Eva Roubalová B10 2007/2008 Předmět: - Obecná biologie - Biologie a genetika Zdroj velké části materiálů: učebnice „Metody molekulární biologie“ (2005) Autoři: Jan Šmarda, Jiří Doškař, Roman Pantůček, Vladislava Růžičková, Jana Koptíková
Nukleové kyseliny (NK)
Izolace nukleových kyselin
Požadavky na izolaci: • izolace v nativním stavu z přirozeného materiálu, v dostatečném množství a čistotě • NK je třeba zbavit všech látek, které se po lyzi buněk nebo virových částic stávají součástí hrubých lyzátů a jejichž přítomnost by bránila účinnému a specifickému působení enzymů používaných k jejich analýze a úpravám
Materiál pro izolaci NK – Jednotlivé buňky (např. prokaryotických organizmů nebo kvasinek) → • Genomová DNA • Plazmidová – Tkáně a orgány eukaryot, které jsou nejdříve homogenizovány – Virové částice purifikované centrifugačními technikami – Nukleové kyseliny v elektroforetických gelech – Produkty PCR reakcí
Metodické principy využívané při izolaci NK: • Rozrušení buněčných stěn nebo virových nukleokapsidů působením – Enzymů (lysozym a celulázy) – Detergentů (dodecylsulfát sodný) • Enzymatické kroky pro odstranění kontaminant – Proteináza K nebo pronáza E – RNáza nebo DNáza • Kroky využívající různou rozpustnost – Fenolová extrakce – Adsorpce na pevný podklad • Centrifugace • Precipitace
Fenolová extrakce • Promíchání lyzátu buněk s roztokem fenolu (se směsí fenolu a chloroformu). Fenol je organické rozpouštědlo používané k oddělení proteinů od NK. Proteiny jsou hydrofobní a zůstávají v organické fázi, zatímco NK jsou vysoce nabité a přecházejí do vodné fáze. Chloroform denaturuje proteiny, rozpouští tuky a napomáhá oddělení jednotlivých fází získaných v následujícím kroku. • Centrifugace, při níž dojde k oddělení spodní organické fáze, tvořené fenolem, mezifáze, tvořené denaturovanými proteiny a zbytky buněk, a horní vodné fáze, v níž jsou rozpuštěny NK. • Vysrážení nukleových kyselin etanolem, případně izopropanolem. (účinnému vysrážení NK přítomných v nízkých koncentracích se napomáhá snížením teploty a přídavkem solí) • Shromáždění precipitátu nukleových kyselin centrifugací a rozpuštění získaného sedimentu ve vhodném roztoku.
Analýza a kvantifikace • SPEKTROFOTOMETRICKÁ METODA – Nukleové kyseliny absorbují UV záření s maximem absorbance v oblasti vlnové délky okolo 260 nm. – Z hodnot optické hustoty lze koncentraci a čistotu vzorku stanovit podle empirických vztahů. Stupeň čistoty NK se stanovuje z poměru absorbance při 260 a 280 nm. Při znečištění vzorku proteiny, jejichž absorpční maximum leží okolo 280 nm, bude vypočtený poměr výrazně nižší a stanovení koncentrace NK nebude přesné.
Manipulace s NK • • •
enzymy – zásahy do struktury DNA a RNA vektory – klonování fragmentů DNA a RNA hybridizace – identifikace specifických sekvencí
Výhody enzymů: - vysoká specifičnost reakcí - možnost pracovat s malým množstvím substrátu
Klasifikace enzymů, jejichž substrátem jsou NK: Podle typu substrátu: DNA enzymy X RNA enzymy Podle typu reakce: - enzymy anabolické = polymerázy (reverzní transkriptázy - martice = RNA) - enzymy katabolické = nukleázy (degradace: od konců = exonukleázy, nebo uvnitř molekuly = endonukleázy; secifita: ds, nebo ss) - enzymy spojující řetězce NK = ligázy - enzymy modifikující NK (metylázy, kinázy, fosfatázy)
Restrikční endonukleázy
izolované z bakterií ochrana před cizorodými molekulami DNA (DNA hostitelské buňky je před účinkem vlastní endonukleázy chráněna metylací)
Restrikční endonukleázy Vlastnosti: sekvenčně specifické štěpí oba řetězce ds DNA Význam: nástroj pro přípravu rekombinantních molekul DNA prostředek pro studium struktury, organizace, exprese a evoluce genomu základ pro genové inženýrství
EcoRI
Využití restrikčních enzymů: • fyzikální
mapování DNA
• analýza populačních polymorfizmů • změny v uspořádání molekul DNA • příprava molekulárních sond • příprava mutantů • analýza modifikací DNA
Termostabilní DNA polymerázy: Katalyzují syntézu DNA z nukleosid trifosfátů na templátu (jako jiné DNA polymerázy). Katalytická aktivita je maximální mezi 75 a 80oC a klesá při nižších teplotách. Taq DNA polymeráza byla purifikována z bakterieThermus aquaticus, která žije v horkých pramenech (1976). Zhruba o 10 let později byla objevena polymerázová řetězová reakce (PCR).
