OPTIMALISASI TES KOMET UNTUK PENENTUAN TINGKAT KERUSAKAN DNA AKIBAT PAPARAN RADIASI PENGION. Dwi Ramadhani, Devita Tetriana dan Viria Agesti Suvifan

Optimalisasi Tes Komet Untuk Penentuan Tingkat Kerusakan DNA Akibat Paparan Radiasi Pengion (Dwi Ramadhani)

ISSN 1411 – 3481

OPTIMALISASI TES KOMET UNTUK PENENTUAN TINGKAT KERUSAKAN DNA AKIBAT PAPARAN RADIASI PENGION Dwi Ramadhani, Devita Tetriana dan Viria Agesti Suvifan Pusat Teknologi Keselamatan dan Metrologi Radiasi (PTKMR), BATAN Jl. Lebak Bulus Raya No.49, Kotak Pos 7043 JKSKL Jakarta Selatan 12070 Tel (021) 7513906/ 7659511 Fax (021) 7657950 Email : [email protected] Diterima: 29-02-2016 Diterima dalam bentuk revisi: 11-03-2016 Disetujui: 15-03-2016

ABSTRAK OPTIMALISASI TES KOMET UNTUK PENENTUAN TINGKAT KERUSAKAN DNA AKIBAT PAPARAN RADIASI PENGION. Tes komet dapat digunakan untuk mengukur tingkat kerusakan asam deoksiribonukleat (DNA) pada sel limfosit darah tepi akibat paparan radiasi pengion.Prinsip dasar dari tes komet adalah berdasarkan besarnya fragmen DNA terdenaturasi yang bermigrasi keluar dari inti sel selama proses elektroforesis. Terdapat beberapa aspek yang harus diperhatikan saat melakukan tes komet antara lain adalah konsentrasi agarose yang digunakan, waktu inkubasi pada alkali, kondisi elektroforesis (waktu, temperatur serta gradien voltase yang digunakan), serta parameter yang digunakan dalam analisis. Parameter yang sangat disarankan dalam menganalisis citra komet adalah persentase DNA ekor (% DNA 6 ekor). Persentase DNA ekor dapat dikonversi menjadi frekuensi lesion per 10 pasangan basa (bp) DNA dengan menggunakan kurva yang menggambarkan hubungan antara dosis radiasi pengion dengan besarnya % DNA ekor. Untuk mendapatkan hasil analisis tes komet yang akurat perlu dilakukan pembuatan kurva kalibrasi yang menggambarkan hubungan antara dosis radiasi pengion dengan besarnya % DNA ekor. Analisis citra komet sebaiknya dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak pengolahan citra sehingga dapat meningkatkan akurasi dan presisi serta mengurangi subjektivitas dalam menganalisis citra komet. Kata kunci: asam deoksiribonukleat (DNA), radiasi pengion, tes komet.

ABSTRACT COMET ASSAY OPTIMIZATION FOR ASSESSMENT OF DNA DAMAGE DUE TO RADIATION EXPOSURE. Comet assay can be used to measure the deoxyribonucleic acid (DNA) damage level caused by ionizing radiation exposure in peripheral blood lymphocytes. The principle of the comet assay is based on the amount of denatured DNA fragments that migrated out of the cell nucleus during electrophoresis. There are several aspects that must be concerned when doing the comet assay. For example the agarose concentration, duration of alkaline incubation, electrophoresis conditions (time, temperature, and voltage gradient), and the measurement parameters that used in analyze the comet. Percentage of DNA in the comet tail (% tail DNA) is strongly recommended as a parameter when analyze the comet because it 6 can be converted to lesions per 10 base pairs (bp) using calibration curve that show relationship between the dose of ionizing radiation and % tail DNA. To obtain an accurate result, the calibration curve must be made and comet should be analyzing using image processing analysis software since it can be increase the precision and reduce the subjectivity of the measurement process. Keywords: comet assay, deoxyribonucleic acid (DNA), ionizing radiation.

37

Jurnal Sains dan Teknologi Nuklir Indonesia Indonesian Journal of Nuclear Science and Technology Vol. 17, No 1, Februari 2016; 37-48

1. PENDAHULUAN

ISSN 1411 - 3481

saat berada pada larutan alkali, sehingga

Setiap hari manusia selalu terpapar

daerah pada untai ganda DNA yang me-

radiasi baik dari alam maupun saat melaku-

ngalami pengenduran dan mengandung

kan pekerjaan sebagai pekerja radiasi.

