OPTIMASI PEMBUATAN EKSTRAK ETANOLIK KAYU SECANG (Caesalpinia sappan L.) SECARA DIGESTI: APLIKASI DESAIN FAKTORIAL
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh: I Gusti Arya Asmarantara Astina NIM: 068114168
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2010
i
ii
HALAMAN PERSEMBAHAN
Dedicated to my beloved parents, Bunda Mariani; Aji Astina
“Ia yang pikirannya tidak digoyahkan dalam keadaan dukacita dan bebas dari keinginan-keinginan di tengah-tengah kesukacitaan, ia yang dapat mengatasi nafsu, kesesatan dan kemarahan, ia disebut seorang yang bijaksana” ( Bhagawad Gita II-56)
“Dengan jalan bagaimanapun ditempuh oleh manusia ke arahKU, semuanya AKU terima dan memenuhi keinginan mereka, melalui banyak jalan manusia menuju jalanKU” (Bhagawad Gita V-2)
Karya ini dipersembahkan untuk IDA SANG HYANG WIDHI WACA Orang-oorang yang saya cintai dan ALMAMATERKU
iii
iv
PRAKATA
Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa sehingga pada akhirnya penulis berhasil menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi dengan judul “Optimasi Pembuatan Ekstrak Etanol Kayu Secang (Caesalpinia sappan L.) secara Digesti : Aplikasi Desain Faktorial”. Penyusunan Skripsi ini dilakukan untuk memenuhi salah satu syarat mendapat gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) dari Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Peneliti berhasil menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan dukungan dari banyak pihak. Pada kesempatan ini, penulis ingin mengucapkan terimakasih kepada : 1. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta 2. Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing yang dengan kesabarannya membimbing, memberi saran dan kritik sejak penyusunan proposal hingga selesainya skripsi ini 3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku dosen penguji atas kesediaannya meluangkan waktu untuk menjadi dosen penguji 4. Jeffry Julianus, M.Si.
selaku dosen penguji yang telah menguji sekaligus
memberikan banyak kritik dan saran kepada penulis 5. Romo Drs. Petrus Sunu Hardiyanta, S.J., S.Si., atas masukan dan arahan yang diberikan menginspirasi penulis
v
6. Ibu, Ajik, Bli Agung, Mbok Gek tercinta atas segala doa, dukungan, perhatian, arahan, nasehat, dan semangat yang selalu menyertai penulis 7. Shasha dan Uthie atas segala kebersamaan, kerjasama, canda tawa, dan dukungannya dalam menyelesaikan skripsi ini 8. Pak Parlan, Mas Bimo, dan Mas Kunto atas bantuan dan bimbingannya selama penelitian 9. Grace, Yoki, Anton, Win, Rani, Cica, Lina, Aan, Iwan, Yacob, Iren dan teman-teman Farmasi angkatan 2006 yang tidak bisa penulis sebutkan satu persatu atas kebersamaan kita selama ini 10. Anak kos-kosan Larasmadyo dan Ngapak Team atas semua kebersamaan dan pertemanan kita selama ini. 11. Anak-anak Gr3at’S angkatan 2004, Sak De, Naga, Edi, Bokir, Ganesh dan Gr3at’S lainnya yang tidak dapat disebutkan satu persatu, “U’r my 2nd family” 12. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah membantu penulis menyelesaikan skrisi ini Penulis menyadari penelitian ini masih belum sempurna mengingat keterbatasan pengetahuan dan kemampuan penulis. Oleh karena itu penulis sangat menghapkan adanya kritik dan saran yang dapat berguna bagi penyempurnaan skripsi ini. Semoga penelitian dan penulisan skripsi ini dapat berguna bagi ilmu pengetahuan. Penulis
vi
vii
INTISARI Secang (Caesalpinia sappan L.) mengandung senyawa pewarna alami antara lain brazilin, brazilein, dan 3’-O-metilbrazilin dan disebut sebagai komposit brazilin serta merupakan senyawa subtipe struktur brazilin. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh lama digesti, konsentrasi cairan penyari, dan interaksinya terhadap area under curve (AUC) komposit brazilin serta memperoleh titik optimum pada proses digesti tersebut. Penelitian ini memakai rancangan desain faktorial dua faktor yaitu lama digesti dan konsentrasi cairan penyari, serta tiga level yaitu pada faktor lama digesti: level rendah 90 menit, level tengah 180 menit dan level tinggi 270 menit dan pada faktor konsentrasi cairan penyari: level rendah 4 %, level tengah 50 % dan level tinggi 100 %. Metode ekstraksi yang dipergunakan adalah digesti. Data hasil penelitian dianalisis secara statistik dengan yate’s treatment menggunakan tingkat kepercayaan 95% dan titik optimum diperoleh dari counter plot. Dari hasil percobaan menunjukkan bahwa lama digesti, konsentrasi cairan penyari dan interaksinya berpengaruh secara signifikan terhadap AUC komposit brazilin. Faktor konsentrasi cairan penyari dominan dalam menentukan respon AUC komposit brazilin. Dari countour plot dapat dilihat titik optimum proses digesti yaitu dengan lama 102,72 menit dan konsentrasi penyari 63,58%. Kata kunci: Optimasi proses digesti, Caesalpinia sappan L., brazilin, brazilein, 3’O-metil brazilin dan desain faktorial.
viii
ABSTRACT Sappan wood (Caesalpinia sappan L.) contains natural colorants compound such as brazilin, brazilein, and 3’-O-metilbrazilin which is named brazilin composite and represent brazilin structure subtype. This research were to determine the effect of digesting duration, fluid concentration, and their interaction on the brazilin and its derivatives area under curve (AUC) and to determine the optimum digesting process. This study was carried out by factorial design with two factors which are digesting duration and fluid concentration, and three levels, the low-level of digesting time is 90 minutes, middle-level is 180 minutes, high-level is 270 minutes and low-level of fluid concentration is 4 %, middle-level is 50 %, high level is 100 %. Extraction method used is digestion. The data were analyzed statistically using Yate’s treatment with 95% level of confidence and optimum condition obtained from contour plot. The result show that the digesting duration, fluid concentration and their interaction influence brazilin and its derivatives AUC significantly. Fluid concentration was dominant on determining brazilin and its derivatives AUC. The contour plot showed the optimum spot is 102,72 minute in digesting duration and 63,58% in fluid concentration. Keywords: Digesting process optimization, Caesalpinia sappan L., braziline, brazileine, 3’-O-metil braziline and factorial design
ix
DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL ................................................................................................. i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ....................................................... ii HALAMAN PENGESAHAN .................................................................................... iii HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................................ iv PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ....................................................
v
PRAKATA ................................................................................................................ vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .................................................................... viii INTISARI .................................................................................................................. ix ABSTRACT ................................................................................................................ x DAFTAR ISI ............................................................................................................. xi DAFTAR TABEL ..................................................................................................... xiv DAFTAR GAMBAR ................................................................................................ xv DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................. xv BAB I PENGANTAR ............................................................................................... 1 A. Latar Belakang ..................................................................................................... 1 1. Perumusan masalah ........................................................................................ 2 2. Keaslian penelitian ......................................................................................... 2 3. Manfaat penelitian .......................................................................................... 3 B. Tujuan............................................................. ...................................................... 3 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ........................................................................ 4 A. Secang ................................................................................................................. 4 1. Klasifikasi ....................................................................................................... 4 2. Kegunaan ........................................................................................................ 4 3. Kandungan kimia ............................................................................................ 5
x
4. Komposit brazilin ........................................................................................... 6 B. Penyarian ............................................................................................................. 6 1. Ekstrak ............................................................................................................ 7 2. Cairan penyari ................................................................................................. 7 3. Metode ekstraksi secara digesti ...................................................................... 8 C. KLT-Densitometri ............................................................................................... 9 1. Kromatografi lapis tipis .................................................................................. 9 2. Densitometri ................................................................................................... 13 D. Metode Desain Faktorial ..................................................................................... 15 E. Landasan Teori .................................................................................................... 17 F. Hipotesis ............................................................................................................. 18 BAB III METODE PENELITIAN ............................................................................ 19 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ........................................................................... 19 B. Variabel dan Definisi Operasional ....................................................................... 19 1. Klasifikasi variabel .......................................................................................... 19 2. Definisi operasional ........................................................................................ 19 C. Bahan atau Materi Penelitian ............................................................................... 20 D. Alat atau Instrumen Penelitian ............................................................................. 20 E. Tata Cara Penelitian ............................................................................................ 21 1. Pengumpulan bahan ........................................................................................ 21 2. Identifikasi tanaman dan kayu ........................................................................ 21 3. Pembuatan simplisia secang ........................................................................... 22 4. Analisis kualitatif komposit brazilin ............................................................... 23 5. Penyarian secara digesti .................................................................................. 24 6. Isolasi komposit brazilin dengan KLT ........................................................... 25
xi
7. Pengukuran AUC komposit brazilin dengan TLC scanner densitometric ...... 25 F. Analisis Hasil ...................................................................................................... 26 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ..…….…………………………………...
27
A. Pengumpulan Bahan............................................................................................. 27 B. Identifikasi Tanaman dan Kayu ........................................................................... 28 C. Pembuatan Simplisia ........................................................................................... 34 D. Analisis Kualitatif Komposit Brazilin ................................................................ 36 E. Penyarian secara Digesti ..................................................................................... 42 F. Pemisahan Komposit Brazilin ............................................................................. 46 G. Pengukuran AUC Komposit Brazilin dengan TLC Scanner Densitometric ................................................................................ 47 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .................................................................... 58 A. Kesimpulan .......................................................................................................... 58 B. Saran ................................................................................................................... 58 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................ 59 LAMPIRAN .............................................................................................................. 63
xii
DAFTAR TABEL
Tabel I
Parameter-parameter aplikasi KLT direkomendasikan ........................
11
Tabel II
Rancangan percobaan berdasarkan desain faktorial ............................
24
Tabel III
Hasil identifikasi kayu secara kimia ....................................................... 30
Tabel IV
Harga Rf dan profil warna masing-masing bercak hasil pemisahan dengan KLT-preparatif ............................................................................. 41
Tabel V
Hasil penelusuran panjang gelombang serapan maksimum isolat menggunakan spektrofotometer visibel ................................................... 42
Tabel VI Hasil rendemen ekstrak kayu secang secara digesti ............................... 45 Tabel VII Hasil pengukuran AUC komposit brazilin ............................................... 48 Tabel VIII Nilai Rf bercak B masing-masing percobaan tiap replikasi ……………………………………………............................... 49 Tabel IX
Nilai Rf bercak C masing-masing percobaan tiap replikasi ……………………………………………............................... 50
Tabel X
Hasil perhitugan efek …………………….............................................. 50
Tabel XI Hasil perhitungan Yate’s treatment pada respon AUC komposit brazilin …………………..………………................................ 54
xiii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur brazilein, struktur 3-0 metil brazilin, dan brazilin ........................................................................................... 6 Gambar 2. Diagram prinsip kerja TLC scanner ………........................................... 13 Gambar 3. Desain penelitian 2 faktor 3 level …….................................................. 16 Gambar 4. Batang secang segar ………................................................................... 27 Gambar 5. Bagian tanaman secang ………………………….................................. 29 Gambar 6. Reaksi brazilin menjadi brazilein dengan penambahan basa ………...
31
Gambar 7. Pembentukan 3’-O-metilbrazilein dari 3’-O-metilbrazilin dengan penambahan basa …………………………………………………… … 32 Gambar 8. Reaksi pembentukan senyawa kompleks antara brazilin dengan FeCl3 ………………………………………………………………….. 33 Gambar 9. Reaksi pembentukan senyawa kompleks antara brazilin dengan Pb(CH3COO)2 ………………………………………………………… 33 Gambar 10. Serutan kayu secang ............................................................................. 34 Gambar 11. Interaksi antara brazilin atau 3’-O-metilbrazilin dengan fase diam selulosa ................................................................................................... 37 Gambar 12. Interaksi brazilin, 3’-O-metil brazilin dengan fase gerak kloroform, metanol, aquadest ..................................................................................... 38 Gambar 13. Profil kromatogram hasil pemisahan dengan KLT-preparatif .............. 40 Gambar 14. Spektra hasil penetapan panjang gelombang serapan maksimum bercak komposit brazilin menggunakan spektrofotometer visibel ..................... 42 Gambar 15. Hasil penelusuran panjang gelombang serapan maksimum pada replikasi 1 …………………………............................................... 47
xiv
Gambar 16. Kurva hasil pengukuran AUC komposit brazilin berbagai percobaan …………………………….................................................... 49 Gambar 17. Grafik hubungan antara lama digesti dengan AUC komposit brazilin dan hubungan antara konsentrasi penyari dengan AUC komposit brazilin ………………...…………................................. 53 Gambar 18. Grafik kontur hasil desain faktorial …………………........................... 56 Gambar 19. Grafik kontur hasil desain faktorial …………………........................... 56
xv
DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Hasil identifikasi secara kimia pada filtrat serbuk kayu .................................................................
63
Lampiran 2. Alat digesti dan hasil ekstrak kering ....................................
64
Lampiran 3. KLT isolasi komposit brazilin ...............................................
65
Lampiran 4. Kurva AUC komposit brazilin ekstraksi secara digesti berdasarkan desain faktorial ...................................................... 67 Lampiran 5. Data rendemen hasil penyarian secara digesti ……................... 70 Lampiran 6. Contoh cara menghitung rendemen .......................................... 71 Lampiran 7. Contoh cara menghitung standard error dan coeffitient of variance …................................................... . 72 Lampiran 8. Contoh cara menghitung persamaan desain faktorial …........... 73 Lampiran 9. Contoh cara menghitung nilai efek menggunakan yate’s treatment ……………………………............................................