Reverzní transkriptáza • RNA-dependentní DNA polymeráza • přepis genetické informace z RNA do DNA • požadována přítomnost primeru a matrice Zdroj: retroviry Využití: tvorba cDNA
Klon: soubor geneticky identických buněk (resp. organismů), odvozených ze společného předka Klonování = proces tvorby klonů • embryonální (rozdělení embryonálních buněk blastocysty, spontánně tak vznikají jednovaječná dvojčata) • transnukleární (vznik klonů buněk přenosem jádra somatické buňky do buňky pohlavní) • molekulární - klonování DNA - tvorba klonů DNA Klon DNA: soubor identických molekul, fragmentů nebo úseků DNA, připravených např. množením rekombinantních molekul DNA v hostitelské buňce (in vivo) nebo PCR (in vitro) Rekombinantní molekula DNA: molekula DNA vytvořená spojením cizorodé (klonované) DNA s klonovacím vektorem
Klonování DNA Stěžejní metoda molekulární biologie: umožňuje izolovat z komplexního genomu jeho dílčí úseky (např. geny), ty ve formě rekombinantních molekul mnohonásobně zmnožit a zpřístupnit je tak dalšímu studiu Využití klonování DNA: • izolace genů • studium regulačních oblastí, které řídí genovou expresi • fyzikální a genetická analýza genomů • exprese cizích genů v nepříbuzných hostitelích (heterologní exprese) za účelem přípravy žádaných produktů • základ genového inženýrství (příprava transgenních organismů obsahují cizorodé geny)
Klonování zahrnuje 3 kroky: • • •
příprava rekombinantní molekuly DNA přenos rekombinantní molekuly do hostitelské buňky (klonovací vektory) Selekce klonů obsahujících rekombinantní DNA (např. pomocí rezistence na ATB)
klonovací vektory: • nejčastěji kružnicové molekuly DNA schopné autonomní replikace • obvykle odvozené z plazmidů nebo virů • navíc obsahují pomocné sekvence různého původu usnadňující vložení cizorodé DNA, její expresi, selekci transformantů, atd.)
Výhodny plazmidových vektorů: • autonomní replikace v bakteriální buňce • tvorba více kopií v buňce • schopnost stabilního udržení cizorodé DNA při replikaci, nepřenosnost do dalších buněk konjugací (bezpečnost práce s novými konstrukty) • přítomnost restrikčních (klonovacích) míst, využitelných pro klonování • snadný a účinný přenos do hostitelských buněk • přítomnost jednoho nebo více markerů pro selekci hostitelské buňky (např. rezistence na antibiotikum) • malá velikost (zvýšení účinnosti transformace, jednoduchá izolace)
Přenosy genů do živých buněk (transfekce) Účel: - studium funkce genů - studium mechanismů řídících genovou expresi
Klasifikace transfekčních postupů Podle stability transgenu: 1. transfekce přechodná přenášená DNA se dostává do buňky, ale zůstává v extrachromozomálním stavu, transgen se přepisuje několik dní jedna transfekovaná buňka může obsahovat větší počet kopií transfekční DNA (vyšší exprese transgenu)
2. transfekce stabilní přenášená DNA se začleňuje do chromozomu hostitelské buňky (tento děj nastává z nízkou frekvencí 10-5 – 10-6)
Podle způsobu penetrace membrány: 1. Postupy biochemické 2. Postupy fyzikální 3. Postupy biologické
Přenosy genů do zárodečných myších buněk mikroinjekcí Význam: - umožňují studium funkce genů v kontextu intaktního organismu - myši, které tímto způsobem získaly cizí geny se nazývají transgenní myši Přibližně u 10% potomstva bude cizorodá DNA integrována do genomu všech buněk. Protože cizorodá DNA se v potomstvu vyskytuje v somatických i zárodečných buňkách, přenáší se křížením do dalšího potomstva stejně, jako kterýkoliv jiný gen.
