [90,92–94]. Muszkarinos AChR antagonista szkopolamin beadása, illetve a septalis magok léziója ugyanakkor gátolja, illetve megszünteti a théta-aktivitást [95]. A théta-oszcilláció, a kolinerg moduláció és a hippocampalis hálózat „üzemmódjai” közötti összefüggésre világítanak rá azok az elektrofiziológiai módszerek is, melyekben szimultán elvezetett lokális mezőpotenciálok és egysejt-aktivitás egymáshoz való időbeli viszonyait, vagyis a neuronok tüzelésének fázis-zártságát vizsgálják. Douchamps és mtsai (2013) [96] patkányok explorációs viselkedése közben a CA1-es területről elvezetett neuronális aktivitásból kimutatták, hogy a helysejtek új környezetben (kódolás) a théta-hullám csúcsához időben közelebb tüzelnek, míg ismerős környezetben (előhívás) a sejtaktivitás inkább a théta-oszcilláció hullámvölgyéhez zárt. Szkopolamin adása esetén az új környezetben tapasztalható rendezett tüzelési mintázat felborul, azonban az előhívásra jellemző fázis-zártsági mintázatot kevésbé zavarja meg a kolinerg antagonista [97]. 1.4.2. A kolinerg neurotranszmisszió zavarai Alzheimer-kórban A kolinerg neurotranszmisszió zavarainak olyan nagy jelentőséget tulajdonítanak, ami arra késztetett egyes kutatókat, hogy megalkossák a betegség hátterének kolinerg hipotézisét [98]. Az egyik legszembetűnőbb változás AD-ban a Meynert-mag kolinerg sejtjeinek szelektív pusztulása [99]. Másrészt az ACh-anyagcserében résztvevő enzimek (AChE, kolin-acil-transzferáz: ChAT) aktivitását alacsonyabbnak találták AD-os betegek neocortexében és hippocampusában, miközben más transzmitterekhez köthető enzimek szintje nem változott jelentősen, ami a memóriával kapcsolatba hozható agyterületek kolinerg bemeneteinek szelektív deficitjére utal [100]. Érdekes módon finomabb vizsgálatokkal kimutatták, hogy a ChAT aktivitása eleinte – az AD-t gyakran megelőző enyhe kognitív zavarban – növekszik a hippocampus-ban, majd visszaesik, és a plakkok kialakulásával korrelálva fokozatosan csökken az AD progressziója során [101]. Fenti elváltozások időbeli sorrendjéből arra következtettek, hogy a Meynert-mag léziója másodlagos a kolinerg aktivitás csökkenéséhez képest, tehát egy retrográd degeneráció zajlik le az AD patogenezise során [61,102]. Az AD során az ACh receptoraival kapcsolatos 11
változások is megfigyelhetők: a mAChR-ok közül az M1 és M2 típusúak ligandkötése csökken a frontális kéregben, míg az M4 típusúak esetén magasabb ligandkötődés figyelhető meg [103]. Az M1, M2 és M4 mAChR-ok denzitása a hippocampus-ban is megváltozik [104]. A nAChRok közül az α7 típusú ligandkötése csökkent a hippocampus-ban, míg az α4β2 típusú receptorokon a temporális cortexben a frontális kéregben, a striatumban és a hídban találtak csökkent ligandkötődést AD-ban [61]. A nAChR-ok ligandkötése az AD korai stádiumában korrelál a figyelem zavarával [105]. Érdekes továbbá, hogy a neuronokkal ellentétben az asztrocitákon megnő az α7 nAChR-ok száma, és ez a növekedés korrelál a plakkok számával [106]. Érdemes megemlíteni továbbá, hogy csökkent mértékű kötődés mutatható ki α7 nAChR-okhoz skizofréniás betegek agyának thalamicus, neocorticalis és hippocampalis területein is, ami összefügghet az érzékelés, a figyelem, illetve más kognitív funkciók zavarával [107–109]. 1.5. Neurokognitív zavarok állatkísérletes modellezése Minthogy az AD és más kognitív hanyatlással járó betegségek napjaink és közeljövőnk legnagyobb népegészségügyi problémái közé tartoznak, ezért kiemelt fontosságú a jelenleg rendelkezésre álló kezelési módok fejlesztése, illetve az új gyógyszerjelöltek (vagy nem-farmakológiai kezelések) megfelelő tesztelése. Mindkét cél érdekében a betegség etiológiáját, patofiziológiáját, tüneteit és gyógyszerekre való érzékenységét jól utánzó [110], alacsony költségű, jól hozzáférhető és sok adatot szolgáltató preklinikai állatmodellek fejlesztésére van szükség. A legtöbb, jelenleg elérhető demencia-modellről elmondható, hogy a fenti kritériumok öszszességét nem képesek teljesíteni, azonban adott célokra vagy egy adott kérdéskör kutatásához megfelelőnek bizonyultak. A kognitív zavarok illetve az AD kutatásában használatos rágcsálómodellek között megkülönböztethetünk spontán, genetikailag módosított és léziós modelleket, valamint más kóros állapotokkal kiváltott illetve farmakonokkal vagy toxinokkal indukált neurokognitív deficiteket hordozó állatokat. Spontán modellként szolgálhatnak öregedési rágcsáló-modellek, melyek közül szelektálhatóak memória-deficitet mutató csoportok [111], azonban az AD jellegzetes hisztopatológiája nem jelenik meg rágcsálókban spontán módon [110]. A transzgenikus AD-modelleket rendszerint valamely, az AD-ral korrelációt mutató, illetve kóros amiloid-plakk képződést okozó humán gén beültetésével hozták létre (alapos összehasonlításukat ld. Van Dam és De Deyn (2006) összefoglalójában [110]). Így számos transzgenikus egértörzs familiális AD-ban azonosított mutációkat tartalmaz az APP vagy a preszenilin (PSEN) génjében: mindkét gén mutációja kóros Aβ fragment-képződéssel és több-kevesebb kognitív tünettel jár. Az AD patofiziológiáját részben utánozzák tehát ezek a modellek, azonban NFT-ek képződése nem kíséri sem az APP, sem a PSEN gén mutációit. Ezért hozták létre a tripla-mutáns egereket, melyek a tau fehérje génjében is mutációt hordoznak, így a taupátia is 12
megjelenik bennük számos további AD-ra jellemző tünettel együtt. Azonban az említett gének mutációi az AD familiális illetve fiatal-kori változataira jellemzőek, melyek az összes megbetegedésnek csak kis hányadát teszik ki. A léziós modelleket rendszerint valamely kolinerg központ (septum vagy a Meynert-magnak megfelelő nucleus basalis magnocellularis) vagy a kognitív működésekben szerepet játszó agyterületek (hippocampus, entorhinalis cortex, amygdala) elektrolitikus, neurotoxikus vagy mechanikai irtásával hozzák létre [112,113]. Egyes immunotoxinok beadásával (pl. 192 IgGsaporin) továbbá a kolinerg neuronok szelektív léziója érhető el [114,115]. Mindezek a léziós modellek az AD-ra jellemző kognitív deficiteket – illetve egyesek a kolinerg deficitet – reprodukálják ugyan, etiológiai és patofiziológiai szempontból azonban nem jól utánozzák az AD-t. Az AD etiológiájának illetve patogenezisének jobb megértéséhez is hasznosak lehetnek azok a modellek, melyekben a kognitív zavarok más, mesterségesen kiváltott betegségekhez társulnak. Ezekben a modellekben olyan kóros állapotokat indukálnak a kísérleti állatokban, melyek gyakran feltűnnek AD-os betegek kórelőzményében, mint például ismételt traumás agysérülések, kardiovaszkuláris betegségek, illetve elhízás, diabétesz és (agyi) gyulladásos folyamatok. Traumás agysérülések súlyos akut következményekkel járnak, ugyanakkor hosszabb távú neurodegeneratív folyamatokat indíthatnak, és már a sérüléstől számított néhány órán belül amiloid-plakkok jelennek meg [116]. Ismételt enyhe koponyatraumákkal az AD-hoz hasonló elváltozások hozhatók létre rágcsálókban [117], a traumás modellek továbbá jól reagálnak kognitív serkentő vegyületekre [118]. Az AD kezdeti stádiumát illetve az enyhe kognitív zavar egyes formáit jól modellezhetik a spontán hipertenzív patkányok (SHR), melyekben a magas vérnyomás következtében olyan agyi elváltozások alakulnak ki, mint asztrogliózis, hippocampalis atrófia és kolinerg deficitek. Az SHR-ok kb. 12 hónapos koruktól viszonylag kis mértékű teljesítmény-romlást mutatnak a kognitív tesztekben a kontroll csoportokhoz képest, ami megelőzhető a vérnyomás csökkentésével és kognitív serkentőkkel is [119]. További, keringési eredetű károsodásokkal járó rágcsáló-modellek az agyi hipoperfúziós modellek, melyeket az agyat ellátó nagyerek vagy kisebb agyi artériák krónikus vagy rövid-idejű elzárásával váltanak ki. A beavatkozások következtében a kognitív deficit mellett számos, AD-ra is jellemző agyi elváltozás alakul ki, mint például az APP mRNS expressziójának fokozódása [120], a kolinerg neurotranszmisszióban beállt változások [121], agyi metabolikus zavarok [122] valamint kiterjedt fehérállományi léziók és gliaproliferáció [123].
13
A fentiekben már említett elhízás, diabétesz és gyulladásos állapotok egymással összefüggő kóros folyamatok, melyek az AD kockázatát is jelentősen növelik [30,124–126]. Emiatt potenciális, jó etiológiai validitással rendelkező állatmodelljei lehetnek az AD-nak például diabéteszre hajlamos rágcsáló-törzsek és/vagy magas zsírtartalmú étrenden tartott állatok [127,128]. Egyes esetekben a kóros tau fehérjék mRNS-ének megnövekedett expresszióját is megfigyelték a térbeli memóriadeficitek mellett ilyen metabolikus eredetű betegségmodellekben [129]. Agyi inzulin-rezisztencia és egyéb metabolikus zavarok létrehozhatóak továbbá farmakológiai úton is streptozotocin (STZ) intracerebroventrikuláris (ICV) beadásával [130], ami szintén kognitív hanyatlással jár [131,132]. A lokális STZ-injekcióval kiváltott egérmodell számos hasonlóságot mutat a tripla-mutáns 3xTg-AD transzgénikus egértörzs patológiájával (gyulladásos folyamatok, szinaptikus és szignál-transzdukciós elváltozások, kóros tau) [133]. Az AD-ra jellemző patofiziológiai jelenségek és kognitív tünetek utánozhatóak továbbá agyi gyulladásos folyamatok farmakológiai indukálásával is, ami bakteriális endotoxinok (lipopoliszacharidok) illetve gyulladásos citokinek lokális infúziójával történhet [134,135]. Amiloid-plakkok kialakulását és memóriazavart eredményező toxicitás érhető el ugyanakkor nem-transzgenikus rágycsálótörzsekben megfelelő Aβ-fragmentumok ICV infúziójával is [136]. A magatartás-farmakológiai vizsgálatokban különleges népszerűségnek örvendenek a farmakológiai úton kiváltott tranziens amnézia-modellek (összefoglalók a témában: [137–139]), annak ellenére, hogy a konkrét betegségek (pl. AD) egyedi jellegzetességeit és patomechanizmusát nem utánozzák. Ugyanakkor reverzibilis, olcsó és egyszerű metódussal váltható ki velük memóriazavar, ami lehetőséget ad a neurotranszmitter-rendszerek deficitjének viszonylag szelektív vizsgálatára, és a kognitív serkentő farmakonok hatásosságának tesztelésére. A tranziens amnéziát leggyakrabban antagonisták szisztémás vagy centrális beadásával váltják ki, melyek a mAChR-okat, különböző nAChR-okat vagy a NMDAR-okat blokkolják. A szkopolamin-modell használatát indokolják azon széleskörű fiziológiai adatok, melyek a mAChR-ok memóriával összefüggő agyterületek (pl. hippocampus, PFC) működésében betöltött kritikus szerepére utalnak [76,140]. A szkopolamin a laboratóriumi állatfajok széles skálájában (egér, patkány, majom) és számos különböző magatartás-tesztben bizonyult hatékonynak a kognitív teljesítmény csökkentésére, többek közt egerek spontán alternálásos tesztparadigmájában [141], patkányok passzív elhárításos és különböző stimulus-diszkriminációs illetve térbeli memória-tesztjeiben [142–144], valamint majmok késleltetett mintafelismerési tesztjében [144]. A szkopolamin sok tekintetben hasonló kognitív zavarokat képes előidézni emberben is, mint amelyek AD-os betegek esetén mérhetőek, azonban nem képes az AD-ra jellemző kognitív tünetek teljes skáláját reprodukálni [145,146]. Hasonlóságok fedezhetők fel szkopolaminnal 14
kezelt egészséges személyek és AD-os betegek elektroenkefalográfiás (EEG) mérései során is: szkopolamin beadása után hasonló változások figyelhetőek meg a delta, theta és alfa aktivitások egymáshoz viszonyított arányában, és a vizuális kiváltott válaszokban, mint AD esetén [145]. Ezek a jellegzetes EEG változások patkányban is megfigyelhetőek a szkopolamin által kiváltott teljesítménycsökkenéssel párhuzamosan [143]. A szkopolamin-amnéziának mint a kolinerg hipotézisen alapuló AD-modellnek a kritikája azonban, hogy a farmakon feltételezhetően sem a befolyásolt neurotranszmitter-rendszerek tekintetében, sem pedig a magatartási hatások tekintetében nem szelektív. Továbbá feltételezik, hogy a kolinerg rendszer blokkolása elsősorban közvetett úton – az éberség, a figyelem és a motiváció módosításával – csökkenti a memóriateljesítményt, közvetlen hatása a memória-rendszerekre ennél jóval kisebb [143,147–149]. Mint láthattuk, az AD-ban és skizofréniában is jelentős csökkenés áll be a nAChR-ok denzitásában a memóriával összefüggő területeken (összefoglalók a témában: [61,109]), ezért nikotinos típusú antagonisták használata is alkalmas lehet a betegség farmakológiai modellezésére. A nikotinos modelleket lényegesen ritkábban alkalmazzák, mint a szkopolamin-modellt, azonban mind a nem-szelektív nAChR antagonista mekamilamin (MEC), mind a szelektív α4β2 receptor antagonista dihidro-béta-eritroidin (DHβE) és az α7 nAChR antagonista metil-akonitin (MLA) csökkenti a kísérleti állatok teljesítményét bizonyos kognitív tesztekben. A MEC releváns dózisa rontja a rágcsálók teljesítményét a Morris-féle víziútvesztőben, a 16-karú radiális labirintusban és egy késleltetett mintafelismerési tesztben, azonban sok más magatartás-tesztben csak nagyon magas dózisokban vagy egyáltalán nem mutattak ki hatást (pl. spontán alternálási tesztben) [150]. Mindkét szelektív antagonista (DHβE, MLA) csökkenti a teljesítményt a 8- illetve 16-karú radiális labirintusok munkamemóriát tesztelő paradigmáiban, továbbá a DHβE a referencia-memóriát mérő paraméterekben is rontotta a teljesítményt. A DHβE továbbá a víziútvesztőben [151] és egy kontextuális félelem-kondícionálási paradigmában is befolyásolta a kognitív teljesítményt [152], míg a MLA a spontán alternálási paradigmában mérhető térbeli munkamemória-zavart idéz elő [80]. Utóbbi kutatásban a MLA hatékonyságát és az AD kezelésére törzskönyvezett gyógyszerekre való érzékenységét hasonlították össze a szkopolamin-modellel, és ebben a paradigmában a MLA-val kiváltott amnézia jobbnak bizonyult az AD modellezésére. Összességében tehát elmondható, hogy a nAChR-ok farmakológiai blokkolása nem hoz létre olyan általános, minden tesztben mérhető kognitív deficitet, mint a szkopolamin, azonban egyúttal lehetőséget biztosítanak a kognitív domének szelektívebb vizsgálatára, feltehetően kevesebb mellékhatással járnak és az AD farmakológiai érzékenységét jobban utánozzák.
15
Az NMDAR-ok LTP-ben betöltött szerepét tekintve nem meglepő, hogy ezeknek a receptoroknak a blokkolása is alkalmas lehet memória-deficitek modellezésére (összefoglaló a témában: [139]), amint azt Morris és mtsai (1986) is demonstrálták az 2-amino-5-foszfono-valeriánsav (AP5) nevű NMDAR antagonistával a víziútvesztőben [46]. További NMDAR antagonisták szintén hatékonynak bizonyultak memória-zavarok állatkísérletes kiváltására, mint például az MK-801 [153], a fenciklidin (PCP) [154] és a ketamin [155,156]. Az NMDAR antagonistákat ugyanakkor gyakran a skizofréniához kötődő kognitív zavarok modelljének tekintik [157], ugyanis egyesek közülük (PCP, ketamin) a skizofréniának mind pozitív, mind negatív tüneteit képesek utánozni [158]. A PCP és a ketamin nem csak a kísérleti állatokban, hanem emberekben is pszichotikus és kognitív tüneteket váltanak ki [159,160], és krónikus változásokat is okozhatnak [161]. A pozitív tüneteket az is magyarázhatja, hogy a PCP és a ketamin az NMDAR antagonizmus mellett egyéb támadáspontokkal is rendelkezik, többek között a dopaminerg rendszerben [162,163]. Az MK-801 azonban viszonylag jó szelektivitással rendelkezik NMDAR-okra [164], ezért elsősorban kognitív tünetek válthatóak ki vele [165]. A MK-801-gyel kiváltott memória-deficit se mentes azonban olyan mellékhatásoktól, mint például a hiperlokomoció [166], ami a NMDAR-ok antagonizmusának monoaminerg transzmiszszióban megnyilvánuló indirekt hatására alakulhat ki [167,168]. 1.6. Kognitív zavarok gyógyszeres kezelése és az α7 nAChR, mint potenciális új célpont Az AD kezelésében napjainkig törzskönyvezett gyógyszerek két csoportba sorolhatók: AChE blokkolók (takrin, donepezil, rivastigmin, galantamin) illetve nem-kompetitív NMDAR antagonisták (memantin) – mindkét vegyületcsoport elsősorban tüneti kezelésre szolgál. Az AChE blokkolók a kolinerg hipotézis elvén alapulnak, alkalmazásuk célja a csökkent ACh szint ellensúlyozása a lebomlás lassításával [169,170]. Azonban egyre több eredmény utal arra, hogy az AChE gátlók hatással lehetnek a betegség progressziójára is (öszefoglalóként ld.: [171]), mivel enyhítik az APP kóros metabolizmusát illetve a tau-foszforilációt, gátolják a plakk-képződést és javítják a regionális vérátáramlást és a glükóz-felhasználást az agyban. Az AChE gátlókat enyhe és középsúlyos AD-ban ajánlott adni, a klinikai vizsgálatok alapján dózisfüggő javulást idéznek elő a kognitív tesztekben a placebo csoporthoz képest, és megfelelően nagy dózisban alkalmazva jelentős mértékben lassítják a kognitív hanyatlást [172]. A hétköznapi élet minőségére vonatkozó mérőszámok azonban bizonytalanabb eredményeket mutatnak a kezelés hatékonyságát illetően, valamint egyes vegyületek esetén a megfelelően magas dózist csak kis százalékban tolerálják a betegek. Másik komoly probléma az AChE blokkolókkal, hogy csak ideiglenes hatékonysággal rendelkeznek, ami a kezelés előrehaladtával a szervezet AChE termelésének adaptációja miatt csökken, és egyes mérések szerint két év után már bizonytalan a 16
terápia hatásossága [171]. Az AChE blokkolók számos preklinikai állatmodellben és magatartási paradigmában is hatékonynak bizonyulnak, ami validálja a preklinikai tesztelési módszereket (fordított transzláció) [80,141,143,173,174]. A NMDAR antagonista memantint középsúlyos és súlyos AD-ban szenvedők kezelésére törzskönyvezték, és a klinikai vizsgálatok alapján AD-os betegek kognitív képességeire, és hétköznapi aktivitására is jelentős pozitív hatással van [175]. A memantin is hatásosan fordítja vissza a kognitív tüneteket az AD különböző állatmodelljeiben és rágcsálók kognitív tesztjeiben [80,174,176,177], bár egészséges állatokban magas dózisokkal ezzel ellentétes hatások is kiválthatók [178]. A memantin hatásmechanizmusa nem teljesen ismert, de több hipotézis is létezik arra vonatkozóan, hogy az NMDAR-ok antagonizmusa milyen úton képes a memóriát javítani. Az egyik, leginkább megalapozott nézet szerint a memantin a Mg2+ ionokhoz hasonló, feszültség-függő módon blokkolja az NMDAR-ok működését, és nyugalmi helyzetben nem engedi létrejönni a NMDAR-ok kóros, tónusos aktivációját. Megfelelő membránpotenciál-változás esetén azonban – a Mg2+-hoz hasonlóan – a memantine leválik a szinaptikus NMDARokról, így létrejöhet a LTP (fiziológiás aktiváció). A kóros aktiváció gátlásával így a fiziológiás aktiváció „jel/zaj arányát” erősíti, ami elősegíti a releváns jelek hatására létrejövő szinaptikus plaszticitást [60,175]. A feltételezést erősítik azok az eredmények, miszerint az NMDAR túlaktiválása gátolja a LTP-t és rontja a tanulási teljesítményt, ugyanakkor ezek a hatások NMDAR antagonistákkal visszafordíthatók [179,180]. A memantin továbbá több AD-modellben is neuroprotektív hatásúnak bizonyult, ami alapján feltételezhető, hogy a tünetek javítása mellett a betegség progresszióját is befolyásolhatja [181]. A gyógyszerfejlesztés fontos célja potenciális új farmakológiai támadáspontok azonosítása és tesztelése: az AD kezelésében felmerülnek például különféle receptorokon, enzimeken (monoamin-oxidáz, szekretázok) illetve növekedési faktorokon ható farmakonok, valamint mikroRNS-ek illetve tau-val és Aβ-val kölcsönhatásba lépő molekulák, vakcinák, antitestek (áttekintésként ld. Froestl és mtsai (2013) összefoglalóit: [182–184]). A potenciális új farmakonok közül különösen sokat kutatják az α7 nAChR-on ható agonistákat és allosztérikus modulátorokat [185], témánk szempontjából a továbbiakban ezekre összpontosítunk. Az elmúlt években számos α7 nAChR agonistát fejlesztettek ki, melyek közül egyelőre nem jutott el egy sem a gyógyszerként való törzskönyvezésig, azonban preklinikai vizsgálatokban jó kognitív serkentő potenciállal rendelkeznek (megjegyzendő, hogy bár a galantamin elsősorban AChE inhibitor, de ismert az α7 nAChR-okhoz való affinitása is [186]). Az α7 nAChR agonisták preklinikai állatmodellekben mutatott hatékonyságát tekinti át Wallace és Porter (2011) összefoglalója [185]. Számos eredmény támasztja alá például, hogy az α7 nAChR 17
agonisták és allosztérikus modulátorok javítják a rágcsálók kognitív teljesítményét az új tárgy felismerési (NOR) tesztben és annak szociális, fajtársfelismerési változatában [187–189]. Az α7 nAChR-ok aktiválása javítja továbbá a hippocampus-függő térbeli memóriát olyan paradigmákban, mint például az Y-labirintusban végzett alternálási feladat [190], különböző radiális labirintus tesztek [191,192] és a Morris-féle vízilabirintus [189,193]. Nem csak különböző magatartási tesztekben, de különféle állatmodellekben is hatásosnak bizonyultak az α7 nAChR ligandok úgy, mint a természetes felejtés modelljében [187], szkopolaminnal, MK-801-el vagy PCP-vel kiváltott tranziens amnéziában [188,194], fimbria-fornix léziós modellben [191] illetve idős patkányokban [192]. Annak ellenére, hogy az α7 nAChR agonistákat is elsősorban a kognitív tünetek enyhítésére fejlesztik, kimutatták nikotinhoz hasonló neuroprotektív hatásukat is, így elképzelhető, hogy ilyen támadáspontú gyógyszerek a jövőben alkalmasak lehetnek a neurodegeneratív folyamatok lassítására is [195]. Megjegyzendő, hogy az α7 nAChR aktiválása az AD mellett a skizofréniában is hatékony stratégia lehet a tünetek enyhítésére, hiszen skizofréniában is megfigyelhető az α7 nAChR-ok kisebb előfordulása az agy különböző területein [107–109]. A preklinikai állatkísérletek is megerősítik, hogy az α7 nAChR agonisták a kognitív tünetek mellett visszafordítják a skizofréniában jellemző deficitet a szenzoros kapuzásban, valamint hatékonyak a skizofréniához hasonló tüneteket produkáló állatmodellekben [193,196–198]. Az α7 nAChR-okon ható farmakonok tehát közös pontot is jelenthetnek a jövőben a neurodegeneratív betegségek és a skizofrénia kezelésében. Számos, állatkísérletekben hatékonynak bizonyult α7 nAChR agonistával végeztek klinikai próbákat, jelenleg az EVP-6124-et a klinikai próbák 3. fázisában vizsgálják mint potenciális AD- illetve skizofrénia-gyógyszert. Több, kereskedelmi forgalomban kutatási célra hozzáférhető vegyületet – mint pl. a kísérleteinkben használt PHA-543613 – kardiovaszkuláris mellékhatások miatt kellett kizárni a lehetséges gyógyszerek közül [199]. Az α7 nAChR-okat aktiváló farmakonok kognitív serkentő potenciálja mögötti hatásmechanizmusok még nem teljesen ismertek, azonban sok információval rendelkezünk ezen receptorok lokalizációjáról és működéséről. Figyelemre méltó tulajdonságuk, hogy különösen nagy számban expresszálódnak kognitív funkciókhoz (memória, figyelem) kötődő agyterületeken (hippocampus, neocortex, Meynert mag), valamint emberben jelentős az előfordulásuk a thalamus retikuláris magjában is, ami a szenzoros kapuzásban betöltött szerepével függhet öszsze [200,201]. A neuronokon való elhelyezkedés tekintetében meg kell jegyeznünk, hogy a kolinerg transzmisszió a központi idegrendszerben leginkább nem-szinaptikus módon történik [202], azonban az α7 nAChR-ok nagy számban előfordulnak preszinaptikusan és posztszinaptikusan is (részletesebben ld. Dani és Bertrand (2007) összefoglalójában [203]). A 18
glutamáterg, GABAerg, monoaminerg és egyéb terminálisokon elhelyezkedő preszinaptikus α7 nAChR-ok valószínűleg a transzmitter-ürülés szabályozásával vehetnek részt a neuronális működésben és a kognitív folyamatok modulációjában [204–206], míg a poszt- illetve extraszinaptikus receptorok megfelelő időablakban történő aktiválása többek között az LTPhez szükséges membránpotenciál beállításával (permisszív szerep), valamint magas Ca2+permeabilitásának köszönhetően intracelluláris jelátviteli útvonalak modulálásával járulhat hozzá a szinaptikus plaszticitáshoz [200,207,208]. Az α7 nAChR speciális tulajdonsága, hogy agonista kötődését követően rendkívül gyorsan (<100 ms) deszenzitizálódik, vagyis ideiglenesen inaktív állapotba kerül [209]. A deszenzitizációs tulajdonságnak nagy szerepe lehet az ACh különböző receptorokon kifejtett hatásainak interakciójában [210], valamint magyarázatot adhat az α7 nAChR agonistákra jellemző fordított U-alakú dózis-hatás görbére [185,211]. Fenti receptormechanizmusok közül nem teljesen tisztázott, hogy melyik folyamat milyen mértékben játszik szerepet az α7 nAChR agonisták magatartás-tesztekben tapasztalt kognitív serkentő hatásában. Kísérleteink során mi a kolinerg és a glutamáterg neurotranszmisszió interakcióit vizsgáltuk a magatartási hatások szintjén különböző (kolinerg és glutamáterg) eredetű farmakológiai
amnézia-modellekben,
valamint
elektrofiziológiai
kísérletekben
a
hippocampalis neuronok tüzelési mintázatára kifejtett hatásokon keresztül.
19
2.
CÉLKITŰZÉSEK A glutamáterg és a kolinerg neurotranszmisszió tehát számos ponton kapcsolódik a kognitív
működésekhez, valamint mindkét rendszer jelentős zavart szenved AD-ban. Mindezek a tények arra utalnak, hogy a kognitív képességek megfelelő működésében kritikus szerepet tölthet be a két transzmitter-rendszer interakciója is, ami az α7 nAChR agonisták elsődleges célpontja lehet. Az α7 nAChR glutamáterg transzmisszióban betöltött szerepének feltárása a gyógyszerfejlesztés irányának meghatározásához is hasznos információkat adhat, továbbá a kognitív hatások hátterében azonosított fiziológiai jelenségek markerként is szolgálhatnak új farmakonok előválogatásához. Kutatásunkban a hippocampus-függő folyamatokra fókuszáltunk, és az alábbi célokat tűztük ki: I. Megvizsgálni egy α7 nAChR agonista (PHA-543613) kognitív teljesítményt növelő hatását patkányok jutalmazás nélküli, hippocampus-függő térbeli munkamemória-tesztjében. II. Vizsgálni, hogy a kolinerg illetve glutamáterg transzmitter-rendszerekben beállt zavarok hogyan befolyásolják az α7 nAChR agonista hatékonyságát két különböző támadáspontú (mAChR antagonista szkopolaminnal illetve NMDAR antagonista MK-801-el kiváltott) farmakológiai amnézia-modellben. III. Az α7 nAChR agonista prokognitív hatásainak magatartás-tesztekben történő kimutatása után célul tűztük ki az α7 nAChR-ok memóriában betöltött fiziológiai szerepének és funkciójuk glutamáterg neurotranszmisszióval való összefüggéseinek vizsgálatát is. Ennek érdekében elektrofiziológiai kísérletekben in vivo vizsgáltuk a hippocampus CA1-régió piramissejtek rétegében a neuronok glutamáterg és kolinerg neurotranszmisszióval összefüggő aktivitását. Elektrofiziológiai kísérleteinkben az alábbi lépéseket határoztuk meg: 1. Optimalizálni egycsatornás, mikroiontoforézissel kombinált elvezetési technikánkat a hippocampalis piramissejtek és interneuronok megbízható elkülönítése érdekében. 2. Megvizsgálni az NMDA és az ACh lokális hatásait a piramissejtek tüzelésére. 3. Vizsgálni a glutamáterg és kolinerg neurotranszmisszió interakcióját a piramissejtek tüzelésének modulációjában az NMDA és az ACh kombinált iontoforézisével. 4. Megállapítani a különböző AChR-ok szerepét az NMDA és az ACh önálló és kombinált hatásaiban, illetve a két transzmitter-rendszer kölcsönhatásában. IV. Elektrofiziológiai kísérleteink eredményei alapján modell alkotása a vizsgált farmakonok magatartás kísérletekben tapasztalt kognitív hatásainak mechanizmusára vonatkozóan. 20
3.