DSB akan bermigrasi menuju kutub positif

Radiasi alam dapat berupa radiasi kosmik

(anoda) saat elektroforesis. Migrasi tersebut

dan radiasi terestrial (berasal dari radio-

akan membentuk ekor komet, sedangkan

nuklida primordial dikerak bumi) (1). Papar-

daerah yang tidak mengalami pengenduran

an radiasi pengion dapat menyebabkan ke-

akan membentuk kepala komet (Gambar 1)

rusakan pada materi genetik yaitu asam de-

(7). Komet yang terbentuk kemudian di-

oksiribonukleat (DNA) (2). Kerusakan ter-

warnai dengan pewarna fluorescent atau pe-

sebut dapat berupa putusnya salah satu

warna perak. Pewarna yang banyak diguna-

untai DNA (single strand break / SSB) dan

kan adalah ethidium bromide, propidium

putusnya kedua untai DNA pada posisi yang

iodide

berhadapan (double strand breaks / DSB).

(DAPI).

dan

4,6-diamidino-2-phenylindole

Kerusakan DNA akibat paparan radiasi pengion dapat dideteksi dengan menggunakan tes komet (Comet Assay). Prinsip analisis tes komet adalah berdasarkan besarnya fragmen DNA terdenaturasi yang bermigrasi keluar dari inti sel selama proses elektroforesis (3,4). Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya pada media gel agarose (5). Secara singkat tes komet dilakukan dengan menanamkan (embedding) sel pada lapisan tipis low melting agarose (LMA) di atas preparat mikroskop terlebih dahulu. Pelisisan sel kemudian dilakukan dengan

Gambar 1. Citra hasil tes komet (8).

menggunakan larutan deterjen serta garam konsentrasi tinggi. Selanjutnya dilakukan

Citra hasil tes komet dapat dianalisis

penghilangan protein dan histon sehingga

secara manual atau menggunakan perang-

nukleolus sel berada pada rongga-rongga

kat lunak pengolahan citra digital. Jumlah

LMA (6,7). Untai ganda DNA secara umum

minimal yang harus diamati pada suatu

memiliki

sangat

penelitian dengan menggunakan tes komet

kompak (supercoiling), namun struktur ter-

adalah sebanyak 50 komet dari tiap preparat

sebut

sekitar

(9). Tes komet dapat digunakan untuk me-

daerah DSB DNA. Molekul DNA mengan-

ngukur tingkat kerusakan DNA pada sel

struktur

sedikit

terpilin

mengendur

yang

pada

dung gugus fosfat bermuatan listrik negatif 38


ISSN 1411 – 3481

limfosit darah tepi. Beberapa metode dapat

rangkat lunak pengolahan citra untuk meng-

digunakan untuk pengoptimalan tes komet

analisis citra digital komet baik yang bersifat

sehingga

pasti

terbuka (opensource) maupun komersial

besarnya kerusakan DNA akibat paparan

(licence). Sebagai contoh Helma et al. pada

radiasi akan dibahas dalam makalah.

tahun 2000 membuat bahasa macro pada

dapat

diketahui

secara

perangkat lunak pengolahan citra yaitu NIH 2. ANALISIS CITRA KOMET

Image untuk menganalisis citra komet.

Analisis citra komet dapat dilakukan

Sayangnya NIH Image hanya dapat diguna-

dengan dua cara. Pertama secara manual

kan pada komputer dengan sistem operasi

dan

Macintosh (14). NIH Image adalah perang-

dilakukan

langsung

menggunakan secara

kat lunak pengolahan citra yang dikembang-

manual dilakukan dengan membagi citra

kan oleh Wayne Rasband dan kini telah di-

komet kedalam lima tingkatan (0 sampai 4)

gantikan oleh ImageJ. ImageJ dikembang-

berdasarkan kerusakan DNA yang teramati

kan dalam bahasa Java sehingga kini dapat

(Gambar 2) (10,11). Meskipun mudah untuk

digunakan pada semua sistem operasi

dilakukan analisis secara manual tidaklah

komputer (14). ImageJ menyediakan fasili-

sederhana.

analisis

tas pembuatan macro untuk dapat diguna-

menggunakan perangkat lunak pengolahan

kan dalam mengolah citra digital komet.

citra

digunakan

Macro adalah baris-baris kode pemrogram-

meskipun analisis secara manual masih

an yang berisi perintah untuk menentukan

dilakukan. Analisis citra komet dengan

masukan

menggunakan perangkat lunak pengolahan

pemrograman tertentu (15,16).

mikroskop

fluorescent.