Polymerázová řetězová reakce (PCR) • Zavedení PCR v roce 1983 (Kary B. Mullis) → Nobelova cena • Metoda pro mnohonásobné zmnožení (amplifikaci) specifického úseku DNA in vitro založená na principu replikace. • K opakující se enzymové syntéze komplementárních řetězců vybraných úseků dvouřetězcové DNA dochází po připojení dvou primerů vázajících se na protilehlé řetězce DNA tak, že jejich 3'-OHkonce směřují proti sobě. • PCR umožňuje získat požadovanou zcela specifickou sekvenci bez klonování.
PCR využívá základních rysů replikace (enzymatické syntézy) DNA: - Jako templát slouží ssDNA, podle níž je syntetizován komplementární řetězec. - K zahájení reakce je zapotřebí primer, který se připojuje na komplementární úseky DNA. Tím je zároveň vymezen úsek DNA, který bude amplifikován. - Jako templáty pro syntézu mohou sloužit oba řetězce dsDNA, po předchozí denaturaci. • Teoreticky lze získat 2n(-1) řetězců (kopií).
Po č e t no výc h Cyklus č íslo dvo uře tě z c o výc h m o le kul 1 1 2 3 3 7 4 15 5 31 6 63 7 127 8 255 9 511 10 1 023 11 2 047 12 4 095 13 8 191 14 16 383 15 32 767 16 65 535 17 131 071 18 262 143 19 524 287 20 1 048 575 21 2 097 151 22 4 194 303 23 8 388 607 24 16 777 215 25 33 554 431 26 67 108 863 27 134 217 727 28 268 435 455 29 536 870 911 30 1 073 741 823
Replikace DNA in vivo vyžaduje mnoho enzymů
Replikace DNA in vitro vyžaduje pouze jeden enzym Reakční směs obsahuje: • Templátovou nukleovou kyselinu (DNA nebo RNA). • Množství DNA jako výchozího materiálu je velmi nízké: obvykle postačuje méně než 1 µg genomové DNA, teoreticky postačuje jedna molekula. – Kvalita templátu ovlivňuje výsledek PCR. – Velké množství RNA může vázat ionty Mg2+ – znečištěný templát může obsahovat inhibitory PCR • Zdroj: mikroorganizmy, buňky z tkáňových kultur, tělní tekutiny, bioptické vzorky, stěry, vlasy, atd…
• Primery - chemicky syntetické ologonukleotidy o velikost 10 - 30 nukleotidů • dNTP ve formě Na+ nebo Li+ solí • Mg2+ ionty tvoří rozpustný komplex s dNTP a vytvářejí substrát, který rozpoznává DNA polymeráza. • Termostabilní DNA polymerázu, která odolává teplotám až 98 °C.
Schéma PCR
Denaturace vzorku DNA Pro oddělení jednořetězců (94 °C, 5 min)
Připojení primerů na řetězce DNA (30 - 65 °C, 1 min)
Denaturace pro separaci řetězců DNA (94 °C, 30 s)
25 – 35 × Syntéza nových řetězců DNA polymerázou (72 °C, 45s - 2 min)
DETEKCE AMPLIFIKOVANÉHO PRODUKTU PCR •
Stanovení fyzikální velikosti produktu gelovou elektroforézou (agaróza, polyakrylamid). Detekce obarvením a pozorování pod UV světlem.
