NOVÉ TRENDY V REGENERATIVNÍ MEDICÍNĚ
doc. RNDr. Evžen Amler, CSc.
TKÁŇOVÉ INŽENÝRSTVÍ
TKÁŇOVÉ INŽENÝRSTVÍ Aplikace zákonitostí a metod inženýrství a přírodních věd na vývoj biologických náhrad sloužících k obnově, zachování nebo zlepšení funkcí tkání. Vývoj a využití „arteficiálních“ v laboratoři připravených molekul, buněk, tkání a orgánů k obnově nebo náhradě defektní nebo poraněné části těla. Interdisciplinarita buněčná biologie molekulární biologie inženýrství biomateriálů počítačové modelování mikroskopická analýza robotové technologie výroba bioreaktorů medicína
Obory biologie chemie fyzika technologie inženýrství vývoj materiálů počítačové technologie medicína
TKÁŇOVÉ INŽENÝRSTVÍ Důvody vzniku a rozvoje
umělé náhrady omezená životnost, nebezpečí infekce a tromboembolismus transplantace tkání a orgánů nedostatek donorů, imunosuprese tkáňové inženýrství a selektivní transplantace buněk náhrada tkáně živou tkání, která je „konstruována“ tak, aby vyhovovala potřebám pacienta
TKÁŇOVÉ INŽENÝRSTVÍ
TKÁŇOVÉ INŽENÝRSTVÍ
Odběr Izolace a následná kultivace buněk Nosiče (scaffoldy), osazení a následná kultivace (3D) Implantace Detekce – analýza vlastností
TKÁŇOVÉ INŽENÝRSTVÍ
ODBĚR
Izolace a následná kultivace buněk Nosiče (scaffoldy), osazení a následná kultivace (3D) Implantace Detekce – analýza vlastností
Odběr tkání, buněk chirurgický zákrok – lékař trend – minimálně invazivní metody
TKÁŇOVÉ INŽENÝRSTVÍ
Odběr
IZOLACE A NÁSLEDNÁ KULTIVACE BUNĚK Nosiče (scaffoldy), osazení a následná kultivace (3D) Implantace Detekce – analýza vlastností
Buňky autologní alogenní heterologní (xenogenní) diferencované (tkáňově specifické) kmenové Zdroj primární tkáň buněčné linie Požadavky neimunogenní vysoká proliferace dobrá manipulace schopnost diferenciace na různé specializované typy (v některých případech – kmenové buňky) Stimulace růstu, diferenciace růstovými faktory
TKÁŇOVÉ INŽENÝRSTVÍ
Odběr Izolace a následná kultivace buněk
NOSIČE (SCAFFOLDY), OSAZENÍ A NÁSLEDNÁ KULTIVACE (3D) Implantace Detekce – analýza vlastností
Nosiče (scaffoldy)
Nosiče (scaffoldy) Vlastnosti Biokompatibilita Bioresorbovatelnost Dostatečný přísun živin pro buňky Adekvátní vlastnosti
→ NUTNOST VÝVOJE NOVÝCH NOSIČŮ
Nosiče (scaffoldy)
vlákenné, pěnové, hydrogely, kapsle … napodobení přirozeného prostředí templáty extracelulárního prostředí
Materiály přírodní syntetické polosyntetické
Nosiče (scaffoldy) Syntetické materiály lepší kontrola vlastností (pevnost, biodegradovatelnost, porosita, mikrostruktura) možnost inkorporace růstových faktorů přesná velikost a tvar – možnost ovlivnění bioresorbovatelnost biokompatibilita neimunogennní podpora buněčného růstu indukce angiogenese
Nosiče (scaffoldy) první pokusy dvojrozměrné a nebiodegradovatelné materiály současný trend: trojrozměrné nosiče (3D) umožňují růst a diferenciaci buněk velká hustota buněk, rovnoměrné rozložení buněk biodegradabilní postupné odbourání a nahrazení novou funkční tkání nutnost kontroly růstu buněk různé modifikace nosičů adhezivní a neadhezivní povrchy, ligandy, liposomy...
