SKRINING SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHYSM rs855791 (C>T) PADA MAHASISWA PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA UNTUK MENGETAHUI KEMUNGKINAN MENDERITA IRON REFRACTORY DEFICIENCY ANEMIA DENGAN MENGGUNAKAN TEKNIK REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTIONHIGH RESOLUTION MELT
Laporan Penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA KEDOKTERAN
OLEH : Amatillah Raifah NIM: 1112103000024
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 1436 H/2015 M
LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA Dengan ini saya menyatakan bahwa: 1. Laporan penelitian ini merupakan hasil karya asli saya yang diajukan untuk memenuhi salah satu persyaratan memperoleh gelar Strata 1 di Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta. 2. Semua sumber yang saya gunakan dalam penulisan ini telah saya cantumkan sesuai dengan ketentuan yang berlaku di UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. 3. Jika dikemudian hari terbukti bahwa karya ini bukan karya asli saya atau merupakan hasil jiplakan dari karya orang lain, maka saya bersedia menerima sanksi yang berlaku di UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Ciputat, 16 Oktober 2015
Amatillah Raifah
ii
LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING SKRINING SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHYSM rs855791 (C>T) PADA MAHASISWA PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA UNTUK MENGETAHUI KEMUNGKINAN MENDERITA IRON REFRACTORY DEFICIENCY ANEMIA DENGAN MENGGUNAKAN TEKNIK REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION-HIGH RESOLUTION MELT Laporan Penelitian Diajukan kepada Program Studi Pendidikan Dokter Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan untuk Memenuhi Persyaratan Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran (S. Ked)
Oleh Amatillah Raifah NIM: 1112103000024
Pembimbing I
Pembimbing II
Chris Adhiyanto, S.Si, M.Biomed, PhD
dr. Nouval Shahab, Sp.U, FICS, PhD, FACS
NIP: 19721103 200604 1 001
NIP: 19690511 200312 1 001
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 1436 H/2015 M iii
LEMBAR PENGESAHAN Laporan Penelitian berjudul SKRINING SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHYSM rs855791 (C>T) PADA MAHASISWA PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA UNTUK MENGETAHUI KEMUNGKINAN MENDERITA IRON REFRACTORY DEFICIENCY ANEMIA DENGAN MENGGUNAKAN TEKNIK REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION-HIGH RESOLUTION MELT yang diajukan oleh Amatillah Raifah (NIM 1112103000024), telah diujikan dalam sidang di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan pada tanggal 16 Oktober 2015. Laporan penelitian ini telah diperbaiki sesuai dengan masukan dan saran penguji, serta telah diterima sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Kedokteran (S. Ked) pada Program Studi Pendidikan Dokter. Ciputat, 16 Oktober 2015 DEWAN PENGUJI Ketua Sidang
dr. Nouval Shahab, Sp.U, FICS, PhD, FACS NIP: 19721103 200604 1 001 Pembimbing I
Pembimbing II
Chris Adhiyanto, S.Si, M.Biomed, PhD NIP: 19690511 200312 1 001
dr. Nouval Shahab, Sp.U, FICS, PhD, FACS NIP: 19721103 200604 1 001
Penguji I
Penguji II
dr. Mukhtar Ikhsan, Sp.P(K), MARS NIP. 19540406 198111 1 001
Nurlaely Mida R., S.Si, M. Biomed, DMS NIP. 19671119 200501 2 001
PIMPINAN FAKULTAS Dekan FKIK UIN
Kaprodi PSPD
Dr. Arif Sumantri, S.K.M., M.Kes NIP.19650808 198803 1 002
dr. Achmad Zaki, M.Epd, Sp.OT NIP. 19780507 200501 1 005
iv
KATA PENGANTAR
Assalamualaikum wr. wb. Puji syukur peneliti panjatkan kepada Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penelitian ini dapat diselesaikan dengan baik. Shalawat serta salam tidak lupa peneliti sampaikan kepada Nabi Muhammad SAW beserta keluarga dan sahabatnya. Alhamdulillahi rabbil ‘alamin, penelitian ini telah selesai, dan akan sulit terselesaikan jika tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, saya mengucapkan banyak terima kasih kepada: 1.
Prof. Dr. H. Arif Sumantri, M.Kes
selaku
Dekan
Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 2.
dr. Achmad Zaki, M.Epd, Sp.OT selaku Kepala Program Studi Pendidikan Dokter FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
3.
Chris Adhiyanto, S.Si, M.Biomed, PhD dan dr. Nouval Shahab, SpU, Ph.D, FICS, FACS selaku dosen pembimbing yang telah membimbing, mengarahkan, dan memberikan dukungan kepada peneliti mulai dari awal hingga akhir penelitian.
4.
dr. Mukhtar Ikhsan, Sp.P(K), MARS dan Nurlaely Mida R., S.Si, M. Biomed, DMS selaku penguji sidang laporan penelitian ini.
5.
dr. Nouval Shahab, SpU, Ph.D, FICS, FACS dan dr. Flori Ratna Sari, Ph.D. selaku penanggung jawab riset Program Studi Pendidikan Dokter angkatan 2012 yang telah memberikan motivasi untuk dapat menyelesaikan penelitian tepat pada waktunya.
6.
dr. Fika Ekayanti, M.Med Ed selaku pembimbing akademik yang telah sabar menasehati dan memberikan dukungan dalam proses pembelajaran di Program Studi Pendidikan Dokter.
7.
Kedua orang tua saya yang tercinta, terhebat, ayahanda alm. H. Asy’ari, S.Ag dan ibunda DR. Hj. Lailial Muhtifah, M.Pd yang selalu memberikan dukungan kepada peneliti baik moral maupun v
materil. 8.
Keempat saudara kandung saya, Hadiatus Sa’adah, S.Pdi, Ummi Fauziah, S.Pd, Nur Rahmiani, S.KM, Niya Latul Muna, S.Kom serta seluruh keluarga besar saya yang senantiasa membuat saya semangat dan kuat dalam mengikuti proses pembelajaran di Program Studi Pendidikan Dokter FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
9.
Rafiqy Sa’adiy Faizun yang selalu menasehati, mendukung, dan memotivasi peneliti.
10.
Untuk teman seperjuangan kelompok penelitian saya, Nurul Hasanah, Hipni Solehudin, Rizky Ananda Prawira, dan Adamilzary Fikry yang berjuang bersama.
11.
Untuk Mba Ai dan Mba Sur selaku Laboran yang ikut membantu saya dalam melakukan penelitian ini.
12.
Untuk Sahabat terdekat saya Ranita, Harlia, Amel, Melia, Binayu, Silvi, dan Barbie Anis, Muthi, Putri, Fitri yang selalu memberikan dukungan.
13.
Untuk Official CIMSA UIN 2014-2015 Adit, Fiizhda, Octa, Firda, Reni, Dewi, Shaby, Raka, Linda, Eel, Galang, Ijul, Nadya, Hylman, dan SCOMEDIAN CIMSA UIN yang senantiasa memberikan dukungan kepada peneliti.
14.
Untuk seluruh mahasiswa PSPD 2012 hingga 2014 yang bersedia menjadi responden dalam penelitian ini.
15.
Untuk semua pihak yang tidak dapat saya sebutkan satu persatu. Peneliti menyadari bahwa laporan penelitian ini masih terdapat
ketidaksempurnaan. Oleh karena itu, peneliti mengharapkan kritik dan saran yang membangun bagi penelitian ini. Semoga penelitian ini dapat bermanfaat bagi masyarakat dan para pembaca. Ciputat, 16 Oktober 2015 Peneliti vi
ABSTRAK Amatillah Raifah. Program Studi Pendidikan Dokter. Skrining Single Nucleotide Polymorphysm rs855791 (C>T) pada Mahasiswa Program Studi Pendidikan Dokter Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta untuk Mengetahui Kemungkinan Menderita Iron Refractory Deficiency Anemia dengan Menggunakan Teknik Real Time Polymerase Chain ReactionHigh Resolution Melt. SNP rs855791 (TMPRSS6) diketahui menyebabkan produksi berlebihan dari hepsidin yang dapat menyebabkan penurunan penyerapan zat besi pada Iron Refractory Deficiency Anemia. Untuk mengetahui frekuensi SNP rs855791 dan hubungannya dengan tingkat Hb, sebuah studi asosiasi genom dilakukan di UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Sampel diperoleh dari mahasiswa Program Studi Pendidikan Dokter angkatan 2012-2014 (N=102). Metode yang digunakan adalah High Resolution Melt (HRM) dengan menggunakan Light Cycler 480® Roche untuk skrining Iron Refractory Deficiency Anemia dan pemeriksaan kadar hemoglobin menggunakan Easy Touch® GCHb meter. Hasilnya, frekuensi genotip SNP rs855791 (C> T) adalah wildtype (3,9%), heterozigot (72,5%), dan mutan (23,5%). Hasilnya tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan antara genotip dengan kadar hemoglobin (p=0,818) dan anemia (p =0,466). Fragmen DNA sampel menunjukkan 1 delesi dan double-hetero di urutan basa lainnya yang menyebabkan perbedaan dalam penelitian ini. Kata Kunci : HRM-PCR, IRIDA, rs855791, TMPRSS6
vii
ABSTRACT Amatillah Raifah. Medical Education Study Program. Screening Single Nucleotide Polymorphysm rs855791 (C>T) on Student of Medical Education Study Program of State Islamic University Syarif Hidayatullah Jakarta Grade 2012-2014 to Know Iron Refractory Deficiency Anemia Possibility Using Real Time Polymerase Chain Reaction-High Resolution Melt Technique. SNPs rs855791 (TMPRSS6) is known to cause excessive production of hepcidin that may lead to decreased iron absorption in Iron Refractory Deficiency Anemia. To know the frequency of SNP rs855791 and its relationship with the levels of Hb, a genome-wide association studies was conducted in UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Samples was obtained from student of Medical Education Study Program grade 2012-2014 (N=102). The method was used High Resolution Melt (HRM) by using Light Cycler 480® Roche for screening Iron Refratory Deficiency Anemia and hemoglobin level examination using Easy Touch® GCHb meters. The result, frequency of genotyping SNPs rs855791 (C>T) is wildtype (3,9%), heterozygote (72,5%), and mutant (23,5%). The result did not show any significant difference between genotyping with hemoglobin levels (p=0,818) and anemia (p = 0,466). The sequence of DNA sample shows 1 deletion and double-hetero in other base sequence causes the difference in this study. Key Words : HRM-PCR, IRIDA, rs855791, TMPRSS6
viii
DAFTAR ISI
LEMBAR JUDUL ..................................................................................................... i LEMBAR PERNYATAAN ..................................................................................... ii LEMBAR PERSETUJUAN ................................................................................... iii LEMBAR PENGESAHAN .................................................................................... iv KATA PENGANTAR .............................................................................................. v ABSTRAK ............................................................................................................. vii ABSTRACT ............................................................................................................ viii DAFTAR ISI ............................................................................................................ ix DAFTAR GAMBAR ............................................................................................... xi DAFTAR TABEL .............................................................................................. xii DAFTAR SINGKATAN .......................................................................................xiii DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ xiv BAB 1 PENDAHULUAN ....................................................................................... 1 1.1 Latar Belakang .................................................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah ............................................................................................... 2 1.3 Hipotesis ............................................................................................................. 3 1.4 Tujuan ................................................................................................................. 3 1.5 Manfaat Penelitian .............................................................................................. 3 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................. 4 2.1 Landasan Teori ................................................................................................... 4 2.1.1 Genomik ..................................................................................................... 4 2.1.1.1 Kajian Islam Tentang Larangan Menikah Sedarah ..................... 5 2.1.2 Anemia ....................................................................................................... 6 2.1.2.1 Kajian Islam Tentang Makanan yang Halal Lagi Baik ............... 7 2.1.3 Siklus Hidup Eritrosit ................................................................................ 8 2.1.4 Metabolisme Zat Besi ................................................................................ 9 2.1.5 Iron Refractory Deficiency Anemia (IRIDA) .......................................... 11 2.1.6 Regulasi Ekspresi Hepsidin ..................................................................... 14 2.1.7 Isolasi Genom .......................................................................................... 16 2.1.7.1 Persiapan untuk Human Genomic DNA .................................... 16 2.1.8 Polymerase Chain Reaction (PCR) ......................................................... 20 2.1.9 Metode High Resolution Melt (HRM) ..................................................... 21 2.1.9.1 Analisis HRM .............................................................................. 22 2.2 Kerangka Teori ................................................................................................. 27 2.3 Kerangka Konsep .............................................................................................. 28 2.4 Definisi Operasional ......................................................................................... 28 BAB 3 METODE PENELITIAN ........................................................................ 30 3.1 Desain Penelitian .............................................................................................. 30 3.2 Lokasi dan Waktu Penelitian ............................................................................ 30 3.3 Populasi dan Sampel ......................................................................................... 30 3.3.1 Populasi Terjangkau ................................................................................ 30 ix
3.3.2 Kriteria Pemilihan .................................................................................... 30 3.3.3 Perkiraan Besar Sampel ........................................................................... 31 3.3.4 Teknik Pemilihan Sampel ........................................................................ 31 3.4 Alat dan Bahan Uji ........................................................................................... 31 3.5 Cara Kerja Penelitian ........................................................................................ 33 3.5.1 Pengumpulan Data ................................................................................... 33 3.5.2 Desain GBlock dan Primer ...................................................................... 33 3.5.3 Isolasi DNA ............................................................................................. 36 3.5.4 Real Time PCR-HRM ............................................................................. 38 3.5.5 Analisis Data ............................................................................................ 40 3.5.6 Etika Penelitian ........................................................................................ 41 3.5.7 Alur Penelitian ......................................................................................... 42 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................ 43 4.1 Hasil .................................................................................................................. 43 4.1.1 Hasil Isolasi Genom DNA dari Whole Blood .......................................... 43 4.1.2 Data Karakteristik Responden ................................................................. 43 4.1.3 Hasil Pengukuran Kadar Hemoglobin ..................................................... 45 4.1.4 Hasil Analisis Kurva HRM ...................................................................... 45 4.1.4.1 Analisis Kurva Genotyping (Wildtype, Heterozygote, dan Mutant) ....................................................................................... 45 4.1.5 Hasil Hubungan Jenis Kelamin dengan Kadar Hemoglobin .................. 46 4.1.6 Hasil Hubungan Jenis Kelamin dengan Kategori Kadar Hemoglobin ... 47 4.1.7 Hasil Hubungan Jenis Kelamin dengan Genotyping (Wildtype, Heterozygote, dan Mutant) ....................................................................... 47 4.1.8 Hasil Hubungan Genotyping (Wildtype, Heterozygote, dan Mutant) dengan Kadar Hemoglobin ...................................................................... 48 4.1.9 Hasil Hubungan Genotyping (Wildtype, Heterozygote, dan Mutant) dengan Kategori Kadar Hemoglobin ....................................................... 49 4.2 Pembahasan ...................................................................................................... 50 4.3 Kelebihan Penelitian ......................................................................................... 52 4.4 Keterbatasan Penelitian .................................................................................... 52 BAB 5 SIMPULAN DAN SARAN ...................................................................... 54 5.1 Simpulan ........................................................................................................... 54 5.2 Saran ................................................................................................................. 54 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................ 55 LAMPIRAN ........................................................................................................... 58
x
DAFTAR GAMBAR Gambar 2.1 Eritropoesis ........................................................................................... 9 Gambar 2.2 Sintesis Hemoglobin pada Pembentukan Sel Darah Merah ................ 12 Gambar 2.3 Letak Gen TMPRSS6 .......................................................................... 13 Gambar 2.4 Siklus Zat Besi – Mekanisme Adaptasi Tubuh pada Defisiensi Besi . 15 Gambar 2.5 Ekspresi gen HAMP ............................................................................ 15 Gambar 2.6 Analisis data HRM dari SNP tipe 4 (A/T) .......................................... 25 Gambar 2.7 Kerangka Teori .................................................................................... 27 Gambar 2.8 Kerangka Konsep ................................................................................ 28 Gambar 3.1 Alur Penelitian ..................................................................................... 42 Gambar 4.1 Rerata Kadar Hemoglobin Menurut Jenis Kelamin ............................. 46 Gambar 4.2 Rerata Kadar Hemoglobin Menurut Genotyping (Wildtype, Heterozygote, dan Mutant) ...................................................................................... 49
xi
DAFTAR TABEL Tabel 2.1 Kadar hemoglobin berdasarkan usia menurut WHO, Hb dalam (g/L) ..... 8 Tabel 2.2 Klasifikasi anemia berdasarkan morfologi dan etiologi ........................... 8 Tabel 2.3 Proporsi relatif besi didalam tubuh pada dewasa muda sehat ................. 10 Tabel 2.4 Konsentrasi DNA yang Dianjurkan untuk Berbagai Template ............... 26 Tabel 2.5 Definisi Operasional ............................................................................... 28 Tabel 3.1 Alat dan Bahan Penelitian ....................................................................... 31 Tabel 3.2 Tahapan Isolasi Genom DNA ................................................................. 37 Tabel 3.3 Parameter PCR yang direkomendasikan untuk Light Cycler 480® System PCR Run ...................................................................................................... 39 Tabel 4.1 Karakteristik Jenis Kelamin Responden ................................................. 44 Tabel 4.2 Karakteristik Usia Responden ................................................................. 44 Tabel 4.3 Indeks Massa Tubuh Responden ............................................................ 44 Tabel 4.4 Kategori Kadar Hemoglobin Responden ................................................ 45 Tabel 4.5 Genotyping SNP rs855791 dari genom DNA responden ....................... 46 Tabel 4.6 Distribusi Frekuensi Kategori Kadar Hemoglobin Berdasarkan Jenis Kelamin .................................................................................................................... 47 Tabel 4.7 Distribusi Frekuensi Kategori Genotyping menurut Jenis Kelamin ........ 48 Tabel 4.8 Distribusi Frekuensi Genotyping Menurut Kategori Kadar Hemoglobin 49
xii
DAFTAR SINGKATAN BFU-E BMP CFU-E EPO Hb HJV HRM IRIDA MT2 PCR SNP TfR1 TfR2 TMPRSS6 WHO ᵹ-ALAD
Burst Forming Unit-Erythroid Bone Morphogenetic Protein Colony Forming Unit-Erythroid Erythropoetin Hemoglobin Hemojuvelin High Resolution Melt Iron Refractory Deficiency Anemia Matriptase-2 Polymerase Chain Reaction Single Nucleotide Polymorphysm Transferin Receptor 1 Transferin Receptor 2 Transmembran Protease, Serin 6 World Health Organization Delta Aminolevulenat Dehidratase
xiii
DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Lembar Persetujuan Responden ............................................................. 58 Lampiran 2. Lembar Tanda Terima Komisi Etik Penelitian ...................................... 59 Lampiran 3. Fragmen gBlock dan Primer ................................................................... 60 Lampiran 4. Alat dan Bahan Penelitian ...................................................................... 61 Lampiran 5. Gel Documentation hasil Elektroforesis Agarose dari Isolasi Genom DNA Sampel .................................................................................................. 63 Lampiran 6. Hasil Kemurnian dan Konsentrasi DNA Sampel .................................. 64 Lampiran 7. Hasil Kurva HRM dan Sekuensing ........................................................ 67 Lampiran 8. Hasil Analisis Statistik ........................................................................... 73 Lampiran 9. Curriculum Vitae Peneliti ....................................................................... 87
xiv
BAB 1 PENDAHULUAN 1.1.
