ISOLASI SENYAWA AKTIF DARI KAYU SECANG (Caesalpinia sappan L.) DAN PENGUJIANNYA TERHADAP PROLIFERASI SEL OSTEOBLAS Mukhriani1, Subehan2, Yusnita Rifai2 1
Jurusan Farmasi FIK UIN Alauddin Makassar Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin Email :
[email protected] 2
ABSTRAK Pengobatan tradisional mayoritas menggunakan obat herbal untuk mendukung kesehatan , salah satu tumbuhan yang digunakan sebagai obat tradisional adalah kayu secang. Penelitian ini
bertujuan untuk mengisolasi senyawa aktif dari kayu secang
(Caesalpinia sappan L) dan menentukan karakter senyawa aktif kayu secang berdasarkan data IR. Penelitian ini berdasarkan bioassay guided isolation pada setiap tahap pengerjaan. Karakterisasi senyawa akitif berdasarkan Kromatografi lapis tipis dengan berbagai penampak bercak dan data IR. Data karakteristik isolat aktif menggunakan analisis kualitatif deskriptif . Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi dan isolat kayu secang memiliki aktivitas terhadap proliferasi sel osteoblas. Ekstrak kayu secang difraksinasi dengan metode sepacore flash cromatography . Pada proses fraksinasi ini, eluen yang digunakan adalah n-heksan dan etil asetat. Hasil fraksinasi ekstrak etanol 70% berupa 6 fraksi gabungan yaitu fraksi 1-6. Berdasarkan profil kromatogram fraksi 4 merupakan fraksi yang menghasilkan nilai proliferasi osteoblas tertinggi dengan nilai viabilitas mencapai 200,00%. Disimpulkan bahwafraksi 4 dan isolat memiliki senyawa yang dapat meningkatkan proliferasi sel osteoblas, Isolat tersebut menunjukkan adanya gugus OH, CH alifatik, C-C siklik dan C=C aromatik berdasarkan data IR. Kata kunci : Isolasi, kromatografi lapis tipis, Caesalpinia sappan L PENDAHULUAN Indonesia merupakan salah satu
300 tanaman yang digunakan sebagai
negara dengan kekayaan hayati terbesar
bahan baku industri farmasi secara reguler.
yang memiliki lebih dari 30.000 spesies
WHO pada tahun 2008 mencatat bahwa
tanaman tingkat tinggi. Hingga saat ini
68%
tercatat 7000 spesies tanaman
menggantungkan
telah
diketahui khasiatnya namun kurang dari
penduduk
tradisional
yang
dunia
masih
sistem
pengobatan
mayoritas
melibatkan
in
dilakukan
dan lebih dari 80% penduduk dunia
menggunakan sel osteoblas mencit (Mus
menggunakan
untuk
musculus ) yang berusia tiga sampai tujuh
mendukung kesehatan mereka (Saifuddin,
hari dimana tingkat proliferasi sel osteoblas
dkk., 2011).
ditentukan
Salah
obat
satu
herbal
tumbuhan
secara
vitro
tumbuhan untuk menyembuhkan penyakit
dengan
dengan
pengukuran
Elisa
yang
reader. Dari hasil penelitian ini diharapkan
digunakan sebagai obat tradisional adalah
dapat menjadi sumber acuan pengobatan
kayu secang (Caesalpinia sappan L.).
tradisional
Tumbuhan ini juga digunakan sebagai obat
antiosteoporosis.
khususnya
sebagai
tradisional untuk pengobatan berbagai penyakit seperti diare, batuk berdarah,
METODE PENELITIAN
pembengkakan
Lokasi dan Rancangan Penelitian
pada
bagian
tubuh
tertentu. Penelitian tentang kandungan kimia
terhadap
tumbuhan
ini
dilakukan dan menunjukkan flavanoid
Penelitian
ini
dilaksanakn
di
telah
Laboratorium Biofarmaka Pusat Kegiatan
senyawa
Penelitian Universitas Hasanuddin.Desain
( Nguyen,dkk, 2005) adalah
senyawa yang paling banyak dikandung.
penelitian ini adalah studi eksperimental. Pengambilan dan Penyiapan Sampel
Tanaman ini juga memiliki aktifitas sebagai
Sampel penelitian yang digunakan
antibakteri dan anti rematik dengan hasil
adalah kayu secang (Caesalpinia sappan
yang sangat bagus (Shu, dkk., 2008)
L.) diperoleh dari Desa Talepu, Kecamatan
Penelitian
sebelumnya
dilakukan standarisasi
telah
Lilirilau,
Kabupaten
Soppeng.