Příprava nanovláken elektrostatické zvlákňování
Technical University of Liberec, Czech Republic
TKÁŇOVÉ INŽENÝRSTVÍ
Odběr Izolace a následná kultivace buněk Nosiče (scaffoldy), osazení a následná kultivace (3D)
IMPLANTACE Detekce – analýza vlastností
Implantace
chirurgický zákrok vhodné období optimálně připravený implantát
TKÁŇOVÉ INŽENÝRSTVÍ
Odběr tkáně Izolace a následná kultivace buněk Osazení nosičů (scaffoldů) a následná kultivace (3D) Implantace
DETEKCE – ANALÝZA VLASTNOSTÍ
Detekce Analýza vlastností v průběhu přípravy výsledné vlastnosti
Některé možnosti hodnocení
makroskopicky mikroskopicky histologicky viabilita buněk molekulárně biologické a biochemické biomechanické a další biofyzikální vlastnosti diagnostické a zobrazovací metody (NMR…)
BIOREAKTORY zařízení, ve kterém probíhá biologický a/nebo biochemický proces při definovaných a kontrolovaných podmínkách (pH, teplota, tlak, přísun živin, odstraňování odpadu)
KONSTRUKCE pomocí počítačových simulací matematické modely bioreaktorů
Bioreaktory Spinner-flask bioreactors baňka (láhev) s mícháním Rotating-wall vessels bioreactors - RWV nádoby s rotující stěnou dynamický laminární proud Hollow-fiber bioreactors bioreaktor s dutými vlákny proudění skrz nebo okolo vláken Direct perfusion bioreactors přímé promývání proudění scaffoldem s buňkami Bioreactors that apply controlled mechanical forces aplikace kontrolovaných mechanických sil
Bioreaktory a) odběr tkáně - lékař b) materiál c) izolace buněk d) kultivace buněk e) osázení scaffoldu f) příprava transplantátu g) monitorování a analýza procesu přípravy transplantátu h) klinická data pacienta i) určení a kontrola předem definovaných parametrů přípravy transplantátu j) implantace - lékař
Bioreaktor budoucnosti
UMĚLÉ CHRUPAVKY NA BÁZI AUTOLOGNÍCH CHONDROCYTŮ
KLOUBNÍ CHRUPAVKA
Kloubní chrupavka stavba a složení Buňky
chondrocyty (syntetizují vlákna a matrix)
Mezibuněčná hmota
kolagenní vlákna + amorfní matrix kolagen, kyselina hyaluronová, proteoglykany, glykoproteiny
kolagen chondrocyt proteoglykan
Mezibuněčná hmota
Kolagen
Proteoglykan
Kloubní chrupavka
Kloubní chrupavka – hyalinní chrupavka Specializovaný typ pojivové tkáně s pevnou, pružnou matrix Pokrývá kloubní plochy, brání abrazi třecích ploch Vyrovnává otřesy a nárazy Tloušťka 0,5– 6 mm S věkem klesá pružnost, snižuje se výška Porézní (chování podobné houbě); submikroskopické otvory (cca 6 nm) Zatížení – pružná deformace vtlačována a vytlačována synoviální tekutina Zátěž – chování určováno stupněm nasycenosti synoviální tekutinou zatížení – z amorfní mezibuněčné hmoty chrupavek vytlačována synoviální tekutina do kloubní štěrbiny, roste hustota mezibuněčné hmoty odlehčení – synoviální tekutina zpět do chrupavky (nasávána osmotickými silami proteoglykanů)
Chrupavky Bezcévnaté tkáně Vyživované difuzí z kapilár přilehlého kolagenního vaziva (perichondria) a synoviální tekutiny kloubní dutiny Velmi nízká mitotická aktivita chondrocytů Bez lymfatických cév a nervů Hojení pomalé, závislé na věku pacienta Větší defekty nereparabilní Novotvořená chrupavka je fibrózního typu biomechanicky méně kvalitní než hyalinní „Nezatížená“ kloubní chrupavka vystavena trvalému tlaku 6–8 kg/cm2 Bez zátěže (např. imobilizace kloubu) – porušena látková výměna hlubších vrstev chrupavky → degenerace chondrocytů Pro regeneraci optimální střídavé zatěžování
Kloubní chrupavka vrstvy – zóny I – POVRCHOVÁ oploštělé chondrocyty mezi kolagenními vlákny rovnoběžnými s kloubním povrchem
II – STŘEDNÍ vlákna – systém oblouků vzdorujících tlaku (arkády), minimum mezib. hmoty a chondrocytů
III – HLUBOKÁ větší, kulovité buňky, orientovány do sloupců; produkují mezibuněčnou hmotu
IV – KALCIFIKOVANÁ velké chondrocyty a vazivová vlákna ve zvápenatělé mezibuněčné hmotě, přecházejí do kosti
SUBCHONDRÁLNÍ KOST
OSTEOARTRÓZA osteo – kost; arthritis – poškození, otok + zánět klouby – zátěž – vysoký tlak → poškození (ztenčení) chrupavky → zbytnění (zvětšení) kosti
ZDRAVÝ KLOUB
OSTEOARTRÓZA
Příčiny
věk (okolo 50 let, neobvyklá do 40 let) pohlaví (častější u žen) obezita úrazy a operace kloubů (v mladším věku) dědičnost (zejména ruce, méně kolena a kyčle)
Osteoartróza
Osteoartróza
Osteoartróza
Osteoartróza
Osteoartróza
Osteoartróza terapie poškozené chrupavky Umělé náhrady kloubů (protézy) starší pacienti – umělé náhrady kloubů (protézy) mladší pacienti – omezená životnost protéz Nutnost vývoje a optimalizace alternativních léčebných metod Mozaiková plastika Autologní chondrocyty – nedostatečná mechanická stabilita Autologní chondrocyty + nosiče autologní chondrocyty v biodegradovatelné trojrozměrné matrici
Mozaiková plastika
Autologní chondrocyty
Nosiče (scaffoldy) buňky + biodegradovatelný trojrozměrný nosič
Nosiče (scaffoldy) autologní chondrocyty a biodegradovatelný trojrozměrný nosič
VÝVOJ A TESTOVÁNÍ NOSIČŮ
Postup při vývoji nosiče
MTT test Zjišťování proliferace, diferenciace a metabolické aktivity buněk Výsledná barva roztoku odpovídá počtu metabolizujících buněk.
