OLYMPUS Hungary Kft. Mikroszkóp Divízió. A mikroszkópia alapjai

Csúcstechnológiai vizsgálómódszerek

OLYMPUS Hungary Kft. Mikroszkóp Divízió A mikroszkópia alapjai

Előadó: Vida László Krisztián [email protected] http://www.olympus.hu/microscopy © OLYMPUS Hungary Kft.

Bevezető fejezetek a mikroszkópia elemeinek alapjaiból

2008.10.02.


A fénymikroszkópia alapjai

Tartalom: • • • • • • • •

A színek jelentése a mikroszkópiában és a képalkotásban Optikai terminológia A fénymikroszkópok felépítése Napjaink mikroszkópjai Kontrasztjavító eljárások a mikroszkópiában Széles látóterű fluoreszcens mikroszkópia Detektálási technológiák (digitális képalkotás) Fejlett képalkotó technológiák és műszaki megoldások

© OLYMPUS Hungary Kft.


2008.10.02.


A színek jelentése a mikroszkópiában és a képalkotásban • A fény – meghatározott amplitúdójú (→ fényerő) és hullámhosszúságú (→ szín) elektromágneses sugárzás • A szín – egyedüli forrása a fény, egyetlen határozott szín általában több különböző eredőjeként áll elő - ebből áll össze a látható spektrum. • Az emberi szem a kb. 400nm és 700 nm közötti hullámhosszú fényre érzékeny (az ezen tartományban keletkező színeket érzékeli)



2008.10.02.


Optikai terminológia • Mezőszám (Field Number, FN): az okulár diafragma mérete mm-ben (a minta képalkotási területe, növelése ld. MIA / panoráma); a gyakorlatban: FoV = OkulárFN / objektív nagyítás (mm) • Munkatávolság (Working Distance, WD): az objektív frontlencséje és a minta (vagy a fedőlemez) felülete között távolság – fókuszban lévő minta esetén • Parfokális távolság (Parfocal Distance, PD): az objektív foglalatának síkja és a minta közötti távolság (Olympus UIS2 optika esetén 45mm) • Teljes nagyítás a binokuláris tubusban: MBI = MOB x MOK(x MMagChanger) • Teljes nagyítás a monitoron: MVIDEO = MOB x MAD x DMonitor / DCCD



2008.10.02.


Optikai terminológia • Numerikus apertúra (Numerical Aperture, NA): NA = n x sinθ n: törésmutató, θ :félszög; Levegő: n = 1, olaj: n = 1.515 • Üres nagyítás: kb. >1000 x NA



2008.10.02.


Optikai terminológia • Laterális felbontóképesség (Lateral Resolution): az objektív azon képessége, amilyen mértékben meg tud különbözteti egymástól két vonalat vagy pontot egy objektumon • Rovátka (line grating - B/W vonalak váltakozva) mintát feltételezve dmin a még éppen feloldható távolság a hagyományos széleslátóterű mikroszkópiában, ahol • λ0 – az alkalmazott megvilágítás (fény) hullámhossza (látható fényre 0.55µm) • NAobj – az objektív numerikus apertúrája • NAkond – a kondenzor numerikus apertúrája



2008.10.02.


Optikai terminológia • Pontszerű mintát feltételezve a formula: • ahol rAiry az Airy diffrakciós kép központi diszkje körüli első sötét gyűrű sugara (NAobj = NAcond) • Ez abban az esetben áll fenn, ha a két azonos intenzitású különálló pontszerű fényforrás képének kontrasztja 74%, valamit teljesülnek a Rayleigh kritériumok: • A két pont inkoherens • A két pont intenzitása azonos • A 74% kontraszt az emberi szem felbontóképességének határa • A laterális felbontás e képlete a diffrakció-elméletből származik. © OLYMPUS Hungary Kft.


2008.10.02.


Mitől homályos a kép?

minta Airy korongok (diffrakció)



homályos kép

2008.10.02.


Optikai terminológia • Elérhető valós felbontóképesség napjainkban: • Fénymikroszkóp: kb. 0.24µm = 240nm (PlanApo100xO/1.4, 550nm) • STED (Stimulated Emission Depletion): kb. 30nm • Pásztázó elektronmikroszkóp: kb. 2.3nm • Transzmissziós elektronmikroszkóp: kb. 0.2nm • Pásztázó szondamikroszkóp: szub-Ångström (1Å = 10-10m)



2008.10.02.


Optikai terminológia • Mélységélesség (Focal Depth of Microscope): a minta azon rétegvastagsága, ami egyidejűleg fókuszban van, a fókuszpozíciótól függetlenül. Mivel az emberi szem fókuszálási képessége egyénenként változó, ezért a mélységélesség érzékelésének képessége is eltérő. • Jelenleg a gyakorlatban a Berek formulát használják, mert az ezzel kapott mélységélesség értéke gyakran egybeesik a kísérletekben tapasztalt mélységélességgel. • ω - az emberi szem felbontóképessége 0.0014 (0.5 foknál) • M – teljes nagyítás • λ – 0.55µm



2008.10.02.