ANYAG ÉS MÓDSZER
3.1. Az
α7
nAChR
agonista
PHA-543613
hatásainak
vizsgálata
a
térbeli
munkamemóriára két különböző farmakológiai amnézia-modellben Magartartás-farmakológiai kísérleteinkben az α7 nAChR agonista PHA-543613 hatásait vizsgáltuk patkányok spontán alternálási viselkedésére. A spontán alternálási teszt a rágcsálók természetes explorációs viselkedését használja ki, ezért nincs szükség a kísérlet során jutalom alkalmazására. A patkányok a labirintus optimális felderítése, valamint lehetséges élelemforrások illetve menedék keresése során alternálásos stratégiát használnak, ami azt jelenti, hogy a Tlabirintus különböző karjait (célkar –„goal arm”) felváltva (alternálva) keresik fel az egymás utáni próbák során. A próbák között megfelelő hosszúságú késleltetést alkalmazva lehetővé válik az állatok térbeli munkamemóriájának a vizsgálata, ami többek között a hippocampus megfelelő működését is feltételezi. 3.1.1. Kísérleti állatok Spontán alternálási kísérleteinkben hím Wistar patkányokat használtunk, melyek a kísérletek kezdetén 335-475 gramm közötti tömeggel rendelkeztek, és 5-12 hónaposak voltak. Az állatok egyesével voltak tartva az állatházban annak érdekében, hogy lehetővé váljon pontosan beállított mennyiségű táppal való élelmezésük. A patkányok naponta kb. 16 gramm standard laboratóriumi tápot fogyasztottak, így testtömegüket – az ad libitum tápláláshoz képest – kb. 80-85%os szinten tudtuk tartani, ami lehetővé tette az elhízás megakadályozását, valamint megfelelő és egyenletes motivációs állapot fenntartását a kísérletek során. Vizet ad libitum fogyaszthattak az állatok, az állatházban szabályozott hőmérséklet és páratartalom uralkodott, a nappal/éjszaka ciklus 12-12 órás szakaszokból állt (7:00-19:00-ig tartott a világos periódus). Kísérleteinket és az állatok tartását a hatályos hazai és nemzetközi állatvédelmi szabályozásokban előírtak figyelembevételével végeztük (40/2013. (II. 14.) Kormányrendelet illetve 2010/63/EU direktíva). 3.1.2. T-labirintus apparátus A spontán alternálási kísérleteket T-labirintusban végeztük, melynek elkészítésében Deacon és Rawlins (2006) tanulmányában leírtakat követtük [15]. Az apparátus a következő méretekkel rendelkezett (hossz × szélesség × magasság, centiméterben): start kar – 50 × 16 × 30; célkarok (egyenként) – 50 × 10 × 30 (1. ábra, B). A két célkar között, a start kar szélességének felénél egy vékony középső elválasztó falat helyeztünk be, ami megakadályozta egyik célkarból a másikba történő közvetlen átjutást. A középső elválasztó elem végénél a start kart lezáró csapóajtó került elhelyezésre, ami lehetővé tette a patkány visszatartását a start helyen két próba között. 21
Az apparátus falai bútorlapból készültek és fekete fóliával lettek bevonva, az apparátust gyenge fénnyel világítottuk meg, a külső zajok zavaró hatásának kizárására fehér zajt alkalmaztunk.
A)
B)
1. ábra: A spontán alternálási paradigma (A), illetve a T-labirintus alaprajza (B; részletek a szövegben)
3.1.3. Kísérleti protokoll A spontán alternációs tesztprotokollban többnyire Spowart-Manning és van der Staay (2004) [141] által közölt protokollt követtük csekély módosításokkal (1. ábra, A). Az állatok a kísérleti ülés elején a start karba voltak behelyezve zárt csapóajtók mellett. Az első próba a csapóajtó felnyitásával kezdődött, a patkány az első próbában is szabadon választhatott a két célkar közül. Amennyiben négy lábbal belépett valamelyik célkarba (jobb/bal), feljegyeztük a választott kart, és megvártuk, hogy az állat önként visszatérjen a start pozícióba, majd a start karban történő rövid visszatartás után (10 s) a patkány újabb próbát kezdhetett. 1-1 próba időtartamát 2 percben maximáltuk, ha ez idő alatt nem tért vissza az állat a startra, akkor enyhe lökésekkel lett a célkar elhagyására ösztönözve. Egy ülés maximum 25 percig tartott, azonban előbb is befejeződhetett, amennyiben az állat teljesített 15 értékelhető próbát. Ha az állat kevesebb, mint 9 értékelhető próbát (ami megfelel 8 alternálási lehetőségnek) teljesített, akkor az adott kísérleti ülést érvénytelennek minősítettük. Egy-egy kísérlet végeztével – mielőtt a következő állatot az apparátusba helyeztük – a T-labirintust kitakarítottuk és lemostuk 50%-os etanollal. 22
A kísérletek során jegyzőkönyveztük, hogy az állat az egyes próbákban melyik kart választotta, valamint az ajtónyitástól a karba való belépésig eltelt időt (karválasztási idő) és az ajtónyitástól a start karba való visszatérésig eltelt időt (próba időtartam). A választások alapján alternálási rátát számoltunk a következőképpen: sikeres alternálásként értékeltük, amikor egy adott próbában az állat az ellenkező kart választotta, mint az azt megelőző próbában, míg hibának minősítettük, amikor az állat azonos kart látogatott meg, mint az azt megelőző próba során. Az alternálási rátát a következő képlettel számoltuk ki: Alternálási ráta=
Alternáló választások száma Próbák száma-1
,
vagyis az alternálások számát osztottuk az összes lehetséges alternálás számával (a maximális 15 érvényes próba esetén 14, mivel az első próbában még nincs alternálásra lehetőség). A patkányok lokomotoros aktivitásának vizsgálatához a karválasztási idő és a próba időtartamának mérésén túl nyomkövető szoftver segítségével (Ethovision XT 10, Noldus, Wageningen, Hollandia) meghatároztuk azt, hogy a teljes ülés időtartamának hány százalékát töltötte az állat horizontális mozgással (mozgással töltött idő %). 3.1.4. A vizsgált farmakonok és a kísérleti modell Spontán alternálási kísérleteinkben a következő farmakonokat használtuk: szkopolamin hidrobromid (Tocris), PHA-543613 hidroklorid (Tocris) és MK-801 hidrogén maleát (SigmaAldrich). A vizsgált vegyületeket fiziológiás sóoldatban oldottuk fel olyan koncentrációban, ami mellett a kívánt dózisokat 1 ml/ttkg mennyiségű oldat beadásával érhettük el. A farmakonokat intraperitoneálisan (IP) vagy szubkután (SC) injektáltuk. A farmakológiai kísérleteket megelőzően az állatokat 3-6 ülés erejéig habituációs és tréning méréseknek vetettük alá, melyeket fiziológiás sóoldat injektálása előzött meg olyan módon, ahogy a későbbi farmakológiai mérésben injektáltuk a vizsgált vegyületeket. A farmakológiai kísérleteket azután kezdtük meg, hogy az állatok alternálási teljesítménye stabilan és szignifikánsan felülmúlta a véletlennel magyarázható 50%-os határt (ld. alább, 3.1.5 alfejezet). Egyegy patkány kontroll adataiként a tréning ülésekben mért adatok mediánját használtuk fel. A PHA-543613 hatásait a spontán alternálásra két különböző támadáspontú, farmakológiailag kiváltott amnézia-modellben vizsgáltuk: az első kísérletben mAChR antagonista szkopolaminnal, míg a másodikban NMDAR antagonista MK-801-el idéztünk elő az alternálási teljesítmény romlásával járó tranziens memóriazavart. Mindkét kísérletet kiegyensúlyozott latin-négyzet elrendezésben végeztük, így minden állat alá lett vetve mindhárom (adott kísérletben vizsgált) kezelésnek. 23
Első kísérletünkben a szkopolamint 0,5 mg/ttkg (továbbiakban: Scop), a PHA-543613-at pedig egy kisebb (1,0 mg/ttkg, továbbiakban: PHA1.0) és egy nagyobb (3,0 mg/ttkg, továbbiakban: PHA3.0) dózisban alkalmaztuk. Ennek megfelelően a következő kezeléseket kapták az állatok egy-egy kísérleti ülés előtt: Scop önmagában, PHA1.0+Scop, PHA3.0+Scop. A szkopolamin önmagában történő alkalmazásakor a PHA-543613 helyett annak megfelelő mennyiségű fiziológiás sóoldattal injektáltuk az állatokat (ugyanígy jártunk el a második kísérletben az MK-801 önmagában történő alkalmazásakor, ld. alább). A PHA-543613 (vagy a fiziológiás sóoldat) beadása SC történt 40 perccel a kísérleti ülés megkezdése előtt, majd 30 perccel ezt követően történt meg a szkopolamin beadása IP (tehát 10 perccel a kísérleti ülés kezdete előtt). A második kísérletben a következő kezeléseket alkalmaztuk: MK-801 önmagában (0,1 mg/ttkg, továbbiakban: MK), PHA1.0+MK, PHA3.0+MK. A PHA-543613 (illetve a fiziológiás sóoldat) ebben az esetben is SC injektáltuk 40 perccel a kísérleti ülés megkezdése előtt, míg az MK-801 szintén SC lett beadva 5 perccel a PHA-543613 után (tehát 35 perccel a kísérleti ülés kezdete előtt). Az amnesztikus farmakonok illetve a PHA-543613 elsődleges dozisait korábbi irodalmi adatok alapján határoztuk meg [153,196,212,213], majd előkísérletek során finomítottuk a dozírozást. 3.1.5. Statiszikai elemzés A kísérletek statisztikai értékelésénél csak azokon az állatokon mért eredményeket vettük figyelembe, melyek az előzetesen meghatározott kritériumokat teljesítették: 1.) Mindegyik kezelés esetén értékelhető adattal rendelkezett, azaz legalább 9 próbát teljesített minden ülésben; 2.) Kontroll helyzetben a teljesítménye meghaladta az 50%-os alternálási rátát; 3.) Amnesztikus ágens hatására alternálási teljesítménye 0,7-et nem haladja meg, és legalább 0,1 értéket romlott a kontrollhoz képest. A statisztikai elemzés során a különböző kezelések után mért adatokat (alternálási ráta, átlagos karválasztási idő, átlagos próba időtartam, mozgással töltött idő %-a) egyutas ismétléses varianciaanalízissel (rANOVA) és post-hoc LSD teszttel hasonlítottuk össze, amennyiben a parametrikus tesztek feltételei ezt megengedték. Nem normális eloszlású adatok esetében (amenynyiben a Shapiro-Wilk teszt eredménye p<0,05) nem-parametrikus teszteket alkalmaztunk: Friedman tesztet, majd Wilcoxon előjeles rangtesztet a páros összehasonlításokhoz. A páros összehasonlításoknál akkor tekintettünk egy különbséget szignifikánsnak, ha a kétszélű p-érték kisebb volt, mint 0,05.
24
Egy-egy kezelés értékelésénél meghatároztuk továbbá, hogy az alternálási ráta szignifikánsan eltér-e a véletlenszerű alternálási viselkedés esetén várható értéktől (0,5). Ennek érdekében kétszélű binomiális teszttel hasonlítottuk össze az alternáló választások számát az összes lehetséges alternáláshoz képest, a szignifikancia küszöbértékeként p<0,05-öt határoztunk meg. 3.2. Glutamáterg illetve kolinerg hatások és interakcióik vizsgálata a hippocampus neuronjain in vivo elektrofiziológiai módszerekkel Alábbiakban először a két kísérletsorozatban általánosan használt technikákat, majd az egyedi kísérleti protokollokat mutatjuk be. 3.2.1. Az elektrofiziológiai módszerek általános bemutatása Kísérleti állatok és műtéti eljárások Az elektrofiziológiai kísérletekhez kifejlett hím és nőstény Wistar patkányokat használtunk fel. A kísérleteket anesztéziában végeztük, aminek kiváltásához 400 mg/ttkg klorál-hidrát oldatot (40 mg/ml) injektáltunk IP. A stabil anesztéziát a sztereotaxiás műtét és a kísérletek alatt az előzőleg beültetett juguláris véna kanülön keresztül folyamatosan adagolt klorál-hidrát biztosította (8 mg/ml töménységű oldatból; kezdetben 100 mg/ttkg/óra sebességgel, szükség esetén az anesztézia mélységének megfelelően módosítva az adagolás sebességét). A sztereotaxiás műtét során hosszanti metszést ejtettünk a fejbőrön, majd a koponyát borító szövetek eltávolítása után a koponyát a célterület felett meglékeltük. A kemény agyhártya eltávolítását követően többcsatornás szénszálas mikroelektródot (Carbostar, Kation Európa Bt., Szeged) jutattunk be manipulátor segítségével a hippocampus CA1-es területére a következő koordináták szerint (Paxinos és Watson, 2006 alapján [214]): AP −3,5-5,0 mm, ML 1,5-2,5 mm, DV 1,8-3,4 mm a Bregmához képest. Az elvezetések során az elektród megfelelő pozíciójáról a sztereotaxiás koordináták mellett elsősorban a hippocampus CA1-es piramissejtes rétegének jellegzetes elektrofiziológiai jelei alapján győződtünk meg. Továbbá véletlenszerűen kiválasztott kísérletekben az elvezetések végeztével Chicago Sky Blue 6B (Sigma-Aldrich) festékkel történő jelölést alkalmaztunk az elektród helyzetének későbbi meghatározása céljából. A festéket a mikroelektród egyik, még fel nem használt iontoforézis kapillárisán keresztül, −3 μA-es egyenáram 20 percig történő alkalmazásával jutattuk ki a vizsgált sejtek környezetébe. Az állatokat ezután feláldoztuk, az agyat kiboncoltuk, és 4%-os paraformaldehid (Sigma-Aldrich) oldatban fixáltuk. Az érdeklő-
25
désre számot tartó agyszakaszból vibratómmal 50 μm vastagságú metszeteket készítettünk, melyeken neutrál vörössel (Sigma-Aldrich) történő festés után azonosítottuk az elvezetési pontot. A 2. ábra egy reprezentatív elektródjelölés hisztológiai fényképét mutatja.
A)
B)
400 μm
100 μm
2. ábra: Az elvezetési pozíció jelölése a hippocampus CA1-es régiójának piramissejtes rétegében egy reprezentatív hisztológiai metszeten, 4x-es (A) illetve 40x-es (B) objektívvel vizsgálva.
Elektrofiziológiai módszerek A többcsatornás mikroelektródok központi szénszálas csatornáján extracelluláris elvezetést végeztünk, amelyből megfelelő szűrés alkalmazásával (kb. 300–2000 Hz sávban áteresztő szűrő) egysejt-aktivitás vizsgálatára nyílt lehetőség. Az elektrofiziológiai jel erősítése és szűrése BioAmp analóg erősítővel (Supertech Kft., Pécs, Magyarország) illetve NeuroLog elektrofiziológiai rendszerrel (Digitimer Ltd., Welwyn Garden City, Egyesült Királyság) történt. Az analóg jelet Power 1401 analóg-digitális konverterrel és Spike2 szoftverrel (Cambridge Electronic Design Ltd., Cambridge, Egyesült Királyság) digitalizáltuk 25 kHz-es mintavételezési frekvenciával, 12 biten. Lokális farmakológiai hatások vizsgálata esetén az elvezetésekkel párhuzamosan, mikroiontoforézises technikával jutattuk be a vizsgálandó farmakonokat az idegsejtek környezetébe. A lokális beadás a mikroelektród szénszálas csatornáját körülvevő kapillárisokon keresztül NeuroPhore BH-2 mikroiontoforézis-pumpával történt (Medical Systems Corp., Greenvale, NY, USA). A kísérletek során a következő vegyületeket alkalmaztuk iontoforetikusan (zárójelben: gyártó, pipettakoncentráció, ejekciós áram): NMDA (SigmaAldrich, 50mM, −10 és −75 nA között), ACh (Sigma-Aldrich, 100mM, +10 és +80 nA között). Az ejekciók szünetében az iontoforézis csatornákon az ejekciós árammal ellentétes előjelű retenciós áramot alkalmaztunk. 26
A neuronok kisülését jelző tüskéknek (továbbiakban: spike) a nyers elektrofiziológiai felvételből történő extrakcióját a kísérletek után offline végeztük a Spike2 szoftverben, a küszöbértéket úgy határoztuk meg, hogy egyaránt meghaladja a háttérzaj csúcsértékének kétszeresét és a négyzetes átlag (RMS) zaj ötszörösét. Az így azonosított spike-okat egy elsődleges szortírozásnak vetettük alá a Spike2 szoftverben amplitudójuk és hullámformájuk alapján („template matching” algoritmus). A továbbiakban ezt finomítottuk, valamint a klasztereket két elkülönülő populációba osztottuk elektrofiziológiai sajátságaik alapján. A hullámalakok szétválogatása és hozzárendelése két különböző neuron-populációhoz Első kísérletünkben célként tűztük ki, hogy két, elektrofiziológiai és funkcionális szempontból jól elkülöníthető neuron-populációt hasonlítsunk össze. Ennek érdekében első lépésben arra törekedtünk, hogy a Spike2 szoftverben elvégzett elsődleges klaszterezést úgy finomítsuk, hogy nagy valószínűséggel egy egyedi neuront reprezentáljanak. A klaszterek meghatározásakor az alulklaszterezési hibát a spike-közötti intervallumok (inter-spike interval, ISI) elemzésével igyekeztünk minimálisra csökkenteni. Kritériumként szabtuk meg ennek megfelelően, hogy az egymást kevesebb mint 2 ms-on belül követő spike-ok (ISI < 2 ms) száma nem haladhatja meg az adott egységbe sorolt összes spike 5%-át. Amennyiben ez a kritérium sérült, az adott egységet tovább bontottuk újabb szortírozási technikák alkalmazásával. A szortírozás finomítására és az alábbiakban részletezett további elemzésekhez már a Spike2 mellett a Buzsáki György laboratóriumában fejlesztett Klusters (Lynn Hazan, Rutgers Egyetem, NJ, USA) szoftverben rejlő lehetőségeket is felhasználtuk [215]. A két szoftver közötti adat-konverziókat saját fejlesztésű szkripttel végeztük, ami a Spike2 alatt futtatva lehetővé teszi a Klusters által használt .res, .clu, .spk és .dat kiterjesztésű fájlok exportálását és importálását egyaránt. A szkript nyíltforráskódú, hozzáférhető a PTE TTK Kísérletes Állattani és Neurobiológiai Tanszék honlapján2, valamint a ResearchGate tudományos közösségi oldalon3. A fenti módon meghatározott, egy-egy neuront reprezentáló klasztereket ezután két csoportba osztottuk a spike-ok hullámalakja, tüzelési mintázata, valamint auto- és keresztkorrelogramjai alapján. A két elkülönített neuronális csoportot – tüzelési mintázatuknak és az irodalomban elterjedt szokásoknak megfelelően [216] – „komplex-tüzelésű” illetve „szimplatüzelésű” névvel illettük. A klaszterek komplex- illetve szimpla-tüzelésű csoportba sorolását az alábbiakban részletezett, és a 3. ábrán szemléltetett elektrofiziológiai tulajdonságok alapján végeztük.
2 3
http://www.neurobio.pte.hu/kutatas/sites/elfiz.html https://www.researchgate.net/publication/268980233_Export_data_from_Spike2_to_Klusters_Spike2_script https://www.researchgate.net/publication/268980057_Import_data_from_Klusters_to_Spike2_Spike2_script
27
A komplex-tüzelésű neuronok legfőbb sajátossága, hogy egy kisülési esemény alkalmával 2-7 spike-ot tüzelnek rövid ISI időkkel (3-10 ms) és fokozatosan csökkenő amplitudóval („burst-szerű” tüzelési mintázat). Ennek megfelelően autokorrelogramjuk is jellegzetes mintázatot mutat, amin egy éles csúcs látható a ±3-10 ms közötti szakaszon. A szimpla-tüzelésű sejtek ezzel szemben mindig egy spike-ot tüzelnek egy kisülés alkalmával, vagyis két spike csak ritka esetekben követi egymást 10 ms-on belül. Így a szimpla-tüzelésű neuronok autokorrelogramján 0 és ±10 ms közötti szakaszon alacsony gyakorisági értékek láthatók, a legmagasabb gyakorisági értékek a 0 ms-tól nagyobb távolságokra találhatóak. A két különböző sejtpopuláció a hullámalakban is eltér, ami megkönnyíti a legtöbbször ezen paraméterek alapján dolgozó algoritmusok (template matching, főkomponens analízisen alapuló) segítségével történő szortírozásukat. A komplex-tüzelésű sejtek tüskéi jellemzően időben elnyújtottak, kevésbé meredek lefutásúak, a nagy amplitudójú csúcs után pedig lényegesen kisebb mértékű ellentétes irányú kitérés figyelhető meg, míg a szimpla-tüzelésű neuronokra erősen bifázisos jellegű (megközelítőleg ugyanakkora pozitív és negatív irányú kitérés), éles felés lefutású keskeny spike-ok jellemzőek. Azokat a spike-klasztereket tehát, melyek széles, aszimmetrikus spike-okkal rendelkeztek és összetett tüzelési mintázatot mutattak, a komplex-tüzelésű csoportba soroltuk, míg a keskeny spike-okat tüzelő, burst-aktivitást nem mutató klasztereket szimpla-tüzelésű neuronokként azonosítottuk. A szakirodalom alapján a hippocampus CA1-es területén ez a két, elektrofiziológiai alapon elkülöníthető sejtpopuláció nagy valószínűséggel megfelel a piramissejtek (komplextüzelésű) illetve interneuronok (szimpla-tüzelésű) csoportjainak, ezért putatív piramissejtekként illetve putatív interneuronokként is hivatkozunk rájuk [216].
28
B)
A)
1.1 1.0
C)
14
13
0.9 12
0.8 0.7
11
80μV
40μV 0.6
10
4
0.5 9
0.4
8
0.8
0.2
1
imp-1-03 Hz
1
unit volt
0.3
7
0.1 6
0.0 -0.1
5
-0.2 4
-0.3 3
-0.4 -0.5
2
-0.6 1
-0.7
0
.0001
.0002
.0003
.0004
.0005
.0006
.0007
.0008
.0009
.0010
.0011
Time
.0012
0 -0.050 T ime
0.010
.0013 seconds
-0.045
-0.040
-0.035
-0.030
-0.025
-0.020
-0.015
-0.010
-0.005
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
0.040
0.045
0.050 seconds
120
110
100
80μV
40μV
25
90
80
0.8
imp-1-04 Hz
70 1
0.4
60
50
40
30
20
10
0 -0.045
.0005
-0.040
-0.035
-0.030
-0.025
-0.020
-0.015
-0.010
-0.005
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
0.040
T ime
Time
0.045
0.050 seconds
0.010
0,5 ms
10 ms
50 ms
3. ábra: A szimpla-tüzelésű (fent) illetve komplex-tüzelésű (lent) spike-ok szeparálása során felhasznált elektrofiziológiai markerek, és a két populáció közötti különbségek. A spike-ok hullámalakja nyers felvételen keskeny (A) illetve széles (B) időablakban. A B) ábra egyúttal a tüzelési mintázatot is reprezentálja, amit matematikailag a tüzelési időpontok autokorrelációs analízisével készült diagramok (C) írnak le (az autokorrelációs hisztogram vízszintes tengelyének felbontása 1 ms, az oszlopok magassága az egymástól adott időintervallumra jelentkező spike-ok számát reprezentálja).
3.2.2. NMDA
iontoforézisével
kiváltott
excitációk
vizsgálata
piramissejteken
és
interneuronokon Az in vivo extracelluláris elektrofiziológiai mérések során az elvezetett CA1-es neuronokat 120 másodperces időközönként 5 másodperc erejéig farmakológiailag stimuláltuk iontoforetikus úton adott NMDA-val. Az NMDA hatására a sejtek túlnyomó többsége növelte tüzelési frekvenciáját (NMDA-val kiváltott tüzelés), ami éles csúcsként jelent meg a tüzelési hisztogrammon. A 4. ábra szaggatott vonallal határolt része reprezentálja az első kísérletsorozatban használt protokollt. Az első kísérletsorozatban elvégeztük a két, fenti módszerekkel elkülönített neuron-populáció 1.) elektrofiziológiai jellemzését és a szeparálás validálását, 2.) összehasonlítottuk a komplex-tüzelésű neuronok (putatív piramissejtek) és a szimpla-tüzelésű sejtek (putatív interneuronok) tüzelési aktivitását, valamint 3.) lokálisan alkalmazott NMDA-ra való érzékenységüket. A két csoport elektrofiziológiai jellemzése érdekében a következő hullámalak paramétereket határoztuk meg az egy-egy felvételen belül átlagolt spike-okon: 1.) a csúcs (angol: „peak”, P) és az ezt követő hullámvölgy (angol: „trough”, T) amplitudója, 2.) a csúcstól a hullámvölgyig mért amplitudó (P-T amplitudó), 3.) a két amplitudó aránya (P/T hányados), 4.) a csúcstól a hullámvölgyig mért idő (P-T idő), 5.) fél-csúcs szélesség (angol: half-peak duration, HPD).
29
A neuronok tüzelési aktivitását a másodpercenként regisztrált spike-ok átlagos számával jellemeztük, és Hz-ben fejeztük ki. A spontán tüzelési aktivitást mindig az NMDA-beadásokat megelőző 30 másodpercben mértük, majd ehhez hasonlítottuk az NMDA iontoforézise alatt és röviddel azután mért tüzelési frekvenciát (7-9 s hosszú szakaszok, NMDA-val kiváltott tüzelési aktivitás). A neuronok NMDA-ra való érzékenységét továbbá a tüzelési frekvencia relatív változásával is jellemztük (NMDA-val kiváltott / spontán tüzelési frekvencia). Annak érdekében, hogy az összehasonlítást azonos körülmények között elvezetett sejteken végezhessük el, és a statisztikai elemzés erejét növeljük, párosított statisztikai próbákkal analizáltuk az eredményeket (Student t-teszt vagy Wilcoxon előjeles rangteszt), melyekben nem-független mérésekként kezeltük az azonos elvezetésben regisztrált piramissejtek és interneuronok adatait. A kétszélű hipotézis-tesztekben azokat a különbségeket tekintettük szignifikánsnak, melyeknél p<0,01 teljesült. ACh NMDA Spike/s
ACh+NMDA-val kiváltott tüzelés NMDA-val kiváltott tüzelés ACh-nal kiváltott tüzelés
100 Spontán tüzelés
μV 400
200 s 4. ábra: Az elektrofiziológiai kísérletsorozatok iontoforetikus kezelési protokollja, és a mért tüzelési frekvencia értékek (kondíciók). Az első kísérletsorozatra (az NMDA hatásának vizsgálata piramissejtekre és interneuronokra) csak a szaggatott vonallal bekeretezett szakasz érvényes.
3.2.3. Lokálisan adott NMDA-ra illetve ACh-ra adott tüzelési válaszok, valamint szisztémásan alkalmazott mAChR és α7 nAChR antagonisták hatásainak vizsgálata Második elektrofiziológiai kísérletsorozatunk során egy-egy állatból csak egyetlen elvezetést végeztünk, mivel a kísérletekben szisztémás farmakológiai kezeléseket alkalmaztunk. Az
30
adott elvezetési ponton regisztrált spike-ok közül – a 3.2.1 alfejezetben bemutatott csoportosítási kritériumok alapján – kizártuk a szimpla-tüzelésűek spike-jait, és csak a komplex-tüzelési mintázatú spike-ok együttes frekvenciáját analizáltuk. Az első kísérletsorozathoz hasonlóan ezekben a kísérletekben is 120 másodpercenként 5 son keresztül gerjesztettük az elvezetett neuronokat mikroiontoforézissel lokálisan ejektált NMDA-val. Három reprodukálható NMDA excitációs csúcs felvétele után 70 s-on át ACh-t iontoforetizáltunk úgy, hogy az ACh beadásának időtartama átfedett a következő NMDA-eseménnyel, így a két lokálisan adott farmakon kombinált hatásának elemzésére is lehetőség nyílt. Az iontoforetikus kezelések hatásának kiértékeléséhez a következő értékeket határoztuk meg (később: tüzelési kondíciók): 1.) az ACh beadása előtt 2 perccel, 1 percen át mértük a spontán tüzelési frekvenciát (Sp), 2.) az ACh beadását megelőző NMDA-esemény adta az NMDA-val kiváltott tüzelési aktivitást (NMDA), míg 3.) az ACh iontoforézise alatt az ACh-nal kiváltott (ACh), majd 4.) az ezt követő NMDA beadás alatt pedig a kombinált kezelés hatására kialakult (ACh_NMDA) tüzelési frekvenciát mértük. Az iontoforetikus kezeléseket és a különböző tüzelési kondíciókat a 4. ábra szemlélteti. A szisztémás kezelés előtti kontroll-értékek (C) meghatározása után – amennyiben az ACh iontoforézise hatékonyan növelte a tüzelési frekvenciát – IP injekcióban 1 mg/ttkg szkopolamint (Tocris) vagy 1 mg/ttkg MLA-t (Sigma-Aldrich) adtunk be a kísérleti állatoknak (mindkettőt fiziológiás sóoldatban oldottuk, 1 mg/ml koncentrációban). Az IP injekció beadása után is folytatódott az NMDA beadási protokoll, valamint 10, 20 és 30 perc elteltével megismételtük az ACh iontoforézisét. Az újabb iontoforetikus kezelések során is elvégeztük a fenti méréseket (IP10, IP20, IP30), melyeket a kontroll értékekhez hasonlítottunk. A mérések végpontjában (IP30) ismét összehasonlítottuk az iontoforetikus farmakológiai kezelések hatását a tüzelési frekvenciára. Az eredmények elemzése során arra is kíváncsiak voltunk, hogy a tüzelési frekvenciának az ACh és az NMDA kombinált iontoforézisével kiváltott növekedése additív vagy szuperadditív természetű-e, továbbá vizsgáltuk, hogy ez a kapcsolat hogyan változik a szisztémás farmakológiai kezelések hatására. A szuperadditivitás tesztelése érdekében – a Trunk és mtsai (2015) [217] által alkalmazott formulához hasonlóan – a következő null-hipotézist állítottuk fel: H0: (𝑁𝑀𝐷𝐴 − 𝑆𝑝) + (𝐴𝐶ℎ − 𝑆𝑝) = 𝐴𝐶ℎ_𝑁𝑀𝐷𝐴 − 𝑆𝑝 Tehát, ha H0 igaz (p>0,05), akkor additív természetű a kapcsolat, amennyiben H0-t elvetjük (p<0,05), akkor viszont szuperadditivitás van jelen. Ennek érdekében két új, származtatott változót vezettünk be (NMDA−Sp)+(ACh−Sp) és ACh_NMDA−Sp néven. 31
A statisztikai hipotézis-teszteléshez egy- vagy több-tényezős hierarchikus lineáris modelleket használtunk („linear mixed-effect model”), melyben az ismételt mérések (azaz egy adott állatból elvezetett neuronok tüzelési frekvencia értékei) korrelációját ún. random intercept modell használatával biztosítottuk. Az analízist az RStudio szoftverben (RStudio Inc., Boston, MA, USA) végeztük, az R programnyelv lme4 és lmerTest csomagjai segítségével [218–220]. A főhatások és interakciók elemzését követően végzett post-hoc analízishez az lsmeans csomagot használtuk, a többszörös összehasonlításokban kapott p-értékeket Holm módszerével korrigáltuk [221,222]. A kapcsolódó fejezetek ábráit a ggplot2 R-csomaggal készítettük [223].
32
4.
