Protilátky proti toxoidu tetanu (IgG) Návod na použití ELISA testu Objednací číslo EI 2060-9601G
Určení Tetanus toxoid
Třída IgG IgG
Substrát Ag-potažené mikrotitrační jamky
Formát 96 x 01 (96)
Princip testu: ELISA kit umožňuje kvantitativní provedení in-vitro testu pro určení lidských protilátek třídy IgG proti toxoidu tetanu. Diagnostický kit (souprava) obsahuje oddělené proužky mikrotitrační desky, každý s osmi jamkami, které jsou potaženy toxoidem tetanu.V prvním reakčním kroku jsou v jamkách inkubována ředěná séra získaná od pacientů. V případě pozitivních vzorků se specifické IgG (také IgM a IgA) protilátky navážou na antigeny. K detekci navázaných protilátek slouží druhá inkubace provedená s enzymem značenou protilátkou proti lidskému IgG ( enzymový konjugát), která je schopna vyvolat barevnou reakci. Intenzita barevné reakce je přímo úměrná koncentraci protilátek proti toxoidu tetanu a odečítá se z kalibrační křivky sestrojené pomocí kalibračních sér 1 až 4. Obsah kitu: - Mikrotitrační jamky potažené antigeny: 12 oddělených proužků mikrotitrační desky, každý obsahuje 8 jednotlivých oddělitelných jamek v rámečku (připravené k použití). - Kalibrační séra 1 až 4, značené červeně s klesající intensitou: - Kalibrační sérum 1, 4 IU/ml (lidské IgG): 1 x 1,3 ml, připravené k použití. - Kalibrační sérum 2, 1 IU/ml (lidské IgG): 1 x 1,3 ml, připravené k použití. - Kalibrační sérum 3, 0,1 IU/ml (lidské IgG): 1 x 1,3 ml, připravené k použití. - Kalibrační sérum 4, 0,01 IU/ml (lidské IgG): 1 x 1,3 ml, připravené k použití. - Pozitivní kontrolní sérum (lidské IgG): 1 x 1,3 ml, připravené k použití. Značeno modře. - Negativní sérum (lidské IgG): 1x 1,3 ml, připravené k použití. Značeno zeleně. - Enzymový konjugát: peroxidasou značené králičí protilátky proti lidskému IgG: 1 x 12 ml, připraveno k použití. Značeno zeleně. - Vzorkový pufr: 1 x 100 ml, připraveno k použití. Značeno světle modře. - Promývací pufr: 1 x 100 ml (10 x koncentrovaný). - Chromogen/substrátový roztok: 1 x 12 ml, připraveno k použití. Chromogen: tetrametylbenzidin; substrát: peroxid vodíku. - Zastavovací roztok: 1 x 12 ml, připraveno pro použití. 1 N kyselina fosforečná. - Návod k provedení testů. - Protokol s hodnotami. Uskladnění a stabilita: Diagnostický kit musí být skladován při teplotě mezi +2 oC až +8 oC, nesmí být zmražen. Souprava, obsahuje-li všechny součásti neotevřené, vydrží až do vyznačeného data expirace. Upozornění: Užitá kontrolní séra jsou testována pomocí enzymoimunologických testů a nepřímých imunofluorescenčních metod na nepřítomnost HbsAG, anti-HCV, anti- HIV-1 a anti-HIV-2. Nicméně, se vším uvedeným materiálem se musí zacházet jako s potenciálně infekčně nebezpečným a musí se s ním zacházet velmi opatrně. Některé reagencie jsou jedovaté (pufr, roztok chromogen/substrát). Vyvarujte se kontaktu s kůží. V případě kontaktu, omyjte kůži mýdlem a velkým množstvím vody.