Sampel
dan didapatkan
dibersihkan terlebih dahulu dengan cara
ektsrak etanol yang menunjukkan hasil
mengupas korteks dan memotong menjadi
yang paling kuat dalam memproliferasi sel
bagian
osteoblas
(Caesalpinia
(Subehan,dkk,2012).
yang
kecil. sappan
Kayu L.)
secang ditimbang
Berdasarkan uraian diatas, maka dilakukan
sebanyak 180 gram dan diekstraksi secara
penelitian isolasi senyawa aktif untuk
sonikasi
menggunakan
menentukan senyawa yang berkhasiat
etanol.
Ekstrak etanol yang diperoleh
menstimulasi proliferasi osteoblas dari
kemudian
kayu secang (Caesalpinia sappan L.).
dengan
Penelitian ini bertujuan mengisolasi
cairan
dikumpulkan,
penyari
dipekatkan
menggunakan
rotavapor
kemudian diliofilisasi sampai
diperoleh
senyawa aktif dari kayu secang dan
ekstrak etanol kental.
menentukan karakter senyawa aktif yang
Fraksinasi Komponen Kimia dengan
berkhasiat
Flash Chromatography
sebagai
stimulan
pada
proliferasi sel osteoblas. Penelitian ini
Sebelum
menjalankan
proses
cara
disaring.
Isolat
pembasahan dan separasi terlebih, metode
kemudian
yang
menggunakan FT-IR .
akan
digunakan
diatur
terlebih
dahulu. Metode mencakup Flowrate, tipe rak
penampung,
diperoleh
dikarakterisasi
dengan
Uji Aktivitas Proliferasi
tabung
Hewan uji yang digunakan yakni
penampung, jenis kolom, tekanan, jenis
mencit (Mus musculus) yang berusia tujuh
dan gradien pelarut, serta waktu yang akan
hari, bagian yang akan digunakan yaitu sel
digunakan dalam proses pambasahan dan
osteoblas yang terdapat dalam tulang
separasi.
parietal dengan cara kultur sel. Sel
Ekstrak etanol kayu secang difraksinasi
osteoblas dilepas dari botol kultur setelah
menggunakan sepacore dengan campuran
kofluen. Sel dilepas dengan trypsin 0,5%
eluen n-heksan : etil asetat dengan gradien
30 detik. Trypsin dinonaktifkan dengan
yang meningkat selama 55 menit. Tiap 2
penambahan larutan medium mengandung
gram
FBS 10%. Suspensi sel disentrifus dan
dilarutkan
volume
yang
dengan
metanol,
dicampurkan dengan silika, dan diuapkan.
endapan
Campuran tersebut dimasukkan ke dalam
dengan
cartridge yang diisi dengan heksan. Fraksi-
10%.Suspensi sel osteoblas dimasukkan
fraksi
tabung
masing-masing 200 µL kedalam sumuran
digabung berdasarkan peak yang tampak
mikroplate 96, kecuali untuk kontrol sel dan
pada detektor. Diperoleh 6 fraksi gabungan
kontrol medium. Setelah itu sel diinkubasi
(Fraksi 1-6) selanjutnya dilakukan KLT
dalam inkubator CO2 selama 24 jam.
dengan eluen n-heksan : etil asetat (1:9)
Medium α-MEM yang mengandung 10%
dan diuji aktivitas proliferasinya terhadap
FBS dikeluarkan diganti dengan α-MEM
osteoblast.