75
Lampiran 10. Cara menghitung signifikansi dengan yate’s treatment …………………...................................................... 77 Lampiran 11. Cara menghitung titik optimum menggunakan fungsi desirability ....................................................................... 79
xvi
BAB I PENGANTAR
A. Latar Belakang Secang merupakan salah satu tanaman yang biasa dipergunakan sebagai pewarna alami. Hasil ekstraksi kayu secang menghasilkan ekstrak yang dapat dipergunakan sebagai indikator pH terhadap asam-basa dan pewarna obat-obatan dengan komponen utama yaitu brazilin (Fu et al., 2008; Jun et al., 2008). Pemanfaatan kayu secang dilakukan dengan pengolahan terlebih dahulu menjadi ekstrak. Standar mutu bahan ekstrak dicapai dengan pengendalian proses ekstraksi sehingga dapat menjamin produk ekstrak yang terstandar dan diharapkan mampu menunjukkan kualitas ekstrak salah satunya dalam hal kandungan zat aktif (Hariyati, 2005). Kandungan zat aktif yang diharapkan dalam ekstrak yaitu mengandung sebagian besar senyawa yang diinginkan (Anonim, 1995), untuk mencapai tujuan tersebut maka diperlukan proses ekstraksi yang baik pula. Oleh karena itu penulis tertarik untuk melakukan optimasi proses pembuatan ekstrak kayu secang. Proses ekstraksi kayu secang dilakukan dengan metode digesti karena pengerjaannya mudah, peralatannya sederhana dan proses ekstraksi lebih cepat dibandingkan maserasi biasa (Anonim, 1986). Optimasi proses digesti yang dilakukan berupa optimasi lama digesti dan konsentrasi cairan penyari yang dipergunakan. Lama proses digesti dioptimasi untuk melihat waktu digesti yang optimum untuk menghasilkan ekstrak kayu secang. Cairan penyari etanol dipergunakan dengan pertimbangan kelarutan
1
2
komponen utama kayu secang yaitu brazilin dalam pelarut tersebut namun belum diketahui konsentrasi etanol yang tepat untuk dapat mengekstraksi brazilin secara optimal. Etanol dipergunakan sebagai penyari karena memiliki sifat tidak beracun, inert, kuman dan kapang sulit tumbuh pada etanol diatas konsentrasi 20%, dan panas yang diperlukan dalam pemekatan relatif kecil (Anonim, 1986). Metode optimasi yang digunakan pada penelitian ini adalah metode desain faktorial, faktor yang paling berpengaruh dilihat dari jumlah komposit brazilin yang dihasilkan, serta untuk dapat melihat ada tidaknya interaksi antara kedua faktor tersebut, selain itu dengan metode desain faktorial dapat diprediksi kondisi digesti meliputi lama digesti dan konsentrasi cairan penyari yang optimum dalam pembuatan ekstrak kayu secang. 1. Rumusan permasalahan Permasalahan yang akan diteliti yaitu : a. Bagaimana pengaruh proses digesti meliputi lama digesti, konsentrasi cairan penyari dan interaksi yang terjadi antara keduanya terhadap area under curve (AUC) komposit brazilin? b. Apakah diperoleh titik kondisi optimum meliputi lama digesti dan konsentrasi cairan penyari dalam proses digesti kayu secang terhadap AUC komposit brazilin? 2. Keaslian penelitian Sejauh penelusuran pustaka yang dilakukan penulis, penelitian tentang optimasi konsentrasi cairan penyari dan lama ekstraksi kayu secang (Caesalpinia Sappan L.) secara digesti menggunakan aplikasi desain faktorial, belum pernah
3
dilakukan. Adapun penelitian yang telah dilakukan yaitu isolasi dan karakterisasi brazilin dari kayu secang, aktivitas antioksidan kayu secang dalam berbagai usia tanaman, serta analisis komponen dalam ekstrak kayu secang (Putrandana, 2003; Wetwitayaklung, Phaechamud dan Keokitichai, 2005; Rusmiati, 2007; dan Fu et al., 2008). 3. Manfaat a. Manfaat teoritis penelitian ini yaitu menambah informasi bagi ilmu pengetahuan, khususnya dalam bidang kefarmasian mengenai aplikasi desain faktorial pada proses digesti kayu secang b. Manfaat praktis penelitian ini yaitu untuk mempermudah proses ekstraksi secara digesti dalam memperoleh komposit brazilin.
B. Tujuan Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk mengetahui : 1. Pengaruh proses digesti meliputi lama digesti, konsentrasi cairan penyari dan interaksi yang terjadi diantara keduanya terhadap AUC komposit brazilin 2. Titik optimum dalam proses digesti kayu secang meliputi lama digesti dan konsentrasi cairan penyari terhadap AUC komposit brazilin
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA
A. Secang 1. Keterangan botani tanaman secang Kayu secang merupakan tumbuhan yang biasa tumbuh di daerah tropis dan biasa dijumpai sebagai tanaman pagar serta hidup pada ketinggian 500-1000 m diatas permukaan laut. Tanaman secang memiliki klasifikasi yaitu termasuk ke dalam familia caesalpiniaceae, genus Caesalpinia L., dan dengan nama ilmiah Caesalpinia sappan L. (Anonim, 1985; Tjitrosoepomo, 1994). 2. Kegunaan Di daerah tropis pada umumnya, tanaman secang biasa dipergunakan sebagai pewarna makanan, kosmetik, cat dan memiliki potensi aksi farmakologi. Tanaman secang banyak mengandung tanin yang baik untuk menyamak barang dari kulit dan memiliki kegunaan lain seperti mengobati TBC, luka, antidiare, analgetik, antipiretik, penyakit kulit, desinfektan, tonikum, dan rematik (Anonim, 1985; Rudjiman, 1995). Menurut Greshop (Heyne, 1987) kayu secang dipergunakan untuk menyembuhkan penyakit yang berkaitan dengan peredaran darah seperti memar, murus darah, muntah darah dan sebagainya. Di Thailan kayu secang dipergunakan dalam pewarna makanan, garmen dan kosmetik. Juga telah diketemukan bahwa ekstrak kayu secang memiliki aktivitas antioksidan serta menunjukkan pengaruh yang signifikan dalam menurunkan daya hidup spermatozoa (Wetwitayaklung, Phaechamud dan Keokitichai, 2005; Rusmiati, 2007).
4
5
3. Kandungan kimia Bila batang tanaman secang dipotong kemudian diambil kulitnya maka akan diperoleh kayu yang berwarna merah kecoklatan yang diberi nama sappan (Wallis, 1955). Kayu secang mengandung zat warna, asam galat, asam tanat, sedikit minyak atsiri, resin, tanin dan polifenol (Perry, 1980; Sugati dan Hutapea, 1991). Komponen utama dari ekstrak kayu secang telah diketahui yaitu dalam bentuk komponen fenolik, dan terdiri dari 4 macan subtipe struktur yaitu subtipe brazilin, kalkon, protosapanin, dan homoisoflavonoid. Diantaranya derivat protosapanin
seperti
protosapanin
B
dan
isoprotosapanin
B,
10-O-
metilprotosapanin dan 10-O-metilisoprotosapanin, sama pula halnya dengan protosapanin E1 dan protosapanin E2 merupakan suatu pasangan epimer. Sementara itu epimer homoisoflavonoid seperti sapanol dan episapanol, 4-Ometilsapanol dan 4-O-metilepisapanol, 3-O-metilsapanol dan 3-O-metilepisapanol telah dapat diisolasi dari kayu secang. Terakhir telah diisolasi pula senyawa baru dari kayu secang dan teridentifikasi sebagai 3-benzilkroman yang merupakan turunan dari 3’-deoksi-4O-metilepisapanol, dan dengan komponen lainnya dalam kayu secang yaitu : protosapanin
A,
bisdihidrosiringenin,
sapankalkon, brazilein,
sapanon,
asam
palmitat,
3-deoksisapankalkon,
(+)-(8S,8’S)-
(+)-lioniresinol,
3-
deoksisapanon B, protosapanin B, isoprotosapanin B, 3'-O-metilbrazilin dan brazilin (Fu et al., 2008).
6
4. Komposit brazilin Komposit brazilin adalah senyawa subtipe brazilin yang terdapat dalam kayu secang antara lain brazilin, brazilein dan 3’-O-metilbrazilin. Brazilin merupakan konstituen utama dari ekstrak kayu secang, tetapi brazilein diisolasi dalam jumlah besar saat ekstrak dipaparkan terhadap udara dan cahaya menghasilkan reaksi oksidasi gugusan hidroksil brazilin menjadi gugusan karbonil. Kedua komponen tersebut memiliki empat buat cincin karbon (tetrasiklis) dengan dua cincin aromatis, satu buah furan dan satu buah cincin 5 karbon. Senyawa 3’-O-metilbrazilin merupakan turunan brazilin dengan gugusan metoksi pada atom C-3’ pada cincin B (Oliveira, Edwards dan Nesbitt, 2002).
brazilein
3’-O-metil brazilin
brazilin
Gambar 1. Struktur brazilein, 3’-O-metilbrazilin dan brazilin (Fu et al., 2008)
B. Penyarian Penyarian merupakan kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut yang berbentuk cair. Penyarian berlangsung dengan perpindahan massa, dimana zat yang semula berada di dalam sel ditarik oleh cairan penyari sehingga larutan penyari menjadi larutan zat yang diinginkan. Pada umumnya proses penyarian akan bertambah baik apabila luas permukaan
7
simplisia yang bersentuhan dengan cairan penyari makin besar, sehingga dikatakan bahwa semakin kecil ukuran serbuk simplisia maka semakin baik proses penyariannya. Tetapi yang menjadi pertimbangan yaitu apabila serbuk simplisia terlalu halus sehingga mempersulit proses penyarian karena simplisia halus tadi akan membentuk suspensi yang sulit dipisahkan dari ekstrak cair yang diperoleh (Anonim, 1986). 1. Ekstrak Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian sehingga memenuhi standar baku yang telah ditetapkan (Anonim, 2000). 2. Cairan penyari Cairan penyari dalam pembuatan ekstrak adalah pelarut yang baik atau optimal untuk senyawa kandungan yang berkasiat atau aktif, sehingga senyawa tersebut dapat terpisahkan dari senyawa kandungan lainnya, serta ekstrak mengandung sebagian besar senyawa yang diinginkan (Anonim, 1995). Pemilihan cairan penyari harus mempertimbangkan banyak faktor. Cairan penyari yang baik harus memenuhi kriteria berikut ini: a. murah dan mudah diperoleh b. stabil secara fisika dan kimia c. bereaksi netral d. tidak mudah menguap dan tidak mudah terbakar
8
e. selektif yaitu hanya menarik zat yang dikehendaki f. tidak mempengaruhi zat yang dikehendaki g. diperbolehkan oleh peraturan. Pada prinsipnya cairan penyari harus memenuhi syarat kefarmasian dengan kelompok spesifikasi pharmaceutical grade. Sampai saat ini berlaku aturan bahwa pelarut yang diperbolehkan adalah air dan alkohol (etanol) serta campurannya. Jenis pelarut yang lain seperti metanol (dan turunan alkohol lainnya), heksana (hidrokarbon alifatik), toluen (hidrokarbon aromatik), kloroform, aseton, umumnya digunakan sebagai pelarut untuk tahap separasi dan tahap pemurnian atau fraksinasi (Sidik dan Mudahar, 2000). 3. Metode ekstraksi dengan digesti Proses penyarian (ekstraksi) secara umum dapat dibedakan menjadi maserasi, infundasi, perkolasi, destilasi uap dan sering terdapat modifikasi. Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana, dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia atau bahan dalam cairan penyari. Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan di luar sel, maka larutan yang terpekat didesak ke luar. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat yang mudah larut dalam cairan penyari, tidak mengandung zat yang mudah mengembang dalam cairan penyari, tidak mengandung benzoin dan sitrak (Anonim, 1986).
9
Dalam proses maserasi, keadaan diam akan menyebabkan terjadinya profil konsentrasi yaitu kesetimbangan perpindahan massa dari sel ke dalam pelarut dan dari pelarut ke dalam sel. Keadaan ini dapat dihindari dengan melakukan pengadukan atau dengan pemanasan (Stahl, 1985). Pada maserasi dapat dilakukan dimodifikasi menjadi digesti yaitu cara penyarian dengan menggunakan pemanasan lemah pada suhu 40-50 OC. Cara maserasi ini hanya cocok dipergunakan untuk simplisia yang zat yang diinginkan tahan terhadap pemanasan. Metode digesti memiliki keuntungan yaitu kemampuan cairan penyari untuk melarutkan zat diinginkan menjadi lebih besar dan memiliki pengaruh sama dengan pengadukan, kekentalan pelarut berkurang yang dapat mengakibatkan berkurangnya lapisan batas, serta akibat koefisien difusi yang berbanding lurus dengan suhu absolut dan berbanding terbalik dengan kekentalan sehingga kenaikan suhu akan berpengaruh pada kecepatan difusi. Pada umumnya kelarutan zat akan meningkat sejalan dengan kenaikan suhu (Anonim, 1986).
C. KLT-Densitometri 1. Kromatografi lapis tipis Kromatografi lapis tipis digunakan untuk pemisahan senyawa secara cepat menggunakan zat penyerap berupa serbuk halus yang dilapiskan serba rata pada lempeng. Lempeng yang dilapisi dianggap sebagai “kolom kromatografi terbuka” dan pemisahan dapat didasarkan pada penyerapan, pembagian dan gabungan, tergantung dari jenis zat penyerap dan jenis larutan pengembang
10
(Anonim, 1979). Kromatografi
lapis
tipis
(KLT)
merupakan
metode
pemisahan
fisikokimia. Campuran yang akan dipisahkan berupa larutan ditotolkan berupa bercak atau pita. Setelah pelat ditaruh dalam bejana yang tertutup rapat dan berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak), pemisahan terjadi selama perambatan kapiler selanjutnya senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan (Hardjono, 1983). Metode KLT menggunakan dua macam komponen, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam dibuat dari salah satu penyerap yang khusus digunakan untuk kromatografi lapis tipis. Penyerap yang umum digunakan adalah silika gel, alumunium oksida, kieselgur, poliamida, selulosa dan turunannya. Untuk analisis, tebal penyerap yang dipergunakan yaitu 0,1-0,3 mm, biasanya 0,2 mm dan merupakan suatu lapisan berpori menimbulkan adanya gaya kapiler. Sebelum digunakan, lempeng disimpan dalam lingkungan yang tidak lembab dan bebas dari uap (Stahl, 1985). Fase gerak merupakan medium angkut yang terdiri atas satu atau campuran beberapa pelarut. Medium bergerak dalam fase diam. Untuk analisa kromatografi digunakan pelarut yang mempunyai tingkat mutu analitik, dan bila diperlukan, sistem pelarut multi komponen ini harus berupa campuran sederhana yang terdiri atas tidak lebih dari tiga macam pelarut (Stahl, 1985). Pada kromatografi lapis tipis perlu diperhatikan polaritas fase gerak. Fase gerak yang mengelusi zat terlalu cepat tidak dapat memisahkan komponen dengan baik, sebaliknya fase gerak yang terlalu lambat mengelusi akan memberikan
11
waktu elusi yang terlalu lama. Urutan polaritas dari fase gerak yang biasa digunakan (dari non polar ke polar) yaitu n-heksana, heptana, sikloheksana, karbon tetraklorida, benzena, kloroform, eter, etil asetat, piridina, aseton, metanol, dan air (Stahl, 1985). Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal dipeoleh haya jika penotolan sampel dilakukan dengan membentuk ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin. Sebagaimana dalam prosedur kromatografi yang lain, jika sampel yang digunakan terlalu banyak maka akan menurunkan resolusi (Rohman, 2009). Penotolan sampel yang tidak tepat akan menyebabkan bercak yang menyebar dan puncak ganda. Berdasarkan tujuan analisis, berbagai macam jumlah sampel telah disarankan untuk dipergunakan dan direkomendasikan oleh Advamovic (1997) dalam tabel 1. Tabel 1. Parameter-parameter aplikasi yang direkomendasikan pada analisis menggunakan KLT
Tujuan
Diameter Bercak (mm)
Densitometri
2 mm untuk volume 0,5 µL
Identifikasi
3 mm untuk volume sampel 1 µL 4 mm untuk volume sampel 2 µL
Uji kemurnian
Konsentrasi Sampel (%) 0,02 – 0,2
0,1 – 1
Banyaknya Sampel (µg) 0,1 – 1 (untuk KLTkinerja tinggi) atau 1 – 10 (KLT Konvensional) 1 – 20
5
100
Pengembangan adalah proses pemisahan campuran cuplikan akibat pelarut pengembang merambat naik dalam lapisan. Jarak pengembangan normal yaitu jarak antara garis awal dan garis batas. Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan dengan harga Rf atau hRf .