Příprava a stabilita reagencií Všechny reagencie se musí nechat před použitím vytemperovat na pokojovou teplotu. Potažené jamky: Připravené k použití. Uchopte zabalenou desku nad lepícím švem a trhnutím otevřete lepící ochranný obal . Neotvírejte dříve, než je mikrotitrační deska vytemperovaná na pokojovou teplotu, tím zabráníte zvlhnutí jednotlivých proužků. Ihned přemístěte jamky mikrotitrační desky, které nebudete používat, zpět do ochranného zalepovacího obalu a obal stiskem lepícího švu uzavřete. Zbylé jamky v již jednou otevřeném ochranném obalu se musí skladovat na suchém místě v rozmezí teplot +2 oC až +8 oC, lze je použít po dobu nejméně dvou měsíců. Kalibračí a kontrolní séra: Připravena k použití. Séra se musí před použitím řádně promíchat. Enzymový konjugát: Připraven k použití. Konjugát se musí před použitím řádně promíchat. Vzorkový pufr: Připraven k použití Promývací pufr: Promývací pufr je dodáván 10 x koncentrovaný. Požadované množství pufru se čistou pipetou odebere ze zásobní lahve a zředí se 1 : 10 destilovanou vodou. Například, zřeďte 5 ml pomocí 45 ml vody pro 8 mikrotitračních jamek. Naředěný pufr je stabilní pro použití maximálně po dobu jednoho týdne při teplotě +2 oC až +8 oC. Poznámka: Jestliže se v koncentrovaném pufru objeví krystaly, zahřejte ho na 37 oC a před ředěním promíchejte. Chromogen/substrátový roztok: Připravený pro užití. Uzavřete láhev ihned po použití, obsah je citlivý na světlo. Zastavovací roztok. Připravený pro užití Ředění séra a vzorků plasmy Vzorky séra a plazmy pro analýzu se ředí 1: 101 vzorkovým pufrem. Například, přidejte 10 µl séra k 1 ml vzorkového pufru a dobře promíchejte. Poznámka: Kalibrační a kontrolní séra jsou již naředěna a připravena pro přímé použití. Neřeďte je znovu. Inkubace Inkubace vzorku: 1. Krok. Přeneste 100 µl kalibračního séra, pozitivní a negativní kontroly nebo ředěného vzorku séra do jednotlivých mikrotitračních jamek a inkubujte 30 minut při pokojové teplotě. Promývání: Vyprázdněte jamky a následně promyjte každou jamku třikrát pomocí 300 µl naředěného promývacího pufru. Aby došlo k promytí, pufr musí v jamce působit alespoň třicet vteřin během každého promývacího cyklu, teprve potom jamku vyprázdněte. Po proběhnutí všech promývacích cyklů (provedených ručně nebo automaticky) kapalinu z jamek řádně odstraňte, vyklepejte promývací pufr poklepem desky dnem vzhůru na filtrační papír.
Inkubace konjugátu: 2. Krok. Napipetujte 100 µl enzymového konjugátu (peroxidasou značené anti-lidské IgG) do každé jamky mikrotitrační desky. Inkubujte po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Promývaní: Vyprázdněte jamky. Promývání je popsáno výše Inkubace substrátu: 3. Krok. Napipetujte 100 µl roztoku chromogen/substrát do každé mikrotitrační jamky. Inkubujte po dobu 15 minut při pokojové teplotě ve tmě. Zastavení reakce: Napipetujte 100 µl zastavovacího roztoku do každé jamky mikrotitrační desky a to v tom samém pořadí , jako byl kapán chromogen/substrátový roztok. Měření: Fotometrické měření intenzity barvy by mělo být prováděno při vlnové délce 450 nm a referenční vlnové délce mezi 620 a 650 nm za 30 minut od přidání zastavovacího roztoku. Před měřením je nutné mikrotitrační desku pečlivě protřepat, tím se zajistí homogenní distribuce roztoku. Pipetovací protokol 1 2 A C1 P3 B C2 P4 C C3 P5 D C4 P6 E pos P7 F neg P8 G P1 P9 H P2 P10
3 P11 P12 P13 P14 P15 P16 P17 P18
4 P19 P20 P21 P22 P23 P24
5
6
7
8
9
10
11
12
Výše uvedený pipetovací protokol je příkladem analýzy sér od 24 pacientů (P1 až P24). Kalibrační séra (C1 až C4), pozitivní a negativní kontrolní séra (pos a neg) a všechny vzorky sér od pacientů byly inkubovány každý v jedné jamce. Spolehlivost ELISA testu se dá zvýšit užitím měření duplikátů každého vzorku. Jamky se mohou po jedné odlamovat z proužku. To umožňuje sestavit test s minimálními spotřebami všech reagencií.