Oleh

digital

lebih

Analisis

karena

itu

banyak

dan

keluaran

dalam

bahasa

citra digital dapat meningkatkan akurasi dan presisi serta mengurangi subjektivitas dalam menganalisis citra komet (12,13). Hingga kini terdapat beberapa pe-

0

2

1

3

4

Gambar 2. Lima tingkat kerusakan DNA yang tervisualisasikan pada teskomet(9).

39


Konca et al. pada tahun 2003 membuat perangkat lunak yang dapat digunakan

ISSN 1411 - 3481

komet hingga ujung ekor komet 7. Panjang Komet (Comet length) yaitu

secara bebas untuk menganalisis citra

menunjukkan

digital komet yaitu CASPLab Comet Assay

keseluruhan mulai dari batas paling kiri

(17). CASPLab dikembangkan mengguna-

kepala komet hingga ujung ekor komet

kan FOX library (http://www.fox-toolkit.org/)

8. CoG

Kepala

panjang

(Head

komet

CoG)

yaitu

sehingga dapat dijalankan pada hampir se-

menunjukkan ‘‘Centre of gravity’’ dari

luruh sistem operasi komputer baik Windows

DNA pada kepala komet

maupun Linux. CASPLab dapat diunduh

9. CoG Ekor (Tail CoG) yaitu menunjukkan

pada situs http://casplab.com/ (18). CASP-

‘‘Centre of gravity” dari DNA pada ekor

Lab hanya dapat digunakan pada citra

komet

digital komet hasil tes komet dengan pe-

10. Momen

Ekor

(Tail

moment)

yaitu

warna berpendar (fluorescent). Apabila pe-

menunjukkan panjang dari CoG kepala

warna komet adalah pewarna perak maka

hingga CoG ekor

harus terlebih dahulu menjadi citra negatif

11. Momen ekor Olive (Olive tail moment)

untuk dapat diolah menggunakan CASPLab

adalah hasil dari perkalian persentase

Comet Assay (17). Perangkat lunak pe-

DNA pada ekor komet dengan nilai hasil

ngolahan citra digital dapat digunakan untuk

pengurangan antara CoG ekor dengan

mengukur beberapa parameter dari citra

CoG kepala.

digital komet. Beberapa parameter tersebut

Tiga parameter yaitu persentase DNA

antara lain adalah sebagai berikut (12).

ekor (% T), panjang ekor dan momen ekor

1. DNA Kepala Komet (Head DNA) yaitu

adalah parameter yang paling umum di-

menunjukkan banyaknya DNA pada

gunakan dalam menganalisis citra komet.

kepala komet

Persentase DNA ekor merupakan parameter

2. DNA Ekor Komet (Tail DNA) yaitu

yang sangat disarankan dalam menganalisis

menunjukkan banyaknya DNA pada

citra komet. Hal tersebut dikarenakan % T

ekor komet

dapat diekspresikan dalam skala nominal

3. Persentase DNA Kepala Komet (% head

mulai dari 0 hingga 100 %. Dengan demi-

DNA) yaitu menunjukkan persentase

kian komparasi antara hasil penelitian yang

DNA pada kepala komet

menggunakan tes komet dapat dilakukan.

4. Persentase DNA Ekor Komet (% tail

Kondisi

elektroforesis

dalam

penelitian

DNA) yaitu menunjukkan persentase

dengan menggunakan tes komet harus di-

DNA pada ekor komet

atur sedemikian rupa sehingga sel pada

5. Radius Kepala Komet (Head radius)

kelompok kontrol atau tanpa perlakuan tetap

yaitu menunjukkan radius pada kepala

menunjukkan proses migrasi DNA dengan

komet

nilai % T sebesar 5 hingga 10 (19).