•
Štěpení produktu restrikčními enzymy a posouzení spektra (PCR-RFLP) vznikajících restrikčních fragmentů
•
Elektroforetická separace produktů za specifických podmínek pro detekci sekvenčních polymorfizmů – DGGE – denaturační gradientová gelová elektroforéza – SSCP – analýza polymorfizmu konformace jednořetězcových forem
VYUŽITÍ PCR •
Základní výzkum – – – – – –
•
•
izolace genů nebo jejich částí sekvencování DNA mutageneza in vitro modifkace konců DNA analýza (selekce) klonů z genových knihoven příprava značených sond
Využití v klinických disciplinách –
– – –
detekce patogenních mikroorganismů (baktérií, virů, prvoků, hub) identifikace onkogenů typizace nádorů stanovení pohlaví
Aplikovaný genetický výzkum – – – –
prenatální diagnostika (dědičných chorob) detekce mutací v genech studium polymorfizmu genů populační genetika
•
Využití v praxi – – –
archeologie soudnictví kriminalistika
detekce bakteriálních a virových infekcí • Konvenční diagnostické metody jsou založeny na schopnosti vypěstovat organismy v kultuře nebo detekovat jejich přítomnost v pacientu za použití protilátek. – vyžaduje několik týdnů (mykobakterie) – někdy metoda málo citlivá (protilátky) • Zvláštní význam má PCR při diagnostice virů, např. HIV. – Cílem je detegovat infikované buňky na pozadí mnohonásobně početnějších neinfikovaných buněk. – Detekce odhalí HIV inkorporované v buňkách. Přítomnost virové RNA naznačuje aktivní infekci, a to lze prokázat provedením PCR za použití cDNA jako templátů vytvořených pomocí RT z RNA infikovaných buněk. • U tuberkulózy je pomocí PCR prokazován některý z vysoce konzervativních genů (sekvencí) mykobakterií pomocí primerů připravených k těmto sekvencím. Amplifikovaný fragment je pak hybridizován se sondami vysoce specifickými pro daný kmen (druh). Tímto postupem je možno detekovat i jen 10 bacilů v 106 eukaryotických buněk.
stanovení pohlaví u prenatálních buněk • Širokou oblastí využití PCR je prenatální diagnostika obecně. • Pro choroby děděné na X-chromozomum které postihují pouze samce, je stanovení pohlaví prvním krokem. To je možné proto, že samci nesou pouze jeden X a jeden Y chromozom, obsahující jedinečné sekvence. • Při oplození in vitro se odebere jedna buňka z rané zygoty pomocí mikromanipulátoru, vyizoluje se DNA a ta se popdorbí amplifikaci pomocí specifických primerů. Prokáže se amplifikační fragment. Výsledku se pak využívá v genetickém poradenství při výběru samičích embryí pro implantaci.
Dělící techniky biomakromolekul • Vlastnosti využívané pro • Metody: dělení: – Centrifugační – Molekulová hmotnost – Konformace a tvar – Elektromigrační – Náboj – Hustota – Chromatografické
Metody elektroforetické Elektroforéza patří v molekulární biologii k nejpoužívanějím separačním technikám při izolaci a analýze nukleových kyselin a proteinů
• Princip – Pohyb nabitých molekul nukleových kyselin v elektrickém poli – Hlavním nositelem náboje nukleových kyselin jsou záporně nabité fosfátové skupiny
• Cíl – Dělení molekul na základě rozdílných elektroforetických pohyblivostí
Provedení elektroforézy
Používané nosiče: • Elektroforetické gely jsou nejčastěji tvořeny – agarózou – polyakrylamidem
• Vytvářejí složitou síťovou strukturu polymerních molekul s póry • Velikost pórů lze ovlivnit složením roztoku a koncentrací polymeru • Optimální velikost separovaných molekul – agarózové gely 100 bp až 50 000 bp – polyakrylamidové 10 až 1000 bp
Příprava agarózového gelu:
Aparatura pro vertikální elektroforézu Polyakrylamidové gely se připravují obtížněji než agarózové. Obvykle se lijí mezi dvě skla oddělená mezerníky.