Výpočet výsledků Kvantifikace: Křivka standardů, ze které se odečítá koncentrace protilátek ve vzorcích sér, se sestrojí vynesením hodnot extinkce získaných z měření 4 kalibračních sér bod po bodu proti odpovídajícím jednotkám (lineární/lineární). Následující vynesení je příkladem typické kalibrační křivky. Prosím, neužívejte tuto kalibrační křivku k určení koncentrací protilátek v sérech pacientů.
Jestliže hodnoty extinkce vzorku leží nad hodnotami standardní křivky, doporučujeme, aby byl vzorek znovu otestován při ředění 1:401. Výsledek v IU/ml získaný ze standardní křivky pro tento vzorek se potom musí vynásobit 4. Jak pozitivní, tak negativní kontrolní sérum slouží jako vnitřní kontroly pro určení spolehlivosti testovaného postupu. Musí být proto vždy do každého testu zařazeny. Charakteristiky testu Kalibrace: Kalibrace kontrolního séra proti toxoidu tetanu v ELISA se udává v mezinárodních jednotkách (IU) s použitím mezinárodního referenčního séra NIBSC 761/589 (Národní ústav pro biologické standardy a kontroly, Hertfordshire, Anglie). Pro každou skupinu prováděných testů, musí hodnoty extinkce pro kalibrační séra a mezinárodní jednotky určené pro pozitivní a negativní kontrolu ležet v hranicích určených pro tyto důležité hodnoty. Protokol obsahující tyto hodnoty je součástí soupravy. Jestliže se nedosáhne hodnot určených pro kontrolní séra, test by mohl být nepřesný a proto se musí opakovat. Vazebná afinita protilátek, stejně tak aktivita použitého enzymu je závislá na teplotě a hodnoty extinkce se mohou lišit, pokud nepoužijete termostat. Čím vyšší je pokojová teplota během inkubace substrátu, tím vyšší jsou hodnoty extinkce. Odpovídající změny se projeví také vzhledem k času inkubace. Kalibrační séra jsou vystavena stejnému vlivu, a to proto, že tyto změny jsou povětšinou zakalkulovány ve výpočtu výsledků. Tyto změny se berou následovně do úvahy a přizpůsobují se časy inkubace substrátu vzhledem k pokojové teplotě: Pokojová teplota 14 oC - 18 oC Pokojová teplota 19 oC - 23 oC Pokojová teplota 24 oC - 30 oC
doba inkubace substrátu 18 min doba inkubace substrátu 15 min doba inkubace substrátu 12 min
Linearita: Linearita testu byla zkoumána pomocí série ředění sér pacientů s vysokými hladinami koncentrací protilátek. Následující obrázek ukazuje typickou linearitu vzorků zjištěnou na základě 4 sér pacientů. IgG ELISA proti toxoidu tetanu vykazuje linearitu měření v oblasti 0,01 až 4 IU/ml.