6. Panjang Ekor Komet (Tail length) yaitu

Analisis citra komet secara manual

menunjukkan panjang ekor komet yang

sebaiknya dilakukan pada sebanyak 100

diukur dari batas paling kanan kepala

citra komet. Dengan demikian nilai yang

40


ISSN 1411 – 3481

diperoleh berada dalam kisaran 0 sampai 400. Satuan yang umum digunakan dalam

Tes komet sangat sensitif untuk men-

analisis manual adalah “arbitrary units” (au).

deteksi 100 hingga beberapa ribu patahan

Nilai tersebut dapat dikonversikan menjadi 0

(breaks) dari setiap sel manusia yang ter-

hingga 100 au dengan membagi empat nilai

ekspresikan sebagai % T. Penelitian mem-

hasil analisis manual dari sebanyak 100 citra

perlihatkan bahwa terdapat hubungan yang

komet. Hal tersebut dilakukan agar nilai au

hampir linier antara jumlah breaks dengan

yang

dikomparasikan

peningkatan dosis radiasi mulai dari 0

dengan nilai % T pada hasil analisis citra

hingga 10 Gy. Kurva yang menggambarkan

komet dengan

menggunakan perangkat

hubungan antara dosis radiasi pengion

lunak pengolahan citra (20). Analisis semi

dengan besarnya % T dapat digunakan

kuantitatif

untuk mengkonversi hasil analisis citra

diperoleh

dapat

lainnya

adalah

dengan

6

menghitung nilai indeks kerusakan genetik

komet menjadi jumlah lesions per 10

(Genetic Damage Index). Seperti halnya

pasangan basa DNA (Gambar 3) (19).

analisis manual citra komet dikategorikan

Berdasarkan penelitian diketahui bahwa

menjadi lima tipe yaitu tipe 0 yaitu pada sel

dosis radiasi sinar Gamma sebesar 1 Gy

yang tidak mengalami kerusakan hingga tipe

dapat menginduksi 0,29 patahan pada untai

IV pada sel dengan kerusakan tinggi. Indeks

DNA (strand breaks) per 10 Dalton DNA

kerusakan genetik (GDI) kemudian dihitung

(22). Massa 1 pasangan basa (bp) adalah

dengan persamaan berikut (20).

sebesar 650 Da (21).

9

Gambar 3. Kurva yang menggambarkan hubungan antara dosis radiasi pengion dengan besarnya % T dari 12 laboratorium yang berbeda (25).

41


Tingkat

pada

Variasi antar laboratorium dapat dipastikan

kurva kalibrasi dapat diguna-kan untuk

akan terjadi mengingat metode yang diguna-

menghitung jumlah kerusakan (lesions) per

kan tidaklah sama. Beberapa usaha telah

6

10

kemiringan

(slopes)

ISSN 1411 - 3481

bp berdasarkan % DNA ekor pada

komet dengan persamaan berikut (22).

dilakukan secara ekstensif oleh peneliti di dunia untuk meminimalisasi variasi tersebut dengan menstandardisasi metode tes komet yang digunakan. Tahapan kritis pada tes komet kini telah diidentifikasi yaitu pada konsentrasi agarose yang digunakan, waktu

Laboratorium

yang

menggunakan

inkubasi pada alkali dan kondisi elektro-

teknik tes komet untuk mengetahui tingkat

foresis (waktu, temperatur serta gradien

kerusakan DNA sangat disarankan memiliki

volt-ase yang digunakan) (23).

kurva kalibrasi hubungan dosis radiasi peng-

Bahkan saat ketiga tahapan tersebut

ion dengan besarnya % T. Kurva tersebut

telah dikontrol variasi terkadang tetap terjadi.

dapat digunakan untuk mengkonversi hasil

Alternatif lain adalah dengan menggunakan

analisis citra komet menjadi jumlah lesions

standard acuan pada penelitian yaitu sel

6

per 10 pasangan basa (bp) DNA. Dosis

dengan tingkat kerusakan DNA yang telah

yang digunakan dalam pembuatan kurva

diketahui secara pasti. Paparan sinar X

dapat berkisar antara 0 hingga 10 Gy. Apa-

dengan dosis tertentu atau pemberian H2O2

bila laboratorium tidak memiliki peralatan

pada konsentrasi yang diketahui secara

untuk

pasti dapat dilakukan untuk membuat sel

melakukan

analisis

citra

komet

dengan perangkat lunak pengolahan citra

standard

maka

acuan sangat berguna saat melakukan

analisis

dapat

dilakukan

secara

manual. Seperti telah dijelaskan sebelum-

penelitian

nya

panjang

analisis

secara

manual

sebaiknya

dilakukan pada 100 komet sehingga diper-

acuan.