EREDMÉNYEK
4.1. Az
α7
nAChR
agonista
PHA-543613
hatásainak
vizsgálata
a
térbeli
munkamemóriára két különböző farmakológiai amnézia-modellben 4.1.1. PHA-543613 hatása a szkopolaminnal kiváltott tranziens amnézia-modellben A szkopolaminnal kiváltott amnézia-modellben 15 állaton végeztük el a vizsgálatokat, ebből 5 állat nem teljesítette az előzetesen felállított kritériumokat, így 10 patkány adatait értékeltük. A 5. ábra foglalja össze a kísérletben kapott eredményeket. A kontroll mérések során a kísérleti állatok normális alternáló magatartást mutattak, amit a véletlen szintnél szignifikánsan magasabb arányban tapasztalt alternáló választások jeleztek. A mAChR antagonista szkopolamin hatására a patkányok teljesítménye jelentősen romlott: az alternálási ráta 0,71 ± 0,03-ról (átlag ± standard hiba) 0,25 ± 0,03-ra csökkent, ami p<0,01 szinten szignifikáns különbség. A szkopolaminnal kezelt állatok továbbá nem mutattak alternáló magatartást, vagyis az alternálások aránya nem haladta meg szignifikánsan a véletlen szintet (0,5). A PHA-543613 nevű α7 nAChR agonista dózisfüggő módon fordította vissza a szkopolamin hatását. Annak ellenére, hogy a szkopolaminnal és a kisebb dózisú PHA-543613-mal kezelt állatok átlagos alternálási rátája (0,45 ± 0,07) nem haladta meg szignifikánsan sem a véletlen szintet, sem a kizárólag szkopolaminnal történt kezelés után mért alternálási rátát (p>0,05), a PHA-543613 nagyobb dózisban már szignifikánsan növelte az alternálási teljesítményt a szkopolamin kezeléshez viszonyítva (0,25 ± 0,03 szemben 0,59 ± 0,06-tal; p < 0,01). Továbbá a szkopolaminnal és 3,0 mg/kg PHA-543613-mal kezelt állatok szignifikánsan a véletlenszerű alternálás szintje felett teljesítettek, és alternálási rátájuk nem tért el szignifikánsan a kontrolltól (p>0,05), tehát a nagyobb dózisú PHA-543613 teljes mértékben visszafordította a szkopolamin amnesztikus hatását a térbeli munkamemória tekintetében. A T-labirintusban végzett kísérletek során vizsgáltuk a farmakonoknak az állatok lokomotoros aktivitására kifejtett hatásait is. A lokomotoros aktivitást egyrészt a próbák átlagos időtartamának mérésével, másrészt a mozgással töltött idő százalékos arányával jellemeztük. Mivel a kétféle mérés eredményei ugyanarra a következtetésre vezettek és nagyfokú (fordított) korrelációt mutattak (R = −0,85), ezért a kettő közül csak a mozgással töltött idő százalékos arányát ábrázoltuk a diagrammon mindkét kísérlet eredményeinek tárgyalásánál.
33
5. ábra: PHA-543613 hatásának vizsgálata szkopolaminnal kiváltott tranziens amnéziára spontán alternációs paradigmában (N=10). (A) Alternálási ráta a négy különböző kezelés után (χ2= 16,71, p < 0,001). A kettős keresztek (#) a véletlen szinttől való szignifikáns eltérést jelölik (kétszélű binomiális teszt, # p<0,05; ### p<0,001). (B) Mozgással töltött idő százalékos aránya a kísérleti ülés teljes időtartamának százalékában (F(3, 27) = 10.590, p < 0.001). (C) Átlagos karválasztási idő. A Friedman teszt nem mutatott ki szignifikáns főhatást (χ2= 1,2, p = 0,769). A páros összehasonlításokban szignifikáns különbséget jelző jelölések mindhárom diagramon: * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001. Az egyes kezeléseket reprezentáló oszlopok felett elhelyezett csillagok a kontrolltól való szignifikáns eltérést jelzik.
A lokomotoros aktivitást a szkopolamin beadása szignifikánsan és nagy mértékben növelte: a próbák átlagos időtartama szkopolamin hatására 60,1 ± 7,3 másodpercre rövidült a 89,3 ± 8,1 másodperces kontroll értékhez képest (p<0,05). A szkopolamin kezelés után az állatok a kísérleti ülés teljes időtartamának 13,9 ± 1,2%-át töltötték mozgással, ami szignifikánsan nagyobb aktivitást jelez, mint a kontroll helyzetben mért 9,8 ± 0,7%-os érték (p<0,01). Az α7 nAChR 34
agonista PHA-543613 egyik alkalmazott dózisban sem fordította vissza a szkopolamin ezen hatását, mivel sem a próbák átlagos időtartamában, sem a mozgással töltött idő százalékos arányában nem láttunk szignifikáns változást a PHA-543613-mal végzett kombinált kezelés után a szkopolamin egymagában történt alkalmazásához képest (PHA1.0+Scop: 58,8 ± 6,5 s illetve 13,7 ± 0,9%; PHA3.0+Scop: 60,9 ± 10,9 s illetve 15,2 ± 1,1%). Tehát a PHA-543613 nem befolyásolta a lokomotoros aktivitást, pontosabban a szkopolamin lokomotoros gyorsító hatása megmaradt az α7 nAChR agonista beadása ellenére. A karválasztásig eltelt időre az általunk alkalmazott kezelések egyike sem fejtett ki szignifikáns hatást a szkopolamin-modellben (Friedman teszt: χ2= 1,2; p = 0,769; nem szignifikáns). 4.1.2. PHA-543613 hatása az MK-801-el kiváltott tranziens amnézia-modellben Az MK-801-el kiváltott amnézia-modellben végzett vizsgálatok során 15 állatból 14 esetében teljesültek az adatok értékelhetőségének kritériumai. Ahogy az 6. ábrán látható, az előzetes kontroll mérések során az állatok ezúttal is normális alternáló viselkedést mutattak (alternálási ráta: 0,71 ± 0,02). A szkopolaminhoz hasonlóan az NMDA receptor antagonista MK-801 is szignifikánsan csökkentette az alternálási rátát (0,71 ± 0,02-ről 0,43 ± 0,03-ra; p < 0,001), így az alternáló választások száma nem haladta meg a véletlen szintet. Az MK-801-el és a kisebb dózisú PHA-543613-mal történt kezelés után az alternálási teljesítmény szignifikánsan nagyobb volt az NMDAR antagonista önmagában való alkalmazásakor mérthez képest (MK: 0,43 ± 0,03, ezzel szemben PHA1.0+MK: 0,56 ± 0,02; p < 0,05). A PHA-543613 1,0 mg/ttkg-os dózisa nem tudta azonban visszafordítani teljes mértékben az MK-801 amnesztikus hatását, mivel a PHA1.0 kezelés után mért alternálási ráta szignifikáns alacsonyabb volt a kontroll helyzetben mértnél (kontroll: 0,56 ± 0,02 illetve PHA1.0+MK: 0,71 ± 0,02; p < 0,001). A PHA1.0+MK kezelés után az alternáló karválasztások száma továbbá nem mutatott eltérést a véletlen szinttől sem (p=0,1). A nagyobb dózisú (3,0 mg/ttkg) PHA-543613 alkalmazása tesztünkben hatástalannak bizonyult az MK-801-el szemben. A PHA3.0+MK kezelés után ugyanis az állatok alternálási rátája hasonló értéket vett fel, mint az NMDAR antagonista önmagában való alkalmazásakor (MK: 0,43 ± 0,03 illetve PHA3.0+MK: 0,44 ± 0,03; p = 0,95). Továbbá a PHA3.0 kezelés után kapott alternálási ráta szignifikánsan kisebb volt a kontroll értéknél és a PHA1.0 kezelés után mért értéknél is (PHA3.0+MK szemben a kontrollal: p < 0,001; PHA3.0+MK szemben PHA1.0+MK-val: p < 0,01), így a PHA-543613 fordított U-alakú dózishatás görbét mutatott az MK-801-el kiváltott tranziens amnézia-modellben a térbeli munkamemória teljesítmény tekintetében a vizsgált dózistartományban.
35
6. ábra: PHA-543613 hatásának vizsgálata MK-801-el kiváltott tranziens amnéziára spontán alternációs paradigmában (N=14). (A) Alternálási ráta a négy különböző kezelés után (F(3, 39) = 28.44, p < 0,001). A kettős keresztek (#) a véletlen szinttől való szignifikáns eltérést jelölik (kétszélű binomiális teszt, # p<0,05; ### p<0,001). (B) Mozgással töltött idő százalékos aránya a kísérleti ülés teljes időtartamának százalékában (F(3, 39) = 51.38, p < 0,001). (C) Átlagos karválasztási idő (χ2= 25,736, p < 0.001). A páros összehasonlításokban szignifikáns különbséget jelző jelölések mindhárom diagramon: * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001. Az egyes kezeléseket reprezentáló oszlopok felett elhelyezett csillagok a kontrolltól való szignifikáns eltérést jelzik.
A szkopolaminhoz hasonlóan az MK-801 is szignifikánsan növelte az állatok lokomotoros aktivitását, ami mind a próbák átlagos időtartamának csökkenésében, mind a mozgással töltött idő százalékos arányának növekedésében megmutatkozott (kontroll: 75,1 ± 5,5 s, MK: 18,7 ± 2,0 s; p < 0,001; illetve kontroll: 11,1 ± 0,7% szemben MK: 25,0 ± 1,2%; p < 0,001). A PHA-
36
543613 az MK-801 által kiváltott hiperaktivitást sem csökkentette: sem a próbák átlagos időtartamában, sem a mozgással töltött idő százalékos arányában nem találtunk szignifikáns változást a PHA-543613 egyik vizsgált dózisának hatására sem az MK-801 önmagában való alkalmazásához képest (PHA1.0+MK: 20,5 ± 3,7 s, PHA3.0+MK: 18,3 ± 3,0 s; illetve PHA1.0+MK: 26,1 ± 1,6%, PHA3.0+MK: 26,8 ± 1,5%). A szkopolaminnal ellentétben az MK-801 a karválasztási időt is jelentősen csökkentette a kontrollhoz képest (kontroll: 32,7 ± 5,0 s, MK: 5,0 ± 1,0 s; p < 0,001). A PHA-543613 az MK801 karválasztási időre kifejtett hatását sem módosította szignifikánsan, egyik alkalmazott dózisban sem (PHA1.0+MK: 4,6 ± 0,6 s; PHA3.0+MK: 4,8 ± 0,4 s). 4.2. Glutamáterg illetve kolinerg hatások és interakcióik vizsgálata a hippocampus neuronjain in vivo elektrofiziológiai módszerekkel 4.2.1. Neuronális szubpopulációk elkülönítése a hippocampus CA1-régiójában, a jelszeparálás validálása Első elektrofiziológiai kísérletsorozatunkban 44 idegsejtről vezettünk el extracelluláris elektromos jeleket altatott patkányok hippocampus-ának CA1-es régiójából. Az Anyag és módszer fejezetben (3.2.1 alfejezet) részletezett procedúra segítségével 27 „komplex-tüzelésű” neuront és 17 „szimpla-tüzelésű” neuront különítettünk el egymástól. Kizártuk az analízisből a 0,1 Hz-nél alacsonyabb spontán tüzelési frekvenciával rendelkező sejteket, valamint azokat a sejteket, melyek nem mutattak semmilyen jelentős választ az iontoforetizált NMDA-ra. A fennmaradó populációt tekintetbe véve 11 olyan felvételt találtunk, melyen szimultán vezettünk el komplex- és szimpla-tüzelésű neuronokról, így biztosítva lehetőséget ahhoz, hogy párosított statisztikai analízist végezhessünk azonos körülmények között felvett adatokon. A komplex-tüzelésű és szimpla-tüzelésű neuronok szétválasztását az irodalomból ismert, jellemző hullámalakbeli különbségeik alapján validáltuk. A spike-ok alakját, nagyságát illetve időbeli hosszát számszerűsítő paraméterek meghatározásának módját és a jelentősebb eredményeket a 7. ábra szemlélteti.
37
B)
A) μV
P/T arány
P-T idő
3
**
2 1 0
N=11
N=11
szimpla-tüzelésű Complex-spiking komplex-tüzelésű Single-spiking
P
C) HPD
0,8
P-T (ms)
**
P-T Amplitudó
0,6 0,4 0,2
ms
0,0
N=11
N=11
szimpla-tüzelésű Complex-spiking komplex-tüzelésű Single-spiking
D) 0,3
T
HPD (ms)
*
0,2 0,1 0,0
N=11
N=11
szimpla-tüzelésű Complex-spiking komplex-tüzelésű Single-spiking
7. ábra: A) A hullámalak-paraméterek szemléltetése egy sematikus spike hullámon: a csúcs (P), a hullámvölgy (T) és a kettő együttes amplitudója (P-T amplitudó), illetve a közöttük eltelt idő (P-T idő), valamint a félcsúcs-szélesség (HPD). B-C) A két neuronpopuláció közötti elektrofiziológiai különbségeket demonstráló eredmények: B) P/T arány, C) P-T idő, D) HPD. A két populáció közötti különbség szignifikancia-szintjét csillagokkal jelöltük: * p<0,01; **p<0,001.
A tüskék nagyságát illető mértékegységek közül nem találtunk különbséget a két elkülönített populáció között 1.) a csúcs (P) nagyságában (szimpla- ill. komplex-tüzelésű, sorban: 66,5 ± 12,6 μV ill. 61,1 ± 3,8 μV, W = 30), 2.) a hullámvölgy (T) nagyságában (44,9 ± 9,6 μV ill. 27,9 ± 1,8 μV, W = 12) és 3.) a P-T amplitudóban (111,4 ± 22,0 μV vs. 89,0 ± 5,1 μV, W = 26). Markánsan különbözött azonban a két populáció a két csúcs amplitudójának arányában: míg a komplex-tüzelésű sejtek esetén a P csúcs több, mint kétszer akkora amplitudójú volt, mint a negatív csúcs (2,22 ± 0,13-szorosa), addig a szimpla-tüzelésű neuronok spike-jai sokkal szimmetrikusabb hullámalakot mutattak (a két csúcs aránya 1,54 ± 0,10; a két populáció közötti különbség p < 0,001). Az időbeli méréseket tekintve a komplex-tüzelésű neuronok tüskéi lényegesen hosszabb ideig tartottak, azaz szélesebbek voltak, mint a szimpla-tüzelésű sejteké. A két csúcs között eltelt időt és a fél-csúcs szélességet illetően azt találtuk, hogy a komplex-tüzelésű neuronok esetén a két csúcs között 0,538 ± 0,043 ms telt el, ennél jelentősen keskenyebb spike-okat tüzeltek a szimpla-tüzelésű neuronok, melyek esetén a két csúcs között eltelt idő 0,283 ± 0,016 ms volt (p < 0,001). A fél-csúcs szélesség mérése megerősítette a komplex- és szimpla-tüzelésű neuronok hullámalakjának időtartambeli különbségeit: a fél-csúcs szélesség a komplex-tüzelésű sejtek esetén 0,201 ± 0,015 ms, míg a szimpla-tüzelésűek esetén 0,150 ± 0,009 ms volt (p < 0,01). 38
4.2.2. NMDA iontoforézisével kiváltott excitációk vizsgálata hippocampalis piramissejteken és interneuronokon Miután a hullámalakok paramétereinek összehasonlítása megerősítette, hogy a két neuron populáció elektrofiziológiai alapon elkülöníthető egymástól, és ezek a különbségek az irodalom alapján megfelelnek a piramissejtek illetve interneuronok jellemzőinek, megvizsgáltuk a komplex-tüzelésű és szimpla-tüzelésű neuronok válaszait lokálisan alkalmazott NMDA-ra. A 8. ábra egy reprezentatív mérés nyers adatait és az analízis során kapott eredményeket mutatja be. Első lépésben meghatároztuk a két neuronpopuláció spontán tüzelési frekvenciáját. A statisztikai analízis során nem találtunk szignifikáns különbséget a komplex-tüzelésű és a szimplatüzelésű neuronok alap tüzelési frekvenciájában (3,48 ± 1,37 Hz illetve 2,54 ± 1,20 Hz; p > 0,05). Amint látható, a tüzelési frekvencia egy-egy csoporton belül nagy variabilitást mutatott, a komplex-tüzelésű sejtek esetén 0,23 és 12,78 Hz között, míg a szimpla-tüzelésű neuronok esetén 0,27 és 14,21 Hz között. Ahogy a 8. ábrán látható, az NMDA lokális alkalmazásának hatása a tüzelési frekvencia hisztogramon gyors, éles és szimmetrikus csúcsokban nyilvánult meg, ami nem mutatott adaptációt a receptorligandhoz. Az iontoforetizált NMDA-ra mindkét populáció megnövekedett tüzelési aktivitással válaszolt, azonban NMDA-val kiváltott tüzelési frekvenciájuk szignifikánsan különböző volt: a komplex-tüzelésű sejtek tüzelési frekvenciája 40,04 ± 6,27 Hz-re növekedett, ami több, mint négyszer akkora frekvencia, mint amivel a szimpla-tüzelésű neuronok válaszoltak az NMDA-ra (9,86 ± 2,06 Hz; p < 0,001). Elemeztük továbbá azt is, hogy hányszoros növekedést váltott ki az NMDA a neuronok tüzelési frekvenciájában az alapvonalhoz képest. Eredményeink itt is igazolták a két neuronpopuláció NMDA-ra mutatott eltérő válaszkészségét: míg a komplex-tüzelésű neuronok (putatív piramissejtek) közel 60-szorosára növelték a tüzelési frekvenciájukat az iontoforetizált NMDA hatására, addig a szimpla-tüzelésű sejtek aktivitása alig több, mint 10-szeresére nőtt (58,0 ± 23,0-szoros növekedés szemben a 11,4 ± 3,6-szoros növekedéssel; p < 0,01).
39
40
3 20 A) NMDA Komplex-tüzelésű
40 9a spike
2
40
Szimpla-tüzelésű
40 9 spike
1 200 μV
100 s 100
Hz
N=11
**
N=11
N=11
komplex-tüzelésű szimpla-tüzelésű Complex-spiking Single-spiking
N=11
komplex-tüzelésű szimpla-tüzelésű Complex-spiking Single-spiking
Hz
B)
6
5
4
3
2
1
0
C)
50
40
30
20
10 0
*
N=11
komplex-tüzelésű szimpla-tüzelésű Single-spiking Complex-spiking
N=11
NMDA/Sp
D)
90 75 60 45 30 15 0
8. ábra A) Egy reprezentatív kísérlet regisztrátuma: a nyers elektrofiziológiai felvétel az összegzett tüskeaktivitással (alul) illetve a két elkülönített neuronális populáció tipikus tüzelési mintázata (középen és felül). B-D) A két neuronális populáció aktivitásának és farmakológiai érzékenységének összehasonlítása: B) spontán tüzelési frekvencia, C) N-metil-D-aszpartáttal kiváltott tüzelési frekvencia, D) a tüzelési aktivitás proporcionális változása a spontán aktivitáshoz képest. A szignifikáns különbségeket csillagok jelölik: *p<0,01; **p<0,001.
40
4.2.3. Iontoforetikusan adott NMDA és ACh önálló hatásainak és interakciójának vizsgálata hippocampalis piramissejteken A második elektrofiziológiai kísérlet során összesen 15 patkányból vezettünk el elektrofiziológiai jeleket, és vizsgáltuk iontoforetikusan alkalmazott ACh illetve NMDA hatásait a tüzelési frekvenciára, valamint a két farmakon kombinációjának hatását. A lokális hatások vizsgálata után 7 állaton szisztémásan alkalmazott szkopolamin, 8 állaton pedig az MLA hatásait vizsgáltuk. Mindezen kísérletekhez a CA1 régióból elvezetett spike-okat a fenti módszerrel komplex-tüzelésű és szimpla-tüzelésű kategóriákba soroltuk, ezúttal azonban kizárólag a komplex-tüzelésű neuronoknak (putatív piramissejtek) vizsgáltuk az összegzett tüzelési aktivitását. Először kontroll helyzetben (vagyis a szisztémás farmakonok beadása előtt, ld. Anyag és módszer 3.2.3 alfejezet) vizsgáltuk az iontoforetikusan adott ACh és NMDA, valamint kombinált adásuk hatásait (9. ábra). Az előzetes elvárásoknak megfelelően nem volt szignifikáns különbség a két különböző kezelési csoport (szkopolamin, MLA) eredményei között (FARMAKON főhatás: F(1, 12,5)=0,17; p=0,69, FARMAKON × KONDÍCIÓ interakció: F(3, 36,2)=0,97; p=0,42), ezért a továbbiakban az összevont átlagokat és szórásokat közöljük. Az összevont adatokon a varianciaanalízis talált eltérést a különböző tüzelési kondíciók között (KONDÍCIÓ főhatás: F(3, 36,2)=39,51; p<0,001), azaz kimutatta az iontoforetizált farmakonok hatását a tüzelési frekvenciára. A spontán tüzelési frekvencia 5,6 ± 2,0 Hz volt, aminél szignifikánsan magasabb tüzelési frekvenciát mértünk az NMDA önmagában való alkalmazása során (58,5 ± 8,9 Hz; Sp – NMDA: p<0,001), az ACh önmagában való alkalmazása során (59,3 ± 9,2; Sp – ACh: p<0,001) valamint a kombinált iontoforézis során is (125,4 ± 13,2; Sp – ACh_NMDA: p<0,001). Továbbá a kombinált kezelés hatására szignifikánsan magasabb tüzelési frekvenciával válaszoltak a vizsgált sejtek, mint amikor csak NMDA-t illetve csak ACh-t iontoforetizáltunk (NMDA – ACh_NMDA: p<0,001; ACh – ACh_NMDA: p<0,001). Az NMDA és az ACh hatása között nem találtunk szignifikáns különbséget (NMDA – ACh: p=0,96).
41
***
Tüzelési frekvencia (Hz) 150
*** ***
Scop MLA Összesítve
100
***
***
50
0 Sp
NMDA
ACh
ACh_NMDA
Tüzelési kondíció 9. ábra: Iontoforetikusan adott N-metil-D-aszpartát (NMDA) és acetilkolin (ACh), valamint kombinált iontoforézisük (ACh_NMDA) hatásának vizsgálata szisztémás kezelések előtti kontroll helyzetben. Az egyes tüzelési kondíciók felett elhelyezett csillagok a kontrolltól való szignifikáns eltéréseket jelölik a két kísérleti csoport (Scop, MLA) összesített adataira vonatkozóan (N=15). *** p<0,001.
A továbbiakban azt is vizsgálni kívántuk, hogy a NMDA és az ACh szimultán iontoforézisének hatása a tüzelési frekvenciára additív vagy szuperadditív módon haladja-e meg a NMDA illetve az ACh önállóan kifejtett hatását. Ennek érdekében származtatott változókat vezettünk be (ld. Anyag és módszer, 3.2.3 alfejezet), az NMDA és az ACh önálló hatásainak összegét reprezentáló változót [(NMDA−Sp)+(ACh−Sp)], valamint az ezzel való összehasonlításra alkalmas, kombinált kezelés során mért tüzelési frekvenciának az aktuális spontán tüzelési frekvenciával csökkentett transzformáltját (ACh_NMDA−Sp). A 10. ábra a két szuperadditivitási változó összehasonlítását reprezentálja a szisztémás beadások előtti kontroll helyzetben mért adatokon. A két-faktoros analízis – az előzetes elvárásoknak megfelelően – nem mutatott ki szignifikáns különbséget a két kezelési csoport között a szisztémás farmakonok beadása előtt (FARMAKON főhatás: F(1, 11)= 0,76; p=0,40; FARMAKON × ADDITIVITÁS interakció: F(1, 11)= 0,61; p=0,45). Az additivitás faktorban (ami a két farmakon hatásának összegét hasonlítja a kombinált hatáshoz) azonban szignifikáns főhatást találtunk (121,3±13,6
42
Hz illetve 99,6±12,5 Hz, F(1, 11)= 5,95; p<0,05), ami azt mutatja, hogy a két farmakon kombinált hatása szuperadditív természetű, azaz nagyobb, mint a két önállóan végzett kezelés hatásának összege. Tüzelési frekvencia (Hz)
*
Scop MLA Összesítve
140
120
100
80 (NMDA−Sp)+(ACh−Sp)
Additivitás
ACh_NMDA−Sp
10. ábra: Az N-metil-D-aszpartát (NMDA) és az acetilkolin (ACh) additív/szuperadditív hatásainak vizsgálata a szisztémás beadások előtti kontroll mérési pontban. Szignifikancia-szint jelölése: * p<0,05, a két kísérleti csoport (Scop, MLA) összesített adataira vonatkoztatva (N=13). ((NMDA−Sp)+(ACh−Sp): az NMDA és az ACh hatásának összege, ACh_NMDA−Sp: a kombinált iontoforézis hatása)
4.2.4. Szisztémásan alkalmazott muszkarinos illetve nikotinos AChR antagonisták hatásai a neuronok NMDA-ra és ACh-ra adott tónusos válaszaira A kontroll felvételt követően mAChR antagonista szkopolamin (1,0 mg/ttkg) vagy α7 nAChR antagonista MLA (1,0 mg/ttkg) IP beadására került sor. A szisztémás injekció után 30 percig vizsgáltuk a spontán tüzelési frekvencia és a különböző iontoforetikus kezelésekre adott válaszok változásait (a méréseket 10 perces intervallumokkal végeztük). A 11. ábra a szkopolaminnal kezelt csoport egy reprezentatív kísérletét mutatja be, míg az 1. táblázat foglalja össze azon egyedi elvezetések számát, melyekben adott tüzelési kondícióban legalább 20%-os növekedés (↑) vagy csökkenés (↓) állt be a tüzelési frekvenciában 30 perccel a szkopolamin beadás után. A további statisztikai elemzéseket a szkopolamin beadása után a különböző kondíciókban mért átlagos tüzelési frekvenciák analízisével végeztük, melyeknek időbeli változása a 12. ábrán látható. 43
NMDA −9 nA
ACh +35 nA Scop, 1 mg/kg, IP
Spike/s
100
μV
400
100 μV
1000 s 10 ms
11. ábra: Egy reprezentatív kísérlet felvétele a szkopolaminnal (Scop) kezelt csoportból. Alulról felfelé: Nyers elektrofiziológiai felvétel (extracelluláris egy-sejt elvezetés hullámalakja), tüzelési aktivitás hisztogramja, iontoforetikus kezelések időpontjai. Kiegészítő ábra (jobb alsó sarok): egy tipikus komplex spike hullámalakja. (ACh: acetilkolin, NMDA: N-metil-D-aszpartát)
1. táblázat: A tüzelési frekvencia különböző kondíciókban történő változásai 30 perccel szkopolamin beadása után egyedi elvezetésekre (N=7) lebontva (↑ illetve ↓ a kontrollhoz képest mért legalább 20%-os eltérés esetén)
Sp NMDA ACh ACh_NMDA
↑ 1 0 0 0
Ø 0 2 0 0
↓ 6 5 7 6
44
Tüzelési frekvencia (Hz) Sp NMDA ACh ACh_NMDA
***
100
***
*
50
*
***
*
*** ***
***
IP20
IP30
0 C
IP10
Mérési időpont 12. ábra: Kontroll helyzetben (C), valamint szkopolamin szisztémás beadása után 10, 20 illetve 30 perccel (IP10, IP20, IP30) mért spontán tüzelési frekvencia (Sp), valamint különböző iontoforetikus kezelésekkel (NMDA: N-metil-D-aszpartát, ACh: acetilkolin, ACh_NMDA: kombinált iontoforézis) kiváltott tüzelési frekvenciák átlagai és standard hibái (N=7). Az egyes időpontok felett elhelyezkedő csillagok az adott kondícióban mért kontroll értékektől való szignifikáns eltéréseket mutatják: * p<0,05; *** p<0,001.
A két-faktoros statisztikai modellben szignifikáns interakciót találtunk a tüzelési frekvencia függését tekintve a négyféle kondíció (Sp, NMDA, ACh és ACh_NMDA) és az időbeli változás között (KONDÍCIÓ × IDŐ: F(9, 50,7)= 5,70; p<0,001), ezért a négy különböző kondíciót külön-külön modellben elemztük tovább. A spontán tüzelési frekvencia ennek megfelelően nem mutatott szignifikáns változást a szisztémás beadás után (Sp: F(3, 18)= 2,19; p=0,12), azonban az NMDA-val, az ACh-nal és a kombinált kezeléssel (ACh_NMDA) kiváltott tüzelési frekvenciára vonatkozóan szignifikáns főhatást találtunk (NMDA: F(3, 18)= 3,73; p<0,05; ACh: F(3, 18)= 11,21; p<0,001; ACh_NMDA: F(3, 17)= 32,91; p<0,001). A 12. ábrán látható, hogy mindhárom kondícióban, ahol szignifikáns kapcsolatot találtunk a szisztémás kezelés után eltelt idő és a tüzelési frekvencia között, az utolsó mérési pontban szignifikánsan alacsonyabb volt a tüzelési aktivitás, mint kontroll helyzetben. Konkrétan, 30 perccel a szkopolamin beadása után az NMDA-val kiváltott tüzelési frekvencia 64,6±13,2 Hz-ről 39,9±19,3 Hz-re (p<0,05), az AChnal kiváltott tüzelési aktivitás 51,8±12,9 Hz-ről 3,0±1,6 Hz-re (p<0,001), míg a kombinált iontoforézissel kiváltott tüzelés (ACh_NMDA) 117,0±18,1 Hz-ről 56,5±20,1 Hz-re csökkent (p<0,001). A legmarkánsabb csökkenést az ACh-hatás mutatta, ami 30 perccel a szkopolamin 45
beadása után átlagosan a kontroll 5,8%-ára csökkent. Keresztmetszeti analízisben összehasonlítottuk az iontoforetikusan adott receptorligandok hatásait a tüzelési frekvenciára az utolsó, IP30 mérési pontban. Szignifikáns főhatást követően (KONDÍCIÓ: F(3, 18)= 5,78; p<0,01) a páronkénti összehasonlítás szerint szisztémásan beadott szkopolamin jelenlétében az iontoforetizált farmakonok (NMDA, ACh) önmagukban már nem okoztak szignifikáns növekedést a tüzelési frekvenciában (Sp – NMDA: 1,5±0,6 Hz-ről 39,9±19,3 Hz-re; p=0,11, Sp – ACh: 1,5±0,6 Hz-ről 3,0±1,6 Hz-re; p=0,93), azonban együttes iontoforézisük szignifikánsan serkentette a piramissejtek tüzelését (Sp – ACh_NMDA: 1,5±0,6 Hz-ről 56,5±20,1 Hz-re növekedett; p<0,05). Továbbá a kombinált iontoforézis szignifikánsan magasabb tüzelési frekvenciát eredményezett, mint az ACh önmagában való alkalmazása (ACh – ACh_NMDA: 3,0±1,6 Hz-ről 56,5±20,1 Hz-re; p<0,05), az egyedül adott NMDA-val kiváltott tüzelésnél azonban már nem volt magasabb a kombinált hatás (NMDA – ACh_NMDA: 39,9±19,3 Hz-ről 56,5±20,1 Hz-re; p=0,63). A 13. ábra a MLA szisztémás beadásának hatásait szemlélteti egy reprezentatív regisztrátumon, míg a 2. táblázat foglalja össze egyedi elvezetésekre lebontva, hogy a beadás utáni 30. percben mért tüzelési frekvencia értékek hogyan viszonyultak a kontrollhoz (küszöb: ±20%-os eltérés). A statisztikai analízis alapjául szolgáló átlagos tüzelési frekvencia értékeket a 14. ábra mutatja be az MLA beadásától eltelt idő függvényében.