Polyakrylamidové gely • • • •
Složení: kopolymer akrylamidu a N,N,- metylenbisakrylamidu Monomer je neurotoxin a mutagen Katalyzátor – tetramethylethylendiamin (TEMED) Iniciátor – persíran amonný (NH4)2S2O8
+
Typy polyakrylamidových gelů • Nedenaturující gely – pro separaci dvouřetězcových molekul v nativním stavu – pro separaci malých fragmentů dsDNA a heteroduplexů
• Denaturující gely – separující jednořetězce – používány při sekvenování
• Denaturující gradientové gely – fragmenty DNA se pohybují gelem, v němž se zvyšuje koncentrace denaturačního agens • Močovina • Formamid – pro separaci stejně dlouhých fragmentů lišících se svou sekvencí
Faktory ovlivňující rychlost migrace v gelu: • • • • • • • •
Velikost molekuly DNA Koncentrace gelu Konformace DNA Aplikovaná voltáž (V/cm) Směr elektrického pole (pulzní gelová ELFO) Složení bází a teplota (jen u PAGE) Přítomnost interkalačních barviv (EtBr) Složení elektroforetických pufrů
Metody detekce • Po proběhnutí elektroforézy je třeba identifikovat polohy rozdělených molekul, které nejsou pouhým okem viditelné. • Molekuly DNA lze zviditelnit: – Přímým barvením vhodným barvivem • Nejjednodušší a nejlevnější • Barvivo se váže na DNA • Zbarvení je proporcionální koncentraci DNA a tím i velikosti fragmentů
– Koncovým značením 32P označených dNTP připojených na konce fragmentů DNA • • • •
Lze aplikovat jen na vysoce přečištěné sekvence Intenzita značky není závislá na délce fragmentu Polohy proužků na gelu se znázorní autoradiograficky Je citlivější než barvící metody, ale dražší
– Hybridizací se značenou sondou
Hybridizace nukleových kyselin Tvorba dvouřetězcových hybridů ze dvou jednořetězcových a alespoň částečně komplementárních molekul nukleových kyselin Založena na schopnosti denaturace a renaturace DNA.
(mohou vznikat i hybridní molekuly DNA/DNA, RNA/RNA i DNA/RNA)
(v intaktních buňkách)
Typický hybridizační experiment – Southernův přenos (Southern blotting)
Běžné použití: • detekce přítomnosti určitých genů v buněčné DNA • sledování evoluční příbuznosti vzorků DNA z různých organismů
Southernův přenos - postup • příprava a značení sondy • rozdělení restrikčních fragmentů DNA daného vzorku gelovou elektroforézou • denaturace DNA a přenos jednořetězcových fragmentů DNA na nylonový filtr („blotting“ - přesávka) • inkubace filtru se značenou jednořetězcovou sondou: hybridizace sondy s komplementární sekvencí imobilizovanou na filtru • odmytí nenavázané sondy • detekce navázané sondy - vizualizace hybridů (autoradiografie)
Southernův přenos
DNA obarvená etidium bromidem
autoradiogram
Použití hybridizace in situ pro detekci genů na chromosomech (FISH)
Použito 6 různých sond pro analýzu sekvencí v lidském metafázním chromozomu 5. Každá sonda vytváří 2 tečky na každém chromozomu (před mitózou je DNA zreplikována).