Optikai terminológia

• Ideális kép + aberrációk = valódi kép • Ideális kép: pont leképezése pont

• Valódi kép: pont leképezése Airy korongok (diffrakciós maximumok és minimumok váltakozva)



2008.10.02.


Optikai terminológia • Szférikus aberráció (gömbi eltérés, nyíláshiba): Egyszínű sugarak esetén a lencse külső zónáinak gyújtótávolsága kisebb, mint a belsőké → az optikai tengelyen lévő pont képe nagy nyílásszögű sugárnyaláb esetén nem pontszerű, hanem gyújtófelület (diakausztika) • Megoldás: rekeszelés (diafragma) vagy összetett lencse



2008.10.02.


Optikai terminológia • Kóma (üstököshiba): Az optikai tengelytől távoli tárgypont képe pont helyett fényfolt, vagy – csak a szélső sugarak használata esetén (diafragma) – szimmetrikus görbe • Megoldás: a szélső sugarak rekeszelése és a szinuszfeltételnek (Abbe, 1873) eleget tevő lencserendszer alkalmazása: ( n sin(u) / n’ sin(u’) ) = y’ / y, illetve sin(u) / sin(u’) = y’ / y, ha n = n’, azaz a nagyításra vonatkozó y’ / y = k / t összefüggésnek akkor is igaznak kell maradnia, ha a tárgy- és képtávolságot nem a főtengelyen, hanem a szélső sugarak mentén mérjük → aplanatikus leképezés © OLYMPUS Hungary Kft.


2008.10.02.


Optikai terminológia • Asztigmatizmus: Ferdén beeső keskeny nyaláb esetén az sehol nem húzódik össze ponttá, hanem egy helyen aránylag éles, rövid vonallá, távolabb pedig egy másik vonallá. E két képvonal (fókuszvonal) egyike a meridiánsíkban, másik pedig a szagittális síkban van. Mivel a lencse két síkkal való metszetét nem egyforma görbületű vonalak határolják, így a két sík sugarai nem egy pontban egyesülnek → asztigmiás különbség.



2008.10.02.


Optikai terminológia • Képgörbület (képmezőhajlás) • Az asztigmatizmussal szorosan összefüggő hiba, amely miatt a lencse főtengelyére merőleges sík tárgy viszonylag éles képe nem sík, hanem görbe felület mentén keletkezik • Megoldás: összetett (anasztigmát) lencserendszer az asztigmatizmus és képgörbület kiküszöbölésére



2008.10.02.


Optikai terminológia • Geometriai torzítás (disztorzió) – nem a kép élességére, hanem annak az eredeti tárgyhoz való geometriai hasonlóságára vonatkozik. Ennek oka, hogy a nagyítás a kép nem minden részén ugyanakkora → hordó (itt a nagyítás a széleken kisebb, mint középen), illetve → párna (itt a nagyítás a széleken nagyobb, mint középen) alakú torzítás. • Mértéke függ a lencse alakjától és a diafragmák helyétől és nyílásától • Megoldás: ortoszkopikus objektív (két meniszkuszlencse között egy diafragma)



2008.10.02.


Optikai terminológia • Tengelymenti (longitudinális v. axiális) színi hiba (kromatikus aberráció): a lencsék törésmutatója a fény hullámhosszától függ, általában a vöröstől az ibolyáig csökken, azaz a fókusztávolság hullámhossz-függő. • Mivel a gyújtótávolság nem csak a kép helyét, hanem a nagyítást is befolyásolja, ezért a színi eltérés egyrészt a képhely, másrészt a képnagyság színi hibájában nyilvánul meg. • Megoldás: akromát lencse / apokromát lencse



2008.10.02.


Optikai terminológia • Tengelyre merőleges (laterális vagy transzverzális) színi hiba • A nagyítás hullámhossz-függő



2008.10.02.


Optikai terminológia • A színi hiba korrekciói



2008.10.02.


Napjaink fénymikroszkópjai



2008.10.02.


Upright mikroszkóp felépítése



2008.10.02.


Inverz mikroszkóp felépítése



2008.10.02.


Sztereó mikroszkóp felépítése



2008.10.02.


Makroszkóp felépítése SZX

NA small © OLYMPUS Hungary Kft.


MVX

large 2008.10.02.