46
NMDA −27 nA
ACh +25 nA MLA, 1 mg/kg, IP
Spike/s 100
μV
400
100 μV
1000 s
10 ms
13. ábra: Egy reprezentatív kísérlet felvétele a metil-akonitinnel (MLA) kezelt csoportból. Alulról felfelé: Nyers elektrofiziológiai felvétel (extracelluláris egy-sejt elvezetés hullámalakja), tüzelési aktivitás hisztogramja, iontoforetikus kezelések időpontjai. Kiegészítő ábra (jobb alsó sarok): egy tipikus komplex spike hullámalakja. (ACh: acetilkolin, NMDA: N-metil-D-aszpartát)
2. táblázat: A tüzelési frekvencia különböző kondíciókban történő változásai 30 perccel MLA beadása után egyedi elvezetésekre (N=8) lebontva (↑ illetve ↓ a kontrollhoz képest mért legalább 20%-os eltérés esetén)
Sp NMDA ACh ACh_NMDA
↑ 4 3 3 0
Ø 1 1 3 2
↓ 3 3 2 5
47
Tüzelési frekvencia (Hz) 150
*
*
Sp NMDA ACh ACh_NMDA
*
100
50
0 C
IP10
IP20
Mérési időpont
IP30
14. ábra: Kontroll helyzetben (C), valamint metil-akonitin szisztémás beadása után 10, 20 illetve 30 perccel (IP10, IP20, IP30) mért spontán tüzelési frekvencia (Sp), valamint különböző iontoforetikus kezelésekkel (NMDA: N-metil-D-aszpartát, ACh: acetilkolin, ACh_NMDA: kombinált iontoforézis) kiváltott tüzelési frekvenciák átlagai és standard hibái (N=8). Az egyes időpontok felett elhelyezkedő csillagok az adott kondícióban mért kontroll értékektől való szignifikáns eltéréseket mutatják: * p<0,05.
A statisztikai analízis során ebben az esetben is szignifikáns interakciót találtunk a tüzelési kondíció és a beadástól eltelt idő hatása között (KONDÍCIÓ × IDŐ: F(9, 59,1)= 3,02; p<0,01), ezért a négyféle kondícióban külön-külön elemeztük az MLA szisztémás beadásának hatását a beadástól eltelt idő függvényében. Az MLA a beadástól eltelt 30 percen belül nem módosította sem a spontán tüzelési frekvenciát, sem az NMDA-val illetve ACh-nal gerjesztett tüzelés frekvenciáját (Sp: F(3,21)= 0,38; p=0,77; NMDA: F(3, 18)= 0,47; p=0,71; ACh: F(3,21)= 1,13; p=0,36). Szignifikáns főhatást találtunk azonban akkor, amikor az MLA-nak a kombinált kezelésre kifejtett hatását vizsgáltuk (ACh_NMDA: F(3, 18)= 3,55; p<0,05). Az MLA a szisztémás beadást követő 10. perctől már szignifikánsan csökkentette a kombinált kezeléssel kiváltott tüzelési frekvenciát a kontrollhoz képest, az utolsó mérési pontra (IP30) az ACh és az NMDA együttes iontoforézisének hatása a kontroll pontban mértnek 65,8%-ára csökkent (C – IP30: 139,4±17,7 Hz-ről 91,7±14,7 Hz-re; p<0,05). Az IP30 mérési pontban végzett keresztmetszeti összehasonlításban a különböző iontoforetikus kezelések (kondíciók) összehasonlítása azt mutatta, hogy mind az NMDA és az ACh önálló iontoforézise, mind együttes iontoforézisük szignifikánsan növelte a tüzelési frekvenciát MLA jelenlétében is (Sp – NMDA: 3,6±0,9 Hz-ről 44,5±8,9 Hz-re; p<0,01; Sp – ACh: 3,6±0,9 Hz-ről 71,2±11,7 Hz-re; p<0,001; Sp – 48
ACh_NMDA: 3,6±0,9 Hz-ről 91,7±14,7 Hz-re; p<0,001), tehát a két receptorligand továbbra is hatásosan serkentette a neuronokat. Megjegyzendő azonban, hogy míg az MLA beadása előtt az NMDA és az ACh önmagában történő iontoforézisével kiváltott tüzelési frekvenciák között nem volt különbség, addig 30 perccel az MLA beadása után már marginálisan szignifikánsan magasabb tüzelési frekvenciát eredményezett az ACh iontoforézise, mint az NMDA alkalmazása (NMDA – ACh: 44,5±8,9 illetve 71,2±11,7; p=0,09). A kombinált kezelés hatására mért tüzelési frekvencia nem haladta meg az ACh önálló alkalmazásával kiváltottat (ACh – ACh_NMDA: 71,2±11,7 Hz-ről 91,7±14,7 Hz-re; p=0,09), viszont szignifikánsan magasabb volt, mint amikor csak NMDA-t iontoforetizáltunk (NMDA – ACh_NMDA: 44,5±8,9 Hz-ről 91,7±14,7 Hz-re; p<0,01), azonban további analízis szükséges annak feltárására, hogy a kombinált kezelés hatására kialakult növekedés additív vagy szuperadditív természetű-e. 4.2.5. NMDA és ACh együttes iontoforézisekor fellépő szuperadditív hatás változása szkopolamin illetve MLA szisztémás alkalmazása után Az adatok kiértékelése során felmerült, hogy a szkopolamin esetében az ACh_NMDA kombinált iontoforetikus kezelésre adott válasz markáns csökkenése nem választható el attól, hogy az ACh hatása minimálisra csökkent önmagában történő iontoforézise során is, ami maga után vonhatta a kombinált kezelés hatásának csökkenését is. Az MLA esetében sem az NMDA-ra, sem az ACh-ra való válasz nem csökkent, azonban a kombinált kezelésre csökkent választ kaptunk az α7 nAChR-ok blokkolása után, ami arra utal, hogy utóbbi hatás mögött a két receptorcsaládon keresztüli jelátvitel interakciójának blokkolása áll. Hipotézisünk tesztelése érdekében megvizsgáltuk, hogy az NMDA és az ACh által kiváltott hatások közötti – az előző fejezetben bemutatott – szuperadditív kapcsolat hogyan változik a szisztémás farmakológiai kezelések függvényében. A szkopolaminnak az NMDA-val és az
ACh-nal kiváltott tüzelési aktivitás
szuperadditívitására való hatását a 15. ábra szemlélteti. A két-faktoros varianciaanalízis a szkopolamin beadásától eltelt idő során a változók szignifikáns csökkenését (IDŐ főhatás: F(3, 17)= 27,58; p<0,001) valamint
szignifikáns szuperadditivitási hatást mutatott ki
(ADDITIVITÁS főhatás: F(1, 6,1)= 8,92; p<0,05), miközben ezen hatások interakciója nem volt szignifikáns (F(3, 17,1)= 1,27; p=0,32). Ebből arra következtetünk, hogy a szkopolamin nem befolyásolta az NMDA és az ACh kombinált hatásának szuperadditív természetét: mindkét származtatott változó hasonló mértékben, egymással párhuzamosan, és a szuperadditív hatás mindvégig megmaradt, vagyis a kombinált iontoforézis nagyobb mértékben növelte a tüzelési aktivitást, mint az NMDA és az ACh önálló hatásainak összege. 49
Tüzelési frekvencia (Hz) 125 ACh_NMDA−Sp (NMDA−Sp)+(ACh−Sp)
*** 100
***
***
75
50
25 C
IP10
IP20
IP30
Mérési időpont 15. ábra: Az N-metil-D-aszpartát (NMDA) és az acetilkolin (ACh) szuperadditív hatásának vizsgálata az idő függvényében szkopolamin szisztémás beadása után (N=7). Az egyes mérési időpontok (IP10, IP20, IP30, azaz a szisztémás kezeléstől eltelt 10, 20 illetve 30 perc) felett elhelyezkedő csillagok a kontroll (C) értékektől való szignifikáns eltéréseket mutatják a két érték összevont analízise alapján (magyarázatot ld. a szövegben): *** p<0,001. ((NMDA−Sp)+(ACh−Sp): az NMDA és az ACh hatásának összege, ACh_NMDA−Sp: a kombinált iontoforézis hatása)
A MLA vizsgálata során azonban más eredményeket kaptunk, melyeket a 16. ábra demonstrál. A variancianalízisben marginálisan szignifikáns interakciót találtunk a szuperadditivitási hatás és az MLA beadásától eltelt idő hatása között (ADDITIVITÁS × IDŐ: F(3, 18)= 2,97; p=0,06). A két származtatott változó időbeli változását külön-külön elemezve azt találtuk, hogy a spontán tüzeléssel csökkentett kombinált tüzelési frekvencia értéke az MLA beadásának hatására szignifikánsan csökkent (F(3, 18)= 3,03; p=0,06; C – IP30: 134,6±18,9 Hz-ről 88,8±15,0 Hz-re; p<0,05), hasonlóan a kombinált kezelés során mért nyers tüzelési frekvencia adatokhoz, míg az egyedül alkalmazott NMDA és ACh hatásának összege nem mutatott változást az MLA beadását követően (F(3, 18)= 0,34; p=0,80). Mindezek az eredmények már arra utalnak, hogy az α7 nAChR antagonista MLA hatással van a kombinált iontoforézissel kiváltott tüzelési frekvencia növekedés szuperadditív természetére, vagyis gátolja az NMDA és az ACh tüzelési aktivitásban megnyilvánuló kölcsönhatását.
50
Tüzelési frekvencia (Hz)
ACh_NMDA−Sp (NMDA−Sp)+(ACh−Sp)
140
120
100
(*)
(*) *
80
C
IP10
IP20
Mérési időpont
IP30
16. ábra: Az N-metil-D-aszpartát (NMDA) és az acetilkolin (ACh) szuperadditív hatásának vizsgálata az idő függvényében metil-akonitin szisztémás beadása után (N=7). Az egyes mérési időpontok (IP10, IP20, IP30, azaz a szisztémás kezeléstől eltelt 10, 20 illetve 30 perc) felett elhelyezkedő csillagok a kontroll értékektől (C) való szignifikáns eltéréseket mutatják adott additivitási változóban: (*)p≈0,05; * p<0,05. ((NMDA−Sp)+(ACh−Sp): az NMDA és az ACh hatásának összege, ACh_NMDA−Sp: a kombinált iontoforézis hatása)
Az NMDA és az ACh együttes iontoforézisének szuperadditív természetét az utolsó mérési pontban nyert adatokon is teszteltük a kontroll mérési pontban elvégzett analízishez hasonló módon, az összehasonlítás eredményét a 17. ábra szemlélteti. Az ábrán jól látható, hogy míg a szkopolamin esetében a kombinált kezelésre nagyobb tüzelési frekvencia emelkedést mértünk, mint az NMDA és az ACh által kiváltott növekedés összege, addig az MLA esetén az összefüggés „megfordul”, azaz a kombinált kezelés az önálló hatások összegénél enyhén kisebb változást idézett elő. A varianciaanalízisben ennek megfelelően marginálisan szignifikáns interakciót kaptunk a szuperadditivitás és a szisztémásan alkalmazott farmakonok között (FARMAKON × ADDITIVITÁS: F(1, 12)= 4,70; p=0,05). A további analízis marginálisan szignifikáns szuperadditív hatást mutatott ki a szkopolamin esetén (40,0±19,3 Hz illetve 55,0±19,9 Hz, F(1, 6)= 5,78; p=0,05), MLA esetén viszont nem volt szignifikáns különbség a két származtatott változó között, tehát nem volt a kombinált kezelésnek szuperadditív hatása (103,6±18,7 Hz illetve 88,8±15,0 Hz, F(1, 6)= 1,45; p=0,27). Mindezen eredményekből arra következtetünk, hogy a szkopolamin gátolta az NMDA és az ACh hatását a neuronok tüzelésének serkentésére, de nem befolyásolta a szuperadditív hatást, ami a két receptorligand kombinált iontoforézise során jelentkezik. Ugyanakkor az MLA nem befolyásolta külön-külön az 51
NMDA és az ACh hatását, viszont hatékonyan blokkolta a két receptorligand szuperadditív természetű kölcsönhatását. Tüzelési frekvencia (Hz) 125 Scop MLA 100
(*)
75
50
25 (NMDA−Sp)+(ACh−Sp)
Additivitás
ACh_NMDA−Sp
17. ábra: Az N-metil-D-aszpartát (NMDA) és az acetilkolin (ACh) additív/szuperadditív hatásainak vizsgálata 30 perccel a szisztémásan alkalmazott farmakonok (Scop: szkopolamin, MLA: metil-akonitin) beadása után (IP30). Szignifikáncia-szint jelölése: (*) p≈0,05, adott farmakonra vonatkozóan (N=7, mindkét csoportban). ((NMDA−Sp)+(ACh−Sp): az NMDA és az ACh hatásának összege, ACh_NMDA−Sp: a kombinált iontoforézis hatása)
52
5.
DISZKUSSZIÓ
5.1. Az
α7
nAChR
agonista
PHA-543613
hatásainak
vizsgálata
a
térbeli
munkamemóriára két különböző farmakológiai amnézia-modellben Fent leírt magatartás-kísérleteinkben az α7 nAChR agonista PHA-543613 kognitív teljesítményfokozó hatását teszteltük két különböző farmakológiai úton indukált tranziens amnéziamodellben. Mind a mAChR antagonista szkopolamin, mind az NMDAR antagonista MK-801 alkalmasnak bizonyult tranziens amnézia kiváltására, mivel szignifikáns teljesítményromlást idéztek elő a térbeli munkamemóriát vizsgáló spontán alternálási paradigmában. Továbbá mindkét amnesztikus ágens növelte a patkányok lokomotoros aktivitását, ami a próbák átlagos időtartamának csökkenésében, illetve a mozgással töltött idő százalékos értékének növekedésében nyilvánult meg, és összhangban volt patkányok általános aktivitási tesztjében (porond teszt) mért irodalmi adatokkal [166]. MK-801 beadása után továbbá a karválasztási idő rövidülését, tehát a döntések gyorsulását is tapasztaltuk. Kísérleteinkben nem vizsgáltuk, hogy a karválasztási idő rövidülése az általános hiperaktivitásnak vagy impulzív viselkedésnek tulajdonítható-e, azonban korábbi tanulmányok alapján feltételezhető, hogy az NMDAR antagonisták növelik a patkányok impulzivitását [224–226]. A PHA-543613 – ahogy előzetesen vártuk más α7 nAChR agonisták irodalmi adatai alapján [188] – enyhítette mind a szkopolaminnal, mind az MK-801-el kiváltott teljesítményromlást, azonban a vegyület hatékonysága és a hatások dózis-profilja a két eltérő modellben különbséget mutatott. A szkopolaminnal kiváltott tranziens memóriazavart ugyanis a PHA-543613 dózisfüggően és teljes mértékben helyreállította, míg az MK-801-el kiváltott teljesítményromlást az α7 nAChR agonista csak részlegesen tudta ellensúlyozni az 1,0 mg/ttkg-os dózisban az alternálási viselkedés helyreállítása nélkül. Továbbá a magasabb dózis már egyáltalán nem javította a teljesítményt az amnesztikus ágenssel szemben, így a vizsgált dózistartományban fordított Ualakú dózis-hatás görbét kaptunk. Hasonló hatásprofilt kaptak Brown és mtsai (2014) [227] nikotinra az MK-801-el kiváltott tranziens amnézia-modellben a passzív elhárítási tanulási paradigmában. A próbák időbeli viszonyait mérő mennyiségek vizsgálata során nem találtunk arra utaló jelet, hogy a PHA-543613 hatással lett volna a szkopolamin illetve MK-801 által kiváltott hiperaktivitásra, valamint az MK-801 hatására lerövidült karválasztási időre. A PHA-543613nak alternálási rátát befolyásoló hatásai tehát nem magyarázhatók az amnesztikus ágensek által kiváltott hiperaktivitás vagy impulzivitás enyhítésével, hanem a munkamemória-teljesítmény javulásaként értelmezhetők.
53
A kognitív teljesítményfokozó vegyületek különböző farmakológiai amnézia-modellekben tapasztalható eltérő hatékonyságára a dolgozatban bemutatottakon túl más eredmények is felhívják a figyelmet. Bonaventure és mtsai (2011) [228] például egy 5-HT7 receptor antagonista hatásait vizsgálták egy késleltetéses nem-megegyező pozíció felismerési paradigmában, és azt találták, hogy a vegyület visszafordítja az MK-801 által kiváltott memória-deficitet, ugyanakkor erősíti a szkopolamin amnesztikus hatásait. Egyes publikációkban azonban az α7 nAChR potens teljesítményfokozó hatását írták le az MK-801 modellben is: többek közt 1.) az új tárgy felismerési tesztben, 2.) a Morris-féle vízi útvesztőben és 3.) a passzív elhárítási paradigmában [188,193,229]. Eredményeink és más szerzők által leírt hatások közötti különbség hátterében egyrészt az alkalmazott vegyületek kémiai tulajdonságai, másrészt az alkalmazott magatartási paradigmák és azok által vizsgált memóriaműködések közötti különbségek állhatnak. Így tehát, Roncarati és mtsai (2009) [188] az új tárgy felismerési tesztben írták le a SEN12333 nevű α7 nAChR agonista kognitív serkentő hatását MK-801-el szemben, azonban ez a teszt a felismerési emlékezetre épül, ami - léziós kísérletek tanúsága szerint – más agyterületek működéséhez kötődik, mint a mi paradigmánkban is vizsgált térbeli memóriaműködések. A hippocampus sérülése ugyanis rendszerint az emlékezet térbeli és kontextuális aspektusaiban okoz zavart [230], míg a tárgyfelismerési memóriát érzékenyebben érinti a perirhinális kéreg írtása [231]. Ugyancsak visszafordította az MK-801-el kiváltott memóriadeficitet az SSR180711 parciális α7 nAChR agonista [193], azonban a vegyületet a Morris-féle vízi útvesztőben vizsgálták, ami a hosszútávú térbeli referencia-memória működéséről ad információt, szemben az általunk használt, térbeli munkamemória tesztelésére alkalmas spontán alternálási paradigmával. Az MK-801-el kiváltott amnézia-modellben kognitív serkentő hatást mutattak ki egy kombinált támadáspontú vegyület (NS9775) esetében is, mely α7 nAChR agonista és monoaminvisszavételt gátló hatásokkal is rendelkezik [229]. A kombinált vegyületet a passzív elhárítási tesztben vizsgálták, ami gyakran alkalmazott módszer a figyelem és az impulzivitás tanulásban betöltött szerepének vizsgálatára [232]. Azonban míg a térbeli memória-tesztekben mutatott teljesítmény nagy mértékben függ a hippocampalis plaszticitástól, addig az elhárításos paradigmákban nem találtak ilyen összefüggést a hippocampalis LTP és a memóriateljesítmény között [233]. Másrészt, mivel az NS9775 a monoaminerg neurotranszmissziót is serkenti, és az ilyen vegyületekről ismert, hogy javítják a teljesítményt az elhárításos tesztekben [234], ezért nem világos, hogy az idézett tanulmányban az NS9775 teljesítményfokozó hatása milyen mértékben tulajdonítható a farmakon α7 nAChR-okon történő kötődésének. 54
Magatartás-kísérletekben mért eredményeink fontos farmakológiai konklúziója, hogy a potenciális kognitív teljesítményfokozó vegyületek hatékonysága a kísérletesen kiváltott memóriadeficitre nagy mértékben függ az alkalmazott demencia-modell hátterében álló fiziológiai és farmakológiai mechanizmusoktól (esetünkben attól, hogy a kolinerg vagy a glutamáterg transzmissziót blokkoljuk-e). A szkopolaminnal kiváltott tranziens amnézia-modellt elterjedten használják ugyanis az AD kezelésére tervezett gyógyszerjelölt vegyületek preklinikai tesztelésére (az AD-ben tapasztalt kolinerg deficit miatt) [137], míg az NMDAR antagonisták által kiváltott memóriadeficit modelleket inkább a skizofréniával összefüggő kognitív zavarok modelljének tekintik [158]. A két modellben mért eltérő eredmények ezért felvetik azt a kérdést, hogy egy adott vegyület alkalmas lehet-e különböző eredetű betegségek kognitív tüneteinek enyhítésére, valamint aláhúzzák annak fontosságát, hogy a preklinikai tesztelések során többféle demenciamodell alkalmazására is sor kerüljön, melyek a tüneteken túl jól modellezik az egyes betegségek egyedi jellegzetességeit is. A farmakológiailag indukált demencia-modellek preklinikai tesztelésben történő használatával kapcsolatos problémákat más kutatócsoportok is felvetették. Andriambeloson és mtsai (2014) [80] három törzskönyvezett gyógyszer (donepezil, galantamin és memantin) kognitív teljesítményfokozó hatását hasonlították össze a szkopolaminnal kiváltott és az α7 nAChR antagonista MLA-val előidézett memóriadeficit modelljében, egerek spontán alternálásos tesztjében. Eredményeik azt mutatták, hogy a két amnesztikus ágenssel azonos mértékű memóriaromlást lehetett előidézni, azonban mind a három teljesítményfokozó vegyület esetén jelentős különbség mutatkozott a két modellben a hatékony dózisok tartományát illetően. Pontosabban, a donepezil és a galantamin a szkopolaminnal indukált memóriadeficitet csak lényegesen (akár több nagyságrenddel) magasabb dózisban volt képes visszafordítani, mint az MLA-val kiváltott memóriazavart, továbbá a szkopolamin modellben a memantin igen csekély hatékonyságot mutatott annak ellenére, hogy az MLA hatásait széles dózistartományban és dózisfüggően visszafordította. A szerzők ebből arra a következtetésre jutottak, hogy a szkopolaminnal végzett preklinikai kísérletek adatai alapján feltehetően túlbecsülik a potenciális kognitív serkentő hatóanyagok későbbi, klinikai tesztelésekben alkalmazott dózisát. Továbbá javasolják az MLAval indukált memóriadeficit modell szélesebbkörű használatát a preklinikai tesztelésben, mivel az ismert kognitív teljesítményfokozó hatással rendelkező memantin az MLA modellben jobban prediktálható eredményeket mutatott, mint a szkopolamin modellben. A kolinészteráz-gátlók (donepezil, galantamin) hatékonyságában tapasztalt különbséget a szerzők azzal magyarázzák, hogy az ACh a muszkarinos receptorokhoz nagyságrendekkel nagyobb affinitással kötődik, mint a nikotinosokhoz [235,236], ezért az ACh-szint ugyanakkora mértékű növekedése 55
kisebb hatással jár, ha csak a nikotinos receptorok hozzáférhetőek a neurotranszmitter számára (vagyis a szkopolamin modellben). A memantin szkopolamin modellben tapasztalt hatástalanságát a szerzők azzal magyarázzák, hogy a memantin – elsődleges, NMDAR antagonista hatása mellett – stimulálja a mAChR-okat [237], ami szintén csak az MLA modellben fejtheti ki teljesítményfokozó hatását. Az említett irodalmi adatokat és saját eredményeinket összegezve, farmakológiai szempontból azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a farmakológiai úton indukált tranziens amnéziamodellekben végzett preklinikai próbák az alkalmazott amnesztikus ágensek, és ezek támadáspontjainak függvényében jelentősen eltérő eredményeket adhatnak. A jelentős eltérések egyrészt annak a fontosságát húzzák alá, hogy a gyógyszerjelölt vegyületek preklinikai tesztelése többféle modellben történjen. Másrészt, az akut farmakológiai modellek számos előnye ellenére felvetődik a szüksége annak, hogy új, a humán betegségekkel jobb oksági viszonyban álló, lehetőleg „természetesebb” módon indukált demencia-modellek kerüljenek beállításra (pl. a korábban említett hipoperfúziós vagy diabéteszes modell). A PHA-543613-mal MK-801-modellben mért eredmények értelmezéséhez érdemes megemlíteni Yang és mtsai (2013) [238] közleményét, akik éber majmokban, vizuális-térbeli feladatok végzése közben vezették el a PFC késleltetési sejtjeinek aktivitását, miközben iontoforetikus úton PHA-543613-at jutattak a neuronok közelébe. Az α7 nAChR agonista hatására a késleltetési sejtek növelték tüzelési frekvenciájukat a késleltetés idején, sőt visszafordították az NR2B alegység-specifikus NMDAR antagonista iontoforézisével kiváltott tüzelési frekvencia-csökkenést. Továbbá, a PHA-543613 alacsony dózisban javította a késleltetési sejtek tüzelési aktivitásának térbeli hangolását (azaz a neuronoknak a stimulus térbeli helyzetére való érzékenységét), magasabb dózisban adva azonban a szemmozgás irányától függetlenül (nem-specifikusan) növelte a tüzelési frekvenciát, és a kognitív teljesítményt nem javította. Tehát a PHA-543613 hatása a késleltetési sejtek térbeli hangoltságára hasonló, U-alakú dózisfüggést mutatott, mint az általunk vizsgált térbeli munkamemória tesztben az MK-801-el kiváltott tranziens amnéziában. Amennyiben tehát feltételezzük, hogy az NMDAR antagonistával kiváltott memóriadeficit visszavezethető a PFC késleltetési sejtjeinek csökkent NMDAR-függő tüzelési aktivitására, akkor elképzelhető, hogy a PHA-543613 alacsony dózisának (részleges) hatásossága a munkamemória javítására annak köszönhető, hogy a késleltetési sejtek α7 nAChRainak farmakológiai stimulálása bizonyos mértékben ellensúlyozni képes a glutamáterg deficitet. Nagyobb dózisú α7 nAChR agonista hatására a késleltetési sejtek tüzelése azonban nemspecifikusan növekedik, ami a kognitív serkentő hatást megszünteti, és a memóriateljesítmény visszatér az MK-801-el kezelt állapottal megegyező szintre. Meg kell jegyeznünk azonban, 56
hogy az alternálási viselkedésben és a térbeli munkamemóriában több agyterület is szerepet játszik [72], ezért nem tudjuk, hogy a PFC késleltetési sejtjeinek aktivitása milyen mértékben magyarázza a magatartás-kísérleteinkben észlelt jelenségeket. Figyelembe kell vennünk továbbá, hogy a PHA-543613 a legideálisabb dózisban se tudta teljes mértékben visszafordítani a MK-801 által kiváltott memória-deficitet, amiből fiziológiai szempontból további fontos következtetéseket vonhatunk le a kolinerg és a glutamáterg neurotranszmisszió interakciójával kapcsolatban. Mivel a szkopolamin illetve az MK-801 viszonylag jó szelektivitással kötődik a mAChR-hoz illetve az NMDAR-hoz [164,239] (bár antagonista aktivitásuknak indirekt hatásai is lehetnek [167,240]), a két farmakon hatása fiziológiai szempontból megfelel a mAChR-ok illetve az NMDAR-ok diszfunkciójának. Az α7 nAChR agonisták tehát megbízhatóan képesek visszafordítani a kolinerg deficitből fakadó kognitív teljesítményromlást, ha a glutamáterg transzmisszió közvetlenül nincs blokkolva, azonban kevésbé hatékonyak, ha az NMDAR-ok nem működnek megfelelően. Az α7 nAChR kognitív folyamatokban
betöltött
szerepe
tehát
funkcionális
NMDAR-okon
keresztüli
neurotranszmissziót feltételez, ezért az aktiválásukkal elérhető kognitív teljesítményjavulás hátterében feltehetőleg az NMDAerg neurotranszmisszió elősegítése illetve serkentése áll, ami nem valósulhat meg, ha az NMDAR-ok eleve blokkolva vannak. A továbbiakban ezen feltételezésünk helytállóságát vizsgáltuk elektrofiziológiai paradigmában, amivel egyúttal a tapasztalt magatartási hatás magyarázatát is kerestük. Mivel a már említett PFC mellett a hippocampusnak is fontos szerepet tulajdonítanak az általunk használt térbeli tesztben, ezért elektrofiziológiai kísérleteinket már a CA1-es régió piramissejtjein végeztük. 5.2. Glutamáterg illetve kolinerg hatások és interakcióik vizsgálata a hippocampus neuronjain in vivo elektrofiziológiai módszerekkel 5.2.1. Neuronális szubpopulációk elkülönítése a CA1-es régióban és a jelszeparálás validálása In vivo elektrofiziológiai kísérleteinkkel az volt a célunk, hogy a kolinerg (elsősorban α7 nAChR-okon keresztüli) és a glutamáterg (NMDAerg) neurotranszmisszió kölcsönhatásáról és ennek a memóriafunkciókra vonatkozó relevanciájáról a neuronok elektromos aktivitásának szintjén is információt nyerjünk. Kísérleteinkhez a LTM-val és a térbeli tájékozódással szorosan összefüggő agyterületet, a hippocampus CA1-es területét választottuk. A CA1-régió piramissejtjeinek extracelluláris elvezetése azonban technikai szempontból nehézkes, mivel ebben a sejtrétegben a idegsejtek – a neocortexhez képest – nagyon sűrűn helyezkednek el, ami nehezíti egy-egy neuronnak a szelektív elvezetését [241]. Ugyanakkor a piramissejtek mellett a réteg 57
tartalmaz interneuronokat is [242], melyeknek elektrofiziológiai és farmakológiai viselkedése jelentősen eltérhet a principális sejtekétől. Mindezen technikai nehézségek először is arra késztettek minket, hogy megszokott kísérleti módszereinket új komputációs lehetőségekkel egészítsük ki annak érdekében, hogy a piramissejteket és az interneuronokat szelektíven vizsgálhassuk. Szükségesnek láttuk továbbá a szeparáció sikerességéről elektrofiziológiai és farmakológiai markerek vizsgálatával megbizonyosodni. Az egycsatornás elvezetésekben a tüskeaktivitási jelek szeparálásához az adatokat a Spike2 szoftverből a Klusters alkalmazásba exportáltuk, melyhez saját, Spike2 alatt futó, exportáló és importáló funkcióval is rendelkező szkriptet fejlesztettünk. A Klusters szoftverben megtörtént a tüskéknek a két különböző neuronális populációba való besorolása (komplex-tüzelésű és szimpla-tüzelésű). A két populáció közti eltéréseket először a tüskejelek hullámformájában vizsgáltuk. A komplex-tüzelésű és szimpla-tüzelésű csoportokba sorolt neuronok tüskéinek amplitudója között nem találtunk különbséget, azonban a két csoport között lényeges eltéréseket találtunk a tüskék időtartamában (fél-csúcs szélesség és P-T időtartam) és a tüskék aszimmetriájában, vagyis a P/T amplitudó-arányban. Megfigyelésünk összhangban áll korábbi irodalmi adatokkal, miszerint a komplex-tüzelésű és szimpla-tüzelésű neuronok elkülönítésének legjobb indikátorai a tüskék időbeli hossza és asszimetriája [243]. Csicsvári és mtsai (1998) eredményei alapján [216] – miszerint a CA1 régióban a tüske-aktivitás hullámformája és mintázata jól indikálja a vizsgált sejt típusát – a komplex-tüzelésű csoportot putatív piramissejteknek, míg a szimpla-tüzelésű sejteket putatív interneuronoknak tekintettük. Megjegyzendő, hogy mivel az extracelluláris felvételeken az általunk elvezetett putatív interneuronok mindig együtt jelentkeztek putatív piramissejtekkel, ezért ezek az interneuronok nagy valószínűséggel a piramissejtek rétegében helyezkedtek el. 5.2.2. NMDA iontoforézisével kiváltott excitációk vizsgálata hippocampalis piramissejteken és interneuronokon A továbbiakban a két neuron-csoport aktivitását hasonlítottuk össze spontán tüzelési állapotban és NMDA hatására. Meglepő módon a spontán tüzelési frekvenciában nem találtunk különbséget a két populáció között. Korábbi adatok alapján a hippocampalis interneuronokat éber állatban és uretán anesztézia alatt magas kisülési ráta jellemzi [244], ezért feltételezzük, hogy a putatív interneuronok általunk tapasztalt alacsonyabb tüzelési frekvenciája és a spontán tüzelési ráta mindkét csoportban tapasztalt nagy szórása az anesztéziához használt klorál-hidrát általános hatásának tudható be. Korábban leírták, hogy a klorál-hidrát hatására megváltozhat az NR1 és NR2B alegységek szubcelluláris eloszlása az NMDAR komplexben [245], azonban arra 58
utaló tényt nem ismerünk, hogy a klorál-hidrát ilyen irányú hatása különbözően érinti a receptor-eloszlást a piramissejtekben és az interneuronokban. A klorál-hidrát spontán tüzelésre kifejtett feltételezhető hatásai ellenére a két neuronális populáció jól elkülönült egymástól az iontoforetikusan adagolt NMDA-ra adott válaszaik alapján. Mindkét sejttípus növelte tüzelési frekvenciáját NMDA hatására, azonban mind a tüzelési frekvencia abszolút értékében, mind pedig a spontán tüzeléshez viszonyított relatív tüzelési frekvencia változásban szignifikáns különbséget találtunk a putatív piramissejtek és interneuronok között. Az NMDA-ra való érzékenység így egy újabb, farmakológiai indikátor a két neuroncsoport elkülönítésére, és még jobban alátámasztja az analízis alatt alkalmazott szeparáció megbízhatóságát. Eredményeink összhangban vannak és in vivo adatokkal erősítik azokat a korábbi, in vitro rendszerekben mért elektrofiziológiai és kálcium-képalkotási eredményeket [62,246,247], miszerint a piramissejtek nagyobb érzékenységet mutatnak az NMDA receptorok aktivációjára, és ennek során magasabb kálcium-tranziensek mérhetőek bennük, mint az interneuronokban. A putatív piramissejtek általunk megfigyelt nagyobb NMDA-válaszai összhangban vannak továbbá azokkal a nemrég leírt eredményekkel, miszerint a CA1 piramissejteinek dendritikus tüskéiben a felszínen expresszált NMDA/AMPA receptorok számbeli aránya többszöröse az interneuronokban mértekhez képest [248]. Technikai szempontból az első elektrofiziológiai kísérletsorozatban végzett mérések azt erősítették meg, hogy az egycsatornás elvezetések során (mint ami az iontoforézissel kombinált extracelluláris technikában megszokott) is megbízhatóan el lehet különíteni egymástól a CA1es régió piramissejtek rétegének komplex-tüzelésű (piramissejtek) és szimpla-tüzelésű (interneuronok) idegsejt-csoportjait, és elkülönülten vizsgálható a két sejttípus farmakológiai viselkedése. A második elektrofiziológiai kísérletsorozatunk során ezeket a technikákat és tapasztalatokat felhasználva vizsgáltuk a piramissejteken a kolinerg és glutamáterg farmakonok lokális és szisztémás adagolásával előidézett hatásokat. 5.2.3. Iontoforetikusan adott NMDA illetve ACh hatásai a piramissejtek tónusos tüzelési aktivitására. A muszkarinos és a nikotinos AChR-ok szerepe a jelenségben Második elektrofiziológiai kísérletsorozatunk során először az iontoforetikusan adagolt NMDA és ACh hatását vizsgáltuk a CA1-es régió piramissejtjeinek tüzelésére. A várakozásainknak megfelelően a szisztémás kezelések előtti kontroll helyzetben mind az NMDA, mind az ACh markánsan növelte a neuronok tüzelési frekvenciáját.