yang tidak mengandung FBS sebanyak
Isolasi dan Pemurnian Senyawa Aktif
200 µL ke dalam tiap sumuran mikroplate
yang
terkumpul
pada
sel
disuspensikan
medium
kembali
mengandung
FBS
Fraksi 4.2.2 dari sepacore yang
96. Sel diinkubasi dalam inkubator CO2
memiliki aktifitas tinggi terhadap osteoblast
selama 24 jam. Data dikumpulkan dari hasil
dilarutkan
pengukuran absorbansi
ditotolkan
dengan secara
etanol. berderet
Sampel
pada
panjang
sehingga
gelombang 630 nm dengan menggunakan
membentuk seperti pita dengan pipa
Elisa reader. Data yang diperoleh dianalisis
kapiler pada lempeng kaca KLTP RP18
dan
dan dielusi dengan metanol:air(4 : 6).
masing-masing perlakuan.
Setelah terelusi, lempeng dilihat pada UV
Analisis Data
ditentukan
presentasi
proliferasi
254 nm dan 366 nm. Senyawa yang
Data karakteristik senyawa isolat
diperoleh dipisahkan dari silika gel dengan
aktif ekstrakCaeselpinia sappan meliputi
gugus
fungsi
berdasarkan
bilangan
gram, F4.4 dan F4.5 masing masing 0,16
gelombang hasil uji spektrofotometer infra
gram dan 1,09 gram.
red (IR) menggunakan analisis kualitatif
Tabel
3
memperlihatkan
deskriptif, dan data aktivitas proliferasi
Refraksinasi II (fraksi 4.2) difraksinasi
isolat
kembali dan diperoleh 6 fraksi (F4.2.1 –
murni
dianalisis
menggunakanmetode kuantitatif-deskriptif
F4.2.6)
dengan
bobot fraksi masing-
dengan mengukur presentasi proliferasi
masing 0,003 gram, 0,19 gram, 0,12 gram,
masing-masing perlakuan.
0,11 gram, 0,10 gram dan 0,11 gram. Hasil pengujian aktivitas proliferasi sel
HASIL PENELITIAN
Tabel 4 memperlihatkan bahwa
Hasil ekstraksi sampel
fraksi 4 merupakan fraksi yang memiliki
Penelitian ini menggunakan kayu secang
dengan
metode
nilai viabilitas tertinggi terhadap proliferasi
maserasi
sel osteoblast yaitu mencapai 200%.
menggunakan pelarut etanol 70%. Dari
Sedangkan isolatnya memiliki aktifitas
penelitian hasil ekstraksi dari 2000 gram
terhadap
kayu secang dengan pelarut etanol 70%
menunjukkan
diperoleh ekstrak 148,09 gram.
47,22%.
Hasil Fraksinasi dengan sepacore
Hasil karakterisasi isolat aktif
Tabel 1 memperlihatkan fraksinasi dengan
menggunakan
sel
Tabel
osteoblas
viabilitas
5
sel
dengan mencapai
memperlihatkan
hasil
sepacore®
karakterisasi IR terhadap isolat yang
menghasilkan 6 fraksi yaitu fraksi 1 bobot
diperoleh dari fraksi menunjukkan adanya
fraksi 2,09 gram, fraksi 2 bobot fraksi 4,84
gugus OH, CH alifatik, C-C siklik dan C=C
gram, fraksi 3 bobot fraksi 9,19 gram, fraksi
aromatik.
4 dengan bobot fraksi 14,80 gram, fraksi 5
PEMBAHASAN
dengan bobot fraksi 1,40 gram dan fraksi 6 dengan bobot fraksi 3,82 gram. Tabel
2
memperlihatkan
Refraksinasi I (fraksi 4) yang diperoleh difraksinasi kembali dan diperoleh fraksi berdasarkan puncak-puncak yang muncul dari profil kromatogram dengan bobot fraksi sebagai berikut : F4.1 dengan bobot fraksi 1,68 gram, F4.2 dengan bobot fraksi 1,06 gram, F4.3 dengan bobot fraksi 1,02
Penelitian ini menunjukkan kerja dari senyawa aktif kayu secang dalam menstimulasi proliferasi osteoblas sel. Pada penelitian sebelumnya, dilakukan ekstraksi kayu secang dengan variasi konsentrasi dan pelarut. Penelitian tersebut menyimpulkan bahwa ekstrak etanol 70% memiliki aktivitas proliferasi yang paling bagus
dengan
konsentrasi
0,01%
(Subehan dkk, 2012). Pada penelitian ini tidak dilakukan variasi konsentrasi karena
pada konsentrasi yang sama, setiap fraksi
osteoporosis akan terjadi abnormalitas
mempunyai kekuatan yang sama, yang
bone turnover yaitu proses penyerapan
berbeda
tulang lebih banyak dari pada proses
adalah
aktivitasnya
terhadap
proliferasi sel osteoblas dan aktivitas
pembentukan
tulang.
