PĜehled SELEKCE PLAZMATICKÝCH BUNċK ISOLATION OF PLASMA CELLS ýUMOVÁ J.1,2, BUREŠOVÁ I.1, 2, KOVÁěOVÁ L.2, KYJOVSKÁ D.1,2, VIDLÁKOVÁ P.1,2, SUSKÁ R.2, PERUTKA T.1, MORAVCOVÁ J.1, RYCOVÁ M.1, PENKA M.2, HÁJEK R.1,2,3 1
UNIVERZITNÍ VÝZKUMNÉ CENTRUM-ýESKÁ MYELOMOVÁ SKUPINA (URC-CMG), LF MU BRNO LABORATOě EXPERIMENTÁLNÍ HEMATOLOGIE A BUNċýNÉ IMUNOTERAPIE (LEHABI), OKH, FN BRNO, PMDV 3 INTERNÍ HEMATOONKOLOGICKÁ KLINIKA, FN BRNO A LF MU BRNO, PMDV 2
Souhrn V našich laboratoĜích jsou plazmatické buĖky (PB) ze vzorkĤ aspiraþních biopsií kostních dĜení pacientĤ nemocných mnohoþetným myelomem (MM) separovány magneticky aktivovanou separací bunČk (MACS) a/nebo fluorescenþnČ aktivovanou separací bunČk (FACS). Pro selekce se používají protilátky CD138 MACS MicroBeads nebo fluorescenþnČ znaþené, které jsou namíĜeny proti povrchovému antigenu CD138 plazmatických bunČk, známému jako syndecan-1. Izolované PB jsou využity pro molekulárnČ biologické studie k PCR analýze, ke komparativní genomické hybridizaci (CGH), fluorescenþní in situ hybridizaci (FISH), k proteinovým analýzám nebo k analýzám povrchových bunČþných markerĤ þi intracelulárních antigenĤ. Klíþová slova: Mnohoþetný myelom, Separace, MACS, FACS, CD138 Summary We have used magnetic-activated cell sorting (MACS) and/or fluorescence-activated cell sorting (FACS) for the separation of plasma cells (PC) from bone marrow aspirates from patients with multiple myeloma (MM) using human antibodies CD138 MACS MicroBeads or CD138-PE antibodies that recognize the plasma cell surface antigen CD138 (syndecan-1). Isolated PC can be used for molecular biology studies of MM such as PCR analysis, comparative genomic hybridization (CGH), fluorescence in situ hybridization (FISH), protein analysis, analysis of cell surface markers, and/or intracellular antigens. Keywords: Multiple myeloma, Separation, MACS, FACS, CD138
Úvod Ve svČtČ bylo v posledních nČkolika desetiletích vyvinuto mnoho principĤ separaþní metod, kterými je možné získat vysoce þisté populace plazmatických bunČk (PB) separovaných ze vzorkĤ kostní dĜenČ (KD) a periferní krve (PK) pacientĤ nemocných mnohoþetným myelomem (MM). NejþastČji se využívá mikrofluidních separaþních technik (9), které umožĖují selekci bunČk na principu imunologické reakce povrchového markeru cílové (pĜístup pozitivní selekce) nebo nežádoucí (depleþní pĜístup, negativní selekce) buĖky s monoklonální protilátkou, která mĤže být fluorescenþnČ znaþená nebo konjugovaná s magnetickou mikro/nano þásticí. Separace plazmatických bunČk je provádČna 1) v magnetickém poli v separaþní kolonČ (technologie MACS, http://www.miltenyibiotec.com/, Dynal, http://www.invitrogen.com/, StemSep, http:// www.stemcell.com/) nebo ve zkumavce (technologie EasySep, http://www.stemcell.com/) 2) imunodenzitní centrifugací (napĜ. technologie RosetteSep, http://www. stemcell.com/). Na našich pracovištích URC-CMG a OKH-LEHABI využíváme pro separace plazmatických bunČk metody MACS (magnetic-activated cell sorting, magneticky aktivovaná separace bunČk) a/nebo FACS (fluorescence-activated cell sorting, fluorescenþnČ akti190
KLINICKÁ ONKOLOGIE 21 SUPPLEMENT 1/2008
vovaná separace bunČk), jejichž principy jsou detailnČ popsány níže. Principy separaþních metod MACS (magnetic-activated cell sorting, magneticky aktivovaná separace bunČk) Metoda MACS (firma Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) (10) je založena na imunomagnetickém znaþení cílových bunČk podle jejich povrchových antigenĤ monoklonální protilátkou, která je konjugována se superparamagnetickou partikulí (MACS MicroBeads). Firma Miltenyi do souþasné doby vyvinula nČkolik separátorĤ MACS (napĜ. MiniMACS, VarioMACS, SuperMACS, autoMACSTM), které mohou být využity pro 2 základní typy separaþních strategií. Pokud pro separaci cílové buĖky existuje pĜímá monoklonální protilátka konjugovaná se superparamagnetickou partikulí (MicroBeads), volíme separaþní pĜístup pozitivní selekce. Cílové buĖky, které jsou magneticky znaþeny pĜímou MACS MicroBeads, jsou zachyceny v separaþní kolonČ, která je umístČna v magnetickém poli separátoru. Neoznaþené buĖky protékají separaþní kolonou do negativní frakce a po odstranČní separaþní kolony z magnetického pole jsou cílové buĖky pak separovány do pozitivní frakce (Obrázek þ.1A).
