13 BAB IV PERCOBAAN
IV.1 Bahan Air miliQ, deoksinukleotida trifosfat (dNTP), MgCl2, (Promega), enzim Pfu DNA polymerase, dapar Pfu (Stratagene), oligonukleotida SR1, SR2, SR3, SR4, SR5, AR6, AR7, AR8, AR9, AR10, primer PFOLIRAB, primer PREVIFNA2B (urutan nukleotida terlampir pada Tabel IV.1 bagian lampiran), enzim Taq DNA polymerase, dapar Taq (Fermentas), agarosa (Boehringer Mannheim), DNA 1 kilo basa, DNA 100 basa (MD Bio), dapar Tris Asetat EDTA, loading buffer, ethidium bromida (EtBr), enzim T4 ligase, dapar ligase (Promega), kit pemurnian DNA (GE health care), kalsium klorida (CaCl2), ampisillin, isopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG), X-gal (Sigma), ekstrak ragi (Difco), tripton, agar bakto (Pronadisa), natrium klorida (NaCl), natrium hidroksida (NaOH), Sodium Deodesil Sulfat (SDS), etilen diamin tetra asetat (EDTA), kalium klorida (KCl), sukrosa (Merck), kit isolasi plasmid (Biobasic), enzim restriksi EcoRI, dapar H, enzim restriksi HindIII, dapar B (Roche), primer promotor T7, primer terminator T7, primer SP6, primer SDMFORIFNA2B, primer SDMREVIFNA2B (urutan nukleotida terlampir pada Tabel IV.1 bagian lampiran), enzim DpnI, buffer A (Roche), akrilamid, bisakrilamid, amoniumpersulfat (APS), dapar Tris EDTA, lisozim, separating gel buffer, stacking gel buffer, tetraetil metilen diamin (TEMED), dapar elektrophoresis, dapar sampel, coomasie blue R-250, metanol, dan asam asetat glasial (Merck).
IV.2 Alat Gene amp PCR System (Perkin Elmer), alat elektroforesis DNA dan protein (BioRad), Ultraviolet (UV) Transiluminator (Vilber lourmat), autoklaf (Sanyo), inkubator goyang (GSL), kompor listrik (rommelbascher), laminar (Microflow), lemari pendingin -20 oC, lemari pendingin 4oC (Denpoo), oven (LTE Ltd), mikropipet (Gilson), vortex, sentrifuga (Biofuge), cawan petri, labu erlenmeyer, tabung reaksi, tip, tabung PCR, dan tabung mikrosentrifuga.
14 IV.3 Plasmid dan Mikroba Uji Plasmid pGEM-T (Promega), plasmid pET32b (Novagene) peta pada gambar 3.1 di bagian lampiran, plasmid pGEM-T IFNα2b 3 mut (Yohanes, 2007), E. coli galur JM109, E. coli galur DH5α, E. coli galur TOP10, dan E. coli galur BL21.