Kontrasztjavító eljárások a mikroszkópiában • • • • • • • •

Világoslátótér (BF) Sötétlátótér (DF) Polarizáció (POL) Fáziskontraszt (PH) Relief kontraszt (RC) / Hoffmann modulációs kontraszt Nomarski Differenciál Interferencia Kontraszt (DIC) Fluoreszcencia (FLUO) Teljes belső visszaverődés (TIRFM)



2008.10.02.


Világoslátótér



2008.10.02.


Sötétlátótér • Sötétlátóterű-/Ultramikroszkóp • Speciális kondenzorral a megvilágító fénykúp központi sugarát kitakarjuk, ezzel körkörösen oldalról világítva meg a mintát • A képalkotásban csak az indirekt fénysugarak vesznek részt, amik a minta részletein szóródva jutnak az objektívbe • Alkalmas kis fényszóró objektumok mozgásának vizsgálatára



2008.10.02.


Világoslátótér vs. Sötétlátótér



2008.10.02.


Polarizáció • Polarizációs mikroszkóp • Polarizátor (→lineárisan poláros fény) + rá 90° analizátor • Ideális pozíció: a polarizáció síkja és a tárgy optikai tengelye által bezárt szög 45° • Az izotróp részen áthaladva a polarizáció nem változik, viszont az anizotróp részen elliptikusan poláros fénnyé alakul • Az izotróp részeken áthaladó fény (az analizátor után) nem jut az objektívbe, de az elliptikusan poláros fény igen → csak a kettősen törő tárgyrészlet látszik



2008.10.02.


Polarizáció • A szín oka: az elliptikusan poláros fény esetében az ellipszis két tengelyének iránya és aránya hullámhossz-függő • Adott hullámhosszon lehet az ellipszis tengelye 0, ekkor a kilépő fény lineárisan poláros, a polarizáció iránya az analizátor polarizációs irányára merőleges → az analizátor kioltja a fényt az adott hullámhosszon: az adott tárgyrészlet színeként a kioltott sugarak kiegészítő színét látjuk • Alkalmas kettősen törő (t.i. bennük a fényre vonatkozó törésmutató (ill. terjedési sebesség) nem irányfüggetlen) anyagok vizsgálatára – az optikai anizotrópia mindig bizonyos rendezettséget mutató belső szerkezet következménye • Pl. kristályok és folyadékkristályos struktúrák (sejtmembrán, polimerek, harántcsíkolt izmok, stb.), vagy áramoltatással rendezett fonalszerű makromolekulák



2008.10.02.


Fáziskontraszt • Frits Zernike (1888 – 1966, holland fizikus) • Kontrasztnövelés átlátszó biológiai mintákban (pl. sejtek, szövetek, mikroorganizmusok) • A módszer a fény fázisában jelentkező (szabad szemmel nem látható) különbségeket alakítja át intenzitásbeli különbségekké



2008.10.02.


Fáziskontraszt • A nulladrendű (főmaximum) nyaláb amplitúdóját lecsökkentik, fázisát pedig késleltetik vagy siettetik 90° -kal • A kondenzorban gyűrűs üveglap világító kúppalástot formál → az objektív hátsó fókuszsíkjában gyűrű alakú diffrakciós maximumok láthatóak • Az objektív hátsó fókuszsíkjára gyűrű alakú fázislemez-réteg van párologtatva, amely • egyrészt elnyeli a direkt fény egy részét, • másrészt ±90° -os fáziseltolást végez (+: negatív, -: pozitív) • Pozitív kontraszt esetén jelentősen csökken a nagyobb törésmutatójú pontok intenzitása a környezetükkel azonos törésmutatójú pontokéhoz képest • A környezetüknél kisebb törésmutatójú pontokon fázissietés következik be, amelyet a fázisgyűrű kompenzál, így az ott áthaladó hullámok a szórt hullámokkal kb. azonos fázisban érkeznek, interferenciájuk erősítést eredményez → e pontok képe világosabb



2008.10.02.


forgatható polarizátor

Relief kontraszt

1%

kondenzor minta

15 %

objektív

modulátor



2008.10.02.


Nomarski Differential Interference Contrast (DIC)



2008.10.02.


Nomarski Differential Interference Contrast (DIC) • A hagyományos oblique és relief megvilágításra épülő kontrasztjavító eljárásokkal szemben a DIC csak a fókuszsíkban (DoF) növeli a kontrasztot, így a fókusz állításával optikailag szeletelhető a minta. • IR fény használata esetén (775nm vagy 900nm) akár >100µm mélyen is bele lehet látni a vastag mintába (pl. neurológiai kutatások, IRCCD!) • A Nomarski DIC a különböző törésmutatójú anyagokon áthaladó fényben keletkező fáziseltérésekből állít elő javított kontrasztot • Polarizátor → lineárisan poláros fény → Wollaston prizma → ordinárius és extraordinárius nyaláb (közöttük 90° fáziseltolás) külön úton → az egyik pl. a sejt egy részén halad át, így késik a másikhoz képest, ami pl. a sejt körüli anyagban halad → fáziseltolódás mindkét nyaláb esetén → újraegyesítés (interferencia) a második Wollaston prizmában → csak azok a fáziseltolt egyesített nyalábok jutnak át, amiknek van az analizátorhoz képest megfelelő rezgési síkú komponense →



2008.10.02.