59
Kezdeti megfigyeléseink összhangban vannak klasszikus szakirodalmi adatokkal, miszerint a glutamát iontoforetikus alkalmazására a hippocampus principális sejtjei gyors tüzelési frekvencia növekedéssel válaszolnak, míg az ACh szintén serkentő hatással van a piramissejtek tüzelésére, azonban ez a hatás lassabban épül fel, és lassabban szűnik meg az iontoforetikus áram kikapcsolása után (ld. 11. és 13. ábra) [249–252]. Az exogén ACh serkentő hatása több mechanizmuson keresztül valósul meg, mint például 1.) a depolarizáció facilitálása, 2.) az utóhiperpolarizáció gátlása [253], 3.) K-csatornák zárása [251,254], és 4.) a rekurrens gátlást közvetítő axonokból a GABA-felszabadulás mértékének csökkenése [254]. Mindezen mechanizmusokban valószínűleg különböző receptor-típusok vesznek részt, amit a későbbiekben tárgyalunk a szisztémásan beadott farmakonok hatásainak diszkussziójánál. Megjegyzendő azonban, hogy az általunk is tapasztalt nettó serkentő hatáson túl specifikusabb vizsgálatokkal az ACh neuronális aktivitást gátló hatásai is kimutathatóak. A gátló kolinerg hatások a piramissejtek tüzelésére leggyakrabban indirekt úton, a piramissejteket beidegző interneuronokon keresztül realizálódik: ilyenkor a principális sejteken inhibitoros PSPk mérhetőek [255]. Dannenberg és mtsai (2015) [90] szabadon mozgó állatok hippocampusának CA3-as területéről elvezetett extracelluláris jelek vizsgálata során azt találták, hogy endogén, a mediális septum ingerlésével felszabadított ACh a terület interneuronjait serkentette, miközben a piramissejtek tüzelési frekvenciája – valószínűleg indirekt hatásra – jelentősen csökkent. Az ACh ugyanakkor a piramissejtek tüzelésének pontosabb időzítését segítette elő a thétaritmus megfelelő fázisaihoz, amiben feltehetően mind a direkt serkentő, mind az indirekt gátló hatásoknak szerepük lehet. Saját kísérleteinkben az ACh iontoforézise úgy tűnik, csak kis mértékben aktiválta az indirekt gátló útvonalat, feltehetően a lokális, piramissejtek rétegére korlátozódó injektálás miatt, így a továbbiakban elsősorban a közvetlen, serkentő hatásokra fókuszálunk. Annak érdekében, hogy a kísérleteink során ACh iontoforézisével kiváltott hatásokban megvizsgáljuk a különféle AChR alosztályok szerepét, a kísérleti állatok egyik csoportját szisztémásan beadott szkopolaminnal (1 mg/ttkg, IP), míg a másik csoportot MLA-val (1 mg/ttkg, IP) kezeltük, és 30 percen át mértük a spontán tüzelés, valamint az iontoforézissel bejuttatott vegyületek által kiváltott hatások változásait. Fontos hangsúlyozni, hogy a szkopolamin és a MLA magatartás-farmakológiai szempontból releváns dózisban került alkalmazásra [80]. A mAChR antagonista szkopolamin beadása után – változatlan spontán tüzelési frekvencia mellett – az idő múlásával folyamatosan és jelentősen csökkent mind az NMDA, mind az ACh hatása a tüzelési frekvenciára. Különösen robosztus csökkenést tapasztaltunk az ACh-nal kiváltott tüzelési akti-
60
vitásban, ami 30 perccel a szkopolamin beadása után már nem tért el a spontán tüzelési frekvenciától, azaz megszűnt az ACh-nak a piramissejtek tónusos tüzelésére kifejtett serkentő hatása. Irodalmi adatok megerősítik azt a megfigyelésünket, miszerint a szisztémásan beadott muszkarinos antagonista nem csökkenti a piramissejtek spontán tüzelési frekvenciáját: Stewart és mtsai (1992) [256] kísérletében a CA1-régió interneuronjainak théta-ritmus alatti spontán tüzelési frekvenciáját gátolta az atropin, a principális sejtjek spontán aktivitására azonban nem volt hatással. Utóbbi jelenségre magyarázatot adhat, hogy mindkét eredmény (a hivatkozott és a sajátunk) altatott állatban lett mérve, ebben az állapotban pedig alacsony a piramissejtek spontán aktivitása a CA1-régióban, ami feltételezhetően – a lassú hullámú alváshoz hasonlóan – alacsony kolinerg tónussal függ össze [81–83,257]. Érdekes módon ugyanakkor a memória visszahívási fázisában, ami szintén alacsony ACh-szintet feltételez, a szkopolamin erősíti a piramissejtek fázis-zárt tüzelési mintázatát [97]. A megemelkedett ACh-szint hatására létrejövő tónusos tüzelési aktivitás érzékeny volt viszont a mAChR-ok gátlására, amit szintén alátámasztanak korábbi eredmények. Az ACh-nal kiváltott serkentő hatások – mint például 1.) a CA1- és a CA3-régió piramissejtjein a tüzelési aktivitás növekedése, 2.) a membrán depolarizációja és 3.) az utóhiperpolarizáció gátlódása – muszkarinos antagonistákkal (atropin, szkopolamin) vagy mAChR-ok génjeinek kiütésével gátolhatóak [249,250,252,253,258]. A mAChR-ok blokkolása ugyanakkor a hippocampus thétaritmusának szabályozásában fontos szerepet betöltő interneuronok gátlását [256], valamint a kolinomimetikumokkal kiváltott théta-ritmus csökkenését is okozza [95], továbbá elrontja a piramissejtek tüzelésének théta-csúcshoz történő időzítését a memória (magas kolinerg tónust feltételező) kódolási fázisában [97]. A szkopolaminnak fent részletezett hatásaiból összességében arra következtethetünk, hogy a mAChR-okon keresztül megvalósuló kolinerg hatások elsősorban a piramissejtek általános, tónusos aktivitását, tüzelésük időzítését és a hálózat működési állapotát határozzák meg. Alacsony ACh-szint mellett tehát a szkopolaminnak nincs jelentős hatása a piramissejtek tüzelési aktivitására, azonban megzavarhatja a magas ACh-szintet igénylő memória-kódolási folyamatokat azáltal, hogy gátolja a neuronok kolinerg aktivációját és tüzelésük megfelelő időzítését. A szkopolaminnal ellentétben az MLA szisztémás beadása után nem változott jelentősen sem az NMDA, sem az ACh iontoforézisével kiváltott tüzelési frekvencia, tehát a nAChR antagonista nem gátolta a piramissejteken sem az NMDA-nak, sem az ACh-nak az alapaktivitásra kifejtett serkentő hatását.
61
Eredményeinkkel összhangban az irodalomban is kevés adatot találunk arra vonatkozóan, hogy egyszerű nikotinerg hatások befolyásolnák a piramissejtek tónusos tüzelési aktivitását, a legtöbb közleményben az ACh-nal kiváltott excitáció érzéketlen volt nikotinos antagonistákra. Kivételt képez Bird és mtsai (1976) [252] eredménye, akik a tüzelési aktivitás nAChR agonisták hatására mért növekedéséről számoltak be a CA1-régióban, valamint az ACh által kiváltott excitáció DHβE-nel és más nAChR antagonistákkal történő gátlását írták le. Egyes nAChR antagonisták egyúttal a glutamát serkentő hatását is gátolták, ami szintén ellentmond saját eredményeinknek, azonban az idézett cikkben használt antagonisták nem α7 nAChR specifikusak, továbbá néhány nikotinos antagonista blokkoló hatása nem volt szelektív a nAChR-okra sem, mivel a muszkarin excitátoros hatását is gátolták [252]. Ugyanakkor Cole és mtsai (1984) [253] kísérletében a CA1-es piramissejtek ACh-nal kiváltott depolarizációját és tüzelését – az atropinnal ellentétben – nAChR antagonisták nem blokkolták. A piramissejtek csekély direkt nikotinerg érzékenységét támasztja alá továbbá McQuiston és Madison (1999) [242] közleménye is, melyben hippocampalis piramissejteken és
különböző
sejtrétegekben
elhelyezkedő
interneuronokon
vizsgáltak
háromféle
elektrofiziológiai választ nikotinra. A neuronokat ezen az alapon a következő csoportokba sorolták: 1.) nagy amplitudójú, gyors α7-típusú áramokat mutató, 2.) kisebb amplitudójú, lassú nem-α7-típusú áramokat mutató (valószínűleg heteromer nAChR-okon keresztül), valamint 3.) nikotinos áramot nem mutató sejtek [259,260]. A piramissejtek vizsgálata azt mutatta, hogy túlnyomó többségük nem érzékeny nikotinra, csekély számban azonban találtak α7-típusú gyors válaszokat is. Az interneuronok vizsgálata már változatosabb képet nyújt, hiszen a hippocampusban számos típusuk különíthető el morfológiájuk, kapcsolatrendszerük és funkciójuk alapján (ld. a következő összefoglalókat: [87,261]), így a rajtuk érvényesülő receptorhatások és a piramissejtekre illetve a hálózat működésére kifejtett hatásuk is jelentősen eltérhet. Témánk szempontjából különösen érdekes McQuiston és Madison (1999) [242] azon megfigyelése, hogy bár a hippocampus többi sejtrétegének interneuronjai általában nagy érzékenységet mutatnak nikotinra, a piramissejtek rétegében elhelyezkedő, többnyire ebben a rétegben szinaptizáló interneuronoknak mintegy felében semmilyen nikotinos választ nem lehetett kiváltani. Továbbá Alkondon és mtsai (2001) [262] kísérletében az α7 nAChR-ra szelektív kezelések – indirekt úton – legerősebben a stratum lacunosum-moleculare interneuronjain okoztak gátlást, míg a piramissejteken ritkábban lehetett inhibitoros posztszinaptikus áramokat (IPSC) elvezetni. Úgy tűnik tehát az irodalom alapján, hogy a piramissejteken lokálisan (azaz a stratum pyramidaleba) beadott ACh hatására fellépő tónusosan megnövekedett tüzelési aktivitásban csak elenyésző 62
mértékű szerepe lehet az α7 nAChR-okon keresztül megvalósuló direkt és indirekt (interneuronokon keresztüli) hatásoknak, ahogy azt az MLA beadása után mért eredményeink in vivo rendszerben is megerősítik. Meg kell jegyeznünk továbbá, hogy bár az átlagos tüzelési frekvenciák vizsgálata alapján az MLA nem hatott a spontán tüzelési aktivitásra sem, az egyedi kísérleti üléseket vizsgálva azonban kb. fele-fele arányban találhatunk legalább 20%-os tüzelési frekvencia növekedést illetve csökkenést az MLA beadását követő 30 perc elteltével. Az iontoforetizált anyagokkal szemben a szisztémásan beadott MLA az összes hippocampalis sejtréteg interneuronjain keresztül kifejthette hatásait, melyek eredőjeként a piramissejtek spontán tüzelési aktivitása növekedett vagy csökkent. Ji és mtsai (2000) [263] hippocampalis szeletekben stratum radiatum interneuronok (SRI) és piramissejtek párjain végzett vizsgálatok során kimutatták, hogy a nikotinos receptorokon keresztül hatva az ACh excitátoros áramokat hoz létre a SRI-okban, ami a piramissejteken legtöbbször az IPSC-k növekedését eredményezi, azonban ritkább esetekben α7 nAChRokon hatva a piramissejtek indirekt gátlásoldásához is vezethet [263]. A piramissejtek interneuronokon keresztül megvalósuló nikotinerg gátlását és diszinhibícióját más szerzők is kimutatták [255], feltételezéseink szerint többek között ez a jelenség állhat a MLA hatására a spontán aktivitásban létrejövő különféle változások mögött. 5.2.4. Iontoforetikusan adott NMDA és ACh kombinációjának szuperadditív hatása. A muszkarinos és nikotinos AChR-ok szerepe a jelenségben Elektrofiziológiai kísérleteink során az önálló hatások mellett tanulmányoztuk az ACh és az NMDA kombinált iontoforézisének hatásait is a tüzelési aktivitásra. A két farmakon kombinált alkalmazása nem csupán a spontán tüzeléshez képest eredményezett magasabb tüzelési frekvenciát, hanem az önmagában alkalmazott NMDA-val illetve ACh-nal kiváltott tüzeléshez képest is. Továbbá megállapítottuk, hogy az NMDA és az ACh kombinációjának hatása szuperadditív természetű, ami arra utalhat, hogy az α7 nAChR-ok és az NMDA-típusú glutamáterg receptorok együttes aktiválásakor egy olyan mechanizmus lép életbe, ami az egyszerű kezelések során nem befolyásolja a tüzelési frekvenciát. Feltételezzük, hogy a szuperadditív hatás a glutamáterg szinapszisok kolinerg facilitációjával magyarázható, amit irodalmi adatok is alátámasztanak. Áram- és feszültség-zár módszerrel végzett in vitro kísérletekből tudjuk, hogy az iontoforetikusan alkalmazott ACh képes potencírozni az iontoforetikusan bejuttatott NMDA excitátoros hatását, de a nem-NMDA típusú glutamát-receptor agonistákkal kiváltott EPSP-ket nem befolyásolja [264,265]. Továbbá mind exogén, mind a mediális septum ingerlésével felszabadított ACh képes a kommisszurális illetve a Schaffer-kollaterális pályák ingerlésével kiváltott neuronális aktivitás hosszútávú facilitálására [78,265]. 63
Szkopolamin beadása után az NMDA és ACh szimultán iontoforézisének serkentő hatása jelentős mértékben csökkent, azonban még 30 perc elteltével is jelen volt, és a csökkenést magyarázhatja az ACh-nal kiváltott tónusos tüzelési aktivitás korábban tárgyalt általános gátlása is. Utóbbi feltételezést erősíti meg, hogy a kombinált iontoforézissel kiváltott hatás szuperadditív természete a szkopolamin beadása után nem változott, tehát az ACh és az NMDA együttes alkalmazása mindvégig a kísérlet folyamán magasabb tüzelési frekvenciát eredményezett, mintha a két receptorligand önálló hatása additív módon összeadódna. Mivel a szkopolamin nem befolyásolta az ACh-nak az NMDA-val kiváltott tüzelést facilitáló hatását, valószínűleg
a
glutamáterg
neurotranszmisszió
kísérletünkben
kimutatott
kolinerg
potencírozásához nem járultak hozzá kritikus mértékben a mAChR-ok. Az irodalomban azonban számos példa található a glutamáterg szinapszisok mAChR-on keresztüli preszinaptikus facilitációjára, azonban más közlemények szerint ezzel ellentétes hatás is érvényesülhet rajtuk keresztül. A CA1-régió piramissejtjein iontoforetikusan adott NMDAval vagy a Schaffer-kollaterális ingerlésével kiváltott EPSP-k kolinerg facilitációja blokkolható atropinnal [264,265]. Továbbá, a kommisszurális ingerléssel kiváltott populációs spike-ok mediális septumból felszabadított ACh-nal történő potencírozását is gátolja az atropin és a szkopolamin [78]. Ugyanakkor az AChR agonista karbakol mAChR-specifikus hatásokon keresztül csökkenti a glutamáterg szinapszisokon egy-egy ingerlés hatásosságát, az EPSC-k nagyságát és a glutamát-felszabadulás valószínűségét, tehát a muszkarinos hatás csökkentheti is a glutamáterg neurotranszmisszió hatékonyságát [266]. Továbbá, a hippocampus CA3-as régióban a muszkarin direkt preszinaptikus moduláción (intracelluláris Ca2+-szint csökkenés) és indirekt úton is (GABAerg tónus fokozása) tompítja az afferens rostok terminálisaiban a neurotranszmissziót [267]. Az eltérő modulációs hatásokban valószínűleg a mAChR-ok különböző alosztályai játszanak szerepet, ami magyarázhatja a facilitáló és szuppresszáló hatások együttes előfordulását. Dasari és mtsai (2011) [258] knock-out egereken vizsgálták a különböző mAChR-ok szerepét a preszinaptikus mechanizmusokban. Eredményeik azt mutatták, hogy a CA1-be projíciáló CA3-as piramissejteket serkentő tónusos és fázisos kolinerg hatások kiváltásához a M1 AChR expressziója szükséges és elégséges, a karbakol viszont a M4 mAChR-okon keresztül gátolja a Schaffer-kollaterálisokban kiváltott EPSP-ket és a glutamát-felszabadulást [258]. Az M1 és M4 típusú AChR-ok szerepét hangsúlyozzák az AD során expressziós mintázatukban bekövetkező változások is (ld. Bevezetés 1.4.2 alfejezet) [103,104]. A mi kísérleti elrendezésünk nem adott rá lehetőséget, hogy az általunk tapasztalt NMDAerg transzmissziót facilitáló nettó kolinerg hatást elemeire bontsuk, azt azonban megállapíthattuk belőle, hogy a különböző mAChR-okon 64
érvényesülő hatások eredője nem járult hozzá kimutatható mértékben a jelenséghez, vagy a szkopolamin ebben a – farmakológiailag egyébként releváns – dózisban alkalmazva nem kötődik a preszinaptikus mAChR-okhoz. Annak ellenére, hogy az NMDA-val illetve ACh-nal kiváltott tüzelési aktivitásra nem volt hatással, a MLA látványosan csökkentette a két ligand kombinált iontoforézisének hatását, ami már 10 perccel az MLA beadása után lényegesen alacsonyabb volt a beadás előtti kontroll értéknél, és ez a különbség a továbbiakban is megmaradt. Továbbá a kombinált hatás szuperadditív természetét is megszüntette az α7 nAChR-ok blokkolása, sőt a kombinált iontoforézissel mért hatás átlaga alacsonyabbnak bizonyult, mint az NMDA-val és az ACh-nal kiváltott hatás összegének átlaga. A szisztémás kezelés utáni harmincadik percben gyűjtött adatok is megerősítették, hogy az MLA – a szkopolaminnal ellentétben – blokkolta az NMDAválaszok ACh-nal kiváltott facilitációját, ami arra utal, hogy az α7 nAChR-ok kísérletünkben kulcsszerepet játszottak a glutamáterg neurotranszmisszió kolinerg potencírozásában. A nAChR-ok, különösen a homomer, α7 alegységekből felépülő típus glutamáterg transzmisszióban betöltött szerepét több korábbi elektrofiziológiai adat is alátámasztja: 1.) a hippocampus CA1-régiójában a serkentő afferensek stimulálásával kiváltott populációs spikeok amplitudóját az ACh nAChR-függő módon növeli [268], 2.) a CA1 piramissejtjein az MLA csökkenti az EPSC-k gyakoriságát, azonban ez a gátlás enyhül a CA3-régió léziójakor [269], 3.) az α7 nAChR agonista S 24795 alacsony koncentrációban erősíti a Schaffer-kollaterálison kiváltott LTP-t. Utóbbi tanulmányban érdekes módon az α7 nAChR agonista nagyobb koncentrációban már csökkentette az excitátoros potenciálok amplitudóját, ami az α7 nAChR agonisták hatásainak más kísérletekben is tapasztalt, fordított U-alakú dózis-hatás függését támasztja alá [238,270]. Az iontoforetikusan alkalmazott MLA továbbá majmok PFC-i területén is gátolja az NMDA-val kiváltott excitációt memória-feladat végzése közben: mivel ebben az állapotban feltehetően magas az ACh szintje, ez a megfigyelés hasonló az általunk a hippocampus-ban, ACh iontoforézise során leírt jelenséghez [238]. Bár kísérleti elrendezésünkben nem állt módunkban tesztelni a receptorok lokalizációját, az irodalmi adatok alapján a glutamáterg neurotranszmissziót befolyásoló α7 nAChR-ok valószínűleg preszinaptikusan helyezkednek el. Számos eredmény támasztja alá, hogy a preszinaptikus nAChR-ok aktiválása – az intracelluláris Ca2+-szint növelésén keresztül – növeli a transzmitterfelszabadulás mértékét glutamáterg terminálisokból [271–274]. Huang és mtsai (2010) [275] szintén preszinaptikus mechanizmusokkal magyarázták a CA3-as régióból elvezetett neuronok tüzelési aktivitásának növekedését lokálisan és szisztémásan alkalmazott α7 nAChR agonisták hatására, mivel a hatás gátolható volt AMPA- és NMDA-receptor antagonistákkal is. 65
Kísérleteinkben a következő modell szerint képzelhető el a preszinaptikus mechanizmus szerepe a megfigyelt jelenségben: az önmagában iontoforetizált NMDA számára – a Mg2+-blokk miatt – a posztszinaptikus denzitások NMDAR-ainak csak egy kisebb része aktiválható, amit az afferens spontán aktivitása nyomán felszabaduló glutamát által aktivált AMPAR-ok száma határoz meg. A szimultán iontoforetizált ACh preszinaptikus kötődése következtében az afferens glutamát-leadása nő, ami több AMPAR aktiválásán keresztül nagyobb valószínűséggel hozza létre a Mg2+-dugó eltávolításához szükséges membránpotenciált, így több NMDAR aktiválódhat ugyanolyan mennyiségű NMDA iontoforézisének hatására. Az AMPAR-ok szerepét ebben a folyamatban más eredmények is megerősítik: az MLA gátolja az AMPAR-függő EPSC-k kialakulását [271], továbbá hosszabb (1-3 órás) nikotin expozíció neuronális aktivitás hiányában is képes erősíteni a glutamáterg jelátvitelt a szinapszisokban azáltal, hogy serkenti az AMPAR-ok stabilizációját és akkumulációját [276]. Amennyiben a preszinaptikus mechanizmust feltételezzük megfigyeléseink hátterében, akkor az MLA hatástalansága az ACh önmagában történő iontoforézise során arra utal, hogy az α7 nAChR-ok aktiválása csak akkor jár eredménnyel a CA1 piramissejtek tüzelési aktivitására vonatkozóan, ha a kolinerg hatás mellé megfelelő időn belül társul a NMDAR-ok más forrásból származó erős aktivációja is. Újabb eredmények alapján azonban felvetődhetnek posztszinaptikus mechanizmusok is az α7 nAChR-ok glutamáterg neurotranszmissziót potencírozó hatásai mögött. A memóriafolyamatokban
szintén
résztvevő
dorzolaterális
PFC-ben
a
glutamáterg
szinapszisok
posztszinaptikus denzitásában is találtak α7 nAChR-okat [238], ami felveti annak lehetőségét, hogy ilyen elhelyezkedésű α7 nAChR-ok a hippocampus-ban is előfordulnak. Elképzelhető, hogy ezek a posztszinaptikus α7 nAChR-ok nagy Ca2+-konduktanciájuknak köszönhetően erősítik azokat az intracelluláris jelátviteli útvonalakat, melyek az NMDAR-aktiváció hatásait közvetítik [208]. Az intracelluláris folyamatok azonban feltehetően hosszabb idő alatt játszódnak le, mint a kísérletünkben elektrofiziológiai eszközökkel kimutatott jelenségek, valamint az intracelluláris útvonalak olyan átalakulásokat indukálnak (pl. AMPAR-ok expressziójának szabályozása [277]), melyek közvetlenül nem magyarázzák az iontoforetizált NMDA-ra adott válaszok növekedését. A glutamát-receptorok mellett elhelyezkedő α7 nAChR-ok kapcsán felvetődik ugyanakkor, hogy az AMPAR-okhoz hasonló permisszív szerepet is betölthetnek a glutamáterg szinapszis működésében [238], ami már jobban magyarázza az NMDAR-okon keresztüli neurotranszmisszió facilitációját. Az ACh α7 nAChR-okhoz való kötődése ebben az esetben – szemben a preszinaptikus mechanizmussal – direkt posztszinaptikus hatásokon keresztül segíti elő a megfelelő mértékű hipopolarizációt ahhoz, hogy több posztszinaptikus receptor váljon hozzáférhetővé az iontoforetizált NMDA számára. Mint fentiekben láthattuk, ez 66
a hatás potenciálisan a szinaptikus hatékonyság növeléséhez és a hosszútávú szinaptikus változások elősegítéséhez is hozzájárulhat [278]. 5.3. Összefoglaló következtetések Kutatásunkban két szinten (magatartás-farmakológia és in vivo egy-sejt elektrofiziológia) tanulmányoztuk a kolinerg és glutamáterg transzmisszió kölcsönhatásait a memóriafolyamatok szempontjából. Magatartás-farmakológiai tesztünkben az α7 nAChR agonista PHA-543613 munkamemóriára való hatását hasonlítottuk össze kolinerg illetve glutamáterg deficittel járó tranziens amnézia-modellekben. Eredményeinkből arra következtettünk, hogy az α7 nAChRok aktiválása hatékonyan visszafordítja a kolinerg neurotranszmisszió zavarából eredő memória-deficitet, ugyanakkor ehhez a kognitív serkentő hatáshoz megfelelően működő NMDARok szükségesek. Elektrofiziológiai kísérleteinkben azt vizsgáltuk, hogyan befolyásolja a lokálisan alkalmazott NMDA és ACh a hippocampalis piramissejtek aktivitását, valamint milyen interakció figyelhető meg hatásaikban együttes alkalmazásuk során, és ezekben a mechanizmusokban mely kolinerg receptor-típusok játszanak szerepet. A hippocampus CA1-es piramissejtjein az AChnak két jól körülírható hatását különítettük el: 1.) egy tónusos aktiváló hatást, ami a neuronok tüzelési frekvenciáját fokozza, valamint 2.) a glutamáterg szinapszisokkal összefüggő, NMDAR-on keresztüli transzmissziót potencírozó hatást. Szkopolaminnal és MLA-val végzett szisztémás kezelések nyomán megállapítottuk, hogy az ACh lokális hatásai közül a tónusos aktiváló hatás elsősorban a mAChR-okhoz kötődik, míg a glutamáterg transzmisszió potencírozása főleg az α7 nAChR-okon keresztül valósul meg. Magatartás-farmakológiai és elektrofiziológiai eredményeink egymással összhangban in vivo rendszerekben demonstrálják az α7 nAChR és az NMDAR kölcsönhatását, valamint a kolinerg és a glutamáterg neurotranszmisszió interakciójának kritikus szerepét a kognitív folyamatokban. A kétféle megközelítéssel mért adatok egymást kiegészítve és irodalmi adatokkal egybevetve lehetővé teszik, hogy potenciális modelleket állítsunk fel a vizsgált farmakonok amnesztikus illetve prokognitív hatásai mögött álló neurobiológiai mechanizmusokra. Hangsúlyozva a hippocampus szerepét a térbeli memóriában feltételezhetjük, hogy a szkopolaminnal kiváltott amnézia hátterében az állhat, hogy a mAChR-ok blokkolása megakadályozza, hogy a felszabaduló ACh a kódolási folyamatokhoz szükséges szintre növelje a piramissejtek tónusos aktivitását. Továbbá – irodalmi adatok alapján – a mAChR-ok antagonizmusa a neuronok tüzelésének ritmusát is felborítja, ezen a két mechanizmuson keresztül öszszességében lelassítja és pontatlanná teszi az információ továbbadását, vagyis a CA1 outputját. 67
Ebben a modellben az α7 nAChR-ok aktiválása a glutamáterg terminálisok potencírozása által serkenteni tudja a bemeneti oldalról az információ feldolgozását, ezzel erősítve a CA1 inputját. Az interneuronok α7 AChR-ainak aktivációja a piramissejtek tüzelésének időzítését modulálva részben ellensúlyozhatja a kimeneti oldal deficitjét is, így az antagonizált receptorokat „megkerülve” állítható helyre a normális működés. Az α7 agonisták tehát két útvonalon keresztül – az input és az output serkentésével – hatékonyan képesek helyreállítani a kognitív funkciókat. Az NMDAR-ok gátlása a CA1-be érkező afferensek (pl. Schaffer-kollaterális) piramissejteken létrehozott glutamáterg szinapszisaiban blokkolja a plaszticitási folyamatokat illetve megakadályozza az információ átadását a CA1-régiónak (input gátlása). Mint láthattuk, ebben az esetben kevéssé hatékony az α7 nAChR-okat célzó kognitív serkentő stratégia. Az α7 nAChRokon keresztül – direkt vagy indirekt mechanizmussal – ugyan elősegíthető a posztszinaptikus oldal hipopolarizációja illetve a glutamát-felszabadulás fokozódása, azonban az erős csatornablokkoló MK-801 jelenléte ebben az állapotban sem teszi lehetővé az NMDAR-ok megfelelő mértékű aktivációját. Enyhe kompetíciós hatások érvényesülése az NMDAR-on, vagy a CA1 piramissejtjeinek modulálása az α7 nAChR agonistával stimulált interneuronokon keresztül csekély mértékben javíthatja ugyan a hálózat működését, azonban mivel a szekvenciális információáramlás legkésőbb a CA1-régióban input hiányában megszakad, teljes mértékben nem állítható helyre a hippocampus-függő memóriafunkció. Az MLA irodalomban leírt amnesztikus hatása továbbá a piramissejteket beidegző rostok glutamát-leadásának csökkenésével magyarázható, ebben az esetben azonban a kolinerg rendszert célzó kezelések (pl. AChE gátlók) lényegesen hatékonyabbnak bizonyulnak, mivel maga az NMDAR-okon keresztül történő transzmisszió nincs közvetlenül blokkolva [80,238]. Másrészt ebben a modellben a CA1 piramissejtek ritmikus aktivitása is zavart lehet az interneuronális α7 nAChR-ok gátlása miatt. Az MLA-val kiváltott tranziens amnézia-modell ezért előnyös választás lehet a farmakológiai kísérletekben, mivel feltehetően az egyes hippocampalis területeken az információáramlásnak mind a bemeneti, mind a kimeneti oldalon létrejövő zavarát képes modellezni anélkül, hogy teljesen blokkolná a glutamáterg neurotranszmissziót. Az MLA-val végzett elektrofiziológiai kísérleteink valamint irodalmi adatok pedig arra utalnak, hogy az α7 nAChR-ok szerepe a hippocampus (illetve a PFC) glutamáterg szinapszisaiban feltétele mind a normális glutamáterg transzmissziónak, mind pedig a különféle memóriafunkciók megfelelő működésének. Végül megállapíthatjuk, hogy a kísérleteink során használt elektrofiziológiai paradigmában a magatartási hatások alapján jól prediktálható eredményeket kaptunk az alkalmazott
68
farmakonokkal, ami felveti a lehetőségét további kognitív hatású vegyületek vizsgálatának, illetve alkalmassá teheti a módszert potenciális kognitív serkentők előzetes tesztelésére. A fent leírt feltételezett mechanizmusok további tesztelésében pedig egy következő lépés lehet az α7 nAChR-ok szerepének vizsgálata az ACh tüzelési ritmust beállító hatásainak közvetítésében. A kérdés megválaszolásához a lokális mezőpotenciálok és az egysejt-aktivitás szimultán elvezetésére van szükség, ami lehetőséget ad a tüzelési aktivitás és a théta-ritmus közötti fázis-zártsági elemzések elvégzésére kontroll helyzetben valamint α7 nAChR-ligandok alkalmazása során.