Latar Belakang Anemia sangat banyak terjadi di berbagai negara belahan dunia. Menurut
WHO dari tahun 1993 hingga 2005, secara global anemia mengenai 1,62 juta orang.1 Prevalensi tertinggi terjadi pada anak usia pra sekolah sebesar 47,4 % dan paling rendah pada laki-laki 12,7 %. Namun untuk jumlah populasi yang paling banyak terkena adalah perempuan tidak hamil yakni sekitar 468 juta di dunia. Di Indonesia, anemia gizi besi masih merupakan masalah kesehatan masyarakat dengan prevalensi pada anak balita sebesar 28,1 %, anak 5-12 tahun 29 %, ibu hamil 37,1 %, remaja perempuan 13-18 tahun dan perempuan usia subur 15-49 tahun masing-masing sebesar 22,7%.2 Masalah anemia defisiensi besi sebagian besar di saluran gastrointestinal. Penurunan absorbsi besi dapat terjadi pada penyakit inflammatory bowel disease, gastritis atrofi, infeksi Helicobacter pylori, dan setelah dilakukan tindakan pembedahan seperti gastrectomi, duodenal bypass, bariatric surgery. Kehilangan darah kronik seperti pada esofagitis, gastritis erosif, ulkus peptikum, divertikulitis, tumor jinak, kanker intestinal, hemorrhoids, infestasi cacing, menstruasi yang banyak, menorrhagia, hemolisis intravaskular, schistomiasis kronik, dan sindrom munchausen juga dapat menjadi penyebab. Konsumsi obat-obatan seperti glukokortikoid, salisilat, NSAIDs, dan PPI sama dapat menyebabkan anemia. Pada keadaan bayi baru lahir, remaja, perempuan yang sedang menstruasi, kehamilan, konsumsi besi yang kurang, malnutrisi, dan diet pada vegetarian dapat menyebabkan anemia. Asupan zat besi yang kurang dan perdarahan akibat infeksi cacing merupakan salah satu penyebab yang banyak di negara berkembang.3 Pada anemia hemolitik herediter, anemia dapat terjadi pada difisiensi enzim glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD). Anemia dapat terjadi pada gangguan sintesis pembentukan rantai globin, yakni pada penyakit talasemia. Timbal dapat mengganggu fungsi enzim delta aminolevulenat dehidratase (ᵹALAD) yang dapat menyebabkan anemia. Salah satu penyebab genetik lainnya yang baru-baru ini ditemukan adalah Iron Refractory Iron Deficiency Anemia 1
2
(IRIDA) merupakan anemia herediter resesif yang disebabkan oleh defek pada gen TMPRSS6 yang mengkode matriptase-2 (MT2). MT2 merupakan regulator negatif transkripsi hepsidin. Kadar hepsidin yang tinggi dapat mencegah penyerapan zat besi di usus halus. Pada tahun 1981, tiga orang bersaudara diketahui tidak menunjukkan respon terhadap pemberian zat besi secara parenteral. Kemudian ditemukan pula dua saudara perempuan mengalami hal yang sama dengan orang tua tidak mengalami hal serupa. Pada kasus lainnya, hal yang sama juga ditemukan dengan hasil pemeriksaan tambahan yang telah menyingkirkan anemia akibat gangguan gastrointestinal maupun perdarahan. Saat itu diduga bahwa pasien menderita anemia akibat gangguan dalam metabolism zat besi yang diturunkan secara genetik. Pada tahun 1997, seorang anak dari ras Afrika berusia 18 bulan dengan iron resistant iron deficiency anemia dan mikrositosis berat dilaporkan.4 Prevalensi dari IRIDA sendiri masih belum banyak diketahui, terlebih di Indonesia.
1.2.
Rumusan Masalah Uraian dalam latar belakang masalah di atas memberikan dasar bagi
peneliti untuk merumuskan pertanyaan penelitian sebagai berikut : a.
Berapa frekuensi genotyping Single Nucleotide Polymorphysm (SNP) rs855791 (TMPRSS6) (C>T) asam amino prolin menjadi serin pada mahasiswa Program Studi Pendidikan Dokter (PSPD) Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan 2012 – 2014 menggunakan teknik Real Time Polymerase Chain Reaction-High Resolution Melt (PCR-HRM)?
b.
Apakah terdapat hubungan antara genotyping SNP rs855791 (TMPRSS6) (C>T) dengan kadar hemoglobin pada mahasiswa PSPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan 2012 – 2014 menggunakan teknik Real Time PCR-HRM?
3
1.3.
Hipotesis Terdapat hubungan antara genotyping SNP rs855791 (TMPRSS6) (C>T) dengan kadar hemoglobin mahasiswa PSPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta menggunakan teknik Real Time PCR-HRM.
1.4.
Tujuan a.
Mengetahui frekuensi genotyping SNP rs855791 (TMPRSS6) (C>T) pada mahasiswa PSPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan 2012 – 2014 menggunakan teknik Real Time PCR-HRM.
b.
Mengetahui hubungan antara genotyping SNP rs855791 (TMPRSS6) (C>T) dengan nilai Hb pada mahasiswa PSPD UIN Syarif Hidayatullah angkatan 2012 – 2014 menggunakan teknik Real Time PCR-HRM.
1.5.
Manfaat Penelitian a. Bagi peneliti, menambah khazanah ilmu pengetahun dan ketrampilan khususnya bidang biologi molekuler serta meningkatkan kemampuan penulis dalam penelitian. b. Bagi penelitian selanjutnya, sebagai sumber informasi dan bahan referensi. c. Bagi masyarakat, sebagai sumber informasi dalam mengatur pola
makan yang sehat dan bergizi cukup. d. Bagi mahasiswa, mengetahui faktor resiko mengenai penyakit anemia
sehingga secara dini dapat dilakukan tindakan pencegahan.
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1.
Landasan Teori
2.1.1. Genomik Menurut
National
Human
Genome
Research
Institute,
genomik
merupakan istilah yang banyak digunakan untuk menggambarkan studi tentang seluruh gen manusia (genom), termasuk interaksi antar gen dan dengan lingkungannya. Genomik mempelajari studi ilmiah mengenai berbagai macam penyakit yang kompleks, seperti penyakit jantung, asma, diabetes, dan kanker.5 Menurut WHO, genomik didefinisikan sebagai studi tentang gen dan fungsi mereka, dan teknik terkait.6 Satu gen dapat divisualisasikan sebagai satu segmen molekul DNA yang mengandung kode dari urutan asam amino dari rantai polipeptida dan mengatur ekspresinya secara sederhana. Pada genom manusia terdapat banyak gen yang mengkode berbagai macam protein dan juga area non-koding. Area non-koding tersebut disebut dengan intron. Intron awalnya ditranskripsi menjadi RNA di dalam inti tetapi tidak hadir dalam mRNA matang di sitoplasma. Dengan demikian, informasi dari urutan intron tidak terwakili dalam produk protein akhir. Intron terletak bergantian dengan ekson. Ekson merupakan area koding yang mengkode produk akhir protein.7 Mutasi pada area ekson maupun intron dapat mempengaruhi hasil akhir dari mutasi tersebut. Polimorfisme nukleotida tunggal atau Single Nucleotide Polymorphysm, sering disebut SNP (diucapkan "snips") adalah jenis yang paling umum dari variasi genetik pada seorang individu. Setiap SNP merupakan perbedaan dalam sebuah blok bangunan DNA tunggal, yang disebut nukleotida. Misalnya, SNP dapat menggantikan sitosin nukleotida (C) dengan timin nukleotida (T) di hamparan tertentu DNA. SNP terjadi secara normal di seluruh DNA seseorang. SNP terjadi sekali dalam setiap 300 nukleotida rata-rata, yang berarti ada sekitar 10 juta SNP dalam genom manusia. Paling umum, variasi ini ditemukan dalam DNA antara gen. Mereka dapat bertindak sebagai penanda biologis, membantu 4
5
para ilmuwan menemukan gen yang berhubungan dengan penyakit. Ketika SNP terjadi dalam gen atau di intra gen, mereka dapat memainkan peran lebih langsung dalam penyakit dengan mempengaruhi fungsi gen. Kebanyakan SNP tidak berpengaruh pada kesehatan atau perkembangan. Beberapa perbedaan genetik ini, bagaimanapun, telah terbukti sangat penting dalam studi kesehatan manusia. Para peneliti telah menemukan SNP yang dapat membantu memprediksi respon seseorang terhadap obat tertentu, kerentanan terhadap faktor lingkungan seperti racun, dan risiko perkembangan penyakit tertentu. SNP juga dapat digunakan untuk melacak warisan gen penyakit dalam keluarga. Penelitian selanjutnya yang ada dapat mengidentifikasi SNP yang berkaitan dengan penyakit kompleks seperti penyakit jantung, diabetes, dan kanker, termasuk IRIDA.8 2.1.1.1
Kajian Islam Tentang Larangan Pernikahan Sedarah Agama Islam merupakan agama yang mengatur kehidupan manusia
secara baik dan terbukti secara ilmiah. Termasuk mengenai larangan untuk melakukan pernikahan sedarah. Sebagaimana kita ketahui bahwa setiap individu manusia memiliki kode genetik yang berbeda dengan individu lainnya. Hal ini akan diturunkan kepada anak yang mendapatkan kode genetik dari kedua orang tuanya. Allah SWT berfirman dalam QS. An-Nisa ayat 23 sebagai berikut.
6
Artinya : “Diharamkan atas kamu (mengawini) ibu-ibumu; anak-anakmu yang perempuan; saudara-saudaramu yang perempuan, saudara-saudara bapakmu yang perempuan; saudara-saudara ibumu yang perempuan; anak-anak perempuan dari saudara-saudaramu yang laki-laki; anak-anak perempuan dari saudara-saudaramu yang perempuan; ibu-ibumu yang menyusui kamu; saudara perempuan sepersusuan; ibu-ibu isterimu (mertua); anak-anak isterimu yang dalam pemeliharaanmu dari isteri yang telah kamu campuri, tetapi jika kamu belum campur dengan isterimu itu (dan sudah kamu ceraikan), maka tidak berdosa kamu mengawininya; (dan diharamkan bagimu) isteri-isteri anak kandungmu (menantu); dan menghimpunkan (dalam perkawinan) dua perempuan yang bersaudara, kecuali yang telah terjadi pada masa lampau; sesungguhnya Allah Maha Pengampun lagi Maha Penyayang”. (QS. An Nisa: 23) Dari ayat tersebut sudah jelas, bahwa Allah SWT mengharamkan adanya pernikahan sedarah. Secara genetik, pernikahan sedarah lebih beresiko mendatangkan suatu penyakit dibandingkan tidak.9 Sebagai contoh, seorang perempuan yang memiliki sifat pembawa gen talasemia. Kemungkinan yang sama dapat terjadi pada saudaranya, karena adanya hubungan sedarah. Maka, apabila adanya pernikahan sedarah kemungkinan untuk melahirkan anak dengan talasemia dapat terjadi. 2.1.2
Anemia Anemia didefinisikan sebagai penurunan konsentrasi hemoglobin,
hematokrit atau hitung eritrosit. Hemoglobin merupakan “major oxygen-carryng pigment” dalam darah, gram hemoglobin per 100 mL darah (g/dL). Hemoglobin adalah metaloprotein (protein yang mengandung zat besi) di dalam sel darah merah yang berfungsi sebagai pengangkut oksigen dari paru ke seluruh tubuh. Menurut WHO, level hemoglobin untuk menentukan diagnosis anemia adalah seperti dalam tabel 2.1. Nilai rujukan pemeriksaan laboratorium dari alat yang
7
digunakan dalam penelitian ini untuk hemoglobin pada laki-laki 13,5-16,5 g/dL dan perempuan 12,1-15,1 g/dL. Anemia dapat terjadi oleh berbagai macam penyebab. Tabel 2.2 menjelaskan beberapa penyebab anemia. Secara genetik, anemia dapat terjadi pada penyakit talasemia. Pada talasemia terjadi mutasi pada gen yang membentuk rantai globin.10 Gangguan pada pembentukan enzim delta aminolevulenat dehidratase (ᵹ-ALAD) oleh timbal juga dapat menyebabkan anemia. 2.1.2.1
Kajian Islam Tentang Makanan yang Halal Lagi Baik Penyakit anemia merupakan kondisi yang dapat disebabkan oleh
berbagai hal. Salah satu penyebab yang paling banyak terjadi di Indonesia adalah karena defisiensi zat besi. Hal ini dapat terjadi karena kurangnya kesadaran masyarakat akan kebutuhan zat besi setiap hari. Bila kita lihat, masyarakat Indonesia sering mengonsumsi teh setelah makan. Hal ini dapat mengganggu penyerapan zat besi dari makanan yang telah dimakan. Allah SWT berfirman dalam QS. Al-Baqarah ayat 168 sebagai berikut.
Artinya : “Wahai manusia! Makanlah dari (makanan) yang halal dan baik yang terdapat di bumi.” (QS. Al-Baqarah: 168) Agama Islam mengajarkan untuk tidak hanya mengonsumsi makanan yang halal, namun juga mengonsumsi makanan yang baik.11 Walaupun teh halal, namun bila dikonsumsi secara berlebihan juga tidak baik. Bangun, dkk (2012) melakukan penelitian mengenai perilaku minum teh dan kadar Hb pada siswa sekolah. Hasil penelitian tersebut, dari 59 siswa yang mengonsumsi teh tingkat sedang 83,05% nya memiliki kategori kadar hemoglobin yang tidak normal.12
8
Tabel 2.1. Kadar hemoglobin berdasarkan usia menurut WHO, Hb dalam (g/L)
110 atau lebih
Anemia Ringan Sedang 100-109 70-99
Berat <70
115 atau lebih 120 atau lebih 120 atau lebih
110-114 110-119 110-119
80-109 80-109 80-109
<80 <80 <80
110 atau lebih
100-109
70-99
<70
130 atau lebih
110-129
80-109
<80
Populasi Bayi dan balita umur 6-59 Bulan Anak 5-11 tahun Anak 12-14 tahun Perempuan yang sedang tidak hamil (usia 15 tahun keatas) Perempuan yang sedang hamil Laki-laki usia 15 tahun keatas
Non-Anemia
Sumber : WHO
Tabel 2.2. Klasifikasi anemia berdasarkan morfologi dan etiologi I. Anemia hipokromik mikrositer a. Anemia defisiensi besi b. Talasemia major c. Anemia akibat penyakit kronik d. Anemia sideroblastik II. Anemia normokromik normositer a. Anemia pasca berdarahan akut b. Anemia aplastik c. Anemia hemolitik didapat d. Anemia akibat penyakit kronik e. Anemia pada gagal ginjal kronik f. Anemia pada sindrom mielodisplastik g. Anemia pada keganasan hematologi
III. Anemia makrositer Bentuk megaloblastik a. Anemia defisiensi asam folat b. Anemia defisiensi B12 Bentuk non megaloblastik a. Anemia pada penyakit hati kronik b. Anemia pada hipotiroidisme Anemia pada sindrom mielodiplastik
Sumber : Sudoyo dkk, 2006
2.1.3. Siklus Hidup Eritrosit Eritrosit dewasa atau matang berada dalam sirkulasi selama 110 – 120 hari. Kemudian ditangkap oleh makrofag. Eritropoesis dipengaruhi oleh sitokin, erythroid specific growth factor, dan erythropoietin (EPO). EPO dihasilkan oleh ginjal sebagai respon apabila terjadi hipoksia untuk mempertahankan jumlah eritrosit yang relatif stabil setiap hari. Peningkatan EPO menyebabkan maturasi
9
dari sel burst forming unit-erythroid (BFU-E) menjadi sel colony forming uniterythroid (CFU-E). Kemudian menjadi pro-eritrosit, eritroblas, lalu menjadi retikulosit. Retikulosit bertahan di dalam sirkulasi selama satu hari, kemudian menjadi eritrosit matur, sekitar 1% dari jumlah eritrosit. Retikulosit dapat meningkat apabila terjadi perdarahan akut, sebagai kompensasi sum-sum tulang yang adekuat. Sehingga retikulosit dapat menilai respon sum-sum tulang adekuat atau tidak. Retikulosit normal sekitar 0,5-1,5 %.10 Evaluasi morfologi dari eritrosit bergantung pada kriteria ukuran, bentuk, distribusi dan konsentrasi Hb, kemampuan menyerap zat warna, hapusan darah tepi, dan inklusi.