Nomarski Differential Interference Contrast (DIC) • a térhatás-jellegű kép eléréséhez a DIC-prizma szabályozásával állítható a két (o/eo) nyaláb közötti fáziseltolás • a térhatású kép nem közvetlenül morfológiát tükröz, hanem fáziskülönbségeket, de van korreláció a morfológiával • A Nomarski DIC csak olyan anyagok esetében műköDIC, amik nem depolarizálnak (mint ahogyan azt teszi pl. a műanyag) • Műanyag Petri csésze vagy multiwell-plate esetén pl. Hoffman modulációs kontraszt vagy Relief kontraszt alkalmazható



2008.10.02.


Fluoreszcencia



2008.10.02.


Széleslátóterű fluoreszcens mikroszkópia • A fluoreszcens molekulák a minta meghatározott területein elhelyezett fényforrásként viselkednek, meghatározott színű fénnyel mutatva a helyzetüket. • Ezen indikátorok energiát igényelnek ahhoz, hogy fényt emittáljanak – ezt az energiát a mikroszkóp fényforrásából származó gerjesztő fény adja a fluorokrómnak. • Minden fluorokrómnak megvan a gerjesztéséhez szükséges meghatározott hullámhossz-tartománya (pl. FITC: kék, azaz kb. 480nm gerjesztés). • Ez két fényutat jelent, amiket el kell különíteni: • Egyrészt a gerjesztő fény a fényforrásból a mintára, • Másrészt az emittált fény a mintáról (fluorokróm) a detektorra. • Az elválasztást a Stokes-féle eltolódás (Stokes shift) teszi lehetővé, ami azt a tényt fogalmazza meg, hogy az emittált fluoreszcens fény hullámhossza általában hosszabb, mint a gerjesztő fény hullámhossza.



2008.10.02.


Széleslátóterű fluoreszcens mikroszkópia • Például a ‘kék’ gerjesztés ‘zöld’ emissziót eredményez a FITC fluorokróm esetében. • Minden fluorokrómnak megvan a saját gerjesztési és emissziós spektruma.



2008.10.02.


Széleslátóterű fluoreszcens mikroszkópia • A fluoreszcens aktivitás sematikus ábrája a Jablonski energiadiagrammal illusztrálható. • Az elnyelt fény energiája a fluorokróm elektronjait gerjeszti alapállapotból magasabb energiájú állapotba. • Ezek a kapott energia egy részét rezgési és forgási energiaként elhasználják, a maradékot pedig fluoreszcens fény formájában kisugározzák, miközben visszatérnek alapállapotú energiaszintjükre kb. 10ns alatt.



2008.10.02.


Széleslátóterű fluoreszcens mikroszkópia • A fókuszon kívülről érkező zaj kiszűrése • Dekonvolúció (matematikai képrekonstruáló eljárás, SW) • Struktúráltfényű megvilágítás (SW) • Spinning Disk (fókuszon kívüli információ részbeni maszkolása, Nipkov disk, DSU, HW) • TIRFM (Total Internal Reflection Microscopy, HW) • Konfokális apertura (fókuszon kívüli információ maszkolása pinhole-lal, CA, HW)



2008.10.02.


Mélységélesség összehasonlítás

Standard széles látótér

LSM

DSU

TIRFM © OLYMPUS Hungary Kft.


2008.10.02.


DSU optika CCD szűrőváltó

FS

D/M

Spinning disk

szűrőváltó

felülnézet

100% tükör oldalnézet obj © OLYMPUS Hungary Kft.


2008.10.02.


A DSU elmélete

Az Airy korong mérete függ az objektív nagyításától és NA-jától, valamint a hullámhossztól => a rések szélességét és távolságát az objektívhez kell igazítani © OLYMPUS Hungary Kft.


2008.10.02.


A DSU elmélete

Konfokalitás nélkül

1D konfokalitás (x-tengely)

1D konfokalitás (y-tengely)



2008.10.02.


DSU korong hatásfok

Gerjesztő fény 57%

DSU korong

W 5%

LL fluoreszcencia

L = 0.6R （R : Airy Disk）



W = 10R

2008.10.02.


X-Y Spatial resolution

M R  1.2 NA R：Airy Disk átmérője λ：hullámhossz M：nagyítás NA：objektív NA


Confocal Axial Resolution

dK

 2  NA   n 1  1       n  

Mélységélesség (DoF) Slit disk : Point scanning ＝0.95:0.67


száraz : n=1 vizes : n=1.33 olajos : n=1.5 Slit Disk : K=0.95 Point Scan: K=0.67

2008.10.02.