12
Jarak titik pusat bercak dari titik awal Rf
= Jarak garis batas dari titik awal
Angka Rf berkisar antara 0,00 dan 1,00 dan hanya dapat ditentukan dua desimal. hRf
adalah angka Rf
dikalikan faktor 100 (h), menghasilkan nilai
berjangka 0 sampai 100 (Stahl, 1985). Pengekoran noda kromatogram terjadi apabila proses pemisahan yang terjadi tidak sempurna yang digambarkan dengan noda bercak yang tidak bulat (berekor). Terlalu tingginya konsentrasi komponen yang ditentukan juga merupakan salah satu penyebab terjadinya kromatogram yang beekor. Penyebab pengekoran antara lain adalah ketidakjenuhan tangki (chamber) KLT sehingga fase gerak yang mengelusi pelat KLT segera menguap dalam ruangan tangki KLT. Ketidaktepatan pemilihan fase gerak terhadap fase diam dan jenis sampel yang dianalisis juga merupakan penyebab pengekoran kromatogram yang lainnya (Mulja dan Suharman, 1995). Terdapat berbagai kemungkinan untuk deteksi senyawa tanpa warna pada kromatogram. Deteksi paling sederhana adalah jika senyawa menunjukkan di daerah ultraviolet gelombang pendek dengan radiasi utama pada kira-kira 254 nm atau jika senyawa itu dapat dieksitasi ke fluoresensi radiasi ultraviolet gelombang pendek dan atau gelombang panjang yakni 365 nm. Jika dengan kedua cara itu senyawa tidak dapat dideteksi, harus dicoba dengan reaksi kimia dengan atau pemanasan (Stahl, 1985). Menurut Putrandana (2003), fase diam selulosa dan fase gerak kloroform, metanol, air (64:50:10 v/v) dapat dipergunakan untuk mengisolasi brazilin dalam kayu secang.
13
2. Densitometri densitometri merupakan salah satu metode analisa kuantitatif. KLT-densitometri Penetapann kadar suatu senyawa dengan metode ini dilakukan dengan mengukur kerapatan bercak senyawa yang dipisahkan dengan cara KLT. Pada umumnya pengukuran kerapatan bercak tersebut dibandingkan dengan kerapatan bercak senyawa standar yang dielusi secara bersama-sama bersama ama (Hardjono, 1985). Keterangan : 1. lampu 2. lensa 3. slit monokromator 4. monokromator grating 5. cermin 6. piringan celah slit 7. sistem lensa 8. cermin 9. beam splitter 10.reference reference photomultiplier 11.objek objek yang di scan 12.photomultiplier photomultiplier pengukur 13.photodiode photodiode transmisi (Sherma and an Fried ,2003)
Gambar 2. Diagram prinsip kerja TLC scanner
Teknik pengukuran dapat didasarkan atas pengukuran intensitas sinar yang diserap (absorbansi), intensitas sinar yang dipantulkan (reflaktansi) atau intensitas sinar yang diflouresensikan. diflouresensikan. Teknik pengukuran berdasarkan refleksi dimana sinar datang sebagian diserap dan sebagian lagi dipantulkan. Banyaknya sinar yang direfleksikan akan ditangkap oleh suatu alat yang disebut reflection
14
photomultiplier dan kemudian diteruskan ke pencatat untuk diterjemahkan ke dalam suatu kromatogram (Mintarsih, 1990). Untuk evaluasi bercak KLT secara densitometri bercak ditelusuri dengan sumber sinar dalam bentuk celah (slit) yang dapat dipilih baik panjangnya maupun lebarnya. Sinar yang dipantulkan diukur dengan sensor cahaya (fotosensor). Perbedaan antara sinyal optik daerah yang tidak mengandung bercak dengan daerah yang mengandung bercak dihubungkan dengan banyaknya analit yang ada melalui kurva kalibrasi yang telah disiapkan dalam lempeng yang sama. Pengukuran densitometri dapat dibuat dengan absorbansi atau dengan flouresensi (Rohman, 2009). Prinsip TLC Scanner terlihat pada gambar 2 (Sherma dan Fried, 2003). Pada umumnya tebal lapisan tipis pada lempeng yang digunakan adalah 0,20 mm – 0,25 mm dan maksimum 0,33 mm untuk mengurangi efek hamburan sinar yang disebabkan oleh fase diam terhadap linearitas hubungan serapan dan konsentrasi dari senyawa yang diteliti. Hubungan antara serapan terhadap konsentrasi dilinearkan dengan dasar teori Kubelka-Munk menggunakan kurva kerja linear yang diprogramkan pada mikrokomputer. Kurva serapan konsentrasi tersebut ditentukan oleh harga parameter hamburan yang disebabkan oleh fase diam. Harga parameter hamburan tersebut tergantung ukuran dan distribusi partikel fase diam pada lempeng KLT (Supardjan, 1987). Karena adanya penghamburan sinar oleh partikel-partikel yang ada di lempeng, maka suatu persamaan matematis yang sederhana dan terdefenisi dengan baik menyatakan hubungan antara sinyal sinar dan banyaknya
15
(konsentrasi) senyawa dalam lapisan tipis tidak pernah dijumpai. Sebagai akibatnya hubungan ini tidak bersifat linear. Meskipun demikian, karena saat ini tersedia perangkat lunak (software) ataupun integrator yang dapat menangani hubungan yang tidak linear maka tidak diperlukan untuk melinearkan hubungan antara konsentrasi dan respon optis (Rohman, 2009).
D. Metode Desain Faktorial Desain faktorial merupakan aplikasi persamaan regresi yaitu teknik untuk memberikan model hubungan antara variabel respon dengan satu atau lebih variabel bebas. Model yang diperoleh dari analisis tersebut berupa persamaan matematika. Desain faktorial
menghasilkan suatu desain percobaan untuk
mengetahui faktor yang dominan berpengaruh secara signifikan terhadap suatu respon (Bolton, 1990). Aplikasi desain faktorial sejauh ini menggunakan 2 level secara langsung akan mengakibatkan hubungan linear yang terjadi antara besarnya faktor dan efek yang ditimbulkan dan daerah diantara level yang dipilih tidak akan dapat dideteksi nilai efeknya. Karena hubungan antara faktor dengan efek yang ditimbulkan tidak selalu linear sehingga diperlukan lebih dari dua level untuk menentukannya. Saat dipergunakan desain 2 faktor dan 3 level maka jumlah percobaan yang dilakukan berjumlah 9. Diagram percobaan menggunakan metode desain faktorial dapat dilihat pada gambar 3.
16
Gambar 3. Diagram desain 2 faktor dan 3 level (Armstrong, 1996)
Pengkodean untuk tiga level dalam dua faktor yaitu 0 untuk level rendah, 1 untuk level tengah dan 2 untuk level tinggi. Penelitian dengan dua faktor dilihat dari dua digit penamaan yang diberikan. Misalnya 00 dimana kedua faktor dalam level rendah, 12 bermakna faktor pertama memiliki level sedang dan faktor kedua dalam level tinggi. Penggunaan 3 level menyebabkan hubungan yang tidak linear antara kedua faktor dengan respon, hal ini dapat dilihat pada persamaan (1) dan (2) yang keduanya mengandung hubungan linear (yang biasa disimbolkan dengan AL dan BL) dan hubungan kuadratik (disimbolkan dengan AQ dan BQ). Respon
= a + bAL + cAQ2 …………………… (1)
Respon
= a + bBL + cBQ2 …………………… (2) (Armstrong, 1996).
Jika diketahui bahwa hubungan antara independen variabel dan dependen variabel tidak linear maka dipergunakan persamaan second order relationship. Model dari persamaan untuk second order relationship adalah sebagai berikut : Y = B0 + B1X1 + B2X2 + B11X12 + B22X22 + B1B2X1X2
17
Dengan Y merupakan respon hasil (variabel dependen); X1, X2 merupakan kedua faktor yang diamati dan B0, B1, B2 merupakan koefisien yang dapat dihitung dari hasil penelitian (Armstrong, 1996). Desain faktorial memiliki beberapa keuntungan. Metode ini memiliki efisiensi yang maksimum untuk memperkirakan efek yang dominan dalam menentukan respon dan memungkinkan untuk mengidentifikasi efek masingmasing faktor, maupun efek interaksi antar faktor. Metode ini ekonomis, dapat mengurangi jumlah penelitian jika dibandingkan dengan meneliti dua efek faktor secara terpisah. Desain faktorial 2 faktor 3 level kemudian dapat dianalisis dengan ANOVA atau Yate’s treatment untuk mengetahui besarnya efek dan signifikansi pengaruh tiap faktor dan interaksinya terhadap respon (Bolton, 1990).
E. Landasan Teori Senyawa subtipe brazilin dalam ekstrak kayu secang yaitu brazilin, brazilein dan 3’-O-metilbrazilin yang selanjutnya disebut sebagai komposit brazilin. Brazilin yang berwarna kuning dan pada pH basa akan berubah menjadi brazilein yang berwarna merah. Proses ekstraksi dilakukan dengan metode digesti karena komposit brazilin merupakan senyawa yang tahan terhadap pemanasan. Brazilin sangat larut pada pelarut etanol dan mudah larut pada pelarut air sehingga campuran keduanya dapat dipergunakan sebagai cairan penyari dalam proses digesti kayu secang namun belum diketahui konsentrasi yang tepat dalam mengekstraksi komposit brazilin sehingga perlu dilakukan optimasi. Lama proses digesti memiliki hubungan langsung dengan jumlah komposit brazilin yang dapat diekstraksi. Secara umum semakin lama proses digesti maka semakin banyak
18
komposit brazilin yang dapat diekstraksi karena waktu kontak cairan penyari dengan serbuk kayu secang semakin meningkat. Sistem kromatografi yang dipergunakan untuk mengisolasi komposit brazilin yaitu dengan fase diam selulosa dan fase gerak kloroform : metanol : aquadest (64:50:10 v/v). Bercak yang terdeteksi sebagai komposit brazilin diukur nilai AUC nya menggunakan TLC scanner secara densitometri. Analisis Yate’s treatment dilakukan untuk melihat signifikansi tiap faktor yaitu lama digesti, konsentrasi cairan penyari dan interaksinya terhadap respon AUC komposit brazilin. Titik optimum kondisi digesti didapat dari countour plot hubungan lama digesti dan konsentrasi cairan penyari dengan respon AUC komposit brazilin.
F. Hipotesis 1. Lama digesti, konsentrasi cairan penyari dan interaksinya berpengaruh terhadap respon AUC komposit brazilin secara signifikan 2. Titik optimum dapat diperoleh dari countour plot
lama digesti dengan
konsentrasi cairan penyari terhadap AUC komposit brazilin
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian
ini
termasuk
jenis
penelitian
eksperimental
quasi
menggunakan aplikasi desain faktorial. Penelitian dilakukan pada Laboratorium Kimia Organik dan Laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
B. Variabel dan Definisi Operasional 1. Klasifikasi variabel a. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah lama ekstraksi secara digesti dan konsentrasi cairan penyari b. Variabel tergantung dalam penelitian ini yaitu AUC dihasilkan oleh komposit brazilin c. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini yaitu waktu pemanenan batang secang dan lingkungan tempat tumbuh 2. Definisi operasional a. Digesti adalah proses penyarian yang dilakukan dengan merendam serbuk dalam maserator dalam pemanasan rendah yaitu 45-50 OC b. Level rendah, tengah dan tinggi dalam lama ekstraksi secara digesti berturut-turut yaitu 90 menit, 180 menit dan 270 menit yang dilakukan dalam 3 kali digesti berulang c. Level rendah, tengah dan tinggi dalam konsentrasi cairan penyari ekstraksi
19
20
secara digesti berturut-turut yaitu 4 %, 50 % dan 100 % d. Konsentrasi cairan penyari merupakan konsentrasi aquadest dalam etanol e. Komposit brazilin adalah komponen fenolik yang merupakan subtipe struktural brazilin, terdiri dari senyawa brazilin, brazilein dan 3’-Ometilbrazilin f. Titik optimum adalah titik dimana proses digesti menghasilkan AUC komposit brazilin yang maksimum dengan lama digesti yang minimum dan konsentrasi penyari yang maksimum
C. Bahan atau Materi Penelitian Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah batang secang (Caesalpinia sappan L.) sebagai sampel yang diperoleh dari Desa Kemuning, Wonosari, Yogyakarta. Cairan penyari berupa aquadest dan etanol 96 %. Bahan untuk KLT dan KLT-P yaitu berupa fase diam selulosa (E Merck), fase gerak derajat pro analisis produksi E Merck yaitu kloroform dan metanol. Bahan untuk pembuatan buffer fosfat yaitu KH2PO4, NaOH, Fe(III) klorida, Timbal(II) asetat dan aquadest.
D. Alat atau Instrumen Penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah blender simplisia (Retsch bc ZM1) dengan pisau nomor 4 dan ayakan serbuk simplisia 12 dan 50 mesh, alat–alat gelas, pelat tetes, kertas saring, cawan porselen, waterbath, labu bersumbat, neraca analitik (Mettler Toledo, AB204), oven (Termaks, salm en tipp bv Seri 08725), pipet mikro, lampu UV (MINUVIS Desaga Heldelberg Seri
21
05.67.02), spektrofotometer (Perkin Elmer UV/VIS Spectrometer Lambda 20) dan Thin Layer Chromatography (TLC) Scanner Densitometric (CAMAG TLC Scanner 3, cat. No. 027.6485, seri 160602)
E. Tata Cara Penelitian 1. Pengumpulan bahan Batang secang diperoleh dari Desa Kemuning Kecamatan Wonosari Kabupaten Bantul, Yogyakarta pada bulan Februari 2009 dalam keadaan utuh, segar, dan masih basah 2. Identifikasi tanaman dan kayu a. Identifikasi morfologis tanaman Identifikasi dilakukan dengan melihat morfologi tanaman dan dicocokkan dengan pustaka Materia Medika Indonesia edisi I mengenai tanaman secang (Caesalpinia sappan L.) b. Identifikasi makroskopik kayu Identifikasi dilakukan dengan melihat kayu secara makroskopik dan dicocokkan dengan pustaka Materia Medika Indonesia edisi I mengenai kayu secang c. Identifikasi kayu secara kimia dilakukan sebagai berikut: i.
Identifikasi awal kayu secara kimia dilakukan dengan mengkocok 100 mg serbuk kayu dengan metanol P selama 5 menit, warna filtrat diamati
ii.
Pada pelat tetes, 3 tetes filtrat ditambah 1 tetes kalium hidroksida P 5 % b
iii.
/v, warna yang terjadi diamati
Pada pelat tetes, 3 tetes filtrat ditambah 1 tetes natrium hidroksida P 5 %
22
b
iv.
/v, warna yang terjadi diamati
Pada pelat tetes, 3 tetes filtrat ditambah 1 tetes timbal(II)asetat P 5 % b/v, warna yang terjadi diamati
v.