IV.4 Sintesis, Amplifikasi, dan Purifikasi Kerangka Baca Terbuka IFNα2b Sintetik Sintesis kerangka baca terbuka IFNα2b dilakukan menggunakan metode TBIO yang berbasis sintesis dua arah, sedangkan amplifikasi kerangka baca terbuka IFNα2b dilakukan dengan metode PCR. Sintesis dengan TBIO dimulai dengan mencampur semua komponen yang dibutuhkan dalam reaksi ke dalam tabung PCR, yaitu dNTPs, dapar Pfu, 10X, primer SR1-AR10 (200nM), SR2-AR9 (120nM), SR3-AR8 (80nM), SR4-AR7 (60nM), SR5-AR6 (40nM), dan air milliQ sampai volume total 49 µL. Reaksi polimerisasi dilakukan dengan siklus sebagai berikut: denaturasi awal pada suhu 95oC selama 2 menit dimana pada tahap ini dilakukan metode Hot Start melalui penambahkan 2,5 U (1 µL) Pfu DNA polymerase, denaturasi 95oC 30 detik, penempelan 54oC 45 detik, polimerisasi 72oC 30 detik (tiga tahap ini dilakukan sebanyak 25 siklus), serta polimerisasi akhir 72oC 5 menit. Produk selanjutnya dianalisis dengan metode elektoforesis pada medium agarosa 1,5%. Gel diwarnai dengan larutan EtBr dan diamati di bawah sinar UV. Hasil yang diharapkan adalah pita-pita pada daerah sekitar 500 pasang basa (pb). Produk TBIO PCR digunakan sebagai cetakan untuk amplifikasi kerangka baca terbuka IFNα2b. Reaksi PCR dilakukan menggunakan komponen berikut : 20 mM dNTP, 10 mM dapar Taq, 0,3 U enzim Taq DNA Polymerase, primer PFOLIRAB (30 µM), primer PREVIFNA2B (30 µM), produk TBIO PCR 2,5 µL dan air miliQ sampai volume total 25 µL. Air miliQ digunakan sebagai kontrol negatif dan sebagai kontrol positif digunakan plasmid pGEM-T IFNα2b 3 mut (Yohanes, 2007). Amplifikasi dilakukan dengan program sebagai berikut: denaturasi awal 94oC 5 menit, denaturasi 94 o
C 1 menit, penempelan 50oC 1 menit, polimerisasi 72oC 1 menit (tiga tahap ini
dilakukan sebanyak 25 siklus), serta polimerisasi akhir 72oC 10 menit. Produk PCR selanjutnya dianalisis dengan metode elektoforesis pada medium agarosa 1,5%. Hasil yang diharapkan adalah pita berukuran sekitar 522 pasang basa (pb).
15 Purifikasi kerangka baca terbuka IFNα2b dilakukan menggunakan kolom GFX. Pita berukuran kira-kira 522 pb dipotong kemudian dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga. Bobot gel ditimbang dan ditambahkan 10 µL dapar pengikat per 10 mg bobot gel. Selanjutnya gel dalam dapar diinkubasikan pada suhu 60oC selama 15 menit. Larutan dalam tabung dipindahkan ke dalam kolom GFX yang telah dihubungkan dengan tabung pengumpul dan disentrifuga pada kecepatan 12.000 rotasi per menit (rpm) selama 1 menit. Kolom kemudian dicuci dengan 500 µL buffer pencuci dan kembali disentrifugasi dengan waktu dan kecepatan sama. Larutan dalam tabung pengumpul dibuang. Elusi dilakukan dengan penambahan 50 µL buffer pengelusi ke dalam kolom yang telah dihubungkan dengan tabung mikrosentrifuga. Selanjutnya kolom diinkubasi 1 menit pada suhu ruang dan disentrifugasi dengan kecepatan sama. Eluat diperoleh pada tabung mikrosentrifuga. Hasil purifikasi dianalisis kembali dengan metode elektroforesis pada medium agarosa 1% untuk memperkirakan konsentrasi kerangka baca terbuka IFNα2b.