69
6.
ÖSSZEFOGLALÁS Napjaink egyik legkomolyabb népegészségügyi problémáját jelentik az ún. neurokognitív
zavarok (különösen az Alzheimer-kór), melyek a tanulási képességek és a memóriaműködések leépülésével járnak, és az önellátásra való képesség teljes elvesztéséhez vezethetnek. A neurokognitív zavarok kezelésére jelenleg kevés gyógyszer áll rendelkezésre, melyek elsősorban a tünetek enyhítésére alkalmasak, és ebben is korlátozott a hatékonyságuk. Az új, hatékonyabb farmakológiai kezelések kifejlesztése érdekében fontos cél, hogy még alaposabb ismereteket
szerezzünk
a
betegségben
alapvetően
érintett
glutamáterg
és
kolinerg
neurotranszmisszió fiziológiájáról és patológiájáról. Fontos cél továbbá a jelenlegi és potenciális hatóanyagok hatásmechanizmusainak feltérképezése, valamint megfelelő állatkísérletes modellek beállítása az új gyógyszerjelölt molekulák preklinikai jellegű hatásvizsgálatára. Fenti célok szükségessé teszik a kognitív folyamatok több szerveződési szinten történő vizsgálatát a neuronok celluláris fiziológiájától kezdve a tanulási és memóriafolyamatokat vizsgáló magatartási paradigmákig. Kutatásunkban az α7 típusú nikotinos acetilkolin-receptorok (α7 nAChR) és az NMDA-típusú glutamát-receptorok (NMDAR) kölcsönhatásainak vizsgálatát tűztük ki célul a kognitív működésekkel összefüggésben. A patkányokon végzett térbeli munkamemória-tesztek (spontán alternációs paradigma) során a potens kognitív serkentő hatásokról ismert α7 nAChR agonisták közül a PHA-543613 nevű vegyület hatékonyságát hasonlítottuk össze két, különböző támadáspontú farmakológiai úton indukált amnézia-modellben. Magatartás-farmakológiai kísérleteinkben arra voltunk kíváncsiak, hogy az α7 nAChR agonista hatékonyságát hogyan befolyásolja az, ha a tranziens amnézia a muszkarinos típusú AChR-ok (mAChR) gátlásán (szkopolamin-modell) illetve az NMDAR-okon keresztüli glutamáterg neurotranszmisszió blokkolásán (MK-801-modell) alapul. A glutamáterg és kolinerg neurotranszmisszió kölcsönhatásának celluláris elektrofiziológiai szintű vizsgálata érdekében altatott patkányok hippocampus-ának CA1-es területéről extracellulárisan vezettük el piramissejtek tüzelési aktivitását. A neuronok tüzelését lokálisan (mikroiontoforézis útján) bejuttatott NMDA-val és ACh-nal moduláltuk, valamint vizsgáltuk a két receptorligand szimultán adagolása során megfigyelhető kölcsönhatásokat. Végül vizsgáltuk az NMDA illetve az ACh iontoforézise során tapasztalt elektrofiziológiai jelenségekben a különböző AChR alosztályok szerepét, ezért a kísérletek során mAChR antagonista szkopolamin illetve α7 nAChR antagonista metil-akonitin (MLA) szisztémás beadására is sor került. Magatartás-farmakológiai kísérleteink eredményei azt mutatták, hogy a PHA-543613 dózisfüggően és teljes mértékben visszafordította a szkopolamin által kiváltott memóriadeficitet, azonban lényegesen kisebb hatékonyságot mutatott azokban az állatokban, melyekben az 70
NMDAR-ok működését MK-801-el blokkoltuk. Az α7 nAChR agonista szűk dózistartományban bizonyos mértékig növelni tudta a kísérleti állatok teljesítményét az MK-801-modellben is, azonban hatása nem volt elegendő ahhoz, hogy a teljesítményt a kontroll szintre javítsa, és nem volt képes helyreállítani a fiziológiás memóriaműködést. Eredményeink arra utalnak, hogy az α7 nAChR agonisták kognitív serkentő hatása nagy mértékben összefügg az NMDAR-ok működésével, és hatékonyságukhoz elengedhetetlen megfelelő mértékben fenntartott, NMDARokon keresztül megvalósuló glutamáterg neurotranszmisszió. In vivo elektrofiziológiai kísérleteink során először is a hippocampus piramissejtes rétegének vizsgálatára optimalizáltuk a laboratóriumunkban használt egycsatornás extracelluláris elvezetési és mikroiontoforézises technikát, valamint elvégeztük a validálási kísérleteket a piramissejtek megbízható elkülönítése érdekében. A továbbiakban, már csak a piramissejtek elektrofiziológiai jelenségeit vizsgálva azt találtuk, hogy a lokálisan alkalmazott NMDA-ra és ACh-ra egyaránt a tüzelési frekvencia növelésével válaszoltak a neuronok. A két receptorligand együttes alkalmazásakor megállapítottuk, hogy az NMDAR-ok és az AChR-ok szimultán aktiválása a tüzelési frekvenciát szuperadditív módon növeli, amit az NMDAR-ok működésének kolinerg potencírozásával magyaráztunk. A szkopolamin szisztémás beadása után a lokálisan adagolt ACh tónusos serkentő hatásának csökkenését, majd teljes megszűnését tapasztaltuk, azonban az NMDA és az ACh szinergista (szuperadditív) hatását a mAChR antagonista nem befolyásolta. Az MLA szisztémás beadása után sem a spontán tüzelési frekvencia, sem a különkülön iontoforetizált NMDA illetve ACh hatása nem változott, azonban az α7 nAChR antagonista blokkolta a két receptorligand együttes, szuperadditív hatását. Az elektrofiziológiai eredményeket összegezve arra a következtetésre jutottunk, hogy a hippocampus CA1-régiójában felszabaduló ACh a mAChR-okon keresztül elsősorban a piramissejtek tónusos tüzelési frekvenciáját (ezzel együtt a CA1 kimenetét) szabályozza, az α7 nAChR-okon keresztüli kolinerg neurotranszmissziónak ugyanakkor kritikus szerepe van a CA1-be érkező glutamáterg afferensek terminálisainak, azaz a CA1 bemeneti oldalának a működésében. Mind magatartás-farmakológiai, mind in vivo elektrofiziológiai eredményeink alátámasztják a glutamáterg és a kolinerg neurotranszmisszió interakciójának kritikus szerepét a kognitív működésekben, különösen a hippocampus-függő memóriafolyamatokban. Kísérleteinkben demonstráltuk továbbá az α7 nAChR-ok fontos szerepét ebben a kölcsönhatásban. Kutatásunk hasznos adatokat biztosíthat továbbá a különböző farmakológiailag indukált amnézia-modellekben (szkopolamin, MK-801, MLA) mért eredmények interpretálásához, az általunk beállított elektrofiziológiai teszt-protokoll pedig a továbbiakban alkalmas lehet potenciális kognitív serkentő farmakonok celluláris elektrofiziológiai szintű hatásmechanizmusainak vizsgálatára. 71
7.
SUMMARY Presently, neurocognitive disorders (especially Alzheimer’s disease) are among the most
serious public health challenges, and are associated with the deterioration of learning and memory abilities, resulting in the loss of basic self-maintenance skills. Currently, relatively few medications are available for the cure of neurocognitive disorders, and are mainly used to ameliorate symptoms with a limited efficacy. As glutamatergic and cholinergic neurotransmission are substantially affected in these diseases, further research of these neurotransmitter systems may be important for the development of novel and more effective pharmacological treatments. Further progress of drug-development requires also the explanation of the mechanisms behind the action of approved and potential medications and the development of appropriate animal models for the preclinical screening of drug-candidates. These purposes require the investigation of cognitive processes on various levels of organization: from cellular neurophysiology to cognition. In the present research, we aimed to study the interaction of α7 nicotinic acetylcholine receptors (α7 nAChR) and glutamate receptors from the NMDA subtype (NMDAR) in the context of cognitive functions. We tested spatial working-memory of rats in the spontaneous alternation task to compare the efficacy of the potent α7 nAChR agonist PHA-543613 in two different pharmacologically induced amnesia models. We investigated how the efficacy of PHA-543613 depends on the type of the amnestic agent, i.e., whether the antagonism of muscarinic AChRs (mAChR, scopolamine model) or the blockade of NMDARs (MK-801 model) lies in the background of pharmacologically induced transient amnesia. For the purpose of investigating the interaction between glutamatergic and cholinergic neurotransmission on the level of in vivo cellular electrophysiology, we recorded extracellular firing activity of pyramidal cells in hippocampal CA1 region of anesthetized rats. During the electrophysiological recordings, NMDA and ACh were locally administered in discrete epochs by the means of microiontophoresis to investigate their effects on neuronal activity. Furthermore, we examined the effects of simultaneously applied NMDA and ACh on the firing activity of the recorded pyramidal cells. Finally, we tested the role of different AChR subtypes in the various effects of iontophoretized NMDA and ACh by the systemic administration of the mAChR antagonist scopolamine or the α7 nAChR antagonist methyllycaconitine (MLA). Results of the behavioral experiments showed that PHA-543613 totally reversed the memory deficit induced by the mAChR antagonist scopolamine in a dose-dependent manner. On the contrary, it was much less effective in the MK-801 model which was based on the blockade of NMDARs. Although, the α7 nAChR agonist slightly increased the performance of animals in 72
the MK-801 model, this effect was not sufficient to restore the normal working-memory function and alternation rate did not reach the control level. These findings suggest that the cognitive enhancer potential of α7 nAChR agonists is closely related to the function of NMDARs, as sustained glutamatergic transmission through the NMDARs is required for the efficacy of α7 nAChR agonists. In the electrophysiological studies, we first optimized the single-channel extracellular recording method and the microiontophoresis technique for measurements in the dense pyramidal cell layer of the hippocampal CA1 region. Next, we performed electrophysiological and pharmacological experiments with this setup to validate proper separation of neuronal signals. In further experiments, we studied the electrophysiological behavior of pyramidal cells and have found that neurons responded both to NMDA and to ACh with a significant increase in their firing frequency. Furthermore, simultaneous activation of NMDARs and AChRs by the combined administration of NMDA and ACh resulted in a superadditive increase of firing rate, which was explained by the cholinergic potentiation of NMDAR signaling. After the systemic administration of scopolamine, we reported gradual decrease in the tonic excitatory effect of locally delivered ACh, which was totally ceased till the end of the experiments. On the other hand, the mAChR antagonist scopolamine did not affect the synergistic (superadditive) effect of simultaneously iontophoretized NMDA and ACh. After the systemic administration of MLA, no changes were observed in the spontaneous firing rate and in the responses to separately iontophoretized NMDA and ACh. However, the α7 nAChR antagonist MLA blocked the superadditive effect of the simultaneous administration of NMDA and ACh. Summarizing the results of the electrophysiological experiments, we concluded that through the activation of mAChRs ACh regulates mainly the tonic firing activity of CA1 pyramidal cells (modulating the output of the CA1). On the other hand, cholinergic neurotransmission through α7 nAChRs has a substantial role in the function of afferent glutamatergic terminals, thus it affects the input of the CA1 region of the hippocampus. The present results, obtained in behavioral pharmacological and in vivo electrophysiological experiments support the critical role of glutamatergic-cholinergic interactions in cognitive functions, especially in hippocampus-dependent memory. Furthermore, we demonstrated the important role of α7 nAChR in this interaction. Our results may also provide important data for interpreting results originating from various pharmacologically induced amnesia models (e.g., scopolamine,
MK-801,
MLA).
Additionally,
the
presently
described
in
vivo
electrophysiological paradigm may be suitable to investigate the cellular mechanisms of action behind the cognitive enhancer effect of possible drug-candidates. 73
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
8.
Ezúton szeretném kifejezni hálámat a Biológiai és Sportbiológiai Doktori Iskolának és vezetőjének, Dr. Gábriel Róbert egyetemi tanárnak a doktori tanulmányaimhoz nyújtott támogatásukat. Köszönetemet szeretném kifejezni témavezetőmnek, Dr. Hernádi István egyetemi docensnek, hogy irányította és irányítja munkámat és támogatja szakmai előmenetelemet: köszönöm mindazt a segítséget, amit kaptam a tudományterület megismeréséhez, a metodikák elsajátításához és az eredményeink publikálásához. Továbbá köszönet illeti azért a sok energiáért is, amit nap, mint nap belefektet abba, hogy kutatócsoportunk sikeresen, motiváltan és jó légkörben végezhesse munkáját. Köszönöm továbbá Dr. Budai Dénesnek, a Kation Európa Bt. ügyvezetőjének, akinek a laboratóriumában eltöltött fél év alatt új technikákat sajátíthattam el, valamint azért is, hog az érdeklődésemet az α7 nAChR-ok kutatására fordította. Hálás vagyok továbbá Dr. Csoknya Mária egyetemi tanárnak és Dr. Dénes Viktória egyetemi docensnek, akik hasznos tanácsaikkal segítették értekezésem összeállítását. Köszönet illeti Dr. Trunk Attila tudományos munkatársat a statisztikai és adatfeldolgozási kérdésekben folytatott konzultációkért, továbbá dolgozatom megírását segítő hasznos tanácsaiért. Ezúton szeretnék köszönetet mondani továbbá az SzKK Magatartásélettani Kutatócsoport tagjainak, akikkel közösen végeztük illetve végezzük magatartás-farmakológiai kísérleteinket: Inkeller Juditnak, Csurgyók Rolandnak, Bruszt Nórának, Nagy Lilinek, Horváth Hajnalkának és Szántó Brigittának. Köszönöm továbbá az állatgondozóknak és asszisztenseknek, Lencse Klárának és Antal Jánosnének a kutatásaink sikere érdekében végzett precíz és alapos munkájukat, ami nélkülkülözhetetlen kísérleteink eredményes elvégzéséhez. Tisztelettel köszönöm családomnak, különösen édesanyámnak és feleségemnek a tanulmányaimhoz és munkámhoz adott támogatásukat. Külön köszönöm feleségemnek a kitartó áldozatvállalást, amivel hozzájárul nap, mint nap munkám sikeréhez és ennek a dolgozatnak a megszületéséhez.
74
9.
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 5-HT – szerotonin (5-hidroxitriptamin) ACh – acetilkolin AChE – acetilkolin-észteráz AD – Alzheimer-kór (Alzheimer’s disease) AMPA – 2-amino-3-(5-metil-3-oxo-1,2-oxazol-4-il)propánsav AMPAR – 2-amino-3-(5-metil-3-oxo-1,2-oxazol-4-il)propánsav receptor AP – anterior-posterior irány AP5 – 2-amino-5-foszfono-valeriánsav ApoE – apolipoprotein E APP – amiloid prekurzor protein Aβ – amiloid béta ChAT – kolin-acil-transzferáz DHβE – dihidro-béta-eritroidin dlPFC – dorsolateralis prefrontalis cortex DV – dorzo-ventralis irány EPSC – excitátoros posztszinaptikus áram (excitatory postsynaptic current) EPSP – excitátoros posztszinaptikus potenciál (excitatory postsynaptic potential) GABA – gamma-amino-vajsav HPD – fél-csúcs szélesség (half-peak duration) ICV – intracerebroventrikuláris IP – intraperitoneális IPSC – inhibitoros posztszinaptikus áram (inhibitory postsynaptic current) ISI – spike-közötti intervallum (inter-spike interval) LSD – legkisebb szignifikáns különbség (least significant difference) LDT – nucleus tegmentalis laterodorsalis LTM – hosszútávú memória (long-term memory) 75
LTP – hosszútávú potenciáció (long-term potentiation) mAChR – muszkarinos típusú acetilkolin receptor MEC - mekamilamin mGluR – metabotróp glutamát receptor ML – mediolaterális irány MLA – metil-akonitin MTL – mediális temporális lebeny nAChR – nikotinos típusú acetilkolin receptor NFT – neurofibrilláris köteg (neurofibrillary tangle) NMDA – N-metil-D-aszpartát NMDAR – N-metil-D-aszpartát receptor NOR – új tárgy felismerési teszt (novel object recognition) P – csúcs (peak) PCP – fenciklidin PFC – prefrontális cortex PPN – nucleus tegmentalis pedunculopontinus (pedunculopontine nucleus) PSEN – preszenilin REM – gyors szemmozgás (rapid eye-movement) SC – szubkután SHR – spontán hipertenzív patkány (spontaneously hypertensive rat) SRI – stratum radiatum interneuron STM – rövidtávú memória (short-term memory) STZ – sztreptozotocin T – hullámvölgy (trough)
76
10. IRODALOMJEGYZÉK [1]
DUDAI Y (1989). The Neurobiology of Memory: Concepts, Findings, Trends. Oxford University Press, Oxford.
[2]
JAMES W (1890). The Principles of Psychology. H. Holt and Company, New York, NY.
[3]
EBBINGHAUS H (1913). Memory: A Contribution to Experimental Psychology. Teachers College, Columbia University, New York, NY.
[4]
ROSENZWEIG MR, BENNETT EL, COLOMBO PJ, LEE DW, SERRANO PA (1993). Shortterm, intermediate-term, and long-term memories. Behav Brain Res 57:193–8.
[5]
SCOVILLE WB, MILNER B (1957). Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. J Neurol Neurosurg Psychiatry 20:11–21.
[6]
LEUNG HC, GORE JC, GOLDMAN-RAKIC PS (2002). Sustained mnemonic response in the human middle frontal gyrus during on-line storage of spatial memoranda. J Cogn Neurosci 14:659–71.
[7]
FUNAHASHI S (2006). Prefrontal cortex and working memory processes. Neuroscience 139:251–61.
[8]
TULVING E (2002). Episodic memory: from mind to brain. Annu Rev Psychol 53:1–25.
[9]
TULVING E, SCHACTER DL, MCLACHLAN DR, MOSCOVITCH M (1988). Priming of semantic autobiographical knowledge: a case study of retrograde amnesia. Brain Cogn 8:3–20.
[10] MCCLELLAND JL, MCNAUGHTON BL, O’REILLY RC (1995). Why there are complementary learning systems in the hippocampus and neortex: Insights from the successes and failures of connectionist models of learning and memory. Psychol Rev 102:419–57. [11] BAYLEY PJ, GOLD JJ, HOPKINS RO, SQUIRE LR (2005). The neuroanatomy of remote memory. Neuron 46:799–810. [12] DAVIES RR, GRAHAM KS, XUEREB JH, WILLIAMS GB, HODGES JR (2004). The human perirhinal cortex and semantic memory. Eur J Neurosci 20:2441–6. [13] ALVAREZ P, SQUIRE LR (1994). Memory consolidation and the medial temporal lobe: a simple network model. Proc Natl Acad Sci U S A 91:7041–5. [14] OLTON DS, SAMUELSON RJ (1976). Remembrance of places passed: Spatial memory in rats. J Exp Psychol Anim Behav Process 2:97–116. [15] DEACON RMJ, RAWLINS JNP (2006). T-maze alternation in the rodent. Nat Protoc 1:7– 12. [16] MORRIS R (1984). Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci Methods 11:47–60. [17] TOLMAN EC (1948). Cognitive maps in rats and men. Psychol Rev 55:189–208. [18] O’KEEFE J, NADEL L (1978). The Hippocampus as a Cognitive Map. Oxford University Press, Oxford. [19] AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION (2013). Neurocognitive Disorders. Diagnostic And Statistical Manual Of Mental Disorders. (5th ed.), American Psychiatric Association, Washington, DC. [20] FOLSTEIN MF, FOLSTEIN SE, MCHUGH PR (1975). “Mini-mental state”. A practical method for grading the cognitive state of patients for the clinician. J Psychiatr Res 77
12:189–98. [21] SWAINSON R, HODGES JR, GALTON CJ, SEMPLE J, MICHAEL A, DUNN BD, IDDON JL, ROBBINS TW, SAHAKIAN BJ (2001). Early detection and differential diagnosis of Alzheimer’s disease and depression with neuropsychological tasks. Dement Geriatr Cogn Disord 12:265–80. [22] SEABROOK G, SMITH D, BOWERY B, EASTER A, REYNOLDS T, FITZJOHN S, MORTON R, ZHENG H, DAWSON G, SIRINATHSINGHJI D, DAVIES C, COLLINGRIDGE G, HILLA R (1999). Mechanisms contributing to the deficits in hippocampal synaptic plasticity in mice lacking amyloid precursor protein. Neuropharmacology 38:349–59. [23] THINAKARAN G, KOO EH (2008). Amyloid precursor protein trafficking, processing, and function. J Biol Chem 283:29615–9. [24] BRAAK H, BRAAK E (1991). Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol:239–59. [25] BRICKELL KL, STEINBART EJ, RUMBAUGH M, PAYAMI H, SCHELLENBERG GD, VAN DEERLIN V, YUAN W, BIRD TD (2006). Early-onset Alzheimer disease in families with late-onset Alzheimer disease: a potential important subtype of familial Alzheimer disease. Arch Neurol 63:1307–11. [26] KOVACS DM, FAUSETT HJ, PAGE KJ, KIM TW, MOIR RD, MERRIAM DE, HOLLISTER RD, HALLMARK OG, MANCINI R, FELSENSTEIN KM, HYMAN BT, TANZI RE, WASCO W (1996). Alzheimer-associated presenilins 1 and 2: neuronal expression in brain and localization to intracellular membranes in mammalian cells. Nat Med 2:224–9. [27] LENDON CL, ASHALL F, GOATE AM (1997). Exploring the etiology of Alzheimer disease using molecular genetics. J Am Med Assoc 277:825–31. [28] SAUNDERS A M, STRITTMATTER WJ, SCHMECHEL D, GEORGE-HYSLOP PH, PERICAKVANCE M A, JOO SH, ROSI BL, GUSELLA JF, CRAPPER-MACLACHLAN DR, ALBERTS MJ (1993). Association of apolipoprotein E allele epsilon 4 with late-onset familial and sporadic Alzheimer’s disease. Neurology 43:1467–72. [29] ROSES AD (1996). Apolipoprotein E alleles as risk factors in Alzheimer’s disease. Annu Rev Med 47:387–400. [30] PROFENNO LA, PORSTEINSSON AP, FARAONE S V. (2010). Meta-analysis of Alzheimer’s disease risk with obesity, diabetes, and related disorders. Biol Psychiatry 67:505–12. [31] MORTIMER JA, VAN DUIJN CM, CHANDRA V, FRATIGLIONI L, GRAVES AB, HEYMAN A, JORM AF, KOKMEN E, KONDO K, ROCCA WA (1991). Head trauma as a risk factor for Alzheimer’s disease: a collaborative re-analysis of case-control studies. EURODEM Risk Factors Research Group. Int J Epidemiol 20 Suppl 2:S28–35. [32] KIVIPELTO M, NGANDU T, FRATIGLIONI L, VIITANEN M, KÅREHOLT I, WINBLAD B, HELKALA EL, TUOMILEHTO J, SOININEN H, NISSINEN A (2005). Obesity and vascular risk factors at midlife and the risk of dementia and Alzheimer disease. Arch Neurol 62:1556–60. [33] O`CARROLL R (2000). Cognitive impairment in schizophrenia. Adv Psychiatr Treat 6:161–8. [34] O’KEEFE J, DOSTROVSKY J (1971). The hippocampus as a spatial map. Preliminary evidence from unit activity in the freely-moving rat. Brain Res 34:171–5. [35] FYHN M, MOLDEN S, WITTER MP, MOSER EI, MOSER MB (2004). Spatial representation in the entorhinal cortex. Science 305:1258–64. 78
[36] HAFTING T, FYHN M, MOLDEN S, MOSER MB, MOSER EI (2005). Microstructure of a spatial map in the entorhinal cortex. Nature 436:801–6. [37] TANG Q, BURGALOSSI A, EBBESEN CL, RAY S, NAUMANN R, SCHMIDT H, SPICHER D, BRECHT M (2014). Pyramidal and stellate cell specificity of grid and border representations in layer 2 of medial entorhinal cortex. Neuron 84:1191–7. [38] KRAUS BJ, BRANDON MP, ROBINSON RJ, CONNERNEY MA, HASSELMO ME, EICHENBAUM H (2015). During running in place, grid cells integrate elapsed time and distance run. Neuron 88:578–89. [39] GOLDMAN-RAKIC P., HAVEN N (1995). Cellular basis of working memory. Neuron 14:477–85. [40] WANG M, ARNSTEN AFT (2015). Contribution of NMDA receptors to dorsolateral prefrontal cortical networks in primates. Neurosci Bull 31:191–7. [41] WANG M, YANG Y, WANG CJ, GAMO NJ, JIN LE, MAZER JA, MORRISON JH, WANG XJ, ARNSTEN AFT (2013). NMDA receptors subserve persistent neuronal firing during working memory in dorsolateral prefrontal cortex. Neuron 77:736–49. [42] CZURKÓ A (2008). Neurális és funkcionális plaszticitás. In: Kállai J, Bende I, Karádi K, Racsmány M (eds.): Bevezetés A Neuropszichológiába, p. 69–113., Medicina Könyvkiadó Zrt., Budapest. [43] HEBB DO (1949). Organization of Behavior. Wiley, New York, NY. [44] BLISS T, LOMO T (1973). Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol 232:331–56. [45] LAROCHE S, JAY TM, THIERRY AM (1990). Long-term potentiation in the prefrontal cortex following stimulation of the hippocampal CA1/subicular region. Neurosci Lett 114:184–90. [46] MORRIS RG, ANDERSON E, LYNCH GS, BAUDRY M (1986). Selective impairment of learning and blockade of long-term potentiation by an N-methyl-D-aspartate receptor antagonist, AP5. Nature 319:774–6. [47] TSIEN JZ, HUERTA PT, TONEGAWA S (1996). The essential role of hippocampal CA1 NMDA receptor–dependent synaptic plasticity in spatial memory. Cell 87:1327–38. [48] ZALUTSKY RA, NICOLL RA (1990). Comparison of two forms of long-term potentiation in single hippocampal neurons. Science 248:1619–24. [49] BOLSHAKOV VY, GOLAN H, KANDEL ER, SIEGELBAUM SA (1997). Recruitment of new sites of synaptic transmission during the cAMP-dependent late phase of LTP at CA3– CA1 synapses in the hippocampus. Neuron 19:635–51. [50] MATSUZAKI M, HONKURA N, ELLIS-DAVIES GCR, KASAI H (2004). Structural basis of long-term potentiation in single dendritic spines. Nature 429:761–6. [51] MALENKA RC, BEAR MF (2004). LTP and LTD: An embarrassment of riches. Neuron 44:5–21. [52] JAY TM, BURETTE F, LAROCHE S (1995). NMDA receptor-dependent long-term potentiation in the hippocampal afferent fibre system to the prefrontal cortex in the rat. Eur J Neurosci 7:247–50. [53] HARRIS EW, COTMAN CW (1986). Long-term potentiation of guinea pig mossy fiber responses is not blocked by N-methyl d-aspartate antagonists. Neurosci Lett 70:132–7. [54] LISMAN J, SCHULMAN H, CLINE H (2002). The molecular basis of CaMKII function in 79
synaptic and behavioural memory. Nat Rev Neurosci 3:175–90. [55] TAKAHASHI T, SVOBODA K, MALINOW R (2003). Experience strengthening transmission by driving AMPA receptors into synapses. Science 299:1585–8. [56] MALENKA RC, NICOLL RA (1999). Long-term potentiation—A decade of progress? Science (80- ) 285:1870–4. [57] ZHUO M, SMALL SA, KANDEL ER, HAWKINS RD (1993). Nitric oxide and carbon monoxide produce activity-dependent long-term synaptic enhancement in hippocampus. Science 260:1946–50. [58] SANES JR, LICHTMAN JW (1999). Can molecules explain long-term potentiation? Nat Neurosci 2:597–604. [59] COLLINGRIDGE GL, SINGER W (1990). Excitatory amino acid receptors and synaptic plasticity. Trends Pharmacol Sci 11:290–6. [60] COLLINGRIDGE GL, VOLIANSKIS A, BANNISTER N, FRANCE G, HANNA L, MERCIER M, TIDBALL P, FANG G, IRVINE MW, COSTA BM, MONAGHAN DT, BORTOLOTTO Z A, MOLNÁR E, LODGE D, JANE DE (2013). The NMDA receptor as a target for cognitive enhancement. Neuropharmacology 64:13–26. [61] SCHAEFFER EL, GATTAZ WF (2008). Cholinergic and glutamatergic alterations beginning at the early stages of Alzheimer disease: participation of the phospholipase A2 enzyme. Psychopharmacology (Berl) 198:1–27. [62] AVIGNONE E, FRENGUELLI BG, IRVING AJ (2005). Differential responses to NMDA receptor activation in rat hippocampal interneurons and pyramidal cells may underlie enhanced pyramidal cell vulnerability. Eur J Neurosci 22:3077–90. [63] ARMSTRONG DM, IKONOMOVIC MD, SHEFFIELD R, WENTHOLD RJ (1994). AMPAselective glutamate receptor subtype immunoreactivity in the entorhinal cortex of nondemented elderly and patients with Alzheimer’s disease. Brain Res 639:207–16. [64] CASANOVA MF, STEVENS JR, KLEINMAN JE (1990). Astrocytosis in the molecular layer of the dentate gyrus: a study in Alzheimer’s disease and schizophrenia. Psychiatry Res 35:149–66. [65] MORUZZI G, MAGOUN HW (1949). Brain stem reticular formation and activation of the EEG. Electroencephalogr Clin Neurophysiol 1:455–73. [66] SAPER CB, CHOU TC, SCAMMELL TE (2001). The sleep switch: Hypothalamic control of sleep and wakefulness. Trends Neurosci 24:726–31. [67] SARTER M, BRUNO JP (1999). Cortical cholinergic inputs mediating arousal, attentional processing and dreaming: Differential afferent regulation of the basal forebrain by telencephalic and brainstem afferents. Neuroscience 95:933–52. [68] FADEL J, SARTER M, BRUNO JP (2001). Basal forebrain glutamatergic modulation of cortical acetylcholine release. Synapse 39:201–12. [69] BROWN RE, BASHEER R, MCKENNA JT, STRECKER RE, MCCARLEY RW (2012). Control of sleep and wakefulness. Physiol Rev 92:1087–187. [70] ROBBINS TW (1997). Arousal systems and attentional processes. Biol Psychol 45:57– 71. [71] MESULAM MM, MUFSON EJ, WAINER BH, LEVEY AI (1983). Central cholinergic pathways in the rat: An overview based on an alternative nomenclature (Ch1–Ch6). Neuroscience 10:1185–201. [72] LALONDE R (2002). The neurobiological basis of spontaneous alternation. Neurosci 80