Pada pelat tetes, 3 tetes filtrat ditambah 1 tetes besi(III)klorida P 5 % b/v, warna yang terjadi diamati
3. Pembuatan simplisia kayu secang a. Sortasi basah Bahan yang telah dikumpulkan disortasi basah dengan memilah bahan uji dipisahkan dengan kotoran-kotoran atau bahan-bahan asing dari simplisia. b. Pencucian, penyerutan, dan pengeringan Batang secang dicuci dengan air mengalir hingga bersih, kemudian ditiriskan. Batang secang yang telah bersih dan bebas dari sisa air cucian tersebut diserut menggunakan alat serut hingga diperoleh hasil dengan ketebalan yang kurang lebih 3-5 mm. Batang secang yang telah diserut, disusun di atas alas berlubang dan dikeringkan menggunakan oven pada suhu 60 OC. Secara berkala dibolak-balik agar pengeringan berlangsung merata. Pengeringan batang secang dihentikan apabila simplisia mudah dipatahkan serta menimbulkan bunyi gemerisik jika diremas. c. Sortasi kering Batang secang yang sudah kering kemudian dipisahkan dari benda-benda asing seperti bagian tanaman yang tidak diinginkan dan kotoran-kotoran lain yang masih tertinggal dalam simplisia kering.
23
d. Pembuatan serbuk kayu secang Kayu secang yang sudah kering kemudian diserbuk menggunakan blender kemudian diayak dengan ukuran serbuk 12/50 mesh 4. Analisis kualitatif komposit brazilin a. Pembuatan bufer fosfat. Kalium dihidrogen fosfat 0,2 M sebanyak 50 ml dimasukkan ke dalam labu ukur 200 ml ditambahkan 29,1 ml natrium hidroksida 0,2 N dan ditambahkan air bebas CO2 P sampai 200 ml. b. Ekstraksi kayu secang secara digesti. Serbuk kering kayu secang sebanyak lima gram dimasukkan ke dalam erlenmeyer bertutup, ditambahkan cairan penyari yaitu aquadest 50 % dalam etanol berturut-turut sebanyak 75, 50, dan 25 ml. Digesti dilakukan selama 270 menit. Ekstrak yang diperoleh diuapkan dengan waterbath pada suhu 80 OC sampai mendapatkan ekstrak kering. c. Isolasi dengan KLT-preparatif. Ekstrak kering dilarutkan dalam etanol, kemudian ditotolkan pada lempeng kromatografi dengan fase diam selulosa setebal 2 mm. Penotolan dilakukan sebanyak 10 µl. Setelah itu lempeng kromatografi dimasukkan ke dalam bejana yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan fase gerak berupa kloroform : metanol : aquadest (64:50:10v/v). Pengembangan dilakukan sepanjang 15 cm. Setelah itu lempeng dikeringkan dan bercak yang diduga komposit brazilin dikerok dan dikumpulkan. Hasil kerokan ini kemudian disebut sebagai isolat. Istilah isolat sesuai dengan yang disampaikan oleh Hostettmann (1995). Hasil kerokan bercak tunggal yang telah dikerok dikerok dilarutkan dalam etanol 96 % dan disentrifugasi.
24
d. Penetapan panjang gelombang serapan maksimum. Supernatan yang diperoleh diuapkan dan dilarutkan dalam bufer fosfat, kemudian ditelusuri menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400 - 800 nm. Hasil penelusuran dibandingkan dengan acuan pustaka. Panjang gelombang serapan maksimum brazilein yaitu 541 nm (Wetwitayaklung, Phaechamud dan Keokitichai, 2005). 5. Penyarian dengan metode digesti Kurang lebih seksama serbuk kering sebanyak 5,0 g dimasukkan ke dalam erlenmeyer bertutup, ditambahkan cairan penyari (aquadest 4 % dalam etanol, aquadest 50 % dalam etanol dan aquadest 100%) berturut-turut sebanyak 75, 50, dan 25 ml. Pemanasan dijaga pada suhu 45 OC sampai 50 OC. Tabel 2. Rancangan percobaan berdasarkan desain faktorial
Faktor Percobaan 00 10 20 01 11 21 02 12 22
Konsentrasi cairan penyari (%) 4 50 100 4 50 100 4 50 100
Lama ekstraksi (menit) 90 90 90 180 180 180 270 270 270
Keterangan : 00 : Konsentrasi cairan penyari level rendah dengan lama ekstraksi level rendah 10 : Konsentrasi cairan penyari level tengah dengan lama ekstraksi level rendah 20 : Konsentrasi cairan penyari level tinggi dengan lama ekstraksi level rendah 01 : Konsentrasi cairan penyari level rendah dengan lama ekstraksi level tengah 11 : Konsentrasi cairan penyari level tengah dengan lama ekstraksi level tengah 21 : Konsentrasi cairan penyari level tinggi dengan lama ekstraksi level tengah 02 : Konsentrasi cairan penyari level rendah dengan lama ekstraksi level tinggi 12 : Konsentrasi cairan penyari level tengah dengan lama ekstraksi level tinggi 22 : Konsentrasi cairan penyari level tinggi dengan lama ekstraksi level tinggi
25
Sari diserkai dan ampas diperas. Sari didiamkan selama satu hari kemudian disaring. Ekstrak yang diperoleh diuapkan dengan waterbath pada suhu 80 OC sampai mendapatkan ekstrak kering. Berat ekstrak kering yang diperoleh dari tiap percobaan dicatat sebagai berat rendemen hasil ekstraksi. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. 6. Pemisahan komposit brazilin dengan KLT Ekstrak kering dilarutkan dalam etanol sampai 10 mL, kemudian diencerkan dengan faktor pengenceran 2,5 kali dan ditotolkan sebanyak 0,5 µL pada lempeng kromatografi 20 cm x 20 cm dengan fase diam setebal 0,25 mm. Setelah itu lempeng kromatografi dimasukkan ke dalam bejana yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan fase gerak berupa kloroform, metanol, aquadest (64:50:10 v/v). Pengembangan dilakukan sepanjang 15 cm. Setelah itu lempeng dikeringkan. 7. Pengukuran AUC komposit brazilin dengan TLC scanner densitometric a. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum. Pengukuran panjang gelombang serapan maksimum dengan TLC Densitometer Scanner dilakukan dengan menyemprot lempeng KLT yang mengandung bercak komposit brazilin dengan buffer fosfat pH 7. Keseluruhan jalur pengembangan analit ditelusuri panjang gelombang serapan maksimumnya dengan penelusuran pada 400 - 600 nm. b. Penetapan AUC komposit brazilin dengan KLT-densitometri. AUC diukur dengan TLC Scanner Densitometric pada panjang gelombang serapan maksimum yang didapatkan.
26
F. Analisis Hasil 1. Analisis hasil dari data AUC komposit brazilin dilakukan dengan metode desain faktorial. Analisis ini bertujuan untuk melihat besarnya efek konsentrasi cairan penyari, lama digesti, dan efek interaksinya sehingga dapat diketahui efek dominan yang mempengaruhi AUC Komposit brazilin. Analisis statistik dengan Yate’s treatment dilakukan untuk mengetahui signifikansi dari setiap faktor dan interaksi dalam mempengaruhi respon. Berdasarkan analisis statistik ini maka dapat ditentukan ada atau tidaknya hubungan dari setiap faktor terhadap respon. Hal tersebut dapat dilihat dari harga F hitung dan F tabel. 2. Dari contour plot faktor lama digesti dan konsentrasi cairan penyari dan AUC komposit brazilin dapat diprediksi titik optimum pada proses digesti komposit brazilin.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pengumpulan Bahan Bahan berupa bagian tanaman segar dan batang secang (Caesalpinia sappan L.) diperoleh dari perkebunan secang di desa Kemuning, Wonosari, Yogyakarta pada bulan Februari 2009. Hasil pengumpulan batang secang yaitu batang secang basah dan segar sebanyak 20,6 kg.
Gambar 4. Batang secang segar
Pengumpulan batang secang ini dilakukan untuk keseluruhan proses penelitian sehingga dapat mengendalikan variabel pengacau seperti waktu pemanenan, umur tanaman, lingkungan dan tempat tumbuh karena bahan simplisia diambil pada tempat budidaya yang sama dan waktu pemanenan yang serempak dari satu tanaman. Menurut Wetwitayaklung, Phaechamud, dan Keokitichai (2005), kadar komposit brazilin (brazilin dan derivatnya) bervariasi dan tidak tergantung umur tanaman dengan umur 2, 4, 6, 10 dan 30 tahun.
27
28
B. Identifikasi Tanaman dan Kayu Identifikasi tanaman dan kayu dilakukan untuk menghindari kesalahan pemilihan bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian. Identifikasi dilakukan dengan identifikasi morfologi untuk tanaman secang (Caesalpinia sappan L.), pemerian secara makroskopis dan identifikasi dengan pereaksi kimia untuk kayu secang. Adapun yang diamati secara morfologis tanaman yaitu ranting berduri bengkok dan tersebar. Daun majemuk panjang 20 cm – 40 cm, bersirip, panjang sirip 7,5 cm sampai 13 cm. Setiap sirip mengandung 10 – 20 pasang anak daun berhadapan. Anak daun tidak bertangkai berbentuk lonjong ujungnya bundar dengan panjang antara 10 mm – 25 mm. Bunga berbentuk malai, pinggir kelopak berambut, tajuk memencar dan berwarna kuning. Bunga terdapat di ujung, panjang malai 10 cm sampai 40 cm, panjang gagang bunga 15 cm sampai 20 cm, pinggir kelopak berambut, panjang daun kelopak yang terbawah lebih kurang 10 mm, lebar lebih kurang 4 mm, empat daun kelopak lainnya panjang lebih kurang 7 mm, lebar lebih kurang 4mm, panjang benang sari lebih kurang 15 mm, panjang putik lebih kurang 18 mm. Polong berwarna hitam, panjang 8 cm sampai 10 cm, lebar 3 cm sampai 4 cm, berisi 3 sampai 4 biji, panjang biji 15 mm sampai 18 mm, lebar 8 mm sampai 11 mm, tebal 5 mm sampai 7 mm.
29
Hasil pengamatan morfologis bagian tanaman terdapat pada gambar 5. Hasil pengamatan sesuai dengan pertelaan mengenai Caesalpinnia sappan L. berdasarkan Materia Medika Indonesia (MMI) edisi I.
(
c
Keterangan: a. Polong secang b. Daun secang c. Bunga secang
)
(
(
a
b
)
)
Gambar 5. Bagian tanaman secang
Pengamatan kayu secara makroskopik adalah berbentuk kayu serutan ukuran bervarias, keras dan padat serta berwarna jingga sampai kuning. Dari hasil pengamatan makroskopis menunjukkan ciri yang tercantum dalam Materia Medika Indonesia edisi I mengenai pemerian kayu secang secara makroskopis. Pada identifikasi kayu secara kimia serbuk kayu dikocok dalam metanol P selama 5 menit menghasilkan filtrat berwarna kuning jingga dilakukan sebagai identifikasi awal terhadap kayu secang. Hasil identifikasi dengan penambahan pereaksi kimia yang dilakukan yaitu pada penambahan larutan kalium hidroksida P 5% b/v dan natrium hidroksida P 5% b/v menghasilkan warna ungu kemerahan, sedangkan pada penambahan timbal (II) asetat P 5 % b/v dan besi (III) klorida P 5 % b/v terjadi warna ungu kecoklatan.
30
Tabel 3. Hasil identifikasi kayu secara kimia
Identifikasi Dalam metanol P Kalium hidroksida P 5% b/v Natrium hidroksida P 5% b/v Timbal(II)asetat P 5% b/v Besi(III)klorida P 5% b/v
Warna Kuning jingga Ungu kemerahan Ungu kemerahan Ungu kecoklatan Ungu kecoklatan
Hasil positif menurut MMI Kuning jingga Ungu Ungu Ungu Ungu
Apabila dibandingkan dengan warna pembanding menurut MMI edisi I terdapat perbedaan warna dengan timbulnya warna kemerahan dan kecoklatan dari hasil reaksi. Hal ini mungkin diakibatkan perbedaan standar kayu secang yang dipergunakan dalam penentuan pembanding dalam identifiksi secara kimia. Perbedaan simplisia dapat disebabkan perbedaan kondisi tanah dan tempat tumbuh tanaman yang menyebabkan perbedaan kandungan senyawa metabolit yang dihasilkan. Identifikasi menghasilkan reaksi positif terhadap serbuk simplisia secang sesuai identifikasi pada MMI edisi I mengenai kayu secang. Dari hasil analisis secara kimia diperoleh bahwa simplisia yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah simplisia kayu secang. Senyawa penanda dari ekstrak kayu secang yaitu brazilin, mengakibatkan reaksi positif dengan terbentuknya warna ungu. Pada penambahan kalium hidroksida dan natrium hidroksida, adanya suasana basa (kehadiran ion -OH) akan menggeser kesetimbangan reaksi ke arah kanan membentuk brazilein yang merupakan hasil reaksi pemanjangan kromofor brazilin.
31
Gambar 6. Reaksi brazilin menjadi brazilein dengan penambahan basa Keterangan : gugus kromofor auksokrom
Saat suatu senyawa mengabsorbsi panjang gelombang tampak tertentu dan merefleksikan panjang gelombang yang lainnya maka senyawa tersebut akan menjadi berwarna. Cahaya tampak yang mengenai kromofor akan diabsorbsi dan terjadi eksitasi elektron dari ground state menuju excited state. Dengan keberadaan ikatan berselingan antara ikatan tunggal dan ikatan rangkap yang panjang maka energi untuk mengeksitasi elektron dari ground state menuju excited state menjadi lebih rendah karena energi orbital molekul berpasangan tertinggi (HOMO) dengan orbital molekul tak berpasangan terendah (LUMO) akan semakin berdekatan daripada ikatan rangkap menyendiri sehingga akan menggeser panjang gelombang yang dihasilkan menuju panjang gelombang yang lebih panjang. Energi eksitasi berkurang akibat adanya stabilisasi resonansi pada saat keadaan eksitasi sehingga semakin panjang kromofor maka semakin kecil
32
energi yang diperlukan untuk menuju keadaan tereksitasi pertama. Dalam kasus ini dengan perpanjangan kromofor brazilin maka terbentuk intensitas warna yang lebih kuat membentuk warna merah jingga pada brazilein. Hal tersebut berlangsung pula pada senyawa 3’-O- metilbrazilin. Pada penambahan kalium hidroksida dan natrium hidroksida, adanya suasana basa (kehadiran ion -OH) akan merubah 3’-O-metilbrazilin menjadi 3’-O- metilbrazilein menurut reaksi di bawah ini,
Gambar 7. Pembentukan 3’-O-metilbrazilein metilbrazilin dengan adanya penambahan basa Keterangan : gugus kromofor auksokrom
dari
3’-O-
Pada penambahan timbal(II) asetat atau besi(III) klorida terbentuk senyawa kompleks antara ion timbal (Pb2+) atau ion besi (Fe3+) dengan gugus hidroksil brazilin membentuk kompleks warna merah sampai ungu. Logam timbal
33
dan besi merupakan suatu atom pusat yang bertindak sebagai akseptor elektron dan memiliki orbital d yang kosong, sedangkan senyawa komposit brazilin memiliki gugus hidroksil yang merupakan donor elektron yang selanjutnya disebut sebagai ligan.