TIRFM



2008.10.02.


fedőlemez

objektív BFP (Back focal plane)

lézernyaláb © OLYMPUS Hungary Kft.


2008.10.02.


fedőlemez

objektív

BFP (Back focal plane)



2008.10.02.


Evanescent wave fedőlemez

objektív

BFP (Back focal plane)



2008.10.02.


Detektálási technológiák • • • • •

CMOS (Complementary metal–oxide–semiconductor) CCD (Charge Coupled Device) EMCCD (Electron Multiplier Charged Coupled Device) PMT (Photomultiplier Tube) APD (Avalanche photodiode)



2008.10.02.


Fejlett képalkotó technológiák és műszaki megoldások

• • • • •

cLSM (confocal Laser Scanning Microscopy) FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging) FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) MPE (Multi Photon Excitation Microscopy) ...



2008.10.02.


cLSM • A konfokális lézer pásztázó mikroszkóp fókuszált lézernyalábot használ a vizsgált minta kis területének megvilágítására. • A lézer frekvenciája az adott minta fluorokrómjára hangolva fluoreszcenciát gerjeszt, így a minta egy kis területéről érkező emissziós jel felfogható egy detektorral. • A konfokális lézer pásztázó mikroszkóp felbontását behatárolja azon pont mérete, amire a gerjesztő fény fókuszálható. • Ez a méret függ a használt rendszer optikai paramétereitől, de közelítőleg a gerjesztő nyaláb hullámhosszának nagyságrendjébe esik.



2008.10.02.


cLSM • A cLSM laterális felbontása • Az laterális felbontás tárgyalása olyan optika képalkotást ír le, ami a véges numerikus apertúrát és a fény hullámtermészetét is figyelembe veszi. • Az intenzitás eloszlását a ‘point spread function’ (PSF) írja le, ami egy optikai rendszer válaszát adja meg (így válasz-függvénynek is hívják). • Az első sötét gyűrű pozíciója azonos, de a csúcs keskenyebb – és a keskenyebb eloszlás jobb felbontást eredményez. Ennek oka az Airy-disk FWHM (‘full width at half maximum’) értéke, ami cLSM esetében 35%-kal jobb, mint a hagyományos mikroszkópnál. • Ebből adódik, hogy a cLSM elméleti felbontása: • rlateral = 0.4 λ / NA



2008.10.02.


cLSM • A laterális felbontás nagyon érzékeny a CA méretére és a megadott elméleti érték a gyakorlatban aligha érhető el. (Az Olympus 0.5-tel számol.) • A cLSM axiális felbontásának definíciója az elméletben: • A cLSM axiális felbontását az FWHM határozza meg, vagy a maximális irradiancia érték felénél mért irradiancia-eloszlás teljes szélessége, feltéve, hogy • A minta végtelenül vékony fluoreszcens minta. • A CA végtelenül kicsi. • Az optikai rendszer aberrációktól mentes. • Az axiális felbontás kevéssé érzékeny a CA méretére, így az a CA növelésével sem romlik jelentős mértékben.



2008.10.02.


A cLSM elv

tárgy

kép

fókuszsík



2008.10.02.


A cLSM elv

tárgy

kép

fókuszsík



2008.10.02.


A cLSM elv • A fókuszpontra ‘rárakódik’ a fókuszon kívüli pontok zaja → • Romlik a laterális és axiális felbontás • Romlik a kép kontrasztja • A konfokális mikroszkópban két pinhole van elhelyezve a konjugált fókuszsíkokban → • A fókuszpontra nem rakódik fókuszon kívüli zaj • A laterális és axiális felbontás javul • A kép kontrasztja javul • Lehetővé válik az optikai szeletelés



2008.10.02.


A cLSM elv • Conjugated Focalplanes (CONFOCal): mezőrekesz – és képsík • Pinhole a képsíkban • Lézernyaláb a mezőrekesz síkjára fókuszálva (a pinhole itt szükségtelen)



2008.10.02.


cLSM fényforrás – a lézer • LASER: • Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation • A gázkeverékben az atomokat energiával gerjesztik (pl. fényvillanásokkal) → koherens (azonos fázisú) fény. A lézertubus két végén speciális tükrök → a fény intenzitása nő és lézertől függően egy vagy több hullámhossz képződik.



2008.10.02.


cLSM lézervezérlés – AOTF • AOTF: • Acoustic Optical Tuneable Filter • Egy piezzo elem állóhullámokat hoz létre egy kristályban. Ez a hullám elhajlítja a beérkező fénynyalábot. Az eltérítés mértéke függ a fény hullámhosszától és az állóhullám frekvenciájától. • A látható tartományban minden lézervonal manipulálható. • A gerjesztő fény be- és kikapcsolása, valamint vezérlése a µs tartományban végezhető.