pĜehled Pokud nejsou dostupné pĜímé MicroBeads pro cílové buĖky, volíme depleþní pĜístup, kdy jsou nežádoucí buĖky magneticky oznaþeny primární protilátkou (biotinylovanou, fluorescenþnČ-znaþenou aj.). Ve druhém kroku jsou nežádoucí buĖky magneticky znaþeny sekundární polyklonální protilátkou namíĜenou proti primární protilátce (napĜ. Anti-Immunoglobulin, Anti-Biotin, Streptavidin nebo Anti-Fluorochrom MicroBeads). Oznaþené (nežádoucí buĖky) jsou zachyceny v kolonČ a jsou oddČleny od neoznaþených (cílových bunČk), které procházejí kolonou do negativní frakce. Po odstranČní kolony z magnetického pole separátoru jsou znaþené buĖky separovány do pozitivní frakce (Obrázek þ.1B). Je také možné využít kombinace tČchto dvou separaþních pĜístupĤ pro zisk vysoce þisté populace vzácnČ zastoupených bunČk, kdy jsou v prvním kroku odstranČny z bunČþné suspenze nežádoucí buĖky a následnou pozitivní selekcí je získána populace vysoce þistých cílových bunČk (Obrázek þ. 2A). Firma také vyvinula separaþní strategii, kterou nazvala MultiSort strategií. Tento pĜístup je vhodný pro separace cílových bunČk, které mají na svém povrchu nČkolik CD antigenĤ a vĤþi kterým je možné využít dostupné pĜímé MicroBeads. Tímto pĜístupem je možné získat rĤzné subpopulace cílových bunČk. V prvním separaþním kroku jsou cílové buĖky, které nás zajímají, magneticky znaþeny MultiSort MicroBeads a po odstranČní magnetického pole jsou separovány do pozitivní frakce. Inkubací s MultiSort Release Reagencií jsou z bunČk enzymaticky odstranČny mikropartikule a v druhém separaþním kroku je subpopulace cílových bunČk magneticky znaþena pĜímou MicroBeads namíĜenou proti jinému povrchovému markeru na cílové buĖce (Obrázek þ.2B).
Obrázek þ. 1: Separaþní pĜístup (A) pozitivní selekce (B) deplece nežádoucích bunČk. PĜevzato a upraveno od výrobce technologie MACS.