IV.5 Kloning Kerangka Baca Terbuka IFNα2b Reaksi ligasi kerangka baca terbuka IFNα2b dengan vektor pGEM-T terdiri atas 5 µL dapar ligasi 2 X, 1 µL vektor pGEM-T (50 ng), hasil purifikasi kerangka baca terbuka IFNα2b (konsentrasi tergantung ketebalan pita dan banyaknya sisipan yang dibutuhkan), enzim T4 DNA ligase 1 µL (10 U), dan air milliQ dicampurkan ke dalam tabung mikrosentrifuga sehingga volume total mencapai 10 µL. Campuran diinkubasi pada suhu 4oC semalam. Variasi ligasi dilakukan dengan perbandingan vektor : sisipan 1 : 3, 1 : 6, dan 1 : 8. Koloni tunggal sel E. coli JM109 pada medium minimum diambil dengan kawat ose dan dikultivasi pada medium LB cair 10 mL selama 18 jam dengan kecepatan pengocokan 200 rpm dan suhu 37oC. Kultur dipindahkan ke dalam medium LB cair baru dengan perbandingan 2 : 100 dan diinkubasi kembali selama 1,5 jam. Kultur sebanyak 6 mL untuk satu reaksi transformasi disentrifuga pada kecepatan 4000 rpm selama 10 menit untuk mendapatkan sel sebagai pelet. Masing-masing pelet diresuspensi dalam larutan 100 mM CaCl2 dingin sebanyak 600 µL dan diinkubasi di es. Suspensi disentrifuga pada kecepatan dan waktu yang sama, kemudian supernatan dibuang. Pelet diresuspensi
16 kembali dengan 200 µL CaCl2 dingin dan diinkubasi pada suhu 4oC semalam. Pada masing-masing 200 µL suspensi sel dimasukkan hasil ligasi sampel (konsentrasi DNA total tidak lebih dari 50 ng). Sebagai kontrol positif digunakan plasmid rekombinan pGEM-T IFNα2b 3 mut (Yohanes, 2007) dan sebagai kontrol negatif digunakan suspensi sel tanpa penambahan reaksi ligasi. Tabung diinkubasi di es selama 30 menit dan diinkubasi pada suhu 42oC selama 90 detik, kemudian tabung dipindahkan cepat ke dalam es selama 1-2 menit. Suspensi kemudian ditambah 800 µL medium LB cair dan diinkubasi 1,5 jam. Suspensi disentrifuga pada kecepatan 4000 rpm selama 10 menit dan sebanyak 800 µL dibuang. Pelet kemudian diresuspensi dan diinokulasikan ke dalam medium LB padat yang mengandung antibiotik ampisillin (100 µg/µL) , IPTG, dan X-gal. Selanjutnya medium diinkubasi pada suhu 37 oC semalam.
Kerangka baca terbuka IFNα2b dan vektor pET32b disiapkan dengan mengkultivasi E.coli JM109 yang membawa plasmid pET32b dan E. coli JM109 yang membawa plasmid pGEM-T IFNα2b dalam medium LB cair yang mengandung ampisillin pada 37oC dan 200 rpm semalam. Plasmid diisolasi dari kultur dengan bantuan kit isolasi plasmid. Hasil isolasi dianalisis dengan metode elektroforesis gel agarosa. Plasmid pET32b dan pGEM-T IFNα2b selanjutnya dipotong dengan enzim HindIII dan EcoRI. Hasil pemotongan dianalisis dengan metode elektroforesis. Hasil pemotongan kedua plasmid tersebut kemudian dimurnikan dengan kit purifikasi DNA (GE healthcare). Ligasi dan transformasi dilakukan dengan prosedur yang sama seperti pada ligasi kerangka baca terbuka IFNα2b dengan vektor pGEM-T dan transformasi ke dalam E. coli DH5α.
IV.6 Seleksi dan Karakterisasi Transforman Hasil transformasi yang sudah diinkubasi semalam diamati. Koloni putih adalah koloni yang secara teoritis mengandung plasmid dengan sisipan yaitu pGEM-T IFNα2b, sedangkan koloni biru adalah koloni dengan plasmid tanpa sisipan. Koloni yang tumbuh di subkultur ke dalam medium LB padat yang mengandung medium ampisillin, IPTG dan X-gal. Pelat diinkubasi pada suhu 37oC semalam.
17 Karakterisasi pertama pada transforman dilakukan dengan metode lisis cepat. Masingmasing koloni disuspensikan ke dalam 50 µL larutan EDTA 0,5 mM. Suspensi kemudian ditambahkan 50 µL larutan lisis cepat, divorteks 30 detik, dan diinkubasi 70oC selama 10 menit. Sebanyak 1,5 µL larutan KCl 4 M dan 0,5 µL larutan bromfenol biru ditambahkan ke dalam masing-masing suspensi. Suspensi divorteks selama 30 detik, diinkubasi di es selama 5 menit, dan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm 3 menit pada 4oC. Selanjutnya supernatan dianalisis dengan metode elektroforesis untuk melihat laju migrasi plasmid.