Biobehav Rev 26:91–104. [73] ENNACEUR A, MELIANI K (1992). A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. III. Spatial vs. non-spatial working memory. Behav Brain Res 51:83– 92. [74] DEIANA S, PLATT B, RIEDEL G (2011). The cholinergic system and spatial learning. Behav Brain Res 221:389–411. [75] HASSELMO ME (2006). The role of acetylcholine in learning and memory. Curr Opin Neurobiol 16:710–5. [76] BRAZHNIK ES, MULLER RU, FOX SE (2003). Muscarinic blockade slows and degrades the location-specific firing of hippocampal pyramidal cells. J Neurosci 23:611–21. [77] FADDA F, COCCO S, STANCAMPIANO R (2000). Hippocampal acetylcholine release correlates with spatial learning performance in freely moving rats. Neuroreport 11:2265–9. [78] KRNJEVIĆ K, ROPERT N (1982). Electrophysiological and pharmacological characteristics of facilitation of hippocampal population spikes by stimulation of the medial septum. Neuroscience 7:2165–83. [79] KANJU PM, PARAMESHWARAN K, SIMS-ROBINSON C, UTHAYATHAS S, JOSEPHSON EM, RAJAKUMAR N, DHANASEKARAN M, SUPPIRAMANIAM V (2012). Selective cholinergic depletion in medial septum leads to impaired long term potentiation and glutamatergic synaptic currents in the hippocampus. PLoS One 7:e31073. [80] ANDRIAMBELOSON E, HUYARD B, POIRAUD E, WAGNER S (2014). Methyllycaconitineand scopolamine-induced cognitive dysfunction: differential reversal effect by cognition-enhancing drugs. Pharmacol Res Perspect 2:e00048. [81] HASSELMO ME, MCGAUGHY J (2004). High acetylcholine levels set circuit dynamics for attention and encoding and low acetylcholine levels set dynamics for consolidation. Prog Brain Res 145:207–31. [82] MARROSU F, PORTAS C, MASCIA MS, CASU MA, FA M, GIAGHEDDU M, IMPERATO A, GESSA GL (1995). Microdialysis measurement of cortical and hippocampal acetylcholine-release during sleep-wake cycle in freely moving cats. Brain Res 671:329–32. [83] GAIS S, BORN J (2004). Low acetylcholine during slow-wave sleep is critical for declarative memory consolidation. Proc Natl Acad Sci U S A 101:2140–4. [84] BUZSÁKI G (1986). Hippocampal sharp waves: their origin and significance. Brain Res 398:242–52. [85] KÁLI S, ACSÁDY L (2003). A Hippocampusfüggő Memória Neurobiológiai Alapjai. In: Gulyás B, Pléh C, Kovács G (eds.): Kognitív Idegtudomány, p. 359–88., Osiris Kiadó, Budapest. [86] BUZSAKI G (1989). Two-stage model of memory trace formation: A role for “noisy” brain states. Neuroscience 31:551–70. [87] KLAUSBERGER T, SOMOGYI P (2008). Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science 321:53–7. [88] FREUND TF, ANTAL M (1988). GABA-containing neurons in the septum control inhibitory interneurons in the hippocampus. Nature 336:170–3. [89] LEE M, CHROBAK JJ, SIK A, WILEY R, BUZSÁKI G (1994). Hippocampal theta activity following selective lesion of the septal cholinergic system. Neuroscience 62:1033–47. 81
[90] DANNENBERG H, PABST M, BRAGANZA O, SCHOCH S, NIEDIEK J, BAYRAKTAR M, MORMANN F, BECK H (2015). Synergy of direct and indirect cholinergic septohippocampal pathways coordinates firing in hippocampal networks. J Neurosci 35:8394–410. [91] LAMOUR Y, DUTAR P, JOBERT A (1984). Septo-hippocampal and other medial septumdiagonal band neurons: Electrophysiological and pharmacological properties. Brain Res 309:227–39. [92] VANDECASTEELE M, VARGA V, BERÉNYI A, PAPP E, BARTHÓ P, VENANCE L, FREUND TF, BUZSÁKI G (2014). Optogenetic activation of septal cholinergic neurons suppresses sharp wave ripples and enhances theta oscillations in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci 111:13535–40. [93] KONOPACKI J, MACIVER MB, BLAND BH, ROTH SH (1987). Carbachol-induced EEG “theta” activity in hippocampal brain slices. Brain Res 405:196–8. [94] KINNEY GG, PATINO P, MERMET-BOUVIER Y, STARRETT JE, GRIBKOFF VK (1999). Cognition-enhancing drugs increase stimulated hippocampal theta rhythm amplitude in the urethane-anesthetized rat. J Pharmacol Exp Ther 291:99–106. [95] OLPE HR, KLEBS K, KÜNG E, CAMPICHE P, GLATT A, ORTMANN R, D’AMATO F, POZZA MF, MONDADORI C (1987). Cholinomimetics induce theta rhythm and reduce hippocampal pyramidal cell excitability. Eur J Pharmacol 142:275–83. [96] JENSEN O (2005). Reading the hippocampal code by theta phase-locking. Trends Cogn Sci 9:551–3. [97] DOUCHAMPS V, JEEWAJEE A, BLUNDELL P, BURGESS N, LEVER C (2013). Evidence for encoding versus retrieval scheduling in the hippocampus by theta phase and acetylcholine. J Neurosci 33:8689–704. [98] BARTUS R, DEAN R, BEER B, LIPPA A (1982). The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science (80- ) 217:408–14. [99] WHITEHOUSE PJ, PRICE DL, STRUBLE RG, CLARK AW, COYLE JT, DELON MR (1982). Alzheimer’s disease and senile dementia: loss of neurons in the basal forebrain. Science 215:1237–9. [100] DAVIES P, MALONEY AJ (1976). Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer’s disease. Lancet (London, England) 2:1403. [101] IKONOMOVIC MD, MUFSON EJ, WUU J, COCHRAN EJ, BENNETT DA, DEKOSKY ST (2003). Cholinergic plasticity in hippocampus of individuals with mild cognitive impairment: correlation with Alzheimer’s neuropathology. J Alzheimers Dis 5:39–48. [102] CANDY JM, PERRY RH, PERRY EK, IRVING D, BLESSED G, FAIRBAIRN AF, TOMLINSON BE (1983). Pathological changes in the nucleus of Meynert in Alzheimer’s and Parkinson's diseases. J Neurol Sci 59:277–89. [103] FLYNN DD, FERRARI-DILEO G, MASH DC, LEVEY AI (1995). Differential regulation of molecular subtypes of muscarinic receptors in Alzheimer’s disease. J Neurochem 64:1888–91. [104] ARAUJO DM, LAPCHAK PA, ROBITAILLE Y, GAUTHIER S, QUIRION R (1988). Differential alteration of various cholinergic markers in cortical and subcortical regions of human brain in Alzheimer’s disease. J Neurochem 50:1914–23. [105] KADIR A, ALMKVIST O, WALL A, LÅNGSTRÖM B, NORDBERG A (2006). PET imaging of cortical 11C-nicotine binding correlates with the cognitive function of attention in Alzheimer’s disease. Psychopharmacology (Berl) 188:509–20. 82
[106] YU WF, GUAN ZZ, BOGDANOVIC N, NORDBERG A (2005). High selective expression of alpha7 nicotinic receptors on astrocytes in the brains of patients with sporadic Alzheimer’s disease and patients carrying Swedish APP 670/671 mutation: a possible association with neuritic plaques. Exp Neurol 192:215–25. [107] COURT J, SPURDEN D, LLOYD S, MCKEITH I, BALLARD C, CAIRNS N, KERWIN R, PERRY R, PERRY E (1999). Neuronal nicotinic receptors in dementia with Lewy bodies and schizophrenia: alpha-bungarotoxin and nicotine binding in the thalamus. J Neurochem 73:1590–7. [108] GUAN ZZ, ZHANG X, BLENNOW K, NORDBERG A (1999). Decreased protein level of nicotinic receptor alpha7 subunit in the frontal cortex from schizophrenic brain. Neuroreport 10:1779–82. [109] MARTIN LF, FREEDMAN R (2007). Schizophrenia and the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor. Int Rev Neurobiol 78:225–46. [110] VAN DAM D, DE DEYN PP (2006). Drug discovery in dementia: the role of rodent models. Nat Rev Drug Discov 5:956–70. [111] WILLIG F, PALACIOS A, MONMAUR P, M’HARZI M, LAURENT J, DELACOUR J (1987). Short-term memory, exploration and locomotor activity in aged rats. Neurobiol Aging 8:393–402. [112] GRAY JA, MCNAUGHTON N (1983). Comparison between the behavioural effects of septal and hippocampal lesions: A review. Neurosci Biobehav Rev 7:119–88. [113] SLOAN HL, GOOD M, DUNNETT SB (2006). Double dissociation between hippocampal and prefrontal lesions on an operant delayed matching task and a water maze reference memory task. Behav Brain Res 171:116–26. [114] BOOK AA, WILEY RG, SCHWEITZER JB (1994). 192 IgG-saporin: I. Specific lethality for cholinergic neurons in the basal forebrain of the rat. J Neuropathol Exp Neurol 53:95–102. [115] MCGAUGHY J, KOENE RA, EICHENBAUM H, HASSELMO ME (2005). Cholinergic deafferentation of the entorhinal cortex in rats impairs encoding of novel but not familiar stimuli in a delayed nonmatch-to-sample task. J Neurosci 25:10273–81. [116] JOHNSON VE, STEWART W, SMITH DH (2010). Traumatic brain injury and amyloid-β pathology: a link to Alzheimer’s disease? Nat Rev Neurosci 11:361–70. [117] URYU K, LAURER H, MCINTOSH T, PRATICÒ D, MARTINEZ D, LEIGHT S, LEE VMY, TROJANOWSKI JQ (2002). Repetitive mild brain trauma accelerates Aβ deposition, lipid peroxidation, and cognitive impairment in a transgenic mouse model of Alzheimer amyloidosis. J Neurosci 22:446–54. [118] GATSON JW, SIMPKINS JW, UTESHEV V V. (2015). High therapeutic potential of positive allosteric modulation of α7 nAChRs in a rat model of traumatic brain injury: Proof-of-concept. Brain Res Bull 112:35–41. [119] PEPEU G (2004). Mild cognitive impairment: animal models. Dialogues Clin Neurosci 6:369–77. [120] SHI J, YANG SH, STUBLEY L, DAY AL, SIMPKINS JW (2000). Hypoperfusion induces overexpression of beta-amyloid precursor protein mRNA in a focal ischemic rodent model. Brain Res 853:1–4. [121] TANAKA K, OGAWA N, ASANUMA M, KONDO Y, NOMURA M (1996). Relationship between cholinergic dysfunction and discrimination learning disabilities in Wistar rats following chronic cerebral hypoperfusion. Brain Res 729:55–65. 83
[122] LEE JS, IM DS, AN YS, HONG JM, GWAG BJ, JOO IS (2011). Chronic cerebral hypoperfusion in a mouse model of Alzheimer’s disease: an additional contributing factor of cognitive impairment. Neurosci Lett 489:84–8. [123] SHIBATA M, OHTANI R, IHARA M, TOMIMOTO H (2004). White matter lesions and glial activation in a novel mouse model of chronic cerebral hypoperfusion. Stroke 35:2598– 603. [124] HOLMGREN S, HJORTH E, SCHULTZBERG M, LÄRKSÄTER M, FRENKEL D, TYSENBÄCKSTRÖM AC, AARSLAND D, FREUND-LEVI Y (2014). Neuropsychiatric symptoms in dementia - a role for neuroinflammation? Brain Res Bull 108:88–93. [125] DE FELICE FG (2013). Alzheimer’s disease and insulin resistance: translating basic science into clinical applications. J Clin Invest 123:531–9. [126] GUSTAFSON D, ROTHENBERG E, BLENNOW K, STEEN B, SKOOG I (2003). An 18-year follow-up of overweight and risk of Alzheimer disease. Arch Intern Med 163:1524–8. [127] WINOCUR G, GREENWOOD CE, PIROLI GG, GRILLO CA, REZNIKOV LR, REAGAN LP, MCEWEN BS (2005). Memory impairment in obese Zucker rats: an investigation of cognitive function in an animal model of insulin resistance and obesity. Behav Neurosci 119:1389–95. [128] GREENWOOD CE, WINOCUR G (2005). High-fat diets, insulin resistance and declining cognitive function. Neurobiol Aging 26:42–5. [129] TAKALO M, HAAPASALO A, MARTISKAINEN H, KURKINEN KM A, KOIVISTO H, MIETTINEN P, KHANDELWAL VKM, KEMPPAINEN S, KAMINSKA D, MÄKINEN P, LEINONEN V, PIHLAJAMÄKI J, SOININEN H, LAAKSO M, TANILA H, HILTUNEN M (2014). High-fat diet increases tau expression in the brain of T2DM and AD mice independently of peripheral metabolic status. J Nutr Biochem 25:634–41. [130] NITSCH R, HOYER S (1991). Local action of the diabetogenic drug, streptozotocin, on glucose and energy metabolism in rat brain cortex. Neurosci Lett 128:199–202. [131] SHARMA M, GUPTA YK (2001). Intracerebroventricular injection of streptozotocin in rats produces both oxidative stress in the brain and cognitive impairment. Life Sci 68:1021–9. [132] GRIEB P (2015). Intracerebroventricular streptozotocin injections as a model of Alzheimer’s disease: in search of a relevant mechanism. Mol Neurobiol [133] CHEN Y, LIANG Z, BLANCHARD J, DAI CL, SUN S, LEE MH, GRUNDKE-IQBAL I, IQBAL K, LIU F, GONG CX (2013). A non-transgenic mouse model (icv-STZ mouse) of Alzheimer’s disease: similarities to and differences from the transgenic model (3xTgAD mouse). Mol Neurobiol 47:711–25. [134] HAUSS-WEGRZYNIAK B, DOBRZANSKI P, STOEHR JD, WENK GL (1998). Chronic neuroinflammation in rats reproduces components of the neurobiology of Alzheimer’s disease. Brain Res 780:294–303. [135] WENK GL, MCGANN K, HAUSS-WEGRZYNIAK B, ROSI S (2003). The toxicity of tumor necrosis factor-α upon cholinergic neurons within the nucleus basalis and the role of norepinephrine in the regulation of inflammation: Implications for Alzheimer’s disease. Neuroscience 121:719–29. [136] HARKANY T, O’MAHONY S, KELLY JP, SOÓS K, TÖRÕ I, PENKE B, LUITEN PG, NYAKAS C, GULYA K, LEONARD BE (1998). Beta-amyloid(Phe(SO3H)24)25-35 in rat nucleus basalis induces behavioral dysfunctions, impairs learning and memory and disrupts cortical cholinergic innervation. Behav Brain Res 90:133–45. 84
[137] BUCCAFUSCO JJ (2009). The Revival of Scopolamine Reversal for the Assessment of Cognition-Enhancing Drugs. In: Buccafusco JJ (eds.): Methods Of Behavior Analysis In Neuroscience. (2nd ed.), p. 329–43., CRC Press, Boca Raton (FL). [138] LEVIN E, BUCCAFUSCO J (2006). Animal Models of Cognitive Impairment. CRC Press, Boca Raton (FL). [139] ELLISON G (1995). The N-methyl-D-aspartate antagonists phencyclidine, ketamine and dizocilpine as both behavioral and anatomical models of the dementias. Brain Res Brain Res Rev 20:250–67. [140] GRANON S, POUCET B, THINUS-BLANC C, CHANGEUX JP, VIDAL C (1995). Nicotinic and muscarinic receptors in the rat prefrontal cortex: differential roles in working memory, response selection and effortful processing. Psychopharmacology (Berl) 119:139–44. [141] SPOWART-MANNING L, VAN DER STAAY FJ (2004). The T-maze continuous alternation task for assessing the effects of putative cognition enhancers in the mouse. Behav Brain Res 151:37–46. [142] DANYSZ W, WROBLEWSKI JT, COSTA E (1988). Learning impairment in rats by Nmethyl-D-aspartate receptor antagonists. Neuropharmacology 27:653–6. [143] SAMBETH A, RIEDEL WJ, SMITS LT, BLOKLAND A (2007). Cholinergic drugs affect novel object recognition in rats: relation with hippocampal EEG? Eur J Pharmacol 572:151–9. [144] BUCCAFUSCO JJ, TERRY A V, WEBSTER SJ, MARTIN D, HOHNADEL EJ, BOUCHARD K A, WARNER SE (2008). The scopolamine-reversal paradigm in rats and monkeys: the importance of computer-assisted operant-conditioning memory tasks for screening drug candidates. Psychopharmacology (Berl) 199:481–94. [145] EBERT U, KIRCH W (1998). Scopolamine model of dementia: electroencephalogram findings and cognitive performance. Eur J Clin Invest 28:944–9. [146] BEATTY WW, BUTTERS N, JANOWSKY DS (1986). Patterns of memory failure after scopolamine treatment: implications for cholinergic hypotheses of dementia. Behav Neural Biol 45:196–211. [147] KLINKENBERG I, BLOKLAND A (2010). The validity of scopolamine as a pharmacological model for cognitive impairment: a review of animal behavioral studies. Neurosci Biobehav Rev 34:1307–50. [148] CHEAL ML (1981). Scopolamine disrupts maintenance of attention rather than memory processes. Behav Neural Biol 33:163–87. [149] TERRY A V (2006). Muscarinic Receptor Antagonists in Rats. In: Levin E, Buccafusco JJ (eds.): Animal Models Of Cognitive Impairment, p. 5–20., CRC Press, Boca Raton (FL). [150] ROEGGE CS, LEVIN ED (2006). Nicotinic Receptor Antagonists in Rats. In: Levin E, Buccafusco JJ (eds.): Animal Models Of Cognitive Impairment, p. 21–35., CRC Press, Boca Raton (FL). [151] CURZON P, BRIONI JD, DECKER MW (1996). Effect of intraventricular injections of dihydro-beta-erythroidine (DH beta E) on spatial memory in the rat. Brain Res 714:185–91. [152] DAVIS JA, GOULD TJ (2006). The effects of DHBE and MLA on nicotine-induced enhancement of contextual fear conditioning in C57BL/6 mice. Psychopharmacology (Berl) 184:345–52. 85
[153]
VAN DER STAAY FJ, RUTTEN K, ERB C, BLOKLAND A
(2011). Effects of the cognition impairer MK-801 on learning and memory in mice and rats. Behav Brain Res 220:215– 29.
[154] KESNER RP, HARDY JD, NOVAK JM (1983). Phencyclidine and behavior: II. Active avoidance learning and radial arm maze performance. Pharmacol Biochem Behav 18:351–6. [155] PITSIKAS N, BOULTADAKIS A, SAKELLARIDIS N (2008). Effects of sub-anesthetic doses of ketamine on rats’ spatial and non-spatial recognition memory. Neuroscience 154:454–60. [156] VERMA A, MOGHADDAM B (1996). NMDA receptor antagonists impair prefrontal cortex function as assessed via spatial delayed alternation performance in rats: modulation by dopamine. J Neurosci 16:373–9. [157] BECKER A, PETERS B, SCHROEDER H, MANN T, HUETHER G, GRECKSCH G (2003). Ketamine-induced changes in rat behaviour: A possible animal model of schizophrenia. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 27:687–700. [158] SEILLIER A, GIUFFRIDA A (2009). Evaluation of NMDA receptor models of schizophrenia: divergences in the behavioral effects of sub-chronic PCP and MK-801. Behav Brain Res 204:410–5. [159] MORGAN CJA, MUETZELFELDT L, CURRAN HV (2009). Ketamine use, cognition and psychological wellbeing: a comparison of frequent, infrequent and ex-users with polydrug and non-using controls. Addiction 104:77–87. [160] MALHOTRA A (1996). NMDA receptor function and human cognition: the effects of ketamine in healthy volunteers. Neuropsychopharmacology 14:301–7. [161] PAULE MG, LI M, ALLEN RR, LIU F, ZOU X, HOTCHKISS C, HANIG JP, PATTERSON T A., SLIKKER W, WANG C (2011). Ketamine anesthesia during the first week of life can cause long-lasting cognitive deficits in rhesus monkeys. Neurotoxicol Teratol 33:220– 30. [162] NISHIMURA M, SATO K (1999). Ketamine stereoselectively inhibits rat dopamine transporter. Neurosci Lett 274:131–4. [163] CARBONI E, IMPERATO A, PEREZZANI L, DI CHIARA G (1989). Amphetamine, cocaine, phencyclidine and nomifensine increase extracellular dopamine concentrations preferentially in the nucleus accumbens of freely moving rats. Neuroscience 28:653– 61. [164] ZHANG X, GONG ZH, NORDBERG A (1994). Effects of chronic treatment with (+)- and (-)-nicotine on nicotinic acetylcholine receptors and N-methyl-D-aspartate receptors in rat brain. Brain Res 644:32–9. [165] RUNG JP, CARLSSON A, RYDÉN MARKINHUHTA K, CARLSSON ML (2005). (+)-MK-801 induced social withdrawal in rats; a model for negative symptoms of schizophrenia. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 29:827–32. [166] FURUIE H, YAMADA K, ICHITANI Y (2013). MK-801-induced and scopolamine-induced hyperactivity in rats neonatally treated chronically with MK-801. Behav Pharmacol 24:678–83. [167] WEDZONY K, KLIMEK V, GOŁEMBIOWSKA K (1993). MK-801 elevates the extracellular concentration of dopamine in the rat prefrontal cortex and increases the density of striatal dopamine D1 receptors. Brain Res 622:325–9. [168] IRIFUNE M, SHIMIZU T, NOMOTO M (1991). Ketamine-induced hyperlocomotion 86
associated with alteration of presynaptic components of dopamine neurons in the nucleus accumbens of mice. Pharmacol Biochem Behav 40:399–407. [169] FRANCIS PT, PALMER AM, SNAPE M, WILCOCK GK (1999). The cholinergic hypothesis of Alzheimer’s disease: a review of progress. J Neurol Neurosurg Psychiatry 66:137– 47. [170] LIANG YQ, TANG XC (2004). Comparative effects of huperzine A, donepezil and rivastigmine on cortical acetylcholine level and acetylcholinesterase activity in rats. Neurosci Lett 361:56–9. [171] LANE RM, KIVIPELTO M, GREIG NH (2004). Acetylcholinesterase and its inhibition in Alzheimer disease. Clin Neuropharmacol 27:141–9. [172] MCGLEENON BM, DYNAN KB, PASSMORE AP (1999). Acetylcholinesterase inhibitors in Alzheimer’s disease. Br J Clin Pharmacol 48:471–80. [173] CSERNANSKY JG, MARTIN M, SHAH R, BERTCHUME A, COLVIN J, DONG H (2005). Cholinesterase inhibitors ameliorate behavioral deficits induced by MK-801 in mice. Neuropsychopharmacology 30:2135–43. [174] YAMADA K, TAKAYANAGI M, KAMEI H, NAGAI T, DOHNIWA M, KOBAYASHI K, YOSHIDA S, OHHARA T, TAKAUMA K, NABESHIMA T (2005). Effects of memantine and donepezil on amyloid β-induced memory impairment in a delayed-matching to position task in rats. Behav Brain Res 162:191–9. [175] PARSONS CG, STÖFFLER A, DANYSZ W (2007). Memantine: a NMDA receptor antagonist that improves memory by restoration of homeostasis in the glutamatergic system--too little activation is bad, too much is even worse. Neuropharmacology 53:699–723. [176] MINKEVICIENE R, BANERJEE P, TANILA H (2004). Memantine improves spatial learning in a transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. J Pharmacol Exp Ther 311:677– 82. [177] MINKEVICIENE R, BANERJEE P, TANILA H (2008). Cognition-enhancing and anxiolytic effects of memantine. Neuropharmacology 54:1079–85. [178] SAAB BJ, LUCA RM, YUEN WB, SAAB AMP, RODER JC (2011). Memantine affects cognitive flexibility in the morris water maze. J Alzheimer’s Dis 27:477–82. [179] FRANKIEWICZ T, PARSONS CG (1999). Memantine restores long term potentiation impaired by tonic N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor activation following reduction of Mg2+ In hippocampal slices. Neuropharmacology 38:1253–9. [180] ZAJACZKOWSKI W, FRANKIEWICZ T, PARSONS CG, DANYSZ W (1997). Uncompetitive NMDA receptor antagoists attenuate NMDA-induced impairment of passive avoidance learning and LTP. Neuropharmacology 36:961–71. [181] DANYSZ W, PARSONS CG (2003). The NMDA receptor antagonist memantine as a symptomatological and neuroprotective treatment for Alzheimer’s disease: preclinical evidence. Int J Geriatr Psychiatry 18:S23–32. [182] FROESTL W, MUHS A, PFEIFER A (2013). Cognitive enhancers (nootropics). Part 1: drugs interacting with receptors. J Alzheimers Dis 33:793–887. [183] FROESTL W, MUHS A, PFEIFER A (2013). Cognitive enhancers (nootropics). Part 2: Drugs interacting with enzymes. J Alzheimer’s Dis 33:547–658. [184] FROESTL W, PFEIFER A, MUHS A (2013). Cognitive enhancers (nootropics). Part 3: drugs interacting with targets other than receptors or enzymes. disease-modifying drugs. J Alzheimers Dis 34:1–114. 87
[185] WALLACE TL, PORTER RHP (2011). Targeting the nicotinic alpha7 acetylcholine receptor to enhance cognition in disease. Biochem Pharmacol 82:891–903. [186] KITA Y, AGO Y, TAKANO E, FUKADA A, TAKUMA K, MATSUDA T (2012). Galantamine increases hippocampal insulin-like growth factor 2 expression via α7 nicotinic acetylcholine receptors in mice. Psychopharmacology (Berl):543–51. [187] PRICKAERTS J, VAN GOETHEM NP, CHESWORTH R, SHAPIRO G, BOESS FG, METHFESSEL C, RENEERKENS OAH, FLOOD DG, HILT D, GAWRYL M, BERTRAND S, BERTRAND D, KÖNIG G (2012). EVP-6124, a novel and selective α7 nicotinic acetylcholine receptor partial agonist, improves memory performance by potentiating the acetylcholine response of α7 nicotinic acetylcholine receptors. Neuropharmacology 62:1099–110. [188] RONCARATI R, SCALI C, COMERY TA, GRAUER SM, ASCHMI S, BOTHMANN H, JOW B, KOWAL D, GIANFRIDDO M, KELLEY C, ZANELLI U, GHIRON C, HAYDAR S, DUNLOP J, TERSTAPPEN GC (2009). Procognitive and neuroprotective activity of a novel alpha7 nicotinic acetylcholine receptor agonist for treatment of neurodegenerative and cognitive disorders. J Pharmacol Exp Ther 329:459–68. [189] TIMMERMANN DB, GRØNLIEN JH, KOHLHAAS KL, NIELSEN EØ, DAM E, JØRGENSEN TD, AHRING PK, PETERS D, HOLST D, CHRISTENSEN JK, CHRSITENSEN JK, MALYSZ J, BRIGGS CA, GOPALAKRISHNAN M, OLSEN GM (2007). An allosteric modulator of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor possessing cognition-enhancing properties in vivo. J Pharmacol Exp Ther 323:294–307. [190] REDROBE JP, NIELSEN EØ, CHRISTENSEN JK, PETERS D, TIMMERMANN DB, OLSEN GM (2009). Alpha7 nicotinic acetylcholine receptor activation ameliorates scopolamineinduced behavioural changes in a modified continuous Y-maze task in mice. Eur J Pharmacol 602:58–65. [191] LEVIN ED, BETTEGOWDA C, BLOSSER J, GORDON J (1999). AR-R17779, and alpha7 nicotinic agonist, improves learning and memory in rats. Behav Pharmacol 10:675–80. [192] MARIGHETTO A, VALERIO S, DESMEDT A, PHILIPPIN JN, TROCMÉ-THIBIERGE C, MORAIN P (2008). Comparative effects of the alpha7 nicotinic partial agonist, S 24795, and the cholinesterase inhibitor, donepezil, against aging-related deficits in declarative and working memory in mice. Psychopharmacology (Berl) 197:499–508. [193] PICHAT P, BERGIS OE, TERRANOVA JP, URANI A, DUARTE C, SANTUCCI V, GUEUDET C, VOLTZ C, STEINBERG R, STEMMELIN J, OURY-DONAT F, AVENET P, GRIEBEL G, SCATTON B (2007). SSR180711, a novel selective alpha7 nicotinic receptor partial agonist: (II) efficacy in experimental models predictive of activity against cognitive symptoms of schizophrenia. Neuropsychopharmacology 32:17–34. [194] WALLACE TL, CALLAHAN PM, TEHIM A, BERTRAND D, TOMBAUGH G, WANG S, XIE W, ROWE WB, ONG V, GRAHAM E, TERRY A V, RODEFER JS, HERBERT B, MURRAY M, PORTER R, SANTARELLI L, LOWE DA (2011). RG3487, a novel nicotinic α7 receptor partial agonist, improves cognition and sensorimotor gating in rodents. J Pharmacol Exp Ther 336:242–53. [195] PRENDERGAST MA, HARRIS BR, MAYER S, HOLLEY RC, PAULY JR, LITTLETON JM (2001). Nicotine exposure reduces N-methyl-D-aspartate toxicity in the hippocampus: relation to distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit. Med Sci Monit 7:1153–60. [196] WISHKA DG, WALKER DP, YATES KM, REITZ SC, JIA S, MYERS JK, OLSON KL, JACOBSEN EJ, WOLFE ML, GROPPI VE, HANCHAR AJ, THORNBURGH BA, CORTESBURGOS LA, WONG EHF, STATON BA, RAUB TJ, HIGDON NR, WALL TM, HURST RS, WALTERS RR, HOFFMANN WE, HAJOS M, FRANKLIN S, CAREY G, GOLD LH, COOK KK, 88