(Manolagos
tersebut dapat diukur.
SC.,1995). Dalam penelitian ini digunakan
Aktivitas terhadap proliferasi sel
sel osteoblas sebagai sel uji karena sel
osteoblas digunakan sebagai bioassay
tersebut bertanggung jawab untuk sintesis
guided
dan deposisi matriks tulang dalam proses
isolation
untuk
memperoleh
senyawa aktif yang berpotensi sebagai
remodeling
antiosteoporosis. Setiap tahap pemisahan
Kontrol positif natrium florida dan kalsitonin
senyawa dimonitor menggunakan KLT dan
berfungsi untuk membandingkan aktivitas
aktivitas proliferasi sel osteoblas diamati
proliferasi oleh golongan obat standar.
hingga didapatkan isolat aktif. Isolasi
tulang
( U Kini dkk, 2012).
Kayu secang segar terlebih dahulu
senyawa aktif dilakukan menggunakan
diangin-anginkan
kromatografi flash sepacore dilanjutkan
berkurang dengan tujuan menghentikan
dengan kromatografi lapis tipis preparatif.
proses enzimatis yang dapat merusak zat
Karakterisasi senyawa antiosteoporosis
aktif.
ditentukan berdasarkan sifat fisikokimia
pertumbuhan
dan data spektroskopi isolat aktif.
simplisia.
Pengujian
skrining
aktivitas
Selain
hingga
itu
untuk
dengan
yang
air
mencegah
mikroorganisme
Sampel
diekstraksi
kadar
pada
telah
metode
kering
maserasi
antisteoporosis dilakukan secara in vitro,
menggunakan
yaitu pengujian zat uji terhadap proliferasi
(proses
sel osteoblas. Efek proliferasi dinyatakan
Metode ini cocok untuk senyawa yang tidak
berdasarkan nilai persen viabiitas sel
stabil terhadap pemanasan karena dengan
osteoblas.
pemanasan diperkirakan dapat merusak
Persen
viabilitas
diperoleh
gelombang
ekstraksi
dengan menghitung aktivitas metaboliknya
senyawa
kimia
melalui
sampel.
Metode
inkubasi
sel
dengan
garam
tanpa
yang
ultrasonik pemanasan).
terdapat
ekstraksi
dalam dengan
tetrazolium MTT. Sel yang bertanggung
menggunakan gelombang ultrasonik lebih
jawab untuk pembentukan tulang disebut
dikenal dengan ekstraksi dengan sonikasi.
osteoblas
Metode
sedangkan
bertanggung jawab
osteoklas
memanfaatkan
gelombang
penyerapan
ultrasonik yang dapat mempercepat waktu
tulang(Jilka nL.,2001). Pembentukan dan
kontak antara sampel dan pelarut sehingga
penyerapan
tulang
berada
dalam
menyebabkan perpindahan zat aktif yang
pada
individu
berusia
ada dalam sel tanaman ke pelarut menjadi
Pada
proses
lebih
keseimbangan sekitar
untuk
ini
30-40
thn.
cepat.
Ultrasonikasi
ini
bekerja
dengan memberikan tekanan mekanik
silika, kemudian diuapkan. Fraksi-fraksi
pada sel sehingga menghasilkan rongga
yang terkumpul pada tabung digabung
pada
dapat
berdasarkan peak yang tampak pada
mempercepat proses ekstraksi. Pelarut
detektor. Diperoleh 6 fraksi gabungan
yang digunakan adalah etanol 70%.
(fraksi 4.2.1-4.2.6). Berdasarkan profil KLT,
sampel.