Gambar 2.1. Eritropoesis Sumber : Hoffbrand & Moss, 2013
2.1.4. Metabolisme Zat Besi Besi merupakan mikronutrien esensial bagi tubuh. Tubuh manusia dewasa mempunyai dua penyimpanan besar untuk besi, pertama besi yang terdapat pada hemoglobin, mioglobin, enzim dan kedua penyimpanan besi pada ferritin, hemosiderin, dan transferrin (protein transport di dalam darah). Laki-laki dewasa sehat mempunyai kurang lebih 3,6 gram besi dari seluruh total tubuh, pada perempuan sekitar 2,4 gram. Tabel berikut menunjukkan proporsi besi di dalam tubuh manusia dewasa sehat.16 Besi sangat dibutuhkan oleh tubuh. Sekitar 90% dikembalikan dan digunakan oleh tubuh setiap hari. Zat besi yang masuk melalui makanan harus seimbang dengan kebutuhan besi di dalam tubuh. Bila asupan nutrisi dari sumber makanan tidak memenuhi kebutuhan di dalam tubuh, maka defisiensi besi dapat terjadi. Menurut Food and Nutrition Board, Institute of Medicine, National Academies (2000), laki-laki pada kelompok umur 9-13 tahun dan 19 hingga >70
10
tahun membutuhkan zat besi sebanyak 8 mg/hari. Perempuan pada kelompok umur 9-13 tahun membutuhkan zat besi sebanyak 8 mg/hari, kemudian kebutuhan meningkat seiring berjalannya umur yakni pada kelompok umur 14-18 tahun membutuhkan sekitar 15 mg zat besi/hari dan 18 mg/hari untuk usia 19-50 tahun. Kebutuhan zat besi pada perempuan kembali menurun pada usia 51 hingga lebih dari 70 tahun.16 Tabel 2.3. Proporsi relatif besi didalam tubuh pada dewasa muda sehat Laki-Laki Tipe Besi
Perempuan
(mg)
(%)
(mg)
(%)
Hemoglobin
2300
64
1700
73
Myoglobin
320
9
180
8
Enzim heme
80
2
60
3
100
3
80
3+
Ferritin
540
15
200
9
Hemosiderin
230
6
100
4
5
<1
4
<1
3575
100
2314
100
Fungsional
Enzin non heme Penyimpanan
Transferin Total Sumber : Mahan & Escott-Stumpt, 2004
Berdasarkan ketersediaannya, terdapat dua jenis zat besi yaitu zat besi non heme dan zat besi heme. Zat besi heme banyak ditemukan dalam makanan hewani, yang ditemukan dalam hemoglobin, mioglobin, dan beberapa enzim dan zat besi non heme banyak ditemukan dalam sayuran dan kacang-kacangan. Zat besi dari hewani sudah dalam bentuk ferro (Fe2+), sedangkan zat besi dari tanaman berbentuk ferri (Fe3+). Zat besi ferro diabsorbsi di brush border (mukosa) melalui pembentukan vesikel disekitar zat besi heme di enterosit intestinal. Setelah zat besi ferro masuk ke sitosol, besi ferro secara enzimatis dipisahkan dari kompleks ferroporphyrin. Besi non heme masuk melalui proses difusi akibat perbedaan gradien konsentrasi. Ion besi yang bebas bergabung secara cepat dengan apoferitin
11
untuk membentuk feritin dan pada saat yang bersamaan ion besi non heme yang bebas berikatan dengan apoferitin. Feritin merupakan penyimpanan besi intraseluler dan satu feritin membawa zat besi dengan cara berikatan dengannya dari brush border ke membran basolateral sel. Tahap akhir dari absorpsi ini adalah ion besi berpindah ke sirkulasi dari membran basolateral dengan mekanisme transport aktif. Pada tahap ini dilakukan baik pada besi heme maupun non heme.16 Makanan dan sekresi dari gastrointestinal kecil mempengaruhi penyerapan besi. Pada individu yang mengonsumsi berbagai jenis makanan, sekitar 5-10% kandungan zat besi heme berasal dari makanan dan absorpsinya mencapai 25%, sedangkan zat besi non heme hanya diabsorpsi sebesar 5%. Pada seseorang vegetarian yang hanya mengkonsumsi makanan yang berasal dari tumbuhan, dibutuhkan konsumsi sumber makanan nabati dalam jumlah yang banyak untuk memenuhi kebutuhan zat besi di dalam tubuh. Oleh karena itu, pada pasien dengan anemia lebih disarankan untuk mengonsumsi sumber makanan zat besi dari hewani dibandingkan dari nabati.16 Besi non heme diabsorpsi di duodenum dan jejunum dalam bentuk terionisasi. Sekresi asam lambung meningkatkan kelarutan besi dan merubahnya menjadi bentuk ion baik ferri (Fe+3) dan ferro (Fe+2). Asam askorbat atau vitamin C dapat mengoksidasi zat besi ferri menjadi ferro, sehingga dapat meningkatkan penyerapannya di usus. Molekul makanan lain seperti gula dan sulfur yang mengandung asam amino juga dapat meningkatkan absorpsi besi.16 Besi dibutuhkan untuk sintesis protein hemoglobin. Hemoglobin sangat berperan penting dalam transport O2 di dalam darah. Sintesis hemoglobin terjadi di dalam mitokondria melalui reaksi biokimia. Reaksi dimulai dengan kondensasi antara glisin dan suksinil koenzim A membentuk enzim δ-aminolaevulinic acid (ALA). Vitamin B6 bertindak sebagai koenzim dalam proses ini. Protoforpirin bertindak sebagai perantara dalam pembentukan heme dengan cara berikatan dengan ferro. Setiap molekul heme berikatan dengan protein globin hingga terbentuk satu paket lengkap hemoglobin.17
12
Gambar 2.2. Sintesis hemoglobin pada pembentukan sel darah merah Sumber : Hoffbrand & Moss, 2006
2.1.5. Iron Refractory Deficiency Anemia (IRIDA) IRIDA merupakan penyakit autosomal resesif yang jarang terjadi. IRIDA ditandai oleh anemia mikrositik hipokrom yang parah, rendahnya serum besi dan saturasi transferin, sedangkan level feritin normal hingga tinggi diikuti dengan tingginya level hormon hepsidin secara berlebihan. Penyakit ini disebabkan oleh hilangnya fungsi akibat mutasi pada gen TMPRSS6 yang mengkode matriptase-2 (MT2) sebagai suatu regulator negatif transkipsi hepsidin. Pada individu dengan level hepsidin yang tinggi, hepsidin mencegah absorbsi zat besi pada duodenum dan besi yang diproses ulang oleh makrofag. Lebih jauh lagi, variasi genetik TMPRSS6 dapat memodulasi fenotip hematologis dan status besi.4 Secara normal, gen TMPRSS6 memberikan instruksi untuk membuat protein yang disebut MT2. Protein ini merupakan bagian dari jalur sinyal yang
13
mengontrol kadar protein lain yang disebut hepsidin, yang merupakan tombol pengatur keseimbangan zat besi dalam tubuh. Ketika kadar besi darah rendah, jalur sinyal ini akan mengurangi produksi hepsidin, yang memungkinkan lebih banyak zat besi dari makanan yang akan diserap melalui usus dan diangkut dari situs penyimpanan (terutama di hati dan limpa) ke dalam aliran darah. Besi merupakan komponen penting dari hemoglobin, yang merupakan molekul dalam sel darah merah yang membawa oksigen. Nama resmi dari gen ini "Transmembran Protease, Serin 6". TMPRSS6 adalah simbol resmi gen. Gen TMPRSS6 adalah bagian dari PRSS (peptidase serin). Gen TMPRSS6 terletak di 22q12.3 lokasi sitogenetik pada kromosom 22. Gen TMPRSS6 terletak di lengan panjang (q) kromosom 22 pada posisi 12,3.18
Gambar 2.3. Letak gen TMPRSS6 Sumber : http://ghr.nlm.nih.gov/gene/TMPRSS6
rs855791 merupakan SNP pada gen TMPRSS6. SNP ini memiliki genotip normal atau wildtype (C;C), dan heterozygot pada (C;T) dengan nilai hemoglobin rata-rata lebih rendah 0,1 g/dL, serta mutant (T;T) dengan nilai hemoglobin ratarata lebih rendah 0,2 g/dL.19 Hasil penelitian yang dilakukan oleh Benyamin, dkk (2009), memperlihatkan hubungan yang kuat antara SNP rs855791 dengan kadar Hb dan MCV pada remaja Australia. Alel T pada rs855791 memperlihatkan penurunan rata-rata kadar Hb dan MCV. Hubungan antara TMPRSS6 dengan kadar Hb memiliki hasil yang bermakna pada setiap kelompok sampel (remaja, dewasa, dan campuran).20 Sehingga kadar Hb dapat digunakan sebagai alat ukur. Penelitian yang dilakukan oleh Chambers, dkk (2009), memperlihatkan hubungan antara mutasi pada TMPRSS6 dengan level hemoglobin di dalam
14
darah. SNP diidentifikasi dari ras Eropa dan India Asia, hasilnya memperlihatkan hubungan yang sangat kuat pada rs855791 (G>A). Alel A pada RS855791 lebih banyak berhubungan dengan level hemoglobin yang rendah pada ras India Asia dibanding dengan ras Eropa. Sebesar 19% individu dengan ras Eropa dan 27% individu dengan ras India Asia yang memiliki genotip AA pada rs855791 memiliki konsentrasi hemoglobin rata-rata 0,2% lebih rendah dibandingkan dengan individu yang memiliki genotip GG. Hasil analisis penelitian tersebut, menunjukkan bahwa alel A memiliki persamaan dengan alel T. Setiap alel A mengindikasikan asosiasi 0,11 g/dL konsentrasi Hb yang lebih rendah.21 2.1.6. Regulasi Ekspresi Hepsidin Jumlah besi dalam plasma menentukan availabilitas besi pada eritropoiesis dan fungsi selular. Besi berikatan dengan transferin [Fe(III)-Tf] dan dapat segera diambil oleh seluruh jenis sel melalui ekspresi reseptor transferin 1 (TfR1). Homeostasis besi dijaga oleh liver-expressed peptide hormone hepcidin yang menjadi pusat dari regulasi besi dalam plasma. Hepsidin meregulasi absorbsi besi di usus yang masuk ke dalam plasma, dalam hal ini makrofag mendaur ulang eritrosit yang sudah rusak, dan mobilisasi besi dari penyimpanan hepar. Hepsidin yang berikatan dengan iron exporter ferroportin yang berada pada permukaan iron-releasing cells akan menurunkan regulasinya, hal tersebut menyebabkan degradasi dan menurunkan level besi dalam plasma. Availabilitas besi secara sistemik, kebutuhan besi untuk eritropoesis, hipoksia, dan inflamasi meregulasi level hepsidin dalam plasma. Penelitian mengenai mekanisme yang mendasari frequent iron related disorders, seperti hemokromatosis herediter, talasemia, atau anemia akibat penyakit kronik menyediakan pengetahuan terhadap regulasi hepsidin.3 MT2 mendegradasi Hemojuvelin (HJV), HJV bertindak sebagai coreseptor Bone Morphogenetic Protein (BMP). HFE dan TfR2 bersama HJV akan mengaktivasi BMP sehingga terjadi ekspresi dari gen HAMP. HFE dipindahkan dari TfR1 oleh Transferrin-iron complex [Tf-Fe(III)] dengan konsentrasi tinggi. BMP akan berikatan dengan reseptor BMP tipe 1 dan 2 yang akan mengaktivasi
15
fosfolirasi protein reseptor activated SMAD, dan pada akhirnya protein hepsidin dibentuk. Proses ini terjadi di dalam sel hepar.3
Gambar 2.4. Siklus zat besi–mekanisme adaptasi tubuh pada defisiensi besi Sumber : Camaschella, 2015.
Gambar 2.5. Ekspresi gen HAMP Sumber : Falco dkk, 2013
16
2.1.7. Isolasi Genom 2.1.7.1.
Persiapan untuk Human Genomic DNA Secara umum, sekitar 90% DNA terdapat di dalam nukleus
(kromosom). Pada studi genetika, isolasi DNA lebih banyak berasal dari sel darah tepi. Namun karena prosedurnya yang invasif, sulit untuk memperoleh sampel dari teknik tersebut. Sumber DNA lain dapat berasal dari sel mukosa pipi yang diperoleh dengan pencucian mulut menggunakan salin (teknik yang non invasif dan tidak menyebabkan perdarahan). Isolasi DNA dari sel bucal lebih murah dan membutuhkan jumlah yang sedikit, dan dapat disimpan dalam waktu yang lama. Teknik lain menggunakan folikel rambut dan biasa digunakan sebagai teknik investigasi pada kasus kriminal. Sampel yang berasal dari urin bermanfaat dalam mendeteksi kasus doping dan drug screening test. Tujuan dari isolasi DNA adalah mengisolasi dan mempurifikasi berat DNA dalam jumlah yang banyak.22 Berikut beberapa tahapan dalam purifikasi DNA. a. Cell breakage (pemecahana sel) Pemecahan sel merupakan langkah awal dalam purifikasi DNA. Teknik ini dapat membuka sel dan memperoleh DNA yang intak menggunakan bahan kimia berupa detergent dan/atau prosedur enzimatis. Detergen dapat melarutkan asam lemak membran sel dan mengakibatkan sel lisis. Detergen juga memiliki efek inhibitor terhadap seluruh DNAse enzim selular dan dapat mendenaturasi protein, dengan demikian membantu dalam pembersihan protein dari larutan tersebut.23 b. Removal of protein (Membuang protein) Langkah kedua dalam purifikasi adalah membuang kontaminan berupa protein dari sel lisis. Prosedur ini disebut dengan deproteinisasi. Prinsip kerja prosedur ini bergantung pada perbedaan antara bentuk fisik antara asam nukleat dan protein. Perbedaan ini terletak pada kelarutan, volume spesifik parsial, sensitifitas terhadap enzim pencernaan.23 Deproteinisasi menggunakan pelarut organik merupakan cara yang umum digunakan. Asam nukleat merupakan molekul hidrofilik dan sangat mudah
17
larut di dalam air. Sedangkan protein, mengandung banyak residu hidrofobik yang menyebabkan protein secara parsial larut di dalam pelarut organik. Pelarut organik biasanya mengandung fenol dan kloroform. Metode yang menggunakan fenol sebagai agen deproteinisasi dikenalkan oleh Kirby (1957), sehingga dikenal sebagai Metode Kirby. Penggunaan campuran kloroform isoamil alkohol dikenalkan oleh Marmur, sehingga dikenal Metode Marmur. Metode ini mendasari banyak modifikasi dan pengembangan dari waktu ke waktu.23 Penggunaan fenol pada metode Kirby memiliki beberapa prinsip. Fenol pada suhu ruang akan membentuk kristal, dengan adanya kandungan air 20% akan membentuk suspensi yang mengandung butiran-butiran fenol tersebar di dalam molekul air. Molekul protein secara umum mengandung banyak residu hidrofobik, yang mana terkonsentrasi dibagian tengah molekul. Ketika protein bercampur dengan fenol dalam volume yang sama, beberapa molekul fenol akan terlarut dalam fase cair (kurang lebih 20% air dan 80% fenol). Sehingga fenol dapat menembus masuk ke dalam protein, menyebabkan protein membengkak dan rusak. Protein yang telah terdenaturasi akan larut di dalam fenol. Sehingga tersisa asam nukleat. Asam nukleat tidak memiliki molekul yang bersifat hidrofobik sehingga tidak larut di dalam fenol.23 Kekurangan metode Kirby adalah produk oksidasi dari fenol dapat bereaksi secara kimia dengan molekul DNA (dan RNA). Fenol juga sangat toksik dan membutuhkan prosedur pembuangan. Untuk mengurangi efek tersebut, beberapa modifikasi yang dapat dilakukan sebagai berikut.23
Menggunakan detergen ionik.
Menggunakan reaksi enzimatis untuk membuang protein sebelum ekstraksi fenol. Hal tersebut menurunkan kebutuhan fenol yang akan digunakan. Sehingga kemungkinan hilangnya molekul DNA dapat diturunkan.