2008.10.02.


cLSM képalkotás – lézer pásztázás • A pásztázás folyamata : • A fókuszált lézernyalábot galvano tükrök végigvezetik a megadott útvonalon a minta kiválasztott területén • Pásztázás során a fluoreszcnes jelet pontonként kiolvassák és a pontokból képet formálnak • Mivel a mintát vonal mentén pásztázzák, a pásztázási pozíciót szinkronizálni kell a detektorral.



2008.10.02.


cLSM detektálás – PMT

• PMT • Photomultiplier Tube • A beérkező fényenergia hatására elektronok szabadulnak el a PMTben. • Az alkalmazott magasfeszülség (HV) az elektronokat dinódáról dinódára vezeti. Az elektronok energiája újabb elektronokat szabadít fel (erősítés). • Több dinóda alkalmazásával, hatékony jelerősítés érhető el (avalanche effektus). • Az erősítés mértéke függ a dinódák között alkalmazott feszültségtől. A PMT kimenő jele analóg áram.



2008.10.02.


cLSM detektálás – PMT • A fotoelektron-sokszorozó (PMT) nem ‘lát’ színeket. A jelhez tartozó színt szoftveres úton rendelik a mért intenzitásértékhez (‘false colour’). • A PMT analóg jel-árama mégegy erősítésen átesik (elektronikus erősítés, gain). • A pásztázott kép minden pixele megfeleltethető a jel-áram egy időpontjában felvett értékével = szinkronizáció.

• Képalkotás során két módon javítható a kép minősége: • Nagy intenzitású gerjesztő fény • Nagy erősítés a PMT-n


 erős fakító (bleaching) hatás a mintán

 zajos kép


2008.10.02.


Olympus FV1000S



2008.10.02.


cLSM Alkalmazások - FRAP • FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) • A FRAP egy eljárás molekuláris mozgások elemzésére. • Mérhető vele diffúziós ráta, molekulák szeparációs sebessége, stb. • A sejt egy kiválasztott területén fakítják (bleaching) a fluorokrómot, majd képsorozatot rögzítenek a sejtről (XYt). • Új fakulatlan (unbleached) fluorokrómok diffúziója vagy transzportációja jelentkezik a kiválasztott területen. • Az eredmény: a fluoreszcens jel felépülése (recovery) vizsgálható és mérhető. • A teljes fakulásra elvégzett korrekciót követően megkapható a fluoreszcens felépülés görbéje.



2008.10.02.


cLSM Alkalmazások - FRET • FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) • A FRET jelenség során fluoreszcens molekulák gerjesztési energiája transzferálódik más fluoreszcens molekulákhoz az átviteli hatásfok (transfer efficiency) mértékében, a két molekula relatív pozíciójától függően. • A FRET lehetővé teszi pl. két protein molekula közötti kölcsönhatás vizsgálatát, struktúrális változások elemzését és a sejtbeli kálcium-koncentrációról történő képalkotást.



2008.10.02.


cLSM Alkalmazások - FLIP • FLIP (Fluorescence Loss In Photobleaching) • Egy sejt kis területén folyamatosan fakítják a fluorofórt. • A kiválasztott területen kívülről a területre érkező fakítatlan fluorofórok mozgásából meghatározható a fluorofórok koncentrációjának csökkenése a sejt más részein. • Az intenzitás csökkenését mérve a fakított területen kívül egy csökkenő görbe (decay curve) mutatkozik.



2008.10.02.


cLSM Alkalmazások - FLIM • FLIM (Fluorescence Lifetime Imaing) • A fluoreszcens élettartam a fluoreszcens emisszió időbeli alakulását mutatja, ami a fluorofórok karakterisztikus jellemzője. • Az időfüggő (time-resolved) fluoreszcens mikroszkópia lehetővé teszi a fluorofórok vagy azok kémiai környezetének pontosabb megismerését. Az eljárás lényege, hogy nem csak a fluoreszcens intenzitást monitorozza, hanem a fluoreszcens emisszió időbeli fejlődését is. • A fluorofórnak bizonyos időre van szüksége ahhoz, hogy a gerjesztett állapotból alapállapotba térjen vissza. • E folyamat kvantumtermészeténél fogva a fluoreszcens foton kibocsátása a fluorokrómokból nem egy meghatározott időben történik, hanem egy időbeli eloszlás szerint. Ez az eloszlás egy exponenciális csökkenő (decay) függvénnyel írható le.