Hasil analisis kecepatan migrasi dengan metode lisis cepat dikonfirmasi dengan melakukan isolasi plasmid. Transforman yang mengandung plasmid rekombinan dengan ukuran sejajar kontrol pada lisis cepat dikultivasi dalam medium LB yang mengandung ampisillin selama 18 jam pada suhu 37oC dan kecepatan pengocokan 300 rpm. Plasmid rekombinan diisolasi menggunakan kit isolasi plasmid. Hasil isolasi dianalisis dengan metode elektroforesis dan laju migrasi dibandingkan dengan laju migrasi kontrol. Sebagai kontrol digunakan plasmid pGEM-T IFNα2b 3 mut (Yohanes, 2007).
Analisis pemotongan dilakukan pada transforman yang memiliki kecepatan migrasi sejajar
dengan
mikrosentrifuga
kontrol.
Plasmid
rekombinan
dimasukkan
ke
dalam
tabung
bersama dengan enzim EcoRI atau HindIII, dapar, dan air miliQ
(banyaknya volume untuk masing-masing komponen tergantung pada jumlah plasmid yang dipotong). Larutan kemudian diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37oC. Hasil pemotongan kemudian dielektroforesis pada gel agarosa 1%. Karakterisasi selanjutnya adalah analisis urutan nukleotida. Pembacaan dilakukan dua arah yaitu arah 5’-3’ dengan primer promotor T7, dan arah 3’-5’ dengan primer SP6.
Seleksi transforman yang membawa plasmid rekombinan pET32b-IFNα2b dilakukan pada medium LB padat yang mengandung ampisillin. Transforman yang tumbuh selanjutnya dikarakterisasi seperti karakterisasi transforman yang membawa plasmid rekombinan pGEM-T IFNα2b. Plasmid rekombinan pET32b IFNα2b yang memiliki mutasi delesi nukleotida deoksiguanosin monofosfat pada kodon kedua (selanjutnya
18 disebut pET32b IFNα2b G del) digunakan sebagai cetakan pada proses mutagenesis terarah dengan metode PCR.
IV.7 Mutagenesis Terarah Terhadap Plasmid Rekombinan pET32b IFNα2b, Transformasi, dan Karakterisasi Primer dirancang untuk mengamplifikasi plasmid rekombinan pET32b IFNα2b G del dan memperbaiki urutan basa kerangka baca terbuka IFNα2b. Reaksi PCR dilakukan menggunakan komponen berikut: dNTP, dapar Pfu, enzim Pfu DNA polymerase 2,5 U, primer SDMPFORIFNA2B (150 ng), primer SDMPREVIFNA2B (30 µM), plasmid rekombinan (50 ng), dan air miliQ sampai volume total 50 µL. Program PCR yang digunakan adalah denaturasi awal 95oC 30 detik, denaturasi 95oC 30 detik, penempelan 55oC 1 menit, polimerisasi 68oC 6,5 menit (tiga tahap ini dilakukan sebanyak 12 siklus). Produk PCR kemudian ditambahkan enzim DpnI untuk menghilangkan cetakan dan diinkubasi pada 37oC selama 1 jam.
Transformasi produk mutagenesis ke dalam E. coli TOP10 dilakukan dengan menambahkan produk ke dalam masing-masing 600 µL sel kompeten E. coli TOP10 dengan konsentrasi tidak lebih dari 50 ng. Transforman yang tumbuh pada medium LB ampisillin dikarakterisasi dengan analisis lisis cepat, analisis kecepatan migrasi, analisis pemotongan, dan analisis urutan nukleotida. Plasmid rekombinan yang memiliki urutan nukleotida kerangka baca terbuka IFNα2b benar (selanjutnya disebut pET32b IFNα2b) ditransformasi ke dalam E. coli BL21 untuk menghasilkan protein rekombinan IFNα2b.