Kerusakan
sel
Hasil pemisahan dari ekstrak etanol
fraksi
4.2.2
merupakan
fraksi
yang
berupa 6 fraksi gabungan, yaitu fraksi 4-6.
berpotensi untuk di lakukan KLTP. KLTP
Masing-masing fraksi diuji terhadap sel
dilakukan dengan
osteoblast
dengan
kontrol
dan
positif
dibandingkan ekstrak
metanol:air
(4:6)
sehingga
awal.
diperoleh beberapa pita yang tampak
Berdasarkan pengujian tersebut, fraksi 4
kemudian dikeruk dengan spatula dan
merupakan fraksi yang menghasilkan nilai
dikumpulkan.
proliferasi
dan
dengan
RP18 dan dielusi
osteoblast
tertinggi.
Nilai
Uji
potensi
aktivitas
viabilitasnya mencapai 200,00%. Nilai ini
antiosteoporosis dilakukan terhadap salah
lebih tinggi dari kontrol positif natrium
satu isolat yang diperoleh. Isolat tersebut
florida
dipilih berdasarkan profil KLT. Isolat yang
dan
mempunyai
klasitonin viabilitas
yang
hanya
100,00%
dan
dipilih
adalah
isolat
yang
memiiki
91,67%. Hal ini mengindikasikan bahwa
konsentrasi tertinggi dalam fraksi. Isolat
fraksi
yang
tersebut dikarakterisasi dengan FT-IR.
meningkatkan
Identifikasi dengan FT-IR menunjukkan
4
memiliki
kemungkinan
senyawa
dapat
proliferasi osteoblas. Fraksi
bahwa 4
direfraksinasi
adanya
gelombang
pita
serapan
pada
3682,96 yang merupakan
menggunakan sepacore dengan campuran
gugus O-H yang biasanya muncul pada
eluen air:metanol (6:4). Tiap 1 gram
bilangan gelombang 3600-3300 cm-1. Pita
dilarutkan dengan eluen, dicampurkan
serapan pada gelombang 2920,34 cm-1
dengan silika RP18, dan diuapkan. Fraksi-
menunjukkan gugus C-H alifatik. Gugus C-
fraksi
tabung
C siklik ditunjukkan oleh adanya serapan
digabung berdasarkan peak yang tampak
dengan intensitas yang lemah pada daerah
pada detektor. Diperoleh 5 fraksi gabungan
1500,25 cm-1 dan 1451,18 cm-1. Alkena
(fraksi 4.1-4.5) selanjutnya dilakukan KLT
biasanya
dengan
(3:7).
gelombang 1600 cm-1. Salah satu spektra
4.2
isolat tersebut menunjukkan 1615,25 cm-1.
merupakan fraksi yang berpotensi untuk
Karakterisasi isolat KS1, berdasarkan klt
direfraksinasi. Tiap 1 gram dilarutkan
dengan berbagai reagen penampak bercak
dengan etil asetat dan dicampur dengan
menunjukkan bahwa isolat KS1 merupakan
yang
terkumpul
heksan:etil
Berdasarkan
profil
pada
asetat KLT,
Fraksi
terabsorbsi
pada
bilangan
Isolat yang diperoleh
Jilka RL. Juni. ( 2002). Cell biology of
diuji aktivitasnya terhadap osteoblas. Isolat
osteoclast and osteoblast and the
tersebut memiliki persen viabilitas sel
hormones
mencapai 47,22%. Hal ini mengindikasikan
control their development and
bahwa isolat masih memiliki efek proliferasi
activity. The 1st Joint Meeting of
terhadap sel.
the International Bone and Mineral
senyawa flavanoid.
Society KESIMPULAN
and
cytokines
The
that
European
calcified Tissue Society CME.