Menambahkan 8-hydroxyquinoline (8HQ) kedalam fenol. 8HQ meningkatkan kelarutan fenol di dalam air. Dengan adanya senyawa ini, fenol dapat diencerkan pada suhu ruang dengan 5% air. 8HQ juga mudah teroksidasi sehingga memegang peranan penting dalam anti-oksidan, menjaga fenol mengalami oksidasi. Bentuk dari 8HQ
18
berwarna kuning dan saat teroksidasi menjadi tidak berwarna, hal ini merupakan indikator yang baik yang dapat terlihat. Penggunaan dari metode Marmur berdasarkan pada karakteristik dari pelarut organik. Kloroform tidak larut dalam air dan meskipun banyak ektraksi tidak mengakibatkan hilangnya DNA ke dalam fase organik.23 c. Removal of RNA (Membuang RNA) Prinsip pembersihan RNA dari DNA menggunakan reaksi enzimatik. Konsekuensi dari prosedur ini tidak dapat membuang semua RNA secara bersih. Prosedur ini menggunakan dua ribonuklease, yaitu ribonuklease A dan ribonuklease T1. Ribonuklease A (RNase A) merupakan endoribonuklease yang dapat memotong RNA setelah residu C dan U. Reaksi tersebut menghasilkan oligonukleotida yang diakhiri dengan 3’–phosphorylated pyrimidine nucleotide. Ribonuklease T1 (RNase T1) memotong dsRNA dan ssRNA setelah residu G, menghasilkan oligonukleotida yang diakhiri dengan 3’–phosphorilated guanosine nucleotide. Karena kedua enzim tersebut spesifik terhadap RNA, penggunaan kedua enzim tersebut dalam RNA removal pada sampel DNA sangat direkomendasikan. Penggunaan hanya salah satu enzim akan menghasilkan DNA yang terkontaminasi dengan oligonukleotida dalam jumlah yang banyak. Sehingga dapat mengganggu pembacaan spektofotometri.23 d. Concentrating the DNA (pemekatan DNA) DNA didapatkan dengan cara pengendapan menggunakan alkohol. Dalam prosedur ini digunakan dua macam alkohol yakni ethanol dan isopropanol. Pengendapan menggunakan alkohol berdasarkan pada fenomena penurunan kelarutan asam nukleat di dalam air. Kutub positif air berinteraksi secara kuat dengan kutub negatif kelompok fosfodiester DNA. Interaksi ini menyebabkan DNA larut dalam air. Sedangkan ethanol tidak dapat berinteraksi dengan kutub negatif DNA seperti air. Sehingga asam nukleat tidak larut di dalam ethanol.23 Penggantian 95% molekul air di dalam DNA dapat menyebabkan DNA mengendap. Untuk mengendapkan DNA dengan konsntrasi ethanol yang rendah, aktivitas dari molekul air harus diturunkan. Hal ini dapat dilakukan dengan cara menambahkan garam di dalam larutan DNA.23
19
e. Determination of the purity and quantity of DNA (Pengukuran kemurnian dan jumlah konsenrasi DNA) Untuk mengukur kemurnian DNA hasil isolasi, dapat dilakukan pembacaan dengan alat spektofotometer menggunakan cahaya ultraviolet (UV). Keberadaan kontaminan berupa protein dapat diketahui dari rasio nilai optical density (OD) hasil isolasi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Hasil isolasi dinyatakan murni bila nilai rasio A260 : A280 adalah 2,0. Jika rasio kurang dari 2,0, maka konsentrasi DNA dapat dihitung dengan menggunakan rumus berikut.23 N (μg ml-1) = 70 A260 – 40 A280 A260 dan A280 merupakan daya serap DNA pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Indikator yang lebih baik dari kemurnian sampel DNA adalah rasio A260 : A234. DNA memiliki daya serap minimum pada 234 nm dan daya serap protein tinggi pada 205 nm. Rasio A260 : A234 merupakan indikator yang sangat sensitif untuk menentukan kontaminasi protein. Rasio antara 1,8-2,0 menunjukkan asam nukleat yang murni. A260 dan A234 merupakan daya serap sampel DNA pada panjang gelombang 260 nm dan 234 nm. Dengan menggunakan kedua panjang gelombang tesebut, konsentrasi DNA dapat dihitung dengan menggunakan rumus berikut.23 N(μg ml-1) = 52,6 A260 – 5,24 A234 Identifikasi kontaminasi memiliki makna tertentu. Jika rasio 260/280 rendah, maka terdapat kontaminan yang diserap pada gelombang 280 nm. Hal tersebut bisa disebabkan oleh fenol atau reagen lain pada protokol dan konsentrasi asam nukleat yang sangat rendah (>10 ng/uL). Meskipun kualitas DNA merupakan hal yang penting, namun bergantung kembali pada teknik apa yang digunakan.24
20
2.1.8
Polymerase Chain Reaction (PCR) Prinsip dasar PCR dapat dikatakan sederhana. Seperti namanya yakni
reaksi berantai: satu molekul DNA digunakan untuk menghasilkan dua salinan, lalu empat, delapan dan seterusnya. Penggandaan terus menerus ini dilakukan oleh protein tertentu yang dikenal sebagai polimerase, enzim yang mampu membuat satu untaian DNA individu untuk membentuk untaian molekul yang panjang. Oleh karena itu diperlukan fragmen DNA yang terdiri dari empat asam nukleat, yakni adenin (A), timin (T), sitosin (C) dan guanin (G). Mereka juga membutuhkan fragmen kecil DNA, yang dikenal sebagai primer. Jika bahan telah tersedia, enzim akan membentuk fragmen baru sama seperti pada template. PCR adalah metode digunakan untuk memperbanyak salinan dari setiap untai tertentu asam nukleat. Hal ini berarti PCR selektif memperkuat sebuah segmen tertentu DNA.25 Secara umum PCR membutuhkan target DNA sepanjang 100-1000 base pairs (bp). Secara teknik sulit untuk mengamplifikasi DNA dengan panjang >500 bp. Primer yang biasa digunakan memiliki panjang 20-20 nukleotida. Dalam proses PCR, dibutuhkan beberapa bahan seperti thermal cycler dan PCR amplification mix, yang terdiri dari sampel dsDNA, thermostable DNA polymerase, dua primer oligonukleotida, deoxynucleotide triphosphat (dNTPs), dan penyangga reaksi yang mengandung ion magnesium dan komponen lainnya (22). Berikut prosedur dalam PCR yang umum digunakan : a. DNA didenaturasi oleh panas dengan suhu 90-95oC selama 20 detik. Dua untai terpisah karena rusaknya hidrogen yang mengikat mereka.
b. Campuran reaksi mengandung mengandung 4 deoxynucleotide triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) dan thermostable DNA polymerase. DNA polimerase tidak mengalami denaturasi pada suhu yang tinggi. Campuran tersebut kemudian mengalami pendinginan, suhu diturunkan menjadi (50-65oC).
21
c. Setiap helai molekul DNA mengalami proses annealing dengan primer oligonukleotida
melengkapi
kedua
ujung
urutan
target
yang
membutuhkan waktu 20 detik.
d. Suhu dinaikkan ke 60-75oC dan primer diperluas oleh aksi polimerase DNA selama 30 detik. Polimerase yang mensintesis urutan komplementer 5 'ke 3' arah dari masing-masing primer. Jika template mengandung nukleotida A, enzim menambahkan pada nukleotida T untuk primer. Jika template berisi G, ia menambahkan C untuk rantai baru. Pada titik ini ada akan persis dua salinan dari urutan DNA target.
e. Campuran dipanaskan lagi di 90-95oC untuk denaturasi molekul dan memisahkan helai dan siklus diulang. Setiap helai baru kemudian bertindak sebagai template untuk siklus sintesis berikutnya. Jadi amplifikasihasil pada eksponensial (logaritmik) tingkat, yaitu jumlah DNA yang dihasilkan ganda pada setiap siklus. Produk diperkuat pada akhir PCR yang disebut amplikon. 2.1.9. Metode High Resolution Melt (HRM) Metode High Resolution Melt (HRM) merupakan metode cepat yang dikembangkan untuk menganalisis mutasi genetik atau variasi sekuensi dari asam nukleat setelah dilakukan analisis PCR. HRM memudahkan peneliti secara cepat mendeteksi dan mengkategorikan mutasi genetik (contoh : Single Nucleotida
22
Polymorphisms (SNPs)), identifikasi varian gen baru tanpa sekuensing (gene scanning) atau mendeterminasi variasi genetik pada populasi.26 Langkah awal dari protokol HRM adalah amplifikasi area yang akan dianalisis dengan menggunakan teknik PCR standar sehingga terdapat double stranded-DNA (dsDNA) yang dapat mengikat zat warna. Pewarna tersebut memiliki daya floresensi yang tinggi saat berikatan dengan dsDNA dan sangat lemah pada daerah yang tidak berikatan.Perubahan ini memungkinkan pengguna untuk memantau amplifikasi DNA selama PCR (sebagai PCR kuantitatif).26 Setelah langkah PCR selesai, target diperkuat secara bertahap dengan cara didenaturasi secara bertahap dengan meningkatkan suhu sedikit demi sedikit, untuk menghasilkan profil karakteristik leleh; ini yang disebut sebagai Melting Analysis. Target yang sudah diamplifikasi didenaturasi secara bertahap, melepaskan
pewarna,
yang
menghasilkan
penurunan
fluoresensi.Ketika
pengaturan sudah tepat, HRM cukup sensitif untuk memungkinkan deteksi perubahan basa tunggal antara urutan nukleotida yang dinyatakan identik. HRM menggunakan pewarna yang termasuk murah dan sedikit optimasi dibandingkan dengan sistem yang sama seperti Taqman dan Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) probes. Dibandingkan dengan metode tersebut, HRM lebih sederhana dan lebih cost-effective untuk sampel yang banyak.26 2.1.9.1
Analisis Hasil HRM Dengan software Light Cycler 480 Roche yang benar, analisis data dapat
dilakukan terhadap beberapa sampel secara simultan. Hal ini penting untuk mengetahui apa yang harus dicari ketika menganalisis hasil; kesalahan tak terduga yang dilakukan selama pemasangan dapat diidentifikasi pada saat ini. Perubahan melt plots yang rendah sering terlihat sebagai derivative plot (-dF / dT terhadap T); Namun, data melting curve harus dianalisis secara berbeda. Bagian ini menjelaskan analisis hasil HRM dengan contoh produk 124 bp meliputi jenis IV SNP(rs641805). Masalah yang paling umumdihadapi dan solusi dari masalah tersebut akan dibahas.26
23
a. Plot amplifikasi Reproduksibilitas amplifikasi lebih penting pada analisis HRM daripada efisiensi amplifikasi (dibandingkan dengan PCR kuantitatif). Misalnya, analisis HRM masih bisa dilakukan jika produk amplifikasi lebih lambat daripada perkiraan (yaitu karena keterbatasan dalam desain primer), asalkan semua sampel konsisten.26 b. Data mentah kurva leleh Data yang dikumpulkan selama HRM yang dianalisis memiliki rentang awal (pre-melt) pembacaan fluoresensi. Variasi ini membuat sulit untuk menganalisis hasil dengan benar, meskipun kelompok genotip yang berbeda dapat terlihat. Gambar 2.6 A menunjukkan bagaimana pemilihan daerah pre- dan postmelt digunakan untuk menyelaraskan data. Pre- dan daerah post-melt harus dipilih untuk setiap set primer, dengan posisi paralel ganda-bar seperti yang ditunjukkan. Hal ini penting untuk menyesuaikan bar ini sehingga wilayah lelehan tidak dipilih. Jika pre- atau post- daerah leleh tidak jelas, mungkin untuk mengulang HRM menjalankan saja (tanpa mengulangi langkah amplifikasi), dan menyesuaikan kisaran suhu yang diperlukan.26 c. Data Normalisasi Jika data yang dinormalisasi benar, akan muncul seperti yang ditunjukkan pada gambar 2.6 B yang disebut 'data normalisasi'. Pada gambar 2.6 B, variasi fluoresensi yang dapat dilihat pada gambar 2.6 A telah dihilangkan, dan hanya kisaran suhu antara bar luar daerah sebelum dan sesudah mencair ditampilkan. Genotip sekarang lebih berbeda, tetapi dua sampel homozigot (merah dan biru) yang masih sulit untuk dibedakan.26 d. Perbedaan grafik Beberapa aplikasi perangkat lunak HRM memungkinkan perhitungan perbedaan alur. Hal ini didapatkan dengan mengurangi data fluoresensi dinormalisasi dari genotip yang ditetapkan pengguna dari yang masing-masing sampel lainnya dalam analisis HRM. Pada gambar 2.6 C, genotip A / A telah dipilih sebagai dasar (genotip apapun dapat dipilih, tetapi biasanya homozigot yang digunakan). Posisi masing-masing sampel relatif terhadap baseline memiliki
24
plot terhadap temperatur. Bentuk analisis HRM ini merupakan bantuan untuk memvisualisasikan normalisasi data.26 HRM memiliki sifat yang sangat sensitif sehingga desain uji nya sangat penting untuk dilakukan dengan baik. Perhatian khusus harus diberikan untuk desain primer, reagen PCR yang digunakan dan kondisi siklus. Perbedaan pengaturan awal dapat sangat mempengaruhi hasil akhir. Faktor-faktor seperti kualitas genom DNA, desain primer, dan konsentrasi MgCl2 semua akan mempengaruhi hasil. Bagian berikut membahas masing-masing faktor-faktor yang harus diperhatikan.26
A/T
T/T A/A
25
T/T A/A A/T
Gambar 2.6. Analisis data HRM dari SNP tipe 4 (A/T).A. Data mentah memperlihatkan pre-melt, melt dan post-melt. Memperlihatkan variasi fluoresensi dan posisi pre dan post melting. B. Data normalisasi C. Grafik lain dari data normalisasi Sumber : https://www.kapabiosystems.com/assets/Introduction_to_High_Resolution_Melt_ Analysis_Guide.pdf
Kualitas dan kuantitas DNA merupakan salah satu faktor utama yang dapat mengurangi kualitas hasil. Hal tersebut dapat terjadi karena akumulasi dari penyangga dari template DNA sampel atau pada saat proses persiapan. Pemurnian DNA yang tidak sesuai teknik dapat mempengaruhi hasil. Garam bisa mempengaruhi proses melting produk PCR, dan dapat mengakibatkan sensitivitas rendah, reproduktifitas sedikit dan keluaran hasil genotip yang salah. Bufer yang terakumulasi dari template DNA tidak hanya akan memodifikasi Tm, proses, melting selama HRM, namun juga dapat mendorong amplifikasi yang spesifik selama PCR26. Untuk hasil yang optimal berikut dianjurkan beberapa hal dibawah ini: •
Idealnya, semua sampel DNA yang akan dianalisis (termasuk genotype kontrol) harus diekstrak menggunakan ekstraksi DNA dengan metode atau kit yang sama.
•
Beberapa kit menggunakan konsentrasi tinggi garam untuk elusi DNA dari kolom. Jadi, semua sampel template harus dielusi dengan kandungan rendah garam, idealnya 10 mM Tris-HCl, pH 8,5.
•
Sampel DNA harus terkonsentrasi setelah pemurnian. Template kemudian dapat diencerkan dengan 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 sebelum
26
digunakan. Hal ini membantu untuk mengurangi variasi larutan penyangga antara sampel. •
Penambahan volume yang sedikit pada template DNA akan mengurangi akumulasi garam dalam reaksi; idealnya volume terendah template yang dapat secara akurat ditambahkan harus digunakan (1-2 ml).
•
Semua sampel harus memiliki konsentrasi akhir DNA yang sama disetiap uji. Tabel 2.4 menjelaskan rincian konsentrasi DNA yang dianjurkan untuk berbagai template. Pada template dengan konsentrasi rendah, ada kesempatan yang lebih besar menggabungkan mutasi di awal PCR yang akan mempengaruhi perilaku melting; konsentrasi tinggi DNA akan menghasilkan latar belakang fluoresensi yang tinggi karena meningkatnya interkalasi pewarna ke dalam dsDNA.
•
Kontrol positif untuk semua genotip harus dimasukkan dan sebaiknya pada konsentrasi yang sama seperti sampel uji. DNA kontrol juga harus dielusi dan/atau diencerkan dalam bufer yang sama sebagai sampel. Tabel 2.4. Konsentrasi DNA yang dianjurkan untuk berbagai template Jenis DNA
Rekomendasi Konsentrasi DNA untuk analisis HRM
Genomic DNA (gDNA)
10 ng – 100 pg
Plasmid DNA (1-10kb)
1 ng – 10 fg
Amplicon DNA
10 pg – 1 fg
Sumber : https://www.kapabiosystems.com/assets/Introduction_to_High_Resolution _Melt_Analysis_Guide.pdf
27
2.2.
Kerangka Teori
Gambar 2.7. Kerangka teori
28
2.3.
Kerangka Konsep
Gambar 2.8. Kerangka konsep
2.4.
Definisi Operasional Dalam
penelitian
ini
peneliti
menggunakan
istilah-istilah
yang
didefinisikan sebagai berikut. Tabel 2.5. Definisi operasional No. Variabel
Definisi
Alat Ukur
Skala
1.
SNP
Variasi
Light
Nominal 1. Wildtype
rs855791
sekuensing
Cycler
2. Heterozygote
(CT)
DNA pada gen
480®Roche
3. Mutant
TMPRSS6.7
04 909 631 001
Skor
29
2.
Kadar
Kadar
Hemoglobin metaloprotein
Strip dan
Ordinal
Laki-laki
Alat cek
1. Rendah:
(protein yang
kadar Hb
<13,5
mengandung
(Easy
zat besi) di
Touch®
dalam sel
GCHb
Perempuan
darah merah
meter)
1. Rendah:
yang berfungsi sebagai pengangkut oksigen dari paru ke seluruh tubuh. Dinyatakan dalam satuan g/dL.17
2. Normal: 13,5-16,5
<12,1 2. Normal: 12,1-15,1
BAB 3 METODE PENELITIAN 3.1.
Desain Penelitian Metode
yang
digunakan
pada
penelitian
ini
adalah
penelitian
eksperimental. Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan alat Light Cycler 480®Roche 04 909 631 001 dengan menggunakan primer spesifik rs855791 (C>T) untuk melakukan skrining Iron Refractory Deficiency Anemia dan pemeriksaan kadar hemoglobin dengan menggunakan Easy Touch®GCHb meter. 3.2.
Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN
Syarif Hidayatullah Jakarta dengan mengambil data primer yakni genom mahasiswa Program Studi Pendidikan Dokter angkatan 2012 hingga 2014. Penelitian dilakukan dari bulan Mei hingga Oktober 2015. 3.3.