Besi(III) klorida
Asam klorida
Brazilin Kompleks berwarna ungu
Gambar 8. Reaksi pembentukan kompleks brazilin dengan FeCl3
Timbal(II)asetat
Brazilin
Asam asetat
Kompleks berwarna ungu Gambar 9. Reaksi pembentukan kompleks antara brazilin dengan Pb(CH3COO)2
Apabila terbentuk kompleks antara komposit brazilin dengan ion logam timbal atau besi dan kompleks tersebut terpapar sinar tampak maka terjadi transisi
34
elektronik yang mengakibatkan senyawa kompleks ini mengabsorbsi panjang gelombang di daerah sinar tampak. Efek absorbsi panjang gelombang pada daerah sinar tampak terjadi karena elektron yang dieksitasi oleh cahaya tampak dari tingkat energi orbital molekul kompleks yang diisi elektron menuju tingkat energi yang kosong pada orbital d yang kosong pada atom pusat. Reaksi pembentukan senyawa komplek yang terjadi antara FeCl3 maupun Pb(CH3COO)2 dapat dilihat pada gambar 8 dan 9. C. Pembuatan Simplisia Secang Batang secang yang diperoleh disortasi basah, dengan maksud untuk memisahkan kotoran-kotoran atau bahan-bahan asing dari simplisia sehingga tidak mengganggu proses penelitian. Kemudian dicuci dengan air mengalir hingga bersih dan ditiriskan. Batang secang tersebut diserut hingga diperoleh hasil dengan ketebalan yang kurang lebih 3 - 5 mm dimana apabila irisan semakin tipis maka semakin cepat penguapan air sehingga waktu pengeringan semakin cepat.
Gambar 10. Serutan kayu secang
Kayu secang yang telah diserut disusun di atas alas berlubang-lubang, dikeringkan di oven pada suhu 60 0C. Bahan simplisia dapat dikeringkan pada
35
suhu 30 - 90 OC, tetapi suhu yang terbaik adalah tidak melebihi 60 OC (Anonim, 1985). Komposit brazilin memiliki suhu degradasi diatas 130 OC, tetapi apabila pemanasan dilakukan secara terus menerus terhadap simplisia dikawatirkan dapat mendegradasi komposit brazilin akibat panas yang terakumulasi dalam bahan simplisia. Penggunaan oven akan menjamin suhu yang terkontrol dan aliran udara panas akan memastikan pemanasan yang merata tidak hanya pada permukaan simplisia tetapi panas kering juga dapat mengambil lembab pada bagian bawah simplisia pada alas pengering yang berlubang-lubang memungkinkan aliran udara dari atas kebawah atau sebaliknya. Simplisia secara berkala selalu dibolak-balik agar pengeringan merata. Kayu yang telah kering dapat diketahui apabila kayu secang dapat dipatahkan dengan baik dan apabila diremas menimbulkan bunyi gemerisik dan dapat diasumsikan bahwa simplisia telah berada pada kadar air 8 - 10 %. Fungsi pengeringan adalah mengurangi kadar air yang terdapat dalam kayu secang sehingga mengurangi resiko tumbuhnya jamur selama penyimpanan yang dapat menurunkan mutu simplisia dan mempengaruhi zat aktif. Pada tujuan ekstraksi, kondisi simplisia yang kering akan meningkatkan keefektifan difusi cairan penyari ke dalam simplisia karena saat simplisia dikeringkan maka membran sel akan rusak sehingga cairan penyari akan semakin mudah masuk ke dalam sel untuk mengekstraksi komposit brazilin. Penyimpanan dilakukan dalam wadah tertutup rapat dan terlindung dari cahaya. Penyimpanan yang baik akan menjaga simplisia dalam kondisi kering. Hasil kayu secang kering yaitu sebanyak 20 kg. Kayu secang yang sudah kering dipisahkan dari benda-benda asing
36
seperti bagian tanaman yang tidak diinginkan dan kotoran-kotoran lain yang masih tertinggal dalam simplisia kering. Batang secang yang sudah kering kemudian diserbuk menggunakan blender dan diayak dengan ayakan 12/50 mesh. Pada ekstraksi secara maserasi dan modifikasinya termasuk digesti, serbuk simplisia direndam dalam cairan penyari sehingga ukuran serbuk simplisia sangat mempengaruhi efektifitas penyarian. Apabila serbuk simplisia terlalu besar maka luas permukaan kontak dengan cairan penyari akan menurun sehingga cairan penyari kurang efektif dalam menarik zat aktif. Sedangkan apabila serbuk berukuran terlalu kecil maka serbuk akan mengambang dan serbuk bagian atas yaitu bagian permukaan tidak dapat kontak dengan cairan penyari. Ukuran yang terlalu kecil juga mengakibatkan kesulitan pada waktu pemisahan hasil ekstraksi dengan serbuk yang membentuk koloid di dalamnya. Menurut Materia Medika Indonesia ukuran serbuk simplisia yang optimum dalam proses ekstraksi yaitu dengan ukuran derajar serbuk 4/18, tetapi pada penelitian ukuran serbuk yang dipergunakan dikonfersi ke dalam ukuran mesh yang paling dekat yaitu ukuran 12/50 mesh. Serbuk ukuran 12/50 mesh diharapkan cukup kecil dan telah dapat terendam sepenuhnya dalam cairan penyari yang dipergunakan.
D. Analisis Kualitatif Komposit Brazilin Analisis kualitatif bercak komposit brazilin dilakukan untuk memastikan bahwa bercak yang dianalisis merupakan komposit brazilin. Analisis kualitatif dilakukan pada pelat selulosa dengan ketebalan 2 mm dan fase gerak kloroform:metanol:aquadest (64:50:10 v/v) (Putrandana, 2003). Sebelum isolasi
37
komposit brazilin, dilakukan persiapan ekstrak yang akan dipergunakan untuk isolasi. Ekstrak yang dipergunakan yaitu ekstrak yang diperoleh secara digesti dengan konsentrasi cairan penyari 50 % selama 270 menit. Penggunaan cairan penyari dengan konsentrasi 50 % yaitu untuk merepresentasikan kelarutan komposit brazilin pada cairan penyari yang akan dipergunakan, dimana kelarutan brazilin yaitu pada air dan etanol. Digesti dilakukan selama 270 menit untuk memastikan keseluruhan komposit brazilin telah terekstraksi dengan terbentuknya ampas yang pucat. Jumlah ekstrak yang ditotolkan pada pelat selulosa 2 mm adalah sebanyak 10 µl dan diharapkan dapat mengisolasi komposit brazilin yang cukup sebelum dianalisis menggunakan spektrometer visibel. Ekstrak yang ditotolkan sebanyak 10 µl membentuk pita panjang kemudian dielusi menggunakan fase gerak kloroform, metanol dan aquadest (64:50:10 v/v) dengan pengembangan sepanjang 15 cm. Pemilihan fase diam selulosa dan fase gerak berdasarkan penelitian sebelumnya mengenai isolasi brazilin (Putrandana, 2003).
Gambar 11. Interaksi antara brazilin atau 3’-O-metilbrazilin dengan fase diam selulosa Keterangan : ------ Ikatan hidrogen
38
Sistem kromatografi yang dipergunakan adalah kromatografi planar fase normal dimana fase diam selulosa yang dipergunakan bersifat lebih polar daripada fase gerak campuran kloroform, metanol, air yang dipergunakan. Fase diam molekul selulosa yang dipergunakan terbentuk dari makromolekul yang mengandung unit D-glukopiranosa yang tergabung oleh ikatan β-glikosidik pada posisi 1 dan 4 oleh atom oksigen menbentuk ikatan rantai panjang. Penggunaan selulosa mikrokristalin memperkecil unit D-glukopiranosa menjadi berkisar 40 sampai 200 unit dalam satu rantai sehingga menurunkan lipofilisitas apabila dibandingkan dengan penggunaan selulosa alam dengan 400 sampai 4000 unit Dglukopiranosa. Pengaruh ini sangat penting dalam proses pemisahan senyawa. δ+
δ-
δ
δ-
δ-
+
+
δ-
δ
δ-
δ-
δ+ δ-
δδ+ δ-
δ-
δ-
-
δ
δ
δ+ δ-
δ+
δ-
δ δ-
δ+
δδ+
Gambar 12. Interaksi antara brazilin atau 3’-O-metilbrazilin dengan fase gerak kloroform, metanol, dan aquadest Keterangan : -------- Ikatan hidrogen ------- Interaksi dipol-dipol
Fase diam selulosa ini bersifat relatif lebih polar dibandingkan dengan fase gerak yang dipergunakan akibat banyaknya atom dengan keelektronegatifan tinggi yaitu atom O pada D-glukopiranosa yang menyusun rantai selulosa.
39
Senyawa yang akan dipisahkan, dalam hal ini komposit brazilin, akan teradsorpsi diantara fase gerak dan fase diam yang lebih polar. Pada pemisahan terdapat 3 buah bercak yang teridentifikasi saat dipaparkan pada sinar UV panjang gelombang 365 nm dan diberi simbol bercak A, bercak B dan bercak C walaupun secara visual hanya tampak satu bercak dan diduga sebagai komposit brazilin yaitu brazilin dan 3’-O-metilbrazilin. Hal ini dikarenakan pelarut yang dipergunakan dalam penotolan yaitu ekstrak etanolik yang bersifat asam sehingga komponen brazilein akan berubah menjadi brazilin. Pernyataan ini diperkuat dengan penambahan pereaksi semprot buffer fosfat kedua bercak ini menjadi berwarna merah, sedangkan pada bercak A tidak berubah menjadi berwarna merah. Saat bercak B dan C yang sebelumnya berwarna kuning terpapar oleh sinar UV panjang gelombang 365 nm, bercak menjadi berwarna kuning dan hijau dengan Rf 0,76 dan 0,83 hal ini menandakan bahwa bercak tak terpisahkan tersebut merupakan dua komponen senyawa yang berbeda. Profil pemisahan tersaji pada gambar 13. Bercak dengan Rf
0,76 dan 0,83 diduga sebagai brazilin dan 3’-O-
metilbrazilin, yang mengabsobsi pada panjang gelombang yang berbeda karena perbedaan auksoksrom yang dimiliki masing-masing senyawa walaupun memiliki kromofor yang identik. Hal ini dapat diketahui dari interaksi yang terjadi antara senyawa tersebut terhadap fase diam dan fase gerak seperti pada gambar 11 dan 12. Sistem kromatografi yang dipergunakan merupakan kromatografi planar fase normal dimana senyawa dengan kepolaran lebih tinggi akan lebih terikat pada fase diam dibandingkan senyawa yang kurang polar. Hal tersebut dapat dilihat
40
pada nilai Rf yang rendah. Akibat hal tersebut maka senyawa 3’-O-metilbrazilin yang bersifat kurang polar dibandingkan brazilin memiliki Rf yang lebih tinggi karena brazilin memiliki gugusan karbon lebih panjang yang terikat pada atom karbon nomor 3, dimana pada brazilin gugusan tersebut adalah sebuah gugusan hidroksil sedang pada 3’-O-metilbrazilin gugusan yang terikat adalah suatu metoksi. Pemanjangan atom karbon (alkil) secara umum akan menurunkan polaritas suatu senyawa. Bercak B dan C dikerok, dikumpulkan dan dianalisis panjang gelombang serapan maksimum menggunakan spekstrofotometri visibel.
C
C
C
C
B
B
B
B
A
I
A
II
III
IV
Gambar 13. Profil kromatogram hasil pemisahan komposit brazilin dengan fase diam selulosa dan fase gerak kloroform, metanol, aquadest (64:50:10 v/v) Keterangan (I) Penampakan secara visibel sebelum disemprot buffer (II) Kenampakan pada uv 365nm sebelum disemprot buffer (III) Kenampakan secara visibel setelah disemprot buffer (IV) Kenampakan pada uv 365nm setelah disemprot buffer
41
Tabel 4. Harga Rf dan profil warna masing-masing bercak hasil pemisahan dengan KLT-preparatif
Bercak
Rf
A. B. C.
0,36 0,76 0,83
Sebelum disemprot bufer Sesudah disemprot bufer Secara UV 365 nm Secara UV 365 nm Visual Visual Ungu Ungu Kuning Kuning Merah Kuning Kuning Hijau Merah Hijau
Selanjutnya bercak yang dianalisis merupakan bercak dengan Rf 0,76 dan 0,83 dimanan bercak B dan C diduga sebagai bercak komposit brazilin karena saat disemprot dengan buffer fosfat warna bercak berubah menjadi merah. Senyawa brazilin pada pH 7 akan berubah menjadi brazilein. Hal ini diduga juga terjadi pada senyawa subtipe brazilin lain yaitu 3’-O-metilbrazilin yang menjadi 3’-Ometilbrazilein. Penelusuran terhadap panjang gelombang serapan maksimum dilakukan pada 3 konsentrasi berbeda dilakukan untuk mengetahui reliabilitas hasil panjang gelombang serapan maksimum pada absorban 0,2 - 0,8. Penelusuran dilakukan pada panjang gelombang 400 - 600 nm. Dari ketiga spektra dengan konsentrasi yang berbeda dapat dilihat profil serapan yang identik dan perbedaan hanya berasal dari tinggi kurva serapan yang diakibatkan perbedaan jumlah analit dalam tiap larutan yang diukur. Dari hasil penelusuran didapat panjang gelombang serapan maksimum dari ketiga konsentrasi adalah 539 nm. Dapat disimpulkan bahwa bercak B dan C adalah bercak komposit brazilin karena menurut Wetwitayaklung, Phaechamud dan Keokitichai (2005) panjang gelombang serapan maksimum brazilein pada pH
42
7 adalah 541 nm. Menurut Farmakope Indonesia III untuk panjang gelombang serapan maksimum pada daerah da di atas 320 nm perbedaan ± 2 nm dari panjang gelombang teoritis,, diperbolehkan. diperbolehkan Tabel 5. Hasil penelusuran panjang gelombang serapan maksimum isolat
Konsentrasi
Absorbansi
1 2 3
0,357 0,622 0,680
Panjang gelombang serapan maksimum (nm) 539 539 539
Gambar 14. Spekt pektraa penetapan panjang gelombang serapan maksimum (A) serapan 0,357 (B) serapan s 0,622 (C) serapan erapan 0,680
E. Penyarian Dengan Metode Digesti Kayu secang diekstraksi dengan menggunakan metode digesti dengan berprinsip pada perendaman bahan simplisia pada cairan penyari dan dengan pemanasan rendah yaitu pada suhu 45 – 50 OC. Digesti dilakukan 3 kali dengan cairan penyari berturut-turut berturut sebanyak sebanyak 75, 50, dan 25 ml. Dilakukan sebanyak 3 kali penyarian dengan volume cairan penyari yang menurun m dengan
43
mempertimbangkan terjadinya titik jenuh pada proses digesti. Pada penyarian pertama masih terdapat banyak komposit brazilin yang dapat diekstraksi sehingga titik jenuh pada volume yang sama lebih mudah dicapai daripada penyarian kedua dan ketiga. Pada penyarian ketiga telah banyak komposit brazilin yang terekstraksi sehingga hanya diperlukan sejumlah kecil cairan penyari untuk mengekstraksi komposit brazilin sebelum titik jenuh tercapai. Setelah proses digesti selesai, sari diserkai dan ampas diperas. Pendiaman selama 1 hari dilakukan untuk mengendapkan serbuk yang ikut saat sari diserkai dan membentuk koloid yang mengakibatkan pemisahan ekstrak dari simplisia yang ikut diserkai sulit dipisahkan dengan metode pemisahan sederhana seperti penyaringan menggunakan kertas saring. Pendiaman akan mengakibatkan pengendapan partikel simplisia sehingga dapat dipisahkan dengan mudah hanya dengan diserkai kembali dan disaring. Faktor yang dioptimasi dalam optimasi proses digesti kayu secang adalah lama digesti dan konsentrasi cairan penyari. Dipilih 3 level untuk lama digesti 90 menit untuk level rendah, 180 menit untuk level tengah dan 270 menit untuk level tinggi. Pemilihan ketiga level tersebut didasarkan pada orientasi yang dilakukan sebelum pelaksanaan penelitian, dimana pada menit ke 90 sudah terbentuk ekstrak yang pekat secara visual dan pada menit ke 270 ampas hasil proses digesti apabila diberi cairan penyari tidak menimbulkan warna merah secara visuial serta berwarna pucat menandakan komposit brazilin telah terekstraksi ke dalam cairan penyari. Level tengah merupakan waktu tengah diantara level tinggi dan level rendah, pada penelitian dipilih waktu digesti selama 180 menit.