FACS (fluorescence-activated cell sorting, fluorescenþnČ aktivovaná separace bunČk) BunČþné sortery jsou zaĜízení, ve kterých na þást odpovídající prĤtokovému cytometru navazuje þást umožĖující tĜídČní bunČk. StejnČ jako každý prĤtokový cytometr pracují pouze s bunČþnými suspenzemi a k identifikaci bunČk využívají znaþení monoklonálními protilátkami konjugovanými s rĤznými fluorochromy, tedy látkami, které po ozáĜení laserovým svČtlem emitují svČtlo urþité vlnové délky (6). Zahrnují vždy systém vedení kapalin, který bunČþnou suspenzi soustĜećuje do úzkého proudu obaleného proudem nosné kapaliny (tzv. hydrodynamická fokuzace) – v této formČ jsou buĖky „jedna po druhé“ vystavovány svČtelnému paprsku z laseru (v tzv. interrogation point), který excituje fluorochromy na navázaných protilátkách. SvČtlo emitované fluorochromem pak slouží jako signál k aktivaci sortovacího mechanismu. Základním principem elektrostatického sorteru je rozechvČní (pomocí piezoelektrického krystalu) proudu nosné kapaliny s proudem vzorku, které vede k rozdČlení proudu na malé kapiþky. TČm mĤže být v okamžiku oddČlení od souvislého proudu udČlen elektrický náboj a nabité kapiþky pak mohou být v elektrickém poli, tvoĜeném dvČma boþními elektrodami, vychýleny z pĤvodní dráhy smČrem k tČmto elektrodám. Tyto pĜístroje pracují s þasovým intervalem (tzv. time delay - v Ĝádu mikrose-
KLINICKÁ ONKOLOGIE 21 SUPPLEMENT 1/2008
191
pĜehled
Obrázek þ. 2: Separaþní pĜístup (A) kombinace deplece a následné positivní selekce (B) MultiSort strategie. PĜevzato a upraveno od výrobce technologie MACS.
kund), který uplyne, než se buĖka dostane z místa ozáĜení laserem (z interrogation point) na konec souvislého proudu nosné kapaliny. Pokud byla detekována jako cílová buĖka, dojde tČsnČ pĜed oddČlením kapiþky s touto buĖkou k nabití proudu nosné kapaliny, nabitá kapiþka je vychýlena k pĜíslušné elektrodČ a nasmČrována do pĜipravené sbČrné nádobky. V okamžiku oddČlení kapiþky se souvislý proud kapaliny vybije a celý systém je pĜipraven k novému cyklu nabití a vybití. Na našem pracovišti máme možnost pracovat s vysokorychlostním prĤtokovým sorterem bunČk FACSAria firmy BD Biosciences. Jde o sorter využívající elektrostatický princip sortování; proti jiným podobným zaĜízením má nČkolik zajímavých inovací. Vzorek prochází speciálnČ navrženou prĤtokovou komorou, která minimalizuje svČtelné ztráty pĜi prĤchodu svČtelným rozhraním a zajišĢuje tak velkou citlivost mČĜení i pĜi použití laserĤ s nižším výkonem a vyšší životností nevyžadujících pĜídatná chladicí zaĜízení. K detektorĤm je svČtlo pĜivádČno optickými kabely, takže jsou minimalizovány jeho 192
KLINICKÁ ONKOLOGIE 21 SUPPLEMENT 1/2008
ztráty, ke kterým mĤže docházet pĜi prĤchodu klasickou optickou lavicí. Speciální design cesty vzorku zajišĢuje, že vzorek prochází prĤtokovou komorou relativnČ pomalu, což zajišĢuje dostateþnČ dlouhý osvit laserem; pak se dostává do úzké trysky, tzv. nozzle, kde dojde k urychlení proudu nosné tekutiny a zároveĖ jeho rozechvČní a následnČ roztrhání na jednotlivé kapiþky. Sorter je také vybaven systémem vedení kapalin zajišĢujícím velmi stabilní rychlost prĤtoku, která je naprosto zásadní pro stálý time delay (viz výše) a dále velmi pĜesným a vysoce lineárním systémem sbČru a zpracování dat na digitální bázi. UmožĖuje tĜídČní jedné až þtyĜ rĤzných populací, a to do zkumavek rĤzných velikostí, do mikrotitraþních destiþek nebo pĜímo na sklíþka. Po speciální pĜípravČ lze provádČt tĜídČní za aseptických podmínek – pokud je zájem vytĜídČné buĖky dále kultivovat. FACSAria je v souþasnosti osazena dvČma lasery a umožĖuje analyzovat najednou až devČt parametrĤ (2 optické a 7 fluorescenþních). Tuto konfiguraci lze do budoucna rozšíĜit na 3 lasery a 11 parametrĤ.
pĜehled
Obrázek þ. 3: Obraz KD v prĤtokovém cytometru pĜed a po tĜídČní bunČk s vyznaþenou populací plazmatických bunČk (CD138+ CD38+).