Populasi dan Sampel
3.3.1
Populasi Terjangkau Populasi terjangkau penelitian ini adalah mahasiswa Program Studi
Pendidikan Dokter angkatan 2012 hingga 2014. 3.3.2
Kriteria Pemilihan Kriteria pemilihan sampel dalam penelitian ini terdiri dari kriteria inklusi
dan ekslusi. Kriteria inklusi mahasiswa Pendidikan Dokter angkatan 2012 hingga 2014 yang telah mengisi lembar informed consent (lampiran 1). Pada penelitian ini kriteria eksklusi tidak ditentukan karena peneliti ingin melihat hasil skrining seluruh sampel dan melihat hubungan antara hasil skrining dan nilai kadar Hb.
30
31
3.3.3
Perkiraan Besar Sampel Dalam penentuan jumlah sampel, peneliti menggunakan perhitungan
Slovin dengan alasan total jumlah mahasiswa PSPD dari 2012-2014 kurang dari 500 orang. Rumus perhitungan adalah: n = N/(1+Ne2) Keterangan: n = Besarnya sampel N = Jumlah sampel e = Batas toleransi kesalahan 10 % (0.1) Maka ditemukan: n = 300/(1+300x0.12) = 300/4 = 75 orang Jadi besar sampel minimal yang dibutuhkan untuk penelitian ini adalah 75 orang sampel. 3.3.4
Teknik Pemilihan Sampel Sampel yang dipilih berdasarkan Simple Random Sampling dimana sampel
diambil secara acak berdasarkan tabel. 3.4
Alat dan Bahan Uji Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini dijelaskan dalam tabel
sebagai berikut. Tabel 3.1. Alat dan bahan penelitian Alat Pengambilan sampel (darah) Spuit 3 cc Torniquet Tabung berisi EDTA Handscoon Alcohol swab
Bahan
Keterangan
-
-
32
(Lanjutan) Alat Pengukuran kadar hemoglobin Easy Touch®GCHb meter Alcohol swab
Bahan
Keterangan
Blood Hemoglobin Test Strips
Nilairujukan : Normal Laki-laki 13,5-16,5 g/dL Normal perempuan 12,1-15,1 g/dL
Isolasi Genom DNA dari darah Tabung mikrosentrifugasi 1,5 ml Whole Blood 300 μL steril RBC Lysis Buffer 900 μLdan 100 μL Water bath AS ONE TRW-42TP, GB Buffer 200 μL 60oC (untuk rehidrasi DNA Ethanol Absolut 200 μL yang cepat) W1 Buffer 400 μL GD column Wash Buffer 600 μL 2 mL collection tube Elution Buffer 50 μL Microcentrifuge Eppendorf 5417 R Vortex DAAD Pipetmikro Nichipet EX Nichiryo ukuran 2-20 μL dan 20-200 μL Pipetmikro BIORAD ukuran 1001000 μL Tipmikro Biologix ukuran 10 μL, 200 μL, dan 1000 μL Biomedical Freezer SANYO Aluminium foil Pengukuran kemurnian dan konsentrasi hasil isolasi DNA Maestro Nano Drops Genom DNA 1 μL Aquadest Micropipet Tip
Elektroforesis genom DNA Elektroforesis ATTO My Power II 300 AE-8135 Microwave SHARP low wattage Timbangan analitik AdventureTM Gel doc system Printgraph ATTO AE-6905 CF CCD camera controller Penggaris sumur Gelas kimia Gelas ukur sibata
Agarose Ethidium bromide Loading dye Plastic Wrap Buffer Tris Asetat EDTA (TAE) 1x
33
(Lanjutan) Real Time PCR HRM Light Cycler 480®II Roche 04 909 631 001 Multiwall Plate Light Cycler®Roche
3.5.
HRM Kit MgCl2 Primer Forward dan Reverse dH2O sampel DNA
7,5 μL 1,2 μL 0,75 μL 1,8 μL 3,75 μL
Cara Kerja Penelitian
3.5.1. Pengumpulan Data Cara pengambilan data dalam penelitian ini yaitu data primer. Data responden diperoleh dengan cara tes kadar Hb mahasiswa dengan menggunakan alat EasyTouch GCHb® mater, dan punksi vena untuk skrining SNP rs855791 (C>T). Responden sebanyak 102 orang yang telah mengisi lembar informed consent (lampiran 1) dilakukan pengambilan darah sebanyak 3 cc satu kali dan pemeriksaan kadar Hb. Sampel darah diberi nomor dan disimpan dalam cold room untuk dilakukan isolasi genom DNA, kemudian dilakukan teknik Real Time PCRHRM dan selanjutnya dianalisis. 3.5.2. Desain gblock dan Primer Proses perancangan gblock dan primer membutuhkan TMPRSS6 Gene Sequence untuk melihat secara keseluruhan urutan basa nukleotida dan melihat area mutasinya. Langkah kerja desain primer yang spesifik untuk mendeteksi IRIDA pada penelitian ini adalah sebagai berikut : a.
Website http://simgene.com/Primer3 dibuka.
34
b.
Data sekuensing, primer forward dan reverse TMPRSS6 disalin dan dipindahkan kedalam kolom data primer3.
Primer yang digunakan dalam penelitian ini adalah5’ TCT GCA GAA AGT GGA TGT GC 3’ (forward) dan 5’ CTC ACC TGA CAG GCA TCC TT 3’ (reverse). c.
Tombol “Pick Primers” ditekan. Kemudian Primer3 OUTPUT berikut ini akan muncul.
35
Langkah kerja desain gBlock yang spesifik untuk mendeteksi IRIDA pada penelitian ini adalah sebagai berikut : a.
Website
https://www.idtdna.com/pages/products/genes/gblocks-gene-
fragments dibuka. b.
Tombol “Product & Services” ditekan. Kolom “gBlocks GeneFragments” ditekan. Tombol “Order” ditekan.
36
c. Data sekuensing DNA TMRSS6 dimasukkan kedalam kolom data sekuensing. Tombol “Test Complexity” ditekan.
3.5.3. Isolasi DNA Setelah sampel darah diambil, dilakukan isolasi DNA untuk mendapatkan genom DNA dengan menggunakan Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell) Geneaid GB100 dengan langkah kerja seperti dalam tabel 3.2.Genom DNA yang telah diisolasi dinilai apakah sudah terisolasi atau tidak dengan cara elektroforesis dan dibaca menggunakan Gel documentation. Hasil isolasi DNA dinilai jumlah konsentrasi DNA-nya dengan menggunakan alat Maestro Nano Drops. Sampel diambil sebanyak 1 μL, lalu diletakkan di lensa nano, ditutup dan di-analized. Hasil kemurnian dan konsentrasi akan langsung terbaca dilayar dan tersimpan.
37
Tabel 3.2. Tahapan isolasi genom DNA Persiapan
Fresh Blood
Sampel
1. Darah sebanyak 300 μl kedalam 1,5 ml tabung mikrosentrifugasi dimasukkan 2. 900 μl RBC Lysis Buffer kemudian ditambahkan dan dikocok. 3. Tabung diinkubasi 10 menit dalam suhu ruangan 4. Tabung disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan 3000 rpm selama 5 menit, supernatan dibuang. 5. 100 μl RBC Lysis Buffer ditambahkan untuk meresuspensi endapan leukosit, kocok, kemudian diproses dengan cell lysis
Langkah
6. 200 μl GB Buffer ditambahkan kedalam tabung tadi
1
7. Tabung diinkubasi pada suhu 60o C selama 10 menit untuk
Cell Lysis
memastikan sampel terlisiskan. 8. Pada saat yang sama tabung lain berisi 50 μl Elution Buffer untuk tiap satu sampel disiapkan, kemudian diinkubasi pada suhu 60o C. 9. Setelah tabung sampel tadi diinkubasi, tabung didinginkan di suhu ruangan.
Langkah 2
10. 200 μl ethanol absolute ditambahkan kedalam tabung tadi, kemudian secara cepat dikocok selama 10 detik.
DNA
11. GD Column pada 2 mL Collection Tube disiapkan.
binding
12. Campuran ethanol tadi dipindahkan kedalam GD Column 13. Tabung disentrifugasi pada 14.000 – 16.000 x g selama 5 menit 14. Cairanpada 2 ml Collection Tube dibuang 15. GD Column ditempatkan kembali pada 2 ml Collection Tube
Langkah 3 Wash
16. 400 μl W1 Buffer ditambahkan kedalam GD Column kemudian disentrifugasi pada 14.000 – 16.000 x g selama 1 menit 17. Cairan pada 2 ml Collection Tube dibuang 18. GD Column ditempatkan kembali pada 2 ml Collection Tube 19. 600 μl Wash Buffer ditambahkan kedalam GD Column 20. Tabung disentrifugasi pada 14.000 – 16.000 x g selama 1 menit 21. Cairan pada 2 ml Collection Tube dibuang 22. GD Column ditempatkan kembali pada 2 ml Collection Tube
38
(Lanjutan) 23. Tabung
disentrifugasi
kembali
selama
1
menit
untuk
mengeringkan matriks kolum Langkah
Standar volume elution buffer untuk 1 sampel adalah 100 μl. Jika
4
sampel yang digunakan dalam volume yang sedikit, volume elusi
DNA
sekitar 30 – 50 μl dapat meningkatkan konsentrasi DNA.
Elution
24. GD Column yang sudah kering dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifugasi yang steril 25. 50 μl Elution Buffer yang sudah diinkubasi ditambahkan ke dalam matriks kolom, dibiarkan selama 3 menit 26. Tabung disentrifugasi pada 14.000 – 16.000 x g selama 1 menit untuk mendapatkan hasil
3.5.3. Real Time PCR-HRM Setelah dilakukan isolasi genom DNA, pemeriksaan skrining dilakukan ketahap selanjutnya yakni Real Time PCR HRM dengan menggunakan alat Light Cycler 480® 04 909 631 001. Kondisi reaksi untuk amplifikasi dari sistem protokol untuk program High Resolution Melting adalah sebagai berikut.
Pre-inkubasi untuk aktivasi Fast Start Taq DNA Polimerase dan denaturasi template
Amplifikasi dari DNA target
Melting dari amplikonuntuk peroleh data dengan resolusi tinggi
Pendinginan (cooling) dari kipas dan thermal chamber
Tabel 3.3 menunjukkan rekomendasi parameter yang digunakan dalam Real Time PCR HRM sebagai gene scanning assay. Langkah memulai genotyping analisa: 1. Pengenceran primer
Sebanyak 5 μL primer forward dari tabung induk diambil dan dipindahkan kedalam tabung mikro 1, kemudian ditambahkan 5 μL dH2O. Hasil pengenceran didapatkan konsentrasi sebesar 50 μM.
39
Tabel 3.3. Parameter PCR yang direkomendasikan untuk Light Cycler 480® System PCR Run untuk membuat gene scanning assay dengan menggunakan Light Cycler 480® High Resolution Melting Master
Sumber : http://sydney.edu.au/medicine/bosch/facilities/molecular-biology/nucleicacid/Lightcycler 480GeneScanningSoftwareV1.5. pdf
40
Sebanyak 5 μL primer reverse dari tabung induk diambil dan dipindahkan kedalam tabung mikro 2, kemudian ditambahkan 5 μL dH2O. Hasil pengenceran didapatkan konsentrasi sebesar 50 μM.
Sebanyak 1 μL primer forward dan 1 μL primer reverse dari pengenceran diatas (50 μM) dipindahkan kedalam tabung mikro 3, kemudian ditambahkan 8 μL dH2O. Hasil pengenceran didapatkan konsentrasi 5 μM, hasil ini yang digunakan dalam mix untuk menjalankan RT PCR HRM.
2. Pengenceran template DNA (genom sampel)
DNA sampel induk yang telah diukur konsentrasinya, kemudian diambil 1 sebanyak 1 μL dan ditambahkan 9 μL dH2O. Hasil ini yang digunakan sebagai template dalam menjalankan RT PCR HRM.
Setelah dilakukan langkah diatas, kemudian dipersiapkan mix untuk HRM di dalam tabung yang berisi HRM kit 7,5 μL, MgCl2 1,2 μL, primer campuran hasil pengenceran 0,75 μL, dan dH2O 1,8 μL. DNA sampel dari hasil pengenceran yang digunakan adalah sebanyak 3,75 μL. Kemudian DNA sampel dimasukkan terlebih dahulu kedalam sumur template PCR baru ditambahkan mix tadi sebanyak 11,25 μL. Sumur ditutup dengan penutup plastiknya, kemudian dimasukkan kedalam alat Light Cycler dan dijalankan. 3.5.4. Analisis Data Pengolahan data primer dilakukan dengan menggunakan program SPSS versi 22. Agar analisis penelitian menghasilkan informasi yang benar, pengolahan data dilakukan dengan tahapan editing, coding, processing, dan cleaning. Editing merupakan kegiatan untuk melakukan pengecekan kelengkapan data rekam medis. Coding merupakan kegiatan merubah data berbentuk huruf menjadi data berbentuk angka atau bilangan. Setelah semua data diperiksa dan telah dilakukan coding, selanjutnya dilakukan Processing yakni memasukkan data kedalam SPSS. Tahap akhir dilakukan cleaning atau pembersihan data untuk mengecek kembali apakah terdapat kesalahan data yang sudah dimasukkan.
41
3.5.4. Etika Penelitian Penelitian ini dimintakan ethical cleareance (lampiran 2) dari panitia Etik Penelitian PSPD (Program Studi Pendidikan Dokter) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Semua data yang didapat dari hasil penelitian yang dipergunakan akan dijaga kerahasiaannya.
42
3.5.5. Alur Penelitian
Gambar 3.1. Alur penelitian
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil 4.1.1. Hasil Isolasi Genom DNA dari Whole Blood Sampel yang digunakan pada penelitian ini berupa sampel DNA yang diisolasi dari sel darah (whole blood). Sampel DNA yang digunakan terdiri dari 102 sampel DNA mahasiswa Program Studi Pendidikan Dokter UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Isolasi dan purifikasi DNA dari sampel darah (whole blood) dilakukan berdasarkan protokol Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell) Geneaid GB100. Kemudian untuk memeriksa apakah DNA telah terisolasi dan terpurifikasi dengan baik dilakukan dengan gel elektroforesis yang dapat dilihat pada gambar (lampiran 5). Setelah itu dilakukan pemeriksaan kemurnian dan konsentrasi dari 102 sampel DNA genom yang dapat dilihat pada tabel (lampiran 6). Dari 102 sampel, 44,1 % memiliki kategori kemurnian rasio A260/A280 (1,8-2,0) baik, 8,8% tinggi, dan 47,1% rendah. Rasio A260/A280 digunakan untuk identifikasi kontaminasi di dalam DNA sampel. Rasio A260/A280 yang rendah dapat disebabkan oleh kontaminasi fenol atau reagen pada saat isolasi, namun dapat pula disebabkan oleh konsentrasi yang sangat rendah (>10 ng/uL) dari asam nukleat.24 Sampel yang memiliki konsentrasi rendah sebanyak 8,8%. Meskipun rasio kemurnian menentukan kualitas dari sampel, indikator kualitas DNA bergantung dari aplikasi yang digunakan.24
4.1.2
Data Karakteristik Responden Responden dalam penelitian ini adalah 102 mahasiswa Program Studi
Pendidikan Dokter angkatan 2012 hingga 2014 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Responden terdiri dari 37 laki – laki dan 61 perempuan dengan rentang usia 17 23 tahun.
43
44
Tabel 4.1. Karakteristik jenis kelamin responden Frekuensi Jenis Kelamin Laki-laki Perempuan Total
Persentase (%) 37 65 102
36,3 63,7 100,0
Berdasarkan tabel 4.1 diketahui bahwa persentase laki – laki adalah 36,3% dan perempuan 63,7%. Tabel 4.2. Karakteristik usia responden Usia Responden (tahun) 17 18 19 20 21 23 Total
Frekuensi 3 18 26 28 24 3 102
Persentase (%) 2,9 17,6 25,5 27,5 23,5 2,9 100,0
Berdasarkan tabel 4.2 diketahui bahwa presentase usia terbanyak dari 102 responden adalah 20 tahun. Rerata usia responden adalah 20 (17-23). Berdasarkan hasil statistik deskriptif diketahui bahwa rerata Indeks Massa Tubuh dari seluruh responden adalah 20,41 (15,22-33,61). Kemudian data indeks massa tubuh dikelompokkan berdasarkan kriteria IMT Asia Pasifik untuk mengetahui status gizi responden. Tabel 4.3. Karakteristik Indeks Massa Tubuh responden Kategori IMT Asia Pasifik
Frekuensi
Persentase (%)
BB kurang Normal BB lebih Obes 1 Obes 2 Total
18 60 9 12 3 102
17,6 58,8 8,8 11,8 2,9 100,0
45
Berdasarkan tabel 4.3 diketahui bahwa kategori IMT terbanyak yakni normal dengan presentase 58,8%. 4.1.3. Hasil Pengukuran Kadar Hemoglobin Berdasarkan hasil statistik deskriptif diketahui bahwa rerata kadar hemoglobin dari seluruh responden adalah 11,35 g/dL (8,00-18,50). Kemudian data kadar hemoglobin dikelompokkan berdasarkan nilai rujukan untuk mengatahui status anemia responden. Nilai rujukan yang digunakan yakni pada laki-laki kadar normal hemoglobin (g/dL) adalah antara 13,5 hingga 16,5 dan pada perempuan 12,1 hingga 15,1. Bila kadar hemoglobin kurang dari rentang tersebut, responden dikelompokkan kedalam kategori anemia. Hasil dari pengelompokkan tersebut didapatkan data sebagai berikut.