44
Dipilih 3 level pula untuk konsentrasi cairan penyari. Konsentrasi cairan penyari yang dimaksud adalah konsentrasi aquadest dalam etanol untuk memudahkan perhitungan menggunakan desain faktorial. Pertimbangan pemilihan penyari yaitu karena brazilin memiliki kelarutan yang baik pada air dan sangat etanol (Anonim, 1976). Ekstrak kayu secang dapat dibuat dengan teknik maserasi menggunakan cairan penyari air, etanol Phaechamud
dan
Chinpaisal,
90 % dan etanol 95 % (Topasri,
2009; Kiatthaweepong,
Lawanprasert
dan
Gritsanapan, 2004; Rusmiati, 2007). Kemudian dipilih 3 level untuk mencari pengaruh konsentrasi cairan penyari terhadap AUC komposit brazilin, dengan pertimbangan hasil orientasi yang menghasilkan AUC komposit brazilin tertinggi pada penyari konsentrasi 50% dibandingkan konsentrasi 4% dan 100%, sehingga dapat dibuktikan bahwa hubungan antara konsentrasi cairan penyari dengan respon AUC komposit brazilin bersifat tidak linear. Pemilihan cairan penyari level atas yaitu konsentrasi 100 % dipilih dengan pertimbangan bahwa cairan penyari dengan ini memiliki keuntungan yaitu harga yang murah sedangkan pemilihan aquadest 4 % dalam etanol atau etanol 96 % karena pertimbangan kelarutan brazilin yang tinggi pada penyari tersebut dan dipilih level tengah yaitu konsentrasi cairan penyari 50 % dimana perbandingan penyari air dan etanol sama banyak. Dalam ekstraksi secara digesti, waktu ekstraksi menentukan banyaknya zat aktif yang dapat berdifusi keluar simplisia menuju cairan penyari. Semakin lama proses ekstraksi maka semakin banyak pula zat aktif yang dapat diekstraksi. Pada maserasi dapat terjadi titik jenuh proses difusi sehingga peningkatan lama
45
ekstraksi tidak dapat meningkatkan jumlah zat aktif yang dapat diekstraksi. Titik kejenuhan ini dapat diatasi dengan melakukan ekstraksi berulang. Tetapi apabila peningkatan waktu ekstraksi tidak menimbulkan perbedaan kadar zat aktif terekstraksi secara signifikan maka efektifitas proses ekstraksi akan menurun. Oleh sebab itu diperlukan titik optimum dalam proses digesti untuk menghasilkan ekstrak yang optimum pula. Konsentrasi cairan penyari mempengaruhi kecepatan difusi zat aktif keluar simplisia. Hal itu tergantung pula pada kemampuan cairan penyari untuk menembus ke dalam simplisia dan mengekstraksi zat aktif keluar menuju cairan penyari. Pengaruh cairan penyari juga pada kelarutan komposit brazilin. Semakin tinggi kelarutan komposit brazilin pada penyari maka semakin mudah pula komposit brazilin tersebut terekstraksi. Tabel 6. Rendemen ekstrak kayu secang secara digesti
Percobaan 00 01 02 10 11 12 20 21 22
% Rendemen Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 6,4034 5,5140 4,5782 8,2314 6,6347 6,5330 2,9220 3,7908 3,2957 5,4887 5,3164 5,5197 5,8193 7,0266 7,1184 3,1743 3,5740 3,6146 5,1437 5,6465 5,5523 6,2632 6,5430 7,1297 3,1682 3,9738 3,7044
SE
% CV
0,53 0,55 0,25 0,06 0,42 0,14 0,15 0,26 0,24
9,58 7,71 7,54 1,16 6,29 4,07 2,83 3,84 6,55
Setelah ekstrak diperoleh kemudian penyari diuapkan dengan diatas waterbath pada suhu 80 OC sampai mendapatkan ekstrak kering. Suhu pemanasan ini tidak mempengaruhi kestabilan komposit brazilin dimana brazilin dapat terdegradasi yaitu pada suhu 130 OC (Anonim, 1976). Berat ekstrak kering yang
46
diperoleh dari tiap percobaan dicatat dan dipakai sebagai perhitungan rendemen dan dapat dilihat pada tabel 6. F. Pemisahan Komposit Brazilin Ekstrak dipisahkan dengan menggunakan lempeng kromatografi lapis tipis 20 cm x 10 cm dengan fase diam selulosa setebal 0,25 mm dan fase gerak berupa kloroform, metanol, aquadest (64:50:10 v/v) serta penotolan dilakukan sebanyak 0,5 µl. Untuk keperluan analisis menggunakan densitometer sampel yang ditotolkan adalah 0,5 µl dengan diameter bercak sempit yaitu 2 mm. Penotolan sampel yang banyak secara manual dapat menurunkan reprodusibilitas hasil (Rohman, 2009). Dengan pertimbangan terjadinya hamburan sinar oleh partikel yang ada di lempeng yang menurunkan linearitas hubungan serapan dengan konsentrasi senyawa yang diteliti maka dipergunakan lempeng kromatografi dengan tebal 0,25 mm. Menurut Supardjan (1987) tebal lapisan tipis pada lempeng yang digunakan biasanya adalah 0,20 - 0,25 mm dan maksimum boleh dipergunakan 0,33 mm. Pada kromatografi bercak yang diperoleh tidak tunggal dan merupakan bercak ganda yang tidak memisah. Hal ini berkaitan dengan analit yang dianalisis yaitu komposit brazilin. Pada komposit brazilin terdapat subtipe struktural yang mirip dan sulit untuk dipisahkan secara kromatografi sederhana seperti KLT. Pada gambar pemisahan KLT dapat dilihat, bercak B dan C dapat diduga sebagai komposit brazilin karena bereaksi positif dengan terbentuknya warna merah saat disemprot dengan bufer fosfat pH 7.
47
G. Pengukuran AUC komposit brazilin dengan TLC scanner densitometric 1. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum pada TLC scanner densitometric Penentuan panjang gelombang serapan maksimum dilakukan kembali menggunakan TLC scanner densitometric untuk melihat kesesuaian dengan hasil pada pengukuran menggunakan spektroskopi visibel. Hal tersebut juga disebabkan karena analisis AUC yang dilakukan nanti menggunakan TLC scanner densitometric sehingga dengan perubahan konsentrasi analit yang kecil mengakibatkan perubahan respon AUC yang signifikan, hal ini akan meningkatkan presisi hasil analisis. Panjang gelombang serapan maksimum diperoleh dengan cara menelusuri bercak pada panjang gelombang 400 – 600 nm. Panjang gelombang serapan maksimum dicapai pada saat terjadi serapan maksimum yang ditunjukkan dengan terbentuknya puncak kurva. panjang gelombang maksimum yang diperoleh pada penelitian ini adalah 539,0 nm dari dua kali replikasi yang dilakukan dan dipakai seterusnya untuk penetapan AUC komposit brazilin.
Gambar 15. Hasil penelusuran panjang gelombang serapan maksimum menggunakan TLC scanner densitometric pada replikasi 1
48
2. Penetapan AUC komposit brazilin dengan KLT-Densitometri Pengukuran AUC brazilin melalui TLC scanner densitometric. Pada penelitian ini respon dipilih adalah respon berupa AUC karena AUC mewakili kadar komposit brazilin dalam ekstrak kayu secang. Hal ini ditegaskan pada analisis kualitatif bercak pada KLT-preparatif yang telah dilakukan dengan penelusuran panjang gelombang serapan maksimum. Sehingga semakin tinggi AUC komposit brazilin maka diasumsikan semakin tinggi pula kadar komposit brazilin yang dapat diekstraksi dari kayu secang. Dari pengukuran ekstrak kayu secang diperoleh data sebagai berikut: Tabel 7. Hasil pengukuran AUC komposit brazilin
Percobaan 00 10 20 01 11 21 02 12 22
AUC rata-rata 12803,13 13402,87 9762,67 16375,93 17237,53 10182,27 18725,13 20612,60 11475,07
SE 104,89 20,21 57,86 244,07 90,25 128,14 116,88 203,38 117,65
% CV 0,82 0,15 0,59 1,49 0,52 1,26 0,62 0,99 1,03
Pada kurva pemisahan komposit brazilin maka dapat dilihat secara umum terjadinya puncak ganda yang menyatakan pemisahan senyawa brazilin dan 3’-Ometilbrazilin seperti yang terjadi pada kurva percobaan 01 pada gambar 16. Puncak awal yang terbentuk merupakan puncak yang berasal dari senyawa brazilin seedangkan puncak kedua yang lebih kecil namun tidak terpisahkan dari puncak pertama dengan sempurna merupakan puncak senyawa 3’-O-metilbrazilin .
49
Gambar 16. Kurva hasil pengukuran AUC komposit brazilin berbagai percobaan Keterangan
Dari hasil profil kromatogram dilihat reliabilitas pemisahan dengan membandingkan nilai Rf masing-masing percobaan pada tiap replikasi. Hasil nilai Rf disajikan pada tabel 8 dan 9. Dapat dilihat bahwa pemisahan bercak B dan C yang merupakan komposit brazilin memiliki reliabilitas yang baik pada kondisi kromatografi yang dipergunakan yang dapat diketahui dari nilai CV yang kurang dari 2%. Tabel 8. Nilai Rf bercak B masing-masing percobaan tiap replikasi Rf Percobaan Replikasi Replikasi Replikasi SE CV 1 2 3 00 0,77 0,76 0,79 0,00801 1,04% 01 0,76 0,79 0,77 0,00801 1,04% 02 0,79 0,77 0,76 0,00801 1,04% 10 0,78 0,76 0,79 0,00801 1,03% 11 0,75 0,76 0,78 0,00801 1,05% 12 0,78 0,78 0,75 0,00889 1,15% 20 0,77 0,75 0,78 0,00770 1,00% 21 0,76 0,78 0,77 0,00588 0,76% 22 0,79 0,77 0,76 0,00801 1,04%
50
Tabel 9. Nilai Rf bercak C masing-masing percobaan tiap replikasi Rf SE CV Percobaan Replikasi Replikasi Replikasi 1 2 3 00 0,84 0,83 0,83 0,00385 0,46% 01 0,83 0,83 0,81 0,00667 0,81% 02 0,81 0,85 0,82 0,01018 1,23% 10 0,85 0,82 0,84 0,00801 0,96% 11 0,81 0,84 0,83 0,00801 0,97% 12 0,83 0,75 0,81 0,02255 1,83% 20 0,83 0,81 0,85 0,01155 1,39% 21 0,85 0,85 0,81 0,01111 1,33% 22 0,82 0,81 0,83 0,00385 0,47% Dari perhitungan efek lama digesti, konsentrasi cairan penyari dan interaksi antara keduanya dalam menentukan AUC komposit brazilin. Semakin besar nilai efek yang diperoleh maka faktor tersebut paling dominan dalam meningkatkan AUC komposit brazilin. Tabel 10. Hasil Perhitungan Efek
Faktor AL AQ BL ALBL AQBL BQ ALBQ AQBQ
Nilai Efek 29142031,68 20463,36 52947538,14 13290549,12 1099142,56 38836364,95 11509282,42 26961,12
Keterangan : : faktor lama digesti linear AL AQ : faktor lama digesti kuadratik BL : faktor konsentrasi penyari linear BQ : faktor konsentrasi penyari kuadratik : interaksi diantara kedua faktor ALBL hubungan linear AQBL : interaksi faktor lama digesti kuadratik dengan faktor konsentrasi penyari linear ALBQ : interaksi faktor lama digesti kuadratik dengan faktor konsentrasi penyari linear AQBQ : interaksi diantara kedua faktor hubungan linear
Dari hasil perhitungan efek maka dapat diketahui bahwa efek dominan terjadi pada faktor konsentrasi cairan penyari daripada faktor lama digesti maupun
51
interaksi diantara keduanya dilihat dari nilai efek pada tabel 10. Efek konsentrasi pada umumnya, baik efek linear maupun quadratik lebih besar daripada faktor yang lainnya. Hal ini berkaitan dengan kemampuan ekstraksi pelarut terhadap komposit brazilin untuk ditarik keluar dari simplisia dan terdistribusi ke dalam cairan penyari. Efek yang paling besar menentukan respon AUC komposit brazilin yaitu efek linear dari konsentrasi cairan penyari yang dipergunakan dalam proses digesti kayu secang. Efek tersebut menyatakan bahwa hubungan kenaikan konsentrasi cairan penyari secara linear lebih berperan dalam menentukan AUC komposit brazilin yang dihasilkan. Dari efek utama yaitu efek linear faktor konsentrasi cairan penyari dapat diketahui bahwa semakin meningkat konsentrasi cairan penyari pada umumnya akan semakin menurunkan komposit brazilin yang dapat tersari. Telah diketahui bahwa brazilin memiliki kelarutan yang sangat baik pada etanol dibandingkan dengan aquadest sehingga pada umumnya kemampuan penyarian aquadest terhadap brazilin lebih kecil daripada etanol. Akan tetapi efek lainnya juga dapat mempengaruhi respon AUC pada penentuan titik kondisi optimum. Respon AUC juga tetap dipengaruhi oleh efek hubungan kuadratik faktor konsentrasi cairan penyari meskipun besarnya efek tidak setinggi efek linear konsentrasi cairan penyari. Dengan pertimbangan efek kedua yaitu efek kuadratik faktor konsentrasi cairan penyari maka meningkatnya konsentrasi cairan penyari akan meningkatkan kandungan aquadest dalam cairan penyari. Suatu penyarian berlangsung dengan efektif salah satunya apabila kelarutan komposit brazilin baik pada pelarut
52
tersebut sehingga memudahkannya terekstraksi. Kelarutan brazilin akan lebih tinggi pada saat polaritas penyari yang semakin mirip dengan komposit brazilin sehingga terjadi efek kuadratik dari perubahan konsentrasi cairan penyari. Semakin menjauh kepolaran cairan penyari dari kepolaran komposit brazilin maka semakin kecil pula kandungan komposit brazilin yang dapat diekstraksi. Efek ketiga yaitu efek lama proses digesti yang secara umum berjalan secara linear. Dari data penelitian disimpulkan bahwa semakin meningkat lama proses digesti maka semakin tinggi pula kandungan komposit brazilin yang dapat terekstraksi ke dalam cairan penyari. Semakin lama proses digesti yang dilakukan pada semua level konsentrasi cairan penyari, respon AUC semakin meningkat, tetapi peningkatan respon AUC semakin menurun akibat pada level tengah waktu digesti telah banyak komposit brazilin telah terekstraksi ke dalam cairan penyari, sehingga dengan penambahan waktu digesti tidak banyak komposit brazilin yang dapat disari (gambar 17a). Pada semua level lama proses digesti, semakin meningkat konsentrasi cairan penyari dari 4 % menuju 50 % terjadi peningkatan respon AUC, dan pada konsentrasi 100 % terjadi penurunan respon AUC (gambar 17b). Akibat hubungan antara konsentrasi cairan penyari dan respon AUC yang tidak linear maka persamaan matematis optimasi desain faktorial menjadi berbentuk kuadratik.