2008.10.02.


cLSM Alkalmazások - FLIM • E csökkenő görbe (decay) karakterisztikus időállandója – a fluoreszcens élettartam – a néhány pikoszekundum (ps, 10-12 s) és több tíz nanoszekundum (ns, 10-9 s) közötti tartományban van. • A karakterisztikus élettartam a fluorofór jellemzője. Ennek ellenére nem mindig állandó, mivel befolyásolhatja a környezet kémiai összetétele. • Ennek oka, hogy a gerjesztet fluorofór nem szükségszerűen emittálja fluoreszcens fényként a gerjesztő energiát, például azt átadhatja más molekuláknak is. Ez a folyamat (quenching) hatással van a fluoreszcens élettartamra, így a kémiai környezetről is nyerhető információ. • Az energia fluorofórok között is átadódhat – e folyamatot fluoreszcens rezonancia energiatranszfernek (fluorescence resonance energy transfer, FRET) nevezzük.



2008.10.02.


FLIM Alkalmazások • • • • • •

Oxigén, víz vagy Ca2+ koncentráció pH érték Távolságok nanométeres skálán Sejtek közötti jelátvitel (intracellular signal transduction) Molekuláris struktúra és dinamika ...

• A FLIM mérés kombinálható a FRET méréssel. A FRET mérésnél használt fluoreszcens élettartam alkalmazásával elkerülhetőek a fluoreszcens emisszió intenzitás-fluktuációjával kapcsolatos problémák.



2008.10.02.


FCS • FCS (Fluorescence correlation spectroscopy) • Ez a mérési eljárás molekuláris jellemzők (diffúzió és oldatbeli koncentráció) mérésére használható egymolekula-szinten. • Az eljárás rögzíti a fluoreszcens emisszió intenzitásának időbeli változásait, amit azon egyedi fluorfórok váltanak ki, amelyek áthaladnak a gerjesztett térfogaton. • Ezen intenzitásváltozások kvantifikálhatóak erősség és időtartam szerint a rögzített intenzitás-jel időbeli autokorrelációjával.



2008.10.02.


FCS Alkalmazások • • • • • • •

Molekuláris asszociáció és disszociáció A minta koncentrációjának mérése femtoliteres térfogatban Fluorofórok laterális és rotációs diffúziójának vizsgálata Konformáció-dinamika Kinetikus rátaállandó mérése Enzim- és intracelluláris dinamika in vitro, vagy akár élő sejtben ...

• Az FCS méréshez alapvetően folyamatos hullámú lézer szükséges, azonban pulzus üzemű lézerek használata esetén még szofisztikáltabb lehetőségek válnak elérhetővé, mint pl. az időkapus (timegated) FCS vagy a fluoreszcens élettartam FCS (FLCS). • Az FLCS alkalmazható pl. a detektor hibáinak (pl. afterpulsing) korrigálására vagy a szóródás járulékának (scattering contribution) meghatározására. • Az FLCS lehetővé teszi a koncentráció és két átlapoló emissziós spektrumú, de különböző élettartamú festék diffúziós sebességének egyidejű monitorozását egyetlen detektor használatával. © OLYMPUS Hungary Kft.


2008.10.02.


További cLSM Alkalmazások • Photo Stimulation • 3D Imaging • PA-GFP (Photo Activatable-Green Fluorescent Protein) Fluorescent protein PA-GFP can be used to mark targeted cells, organelles and proteins. • Spectral Unmixing • Colocalization • Uncaging • TIRFM (Total Internal Reflection Microscopy) • MPE (Multi Photon Excitation) • ...



2008.10.02.


OLYMPUS cLSM rendszerek Magyarországon

• • • • • • • • •

ELTE TTK Biológiai Intézet (Dr. Matkó János) OGYK Sejtbiológiai Kutató Laboratórium (Dr. Homolya László) MTA KOKI (Dr. Nusser Zoltán, Dr. Vizi E. Szilveszter, Dr. Rózsa Balázs) MTA KKKI (Dr. Lasztóczy Bálint) MTA SZBK Cellular Imaging Laboratórium (Dr. Ferhan Ayaydin) SZTE ÁOK Orvosi Biológia (Dr. Szabad János, Dr. Belecz István) DE OEC Anatómiai Intézet (Dr. Antal Miklós) DE OEC Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet (Dr. Vámosi György) PTE ÁOK Orvosi Biológia (ifj. Dr. Sétáló György)



2008.10.02.


Neuron Image in depth – 2PE

MPE Surface

Cerebellum/Purkinje

400mm

Cerebral cortex Astroglia

FV1000MPE Image Files XYZ stack 700 µm deep - 4 µm steps (AVI File 180 MB / 16 MB) H. Waki, T.Nemoto, J.Nabekura, Nat. Inst. F. Physiological Sciences, Nat. Inst. Of Natural Sciences, Japan


800mm

Cerebral cortex Blood vessels Bevezető fejezetek a mikroszkópia elemeinek alapjaiból

2008.10.02.