Detekční limit: Spodní hranice detekčního limitu je definována jako trojnásobek standardní odchylky hodnoty vzorku, kde nebyla přítomna určovaná látka a udává tak nejnižší detekovatelný titr protilátky. Detekční limit pro anti-tetanus toxoid ELISA je 0,01 IU/ml. Reprodukovatelnost: Reprodukovatelnost testu byla zkoumána určením koeficientů rozptylu (CV) uvnitř jednoho a mezi jednotlivými bloky měření za užití tří sér, jejichž hodnoty ležely v různých bodech kalibrační křivky. Koeficienty rozptylu uvnitř bloku byly stanoveny z 20 měření a koeficienty rozptylu mezi bloky ze 4 měření provedených v šesti různých dnech. Koeficienty rozptylu uvnitř bloku , n=20 sérum Průměrná hodnota (IU/ml) 1 0,698 2 0,913 3 1,441
Koeficienty rozptylu mezi bloky , n=4 x 6 sérum Průměrná hodnota (IU/ml) 1 0,49 2 0,63 3 1,45
CV (%) 6,3 3,7 2,3
CV (%) 7,9 5,0 5,5
Korelace EUROIMMUN ELISA s dalším komerčně dostupným ELISA kitem: S testem EUROIMMUN Protilátky proti toxoidu tetanu (IgG) bylo testováno 469 dárců krve, vzorky byly vyhodnoceny i odpovídajícím ELISA kitem dalšího výrobce. Korelace mezi
oběma testy byla velmi vysoká. Interpretace výsledků testu: Dále v textu jsou uvedené doporučené hodnoty, převzaté z literatury, pro vyhodnocení testů týkajících se ochrany proti tetanu . < 0,1 IU/ml
není ochrana: je potřeba základní očkování či podání obnovovací dávky (booster), záleží na anamnéze, sérologická kontrola po 4 až 8 týdnech
0,01 –0,1 IU/ml
ochrana nejistá: je potřeba obnovovací dávka, sérologická kontrola po 4 až 8 týdnech
> 0,1 –0,5 IU/ml
je prokázána krátkodobá ochrana očkováním: doporučuje se booster
> 0,5- 1,0 IU/ml
je prokázána ochrana očkováním: doporučuje se booster či sérologická kontrola nejdříve za 3 roky. Poznámka: Podá-li se obnovovací dávka při koncentraci protilátek vyšší než > 0,5 IU/ml, mohou se projevit nechtěné vedlejší projevy očkování
> 1,0 - 5,0 IU/ml
je prokázána dlouhodobá ochrana očkováním: doporučuje se booster či sérologická kontrola nejdříve za 5 let
> 5,0 - 10,0 IU/ml
je prokázána dlouhodobá ochrana očkováním: doporučuje se booster či sérologická kontrola nejdříve za 8 let
> 10 IU/ml
je prokázána dlouhodobá ochrana: doporučuje se booster či sérologická kontrola nejdříve za 10 let
Literární odkazy: 1. Naumann, P., Weber, H.-G.: Diphtherie –Immunitat bei Schulanfangern und nach Wiederimpfung mit d-Impfstoff. Deutsche Medizinishe Wochenschrift 117: 1308 – 1312 (1992). 2. Bekanntmachungen Robert –Koch –Institut: Impfempfehlungen der Standigen Impfkomission (STIKO) des Bundesgeundheitsamtes vom 22.2. 1994. Bundesgesundheitsblatt 8 (1994) 3. Pietsch, M., Kraft, B.: Tetanus-Impfserologie. Ellipse 28: 1-6 (1991) 4. Pietsch, M., Gaase, R., Werner, H.-P.: Immunitatslucken gegen Diphtherie und Tetanus bei Kindern und Jugendlichen. Sozialpadiatrie fur Praxis und Klinik 15:410 – 413 (1993). 5. Schroder, J.P., Kuhlmann, W.D. : Tetanusimpfschutz und Vermaidung von Nebenreaktionen bei Auffrishungen. Deutsche Medizinishe Wochenschrift 117: 19031906 (1992). 6. Gupta, R.G. , Griffin, P., Xu,J., Rivera, R., Thompson, C., Siber, G.R. : Diphtheria antitoxin levels in US blood and plasma donors. Journal of Infectious Diseases :1493 – 1497 (1996). 7. Muller, H.E., Muller, M., Schieck ,W.: Tetanus-Schutzimpfung- Indikation und Kontraindikation. Deutsche Medizinishe Wochenschrift 113: 1326 –1328 (1988).