53
25000.00 AUC 20000.00 15000.00
konsentrasi level tengah
10000.00
konsentrasi level rendah
5000.00
konsentrasi level tinggi
0.00
menit 90 Lama Digesti 180
270
(a) 25000.00 AUC 20000.00 15000.00
lama level rendah lama level tengah
10000.00
lama level tinggi 5000.00
konsentrasi penyari
0.00 4
24
44
64
%
84
(b) Gambar 17. (a). grafik hubungan antara lama digesti dengan AUC komposit brazilin, (b). grafik hubungan antara konsentrasi penyari dengan AUC komposit brazilin
Jika dilihat dari gambar 17 dapat disimpulkan terjadi interaksi antara lama digesti dan konsentrasi cairan penyari dalam menentukan respon AUC komposit brazilin, hal ini dapat dilihat dari tidak sejajarnya garis-garis yang terbentuk baik antara lama digesti dan konsentrasi cairan penyari ataupun antara konsentrasi cairan penyari dan lama digesti. Adanya interaksi tersebut harus dibuktikan dengan perhitungan Yate’s treatment untuk menentukan signifikansi
54
tiap efek yang timbul. Hasil perhitungan Yate’s treatment dengan taraf kepercayaan 95 % untuk respon AUC disajikan pada tabel 11. Hipotesis alternatif (H1) menyatakan adanya hubungan antara faktor dengan respon, sedangkan Ho merupakan negasi dari H1 yang menyatakan tidak adanya hubungan antara faktor dengan respon. H1 diterima dan Ho ditolak bila harga F hitung lebih besar daripada harga F Tabel yang berarti bahwa faktor berpengaruh signifikan terhadap respon. Perhitungan harga F hitung yang diperoleh dari Yate’s treatment untuk respon AUC memperlihatkan bahwa lama digesti, suhu pencampuran dan interaksi antara keduanya baik dalam efek linear maupun kuadratik, memberikan pengaruh yang bermakna secara statistik, hal ini dapat ditunjukkan oleh harga F hitung dari ketiganya lebih besar daripada F(1,18) tabel yaitu 4,41. Tabel 11. Hasil Perhitungan Yate’s treatment pada respon AUC komposit brazilin
Source of Variation
Sum Of Squares
df
AL AQ
29142031,68 20463,36
BL BQ ALBL AQBL ALBQ AQBQ
Mean square
F hitung
f tabel (1,18)
1 1
93744103,8 24951,5 405518363,2 107935,1
4,41 4,41
52947538,14 38836364,95
1 1
307282792,4 24737716,9
81788,2 6584,3
4,41 4,41
13290549,12 1099142,56 11509282,42 26961,12 67627,02
1 1 1 1 18
8759479,7 8279143,0 72963,0 46805525,0 3757,1
2331,5 2203,6 19,4 12458,0
4,41 4,41 4,41 4,41
A
B
AB
Error Total
26
55
Dilihat dari hasil perhitungan desain faktorial dan Yate’s treatmen dapat disimpulkan bahwa respon AUC dominan ditentukan oleh faktor konsentrasi cairan penyari, hal ini dapat dilihat dari nilai perhitungan efek faktor dan F hitung dari faktor konsentrasi cairan penyari yang lebih besar dibandingkan lama digesti dan interaksi antara keduanya. Hasil perhitungan Yate’s treatment menunjukkan bahwa terjadi interaksi antara lama digesti dan konsentrasi cairan penyari dalam menentukan respon AUC (F hitung interaksi lebih besar dari F tabel), sehinga dapat disimpulkan bahwa respon AUC tidak hanya dipengaruhi oleh lama digesti, tapi juga dipengaruhi oleh konsentrasi cairan penyari. Optimasi proses digesti dimaksudkan untuk memperoleh proses digesti yang optimum yang merupakan perpaduan antara lama digesti dan konsentrasi cairan penyari tertentu. Suatu proses ekstraksi secara digesti dikatakan optimum jika hasil AUC maksimum untuk waktu digesti yang minimum dan konsentrasi cairan penyari yang maksimum, diharapkan proses digesti berlangsung dengan singkat dan dengan menggunakan cairan penyari yang mengandung semakin banyak aquadest (dengan pertimbangan bahwa aquadest merupakan cairan penyari yang lebih ekonomis dibandingkan etanol) untuk dapat menghasilkan komposit brazilin yang lebih banyak pula. Dari data dapat dilihat bahwa faktor lama digesti kayu secang dan konsentrasi cairan penyari merupakan faktor yang sangat mempengaruhi AUC komposit brazilin yang dihasilkan, oleh karena itu kedua faktor tersebut harus diperhatikan dan dikendalikan dalam proses digesti kayu secang. Proses perhitungan titik optimum dilihat dari countour plot respon AUC
56
dari faktor lama digesti dan konsentrasi cairan penyari yang dipergunakan. Respon hasil pengukuran AUC komposit brazilin dapat dibuat countour plot berdasarkan pehitungan desain faktorial. Dari hasil perhitungan desain faktorial diperoleh persamaan untuk respon AUC komposit brazilin yaitu Y = 7846.92 + (46.27) X1 + (157.10) X2 + (-0.25) X1X2 + (-0.02) X12 + (-1.63)X22. Bentuk grafik kontur persamaan kuadratik yang dihasilkan dapat dilihat pada gambar 18.
Gambar 18. Grafik kontur hasil desain faktorial ekstraksi kayu secang secara digesti
Dari countour plot fungsi desirability didapat hasil bahwa titik optimum proses digesti komposit brazilin kayu secang yaitu pada konsentrasi cairan penyari 63,62 % dan digesti yang berlangsung selama 102,74 menit (dalam 3 kali digesti berulang) dilihat dari terbentuknya puncak grafik kontur (gambar 19). Prediksi AUC komposit brazilin pada kondisi ini yang diperoleh dari persamaan yaitu sebesar 14194,5.
57
Gambar 19. Grafik kontur fungsi desirability hasil desain faktorial ekstraksi kayu secang secara digesti
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan 1. Lama digesti, konsentrasi cairan penyari dan interaksinya mempengaruhi area under curve komposit brazilin secara signifikan 2. Titik optimum dalam proses digesti kayu secang secara digesti diperoleh dari persamaan Y = 7846.92 + (46.27) X1 + (157.10) X2 + (-0.25) X1X2 + (-0.02) X12 + (-1.63)X22 yaitu dengan komposisi proses digesti dengan lama digesti 102,72 menit dan konsentrasi cairan penyari 63,58 %
B. Saran Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, maka saran yang dapat diberikan adalah perlunya pembuktian lebih lanjut tentang AUC sebenarnya pada kondisi optimum yang telah didapatkan.
58
63
DAFTAR PUSTAKA Adamovic, J.A., 1997, Chromatographic Analysis Of Pharmaceutical, 2nd edition, marcel dekker, new York Anonim, 1976, The Merck Index 9th ed, 1362, Merck&Co Rahway, New York Anonim, 1977, Materia Medika Indonesia, Jilid I, 29-33, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, jakarta Anonim, 1985, Tanaman Obat Indonesia, Jilid I, 72, Departemen Kesehatan Republik Indonesi, Jakarta Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 5-25, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi IV, 9, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Cetakan I, 112, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta Armstrong, N. A., 1996, Pharmaceutical Experimental Design and interpretation, 146, Taylor&Francis ltd, Britain Balsam, M.S., Sagarin, E., 1974, Cosmetic Science and Technology, Volume III, 2nd edition, 539, A. Willey Interscience Publicaion John Wiley and sons, New York Backer, C.A., Bakhuizen Van den Brink Jr.R.C., 1968, Flora of Java (Spermatophytes Only), Volume I, 545-546, N.V.P. Noordhoff, Groningen, The Netherlands Bolton, S., 1997, Pharmaceutical Statistic Practical and Clinical Application, 3rd Ed., 84-85, 308-337, 533-545, Marcel Dekker Inc., New York Fu, L., Huang, X., Lai, Z., Hu, Y., Liu, H., dan Cai, X., 2008, A New 3Benzylchroman Derivative from Sappan Lignum (Caesalpinia sappan), Molecules 2008, 13, 1923-1930; DOI: 10.3390/molecules13081923, http://www.mdpi.org/molecules , diakses tanggal 14 Oktober 2009 Hardjono, S., 1983, Kromatografi, 32-34, Laboratorium Analisa Kimia Fisika Pusat, UGM, Yogyakarta
64
Hariyati, Sri, 2005, Standarisasi Ekstrak Tumbuhan Obat Indonesia, Salah Satu Tahapan Penting dalam Pengembangan Obat Asli Indonesia, infoPOM volume 6 No.4 juli 2005, http://perpustakaan.pom.go.id/KoleksiLainnya/InfoPOM/0405.pdf, diakses tanggal 2 Januari 2010 Hostettmann, K; Hostettmann M., dan Marston, A., 1995, Preparative Chromatography Techniques, 9-11, Terjemahan Kosasih Padmawinata, Penerbit : ITB, Bandung Heyne, K., 1987, Tumbuhan Berguna Indonesia I, cetakan ke-1, 1443-1446, Badan Penelitian dan Pengembangan Kehutanan, Departemen Kehutanan Republik Indonesia Harbelubun, A. E., Kesaulija, E.M., dan Rahawarin, Y.Y., 2005, Tumbuhan Pewarna Alami dan Pemanfaatannya secara Tradisional oleh Suku Marori Men-Gey di Taman Nasional Wasur Kabupaten Merauke, b i o d i v e r s i t a s volume 6, nomor 4 oktober 2005 halaman: 285-288, http://www.unsjournals.com/D/D0604/D0604pdf/D060414.pdf, diakses tanggal 14 Oktober 2009 Jun, H., Xiaoling, Y., Wei, W., Hao, Wu, Lei, H., Lijun, D., 2008, Antioxidant Activity In Vitro of Three Constituents from Caesalpinia sappan L, 474479, Tsinghua Science and Technology, August 2008, 13(4), http://news.tsinghua.edu.cn, diakses tanggal 4 Oktober 2009 Kiatthaweepong, S., Lawanprasert P., dan Gritsanapan W., 2004, Phytochemical Evaluation Of Herbal Colorant From Ceasalpinia sappan L., Abstracts of FAPA 20th 2004, 181, Faculty of Pharmacy, Mahidol University. Bangkok Mintarsih, E. R.R., 1990, Penetapan Kadar Alkaloid Kinina dalam Akar, Batang, dan Daun Chinchona succirubra Pavon et Klotzsch dari daerah Kaliurang Secara Spektrodensitometri (TLC Scanner), Skripsi, Fakultas Farmasi, UGM, Yogyakarta Mulja, H.M., dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, cetakan I, airlangga university press, Surabaya Oliveira L., Edwards, H., Veloso, E., dan Nesbitt, M., 2002, Vibrational Spectroscopic Study of Brazilin and Brazilein, The Main Constituent of Brazilwood from Brazil, Vibrational Spectroscopy 28 (2002), 243-249, www.elsevier/locate/vibspec , , diakses tanggal 14 Oktober 2009 Perry, L. M., 1980, Medicinl Plants of East and South Asia, 190, The MIT Press, Cambridge, Massachussets and London England
65
Putrandana, F.H., 2003, Isolasi dan Krakterisasi Brazilin dari Kayu Secang (Caesalpinia sappan L.), Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta Rohman, A., 2009, Kromatografi Untuk Analisis Obat, 48-54, Graha Ilmu, Yogyakarta Rudjiman, 1995, Seluk Beluk Caesalpinia sappan L., Makalah Seminar Nasional, Kelompok kerja Nasional Tumbuhan Obat Indonesia IX, Yogyakarta 2122 September 1995 Rusmiati, 2007, Pengaruh Ekstrak Kayu Secang (Caesalpinia Sappan L) terhadap Viabilitas Spermatozoa Mencit Jantan (Mus musculus L), BIOSCIENTIAE Volume 4, Nomor 2, Juli 2007, halaman 63-70 http://bioscientiae.unlam.ac.id , , diakses tanggal 14 Oktober 2009 Sherma, J. and Fried, B.,2003, Handbook of Thin layer Chromatography, Edisi 3, 146-148, Marcell Dekker, Inc., New York Sidik dan Hafia Mudahar, 2000, Ekstraksi Tumbuhan Obat, Metode dan FactorFaktor Yang Mempengaruhi Produksi, dalam seminar PERHIBA pemenfaatan bahan obat alam III, fakultas farmasi Universitas 17 agustus 1945, Jakarta Stahl, E., 1985, Drug Analysis by Chromatography and Microscopy : A Practical Supplement to Pharmacopoias, 1-8, terjemahan Kosasih Padmawinata, Iwang Soediro, Penerbit ITB Bandung Sugati, S.S., dan Hutapea, J.R., 1991, Inventaris Tanaman Obat Indonesia, 98-99. Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta Supardjan, A.M., 1987, Pemisahan Tetrasiklin Dan Hasil Uraiannya Dalam Sediaan Tetrasiklin Secara KLT-Densitometri, lembaga penelitian, UGM, Yogyakarta Trijotosoepomo, G., 1994, Taksinomi Tumbuhan Obat-obatan, Edisi I, Gadjah Mda University Press, Yogyakarta Voigt, Rudolf, 1994, Buku Pelajaran Teknologi Farmasi, Edisi 5, --, Universitas Gadjah Mada Press, Yogyakarta Wallis, T. E., 1955, Textbook of Pharmacognosy, IIIrd edition, 65, Little Brown and company, Boston