Specifická nastavení u MM Separace PB z mononukleárních bunČk kostní dĜenČ þi periferní krve pacientĤ je nejþastČji provádČna pomocí komerþnČ dostupné monoklonální protilátky CD138 (11), která je namíĜena proti povrchovému antigenu CD138 (syndecanu-1). Jde o membránový glykoprotein bohatý na heparan sulfát – proteoglykany. Syndecany se obecnČ úþastní interakcí s proteiny extracelulární matrix, s rozpustnými proteiny typu cytokinĤ a s povrchovČ vázanými molekulami. Exprese syndecanu-1 byla popsána na normálních i nádorových plazmatických buĖkách KD a PK pacientĤ s mnohoþetným myelomem, ale také na neuronových a endoteliálních buĖkách (1,2). Plazmatické buĖky, které vstupují do apoptózy, pak antigen CD138 ztrácejí (8). Diferenciace B bunČk na plazmatické buĖky je také provázena ztrátou exprese CD45 antigenu. Této ztráty exprese lze využít pĜi separacích plazmatických bunČk v dvoukrokové proceduĜe v kombinaci deplece CD45+ bunČk s pozitivní selekcí CD138+ bunČk frakce CD45- (4). NejþastČji se však využívá jednokrokové procedury pozitivní selekce plazmatických bunČk oznaþených pĜímou protilátkou CD138-PE þi CD138 MACS MicroBeads. PĜed vlastní separací PB je nutné provést izolaci mononukleárních bunČk. Kostní dĜeĖ (20-60 ml) pacienta je odebrána do heparinu a ihned smíchána s transportním médiem v pomČru 1:1 obsahujícím IMDM médium (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium, Sigma No: I-2510) s DNázou o koncentraci 0,1 mg/ ml (Roche, No.1 284 932). Mononukleární buĖky kostní dĜenČ jsou získány denzitní gradientovou centrifugací na Histopaque – 1077 (Sigma, No:H-8809), centrifugace 400g, 35 min, 4 °C. Po dvojím promytí mononukleárních
bunČk v PBS pufru obsahujícím 2mM EDTA (centrifugace 300g, 10 min, 4°C) je provedeno vlastní znaþení PB podle standardních protokolĤ separace bunČk pomocí MACS nebo FACS metody. Na Obrázku þ.3 je pĜíklad obrazu KD v prĤtokovém cytometru pĜed a po tĜídČní s vyznaþenou populací plazmatických bunČk CD138+ CD38+. Specifické problémy u MM Pro veškeré výzkumné analýzy v oblasti MM, které na našem pracovišti provádíme, je nutné získat separacemi dostateþný poþet PB o velmi vysoké þistotČ. ýistota bunČk je pĜi separaci metodou MACS vždy závislá na vstupní infiltraci patologických bunČk v odebraném vzorku KD. Proto je nutné pro každou MACS separaci zvolit vhodný separaþní program. PĜístroj autoMACSTM má pĜednastavených 9 separaþních programĤ v závislosti na separaþní strategii, frekvenci cílových bunČk a expresi cílového antigenu. Pro selekci málo zastoupených bunČk z velkého množství bunČk je doporuþován program posseld2, který umožĖuje pozitivní separaci a pĜeþištČní cílových bunČk ve 2 separaþních kolonách. Tento program jsme zvolili pro separace plazmatických bunČk z kostní dĜenČ pacientĤ, u kterých bylo stanovené procento PB ve frakci mononukleárních bunČk kostní dĜenČ 10% (analýza prĤtokovou cytometrií, populace plazmatických bunČk CD38+ CD138+). Pro ostatní vzorky aspiraþních biopsií kostních dĜení se procentem PB > 10% jsme zvolili program possels. Tento program umožĖuje zvýšení výtČžku separovaných bunČk za cenu mírného snížení þistoty bunČk. Separace tČchto bunČk probíhá pĜes 1 kolonu.
