Transgenní zvířata
Obsah přednášky 1) Historické poznámky
2) Lidské kmenové buňky 3) Farmaceutické produkty v živočišných klonech 4) Příklady experimentálního klonování
Rozlišujme klonování jednotlivých genů a klonování celých organismů
První vědecké pokusy o klonování celých organismů regenerace žížal, mořských hvězdic
1952 – Briggs a King přenos jader mezi vajíčky žab dárcem buňky časného embrya klony dorostly jen do stádia pulce 60. a 70. léta 20. století – John Gurdon dárcem buňky z vnitřností pulce vypěstoval dospělé žáby Nobelova cena v roce 2012 (za objev pluripotence)
80. léta – rozdělení embrya Umělá příprava dvojčat, trojčat, …
1. adoptivní matka
2. adoptivní matka
3. adoptivní matka
90. léta metody rozdělení embrya i transplantace jader využívány ke klonování myší, krav, prasat, králíků a ovcí další pokusy byly neúspěšné, u vyšších obratlovců se jedinci nedožili dospělosti
PROBLÉM SPECIALIZACE SAVČÍCH BUNĚK ? U ROSTLIN JE JINÁ SITUACE
Klonování genu - Supermouse
Myš
Supermyš
připravena v roce 1982 nesla gen pro krysí nebo lidský růstový hormon
8
Beltsville pig Připraveno v roce 1989
transgenní prase s genem pro lidský růstový hormon velké přírůstky na váze ve srovnání s normálním prasetem zvýšená produkce hormonu způsobila zvětšení vnitřních orgánů problém s pohybem v důsledku nadváhy 9
Ovečka Dolly 1996, Ian Wilmut, Roslin Institute, Edinburg, Skotsko
buňky z mléčné žlázy dospělé ovce přenos do enukleovaného vajíčka elektrické pulsy 277 neúspěšných pokusů
Je možné reprogramovat jádro živočišné buňky
Jak vznikla ovečka Dolly?
tělní buňka s DNA
transformace
fůze
odstranění DNA z vajíčka
klon
Metoda pronukleární injekce velmi nespolehlivá (DNA přenos a integrace do genomu vajíčka je velmi málo pravděpodobné typický „výtěžek“ 1 až 5 transgenních zvířat na 100 narozených
Metoda přenosu jádra
vyjmutí jádra z buňky dárce přenesení do vajíčka ze kterého bylo předtím jádro odstraněno
Co následovalo? 1997 naklonovaná kráva 1997 ovce s lidským genem – srážecí faktor IX
1998 telata s lidským sérovým albuminem transgenní myši, pes, opice 2007 – Ústav živočišné fyziologie a genetiky AV ČR, Liběchov u Prahy – objev funkce jadérka
Nastala éra geneticky modifikovaných organismů
2013 – naklonovány kmenové buňky člověka Shoukhrat Mitalipov, The Oregon National Primate Research Center in Beaverton (http://vimeo.com/66218135) kožní buňka – fétus nebo 8 měsíční dítě
fúze = přenos jádra
lidský oocyt s odstraněnou DNA
podpořeno přidáním virových kapsidových proteinů a kofeinu
embryo s DNA z kožních buněk
odběr kmenových buněk z blastocysty
Implantace (u opic) do dělohy se nezdařila, placenta se nevyvinula (podobné abnormality u lidských embryí)
http://vimeo.com/66218135
Rekombinantní proteiny v mléce zvířat vysoce efektivní a ekonomicky výhodné jedna kráva nadojí cca 10.000 L úroveň exprese 1-10 g/L proteinu Pro některé teraupeutické proteiny postačí pouze několik transgenních krav na zabezpečení požadavků farmaceutického trhu.
Nebo budou lepší transgenní kozy? (BELE®) – Nexia Biotechnologies
rychlejší množení a dřívější laktace ve srovnání s krávou
Příklady kozy antitrombin III zabraňuje vzniku krevních sraženin GTC Biotherapeuticals, USA
ovce Polly srážecí krevní faktor IX léčba hemofilie
krávy lidský laktoferin Pharming, Nizozemí 19
Problémy? klonování 18 měsíců produkce do 1 roku – k dispozici množství anti-trombinu ekvivalentní 90 000 odběrů ! použit při operaci 12 pacientů a 9 porodech European Medicine Agency označila počet za nedostatečný
V roce 2002 PPL Therapeutics (ovce s lidským alfa-1antitrypsinem) – nežádoucí účinky při klinických zkouškách Podobně Pharming s laktoferinem 20
Klony skotu mají více proteinů Biotechnologická firma AgReserach, NZ 2003 devět GM klonů skotu se zvýšenou hladinou kaseinů beta a kapa v mléce hladiny beta kaseinu o 20%, kappa o 40% celkové množství proteinu v mléce vyšší o 13%
geny byly vneseny do kožních buněk 60 dní starého plodu samičího pohlaví organismus tak nese kromě původních genů i extra kopie ze stejného druhu Budou do 10 let na trhu GM jogurty?
21
Budou GM jogurty do 10 let na trhu ?