Tabel 4.4. Kategori kadar hemoglobin responden Kategori Kadar Hemoglobin Non Anemia Anemia Total
Frekuensi 22 80 102
Presentase (%) 21,6 78,4 100,0
Berdasarkan tabel 4.4 diketahui bahwa persentase anemia adalah 78,4%. 4.1.4. Hasil Analisis Kurva HRM 4.1.4.1. Analisis Kurva Genotyping (Wildtype, Heterozygote, dan Mutant) Sampel yang telah dilakukan pemeriksaan mutasi gen dengan Real Time PCR HRM akan memberikan hasil berupa kurva yang berbeda berdasarkan temperatur leleh (lampiran 7). Berdasarkan analisis kurva HRM dari genom DNA sampel, didapatkan data genotyping dari 102 sampel seperti dalam tabel 4.6. Berdasarkan tabel 4.6 diketahui bahwa dari 102 sampel persentase wildtype 3,9%, heterozygote 72,5%, dan mutant 23,5%.
46
Tabel 4.5.Genotyping SNP rs855791 dari genom DNA responden Genotyping Wildtype Heterozygote Mutant Total
Frekuensi 4 74 24 102
Persentase (%) 3,9 72,5 23,5 100,0
4.1.5. Hasil Hubungan Jenis Kelamin dengan Kadar Hemoglobin Hasil data yang diperoleh dari 102 responden didapatkan nilai rerata kadar hemoglobin untuk jenis kelamin laki-laki sebesar 12,96 g/dL (SD 1,98) dan untuk jenis kelamin perempuan 10,71 g/dL (SD 1,54).
Gambar 4.1. Rerata kadar hemoglobin menurut jenis kelamin Hasil data yang diperoleh dari 102 responden pada penelitian ini diuji normalitasnya dengan menggunakan Kolmogorov Smirnov test. Hasilnya adalah data dari 102 responden terdistribusi normal dengan p value ≥ 0,05 (lampiran 8). Sehingga dapat dilanjutkan dengan uji statistik menggunakan independent t-test. Dari hasil uji independent t-test, didapatkan nilai p value ≤ 0,05 (lampiran 8) yang
47
berarti menunjukkan terdapat perbedaan bermakna antara jenis kelamin dengan kadar hemoglobin (g/dL). 4.1.6. Hasil Hubungan Jenis Kelamin dengan Kategori Kadar Hemoglobin Hasil data yang diperoleh dari 102 responden didapatkan presentase penderita anemia pada perempuan sebesar 86,15 % yang lebih tinggi daripada laki-laki yakni 64,86 %. Sedangkan kategori non anemia sebanyak 13,85 % pada perempuan dan 35,14 % pada laki-laki. Tabel 4.6. Distribusi frekuensi kategori kadar hemoglobin berdasarkan jenis kelamin Kategori Kadar Hb Jenis
Anemia
Non Anemia
Total
Kelamin
N
%
N
%
N
%
Laki-laki
24
64,86
13
35,14
37
100
Perempuan
56
86,15
9
13,85
65
100
Kemudian dicari hubungan antara kategori jenis kelamin dan kategori kadar hemoglobin (anemia dan non anemia). Dari hasil crosstabulation didapatkan nilai observed 13, 24, 9, dan 56. Nilai expected yang didapatkan 8, 29, 14 dan 51. Sehingga tabel tersebut (lampiran 8) layak untuk diuji Chi-Square karena tidak ada nilai expected yang kurang dari 5. Setelah dilakukan uji ChiSquare, didapatkan nilai signifikansi dari Pearson Chi-Square sebesar 0,012. Sehingga dapat disimpulkan terdapat perbedaan yang signifikan antara jenis kelamin dan kategori kadar hemoglobin (anemia dan non anemia). 4.1.7. Hasil Hubungan Jenis Kelamin dengan Genotyping (Wildtype, Heterozygote, dan Mutant) Hasil data yang diperoleh dari 102 responden didapatkan presentase lakilaki yang memiliki genotyping wildtype sebesar 5,41 %, heterozygote 67,57 %,
48
dan mutant 27,02 %. Presentase perempuan yang memiliki genotyping wildtype sebesar 3,10 %, heterozygote 75,38 %, dan mutant 21,52 %. Hasil data yang diperoleh dari 102 responden kemudian dicari hubungan antara kategori jenis kelamin dan genotyping (wildtype, heterozygote, dan mutant). Dari hasil crosstabulation didapatkan nilai observed 2, 25, 10, 2, 49, dan 14. Nilai expected yang didapatkan 1,5, 26,8, 8,7, 2,5, 47,2, dan 15,3. Tabel 2x3 (lampiran 8) tidak layak untuk diuji dengan Chi Square karena sel yang nilai expexted-nya kurang dari 5 sebesar 33%. Oleh karena itu, digunakan uji alternatifnya yakni uji Mann-Whitney dengan p value=0,707. Sehingga dapat disimpulkan tidak terdapat hubungan yang signifikan antara jenis kelamin dengan genotyping (wildtype, heterozygote, dan mutant). Tabel 4.7. Distribusi frekuensi kategori genotyping menurut jenis kelamin Kategori Genotyping Jenis Kelamin
Wildtype
Heterozygote
Mutant
Total
N
%
N
%
N
%
N
%
Laki-laki
2
5,41
25
67,57
10
27,02
37
100
Perempuan
2
3,10
49
75,38
14
21,52
65
100
4.1.8. Hasil Hubungan Genotyping (Wildtype, Heterozygote, dan Mutant) dengan Kadar Hemoglobin (g/dL) Hasil data yang diperoleh dari 102 responden didapatkan nilai rerata kadar hemoglobin untuk wildtype sebesar 12,1 g/dL (SD 2,16), heterozygote 11,56 g/dL (SD 2,13) dan mutant 11,33 g/dL (SD 1,70). Hasil data yang diperoleh dari 102 responden kemudian dicari hubungan antara kadar hemoglobin (g/dL) dengan genotyping (wildtype, heterozygote, dan mutant). Dari hasil uji variasi dan uji normalitas syarat one way ANOVA tidak terpenuhi (lampiran 8). Sehingga digunakan alternatif uji nya yakni uji KruskalWillis. Setelah dilakukan uji Kruskal-Willis, didapatkan nilai signifikansi sebesar
49
0,818. Sehingga dapat disimpulkan tidak terdapat perbedaan yang signifikan antara kadar hemoglobin dengan genotyping (wildtype, heterozygote,dan mutant).
Gambar 4.2. Rerata kadar hemoglobin heterozygote, dan mutant)
menurut
genotyping
(wildtype,
4.1.9. Hasil Hubungan Genotyping (Wildtype, Heterozygote, dan Mutant) dengan Kategori Kadar Hemoglobin (Anemia dan Non Anemia) Tabel 4.8. Distribusi frekuensi genotyping menurut kategori kadar hemoglobin Genotyping Kategori Kadar Hemoglobin
Total Wildtype
Heterozygote
Mutant
N
%
N
%
N
%
N
%
Anemia
3
3,75
56
70
21
26,25
80
100
Non Anemia
1
4,54
18
81,81
3
13,65
22
100
Hasil data yang diperoleh dari 102 responden didapatkan presentase penderita anemia yang memiliki genotyping wildtype 3,75 %, heterozygote 70 %,
50
dan mutant 26,25 %. Presentase responden non anemia yang memiliki genotyping wildtype 4,54 %, heterozygote 81,81 %, dan mutant 13,65 %. Hasil data yang diperoleh dari 102 responden kemudian dicari hubungan antara kategori kadar hemoglobin dengan genotyping (wildtype, heterozygote, dan mutant). Dari hasil crosstabulation didapatkan nilai observed 1, 18, 3, 3, 56, dan 21. Nilai expected yang didapatkan 0,9, 16, 5,2, 3,1, 58, dan 18,8. Tabel 2x3 (lampiran 8) layak untuk diuji dengan Chi Square karena sel yang nilai expextednya kurang dari 5 sebesar 33,3% (masih dibawah 50%). Setelah dilakukan uji Chi Square, didapatkan nilai signifikansi dari Pearson Chi-Square sebesar 0,466. Sehingga dapat disimpulkan tidak terdapat perbedaan yang signifikan antara kategori kadar hemoglobin (anemia dan non anemia) dengan genotyping (wildtype, heterozygote, dan mutant). 4.2. Pembahasan Hasil uji bivariat antara jenis kelamin dengan kadar hemoglobin menggunakan uji independent t-test, didapatkan nilai p value ≤ 0,05 yang berarti menunjukkan terdapat perbedaan bermakna antara jenis kelamin dengan kadar hemoglobin (g/dL). Hasil analisis ini diperkuat oleh penelitian Permaesih dan Herman bahwa ada hubungan yang bermakna antara jenis kelamin dan kadar hemoglobin dengan p value=0,000* dengan OR 0,6 dan 1.27 Secara teori, kadar hemoglobin pada perempuan memang lebih rendah dibandingkan laki-laki. Menurut parameter dari komponen sel darah merah juga menunjukkan perbedaan yang bermakna.28 Kemudian setelah dilakukan uji Chi-Square, untuk melihat hubungan antara kategori kadar hemoglobin (anemia dan non anemia) didapatkan nilai signifikansi dari Pearson Chi-Square sebesar 0,012. Sehingga dapat disimpulkan terdapat perbedaan yang signifikan antara jenis kelamin dan kategori kadar hemoglobin (anemia dan non anemia). Secara teori, perempuan memiliki faktor resiko lebih dalam kejadian anemia dibandingkan laki-laki, terutama pada perempuanusia reproduktif yang mengalami menstruasi. Hal ini telah diteliti oleh Sung-Nan Pei dkk (2014) dari sampel 67 perempuan dengan Iron Deficiency Anemia (IDA) dan 107 kelompok perempuan tanpa IDA dilakukan pemeriksaan Pictorial Blood Loss Assessment Chart (PBAC).29 Hasil dari penelitian tersebut
51
didapatkan perbedaan yang bermakna antara kelompok perempuan dengan IDA dan kelompok perempuan sehat dengan p value <0,001 (p<0,05). Hal ini sejalan dengan angka kebutuhan zat besi perhari antara laki-laki dan perempuan yang berbeda. Menurut Food and Nutrition Board, Institute of Medicine, National Academies (2000), laki-laki pada kelompok umur 19 hingga >70 tahun membutuhkan zat besi sebanyak 8 mg/hari. Berbeda pada perempuan yang membutuhkan 18 mg/hari zat besi untuk usia 19-50 tahun.16 Pada hasil penelitian ini secara statistik tidak ditemukan adanya perbedaan yang signifikan antara jenis kelamin dengan genotyping (wildtype, heterozygote, dan mutant) (p=0,662), antara genotyping dengan kadar hemoglobin (p=0,818) dan antara genotyping dengan kategori kadar hemoglobin (p=0,466). Secara teori, IRIDA terjadi karena hilangnya fungsi matriptase-2 sebagai regulator negatif transkripsi hepsidin akibat mutasi pada gen TMPRSS6. Akibat proses tersebut terjadi overproduksi dari hepsidin yang menyebabkan terhambatnya absorpsi zat besi di usus. Hal ini akan berpengaruh terhadap kadar hemoglobin di dalam darah. Berdasarkan gambar 4.2 didapatkan rerata kadar hemoglobin wildtype 12,10 g/dL (SD 2,16) lebih tinggi dibandingkan rerata kadar hemoglobin heterozygote 11,56 g/dL (SD 2,13) dan mutant 11,33 g/dL (SD 1,70). Berdasarkan tabel 4.8 diketahui presentase kelompok anemia dengan heterozygote 70% dan pada kelompok mutant didapatkan kejadian anemia 26,25 % dan non anemia 13,65 %. Perbedaan dari hasil penelitian ini bisa dikarenakan adanya IRIDA merupakan penyakit autosomal resesif sehingga fenotip baru akan muncul untuk dalam dua alel baik dalam bentuk heterozigot maupun homozigot. Hal ini sejalan dengan penelitian yang dilakukan oleh Goncalves dkk (2013) tidak terdapat perbedaan bermakna antara frekuensi alel C dan T dengan kelompok normal dan kelompok IDA (p=0,08) dibandingkan dengan frekuensi genotip CT dan TT pada kedua kelompok (p=0,037).31 Namun demikian, kejadian dari kadar hemoglobin yang rendah berdasarkan genotip (C>T) telah diobservasi dalam penelitian ini. Pada hasil analisis kurva HRM, didapatkan beberapa sampel memiliki bentuk kurva yang berbeda (lampiran 7). Kurva analisis HRM-PCR adalah kurva alel hetero maupun mutan yang hanya berdasarkan pada posisi perubahan basa dalam untai produk PCR. Perubahan ini dapat saja terjadi diposisi basa nukleotida
52
yang kita amati atau diluar area posisi basa nukleotida. Akibatnya adalah pola yang terbaca dan dianalisa oleh program HRM tetap menunjukan grafik posisi alel hetero atau mutan. Oleh karena itu, perlu dilakukan sekuensing untai DNA sampel untuk memvalidasi kejadian tersebut. Dari hasil sekuensing didapatkan sampel benar memiliki mutasi lain pada fragmennya, sehingga dapat menjadi salah satu faktor dalam perbedaan ini. Hal ini dibuktikan dari hasil pengamatan, contoh pada sampel nomor 2 yang menunjukkan kurva HRM-PCR di area alel hetero, namun setelah diamati dengan lebih seksama, ternyata bukan hanya terdapat bentuk hetero namun ada delesi dengan ganda hetero di posisi basa nukleotida lain (lampiran 7). Kemudian pada sampel nomor 70-72, 85, dan 86 menunjukkan bentuk ganda heterozygote (lampiran 7). Sehingga dapat disimpulkan, penggunaan teknik HRM-PCR ini kurang spesifik namun sensitif untuk membedakan individu yang memiliki bentuk wildtype, heterozygote, dan mutant. Pada individu yang memiliki bentuk heterozygote dan mutant dianjurkan untuk melakukan sekuensing DNA dan pengamatan lain terkait penyakit tersebut.
4.3. Kelebihan Penelitian Penelitian skrining SNP rs855791 (C>T) untuk mengetahui kemungkinan responden menderita IRIDA ini dapat dikatakan penelitian yang baru di Indonesia karena IRIDA sendiri merupakan penyebab anemia yang baru diketahui. Dalam pelaksanaan penelitian ini, cara kerja penelitian yang dilakukan memiliki tingkat kesulitan yang tinggi karena membutuhkan waktu dan tenaga yang banyak. Dalam mendeteksi mutasi dari SNP tersebut, teknik Real Time PCR-HRM yang digunakan merupakan salah satu teknik yang murah dan sensitif. Dalam penelitian ini pula responden mengetahui hasil dari pemeriksaan kadar Hb sehingga dapat menjadi informasi bagi responden untuk memperbaiki gaya hidup terutama dari segi asupan nutrisi yang berkaitan dengan zat besi.
4.4. Keterbatasan Penelitian Selama penelitian berlangsung terdapat beberapa hambatan yang dialami oleh peneliti, diantaranya:
53
1. Tidak diukurnya kriteria diagnosis lain untuk menentukan anemia dan non anemia seperti pemeriksaan hapusan darah tepi. 2. Tidak mencari data mengenai asupan zat besi responden per hari untuk mengetahui kemungkinan pasien yang mengalami Iron Deficiecy Anemia. 3. Tidak mencari data mengenai status menstruasi pada responden perempuan untuk mengetahui kemungkinan penyebab lain terjadinya anemia. 4. Besar sampel diduga mempengaruhi hasil statistik analitik.
BAB 5 SIMPULAN DAN SARAN 5.1. Simpulan 1. Frekuensi genotyping SNP rs855791 (C>T) asam amino prolin menjadi serin pada mahasiswa PSPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan 2012 – 2014 menggunakan teknik Real Time PCR-HRM sebagian besar merupakan genotyping heterozygote sebesar 72,5% . 2. Tidak terdapat hubungan antara genotyping SNP rs855791 (TMPRSS6) (C>T) dengan nilai Hb pada mahasiswa PSPD UIN Syarif Hidayatullah angkatan 2012 – 2014 menggunakan teknik Real Time PCR-HRM. 5.2. Saran 1. Diperlukan besar sampel yang lebih banyak untuk melihat hubungan antara SNP rs855791 dengan kadar hemoglobin. 2. Diperlukan sekuensing DNA untuk mengetahui jumlah basa yang mengalami mutasi dan untuk memvalidasi hasil pemeriksaan. 3. Diperlukan pemeriksaan lebih lanjut untuk diagnosis anemia seperti hapusan darah tepi, dan pemeriksaan lainnya. 4. Diperlukan kuesioner untuk mengetahui faktor lain yang mempengaruhi kondisi anemia defisiensi besi seperti asupan zat besi dan kejadian menorhargia pada perempuan. 5. Bagi mahasiswa, diharapkan dapat memperbaiki pola makan untuk mengatasi kondisi anemia.