Sondy • • • •
restrikční fragmenty dvouřetězcové DNA mRNA izolovaná z buněk nebo tkání RNA transkripty in vitro syntetické oligonukleotidy (podle sekvence AK)
+ různé způsoby značení: • radioaktivní (32P, 35S) • neradioaktivní (digoxineninem, biotinem, fluorescenčními značkami)
Typy přenosu („blottingu“) podle typu analyzovaných molekul:
• Southernův přenos - DNA (Dr. Edwin Southern) • northernový přenos - RNA • westernový přenos - proteiny
Metody molekulární diagnostiky
Molekulární diagnostika sledování rozdílů v sekvencích DNA a identifikace polymorfismů
Identifikace
Typizace
Léčba choroby Prevence Vyhledání zdroje / původce Fylogenetické studie
Metody studia sekvenčního polymorfizmu DNA • 1. Přímá metoda: – sekvenování
• 2. Nepřímé metody: „DNA fingerprinting“ (= profil DNA konkrétního organismu) – – – – – –
RFLP – polymorfizmus délek restrikčních fragmentů AFLP – polymorfizmus délek amplifikovaných fragmentů SSLP– polymorfizmus délek fragmentů s jednoduchou repeticí CFLP– polymorfizmus délek fragmentů vytvořených kleavázou SSCP – polymorfizmus konformace jednořetězců DSCP – polymorfizmus konformace dvouřetězců
• 3. Metody pro specifickou detekci jednonukleotidových polymorfizmů
Princip RFLP RFLP vzniká přestavbami sekvencí - inzercemi - delecemi - substitucemi bazí uvnitř restrikčních míst
Využití RFLP • testování paternity, maternity
• diagnostika chorob • kriminalistika (identifikace osob) • studium příbuznosti jedinců, druhů… (př. studium příbuznosti lidí a ostatních primátů)
Southernova analýza potomků heterozygotních rodičů (RFLP)
Pokud je výskyt většího fragmentu spojen s nemocí je třeba sledovat dceru #1, sourozenci #2 a 3 jsou přenašeči
marker
matka
dítě
“otec”
Sekvenování DNA • stanovení pořadí nukleotidů v molekule DNA (primární struktury) používají se 2 metody:
Chemická (Maxamova-Gilbertova) Enzymová (Sangerova) společný rys obou metod: příprava a separace fragmentů DNA, jejichž velikost se liší o 1 nukleotid
Chemická metoda (Maxam-Gilbert)
Sekvence je odvozena z molekuly DNA, která se chemicky degraduje v místech, kde se vyskytuje báze určitého typu na fragmenty. Ty se následně oddělují elektroforézou.
Chemická metoda (Maxam-Gilbert) Postup: 1. Příprava značené jednořetězcové DNA, jejíž sekvence má být stanovena 2. Rozdělení vzorku DNA do 4 částí 3. Chemická modifikace jednoho nebo dvou typů bází v náhodných místech molekuly DNA v každém vzorku 4. Štěpení molekuly DNA v místech, kde došlo k modifikaci bází 5. Elektroforéza fragmentů DNA v denaturačním polyakrylamidovém gelu 6. Autoradiografická (nebo jiná) detekce fragmentů DNA
Enzymová metoda sekvencování DNA (Sanger)
Pokud je dideoxynukleotid inkorporován do syntetizujícího se řetězce, působí jako terminátor reakce
Dideoxynukleotidy nemají hydroxyl na 3’-konci
Původní sekvence
Templátový řetězec 3’
5’ Perfektní kopie
Směs řetězců ukončených GUANINEM při použití směsi dGTP a ddGTP
Enzymová metoda sekvencování DNA (Sanger)
Automatické sekvenování DNA • Je variantou enzymatického sekvenování DNA • Syntéza DNA probíhá v jedné reakci • Ke značení produktů se používají čtyřmi různými fluorescenčními značkami označené - primery - dideoxyribonukleotidy
Asymetrická PCR pro sekvenování
Strategie barevných primerů
Strategie barevných terminátorů
Princip detekce produktů Detekce produktů probíhá během elektroforézy pomocí laserového detektoru (laserem indukovaná fluorescence) napojeného na počítač, který vyhodnocuje sekvenci.