1 foton

2 foton Gerjesztett állapot

Gerjesztő fény

Gerjesztő fény

Fluoreszcencia

Fluoreszcencia

Alapállapot

Kb. fél energia (=dupla frevencia) Két foton egyidejű elnyelése

Egy foton elnyelése

>300kW < 100mW

100fs © OLYMPUS Hungary Kft.


2008.10.02.


2-foton gerjesztés Két foton elnyelésének valószínűsége kevesebb, mint 1 : 100.000.000 az egy foton elnyeléséhez képest

Nagy energiájú rövid pulzus gerjesztés Femtoszekundumos IR lézerrel a kétfoton-abszorpció feltételeinek előállításához

Mennyi idő a Femtoszekundum ? -15

= 10


-13

sec = 0,000 000 000 000 001 sec - IR Pulzus ≈ 100fs = 10


sec

2008.10.02.

Csúcstechnológiai vizsgálómódszerek 2-foton gerjesztés Ti:Sapphire IR Lézer – fontosabb adatok: Hangolható hullámhossz (690 – 1080nm max.) a nyaláb átmérője enyhén változik - a nyaláb finomhangolása szükséges 80 – 90 MHz ismétlési ráta = 80 - 90.000.000 pulzus per mp

Időbeli reláció: Pulse 1

– :

Intervall 10.000

– :

Pulse 1

:

Intervall 10.000

:

Pulse 1

170 – 330 kW csúcsintenzitás = 100 Mio x nagyobb intenzitás a konstans hullámú lézerekhez képest (1 – 30 mW) ≈ 1,5 W @ 800 nm (referencia hullámhossz) © OLYMPUS Hungary Kft.


2008.10.02.




2008.10.02.


2-Photon excitation - high photon density in the focal point • • •

no excitation outside the focal point & less optical damage acquire intensity image of optical cross section without pinhole - “focal excitation” laser stimulation & bleaching in focal point / focal plane

Illumination

Multi Photon

Single Photon

Multi Photon

Single Photon Uncaged outside focal point

Excitation area

Sample © OLYMPUS Hungary Kft.

Caged compound Bevezető fejezetek a mikroszkópia elemeinek alapjaiból

Uncaged local focal point Not uncaged outside focal point 2008.10.02.


STED

• Stimulated Emission Depletion • Technique that uses the non-linear de-excitation of fluorescent dyes to overcome the resolution limit imposed by diffraction. • Stimulated Emission Depletion microscopy reduces the size of the excited region by using a very short excitation pulse which is immediately followed by a "depletion" pulse, tuned to an emission line of the fluorescent dye. This depletion pulse causes stimulated emission, moving electrons from the excited state (from which fluorescence occurs) to a lower energy state. The wavefront of the depletion beam is altered in such a way that it is focused to a ring instead of a spot, featuring a dark spot of zero laser intensity in the center. While this dark spot is itself diffraction-limited, the intensity distribution is continuous and is zero only at the center. Therefore, using a bright depletion pulse causes almost all of the electrons excited by the excitation pulse to return to the ground state, leaving only the region of the sample very close to the axis of the depletion beam excited. After both pulses have been sent, fluorescence from the remaining excited dye molecules is detected by the microscope. © OLYMPUS Hungary Kft.


2008.10.02.


STED • While the blue excitation (EXC) beam is focused to a diffraction-limited excitation spot, shown in the adjacent panel in blue, the orange STED beam is able to de-excite molecules. The STED beam is phase-modulated to form the focal doughnut shown in the top right panel. Superimposition of the two focal spots confines the area in which fluorescence is possible to the doughnut centre, yielding the effective fluorescent spot of subdiffraction size



2008.10.02.


STED • The spot size and hence the resolution r of a STED microscope follows a new law, where • - wavelength • n sin - NA of lens • I - maximal focal intensity applied for STED • Isat - characteristic value at which the fluorescence probability is reduced to ~1/e • Unlike in a confocal or epifluorescence light microscope, here • for I/Isat → ∞ it follows that r → 0, meaning that the resolution is no longer limited by diffraction.



2008.10.02.


AJÁNLOTT IRODALOM

• Kísérleti fizika III. (Budó-Mátrai, Tankönyvkiadó, 1989) • Orvosi biofizika (Damjanovich-Fidy-Szöllősy, Medicina, 2006) • • • • •

http://www.olympusmicro.com/primer/ http://www.olympusfluoview.com/ http://www.olympus.hu/microscopy(/4427_7436.htm) http://www.emccd.com/ ...



2008.10.02.


Köszönöm a figyelmet.



2008.10.02.

OLYMPUS Hungary Kft. Mikroszkóp Divízió. A mikroszkópia alapjai

Recommend Documents