54
DAFTAR PUSTAKA 1. Benoist B, McLean E, Egli I, Cogswell M, editor. Worldwide prevalence of anaemia 1993 – 2005 [Internet]. Switzerland: WHO Press: 2008 [diakses pada 7 Jul 2015]. Tersedia pada WHO: http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/43894/1/9789241596657_eng.pdf?ua =1 2. Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Kementerian Kesehatan RI. Riset kesehatan dasar 2013 [Internet] [diakses pada 7 Jul 2015]. Tersedia pada Depkes: http://www.depkes.go.id/resources/download/general/Hasil%20Riskesdas%20 2013.pdf 3. Camaschella C. Iron deficiency anaemia. N Engl J Med 2015; 372(19): 18351843 4. Falco LD, Sanchez M, Silvestri L, Kannenglesser C, Muckenthaler MU, Lolascon A, et all. Iron refractory iron deficiency anaemia. Haematol 2013; 98(6): 848-853 5. What are genetics and genomics [Internet]. 14 Feb 2014 [diakses pada 10 Jul 2015]. Tersedia pada National Human Genome Research Institute: http://www.genome.gov/19016904 6. WHO. Who definitions of genetics and genomics [Internet]. [diakses pada 10 Jul 2015]. Tersedia pada WHO : http://www.who.int/genomics/geneticsVSgenomics/en/ 7. The human genome: structure and function of genes and chromosomes. Thompson and Thompson genetics in medicine [Internet]. [diakses pada 12 Sep 2015]. Tersedia pada : http://www.fi.muni.cz/~lexa/lsb2014/chapter03sample.pdf 8. What are single nucleotide polymorphisms [Internet]. Sep 2015 [diakses pada 5 Sep 2015]. Tersedia pada genetic home reference: http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/genomicresearch/snp 9. Mukhlisin BK. Hikmah Larangan Menikah Sedarah [Internet]. Jan 2015 [diakses pada 5 Sep 2015]. Tersedia pada: http://bersamadakwah.net/hikmahlarangan-kawin-sedarah-5-000-orang-ini-menderita-alzheimer/ 10. Hoffbrand AV, Moss PAH; alih bahasa, Brahm UP, Liana S, Anggraini I. Kapita selekta hematologi, edisi 6. Jakarta: EGC; 2013. h.84-86 11. Suryana. Makanan yang halal dan haram. Jakarta: Mitra Aksara Panaitan; 2009. h. 2-6 55
56
12. Bangun EB, Lubis Z, Siagian A. Perilaku minum teh dan kadar hemoglobin (hb) pada siswa-siswi sekolah menengah kejuruan negeri 1 jorlang hataran desa dolok marlawan kecamatan jorlang kabupaten simalungun tahun 2012 [Internet]. [diakses pada 20 Jul 2015]. Tersedia pada: http://download.portalgaruda.org/article.php?article=51409&val=4108 13. WHO. Haemoglobin concentrations for the diagnosis of anaemia and assessment of severity [Internet]. [diakses pada 20 Jul 2015]. Tersedia pada WHO: http://www.who.int/vmnis/indicators/haemoglobin.pdf 14. Sudoyo AW, Setiyohadi B, Alwi I, Simadibrata M, Setiati S. Buku ajar ilmu penyakit dalam. Jilid II edisi IV. Jakarta: Interna Publishing; 2006. h.633-636 15. Loffler H, Rastetter J, Haferlach T. Atlas of clinical hematology, 6th ed. New York: Springer Berlin; 2005, h.31-34 16. Mahan K, Escott-Stumpt S. Krause’s food, nutrition, and diet therapy, 11th ed. USA: Elsevier; 2004, h.135-137 17. Hoffbrand AV, Moss PAH, Pettit JE, editors. Essential haematology, 5th ed. Australia: Blackwell Publishing; 2006, h.16-19 18. TMPRSS6 [Internet]. Jul 2014 [diakses pada 5 Sep 2015]. Tersedia pada genetic home reference: http://ghr.nlm.nih.gov/gene/TMPRSS6 19. RS855791 [Internet]. Jun 2015 [diakses pada 10 Jul 2015]. Tersedia pada snpedia : http://www.snpedia.com/index.php/Rs855791 20. Benyamin B, Ferreira MA, Willemsem G, Gordon S, Middleberg RPS, McEvoy BP, et al. Common variants in TMPRSS6 are associated with iron status and erythrocyte volume. Nat Genet 2009; 41(11): 1173-1175 21. Chambers JC, Zhang W, Li Y, Sehmi J, Wass MN, Zabaneh D, dkk. Genome wide association study identifies variants in TMPRSS6 associated with hemoglobin levels. Nat Genet 2009; 41(11): 1170-1172 22. Ghatak S, Muthukumaran RB, Nachimutu SK. A simple method of genomic DNA extraction from human samples for PCR-RFLP Analysis. J Biomol Tech 2013; 24: 224-231 23. Surzycki S. Laboratory manual: human molecular biology. Berlin: Blackwell Publishing; 2003. h.3-10 24. Assessment of nucleic acid purity [Internet]. [diakses pada 14 Sep 2015]. Tersedia pada Thermo-Scientific : http://www.nanodrop.com/Library/T042NanoDrop-Spectrophotometers-Nucleic-Acid-Purity-Ratios.pdf
57
25. Joshi M, Desphande JD. Polymerase chain reaction: method, principles, and application.Int J Biomed Res 2010; 1(5): 81-97. 26. Introduction to high resolution melt analysis. Kapa Biosystem [Internet]. [diakses pada 14 Sep 2015]. Tersedia pada: https://www.kapabiosystems.com/assets/Introduction_to_High_Resolution_M elt_Analysis_Guide.pdf 27. Permaesih D, Herman D. Faktor-faktor yang mempengaruhi anemia pada remaja. Bal Penel Kesehatan 2005; 33(4):162-171 28. Beutler E, Lichtman MA, Coller BS, editor. William’s haematology, 6th ed. New York: Mc Graw Hill; 2001 29. Pei SN, Ma MC, You HL, Fu HC, Kuo CY, Rau KM, dkk. TMPRSS6 rs855791 polymorphism influences the susceptibility to iron deficiency anemia in women at reproductive age. Int J Med Sci 2014; 11(6): 614-619. 30. Light cycler gene scanning software. Roche [Internet]. Okt 2008 [diakses pada 14 Sep 2015] Tersedia pada : http://sydney.edu.au/medicine/bosch/facilities/ molecular-biology/nucleicacid/LightCycler480_GeneScanningSoftware_V1.5. pdf 31. Goncalves L, Nobre Jesus G, Afonso C, Vieira A, Maia R, Miranda A, dkk. The role of TMPRSS6 gene variants in different types of iron deficiency anemia – from the rare severe hereditary IRIDA to the common mild acquired IDA [Internet]. [diakses pada 14 Sep 2015]. Tersedia pada: http://repositorio.insa.pt/bitstream/10400.18/2511/1/poster%20SPGH%20201 4%20IRIDA.pdf
Lampiran 1. Lembar persetujuan responden SURAT PERSETUJUAN PENELITIAN SKRINING GEN RS855791 YANG BERHUBUNGAN DENGAN IRIDA PADA MAHASISWA PSPD UIN JAKARTA ANGKATAN 2012-2014 Saat ini saya Amatillah Raifah mahasiswa PSPD UIN Jakarta angkatan 2012 sedang melakukan penelitian dengan judul Skrining Single Nucleotide Polymorphysm rs855791 (C>T) pada Mahasiswa Program Studi Pendidikan Dokter Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta Untuk Mengetahui Kemungkinan Menderita Iron Refractory Deficiency Anemia dengan Menggunakan Teknik Real Time Polymerase Chain Reaction-High Resolution Melt. Pada penelitian ini saya akan melakukan dua kali pemeriksaan. Pemeriksaan
pertama
akan
dilakukan
pemeriksaan
Hb
darah
dengan
menggunakan alat EasyTouch GCHb. Pemeriksaan kedua akan dilakukan pengambilan darah partisipan sebanyak satu kali yaitu 3 cc. Darah tersebut akan dibawa ke laboratorium untuk dilakukan skrining. Pengambilan darah dilakukan oleh analis yang sudah berpengalaman. Untuk itu, dengan hormat saya memohon kesediaan Anda untuk ikut serta dalam penelitian ini. Setelah membaca penjelasan diatas, bahwa yang bertanda tangan dibawah ini: Nama: Umur:
tahun
Alamat: Dengan sukarela diikutsertakan dalam penelitian ini. Segala hal yang menyangkut kerahasiaan tentang partisipan akan terjaga dengan baik oleh peneliti. Jakarta,
Mei 2015
Mengetahui,
(________________)
(Amatillah Raifah)
Mahasiswa
Peneliti 58
59
Lampiran 2. Lembar tanda terima
60
Lampiran 3. Fragmen gblock dan primer Fragmen gBlock wildtype asam amino prolin GGA GAA TAG AGA ACA GGG GCT CCA GGC TCC TGA GAT CTC ACT TCT GCC CTT GAC CAC GGA CAG GCC CCA TCA GCA ACG CTC TGC AGA AAG TGG ATG TGC AGT TGA TCC CAC AGG ACC TGT GCA GCG AGG CCT ATC GCT ACC AGG TGA CGC CAC GCA TGC TGT GTG CCG GCT ACC GCA AGG GCA AGA AGG ATG CCT GTC AGG TGA GTC CCC (produk PCR) 126 bp Fragmen gBlock mutan asam amino serin GGA GAA TAG AGA ACA GGG GCT CCA GGC TCC TGA GAT CTC ACT TCT GCC CTT GAC CAC GGA CAG GCC CCA TCA GCA ACG CTC TGC AGA AAG TGG ATG TGC AGT TGA TCC CAC AGG ACC TGT GCA GCG AGG TCT ATC GCT ACC AGG TGA CGC CAC GCA TGC TGT GTG CCG GCT ACC GCA AGG GCA AGA AGG ATG CCT GTC AGG TGA GTC CCC Fragmen primer forward 5’- GGA TCT CAG GGT GGG TGG CAA TGC T – 3’ Fragmen primer reverse 5’- GAA AAG CAA GCT ACC AGA AGC CCC AA – 3’
61
Lampiran 4. Alat dan bahan penelitian
Gambar 7.3.1. Elektroforesis
Gambar 7.3.3. Alat Inkubator
Gambar 7.3.2. Centrifuge Eppendorf
Gambar 7.3.4. Micropipet & Tip
Gambar 7.3.5. Cold Room dan Freezer
Gambar 7.3.6. gBlock wildtype dan mutant (tutup putih) serta primer (tutup biru)
62
Gambar 7.3.7. Reagen LC 480 HRM Master (H2O, MgCl, dan Master mix)
Gambar 7.3.8. Multiwall Plate dan alat Real Time PCR Light Cycler®Roche
Gambar 7.3.9. DNA sampel
63
Lampiran 5 Gel documentation hasil elektroforesis agarose dari isolasi genom DNA sampel
Gambar 7.4.1. Gel documentation hasil elektroforesis agarose dari isolasi genom DNA sampel Marker
120 bp
Gambar 7.4.1. Gel documentation hasil elektroforesis agarose dari produk PCR genom DNA sampel
64
Lampiran 6. Hasil kemurnian dan konsentrasi DNA sampel Tabel 7.5.1. Kemurnian dan Konsentrasi DNA Sampel No, 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37
A230 0,262 1,209 0,177 0,899 0,242 0,588 -0,062 -0,042 0,129 -0,076 -0,196 0,457 -0,017 -0,007 -0,203 -0,151 -0,301 0,054 -0,225 -0,219 -0,001 -0,012 0,22 0,247 -0,22 -0,163 -0,25 0,425 0,097 0,143 2,57 0,867 0,092 1,256 0,111 1,202 0,842
A260 0,515 2,18 0,348 2,267 0,337 1,105 0,57 0,426 0,413 0,125 0,18 0,923 0,279 0,107 0,288 0,306 0,12 0,496 0,235 0,2 0,723 0,828 0,951 1,097 0,237 0,441 0,195 0,982 1,009 0,801 2,265 1,46 0,836 3,73 1,081 2,128 1,627
A280 0,251 1,108 0,166 1,129 0,234 0,587 0,307 0,232 0,213 0,063 0,086 0,499 0,128 0,061 0,141 0,178 0,063 0,352 0,119 0,105 0,392 0,421 0,504 0,621 0,141 0,197 0,107 0,739 0,485 0,532 1,623 1,039 0,463 2,151 0,53 1,364 1,113
A260/A230 1,963 1,802 1,97 2,523 1,395 1,881 -9,226 -10,04 3,208 -1,66 -0,921 2,019 -16,772 -14,587 -1,423 -2,028 -0,4 9,182 -1,043 -0,914 -847,665 -71,179 4,325 4,438 -1,081 -2,704 -0,782 2,31 10,382 5,609 0,881 1,684 9,122 2,971 9,734 1,771 1,933
A260/A280 2,053 1,968 2,094 2,007 1,438 1,881 1,858 1,835 1,935 1,986 2,089 1,849 2,175 1,775 2,042 1,72 1,912 1,409 1,973 1,898 1,845 1,964 1,887 1,768 1,684 2,235 1,827 1,329 2,081 1,505 1,395 1,406 1,805 1,734 2,04 1,56 1,462
Konsentrasi 25,77 108,99 17,4 113,35 16,86 55,25 28,51 21,32 20,64 6,27 9,02 46,13 13,95 5,37 14,42 15,32 6,01 24,79 11,75 10 36,13 41,38 47,55 54,87 11,87 22,06 9,75 49,08 50,46 40,05 113,23 73,01 41,78 186,52 54,05 106,42 81,35
65
(Lanjutan) No, 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75
A230 0,211 0,097 0,186 0,868 -0,17 0,143 1,015 -0,147 -0,118 -0,099 0,722 0,969 0,277 -0,144 0,461 0,272 0,636 0,575 -0,29 -0,283 -0,333 -0,309 1,302 -0,288 0,468 0,149 0,32 0,306 0,194 0,271 0,603 0,217 -0,132 0,082 -0,004 0,236 -0,02 -0,122
A260 0,715 1,013 1,19 1,481 0,347 1,101 2,162 0,356 0,414 0,648 1,304 1,121 1,253 0,302 1,444 0,965 1,285 1,94 0,047 0,016 0,011 0,118 1,541 0,22 1,783 0,945 1,008 1,261 1,021 1,214 1,356 1,095 0,407 0,852 0,757 0,992 0,683 0,473
A280 0,558 0,511 0,601 1,056 0,195 0,544 1,376 0,212 0,252 0,309 0,867 0,838 0,648 0,153 0,796 0,559 0,878 0,944 0,022 0,009 0,009 0,05 1,398 0,105 1,01 0,548 0,614 0,686 0,593 0,662 0,942 0,586 0,229 0,51 0,42 0,581 0,378 0,246
A260/A230 3,387 10,468 6,385 1,707 -2,042 7,681 2,129 -2,418 -3,51 -6,562 1,804 1,157 4,532 -2,105 3,131 3,554 2,019 3,371 -0,162 -0,055 -0,034 -0,381 1,183 -0,765 3,81 6,324 3,145 4,118 5,251 4,474 2,248 5,05 -3,076 10,417 -186,279 4,2 -33,861 -3,872
A260/A280 1,281 1,98 1,98 1,403 1,78 2,022 1,571 1,679 1,641 2,1 1,503 1,339 1,934 1,972 1,815 1,725 1,464 2,054 2,11 1,654 1,247 2,331 1,102 2,102 1,766 1,724 1,642 1,838 1,72 1,835 1,439 1,869 1,775 1,671 1,804 1,709 1,806 1,92
Konsentrasi 35,73 50,63 59,49 74,07 17,36 55,04 108,1 17,81 20,7 32,42 65,18 56,06 62,66 15,1 72,22 48,24 64,24 96,98 2,35 0,78 0,57 5,88 77,03 11 89,14 47,27 50,4 63,03 51,05 60,72 67,78 54,73 20,35 42,62 37,87 49,61 34,16 23,64
66
(Lanjutan) No, 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102
A230 0,08 0,114 0,017 0,178 0,211 0,416 0,587 2,678 1,137 0,625 0,038 0,072 0,279 2,394 1,004 0,199 0,669 0,547 1,508 0,195 0,764 0,437 0,501 0,019 1,247 0,247 -0,191
A260 0,816 0,86 0,685 0,988 0,937 1,207 2,023 5,249 1,644 1,182 0,911 0,874 0,992 3,807 1,619 1,149 1,39 1,19 1,979 0,943 2,306 1,697 0,842 0,707 2,727 1,117 0,251
A280 0,487 0,548 0,47 0,715 0,541 0,697 0,96 3,034 0,909 0,821 0,427 0,418 0,507 3,01 1,134 0,608 0,842 0,626 1,113 0,459 1,11 0,788 0,519 0,347 1,524 0,59 0,129
A260/A230 10,173 7,513 39,492 5,564 4,446 2,899 3,448 1,96 1,446 1,892 23,765 12,113 3,557 1,591 1,613 5,783 2,078 2,177 1,313 4,829 3,02 3,885 1,681 37,568 2,186 4,521 -1,311
A260/A280 1,676 1,571 1,459 1,382 1,732 1,733 2,108 1,73 1,808 1,44 2,136 2,092 1,958 1,265 1,428 1,891 1,652 1,901 1,778 2,055 2,077 2,152 1,622 2,038 1,79 1,893 1,944
Konsentrasi 40,8 43,01 34,27 49,4 46,86 60,37 101,16 262,43 82,2 59,1 45,56 43,72 49,6 190,37 80,95 57,47 69,51 59,5 98,96 47,14 115,31 84,84 42,08 35,36 136,37 55,83 12,53
67
Lampiran 7. Hasil kurva HRM dan sekuensing
Gambar 7.6.1. Melting Curve gBlock Wildtype, Heterozygote, dan Mutant
Gambar 7.6.2. Melting Curve DNA Sampel
Delesi 1 basa C
Ganda basa C/T
Gambar 7.6.3. Hasil Secuencing Sampel Nomor 2, terdapat dua mutasi, yakni 1 delesi dan 1 ganda basa
68
(Lanjutan)
Ada basa T
Tidak ada ganda basa
Gambar 7.6.4. Hasil Secuencing Sampel Nomor 86, terjadi substitusi C menjadi T dan tidak ada ganda basa
A
B C