Penggunaan

berkelanjutan untuk

standard

dalam

mengetahui

jangka

konsistensi

metode yang digunakan (23).

oleh nilai analisis manual dalam kisaran 0

Idealnya sel standard acuan harus

sampai 400. Nilai analisis manual kemudian

diletakkan dalam gel yang sama dengan sel

dibagi empat sehingga diperoleh kisaran

sampel. Masalah yang timbul kemudian

nilai 0 hingga 100 yang dapat dikomparasi-

adalah bagaimana membedakan sel stan-

kan dengan nilai %T.

dard acuan dengan sel sampel setelah proses elektroforesis dan pewarnaan selesai

3. VARIASI HASIL ANALISIS TES KOMET

dilakukan. Hingga kini terdapat beberapa

Variasi pada hasil tes komet me-

cara untuk membedakan sel standard acuan

rupakan permasalahan yang penting untuk

dengan sel sampel, meskipun sel standard

diperhatikan. Variasi dapat terjadi antara be-

acuan tidak belum digunakan secara rutin

berapa percobaan dalam satu laboratorium

pada laboratorium tes komet. Identifikasi sel

meski

standard acuan dapat dilakukan dengan

42

metode

yang

digunakan

sama.


penggunaan

ISSN 1411 – 3481

(BrdU)

pemberian paparan radiasi pada dosis

yang dapat terinkorporasi kedalam timidin

tertentu masih terdapat aspek yang harus

pada DNA untuk kemudian diwarnai dengan

diperhatikan. Metode tes komet yang di-

pe-warna fluorescent. Sel standard acuan

gunakan pada sel standard acuan dan sel

dan

sampel tidak akan pernah sama seratus

sel

bromodeoxyuridine

sampel

kemudian

dibedakan

dengan mengunakan filter yang berbeda pada

mikroskop

persen (23).

Metode

Hingga kini beberapa usaha telah

lainnya adalah dengan menggunakan sel

dilakukan oleh konsorsium ECVAG (Europe-

dari orga-nisme yang berbeda misalnya sel

an Comet assay Validation Group) untuk

eritrosit ikan. Sel standard acuan yaitu sel

mengetahui secara pasti variasi yang timbul

eritrosit ikan akan dengan mudah dapat

serta penyebabnya pada hasil tes komet.

dibedakan dengan sel sampel yaitu sel

Percobaan pertama dilakukan dengan me-

limfosit darah tepi manusia karena memiliki

libatkan 12 laboratorium di Eropa (25). Per-

bentuk yang berbeda (23).

cobaan kedua dilakukan dengan melibatkan

fluorescenct.