0,9 0,8
Absorbance
0,7 0,6
1.den
0,5
3.den
0,4
7.den
0,3 0,2 0,1 0 1
2
3 Scaffold
4
Buňky
Mikroskopické hodnocení izolace chondrocytů – působení kolagenázy
Mikroskopické hodnocení proliferace chondrocytů
Chondrogenní fenotyp po 4 dnech
Fibroblast-like fenotyp po 7 dnech
Mikroskopické hodnocení kompozitní nosič osazený chondrocyty
Chondrocyt
Buněčná viabilita konfokální mikroskopie • nefixované nosiče • živé buňky – zeleně BCECF – 2´,7´´-bis(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein • mrtvé buňky – červeně PI – propidium jodide
Chondrocyty na nosiči
Fluorescenční mikroskopie, barveno propidium jodidem
Nosič a nosič s chondrocyty
SEM nosič, želatina síťovaná pěna
Konfokální mikroskopie nosič s buňkami, želatina, 15. den, propidium jodid
Konfokální mikroskopie
Imunofluorescenční barvení proti kolagenu typu II (monoklonální protilátka proti kolagenu II: Ab –anti-kolII, sekundární protilátka značená Cy3)
Histologie
Barvení hematoxylin-eosinem (A) Detekce GAG: kyselé (C); neutrální (E)
Imunohistochemie
Detekce kolagenu II
HISTOLOGIE A IMUNOHISTOLOGIE Nově vytvořená chrupavka
důkaz GAG alcianová modř + PAS (pH 2,5) Původní chrupavka
Zv. 40x
Nově vytvořená chrupavka
kolagen II
Zv. 80x
Biomechanické testy
Schéma a fotografie přístroje pro testování biomechanických vlastností. Zátěžový diagram nativní chrupavky a buněčných nosičů.
Implantace
Implantace
Implantace
Poškození
Implantát
Makroskopické hodnocení
po 6 týdnech – králíci
NANOTECHNOLOGIE A ŘÍZENÉ DODÁVÁNÍ LÉČIV MICELY
DENDRIMERY
NANOČÁSTICE
LIPOSOMY
Nosiče léků
micely liposomy dendrimery tekuté krystaly nanočástice nanoporézní materiály molekulárně vtištěné polymery
NANOČÁSTICE
LIPOSOMY pro řízené uvolňování léčiv
ŘÍZENÉ UVOLŇOVÁNÍ LÉČIV Dodávání léčiv (anglicky drug delivery) - doručení bioaktivní látky (léčiva) k cílové oblasti. Nejpoužívanější metody aplikace léčiv: perorální nasální (nosní) pneumoniální (inhalace) rektální
riziko degradace, poškození nebo neefektivní inkorporace léčiva injekční forma podání proteinových a peptidových léků liposomy jako nosiče léčiv
ŘÍZENÉ UVOLŇOVÁNÍ LÉČIV Základem řízeného uvolňování léčiv (anglicky controlled drug delivery) je skutečnost, že při standardizovaných podmínkách má uvolňování léčiva z léků určitý časový průběh a podle toho je nutné zajistit v místě účinku potřebný koncentrační spád. Fyzikální veličinou, která řídi rychlost uvolňování léčiva, je tedy proces difúze. Nosič léčiv je látka, která poskytuje časově kontrolované dodání, orgánově specifické cílení, ochranu, přetrvávající in vivo funkce a snížení toxicity léčiva. Vhodné nosiče léčiv: liposomy, albuminové mikročástice, rozpustné syntetické polymery, DNA komplexy, konjugáty protein-léčivo, nosiče erytrocytů a další biodegradabilní látky.