_
GEL LASER DETEKTOR
Fragmenty
+
Genetický analyzátor ABI 3100 Soustava kapilár
Příprava gelu Laserový detektor Rezervoár pufru Automatické nanášení vzorku
Vyhřívaná deska
Fyzikální mapování genomů - DNA je fyzickým materiálem genomu → fyzikální mapování - Cíl = konstrukce fyzikální mapy nebo stanovení sekvence genomu - Proces zahrnuje manipulace s fragmenty DNA - bez klonování – menší genomy; s PFGE - s klonováním – častější přístup; vektory Základní strategie: • restrikční (makrorestrikční) mapování • kontigové mapování (seřazení souvislých sekvencí genomu) • přímé sekvencování DNA
Základní strategie pro mapování a sekvencování velkých genomů Přístup shora dolů
Štěpení RE PFGE hybridizace
Přístup zdola nahoru
Uspořádání klonů Srovnání klonů Genomová knihovna
Konverze fyzikální mapy na genetickou • Výhodou fyzikálních map je zavedení univerzální mapové jednotky – kb (kbp) = 1000 bp
• Konverzi na genetickou mapu lze provést Southernovou hybridizací s genově specifickými sondami – dostupné geny téhož organizmu – konzervativní geny jiných příbuzných organizmů
Genová knihovna (genová banka) • soubor náhodně klonovaných fragmentů genomové DNA příslušného organismu • základ klonovacích strategií • nutná pro vyhledání a klonování určitého genu
Příprava genomové knihovny: • • • → •
izolace genomové DNA fragmentace na části o vhodné velikosti (restrikční endonukleázy) klonování fragmentů do vhodného vektoru knihovna má podobu transformovaných bakterií nebo fágových částic identifikace klonu obsahujícího studovaný fragment genomová DNA
fragmenty genomové DNA
rozštěpení restrikční endonukleázou
rekombinantní DNA
klonování DNA-fragmentů do vektoru
vnesení do bakterií
knihovna
Dělení knihoven podle původu DNA: genomová knihovna - soubor klonovaných fragmentů vzniklých štěpením genomové DNA, které reprezentují celý genom organismu knihovna cDNA - soubor klonů cDNA, které byly připraveny zpětnou transkripcí mRNA a v podobě cDNA tak reprezentují transkriptom daného organismu/tkáně/buňky v daném čase - knihovny cDNA připravené z různých tkání téhož organismu jsou odlišné - výhoda: geny v této knihovně jsou bez intronů
Vyhledávání genů v knihovně Hledání klonů nesoucích studované sekvence. Obvykle založeno na hybridizacích se sondami DNA třech typů: • cDNA připravené z mRNA tkáně, ve které dochází k silné expresi daného genu • sekvence DNA genu příbuzného organismu • synteticky připravené oligonukleotidy odvozené ze sekvence aminokyselin proteinu Je-li znám proteinový produkt, je možno pro detekci hledaného klonu použít protilátek.
Sekvenování genomů V praxi je velice často potřeba stanovit sekvenci fragmentu DNA, který je delší než průměrná délka 500 – 1 000 bází dosahovaná v jedné reakci. K tomuto účelu sekvencování genomů mohou být zvoleny dvě zcela odlišné strategie: – náhodné sekvencování – uspořádané sekvencování sousedních úseků
Izolace DNA
Fragmentace
+ Vektor
Úprava konců a klonování
Sestavení překrývajících se klonů
Mapování lidského genomu Genomika - studium genomů 1990 - mezinárodní konsorcium zahájilo “Human Genome Project” (HUGO) s cílem kompletně sekvenovat lidský genom Již osekvenované genomy:
Analýza transkripce • studium množství určitého transkriptu v daném vzorku a v daném čase • studium transkripční aktivity daného genu POZOR: • množství dané molekuly mRNA v dané buňce a v daném čase závisí nejen na transkripční aktivitě, ale také stabilitě mRNA • množství mRNA nemusí korelovat s množstvím proteinu, který kóduje • -
Metody: northernový přenos RT-PCR hybridizace in situ (identifikace buněk, které tvoří specifickou mRNA; identifikace buněk infikovaných viry)
Microarrays – DNA čipy • základem jsou syntetické oligonukleotidy nebo produkty PCR, které odpovídají velkému počtu (nebo všem) genům daného organismu • robotem se tyto fragmenty DNA kovalentně připojí na speciální skleněnou destičku v podobě uspořádaných teček • hybridizace se značenou DNA izolovanou z daného vzorku: - genomová DNA (genomové studie) - cDNA (expresní studie) - celkové spektrum genů, které se exprimují za určitých podmínek