standard

acuan

10 laboratorium (26). Variasi antar laborato-

dan

tanpa

rium umumnya disebabkan oleh perbedaan

perlakuan sebagai kontrol negatif dalam

metode tes komet yang digunakan. Variasi

suatu penelitian sangat disarankan. Hingga

yang terjadi dapat dikurangi apabila hasil

kini belum terdapat konsensus mengenai

akhir analisis dikonversi menjadi nilai fre-

sumber yang digunakan dalam membuat sel

kuensi patahan (breaks) DNA mengguna-

standard acuan. Paparan radiasi pengion

kan kurva kalibrasi hubungan dosis radiasi

memiliki kelebihan bila digunakan dalam

pengion dengan besarnya % T. Percobaan

membuat sel standard acuan yaitu dapat

ketiga

diketahui secara pasti jumlah breaks pada

mengimplementasikan metode standard tes

DNA

kalibrasi

komet agar mengurangi variasi yang akan

hubungan dosis radiasi pengion dengan

timbul. Sayangnya beberapa laboratorium

besarnya % T (24). Secara prinsip konversi

mengalami

hasil

metode tersebut (27). Percobaan keempat

Penggunaan sebagai

kontrol

dengan

analisis

sel positif

bantuan

tes

komet

sel

kurva

sebagai

nilai

dilakukan

dengan

kesulitan

untuk

tujuan

untuk

mengadopsi

frekuensi patahan (breaks) DNA mengguna-

dilakukan

kan kurva kalibrasi hubungan dosis radiasi

penyebab variasi dan disimpulkan bahwa

pengion dengan besarnya % T adalah salah

masih sulit mengidentifikasi secara pasti

satu cara agar hasil tes komet antar peneliti-

penyebab terbentuknya variasi antar labo-

an dapat dibandingkan. Akan tetapi konversi

ratorium (28). Meskipun demikian secara

tersebut bukan tanpa masalah mengingat

garis besar seperti telah dijelaskan sebelum-

banyak peneliti tidak memiliki akses ter

nya bahwa tahapan kritis pada tes komet

hadap sumber radiasi sehingga sulit untuk

adalah pada konsentrasi agarose yang

memiliki kurva kalibrasi sendiri. Bahkan saat

digunakan, waktu inkubasi pada alkali dan

sumber radiasi tersedia dan memungkinkan

kondisi elektroforesis (waktu, temperatur

untuk memiliki sel standard acuan dengan

serta gradien voltase yang digunakan).

untuk

mengidentifikasi

faktor

43


Komet akibat paparan radiasi pengion

ISSN 1411 - 3481

konsentrasi akhir

agarose sebesar

0,6

terutama dipengaruhi oleh waktu elektro-

hingga 0,8 %, lama waktu inkubasi alkali

foresis dan gradien voltase elektroforesis

lebih kurang 40 menit dan elektroforesis

yang digunakan. Waktu elektroforesis ber-

dilakukan selama 20 hingga 30 menit

variasi hingga paling lama selama 40 menit

dengan

sedangkan

umumnya

kurang 1 V/cm. Kondisi apapun yang

sebesar 0,2 hingga 1,6 V/cm. Pengukuran

digunakan harus dilakukan secara seksama

gradien voltase elektroforesis yang diguna-

dan cermat serta dilaporkan dalam publikasi

kan harus dilakukan dengan meletakkan

agar dapat dilakukan komparasi dengan

slide berada diantara elektroda karena

laboratorium lain (23). Hingga kini masih

lokasi tersebut adalah lokasi dimana poten-

terdapat perdebatan mengenai parameter

sial elektrik menarik DNA yang mengalami

utama yang paling relevan untuk digunakan

kerusakan

Peng-

dalam analisis komet. Panjang ekor komet

hitungan nilai gradien voltase elektroforesis

kini tidak banyak lagi digunakan oleh para

(V/cm) dapat dilakukan dengan bantuan

peneliti. Parameter % T terutama pada sel

lembar kerja Microsoft Excel yang bisa

limfosit darah tepi lebih banyak digunakan

diunduh pada alamat berikut http://comics.

terutama dalam studi biomonitoring sebagai

vitamib.com/electrophoresis-physics.

parameter akhir analisis komet. Perdebatan

gradien

keluar

voltase

dari

nukleus.

gradien

voltase

sebesar

lebih

Secara umum proses elektroforesis

mengenai penggunaan % T atau momen

direkomendasikan untuk dilakukan dalam

ekor sebagai parameter akhir analisis komet

lemari pendingin sehingga temperatur pada

telah mengaburkan masalah yang sebenar-

solusi dan gel tidak meningkat hingga me-

nya yaitu apakah parameter akhir dalam

lebihi 15 °C. Penelitian McKelvey-Martin et

analisis komet dapat berguna bagi peneliti

al. (1993) memperlihatkan bahwa terdapat

yang tidak terbiasa dengan tes komet.

sedikit perbedaan pada komet yang ter-

Penelitian dengan menggunakan limfosit

bentuk dengan melakukan elektroforesis

darah tepi pada studi biomonitoring manusia

pada 5 °C atau 10 °C. Sel yang digunakan

parameter akhir berupa % T dianggap lebih

dalam penelitian tersebut adalah sel limfosit

menguntungkan dan lebih banyak diguna-

yang diradiasi dan tidak diradiasi (29).

kan oleh para peneliti lainnya (24).

Peningkatan yang signifikan pada migrasi DNA terjadi saat elektroforesis dilakukan

4. KESIMPULAN Tes komet dapat digunakan untuk

pada temperatur tinggi (mencapai 25 °C). Hasil penelitian tersebut dikonfirmasi oleh

mengetahui

penelitian

Beberapa

Sirota

et

al.