Fraksi dan isolat kayu secang dapat menstimulasi
and
proliferasi
sel
osteoblas
Kini U & Nandeesh BN.(2012). Chapter 2: Physiology of Bone Formation,
berdasarkan data viabilitas sel, yaitu fraksi
remodelling,
4 dan isolatnya. Fraksi 4 merupakan fraksi
Berlin: Springer-Verlag. Hal. 44-
yang
46.
memiliki nilai
viabilitas
tertinggi
and
metabolism.
terhadap proliferasi sel osteoblas, yaitu
Manolagas SC, and Jilka RL. Feb .(1995).
mencapai 200,00%. Sedangkan isolatnya
Bone Marrow, Cytokines, and
juga
Bone
memilki
aktifitas
terhadap
sel
Remodeling
Emerging
osteoblas dengan menunjukkan viabilitas
Insights into the Pathophysiology
sel mencapai 47,22%.
of Osteoporosis. N Engl J Med
Karakterisasi
isolat
KS1,
berdasarkan klt dengan berbagai reagen
332(2). hal. 305-11 Nguyen MT., Awale S., Tezuka Y., Tran
IR
QL., Kadota S.(2005). Xanthin
menunjukkan bahwa isolat KS1 merupakan
oxidase inhibitors from heartwood
senyawa flavanoid dengan gugus
of
penampak
bercak
dan
data
CH
Vietnamese
Caesalpinia
sappan. Chem Pharm Bull 53(8).
alifatik, C-C siklik dan C=C aromatik.
Shu hui shi. (2008).A New Flavanoid from Heartwood of Caesalpinia sappan. KEPUSTAKAAN
China journal of Chinese materia
Alan R. Gaby MD. (2005).Osteoporosis:
medica.Hal 903-5
Natural
Solutions.
Vitality
Magazine. Kanada: The Wire Inc. Setiyohadi.(2000).
Osteoporosis
Akibat
Secang
Steroid, Grup PT Kalbe Farma,
terhadap
Jakarta, hal 28.
Osteoblas.
Subehan,
Rifai,Y.,Mufidah.
Standarisasi
Ekstrak
(2012). Kayu
dan
Pengujiannya
Proliferasi
Sel
Saifuddin A, Rahayu, Yuda Hilwan.(2011).
Yatim F.(2003). Osteoporosis: Penyakit
Standarisasi Bahan Obat Alam.
Kerapuhan Tulang pada Manula.
Graha Ilmu. Yogyakarta. hal. 1-22.
Jakarta: Pustaka Populer Obor.
Tabel 1. Fraksinasi Ekstrak Awal Fraksi
Bobot Fraksi
F1
2,09 gram
F2
4,84 gram
F3
9,19 gram
F4
14,80 gram
F5
1,40 gram
F6
3,82 gram
Tabel 2. Refraksinasi I (Fraksi 4) Fraksi
Bobot Fraksi
F4.1
1,68 gram
F4.2
1,06 gram
F4.3
1,02 gram
F4.4
0,16 gram
F4.5
1,09 gram
Tabel 3. Refraksinasi II (Fraksi 4.2) Fraksi
Bobot Fraksi
F4.2.1
0,003 gram
F4.2.2
0,19 gram
F4.2.3
0,12 gram
F4.2.4
0,11 gram
F4.2.5
0,10 gram
F4.2.6
0,11 gram
Tabel 4.Hasil Pengujian Aktivitas Proliferasi Sel Perlakuan
% viabilitas ± S
K.s
100,00% ± 0,003
K.m
0,00% ± 0,004
NAF
100,00% ± 0,002
C
91,67% ± 0,002
E
91,67% ± 0,0007
Fr.1
27,78% ± 0,000
Fr.2
25,00% ± 0,003
Fr.3
116,67% ± 0,0007
Fr.4
200,00% ± 0,002
Fr.5
11,11% ± 0,009
Fr.6
11,11% ± 0,003
Isolat
47,222% ± 0,005
Ket: K.s
: Kontrol sel
K.m
: Kontrol medium
NAF
: Natrium Florida
C
: Kalsitonin
E
: Ekstrak awal
Fr.
: Fraksi
A
: Absorbansi
Tabel 5. Data spektrum IR isolat KS Bilangan
gelombang Bentuk
Intensitas
Kemungkinan
gugus
(cm-1)
pita
3682,96
Lebar
medium
O-H
2930,43
Lebar
medium
C-H alifatik (strech)
1615,25
Lebar
lemah
C=C alkena/aromatik
1500,25
Lebar
lemah
C-C siklik
1451,18
Lebar
lemah
C-C siklik
fungsi