GM
22
Transgenní králíci A) králíci se efektivně a rychle množí a dosahují produkce mléka do 1 roku B) „pharming králíci“ jsou prostí patogenů a není známa nemoc přenášející se na člověka C) produkce až 10 L mléka /rok exprese až 20 g/L proteinu D) ideální pro výrobu malého a středního rozsahu do 50kg proteinu/rok
„Alergy-free“ domácí mazlíček Kůže a sliny kočky obsahují protein považovaný za jeden z významných alergenů pro člověka - je produkován genem "Fel d1". „Výroba“ transgenní kočky: 1) odběr kožních buněk kočky 2) nahrazení „Fel d1“ genu defektním 3) klonování - přenesení jádra kožní buňky do bezjaderného vajíčka 4) přenos vajíček do náhradní matky
Firma Transgenic Pets Inc. - zaváděcí cena na trhu 900 USD
Klonování koček „Carbon Copy“
- první klon kočky se svou matkou-klonem (Texas A&M University) odlišné zbarvení srsti = příslušné geny jsou aktivovány během fetálního vývoje
Metoda: 1) fúze 188 kožních buněk s vajíčkem – 82 klonovaných embryí x pouze jedno se úspěšně uchytilo v děloze x potrat 2) fúze kožních buněk s buňkami epitelu dělohy
Enviropig EnviropigTM - transgenní prase „přátelské pro životní prostředí“ University of Guelph, UK - schopnost degradace fytátu v rostlinné potravě díky enzymu ve slinách = není třeba dodávat fosfor do krmiva = snížené znečištění kejdy fosfátem o 60%
Phytasa a) produkována slinnými žlázami díky transgenu phytasy z E. coli spojeného s myším genem pro protein ze slinných žláz (pouze stopy produkovány ve svalech, játrech, srdci a kůži - do 0,1%) b) produkována ve vysokém množství - až 100,000 U/kg krmiva c) enzym je plně stabilní v žaludku a kompletně odbouráván v tenkém střevě
Klonování koní „Prometea“ - první koňský klon se svou matkou-klonem (Laboratory of Reproductive Technology, Cremona)
- matka hříběte= vlastní dárce vajíčka ! - potřeba 800 neúspěšných fúzí 2008 – porodila hříbě Pegasus
Při klonování není identita klonů živočichů zaručena epigenetické faktory (metylace DNA) extra-jaderná dědičnost náhodné ztráty správného imprintingu diferencované samičí buňky obsahují pouze jeden X chromozóm x buňky z časného samčího embrya mají aktivní oba X chromozómy reprogramování genomu po jaderném přenosu v důsledku funkčních rozdílů mezi samci a samicemi
Myši s rybím tukem pozměněný metabolismus mastných kyselin – produkují omega-3polynenasycené mastné kyseliny naklonován gen z Caenorhabditis elegans
Získáme podobně hospodářská zvířata produkující omega-3 v mléce, mase, vejcích? 29
Špenátové prase připraveno v Japonsku nese desaturasu špenátu mění nasycené mastné kyseliny na nenasycené Na trhu se zdravými potravinami se zatím ale neprosadilo
30
Krávy odolné proti mastitidě fibroblast
gen pro lysostaphin
mastitidu způsobuje S. aureus fůze
odstranění DNA z vajíčka
transformace rok 2000
klon Annie
31
Pokračování? Annie měla v roce 2002 další 3 sestry
V roce 2003 se Annie narodil býček Podobně si vedly její sestry Po infekci S. aureus onemocnělo 14% transgenních a 71% kontrolních zvířat 32
Krávy odolné k BSE Vyvinula americká Hematech spolu s biotechnologickou divizí japonského pivovaru Kirin Okolnosti vzniku odolného jedince tají – údajně knock-out Podobně oznámili přípravu takové krávy v Koreji v roce 2003 Genetická modifikace, která zajistila produkci té části prionového proteinu, který je odolný vůči proměně na prion 33
Jalovice Yoon Nese umělý chromozóm s geny pro tvorbu lidských protilátek Vyvinula americká Hematech spolu s biotechnologickou divizí japonského pivovaru Kirin
34
Stanovisko EFSA a FDA ke klonování hospodářských zvířat FDA konstatovala, že živočišné produkty získané z klonů hospodářských zvířat jsou pro konzumenty bezpečné
EFSA se s verdiktem FDA ztotožnila
http://www.osel.cz/index.php?obsah=6&clanek=3952
36
Fluoreskující rybičky Danio rerio nesoucí GFP - GloFish Gen se vyskytuje v medůze Aequorea victoria Vytvořeny na Národní univerzitě v Singapuru Určeny k testování přítomnosti estrogenů nebo polutantů v ŽP Změna barvy indikuje znečištění Naklonován též do moskytů, octomilek, myší, prasat
37
V České republice se nesmí pěstovat ani dovážet! Postih a vysoká pokuta za neoprávněné nakládání s nepovoleným geneticky modifikovaným organismem podle zákona č.78/2004 Sb.
38
Další varianty fluoreskujících rybiček Zelený fluoreskující protein z medůzy (GFP)
Červený fluoreskující protein z korálu (RFP) Bakteriální proteiny fluoreskující v infraoblasti (IFP) Deinococcus radiodurans
K čemu to slouží ?
39
Další příklady „fosforeskující myš“ Japanese team at Osaka University „After trying to express GFP with various kinds of promoters, we turn on the hand held UV lamp on a new trial of transgenic mouse line and there we found the mice glowing in the dark“ „fosforeskující králik Alba“ EGFG ( enhanced green fluorescent gene) vnesen do oplodněného králíčího vajíčka
Mr. Green Genes
2008 - Audubon Center for Research of Endangered Species (USA)
Opičák ANDi První GM primát - makak rhesus „ANDi“ (inserted DNA backwards) Oregon Regional Primate Research Centre, USA (12 January 2001)
injektováno 224 vajíček 40 životaschopných embryí - 5 těhotenství 3 narozená mláďata, pouze jeden nositel neaktivního genu
A mnoho dalších informací najdete na
www.osel.cz
Shrnutí 1) Historické poznámky
2) Lidské kmenové buňky 3) Farmaceutické produkty v živočišných klonech 4) Příklady experimentálního klonování