(2014)

yang

tingkat hal

perlu

kerusakan

DNA.

dilakukan

untuk

membandingkan antara elektroforesis pada

meningkatkan keakuratan analisis hasil tes

temperatur 4 °C dan 20 °C (30).

komet

Secara

keseluruhan

direkomendasikan

44

adalah

serta

mendapatkan

hasil

yang

yang

konsisten dan mencegah variasi yang akan

menggunakan

timbul. Pertama perlu dibuat kurva kalibrasi

kondisi


ISSN 1411 – 3481

yang menggambarkan hubungan antara

of Pharmacology and

dosis radiasi pengion dengan besarnya %T.

Pharmacotherapeutics2011;2(2):107-

Kurva

111.

tersebut

dapat

digunakan

untuk

mengkonversi hasil analisis citra komet

4.

6

Langie SAS, Azqueta A, Collins AR.

menjadi jumlah lesions per 10 pasangan

The comet assay: past, present, and

basa

future. Frontiers in

DNA.

Kedua

perlu

dilakukan

genetics2015;6(266):6-8.

penghitungan gradien voltase elektroforesis yang digunakan dalam tes komet. Gradien

5.

Azqueta A, Slyskova J, Langie SAS,

voltase yang disarankan untuk digunakan

Gaivão IO, Collins A.Comet assay to

dalam tes komet adalah sebesar 1 V/cm.

measure DNA repair: approach

Ketiga perlu dipertimbangkan penggunaan

andapplications.Frontiers in genetics

sel standard acuan yaitu dengan sel eritrosit

2014;5(288):71-78.

ikan atau dengan penggunaan BrdU pada

6.

Ersson C, Moller L. The effects on DNA

sel limfosit tepi manusia sehingga dapat

migration of altering parameters in the

dibedakan

comet assay protocol suchas agarose

dengan

sel

menganalisis hasil tes

sampel

saat

density, electrophoresis conditions and

komet. Terakhir

penggunaan perangkat lunak pengolahan

durations of the enzyme or thealkaline

citra untuk menganalisis hasil tes komet

treatments.Mutagenesis

harus dilakukan untuk meningkatkan akurasi

2011;26(6):689–695.

dan presisi serta mengurangi subjektivitas

7.

Lovell DP, Omori T. (REVIEW) Statistical issues in the use of the

dalam menganalisis citra komet.

comet assay. Mutagenesis 5. DAFTAR PUSTAKA 1.

Alatas Z, Lusiyanti Y, Purnami S,

3.

8.

CellBiolabs, Inc. Comet Assay Kits, 3-

Ramadhani D, Lubis M, Suvifan VA.

Well (Internet). Cell Biolabs, Inc; (cited

Respon Sitogenetik Penduduk Daerah

2016 Feb 28). Available from:

Radiasi Alam Tinggi di Kabupaten

http://www.cellbiolabs.com/comet-

Mamuju, Sulawesi Barat. Jurnal Sains

assay-kits-3-well

dan Teknologi Nuklir Indonesia

2.

2008;23(3):171–182.

9.

Collins A.The Comet Assay (Principles,

2012;13(1):13–26.

Applications, and Limitations).

Alatas Z. Ketidakstabilan Genom Akibat

InDidenko VV editor. In Situ Detection

Radiasi. Prosiding Presentasi Ilmiah

of DNA Damage (Methods and

Keselamatan Radiasi dan Lingkungan

Protocols), 1st ed.New York: Humana

XI, Jakarta: Penerbit PTKMR;2006.

Press;2002.

Nandhakumar S, Parasuraman S,

10. Azqueta A, Meier S, Priestley C,

Shanmugam MM, Ramachandara RK,

Gutzkow KB, Brunborg G, SalletteJ, et

Parkash C, Vishnu BB. Evaluation of

al. The influence of scoring method on

DNA damage using single-cell gel

variability in results obtained with the

electrophoresis (Comet Asay). Journal

comet assay. 45


Mutagenesis2011;26(3):393–399. 11. Lehnert S.Biomolecular Action of

Mutagenesis2008;23:143–151. 20. Mohammadi S, Taghavi-dehaghani M,

Ionizing Radiation.New York (NY):

Gharaati MR, Masoomi R, Ghiassi-

Taylor & Francis Group; 2007.

Nejad M. Adaptive Response of Blood

12. Lovell DP.Statistical Analysis of Comet

Lymphocytes of Inhabitants Residing in

Assay Data. In Dhawan A, Anderson D

High Background Radiation Areas of

editors.The Comet Assay in

Ramsar- Micronuclei , Apoptosis and

Toxicology.Cambridge:The Royal

Comet Assays. Journal of Radiation

Society of Chemistry; 2009.