Gambar 7.6.5. Melting Curve. (A) Grafik wildtype, (B) Grafik mutant, sampel nomor 86, C berubah menjadi T,dan (C) Grafik heterozygote C/T dan delesi C
Heterozygote Mutant
Ganda Heterozygote
Gambar 7.6.6. Melting Curve. Sampel nomor 70, 71, 72, 85 dan 86
69
(Lanjutan)
Gambar 7.6.7. Hasil sekuensing ganda heterozygote
70
(Lanjutan) Tabel 7.6.1. Hasil Analisis Penggolongan SNP rs855791 berdasarkan Melting Curve No Sampel 1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
Hb 14 11,7 9,3 10,1 8,1 11,7 15,2 10,5 13,1 11,2 14,9 11 15,3 13,1 13,2 13,1 8,6 11,6 8,4 9,7 8,8 18,5 10 11,1 8,3 10,9 14,1 13,3 12,3 9,5 10,4 9,5 12,9 12 11,4 11,8 15 14,6
Jenis Kelamin P P P P P L L P P P L L L L L P P P P P P L L P P P L L L P P P P L P P L L
Wildtype Heterozygot Mutant + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
71
(Lanjutan) No Sampel 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84
Hb 8,4 12,7 13,1 12 12,9 10,7 9 14,8 9,8 10,2 9,7 11,6 9,8 8,7 11,2 11,9 11 10,1 10,2 12,1 11,2 8,2 13,8 9,3 11,6 11 11,9 10 8,8 11,1 8,7 11,7 13,8 11,4 12,3 16,4 11,3 10,9 12 11,4
Jenis Kelamin L L P L L P P L P P P P P P L L L P P P P P L P P P P P P P P P L L L L P P P P
Wildtype Heterozygot Mutant + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
72
(Lanjutan) No Sampel 85 86 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135
Hb 9,8 11,8 11,8 11,6 13,1 12,6 11,2 11,1 15,1 11,1 9,9 10,5 8 12 12,1 10 11,1 13,1 10,4 10,4 13,2 14,7 10,5 15,7
Jenis Kelamin P P L P P P P P L P P P P L L P P L L P L L L P
Wildtype Heterozygot Mutant + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
73
Lampiran 8. Hasil analisis statistik Jenis Kelamin Jenis Kelamin
Valid
Laki-laki Perempuan
Frequency 37
Total
Percent Valid Percent 36,3 36,3
65
63,7
63,7
102
100,0
100,0
Cumulative Percent 36,3 100,0
Usia Responden
Usia Responden
Case Processing Summary Cases Valid Missing N Percent N Percent 102 100,0% 0 0,0%
Total N Percent 102 100,0%
Descriptives Statistic Mean 90% Confidence Interval for Mean
Umur Responden
5% Trimmed Mean Median Variance Std. Deviation Minimum Maximum Range Interquartile Range Skewness Kurtosis
Lower Bound Upper Bound
19,63 19,42
Std. Error ,125
19,84 19,61 20,00 1,602 1,266 17 23 6 2 ,200 -,034
,239 ,474
74
(Lanjutan) Tests of Normality Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk Statistic Df Sig. Statistic df Sig. Usia Responden ,155 102 ,000 ,924 102 ,000 a. Lilliefors Significance Correction Usia Responden Frequency Valid
17 18 19 20 21 23 Total
3 18 26 28 24 3 102
Percent Valid Percent 2,9 2,9 17,6 17,6 25,5 25,5 27,5 27,5 23,5 23,5 2,9 2,9 100,0 100,0
Cumulative Percent 2,9 20,6 46,1 73,5 97,1 100,0
Indeks Massa Tubuh
Index Massa Tubuh
Case Processing Summary Cases Valid Missing N Percent N Percent 102 100,0% 0 0,0%
Total N Percent 102 100,0%
Descriptives Index Massa Tubuh
Mean 90% Confidence Interval for Mean 5% Trimmed Mean Median Variance Std. Deviation Minimum Maximum
Lower Bound Upper Bound
Statistic Std. Error 21,4235 ,34903 20,8441 22,0029 21,1728 20,4147 12,426 3,52499 15,22 33,61
75
(Lanjutan) Range Interquartile Range Skewness Kurtosis
18,39 3,57 1,268 1,720
Tests of Normality Kolmogorov-Smirnova Statistic ,139
Df 102
Index Massa Tubuh a. Lilliefors Significance Correction
,239 ,474
Shapiro-Wilk
Sig. Statistic ,000 ,903
Df 102
Sig. ,000
Kategori Index Massa Tubuh
Valid
BB kurang Normal BB lebih Obes 1 Obes 2 Total
Frequency 18 60 9 12 3 102
Kadar Hemoglobin (g/dL) Statistics Kadar Hemoglobin (g/dL) N Valid Missing Mean Std. Error of Mean Median Mode Std. Deviation Variance Skewness Std. Error of Skewness Kurtosis
102 0 11,5265 ,20022 11,3500 13,10 2,02215 4,089 ,627 ,239 ,563
Percent Valid Percent 17,6 17,6 58,8 58,8 8,8 8,8 11,8 11,8 2,9 2,9 100,0 100,0
Cumulative Percent 17,6 76,5 85,3 97,1 100,0
76
(Lanjutan) Std. Error of Kurtosis Range Minimum Maximum
,474 10,50 8,00 18,50
Tests of Normality Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk Statistic df Sig. Statistic df Sig. ,094 102 ,026 ,970 102 ,019
Kadar Hemoglobin (g/dL) a. Lilliefors Significance Correction Statistics Kategori Kadar Hemoglobin N Valid 102 Missing 0
Kategori Kadar Hemoglobin
Valid
Non Anemia Anemia Total
Genotyping (C>T) Statistics Genotip C>T N Valid Missing
Frequency 22 80 102
Percent Valid Percent 21,6 21,6 78,4 78,4 100,0 100,0
Cumulative Percent 21,6 100,0
102 0 Genotip C>T
Valid
C CT T Total
Frequency 4 74 24 102
Percent Valid Percent 3,9 3,9 72,5 72,5 23,5 23,5 100,0 100,0
Cumulative Percent 3,9 76,5 100,0
77
(Lanjutan) Case Processing Summary Cases Valid Missing Total Jenis Kelamin N Percent N Percent N Percent Kadar Laki-laki 37 100,0% 0 0,0% 37 100,0% Hemoglobin Perempuan 65 100,0% 0 0,0% 65 100,0% (g/dL) Descriptives Jenis Kelamin Kadar Laki-laki Mean Hemoglo90% Lower bin (g/dL) Confidence Bound Interval for Upper Mean Bound 5% Trimmed Mean Median Variance Std. Deviation Minimum Maximum Range Interquartile Range Skewness Kurtosis Perempuan Mean 90% Lower Confidence Bound Interval for Upper Mean Bound 5% Trimmed Mean Median Variance Std. Deviation Minimum Maximum Range Interquartile Range
Statistic Std. Error 12,9649 ,32591 12,4146 13,5151 12,9237 12,9000 3,930 1,98245 8,40 18,50 10,10 2,90 ,345 ,688 10,7077 10,3893 11,0261 10,6590 10,9000 2,365 1,53799 8,00 15,70 7,70 1,90
,388 ,759 ,19076
78
(Lanjutan) Skewness Kurtosis
Jenis Kelamin Laki-laki Perempuan
,480 ,623
,297 ,586
Tests of Normality Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk Statistic df Sig. Statistic df Sig. * ,091 37 ,200 ,981 37 ,754
Kadar Hemoglobin ,070 65 ,200* (g/dL) *. This is a lower bound of the true significance. a. Lilliefors Significance Correction
,972
65
,144
Kadar Hemoglobin (g/dL) T-Test Group Statistics Jenis Kelamin Kadar Laki-laki Hemoglobin Perempuan (g/dL)
N
Mean Std. Deviation 37 12,9649 1,98245 65 10,7077
1,53799
Std. Error Mean ,32591 ,19076
(Lanjutan) Independent Samples Test Levene's Test for Equality of Variances
F Kadar Hemoglobin (g/dL)
Equal variances assumed Equal variances not assumed
2,449
Sig. ,121
t-test for Equality of Means
T
Sig. (2tailed)
df
Mean Difference
Std. Error Difference
90% Confidence Interval of the Difference Lower Upper
6,404
100
,000
2,25717
,35244
1,67205
2,84230
5,977
60,874
,000
2,25717
,37764
1,62641
2,88793
80
(Lanjutan) Case Processing Summary Cases Valid Missing N Percent N Percent Jenis Kelamin * Kategori Kadar Hemoglobin
102
100,0%
0
0,0%
N 102
Total Percent 100,0%
Jenis Kelamin * Kategori Kadar Hemoglobin Crosstabulation Kategori Kadar Hemoglobin Non Anemia Anemia Total Jenis Laki-laki Count 13 24 37 Kelamin Expected 8,0 29,0 37,0 Count Perempuan Count 9 56 65 Expected 14,0 51,0 65,0 Count Total Count 22 80 102 Expected 22,0 80,0 102,0 Count Chi-Square Tests Asymp. Exact Sig. (2Sig. (2- Exact Sig. Value df sided) sided) (1-sided) a 6,317 1 ,012 5,121 1 ,024 6,111 1 ,013 ,023 ,013
Pearson Chi-Square Continuity Correctionb Likelihood Ratio Fisher's Exact Test Linear-by-Linear 6,255 1 ,012 Association N of Valid Cases 102 a. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 7,98. b. Computed only for a 2x2 table
81
(Lanjutan) Crosstabs Case Processing Summary Cases Valid Missing N Percent N Percent N Jenis Kelamin * Genotip C>T
Jenis Kelamin
Total
102
100,0%
0
0,0%
Total Percent
10 2
Jenis Kelamin * Genotip C>T Crosstabulation Genotip C>T C CT T Laki-laki Count 2 25 10 Expected 1,5 26,8 8,7 Count Perempuan Count 2 49 14 Expected 2,5 47,2 15,3 Count Count 4 74 24 Expected 4,0 74,0 24,0 Count Chi-Square Tests Value ,826a ,810
df
Asymp. Sig. (2sided) 2 ,662 2 ,667
Pearson Chi-Square Likelihood Ratio Linear-by-Linear ,099 1 ,753 Association N of Valid Cases 102 a. 2 cells (33,3%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 1,45.
100,0%
Total 37 37,0 65 65,0 102 102,0
82
(Lanjutan) Genotip C>T Case Processing Summary Cases Valid Missing Total Genotip Percen C>T N Percent N t N Percent Kadar C 4 100,0% 0 0,0% 4 100,0% Hemoglobin CT 74 100,0% 0 0,0% 74 100,0% (g/dL) T 24 100,0% 0 0,0% 24 100,0% Tests of Normality KolmogorovSmirnova Shapiro-Wilk Genotip C>T Statistic df Sig. Statistic df Sig. Kadar C ,268 4 , ,949 4 ,712 Hemoglobin CT ,122 74 ,008 ,952 74 ,007 (g/dL) T ,151 24 ,163 ,938 24 ,145 a. Lilliefors Significance Correction Genotip C>T
Kadar Hemoglobin (g/dL)
Case Processing Summary Cases Valid Missing Genotip C>T N Percent N Percent C 4 100,0% 0 0,0% CT 74 100,0% 0 0,0% T 24 100,0% 0 0,0%
Total N Percent 4 100,0% 74 100,0% 24 100,0%
Tests of Normality KolmogorovSmirnova Shapiro-Wilk Genotip C>T Statistic df Sig. Statistic df Sig. Kadar C ,268 4 , ,949 4 ,712 Hemoglobin CT ,122 74 ,008 ,952 74 ,007 (g/dL) T ,151 24 ,163 ,938 24 ,145 a. Lilliefors Significance Correction
83
(Lanjutan) Genotip C>T Kadar C Mean Hemoglobin 90% Confidence Lower Bound (g/dL) Interval for Mean Upper Bound 5% Trimmed Mean Median Variance Std. Deviation Minimum Maximum Range Interquartile Range Skewness Kurtosis CT Mean 90% Confidence Lower Bound Interval for Mean Upper Bound 5% Trimmed Mean Median Variance Std. Deviation Minimum Maximum Range Interquartile Range Skewness Kurtosis T Mean 90% Confidence Lower Bound Interval for Mean Upper Bound 5% Trimmed Mean Median Variance Std. Deviation Minimum Maximum Range Interquartile Range Skewness Kurtosis
Statistic Std. Error 12,1000 1,07858 9,5617 14,6383 12,0667 11,8000 4,653 2,15716 9,80 15,00 5,20 4,00 ,803 1,014 1,705 2,619 11,5595 ,24752 11,1471 11,9718 11,4611 11,2000 4,534 2,12924 8,20 18,50 10,30 2,88 ,789 ,279 ,576 ,552 11,3292 ,34513 10,7377 11,9207 11,3806 11,8000 2,859 1,69076 8,00 13,80 5,80 2,72 -,572 ,472 -,615 ,918
84
(Lanjutan)
Kadar Hemoglobin (g/dL)
Genotip C>T C Mean 90% Lower Bound Confidence Upper Bound Interval for Mean 5% Trimmed Mean Median Variance Std. Deviation Minimum Maximum Range Interquartile Range Skewness Kurtosis CT Mean 90% Lower Bound Confidence Upper Bound Interval for Mean 5% Trimmed Mean Median Variance Std. Deviation Minimum Maximum Range Interquartile Range Skewness Kurtosis T Mean 90% Lower Bound Confidence Upper Bound Interval for Mean 5% Trimmed Mean Median Variance Std. Deviation Minimum Maximum Range Interquartile Range Skewness Kurtosis
Statistic 12,1000 9,5617
Std. Error 1,07858
14,6383 12,0667 11,8000 4,653 2,15716 9,80 15,00 5,20 4,00 ,803 1,705 11,5595 11,1471
1,014 2,619 ,24752
11,9718 11,4611 11,2000 4,534 2,12924 8,20 18,50 10,30 2,88 ,789 ,576 11,3292 10,7377
,279 ,552 ,34513
11,9207 11,3806 11,8000 2,859 1,69076 8,00 13,80 5,80 2,72 -,572 -,615
,472 ,918
85
(Lanjutan) Kadar Hemoglobin (g/dL) Kruskal-Wallis Test Ranks Genotip C>T Kadar Hemoglobin (g/dL) C CT T Total
N
Mean Rank 4 60,25 74 50,81 24 52,17 102
Kadar Hemoglobin (g/dL) ,402 2 ,818
Chi-Square df Asymp. Sig. a. Kruskal Wallis Test b. Grouping Variable: Genotip C>T Crosstabs
Case Processing Summary Cases Valid Missing N Percent N Percent Kategori Kadar Hemoglobin * Genotip C>T
102
100,0%
0
0,0%
N 102
Total Percent 100,0%
Kategori Kadar Hemoglobin * Genotip C>T Crosstabulation Genotip C>T C CT T Total Kategori Non Count 1 18 3 22 Kadar Anemia Expected Count ,9 16,0 5,2 22,0 Hemoglobin Anemia Count 3 56 21 80 Expected Count 3,1 58,0 18,8 80,0 Total Count 4 74 24 102 Expected Count 4,0 74,0 24,0 102,0
86
(Lanjutan) Chi-Square Tests Value 1,527a 1,672
df
Asymp. Sig. (2-sided) ,466 ,433
Pearson Chi-Square 2 Likelihood Ratio 2 Linear-by-Linear 1,301 1 ,254 Association N of Valid Cases 102 a. 2 cells (33,3%) have expected count less than 5. The minimum expected count is ,86.
Statistics kategori A260/A280 N Valid Missing
Valid baik tinggi rendah Total
102 0
kategori A260/A280 Valid Cumulative Frequency Percent Percent Percent 45 44,1 44,1 44,1 9 8,8 8,8 52,9 48 47,1 47,1 100,0 102 100,0 100,0
Statistics kategori konsentrasi N Valid Missing
102 0
kategori konsentrasi Valid Cumulative Frequency Percent Percent Percent Valid baik 93 91,2 91,2 91,2 <10ng/uL 9 8,8 8,8 100,0 Total 102 100,0 100,0
87
Lampiran 9. Curriculum vitae peneliti
CURICULUM VITAE Nama Panggilan Jenis Kelamin Tempat, Tanggal Lahir Usia Golongan Darah Mobile Agama E-mail Alamat
Pendidikan a. Kindergarten b. Elementary School c. Yunior High School d. Senior High School e. University
: Amatillah Raifah : Ifah : Perempuan : Pontianak, 4 April 1994 : 21 Tahun :O : 082213243645 : Islam :
[email protected] : Jl. Danau Sentarum Gg. H. Nawawi No. 66, Pontianak, Kalimantan Barat
: TK Al-Mukaddimah : SD Muhammadiyah I Pontianak : MTs Negeri 2 Pontianak : SMA Negeri 1 Pontianak : UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Pengalaman Organisasi : Local Officer on Medical Education CIMSA UIN 2014-2015 Supervising Council CIMSA UIN 2015-2016 Penghargaan: Best Commander LKBB tingkat Sekolah Menengah Pertama se Kota Pontianak 2008 5 Terbaik LKTI Fakultas Biologi UNTAN Pontianak 2011 Mahasiswa Putri terbaik OPAK PSPD 2012 UIN Jakarta Best Member CIMSA Local UIN 2013-2014 Best Local Officer CIMSA Local UIN 2014-2015 Most Innovative Project of SCOME CIMSA UIN on Project Day CIMSA 2014 Best Local SCOME CIMSA on May Meeting CIMSA 2015 10 Finalis LKTI Muhammadiyah Jakarta Scientifc Competition (Majesty) Tingkat Nasional 2014 Karya Tulis : Potensi Z-din dalam Arachis hypogaea L sebagai Inhibitor Reseptor P2X7 untuk Alternatif Penatalaksanaan Hepatitis C