Transformasi plasmid rekombinan pET32b IFNα2b ke dalam E. coli BL21 dilakukan seperti transformasi ke dalam E. coli TOP10. Koloni tunggal transforman diambil dengan bantuan kawat ose dan dikultivasi dalam medium LB cair 10 mL yang mengandung antibiotik ampisillin pada suhu 37oC dan 200 rpm selama 18 jam. Sebanyak 2% kultur ditambahkan ke dalam labu yang berisi medium LB 100 mL. Kultur diinkubasi lagi selama 3 jam pada suhu 37oC dan 200 rpm. Selanjutnya ditambahkan IPTG ke dalam setiap labu (kecuali untuk kontrol negatif) sehingga konsentrasi akhirnya 0,3 mM. Kultur
19 diinkubasikan lagi selama 3 jam pada kondisi yang sama. Masing-masing kultur kemudian disentrifuga dan sel sebagai pelet disimpan.
IV.8 Isolasi, Purifikasi, Karakterisasi, dan Protein Rekombinan IFNα2b Pelet sel diresuspensi dalam dapar pengikat tanpa imidazol (5ml per 1 g pellet). Suspensi kemudian ditambahkan larutan PMSF (konsentrasi akhir dalam suspensi 1 mM) dan disonikasi selama 30 detik sebanyak 10 kali pada frekuensi 2,5 Hertz. Hasil sonikasi disentrifuga pada 4300 rpm selama 15 menit. Ekstrak protein diperoleh sebagai supernatan dan kemudian dikarakterisasi. Pelet sel dapat dilisis langsung menggunakan loading buffer, diinkubasi 3 menit pada 100oC dan disentrifuga 12.000 rpm 1 menit. Kemudian protein dalam supenatan dikarakterisasi.
Karakterisasi protein rekombinan IFNα2b dilakukan dengan metode SDS PAGE. Gel poliakrilamid yang terdiri atas separating dan stacking gel disiapkan. Larutan untuk separating gel 15% dibuat sebanyak 6 mL yang terdiri atas 3 mL larutan A (akrilamid 30%, bisakrilamid 0,8%), 1,5 mL larutan B (dapar separating gel 4X: 1,5 M Tris–HCl pH 8,8 dan 0,4% SDS), aquadest 1,5 mL, APS 30 µL, dan TEMED 5 µL. Larutan dalam cetakan dibiarkan selama 30 menit agar berpolimerisasi sehingga terbentuk gel.
Selanjutnya dibuat larutan untuk 4 mL stacking gel 5% yang terdiri atas: solution A 0,67 mL, solution C (1 mL dapar stacking gel 4X: Tris HCl pH 6,8 0,5 M dan SDS 0,4%), aquadest 2,3 mL, APS 30 µL, dan TEMED 5 µL. Larutan kemudian dimasukkan ke dalam cetakan pada posisi di atas separating gel. Kemudian sisir dimasukkan pada cetakan dan gel akan terbentuk selama 30 menit.
Masing-masing lisat, kontrol negatif serta positif dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga sebanyak 30 µL dan ditambahkan dapar sample 6 µL. Tabung yang berisi marker protein 10 µL disiapkan. Lisat, marka, dan kontrol dididihkan 15 menit kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam sumur dan dielektroforesis dalam dapar elektroforesis pada tegangan 125 volt 90 menit. Gel diwarnai dengan commasie blue selama setengah jam. Setelah pewarnaan, gel diperlakukan dengan destaining solution.
20 Purifikasi protein rekombinan IFNα2b dilakukan dengan menggunakan kolom nikel. Sebanyak 1 mL resin nikel dimasukkan ke dalam kolom dan dibiarkan sampai diperoleh matriks padat. Resin dicuci berturut-turut dengan air deion 1,5 mL, dapar charge 1,5 mL, dan dapar pengikat 1,5 mL. Ekstrak protein sebanyak 5 mL kemudian dimasukkan ke dalam kolom. Kolom dibilas dengan dapar pengikat 5 mL dan dapar pencuci 3 mL. Elusi dilakukan dengan dapar pengelusi sebanyak 3 mL dan eluat ditampung. Protein yang terkandung dalam eluat dikarakterisasi dengan metode SDS PAGE.