66
Wetwitayaklung, P., Phaechamud, T., dan Keokitichai, S., 2005, The Antioxidant Activity of Caesalpinia sappan L. Heartwood in Various Ages, Naresuan University Journal 2005; 13(2): 43-52, http://office.nu.ac.th/nu_journal/pdf/journal/13(2)43-52.pdf, diakses tanggal 14 Oktober 2009
67
68
Lampiran 1. Hasil foto identifikasi kimia Hasil Identifikasi 1
Dalam metanol P
2
Kalium hidroksida P 5% b/v
3
Natrium hidroksida P 5% b/v
4
Timbal(II)asetat P 5% b/v
5
Besi(III)klorida P 5% b/v
69
Lampiran 2. Foto alat ekstraksi secara digesti (a) dan foto hasil ekstrak kering (b)
(a)
(b)
70
Lampiran 3. Foto KLT isolasi komposit brazilin Sebelum disemprot bufer fosfat secara visual pada replikasi 1 (a), replikasi 2 (b), dan replikasi 3 (c) (a)
(b)
(c)
Sebelum disemprot bufer fosfat pengamatan UV 365 nm pada replikasi 1 (a), replikasi 2 (b), dan replikasi 3 (c) (a)
(b)
(c)
71
Setelah disemprot buffer fosfat pada replikasi 1 (a), replikasi 2 (b), dan replikasi 3 (c) (a)
(b)
(c)
72
Lampiran 4. Kurva Area Under Curve ekstraksi secara digesti berdasarkan desain faktorial Replikasi I
(a)
(b)
(c)
Kurva hasil pengukuran AUC komposit brazilin dengan lama digesti 90 menit dan konsentrasi penyari 4 % (a), 50 % (b) dan 100 % (c)
(a)
(b)
(c)
Kurva hasil pengukuran AUC komposit brazilin dengan lama digesti 180 menit dan konsentrasi penyari 4 % (a), 50 % (b) dan 100 % (c)
(a)
(b)
(c)
Kurva hasil pengukuran AUC komposit brazilin dengan lama digesti 270 menit dan konsentrasi penyari 4 % (a), 50 % (b) dan 100 % (c)
73
Replikasi II
(a)
(b)
(c)
Kurva hasil pengukuran AUC komposit brazilin dengan lama digesti 90 menit dan konsentrasi penyari 4 % (a), 50 % (b) dan 100 % (c)
(b)
(b)
(c)
Kurva hasil pengukuran AUC komposit brazilin dengan lama digesti 180 menit dan konsentrasi penyari 4 % (a), 50 % (b) dan 100 % (c)
\
(b)
(b)
(c)
Kurva hasil pengukuran AUC komposit brazilin dengan lama digesti 270 menit dan konsentrasi penyari 4 % (a), 50 % (b) dan 100 % (c)
74
Replikasi II
(a)
(b)
(c)
Kurva hasil pengukuran AUC komposit brazilin dengan lama digesti 90 menit dan konsentrasi penyari 4 % (a), 50 % (b) dan 100 % (c)
(c)
(b)
(c)
Kurva hasil pengukuran AUC komposit brazilin dengan lama digesti 180 menit dan konsentrasi penyari 4 % (a), 50 % (b) dan 100 % (c)
\
(c)
(b)
(c)
Kurva hasil pengukuran AUC komposit brazilin dengan lama digesti 270 menit dan konsentrasi penyari 4 % (a), 50 % (b) dan 100 % (c)
75
Lampiran 5. Data rendemen hasil penyarian secara digesti Percobaan 00 01 02 10 11 12 20 21 22
Percobaan 00 01 02 10 11 12 20 21 22
Percobaan 00 01 02 10 11 12 20 21 22
Berat serbuk (mg) 5036,4 5013,7 5000,0 5013,9 5022,9 5012,1 5025,6 5005,4 5021,7
Replikasi 1 Berat ekstrak Rendemen (mg) (%) 322,5 6,40 412,7 8,23 146,1 2,92 275,2 5,49 292,3 5,82 159,1 3,17 258,5 5,14 313,5 6,26 159,1 3,17
Berat serbuk (mg) 5001,8 5004,0 5017,4 5003,4 5013,8 5008,4 5008,4 4999,2 5010,3
Replikasi 2 Berat ekstrak Rendemen (mg) (%) 275,8 5,51 332,0 6,63 190,2 3,79 266,0 5,32 352,3 7,03 179,0 3,57 282,8 5,65 327,1 6,54 199,1 3,97
Berat serbuk (g) 5004,2 5006,9 5009,6 5009,3 5001,1 5024,1 5008,7 5003,0 5007,6
Replikasi 3 Berat ekstrak Rendemen (g) (%) 229,1 4,58 327,1 6,53 165,1 3,30 276,5 5,52 356,0 7,12 181,6 3,61 278,1 5,55 356,7 7,13 185,5 3,70
76
Lampiran 6. Contoh cara perhitungan rendemen Untuk menghitung % rendemen digunakan rumus sebagai berikut : berat ekstrak kering x 100 % berat serbuk Contoh perhitungan menggunakan percobaan 00 Replikasi 1 % Rendemen = berat rendemen X 100% berat serbuk = 322,5 X 100% =
5036,4 6,40%
Replikasi 2 % Rendemen = 275,8 =
Replikasi 3 % Rendemen = 229,1 =
X 100%
5001,8 5,51%
5004,2 5,50%
X 100%
77
Lampiran 7. Contoh cara menghitung standard error dan coeffitient of variance Untuk menghitung Standard Error dan Coeffitient of Variance digunakan rumus sebagai berikut :
SE =
CV =
SD N SE x100 % x
Keterangan : SE : Standard Error
CV : Coeffitient of Variance
SD : standard deviation
x
: rata-rata rendemen
N : jumlah replikasi
Misalnya hendak menghitung SE untuk percobaan 00 replikasi 1, maka perhitungannya adalah sebagai berikut : SE =
CV =
0,9127 3
= 0.52694
0.52694 x100% = 9.58331 % 5.50
78
Lampiran 8. Contoh cara menghitung persamaan desain faktorial Faktor
Lama (X1)
Percobaan 00 10 20 01 11 21 02 12 22
90 180 270 90 180 270 90 180 270
digesti Konsentrasi AUC Rata-rata cairan (Y) penyari (X2) 4 12803,1 4 16375,9 4 18725,1 50 13402,9 50 17237,5 50 20612,6 100 9762,7 100 10182,3 100 11475,1
Persamaan umum Y = bo + b1X1 + b2X2 + b11X12 + b22X22 + b12X1X2 Percobaan 00 12803,1 = bo + b1(4) + b2(90)+ b11(16) + b22(8100) + b12(360) Percobaan 01 13402,9= bo + b1(4 )+ b2(180)+ b11(16) + b22(32400)+ b12(720) Percobaan 02 9762,7 = bo + b1(4) + b2(270)+ b11(16)+ b22(72900) + b12(1080) Percobaan 10 16375,9 = bo + b1(50) + b2(90) + b11(2500) + b22(8100) + b12(4500) Percobaan 11 17237,5= bo + b1(50) + b2(180) + b11(2500) + b22(32400) + b12(150) Percobaan 12 10182,3= bo + b1(50) + b2(270) + b11(2500) + b22(72900) + b12(250) Percobaan 20 18725,1= bo + b1(100) + b2(90) + b11(10.000) + b22(8100) + b12(100) Percobaan 21 20612,6 = bo + b1(100) + b2(180) + b11(10.000) + b22(32400) + b12(300) Percobaan 22 11475,1 = bo + b1(100) + b2(270) + b11(10.000) + b22(72900) + b12(27000)
79
Melalui metode substitusi eliminasi didapat koefisien sebagai berikut : bo : 7846,92 b11 : - 0,02 b22 : - 1,63 b1 : 46,27 b2 : 157,10 b12 : - 0.25 maka didapat persamaan sebagai berikut : Y = 7846,92+ 46,27X1 + 157,10X2 - 0.25X1X2 – 0,02 X12 – 1,63 X22
80
Lampiran 9. Contoh cara menghitung nilai efek menggunakan yate’s treatment Percobaan 00 10 20 01 11 21 02 12 22
R1 12968.9 16109.8 18492.6 13443.2 17404.4 20978.0 9737.1 9949.9 11401.1
R2 12831.6 16863.4 18820.7 13384.9 17094.5 20275.1 9677.7 10392.1 11318.6
R3 12608.9 16154.6 18862.1 13380.5 17213.7 20584.7 9873.2 10204.8 11705.5
00 10 20 01 11
Total kolom 1 kolom 2 AUC 38409.40 94584.80 158298.00 49127.80 102046.40 22903.20 56175.40 63713.20 -1051.20 40208.60 17766.00 -30871.60 51712.60 21629.20 -12628.80
21 02 12 22
61837.80 29288.00 30546.80 34425.20
5137.20 -3670.80 -1378.80 2619.60
6290.40 -45794.80 -20355.20 1706.40
Total 38409.40 49127.80 56175.40 40208.60 51712.60 61837.80 29288.00 30546.80 34425.20
AL AQ BL ALBL
mean divisor 18 54 18 12
29142031.68 20463.36 52947538.14 13290549.12
AQBL BQ ALBQ AQBQ
36 54 36 108
1099142.56 38836364.95 11509282.42 26961.12
efek
Square
Kolom 1 dihitung dengan cara sebagai berikut : Baris 1 merupakan jumlah dari total AUC pada percobaan 00, 10, dan 20 Baris 2 merupakan jumlah dari total AUC pada percobaan 01, 11, dan 21 Baris 3 merupakan jumlah dari total AUC pada percobaan 02, 12, dan 22 Baris 4 merupakan selisih dari total AUC pada percobaan 20 dan 00 Baris 5 merupakan selisih dari total AUC pada percobaan 21 dan 01 Baris 6 merupakan selisih dari total AUC pada percobaan 22 dan 02 Baris 7 merupakan jumlah dari total AUC pada percobaan 20 dan 00 dikurangi dua kali total AUC pada percobaan 10 Contohnya : 56175,40+ 38409,40- (2 x 49127,80) = -3670,80
81
Baris 8 merupakan jumlah dari total AUC pada percobaan 21 dan 01 dikurangi dua kali total AUC pada percobaan 11 Baris 9 merupakan jumlah dari total AUC pada percobaan 22 dan 02 dikurangi dua kali total AUC pada percobaan 12
Kolom 2 diturunkan dari kolom 1 dengan cara yang sama Mean divisor dihitung dengan rumus: 2r3tn Dimana r adalah jumlah faktor dalam percobaan, t adalah jumlah faktor dalam percobaan dikurangi jumlah sifat linear dalam percobaan, dan n adalah jumlah replikasi Contohnya : AQBL r = 2, t = 2-1 = 1, n = 3, maka mean divisor = 2231.3 =36
Square dihitung dengan cara : nilai kolom 2 dikuadratkan kemudian dibagi mean divisor Contohnya : AQBL nilai kolom 2 = -17264,1, mean divisor = 2231.3 =36 maka Square = (-6290,40)2 : 36 = 1099142,56
82
Lampiran 10. Cara menghitung signifikansi dengan yate’s treatment
Sum of squares
Degree of freedom
AL AQ
93744103,8 405518363,2
1 1
93744103,8 24951,47 405518363,2 107935,1
BL BQ
307282792,4 24737716,87
1 1
307282792,4 81788,17 24737716,87 6584,334
ALBL AQBL ALBQ AQBQ
8759479,688 8279143,022 72963,01361 46805525,02 67627,02444
1 1 1 1 18 26
8759479,688 8279143,022 72963,01361 46805525,02 3757,056914
Source of variation A
Mean square
F hitung
B
AB
Error Total
2331,474 2203,625 19,42026 12458,03
Sum of squares = square pada perhitungan nilai efek Mean squares = Sum of squares dibagi df F hitung = Mean squares dibagi experimental error mean square experimental error mean square = experimental error Sum of squares : df experimental error df experimental error = total percobaan – 1 - 8 = 18 experimental error Sum of squares = total sum of squares – replicate sum of square – treatment sum of square
83
Lampiran 11. Cara menghitung titik optimum menggunakan fungsi desirability Titik optimum didapat dari plot fungsi desirability dengan lama digesti dan konsentrasi cairan pennyari. Rumus umum desirability:
Dimana
d1 : nilai desirability untuk faktor lama digesti d2 : nilai desirability untuk faktor konsentrasi cairan penyari d3: nilai desirability untuk
Cara perhitungan desireability dengan penentuan di dimana nilai di yaitu 1. Pada faktor konsentrasi cairan penyari dan AUC komposit brazilin di = 0 jika respon berada pada batas paling rendah 0 < di < 1 jika respon range rendah sampai tinggi di = 1 jika respon berada pada batas nilai tertinggi 2. Pada faktor lama proses digesti di = 0 jika respon berada pada batas nilai tertinggi 0 < di < 1 jika respon range rendah sampai tinggi di = 1 jika respon berada pada batas paling rendah Contoh perhitungan pada kondisi lama digesti 180 menit, konsentrasi cairan penyari 50 % dengan AUC 17237,53. d1 =
batas atas – x batas atas – batas bawah
d1 =
270 – 180 270 - 90
84
= 0,5000 d2 =
x – batas bawah batas atas – batas bawah
=
50 - 4 100 - 4
= 0,4792 d3 =
x – batas bawah batas atas – batas bawah
=
17237,53 – 9677,7 20978 - 9677,7
= 0,6690
0,5432 Keterangan 1. Batas bawah lama proses digesti yaitu 90 menit dan dengan batas atas yaitu 270 menit 2. Batas bawah konsentrasi cairan penyari yaitu 4 % dan dengan batas atas yaitu 100 % 3. Batas bawah AUC komposit brazilin yaitu 9677,7 dan dengan batas atas yaitu 20978
BIOGRAFI PENULIS
Penulis lahir pada tanggal 25 Mei1988 di Tabanan, Bali. Lahir dari Ayah bernama I Gusti Arya Astina dan Ibu bernama Luh Putu Mariani, memiliki satu saudara laki-laki dan satu saudara perempuan. Penulis telah menyelesaikan masa studinya di TK Rare Suci pada tahun pada tahun 1993 sampai tahun 1994, SD N 4 Denbantas pada tahun 1994 sampai pada tahun 2000, SLTP N 1 Tabanan pada tahun 2000 sampai dengan tahun 2003, kemudian penulis melanjutkan sekolah di SMU N 1 Tabanan pada tahun 2003 sampai pada tahun 2006 dan kuliah di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta mulai tahun 2006 sampai tahun 2010. Mempunyai pengalaman sebagai asisten praktikum Botani Dasar (2007), asisten praktikum Formulasi Teknologi Sediaan Solid (2008) dan asisten praktikum Analisi Makanan (2009). Selain itu penulis juga aktif dalam kegiatan kemahasiswaan di Universitas Sanata Dharma antara lain sebagai pengurus komunitas kerohanian KMHD (2007-2009) dan ikut aktif dalam kegiatankegiatannya baik di dalam maupun diluar lingkungan universitas.