izolace mRNA ze dvou různých vzorků (kontrolního a testovaného) • vytvoření cDNA zpětnou transkripcí • označení cDNA z jednoho vzorku červenou fluorescenční barvou a druhého vzorku zelenou fluorescenční barvou • směs obou značených cDNA (ve stejném poměru) je nanesena na sklíčko s 384 vzorky DNA a výsledek hybridizace je analyzován fluorescenční mikroskopií: • žlutý signál: cDNA obou vzorků se vážou proporcionálně, daný gen se exprimuje v obou vzorcích ekvivalentně • červený signál: preferenčně se váže cDNA prvního vzorku • zelený signál: preferenčně se váže cDNA druhého vzorku
Studium přítomnosti proteinů v buňkách (analýza proteomu) Metody pro stanovení fyzické přítomnosti proteinů: • • • • • • • • •
polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE) westernový přenos imunoprecipitace imunohistochemie izoelektrická fokusace dvourozměrná elektroforéza v polyakrylamidovém gelu chromatografie fluorescenční a elektronová mikroskopie průtoková cytometrie
Proteomika • určuje úplný profil všech proteinů, které daný organismus (buňka) vytváří za definovaných podmínek • na rozdíl od genomu, který se neliší v buňkách téhož organismu, je proteom proměnlivý podle vnějších a vnitřních faktorů Přístupy: - dvourozměrná elektroforéza - definování proteinů rozdělených na gelu (určení sekvence aminokyselin, westernový přenos) - štěpení eluovaných proteinů proteolytickým enzymem a stanovení molekulové hmotnosti vzniklých peptidů hmotnostní spektrometrií, srovnání hmotnostních spekter s databázemi – identifikace proteinu
westernový přenos
rozdělení podle molekulové hmotnosti
Imunoprecipitace technika izolace specifických proteinů z proteinových směsí prostřednictvím protilátek -
Obvyklý postup: - označení buněčných proteinů inkubací buněk za přítomnosti radioaktivně značených aminokyselin (není nutné, pokud jsou k dispozici jiné metody pro detekci vysrážených a od protilátek oddělených proteinů) - lýze buněk - inkubace buněčných extraktů, které obsahují značené proteiny s protilátkou specifickou pro cílový protein - vytvořené komplexy se oddělí od zbytku extraktů prostřednictvím kuliček vážících imunoglobuliny - varem se cílové proteiny oddělí od imunoglobulinů a kuliček - elektroforéza, autoradiografie (westernový přenos)
Dvourozměrná elektroforéza proteinů
Izoelektrická fokusace
Dvourozměrná elektroforéza proteinů
Sloupcová chromatografie
různé proteiny mají různou míru afinity k matrici v koloně
Průtoková cytometrie Studium vlastností individuálních buněk v buněčné populaci Umožňuje: • spočítat buňky v suspenzi • rozlišit živé buňky od mrtvých • vyhodnotit více než 100 buněk za 1 minutu • zhodnotit míru emitované fluorescence • frakcionovat buňky podle určitých vlastností, které korelují s mírou fluorescence: - míra přítomnosti určitých antigenů (diferenciace) - míra přítomnosti DNA - barvení propidiumiodidem (buněčný cyklus - obsah DNA se v průběhu cyklu periodicky mění; apoptóza - fragmentace DNA) - velikost buněk, přítomnost granulí v cytoplazmě (determinace buněčných typů ve směsích buněk) - možno využít k frakcionaci buněk dle určitých vlastností
Protilátky - proteiny tvořené lymfoidní tkání jako reakce na přítomnost cizorodého materiálu - antigenů - vysoká specificita - jedna protilátka může rozlišit polypeptidy lišící se jedinou aminokyselinou nebo dokonce jedinou modifikaci dané aminokyseliny (např. fosforylaci)
Monoklonální protilátky - produkt jednoho klonu B lymfocytů, který je chemicky a funkčně homogenní - B lymfocyty izolované z laboratorních živočichů nelze kultivovat in vitro
Milstein a Köhler 1975: → fúze normálních lymfocytů produkujících protilátky s maligní myelomovou buňkou → hybridní buňky (hybridomy): - možnost kultivace in vitro - vysoká schopnost tvorby jediné (monoklonální) protilátky - protilátka svou specifitou odpovídá produktu normálního lymfocytu použitého k fúzi
Myelomové buňky: - maligní buňky - možnost kultivace in vitro - vysoká schopnost tvorby protilátek - protilátky nejsou specifické pro určitý antigen - vznikají maligní transformací normálního lymfocytu
Na základě znalostí molekulární biologie můžeme dojít od proteinové sekvence ke genu a naopak