SANDS SB, ZHAO SX, SOGLIA JR, KALGUTKAR AS, ARNERIC SP, ROGERS BN (2006). Discovery of N-[(3R)-1-azabicyclo[2.2.2]oct-3-yl]furo[2,3-c]pyridine-5-carboxamide, an agonist of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor, for the potential treatment of cognitive deficits in schizophrenia: synthesis and structure--activity relationship. J Med Chem 49:4425–36. [197] BARAK S, ARAD M, DE LEVIE A, BLACK MD, GRIEBEL G, WEINER I (2009). Procognitive and antipsychotic efficacy of the alpha7 nicotinic partial agonist SSR180711 in pharmacological and neurodevelopmental latent inhibition models of schizophrenia. Neuropsychopharmacology 34:1753–63. [198] STEVENS KE, KEM WR, MAHNIR VM, FREEDMAN R (1998). Selective alpha7-nicotinic agonists normalize inhibition of auditory response in DBA mice. Psychopharmacology (Berl) 136:320–7. [199] O’DONNELL CJ, ROGERS BN, BRONK BS, BRYCE DK, COE JW, COOK KK, DUPLANTIER AJ, EVRARD E, HAJÓS M, HOFFMANN WE, HURST RS, MAKLAD N, MATHER RJ, MCLEAN S, NEDZA FM, O’NEILL BT, PENG L, QIAN W, ROTTAS MM, SANDS SB, SCHMIDT AW, SHRIKHANDE A V, SPRACKLIN DK, WONG DF, ZHANG A, ZHANG L (2010). Discovery of 4-(5-methyloxazolo[4,5-b]pyridin-2-yl)-1,4diazabicyclo[3.2.2]nonane (CP-810,123), a novel alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor agonist for the treatment of cognitive disorders in schizophrenia: synthesis, SAR development, and in vivo efficacy in cognition models. J Med Chem 53:1222–37. [200] SÉGUÉLA P, WADICHE J, DINELEY-MILLER K, DANI JA, PATRICK JW (1993). Molecular cloning, functional properties, and distribution of rat brain alpha 7: a nicotinic cation channel highly permeable to calcium. J Neurosci 13:596–604. [201] BREESE CR, ADAMS C, LOGEL J, DREBING C, ROLLINS Y, BARNHART M, SULLIVAN B, DEMASTERS BK, FREEDMAN R, LEONARD S (1997). Comparison of the regional expression of nicotinic acetylcholine receptor alpha7 mRNA and [125I]-alphabungarotoxin binding in human postmortem brain. J Comp Neurol 387:385–98. [202] LENDVAI B, VIZI E (2008). Nonsynaptic chemical transmission through nicotinic acetylcholine receptors. Physiol Rev 88:333–49. [203] DANI JA, BERTRAND D (2007). Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system. Annu Rev Pharmacol Toxicol 47:699–729. [204] ZAPPETTINI S, GRILLI M, LAGOMARSINO F, CAVALLERO A, FEDELE E, MARCHI M (2011). Presynaptic nicotinic α7 and non-α7 receptors stimulate endogenous GABA release from rat hippocampal synaptosomes through two mechanisms of action. PLoS One 6:e16911. [205] MARCHI M, RISSO F, VIOLA C, CAVAZZANI P, RAITERI M (2002). Direct evidence that release-stimulating alpha7* nicotinic cholinergic receptors are localized on human and rat brain glutamatergic axon terminals. J Neurochem 80:1071–8. [206] SUMMERS KL, KEM WR, GIACOBINI E (1997). Nicotinic agonist modulation of neurotransmitter levels in the rat frontoparietal cortex. Jpn J Pharmacol 74:139–46. [207] GE S, DANI JA (2005). Nicotinic acetylcholine receptors at glutamate synapses facilitate long-term depression or potentiation. J Neurosci 25:6084–91. [208] BITNER RS, BUNNELLE WH, ANDERSON DJ, BRIGGS CA, BUCCAFUSCO J, CURZON P, DECKER MW, FROST JM, GRONLIEN JH, GUBBINS E, LI J, MALYSZ J, MARKOSYAN S, MARSH K, MEYER MD, NIKKEL AL, RADEK RJ, ROBB HM, TIMMERMANN D, SULLIVAN JP, GOPALAKRISHNAN M (2007). Broad-Spectrum Efficacy across Cognitive Domains 89
by alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor Agonism Correlates with Activation of ERK1/2 and CREB Phosphorylation Pathways. J Neurosci 27:10578–87. [209] QUICK MW, LESTER RAJ (2002). Desensitization of neuronal nicotinic receptors. J Neurobiol 53:457–78. [210] GINIATULLIN R, NISTRI A, YAKEL JL (2005). Desensitization of nicotinic ACh receptors: Shaping cholinergic signaling. Trends Neurosci 28:371–8. [211] PICCIOTTO MR (2003). Nicotine as a modulator of behavior: beyond the inverted U. Trends Pharmacol Sci 24:493–9. [212] BEJAR C, WANG RH, WEINSTOCK M (1999). Effect of rivastigmine on scopolamineinduced memory impairment in rats. Eur J Pharmacol 383:231–40. [213] WOOLLEY ML, MARSDEN C A, SLEIGHT AJ, FONE KCF (2003). Reversal of a cholinergic-induced deficit in a rodent model of recognition memory by the selective 5HT6 receptor antagonist, Ro 04-6790. Psychopharmacology (Berl) 170:358–67. [214] PAXINOS G, WATSON C (2014). The Rat Brain In Stereotaxic Coordinates. (7th ed.). Elsevier Academic Press, San Diego, CA. [215] HAZAN L, ZUGARO M, BUZSÁKI G (2006). Klusters, NeuroScope, NDManager: a free software suite for neurophysiological data processing and visualization. J Neurosci Methods 155:207–16. [216] CSICSVARI J, HIRASE H, CZURKO A, BUZSÁKI G (1998). Reliability and state dependence of pyramidal cell-interneuron synapses in the hippocampus: an ensemble approach in the behaving rat. Neuron 21:179–89. [217] TRUNK A, STEFANICS G, ZENTAI N, BACSKAY I, FELINGER A, THURÓCZY G, HERNÁDI I (2015). Effects of concurrent caffeine and mobile phone exposure on local target probability processing in the human brain. Sci Rep 5:14434. [218] R CORE TEAM R: A language and environment for statistical computing. 2015; URL: http://www.r-project.org/ [219] BATES D, MÄCHLER M, BOLKER B, WALKER S (2014). Fitting Linear Mixed-Effects Models using lme4. J Stat Softw [220] KUZNETSOVA A, BROCKHOFF PB, CHRISTENSEN RHB lmerTest: Tests in linear mixed effects models. 2015; URL: http://cran.r-project.org/package=lmerTest [221] LENTH R V, HERVÉ M lsmeans: least-squares means. 2015; URL: http://cran.rproject.org/package=lsmeans [222] HOLM S (1979). A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand J Stat 6:65–70. [223] WICKHAM H (2009). ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. Springer, New York, NY. [224] FLORESCO SB, TSE MTL, GHODS-SHARIFI S (2008). Dopaminergic and glutamatergic regulation of effort- and delay-based decision making. Neuropsychopharmacology 33:1966–79. [225] COTTONE P, IEMOLO A, NARAYAN AR, KWAK J, MOMANEY D, SABINO V (2013). The uncompetitive NMDA receptor antagonists ketamine and memantine preferentially increase the choice for a small, immediate reward in low-impulsive rats. Psychopharmacology (Berl) 226:127–38. [226] FLETCHER PJ, RIZOS Z, NOBLE K, HIGGINS GA (2011). Impulsive action induced by amphetamine, cocaine and MK801 is reduced by 5-HT(2C) receptor stimulation and 590
HT(2A) receptor blockade. Neuropharmacology 61:468–77. [227] BROWN JW, RUETER LE, ZHANG M (2014). Predictive validity of a MK-801-induced cognitive impairment model in mice: implications on the potential limitations and challenges of modeling cognitive impairment associated with schizophrenia preclinically. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 49:53–62. [228] BONAVENTURE P, ALUISIO L, SHOBLOCK J, BOGGS JD, FRASER IC, LORD B, LOVENBERG TW, GALICI R (2011). Pharmacological blockade of serotonin 5-HT7 receptor reverses working memory deficits in rats by normalizing cortical glutamate neurotransmission. PLoS One 6:e20210. [229] ANDREASEN JT, REDROBE JP, NIELSEN EØ, CHRISTENSEN JK, OLSEN GM, PETERS D (2013). A combined α7 nicotinic acetylcholine receptor agonist and monoamine reuptake inhibitor, NS9775, represents a novel profile with potential benefits in emotional and cognitive disturbances. Neuropharmacology 73:183–91. [230] MUMBY DG, GASKIN S, GLENN MJ, SCHRAMEK TE, LEHMANN H (2002). Hippocampal damage and exploratory preferences in rats: memory for objects, places, and contexts. Learn Mem 9:49–57. [231] BUSSEY TJ, DUCK J, MUIR JL, AGGLETON JP (2000). Distinct patterns of behavioural impairments resulting from fornix transection or neurotoxic lesions of the perirhinal and postrhinal cortices in the rat. Behav Brain Res 111:187–202. [232] FOX GB (2004). Model of Attention Deficit Hyperactivity Disorder: Five-Trial, Repeated Acquisition Inhibitory Avoidance in Spontaneously Hypertensive Rat Pups. Current Protocols In Pharmacology, p. 5.37.1–11., John Wiley and Sons, Inc., New York, NY. [233] SCHULZ D, HUSTON JP, JEZEK K, HAAS HL, ROTH-HARER A., SELBACH O, LUHMANN HJ (2002). Water maze performance, exploratory activity, inhibitory avoidance and hippocampal plasticity in aged superior and inferior learners. Eur J Neurosci 16:2175– 85. [234] ROOZENDAAL B, CARMI O, MCGAUGH JL (1996). Adrenocortical suppression blocks the memory-enhancing effects of amphetamine and epinephrine. Proc Natl Acad Sci U S A 93:1429–33. [235] KELLAR KJ, MARTINO AM, HALL DP, SCHWARTZ RD, TAYLOR RL (1985). Highaffinity binding of [3H]acetylcholine to muscarinic cholinergic receptors. J Neurosci 5:1577–82. [236] GOPALAKRISHNAN M, BUISSON B, TOUMA E, GIORDANO T, CAMPBELL JE, HU IC, DONNELLY-ROBERTS D, ARNERIC SP, BERTRAND D, SULLIVAN JP (1995). Stable expression and pharmacological properties of the human alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor. Eur J Pharmacol 290:237–46. [237] DREVER BD, ANDERSON WGL, JOHNSON H, O’CALLAGHAN M, SEO S, CHOI DY, RIEDEL G, PLATT B (2007). Memantine acts as a cholinergic stimulant in the mouse hippocampus. J Alzheimers Dis 12:319–33. [238] YANG Y, PASPALAS CD, JIN LE, PICCIOTTO MR, ARNSTEN AFT, WANG M (2013). Nicotinic α7 receptors enhance NMDA cognitive circuits in dorsolateral prefrontal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A 110:12078–83. [239] FREY KA, EHRENKAUFER RL, BEAUCAGE S, AGRANOFF BW (1985). Quantitative in vivo receptor binding. I. Theory and application to the muscarinic cholinergic receptor. J Neurosci 5:421–8. [240] FALSAFI SK, DELI A, HÖGER H, POLLAK A, LUBEC G (2012). Scopolamine 91
administration modulates muscarinic, nicotinic and NMDA receptor systems. PLoS One 7:e32082. [241] RANCK JB (1973). Studies on single neurons in dorsal hippocampal formation and septum in unrestrained rats. I. Behavioral correlates and firing repertoires. Exp Neurol 41:461–531. [242] MCQUISTON AR, MADISON D V (1999). Nicotinic receptor activation excites distinct subtypes of interneurons in the rat hippocampus. J Neurosci 19:2887–96. [243] MIZUSEKI K, SIROTA A, PASTALKOVA E, BUZSÁKI G (2009). Theta oscillations provide temporal windows for local circuit computation in the entorhinal-hippocampal loop. Neuron 64:267–80. [244] FOX SE, RANCK JB (1981). Electrophysiological characteristics of hippocampal complex-spike cells and theta cells. Exp Brain Res 41-41:399–410. [245] LACKAMP A, ZHANG GC, MAO LM, FIBUCH EE, WANG JQ (2009). Loss of surface Nmethyl-D-aspartate receptor proteins in mouse cortical neurones during anaesthesia induced by chloral hydrate in vivo. Br J Anaesth 102:515–22. [246] MARTINA M, COMAS T, MEALING GAR (2013). Selective Pharmacological Modulation of Pyramidal Neurons and Interneurons in the CA1 Region of the Rat Hippocampus. Front Pharmacol 4:24. [247] SEGAL M, GREENBERGER V (1992). Acidic amino acids evoke a smaller [Ca2+]i rise in GABAergic than non-GABAergic hippocampal neurons. Neurosci Lett 140:243–6. [248] NYÍRI G, STEPHENSON F, FREUND T, SOMOGYI P (2003). Large variability in synaptic nmethyl-d-aspartate receptor density on interneurons and a comparison with pyramidalcell spines in the rat hippocampus. Neuroscience 119:347–63. [249] BISCOE TJ, STRAUGHAN DW (1966). Micro-electrophoretic studies of neurones in the cat hippocampus. J Physiol 183:341–59. [250] BLAND BH, KOSTOPOULOS GK, PHILLIS JW (1974). Acetylcholine sensitivity of hippocampal formation neurons. Can J Physiol Pharmacol 52:966–71. [251] DODD J, DINGLEDINE R, KELLY JS (1981). The excitatory action of acetylcholine on hippocampal neurones of the guinea pig and rat maintained in vitro. Brain Res 207:109–27. [252] BIRD SJ, AGHAJANIAN GK (1976). The cholinergic pharmacology of hippocampal pyramidal cells: a microiontophoretic study. Neuropharmacology 15:273–82. [253] COLE AE, NICOLL RA (1984). The pharmacology of cholinergic excitatory responses in hippocampal pyramidal cells. Brain Res 305:283–90. [254] BEN-ARI Y, KRNJEVIĆ K, REINHARDT W, ROPERT N (1981). Intracellular observations on the disinhibitory action of acetylcholine in the hippocampus. Neuroscience 6:2475– 84. [255] BUHLER A V, DUNWIDDIE T V (2002). Alpha7 nicotinic acetylcholine receptors on GABAergic interneurons evoke dendritic and somatic inhibition of hippocampal neurons. J Neurophysiol 87:548–57. [256] STEWART M, LUO Y, FOX SE (1992). Effects of atropine on hippocampal theta cells and complex-spike cells. Brain Res 591:122–8. [257] PAGLIARDINI S, GOSGNACH S, DICKSON CT (2013). Spontaneous sleep-like brain state alternations and breathing characteristics in urethane anesthetized mice. PLoS One 8:e70411. 92
[258] DASARI S, GULLEDGE AT (2011). M1 and M4 receptors modulate hippocampal pyramidal neurons. J Neurophysiol 105:779–92. [259] GRIGUOLI M, SCURI R, RAGOZZINO D, CHERUBINI E (2009). Activation of nicotinic acetylcholine receptors enhances a slow calcium-dependent potassium conductance and reduces the firing of stratum oriens interneurons. Eur J Neurosci 30:1011–22. [260] THINSCHMIDT JS, FRAZIER CJ, KING MA, MEYER EM, PAPKE RL (2005). Medial septal/diagonal band cells express multiple functional nicotinic receptor subtypes that are correlated with firing frequency. Neurosci Lett 389:163–8. [261] FREUND TF, BUZSÁKI G (1996). Interneurons of the hippocampus. Hippocampus 6:347–470. [262] ALKONDON M, ALBUQUERQUE EX (2001). Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 and alpha4beta2 subtypes differentially control GABAergic input to CA1 neurons in rat hippocampus. J Neurophysiol 86:3043–55. [263] JI D, DANI JA (2000). Inhibition and disinhibition of pyramidal neurons by activation of nicotinic receptors on hippocampal interneurons. J Neurophysiol 83:2682–90. [264] MARKRAM H, SEGAL M (1990). Acetylcholine potentiates responses to N-methyl-Daspartate in the rat hippocampus. Neurosci Lett 113:62–5. [265] MARKRAM H, SEGAL M (1990). Long-lasting facilitation of excitatory postsynaptic potentials in the rat hippocampus by acetylcholine. J Physiol 427:381–93. [266]
DE SEVILLA DF, CABEZAS C, DE PRADA ANO, SÁNCHEZ-JIMÉNEZ A, BUÑO W
(2002). Selective muscarinic regulation of functional glutamatergic Schaffer collateral synapses in rat CA1 pyramidal neurons. J Physiol 545:51–63.
[267] VOGT KE, REGEHR WG (2001). Cholinergic modulation of excitatory synaptic transmission in the CA3 area of the hippocampus. J Neurosci 21:75–83. [268] FREUND RK, JUNGSCHAFFER DA, COLLINS AC (1990). Nicotine effects in mouse hippocampus are blocked by mecamylamine, but not other nicotinic antagonists. Brain Res 511:187–91. [269] BANERJEE J, ALKONDON M, ALBUQUERQUE EX, PEREIRA EFR (2013). Contribution of CA3 and CA1 pyramidal neurons to the tonic alpha7 nAChR-dependent glutamatergic input to CA1 pyramidal neurons. Neurosci Lett 554:167–71. [270] LAGOSTENA L, TROCME-THIBIERGE C, MORAIN P, CHERUBINI E (2008). The partial alpha7 nicotine acetylcholine receptor agonist S 24795 enhances long-term potentiation at CA3-CA1 synapses in the adult mouse hippocampus. Neuropharmacology 54:676– 85. [271] BANERJEE J, ALKONDON M, ALBUQUERQUE EX (2012). Kynurenic acid inhibits glutamatergic transmission to CA1 pyramidal neurons via alpha7 nAChR-dependent and -independent mechanisms. Biochem Pharmacol 84:1078–87. [272] HUANG M, FELIX AR, FLOOD DG, BHUVANESWARAN C, HILT D, KOENIG G, MELTZER HY (2014). The novel α7 nicotinic acetylcholine receptor agonist EVP-6124 enhances dopamine, acetylcholine, and glutamate efflux in rat cortex and nucleus accumbens. Psychopharmacology (Berl):4541–51. [273] UTESHEV V V (2012). α7 nicotinic ACh receptors as a ligand-gated source of Ca(2+) ions: the search for a Ca(2+) optimum. Adv Exp Med Biol 740:603–38. [274] MCGEHEE DS, HEATH MJ, GELBER S, DEVAY P, ROLE LW (1995). Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors. Science 269:1692–6. 93
[275] HUANG LT, SHERWOOD JL, SUN YJ, LODGE D, WANG Y (2010). Activation of presynaptic alpha7 nicotinic receptors evokes an excitatory response in hippocampal CA3 neurones in anaesthetized rats: an in vivo iontophoretic study. Br J Pharmacol 159:554–65. [276] HALFF AW, GÓMEZ-VARELA D, JOHN D, BERG DK (2014). A novel mechanism for nicotinic potentiation of glutamatergic synapses. J Neurosci 34:2051–64. [277] KIM MJ, DUNAH AW, WANG YT, SHENG M (2005). Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking. Neuron 46:745–60. [278] JI D, LAPE R, DANI JA (2001). Timing and location of nicotinic activity enhances or depresses hippocampal synaptic plasticity. Neuron 31:131–41.
94
11. PUBLIKÁCIÓS LISTA 11.1. A PhD értekezés alapjául szolgáló közlemények BALI ZK, BUDAI D, HERNÁDI I (2014). Separation of electrophysiologically distinct neuronal populations in the rat hippocampus for neuropharmacological testing under in vivo conditions. Acta Biol Hung 65:241–51. IF: 0,589 BALI ZK, INKELLER J, CSURGYÓK R, BRUSZT N, HORVÁTH H, HERNÁDI I (2015). Differential effects of α7 nicotinic receptor agonist PHA-543613 on spatial memory performance of rats in two distinct pharmacological dementia models. Behav Brain Res 278:404–10. IF: 3,028 (2014) Előkészítés alatt: BALI ZK, NAGY LV, HERNÁDI I. Differential effects of systemically applied cholinolytic amnestic agents on synergistic interplay of glutamatergic and and cholinergic neurotransmission on firing activity of hippocampal CA1 neurons in vivo. (In preparation) 11.2. A PhD értekezés témájában készült konferencia-előadások és absztraktok BALI ZK, BUDAI D, HERNÁDI I (2013). The effects of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor agonist PHA 543613 on maintained and NMDA-evoked firing activity of CA1 hippocampal neurons in vivo. XIV. Conference of the Hungarian Neuroscience Society; Budapest, Magyarország. (abstract) BALI Z, BUDAI D, INKELLER J, CSURGYÓK R, BRUSZT N, HORVÁTH H, HERNÁDI I (2014). Targeting hippocampal alpha7 nicotinic receptors with potent agonist PHA-543613 enhances cognitive function through network stabilization I: In vivo electrophysiological aspects. 9th FENS Forum of Neuroscience; Milan, Italy. (abstract) BALI ZK, BUDAI D, INKELLER J, CSURGYÓK R, BRUSZT N, HORVÁTH H, HERNÁDI I (2014). Cognitive Enhancement Through Stabilization of the Hippocampal Network: The role of alpha7 nicotinic receptor mediated mechanisms as indexed with in vivo extracellular electrophysiology. IBRO Workshop 2014, Debrecen; Debrecen, Magyarország. (abstract) BALI ZK (2014). Az alfa7 nikotinos receptor agonista PHA-543613 hatásai a hippokampális neuronok tüzelési aktivitására valamint a térbeli munkamemóriára Wistar patkányokban. Pécsi Tudományegyetem Idegtudományi Centrum/Szentágothai János Kutatóközpont PhD és TDK konferencia; Pécs, Magyarország. (előadás) 95
INKELLER J, BALI ZK, CSURGYÓK R, BRUSZT N, HORVÁTH H, HERNÁDI I (2014). Targeting hippocampal alpha7 nicotinic receptors with potent agonist PHA-543613 enhances cognitive function through network stabilization II: Behavioral pharmacological aspects. 9th FENS Forum of Neuroscience; Milan, Italy. (abstract) INKELLER J, BALI ZK, CSURGYÓK R, BRUSZT N, HORVÁTH H, HERNÁDI I (2014). Cognitive enhancer effects of an alpha7 nicotinic receptor agonist (PHA-543613) in pharmacologically induced transient amnesia models in the rat. IBRO Workshop 2014, Debrecen; Debrecen, Magyarország. (abstract) BALI ZK, NAGY LV, HERNÁDI I (2016). Differential effects of cholinolytic amnestic agents on the firing activity of hippocampal CA1 neurons in vivo. IBRO Workshop 2016, Budapest; Budapest, Magyarország. (abstract) 11.3. Egyéb tudományos közlemények BUDAI D, HERNÁDI I, MÉSZÁROS B, BALI ZK, GULYA K (2010). Electrochemical responses of carbon fiber microelectrodes to dopamine in vitro and in vivo. Acta Biol Szeged 54:155– 60. KOVÁCS Z, SLÉZIA A, BALI ZK, KOVÁCS P, DOBOLYI A, SZIKRA T, HERNÁDI I, JUHÁSZ G (2013). Uridine modulates neuronal activity and inhibits spike-wave discharges of absence epileptic Long Evans and Wistar Albino Glaxo/Rijswijk rats. Brain Res Bull 97:16–23. IF: 2,974 11.4. Egyéb témákban készült konferencia-előadások és absztraktok BALI ZK, BUDAI D, MESZAROS B, KELLENYI L, HERNADI I (2011). Comparison of in vitro and in vivo response characteristics of carbon fiber microelectrodes to monoamines. 13th Conference of the Hungarian Neuroscience Society (MITT), Budapest, Magyarország. (abstract) BALI ZK, BUDAI D, MESZAROS B, HERNADI I (2012). Novel silver-coated carbon fiber microelectrodes for in vivo electrochemical measurements of extracellular dopamine levels in rat brain. Abstracts of the János Szentágothai Memorial Conference and Student Competition; Pécs, Magyarország. (abstract) BALI ZK, KELLENYI L, HERNADI I (2012). Optimization of experimental arrangement for fast and real-time neurochemical detection of dopamine transients in the rodent brain. IBRO Workshop 2012, Szeged; Szeged, Magyarország. (abstract) 96
BALI ZK, BUDAI D, NAGY L, HERNÁDI I (2014). In vivo elektrofiziológiai és neurokémiai vizsgálatokra alkalmas kísérleti összeállítások optimalizálása gyógyszerjelölt vegyületek központi idegrendszeri hatásának vizsgálatára. A Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság Experimentális Farmakológiai szekciójának VIII. szimpóziuma és az MBKE Gyógyszerbiokémiai Szakosztály XXVIII. Munkaértekezlete; Velence, Magyarország. (abstract) INKELLER J, BALI Z, CSURGYÓK R, BRUSZT N, HORVÁTH H, HERNÁDI I (2014). Fiatal és idős spontán hipertenzív (SHR) és outbred Wistar patkányok kognitív teljesítményének vizsgálata spontán alternációs és új tárgy felismerési tesztekben. A Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság Experimentális Farmakológiai szekciójának VIII. szimpóziuma és az MBKE Gyógyszerbiokémiai Szakosztály XXVIII. Munkaértekezlete; Velence, Magyarország. (abstract) BALI ZK, BRUSZT N, INKELLER J, CSURGYÓK R, HERNÁDI I (2015). Assessment of working memory performance of aged rats as a potential natural model of cognitive impairment. A Magyar Idegtudományi Társaság XV. Konferenciája; Budapest, Magyarország. (abstract) CSURGYÓK R, BRUSZT N, SZÁNTÓ B, BALI Z, INKELLER J, HERNÁDI I (2015). Nikotinos acetilkolin receptor agonista és acetilkolin-észteráz gátló vegyületek hatása a szkopolaminnal indukált memóriaromlásra. A Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság Experimentális Farmakológiai Szekciójának IX. Szimpoziuma; Velence, Magyarország. (abstract) CSURGYÓK R, INKELLER J, BALI ZK, BRUSZT N, PÉTERVÁRI E, BALASKÓ M, HERNADI I (2015). The effect of acute food deprivation on the cognitive performance of obese, calorie restricted and normal fed rats. A Magyar Idegtudományi Társaság XV. Konferenciája; Budapest, Magyarország. (abstract) INKELLER J, CSURGYÓK R, BALI ZK, BRUSZT N, DERES L, ERŐS K, HALMOSI R, HERNADI I (2015). Long term behavioral and cognitive effects of PARP inhibitor (L-2286) in spontaneously hypertensive (SHR) and normotensive (WKY). A Magyar Idegtudományi Társaság XV. Konferenciája; Budapest, Magyarország. (abstract) CSURGYÓK R, BALI ZK, MUNZ C, BRUSZT N, SZÁNTÓ B, HERNÁDI I (2016). Combined effect of PHA-543613 and memantine on a scopolamine-induced transient amnesia model in rats. IBRO Workshop 2016, Budapest; Budapest, Magyarország. (abstract)
97
SZÁNTÓ B, BALI ZK, BRUSZT N, CSURGYÓK R, HERNÁDI I (2016). The effects of enriched environmental conditions on species-specific general behavior and cognitive performance in rats. IBRO Workshop 2016, Budapest; Budapest, Magyarország. (abstract)
98
MTMT közlemény és idéző összefoglaló táblázat Bali Zsolt adatai (2016.02.24.) Közlemény típusok Teljes tudományos közlemények2
Száma
Hivatkozások1
Összesen
Részletezve
Független
Összes
I. Tudományos folyóiratcikk
4
---
---
---
nemzetközi szakfolyóiratban
---
2
3
8
hazai kiadású szakfolyóiratban idegen nyelven
---
2
4
4
hazai kiadású szakfolyóiratban magyar nyelven
---
0
0
0
II. Könyvek
0
---
---
---
a) Könyv, szerzőként
0
---
---
---
idegen nyelvű
---
0
0
0
magyar nyelvű
---
0
0
0
b) Könyv, szerkesztőként
0
---
---
---
0
3
---
---
idegen nyelvű
---
magyar nyelvű
---
0
---
---
III. Könyvrészlet
0
---
---
---
idegen nyelvű
---
0
0
0
magyar nyelvű
---
0
0
0
IV. Konferenciaközlemény folyóiratban vagy konferenciakötetben
17
---
---
---
Idegen nyelvű
---
14
0
0
Magyar nyelvű
---
3
0
0
Tudományos közlemények összesen (I.-IV.)
21
---
7
12
További tudományos művek4
---
0
0
0
Idézetek száma5
---
---
7
12
Felsőoktatási tankönyv
0
---
---
---
Idegen nyelvű
---
0
0
0
Magyar nyelvű
---
0
0
0
Felsőoktatási tankönyv része idegen nyelven
---
0
0
0
Felsőoktatási tankönyv része magyar nyelven
---
0
0
0
További oktatási művek
0
---
0
0
Oltalmi formák
0
---
0
0
Alkotás
0
---
0
0
Könyvek
0
---
0
0
További művek
0
---
0
0
Közérdekű és nem besorolt művek
0
---
0
0
Absztrakt
0
---
0
0
Oktatási művek
Ismeretterjesztő művek
Egyéb szerzőség
0
---
0
0
Idézők szerkesztett művekben
---
---
0
0
Idézők disszertációban, egyéb típusban
0
---
1
1
Idézők összesen, minden típus, minden jelleg
---
---
8
13
Megjegyzések: A táblázat számai hivatkozások is. A számra kattintva a program listázza azokat a műveket, amelyeket a cellában összeszámlált. --- : Nem kitölthető cella 1 A hivatkozások a disszertáció és egyéb típusú idézők nélkül számolva. A disszertáció és egyéb tipusú idézők összesítve a táblázat végén találhatók. 2 Teljes tudományos közlemény ebben az adatbázisban: - Folyóiratcikk : szakcikk/tanulmány, összefoglaló cikk, rövid közlemény, sokszerzős vagy csoportos szerzőségű közlemény, forráskiadás, recenzió/kritika, műkritika, esszé - Könyv: szakkönyv, monográfia, kézikönyv, tanulmánykötet, forráskiadás, kritikai kiadás, műhelytanulmány, atlasz - Könyvrészlet: szaktanulmány, fejezet, esszé, forráskiadás, recenzió/kritika, műkritika, műtárgyleírás, térkép, műhelytanulmány része - Konferenciaközlemény: folyóiratban, könyvben, egyéb konferenciakötetben megjelent legalább 3 oldal terjedelemben - Oltalmi formák: szabadalmak, mintaoltalmak (részletek) 3 Szerkesztőként nem részesedik a könyv idézéséből 4 Ide értve a teljes közlemények listájában nem szereplő publikációkat, a nem ismert lektoráltságú folyóiratokban megjelent műveket és minden olyan tudományos művet, ami a I.-IV. sorokban nem került összeszámlálásra. 5 A disszertációk és egyéb tipusú idézők nélkül számolva. A sor értéke a "Tudományos közlemények összesen (I.-IV.)", a "További tudományos művek" és az "Absztrakt" sorok idézettség értékeit összegzi.
2
Doktori értekezés benyújtása és nyilatkozat a dolgozat eredetiségéről
Alulírott név: Bali Zsolt Kristóf születési név: Bali Zsolt Kristóf anyja neve: Pintér Eszter Katalin születési hely, idő: Pécs, 1987.02.03 A kolinerg és glutamáterg neurotranszmisszió interakciójának vizsgálata kognitív zavarok állatkísérletes modelljeiben című doktori értekezésemet a mai napon benyújtom a(z) Doktori Iskola: Biológiai és Sportbiológiai Doktori Iskola Témavezető(k) neve: Dr. Hernádi István Egyúttal nyilatkozom, hogy jelen eljárás során benyújtott doktori értekezésemet - korábban más doktori iskolában (sem hazai, sem külföldi egyetemen) nem nyújtottam be, - fokozatszerzési eljárásra jelentkezésemet két éven belül nem utasították el, - az elmúlt két esztendőben nem volt sikertelen doktori eljárásom, - öt éven belül doktori fokozatom visszavonására nem került sor, - értekezésem önálló munka, más szellemi alkotását sajátomként nem mutattam be, az irodalmi hivatkozások egyértelműek és teljesek, az értekezés elkészítésénél hamis vagy hamisított adatokat nem használtam.
Dátum: Pécs, 2016.02.25 ................................................... doktorjelölt aláírása