Research 2006;47(3-4):279–85.

13. Garcia O, Romero I, Gonzalez JE,

21. Ahnström G, Erixon K.Measurement of

Moreno DL, Cuetara E, Rivero Y,et al.

strand breaks by alkaline denaturation

Visual estimation of the percentage of

and hydroxyapatite chromatography.In

DNA in the tail in the comet assay:

Friedberg EC, Hanawalt PC editors.

Evaluation of different approaches in an

DNA Repair: A Laboratory Manual of

intercomparison exercise. Mutation

Research Procedures. New York:

Research 2011;720:14–21.

Marcel Dekker;1981.

14. Helma C, Uhl M. A public domain

22. Kohn KW, Erickson LC. Ewig RA,

image-analysis program for the single-

Friedman CA.Fractionation of DNA

cell gel-electrophoresis comet assay.

from mammalian cells by alkaline

Mutation Research2000;466:9–15.

elution.Biochemistry 1976;15:4629–

15. Collins TJ. ImageJ for microscopy. BioTechniques2007;43:S25-S30. 16. Putra D. Pengolahan Citra Digital. Yogyakarta:Andi Press;2010. 17. Konca K, Lankoff A, Banasik A, Lisowska H, Kuszewski T, Gozdz S, et al. A cross-platform public domain PC

4637. 23. Collins AR, Yamani NE, Lorenzo Y, Shaposhnikov S, Brunborg G, Azqueta A. Controlling variation in the comet assay. Frontiers in Genetic 2014;5(359):1-6. 24. Møller P, Loft S, Ersson C, Koppen G,

image-analysis program for the comet

Dusinska M, Collins A. On the search

assay. Mutation Research2003;534:15–

for an intelligible comet assay

20.

descriptor. Frontiers in Genetic

18. González JE, Romero I, Barquinero JF, García O. Automatic Analysis of Silver-

2014;5(217): 1-4. 25. Forchhammer L, Johansson C, Loft S,

stained Comets by CellProfiler Software.

Moller L, Godschalk RWL, Langie SAS,

Mutation Research 2012;748:60–64.

et al. Variation in the measurement of

19. Collins AR, Oscoz AA, Brunborg G,

46

ISSN 1411 - 3481

DNA damage by comet assay

Isabel-Gaiva˜o I, Giovannelli L, Marcin-

measured by the ECVAG inter-

Kruszewski M,et al. The Comet

laboratory validation trial.

assay:topical issues.

Mutagenesis2010;25(2):113–123.


26. Johansson C, Moller P, Forchhammer L,

ISSN 1411 – 3481

variations of DNA strand breaks and

Loft S, Godschalk RWL, Langie SAS, et

FPG-sensitive sites in human

al. An ECVAG trial on assessment of

mononuclear cells. Mutagenesis

oxidative damage to DNA measured by

2013;28(3):279–286.

the comet assay. Mutagenesis2010;25(2):125–132. 27. Forchhammer L, Ersson C, Loft S,

29. McKelvey-Martin VJ, Green MHL, Schmezer P, Pool-Zobel BL, deMéo MP, Collins AR. The single cell gel

Moller L, Godschalk RWL, Schooten

electrophoresis assay(comet assay): a

FJ,et al.Inter-laboratory variation in

European review. Mutation

DNA damage using a standard comet

Research1993;288:47–63.

assay protocol. Mutagenesis2012;27(6):665–672. 28. Ersson C, Møller P, Forchhammer L,

30. Sirota NP, Zhanataev AK, Kuznetsova EA, Khizhnyak EP, AnisinaEA, Durnev AD. Some causes of inter

Loft S, Azqueta A, Godschalk RWL, et

laboratoryvariation in the results of

al. An ECVAG inter-laboratory

comet assay. Mutation Research2014;

validation study of the comet assay:

770:16–22.

inter-laboratory and intra-laboratory

47


48

ISSN 1411 - 3481

OPTIMALISASI TES KOMET UNTUK PENENTUAN TINGKAT KERUSAKAN DNA AKIBAT PAPARAN RADIASI PENGION. Dwi Ramadhani, Devita Tetriana dan Viria Agesti Suvifan

Recommend Documents