Struktura membrán
© Espero Publishing, s.r.o.
Struktury
LIPOSOMY V 60. letech minulého století publikoval Bangham sérii prací, ve kterých ukázal, že částice vznikající bobtnáním vysušeného filmu fosfolipidů ve vodě představují mono- a multilamelární struktury tvořené dvojvrstvami lipidů, které uzavírají ve svých vnitřních kompartmentech vodnou fázi. Liposomy, jak byly tyto útvary pojmenovány, se brzy staly oblíbeným modelem biologických membrán.
Drawing of vesicle by Dr. André Pampel Universität Leipzig Fakultät für Physik und Geowissenschaften Avanti Polar Lipids
Vlastnosti membrána není propusná pro ionty a velké dipóly (proteiny a sacharidy) enkapsulované látky jsou „chráněny“ před okolním prostředím amfifilní charakter nosiče hydrofilních i hydrofobních látek biokompatibilní nosiče řady substancí (léky, proteiny, peptidy, DNA, oligonukleotidy…) pro účely farmaceutické, kosmetické i biochemické cílená a řízená příprava ⇒ různě vlastnosti - velikost (nanometry až mikrometry), složení membrány, množství enkapsulované látky, vlastnosti povrchu
Imunoliposomy
Imunoliposomy Modifikace povrchu liposomů specifické ligandy „řízené-cílené“ (targeted) liposomy hydrofilní polymery s vysoce flexibilním hlavním řetězcem dlouhodobě cirkulující „long-circulating“ liposomy značky monitorování osudu liposomů v buňce nebo organismu, příprava kontrastních liposomů pro zobrazovací metody deriváty lipidů s kladným nábojem, polymery s kladným nábojem vazba DNA a transfekce buněk protilátka nebo antigen imunodetekční systém
Klasifikace liposomů
Podle velikosti malé unilamelární váčky (anglicky small unilamelar vesicles) velké unilamelární váčky (anglicky large unilamelar vesicles) velké multilamelární váčky (anglicky large multilamelar vesicles) Podle cirkulace in vivo klasické liposomy stericky stabilizované liposomy Podle lamelarity unilamelární multilamelární Podle aplikace diagnostické terapeutické Podle povrchového náboje s kladným nábojem (kationtové) / liposomální DNA vektory se záporným nábojem (aniontové) neutrální Podle specializace „řízené-cílené“ (targeted) liposomy imunoliposomy transfeozomy liposomální DNA vektory LPDI, LPDII Banerjee et al. 2001
Liposomy jako nosiče léčiv
Liposomy jako nosiče léčiv Liposomy - nosiče léčiv ve farmaceutické a kosmetické oblasti: zásobníky s řízeným uvolňováním nosičové systémy k cílené orgánové distribuci (anglicky targeting) pomocná látka ke zlepšení absorpce léčiva do určených buněk Složení z přirozených a netoxických stavebních prvků vhodnější oproti jiným systémům, např. nanočásticím. Aplikace: nejčastěji parenterální a topická (nízká odolnost vůči žaludečnímu pH, enzymům v gastrointestiálním traktu a solím žlučových kyselin v tenkém střevě - nevhodné perorální podávání)
Degradace liposomů
přesný mechanismus po kontaktu s buňkou není znám fůze s membránou endocytózy, fagocytózy uvolnění obsahu samovolným unikáním (propustnost), dfúzí, póry v membráně uvolňování lze ovlivnit např. teplotou, tlakem, pH, vlastnostmi povrchu (řízená a cílená interakce s receptory) pomocí ultrazvuku a rázových vln
Otevírání liposomů pomocí ultrazvuku
AFM of liposomes before and after ultrasound application (Míčková et al. 2008)
Shock-wave method (Šunka et al. 2006)
Sonikace vhodná technika pro otevírání liposomů – krátkodobá (minutová) ultrazvuková sonikace (intenzita I = 2 W/cm2 při frekvenci f = 1 MHz)
Technika rázových vln rázové vlny je možné dobře fokusovat a mají i podstatně menší vedlejší negativní účinky na organismus rázové vlny jsou velice perspektivním nástrojem pro řízené uvolňování léčiv ve tkáňovém inženýrství
NOSIČE OBSAHACENÉ O LIPOSOMY Výhody spojení s liposomy spojení materiálu s liposomy umožňuje další aplikace
řízené otevírání liposomů cílené řízení cílené uvolňování látek v těle pacienta
Nanovlákna obohacená o liposomy