KLINICKÁ ONKOLOGIE 21 SUPPLEMENT 1/2008
193
pĜehled Význam metod u MM stávající a oþekávaný Purifikace PB od pacientĤ nemocných mnohoþetným myelomem je nezbytná pro uplatnČní Ĝady studií, u kterých musíme pracovat s vysoce þistou populací nádorových bunČk (3, 5, 7). Možností, jak docílit tohoto obohacení plazmatických bunČk ze vzorkĤ aspiraþních biopsií kostních dĜení s nízkou infiltrací patologických bunČk, je použití vysoce specifických a senzitivních separaþních metod MACS a/ nebo FACS (Tabulka þ. 1). Vitalita separovaných bunČk tČmito procedurami není významnČ ovlivnČna, þehož mĤžeme využít v experimentech vyžadujících kultivaci tČchto bunČk (cytogenetické studie, produkce imunoglobulinĤ, produkce cytokinĤ aj.). Výhodou selekce bunČk na principu FACS je možnost využít více znakĤ, a sortovat tak i rĤzné typy plazmatických bunČk podle fenotypu (napĜ. CD19+ CD56- x CD19- CD56+), podle klonality stanovené intracelulárním barvením lehkých ĜetČzcĤ imunoglobulinĤ aj. V budoucnu plánujeme zahájit selekce PB u mono-
klonálních gamapatií s nízkou vstupní infiltrací. K tČmto separacím bude využit bunČþný sorter FACSAria. ZávČr MACS a FACS separaþní systémy umožĖují rychlou, úþinnou a levnou separaci vysoce þisté populace plazmatických bunČk ze vzorkĤ kostní dĜenČ a periferní krve pacienta s mnohoþetným myelomem. Kvalita þistoty a výtČžku separovaných bunČk v pĜípadČ použití technologie MACS je vždy závislá na vstupní infiltraci plazmatických bunČk ve frakci mononukleárních bunČk. Proto je nutné vždy zvážit volbu vhodného separaþního programu MACS pro rĤzné vstupní infiltrace plazmatických bunČk ve frakci mononukleárních bunČk. PodČkování Práce byla podpoĜena projekty MŠMT LC06027, MSM0021622434 a IGF þ. 3/05.
Literatura: 1. Couchman JR, Woods A. Syndecans, Signaling and Cell Adhesion. J Cell Biochem. 1996; 61 (4): 578-584. 2. Dhodapkar MV, Sanderson RD. Syndecan-1 (CD 138) in myeloma cells and lymphoid malignancies: a multifunctional regulator of cell behavior within the tumor microenvironment. Leuk Lymphoma. 1999; 34 (1-2): 35-43. 3. Draube A, Pfister R, Vockerodt M, et al. Immunomagnetic enrichment of CD138+ positive cells from weakly infiltrated myeloma patinets samples enables the determination of the tumor clone specific IgH rearrangement. Ann Hematol. 2001; 80 (2): 83-89. 4. Fišerová A, Hájek R, Doubek M, et al. Imunomagnetická separace myelomových bunČk. Klin Onkologie. 2001; 14 (2): 46-50. 5. Fišerová A, Hájek R, Holubová V, et al. Detection of 13q abnormalities in multiple myeloma using immunomagnetically selected plasma cells. Neoplasma. 2002; 49 (5): 300-306. 6. Herzenberg LA, Parks D, Sahaf B, Perez O, Roederer M, Herzen-
194
KLINICKÁ ONKOLOGIE 21 SUPPLEMENT 1/2008
7.
8. 9. 10. 11.
berg LA.The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 2002; 48 (10): 1819-1827. Horst A, Hunzelmann N, Arce S, Herber M, Manz RA, Radbruch A, Nischt R, Schmitz J, Assenmacher M. Detection and characterization of plasma cells in peripheral blood: correlation of IgE+ plasma cell frequency with IgE serum titre. Clin Exp Immunol. 2002; 130 (3): 370-378. Jourdan M, Ferlin M, Legouffe E, et al. The myeloma cell antigen syndecan-1 is lost by apoptotic myeloma cells. Br J Haematol. 1998; 100 (4): 637-646. Kang JH, Park J-K. Technical paper on microfluidic devices- cell separation technology. APBN. 2005; 9 (21): 1135-1146). Miltenyi S, Müller W, Weichel W, Radbruch A.High Gradient Magnetic Cell Separation With MACS. Cytometry. 1990; 11 (2): 231-238. Wijdenes J, Vooijs WC, Clement C, et al. A plasmocyte selective monoclonal antibody (B-B4) recognizes syndecan-1. Br J Haematol. 1996; 94 (2): 318-323.
